DK172064B1

DK172064B1 - Fusionsprotein, dets fremstilling og anvendelse, genstruktur, som koder for fusionsproteinet, vektor, som indeholder genstrukturen, og værtscelle, som indeholder vektoren

Info

Publication number: DK172064B1
Application number: DK568586A
Authority: DK
Inventors: Paul Habermann; Friedrich Wengenmayer
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1985-11-27
Filing date: 1986-11-26
Publication date: 1997-10-06
Also published as: KR870005098A; PT83813B; JP2566933B2; ES2073081T3; HU203579B; AU6569386A; DE3650322D1; EP0464867B1; JPS62143696A; IL80755A0; EP0227938B1; DK52292D0; EP0468539B1; NO864759D0; EP0468539A1; FI864798A0; NO176481C; KR950000300B1; DK568586A; NO176481B

Description

DK 172064 B1

Opfindelsen angår et fusionsprotein, dets fremstilling og anvendelse, en genstruktur, som koder for fusionsproteinet, en vektor, som indeholder genstrukturen, og en værtscelle, som indeholder vektoren. Ved opfindelsen anvendes et 5 "åbent aflæsningsraster" fra et DNA, der koder for inter-leukin-2, som ekspressionshjælpemiddel til ekspression af peptider eller proteiner.

Ved genteknologisk fremstilling af eukaryotiske proteiner opnås der i bakterier hyppigt kun et ringe 10 udbytte, især ved små proteiner med en molekylvægt på indtil ca. 15.000 dalton, hvis strukturer indeholder di-sulfidbroer. Det antages, at de dannede proteiner hurtigt nedbrydes af værtsegne proteaser. Der konstrueres derfor hensigtsmæssigt genstrukturer, der koder for fu-15 sionsproteiner, hvorved den uønskede andel af fusionsproteinet er et værtseget protein, som efter isolering af primærproduktet fraspaltes ved i og for sig kendte metoder.

Det har nu overraskende vist sig, at en N-termi-20 nal andel af interleukin-2, der i det væsentlige svarer til de første 100 aminosyrer, er særlig godt egnet til fremstilling af fusionsproteiner. Der fås altså som primærprodukt et fusionsprotein, der fuldstændig eller helt overvejende består af eukaryotiske proteinsekvenser'.

25 Overraskende erkendes dette protein åbenbart ikke som fremmedprotein i den anvendte værtsorganisme og nedbrydes ikke straks igen. En anden fordel er, at de her omhandlede fusionsproteiner er tungtopløselige til uopløselige og derfor let kan fraskilles fra de opløselige 30 proteiner, hensigtsmæssigt ved centrifugering.

I fusionsproteinet ifølge opfindelsen er "ballastandelen", dvs. interleukin-2-åndelen ikke et biologisk aktivt molekyle, og den nøjagtige struktur af interleukin-2-andelen 2 DK 172064 B1 er ikke af afgørende betydning. Det er herved tilstrækkeligt, at der i det væsentlige foreligger de første 100 N-terminale aminosyrer. Det er altså f.eks. muligt at foretage variationer ved N-terminussen, der tillader en spaltning af fusions-5 proteinet, hvis det ønskede protein er anordnet N-terminalt dertil. Omvendt kan der foretages C-terminale variationer for at muliggøre eller lette fraspaltningen af det ønskede protein, hvis dette, således som det er almindeligt, er bundet C-terminalt i fusionsproteinet.

10 Den naturlige DNA-sekvens, der koder for humant interleukin-2, i det følgende betegnet IL-2, er kendt fra den europæiske patentansøgning med offentliggørelsesnummeret EP-A1-0.091.539. Den der anførte litteratur refererer til muse- og rotte-IL-2. Disse pattedyr-DNA'er 15 kan anvendes til syntese af de her omhandlede proteiner.

Mere hensigtsmæssigt gås der dog ud fra et syntetisk DNA, særlig fordelagtigt fra DNA for humant IL-2, som er foreslået i (ikke offentliggjort) DE offentliggørelsesskrift nr. 3.419.995 (svarende til den europæiske patent-20 ansøgning, der er offentliggjort under nr. 163.249) . Denne syntetiske DNA-sekvens er anført i bilaget (DNA-se-kvens I). Dette syntetiske DNA har ikke kun den fordel, at det rtied hensyn til codon-valget er afstemt efter forholdene i den hyppigst anvendte værtsorganisme, E. coli, 25 men indeholder også en række af spaltningssteder for re-striktionsendonucleaser, hvoraf der kan gøres brug ifølge opfindelsen. I den følgende tabel I er der anført et udvalg af egnede spaltningssteder ved begyndelsen henholdsvis i området af triplet nr. 100. Herved er det dog 3 0 ikke udelukket, at der kan foretages variationer i DNA'et i det derimellem liggende område, hvorved der kan gøres brug af de i den ovennævnte patentansøgning anførte yderligere spaltningssteder.

3 DK 172064 B1

Tabel I

Position af det første nukleotid af genken-Genkendelses- delsessekvensen (ko-5 Restriktionsenzym_sekvens_derende streng) 5' 3'

Aha II, Ban I,

Hae II, Nar I, GGCGCC 8

Ban II, Sad, Sst I GAGCTC 291 10 Hha I GCGC 9

Hinf I GACTC 35

Pvu I CGATCG 346

Taq I TCGA 387 15

Hvis der gøres brug af nucleaserne Ban II, Sac I eller Sst I; fås der en IL-2-delsekvens, der koder for ca. 95 aminosyrer. Denne længde er i almindelighed tilstrækkelig til at 'opnå et uopløseligt fusionsprotein.

20 Når tungtopløseligheden, f.eks. ved et ønsket hydrofilt eukaryotisk protein* ikke er tilstrækkelig, men man -for at producere så lidt "ballast" som muligt - ikke vil gøre brug af de spaltningssteder, der ligger nærmere ved C-terminussen, kan man ved hjælp af tilsvarende adaptere 25 eller linkere forlænge DNA-sekvensen ved den N-terminale og/eller C-terminale ende og således "skræddersy" "ballast" -andelen.

Opfindelsen angår således et fusionsprotein, som er ejendommeligt ved en C-terminal eller N-terminal andel, 30 der i det væsentlige svarer til de første 100 aminosyrer af interleukin-2, men som ikke udviser interleukin-2-ak-tivitet.

Opfindelsen angår især et fusionsprotein med den almene formel 35 4 DK 172064 B1

Met - X - Y - Z eller Met - Z - Y - X (la) (Ib) 5 hvori X i det væsentlige betyder aminosyresekvensen af de ca. 100 første aminosyrer af fortrinsvis humant IL--2, Y betyder en direkte binding, hvis aminosyren eller aminosyresekvensen, som er nabostillet til det ønskede protein, muliggør en fraspaltning af det ønskede 10 protein, og ellers et broled af en eller flere genetisk koderbare aminosyrer, som muliggør fraspaltningen, og z betyder en sekvens af genetisk koderbare aminosyrer, der koder for det ønskede protein, fortrinsvis af et proinsulin eller et hirudin.

15 Som det fremgår af formel la og Ib, og som det allerede er nævnt ovenfor, er det muligt at bringe det ønskede protein til ekspression før eller efter IL-2--andelen. For enkeltheds skyld forklares i det følgende i det væsentlige den første mulighed, der svarer til 20 den gængse metode til fremstilling af fusionsproteiner.

Når denne "klassiske" variant beskrives i det følgende, skal det andet alternativ altså ikke herved udelukkes.

Fusionsproteinet fås på i og for sig kendt måde ved ekspression i et egnet ekspressionssystem. Egnet hertil er 25 alle kendte vært-vektor systemer, altså f.eks. pattedyrceller og mikroorganismer, f.eks. gærarter og fortrinsvis bakterier, især E. coli.

Opfindelsen angår således også en fremgangsmåde til fremstilling af et fusionsprotein ifølge opfindelsen, hvilken 30 fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en genstruktur, der koder for dette protein, exprimeres i en værtscelle, og fusionsproteinet skilles fra de opløselige proteiner, fortrinsvis ved centrifugering.

DNA-sekvensen, som koder for det ønskede protein, 35 indbygges på kendt måde i en vektor, som sikrer en god ekspression i det valgte ekspressionssystem.

5 DK 172064 B1

Opfindelsen angår således også en genstruktur, som koder for et fusionsprotein ifølge opfindelsen, og en vektor, som indeholder en sådan genstruktur.

5 I bakterielle værtsorganismer vælges promotoren og operatoren hensigtsmæssigt fra gruppen lac, tac, trp, PL eller pr af A“fag, hsp, omp eller en syntetisk promotor, som f.eks. er foreslået i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.430.683 (EP patentansøgning med offentlig— 10 gøre1sesnummeret 173.149). Fordelagtig er tac-promotor--operator-sekvensen, som i mellemtiden er blevet handelsgængs (f.eks. ekspressionsvektor pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).

15 Ved ekspressionen af det her omhandlede fusions protein kan det vise sig at være hensigtsmæssigt at ændre enkelte tripletter af de første aminosyrer efter ATG-start-codonet for at forhindre en eventuel baseparring på mRNA-plan. Sådanne ændringer, ligesom ændringer, 20 udeladelser eller tilføjelser af enkelte aminosyrer i IL-2-proteinandelen, er gængse for en fagmand og ligeledes genstand for opfindelsen.

Opfindelsen angår endelig også anvendelsen af fusionsproteinet ifølge opfindelsen til fremstilling af proteinet, 25 der i det væsentlige svarer til aminosyresekvensen Z, ved kemisk eller enzymatisk spaltning.

Denne spaltning af fusionsproteinet ad kemisk eller enzymatisk vej kan ske på i og for sig kendt måde. Udvælgelsen af den egnede metode retter sig fremfor alt efter amino-30 syresekvensen af det ønskede protein. Når dette f.eks. ikke indeholder methionin, kan Y betyde Met, hvorpå der sker en kemisk spaltning med chlor- eller bromcyan. Hvis der i bindeleddet Y ved carboxyterrainussen foreligger cystein eller Y betyder Cys, kan der følge en enzymatisk cysteinspecifik 35 spaltning eller en kemisk spaltning, f.eks. ved specifik S-cyanylering. Hvis der i broleddet Y ved carboxyterminussen 6 DK 172064 B1 foreligger tryptophan eller Y betyder Trp, kan der ske en kemisk spaltning med N-bromsuccinimid.

Proteiner, der i deres aminosyresekvens ikke indeholder 5

Asp - Pro og er tilstrækkelig syrestabile, kan spaltes proteoly-tisk på i og for sig kendt måde. Herved fås proteiner, 10 som indeholder prolin N-terminalt eller asparaginsyre C--terminalt. På denne måde kan der også syntetiseres modificerede proteiner.

Asp-Pro-bindingen kan også være mere syrelabil, når dette broled er (Asp)„-Pro eller Glu-(Asp)„-Pro, 15 η n hvori n betyder 1-3.

Eksempler på enzymatiske spaltninger er ligeledes kendte, idet der også kan anvendes modificerede enzymer med forbedret specificitet (jf. C.S. Craik et al..

Science 228 (1985) 291-297). Hvis det Ønskede eukaryoti- 20 ske peptid er proinsulin, vælges der hensigtsmæssigt som sekvens Y en peptidsekvens, hvori en med trypsin fraspaltelig aminosyre (Arg, Lys) er bundet til den N-terminale aminosyre (Phe) af proinsulin, f.eks. Ala-Ser-Met-^ -Thr-Arg, da den argininspecifikke spaltning da kan ske med proteasen trypsin.

Hvis det ønskede protein ikke indeholder amino-syresekvensen

Ile-Glu-Gly-Arg, 30 kan fusionsproteinet spaltes med faktor Xa (EP-patentan-søgningerne med offentliggørelsesnumrene 25.190 og 161.973).

35 0 7 DK 172064 B1 I de følgende eksempler og på tegningen forklares opfindelsen nærmere.

Fig. 1 og dennes fortsættelse, fig. la, på tegningen viser syntesen af plasmidet pK360, der koder for et 5 fusionsprotein, som udviser hirudinsekvensen.

Fig. 2 og dens fortsættelse, fig. 2a, viser syntesen af plasmidet pK410, som ligeledes koder for et fusionsprotein med hirudin-aminosyresekvensen.

Fig. 3 og dens fortsættelser, fig. 3a til 3c, vi-10 ser konstruktionen af plasmiderne pPH15, 16, 20 og 30, der koder for fusionsproteiner, der indeholder aminosy-resekvensen af abe-proinsulin.

Fig. 4 og dens fortsættelse, fig. 4a, viser konstruktionen af plasmidet pK370, som koder for et fu-15 sionsprotein med hirudin-aminosyresekvensen.

Fig. 5 og dens fortsættelse, fig. 5a, viser syntesen af plasmidet pKHIOl, som koder for et fusionsprotein med abe-proinsulin-aminosyresekvensen.

Figurerne er ikke målestokskorrekte, fremfor alt 20 er målestokken "strakt" ved polylinkerens område.

Eksempel 1

Ved indføjelse af lac-repressoren (P.J, Farabaugh,·.

Nature 274 (1978) 765-769) i plasmidet pKK 177-3 G&mann 25 et al., Gene 25_ (1983) 167) fås plasmidet pJF118 (1) (fig. 1, jf. DE patentansøgning nr. 3.526.995, eksempel 6, fig. 6). Dette åbnes ved det eneste restriktionssted for Ava I og formindskes med ca. 1000 bp ved exonuclease--behandling på i og for sig kendt måde. Efter ligering 30 fås plasmidet pEW 1000 (2) (fig. 1) , hvori lac-r.epressor-genet er bevaret fuldstændig, men på grund af formindskelsen foreligger med et tydeligt højere kopiantal end udgangsplasmidet.

I stedet for plasmidet pKKl77-3 kan man også gå 35 8 DK 172064 B1 0 ud fra det ovennævnte handelsgængse plasmid pKK223-3, indbygge lac-repressoren og forkorte det fremkomne produkt på analog måde.

Plasmidet pEW 1000 (2) åbnes med restriktionsen-5 zymerne EcoR I og Sal I (3).

Det for hirudin koderende plasmid (4), fremstilles ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 3.429.430 (EP patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 171.024), eksempel 4 (fig. 3), åbnes med restriktionsenzymerne Accl 10 og Sall, og det lille fragment (5), der for størstedelens vedkommende indeholder hirudinsekvensen, isoleres.

Plasmidet pl59/6 (6), fremstillet ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 3.419.995 (EP patentansøgning med offentliggørelsesnummeret 163.249), eksempel 4 (fig.

15 5), åbnes med restriktionsenzymerne Eco RI og Pvu I, og det lille fragment (7), som indeholder størstedelen af IL-2-sekvensen, isoleres. Denne delsekvens og i det følgende også andre forkortede IL-2-sekvenser er i figurerne betegnet "AlL2".

20 Derefter behandles sekvenserne (3), (5), (7) samt den syntetiske DNA-sekvens (8, fig. la) med T4-li-gase. Der fås plasmidet pK360 (9).

Kompetente E. coli-celler transformeres med ligeringsproduktet og udplades på NA-plader, som indehol-25 der 25 ^ig/ml ampicillin. Plasmid-DNA'et af klonerne karakteriseres ved hjælp af restriktions- og sekvensanalyse.

En kultur natten over af E. coli-celler, som indeholder plasmidet (9), fortyndes med LB-medium (J.H.

30 Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972), som indeholder 50 ^ig/ml ampicillin, i forholdet ca. 1:100, og væksten følges ved 0D--måling. Ved en OD-værdi på 0,5 indstilles rystekulturen til 1 mM isopropyl-3-galactopyranosid (IPTG), og 35 bakterierne fracentrifugeres efter 150-180 minutter. Bakterierne koges i 5 minutter i en pufferblanding DK 172064 B1 9 0 (7M urinstof, 0,1% SDS, 0,1M natriumphosphat, pH-værdi 7,0), og prøver anbringes på en SDS-gelelektroforese-plade. Efter elektroforese fås der fra bakterier, som indeholder plasmidet (9), et proteinbånd, som svarer 5 til størrelsen af det forventede fusionsprotein. Efter oplukning af bakterierne (French Press; "Dyno-Muhle") og centrifugering befinder fusionsproteinet sig i bundfaldet, således at der allerede med den ovenstående væske kan fraskilles betydelige mængder af de øvrige 10 proteiner. Efter isolering af fusionsproteinet frigøres det forventede hirudin-peptid ved bromcyan-spalt-ning. Dette karakteriseres efter isolering ved prote-in-sekvensanalyse.

De angivne induktionsbetingelser gælder for ry-15 stekulturer. Ved større fermenteringer er tilsvarende ændrede OD-værdier og eventuelt let varierede IPTG-kon-centrationer hensigtsmæssige.

Eksempel 2 20 Plasmidet (4) (fig. 1) åbnes med Acc I, og de ud ragende ender opfyldes med Klenow-polymerase. Derefter spaltes der med Sac I, og fragmentet (10), der indeholder størstedelen af hirudin-sekvensen, isoleres.

Den handelsgængse vektor pUC 13 åbnes med re-25 striktionsenzymerne Sac I og Sma I, og det store fragment (11) isoleres.

Ved hjælp af T4-ligase ligeres nu fragmenterne (10) og (11) til plasmidet pK 400 (12) (fig. 2). Plasmidet (12) er vist to gange i fig. 2, idet aminosyrese-30 kvensen af det således fremstillelige hirudinderivat er fremhævet på den nederste afbildning.

Plasmidet (4) (fig. 1) åbnes med restriktionsenzymerne Κρη I og Sal I, og det lille fragment (13) , der indeholder hirudin-delsekvensen, isoleres.

35 Plasmidet (12) omsættes med restriktionsenzymer ne Hine II og Κρη I, og det lille fragment (14) , der o 10 DK 172064 B1 indeholder hirudin-delsekvensen, isoleres.

Plasmidet (9) (fig. la) spaltes partielt med EcoR I, de frie ender opfyldes med Klenow-polymerase ved en "fill-in"-reaktion og spaltes med Sal X. Der fås derivatet af plasmidet pK360 (15).

O

Ved ligering af fragmenterne (3), (13), (14) og (15) fås plasmidet pK410 (16), som er vist to gange i fig. 2a, idet aminosyresekvensen af fusionsproteinet og dermed det efter syrespaltning fremkomne hirudinde- Λ rivat fremgår af den nederste afbildning.

10

Efter ekspression og oparbejdning ifølge eksempel 1 fås et nyt hirudinderivat, som i positionerne 1 og 2 har aminosyrerne prolin og histidin. Dette hirudinderivat udviser den samme aktivitet som naturproduk- 15 tet ifølge DE offentliggørelsesskrift nr. 3.429.430, der i disse positioner har aminosyrerne threonin og tyrosin, men er mere stabilt mod angreb af aminopeptidaser, hvilket kan give fordele ved in vivo-anvendelse.

20 Eksempel 3

Den handelsgængse vektor pBR 322 åbnes med Barn Η I, hvorved der fås det lineariserede plasmid (17). De frie ender opfyldes partielt under anvendelse af dATP, dGTP og dTTP, og det udragende nucleotid G nedbrydes 25 med Sl-nuclease, hvorved der fås pBR 322-derivatet (18).

Hae Ill-fragmentet (19) fra abe-proinsulin (Wete-kam et al., Gene lj) (1982) 181) ligeres med det modificerede plasmid (18) , hvorved der fås plasmidet pPH 1 (20). Da insulin-delsekvensen er indsat i tetracyclin- 30 -genet, er klonerne, der indeholder dette plasmid, ikke resistente mod tetracyclin og kan på denne måde identificeres .

Plasmidet (20) åbnes med Barn HI og Dde I, og det lille fragment (21) isoleres.

35 Desuden isoleres der fra abe-proinsulinsekvensen

Dde I-Pvu II-delsekvensen (22).

11 DK 172064 B1 o

Vektoren pBR 322 åbnes med Barn HI og Pvu II, og det lineariserede plasmid (23) isoleres.

Ved ligering af insulin-delsekvenserne (21) og (22) med det åbnede plasmid (23) fås plasmidet pPH5 (24). Dette åbnes med Barn HI og Pvu II, og det lille fragment (25) isoleres.

Til fuldstændiggørelse af insulinstrukturen syntetiseres DNA-sekvensen (26).

Den handelsgængse vektor pUC 8 åbnes med enzymer-ne Bam HI og Sal I, og restplasmidet (27) isoleres. Dette ligeres med DNA-sekvenserne (25) og (26) til plasmidet pPH 15 (28). Dette åbnes med Sal I, og de udragénde ender opfyldes. Fra det resulterende plasmidderivat (29) fraspaltes DNA-sekvensen (30) med Bam HI.

15 Den handelsgængse vektor pUC 9 åbnes med enzymer ne Bam HI og Sma I, og det store fragment (31) isoleres.

Dette ligeres med DNA-sekvensen (30), hvorved det fås plasmidet pPH16 (32) .

Plasmidet (32) åbnes med Sal I, og det liriearise-20 rede plasmid (33) opfyldes partielt med dCTP, cGTP og dTTP, og det tilbageblivende nucleotid T fraspaltes med Sl-nuclease. Det således fremkomne plasmidderivat (34) behandles med Bam HI, og fra produktet (35) fjernes ved hjælp af Sl-nuclease den udragende enkeltstreng, hvorved 25 der fås plasmidderivatet (36).

De stumpe ender af plasmidderivatet (35) cycli-seres til plasmidet pPH 20 (37).

Kompetente E. coli Hb 101-celler transformeres med ligeringsblandingen og udplades på selektivt medi-30 um. Kloner, som indeholder det ønskede plasmid, ekspri-merer proinsulin, idet 28 ud af 70 testede kloner indeholder radioimmunologisk påviseligt proinsulin. Plasmi-derne karakteriseres endvidere ved DNA-sekvensanalyse.

De indeholder DNA, som før kodonet for den første ami-35 nosyre af B-kæden (Phe) koder for arginin.

Plasmidet (37) spaltes med Hind III, de udragende ender opfyldes og efterspaltes med Dde I. Det lil- 0 12 DK 172064 B1 le fragment (38) isoleres.

Plasmidet (28) (fig. 3a) spaltes med Sal I og Dde I, og det lille fragment (39) fraskilles.

Plasmidet (9) (fig. la) spaltes først med Acc I, 5 de frie ender opfyldes og efterspaltes partielt med

Eco RI. Fragmentet (40), som indeholder den forkortede IL-2-sekvens, isoleres.

Det lineariserede plasmid (3) (fig. 1) og DNA- -segmenterne (38), (39) og (40) ligeres nu til plasmi-10 det pPH 30 (41). Dette plasmid koder for et fusionsprotein, der i tilslutning til aminosyrerne 1-114 af IL-2 udviser følgende aminosyresekvens:

Asp-Phe-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg.

15

Argininet som sidste aminosyre af dette broled Y muliggør fraspaltning af insulinkæderne med trypsin.

Ud fra plasmidet (9) (fig. la) kan man på følgende måde fremstille plasmidet (41): 20 (9) åbnes med Acc I, de udragende ender opfyl des, der efterspaltes med Sal I, og det fremkomne plas-midderivat (42) ligeres med segmenterne (3), (38) og (39) .

25 Eksempel 4

Den handelsgængse vektor pUC 12 åbnes med restriktionsenzymerne Eco RI og Sac I. I dette lineariserede plasmid (46) indsættes en IL-2-delsekvens, der er fraspaltet fra plasmidet (6) (fig. 1) med restriktionsen-30 zymerne Eco RI og Sac I. Denne sekvens (47) omfatter komplette tripletter for de første 94 aminosyrer af IL--2. Ved ligering af (46) og (47) fås plasmidet pK 300 (48) .

Plasmidet (9) (fig. la) åbnes med Eco RI, de ud-35 ragende ender opfyldes og efterspaltes med Hind III.

Det lille fragment (49) , der i tilslutning til den for hirudin koderende DNA-sekvens indeholder en del af po-lylinkeren fra pUC 12, isoleres.

13 DK 172064 B1 0

Plasmidet (48) åbnes med restriktionsenzymerne Sam I og Hind III, og det store fragment (50) isoleres.

Ved ligering af (50) med (49) fås plasmidet pK 301 (51).

Med ligeringsblandingen transformeres kompetente 5 E. coli 294-celler). Kloner, som indeholder plasmidet (51), karakteriseres ved restriktionsanalyse. De indeholder DNA, som i tilslutning til codonerne for de første 96 aminosyrer af IL-2 indeholder codoner for et broled af 6 aminosyrer og derefter codoner for hirudin.

10 Plasmidet (51) omsættes med Eco RI og Hind III, og fragmentet (52) som indeholder DNA-sekvensen for det nævnte eukaryotiske fusionsprotein, isoleres.

Plasmidet (II) (fig. 1) åbnes med Eco RI og Hind III.

Det fremkomne lineariserede plasmid (53) ligeres med 15 DNA-sekvensen (52), hvorved der fås plasmidet pK 370 (54) .

Hvis plasmidet (54) bringes til expression i E. coli som i eksempel 1, fås et fusionsprotein, i hvilket der efter de første 96 aminosyrer af IL-2 følger broled-20 det

Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr og i tilslutning til denne hirudin-aminosyresekvensen.

25

Eksempel 5

Fra plasmidet (41) (eksempel 3, fig. 3c) spaltes med restriktionsenzymerne Eco RI og Hind III DNA-sequen-tet, som koder for abe-proinsulin, og de udragende en-30 der opfyldes. Der fås DNA-segmentet (55).

Plasmidet (48) (eksempel 4, fig. 4) åbnes med Sma I og behandles med basisk kvægphosphatase. Det således fremkomne lineariserede plasmid (56) ligeres med DNA-segmentet (55) , hvorved der fås plasmidet pK -302 35 DK 172064 Bl 0 14 (57) . E. coli 294-celler transformeres med ligeringsblandingen, hvorved kloner, som indeholder det ønskede plasmid, først karakteriseres ved restriktionsanalyse og derefter ved sekvensanalyse af plasmid-DNA'et.

5 Fra plasmidet (55) spaltes med Eco RI og Hind III

segmentet (58) , som koder for 11-2 og abe-proinsulin.

Plasmidet (2) (eksempel 1, fig. 1) spaltes ligeledes med Eco RI og Hind III, og segmentet (58) ligeres i det lineariserede plasmid (3). Der fås plasmidet 10 pKH 101 (59) .

Expressionen ifølge eksempel 1 fører til et fusionsprotein, i hvilket der efter de første 96 aminosyrer af IL-2 følger et broled med 14 aminosyrer (svarende til Y i DNA-segmentet (58)), hvorefter der følger aminosyre-15 sekvensen af abe-proinsulin.

20 25 30 35 DK 172064 B1 0 15

Bilag It DNA-sekvens af interleukin-2

Triplet nr. 012 5 Aminosyre Met Ala Pro

Nucleotid nr. 1 10

Kodende streng 5» AA TTC ATG GCG CCG

Ikke-kodende streng_3J_G TAC CGC GGC

10 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 30 40

ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG

TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC

15 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 50 " 60 70

CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG

20 GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC

23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

80 90 - 100 25 ATG ATC CTG AAC GGT AT C AAC AAC TAC AAA

TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT

33 34 35 36 37 38 39 40 41 42

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 30 110 120 130

AAC CCG AAA CTG ACG C GT ATG CTG ACC TTC

TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG

35 DK 172064 B1 0 16 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52

Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160

AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA

5 TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT

53 54 55 56 57 58 59 60 61 62

Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 190

10 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG

GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC

63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 15 200 210 220

CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG

GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC

73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 20

Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250

GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG

CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC

25 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92

Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile 260 270 280

CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC

GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG

30 - 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310

GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG

CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC

35 DK 172064 B1 0 17 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112

Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340

5 TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC G AA ACT GCG

AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC

113 114 115 116 117 118 119 120 121 122

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile 10 350 360 370

ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC

TGC TAG C AA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG

123 124 125 126 127 128 129 130 131 152 15 Thr Phe Cys Gin Ser Ile Ile Ser Thr Leu 380 390 400

ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG

TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC

20 1 33 1 34 1 35

Thr 410 ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGC T 5' 25 30 35

Claims

1. Fusionsprotein, kendetegnet ved en C-terminal eller N-terminal andel, der i det væsent-5 lige svarer til de første 100 aminosyrer af interleu-kin-2, men som ikke udviser interleukin-2-aktivitet.

2. Fusionsprotein med den almene formel

10 Met - X - Y - Z eller Met - Z - Y - X (la) (Ib) hvori X i det væsentlige betyder aminosyresekvensen af de første ca. 100 aminosyrer af humant interleukin-2, 15. betyder en direkte binding eller et broled af genetisk koderbare aminosyrer, som muliggør fraspaltning af aminosyresekvensen Z, fortrinsvis, nabostillet til Z, indeholder Met, Cys, Trp, Arg eller Lys eller består af disse aminosyrer, især nabostillet til Z indeholder 20 aminosyresekvensen Asp - Pro, eller består af denne sekvens, og Z betyder en sekvens 25 af genetisk koderbare aminosyrer, fortrinsvis af et pro- insulin eller et hirudin.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af et fusionsprotein ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 30 ved, at en genstruktur, der koder for dette protein, exprimeres i en værtscelle, og fusionsproteinet skilles fra de opløselige proteiner, fortrinsvis ved centrifugering. 35 DK 172064 B1 19

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendete g-n e t ved, at værtscellen er en bakterie, fortrinsvis E. coli.

5. Anvendelse af fusionsproteinet ifølge krav 1 eller 2 eller de ifølge krav 3 eller 4 fremstillede fusionsproteiner til fremstilling af proteinet, der i det væsentlige svarer til aminosyresekvensen Z, ved kemisk eller enzymatisk spaltning. 10

6. Genstruktur, kodende for et fusionsprotein i-følge krav 1 eller 2.

7. Vektor, indeholdende en genstruktur ifølge 15 krav 6.

8. Værtscelle, indeholdende en vektor ifølge krav 7.