EA008799B1

EA008799B1 - Фармацевтический препарат для лечения шока

Info

Publication number: EA008799B1
Application number: EA200600561A
Authority: EA
Inventors: Петер Петцельбауер; Кай Цахаровски
Original assignee: Фибрекс Медикал Рисерч Энд Девелопмент Гезмбх
Priority date: 2004-06-25
Filing date: 2005-06-24
Publication date: 2007-08-31
Also published as: NZ545634A; AU2005256121A1; AU2005256121B2; HK1093308A1; IL173969A0; US20080249006A1; AU2005256121A8; BRPI0506148A; SI1691827T1; WO2006000007A1; EP1691827B1; EA200600561A1; HRP20090618T1; DE502005007926D1; ES2331958T3; CY1109631T1; JP2008503503A; ATE439856T1; CA2544676A1; PL1691827T3

Abstract

Изобретение относится к применению пептида общей формулы (I)где Rи R, будучи одинаковыми или разными, обозначают водород, насыщенную или ненасыщенную углеводородную группу, включающую от 1 до 10, в частности от 1 до 3, атомов углерода, Zобозначает гистидиновый или пролиновый остаток, Zобозначает аргининовый остаток, пептидный фрагмент или белковый фрагмент, включающий исходный аргининовый остаток, в частности включающий от 2 до 30 аминокислот. Указанный пептид обладает биологическим свойством соответствия индуцибельному компоненту Вβ-цепи (т.е. Вβ) человеческого фибрина, связывающему VE-кадгерин, для получения фармацевтического препарата для лечения шока.

Description

Предшествующий уровень техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтическому препарату для лечения шока.

Шок представляет собой острое осложнение множества патологических состояний, характеризующееся неспособностью сердечно-сосудистой системы поддерживать адекватное перфузионное давление. Инфекционные агенты могут прямо или косвенно вызывать недостаточность сердечно-сосудистой системы. Бактерии, бактериальные токсины, вирусы и последние, но не менее важные, неадекватный клеточный или гуморальный ответ организма-хозяина, включая воспаление и коагуляцию, могут приводить к потере тонуса сосудов, потере сосудистой барьерной функции, потере сократимости миокарда и потере функции органов, которые отдельно или в комбинации приводят к шоку и к смерти пациента. Лечение бактериальной инфекции основывается на антибиотикотерапии, которая убивает бактерии, но это не лечит токсинемию и не исправляет неадекватный клеточный или гуморальный ответ. У грамотрицательных бактерий липополисахарид (ЛПС или эндотоксин) является ответственным за развитие грамотрицательного шока. Грамположительные бактерии могут вызывать множественную органную недостаточность и септический шок без эндотоксемии, но клеточная стенка грамположительных бактерий также содержит токсины, такие как липотейхоевая кислота (ЬТА) и пептидогликан (РерС). ЬТА и РерС действуют синергически на высвобождение цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (ФНО) α и интерферон (ΙΡΝ)γ, для индукции 1Ν08 и, наконец, вызывают шок и органную недостаточность.

Эндотоксемия, сепсис и септический шок ассоциированы с образованием избыточных количеств оксида азота (N0). Избыточная вазодилатация и гипореактивность сосудов на вазопрессорные агенты, ассоциированные с циркуляторным шоком, могут быть обращены ингибиторами индуцибельной изоформы N0 синтазы (1Ν08) (8ои1йап апб 8хаЬо. Вюсйеш. Рйагшасо1. 1996; 51:383-94, ТЫешегшапп Сеп Рйагшасо1. 1997; 29:159-66), однако ингибиторы 1Ν08 не уменьшают повреждения органов, вызванного токсинами (\7гау е! а1. 81юск. 1998; 9:329-335).

Лечение шока, вызванного вирусными инфекциями, является даже большей проблемой, так как противовирусные лекарственные средства не эффективны в отношении большинства инфекций. Лечение, имеющее целью устранить только инфекционный агент, является недостаточным у пациентов с шоком изза инфекционного агента, так как вторичные события, вызываемые инфекционным агентом, включающие воспалительную реакцию и нарушения в системе коагуляции, могут стать независимыми и привести к смерти пациента, независимо от вопроса, был ли причинный агент нейтрализован или нет. Специфическое лечение является недоступным, следовательно, употребляемые методики имеют цель облегчить симптомы, которые включают в себя механическую вентиляцию, замещение жидкости, применение кардиоактивных лекарственных средств, четкий контроль насыщения кислорода, гемоглобина, глюкозы и функции почек. Регуляция только воспалительной реакции, например, высокими дозами стероидов или ингибирование коагуляции антитромбином не дают улучшения выживаемости. Единственной молекулой, для которой до настоящего времени доказана заметная эффективность в уменьшении смертности, является активированный протеин С, который взаимодействует с коагуляцией/фибринолизом и процессами воспаления.

Шок во время течения инфекции главным образом ассоциирован с явными или неявными изменениями фибриногена плазмы, сопровождаемыми образованием фибрина и повышением фрагментов фибрина. Такая активация свертывания крови, а также фибринолитических путей может привести к явному или неявному диссеминированному внутрисосудистому свертыванию (ДВС), приводящему к окклюзии сосудов и повреждению органа, питаемого этими сосудами, и из-за потребления факторов свертывания крови может привести к кровотечению. Сепсис является наиболее частой причиной ДВС. Важно что, фибриноген, фибрин и фрагменты фибрина не только играют роль в свертывании крови, но имеют несколько участков связывания для клеточных белков и белков матрикса, которые позволяют им взаимодействовать с лейкоцитами, тромбоцитами, эндотелиальными клетками и структурами матрикса. Это приводит к активации клеток, миграции клеток, высвобождению цитокинов и, наконец, к воспалительной реакции. Роль фибриногена или фибрина в воспалении является достаточно документированной (АШеп. ТйгошЬ. Наеток!. 82:781-786; Нетск е! а1. 1п!. 1. Вюсйеш. Се11. Вю1. 31:741-46). Ό-участок молекулы содержит много связывающих участков для молекул матрикса, эндотелиальных клеток, тромбоцитов и воспалительных клеток. Е-участок фибрина связывается с СЭ11с (Ьо1ке е! а1. Ргос. №11. Асаб. 8ск И8А. 88:1044-48).

Авторами предложена новая роль для последовательности фибрина ВЗ_!5-42 в воспалении (\70 02/48180). Такая последовательность также расположена в Е-участке фибрина и является активной только тогда, когда отщепляется фибринопептид. Фрагменты фибрина, содержащие такую последовательность на их свободном Ν-конце β-цепи, связываются с эндотелием и вызывают воспаление, и пептид, соответствующий аминокислотам В31_5-42-цепи фибрина, блокирует связывание фрагментов фибрина с эндотелиальной поверхностью и воспаление ш уйго (\70 02/48180). 1п у1уо такой пептид предотвращает воспаление миокарда и уменьшает размеры инфаркта миокарда в ситуациях ишемии/реперфузии (\70 02/48180).

- 1 008799

Фрагменты фибрина появляются в любой ситуации нарушенного образования фибрина и нарушенного фибринолиза. Особенно в ситуациях шока из-за инфекционного агента такое нарушенное образование фибрина и фибринолиз являются главной проблемой. Для множества заболеваний документирована прямая корреляция между исходом и нарушением образования фибрина/фибринолиза. Например, лихорадка денге (уап Оогр е! а1. I. Мед. У1го1. 2002; 67:549-54, Ма1гийи е! а1. Бапсе! 1п£. Όίδ. 2003; 3:33-41). Респираторный дистресс-синдром взрослых (ΆΚΌ8) представляет собой форму острого повреждения легких, которое характеризуется распространенным внесосудистым отложением фибрина (1де11. Ат. I. Кезрп. Мед. 2002; 1:383-91). Тромбоз легочных сосудов и диссеминированное внутрисосудистое свертывание также наблюдали в связи с АКО8.

Причины устойчивости/мирового возникновения лихорадки денге (ЭР) и геморрагической лихорадки денге (ΏΗΡ) как важной проблемы общественного здравоохранения являются комплексными, мера борьбы с переносчиками не была успешной для устранения ΏΡ/ΏΗΡ. В настоящее время главными точками бюджетного финансирования исследований денге (оцененного как 15 млн долларов США в 2001 г.) являются молекулярная эпидемиология, иммунная патофизиология, испытание открытия второго поколения вакцин и новые или улучшенные подходы к борьбе с переносчиками инфекции.

Несколько вакцин-кандидатов проходят клинические испытания в США и Таиланде, однако на мировом рынке все еще не существует лекарственного средства для лечения зараженных пациентов, хуже того, в настоящее время не развивается деятельность по исследованию и разработке коммерческой химиотерапии. Всемирная организация здравоохранения опубликовала стратегические направления для борьбы с ΏΡ/ΏΗΡ, которые в качестве первоочередных задач включают в себя разработку противовирусных средств, направленных на протеазу или на другие, менее изученные ферменты; разработку антимедиаторов, направленных на причины повышенной сосудистой проницаемости или нарушенный гемостаз.

Сущность изобретения

Изобретение относится к применению пептида общей формулы (I) оО

II(I)

Ν—СН₂—С—Ζι—Ζ₂

К₂ где К₁ и К₂, будучи одинаковыми или разными, обозначают водород, насыщенную или ненасыщенную углеводородную группу, включающую в себя от 1 до 10, в частности от 1 до 3, атомов углерода;

Ζ₁ обозначает гистидиновый или пролиновый остаток;

Ζ₂ обозначает аргининовый остаток, пептидный фрагмент или белковый фрагмент, содержащий исходный аргининовый остаток, в частности включающий в себя от 2 до 30 аминокислот.

Указанный пептид обладает биологическим свойством соответствия индуцибельному фрагменту, Врцепи (т.е. Вр_15-42) человеческого фибрина, связывающему УЕ-кадгерин, для получения фармацевтического препарата для лечения шока.

Предпочтительно используется пептид общей формулы (II) оО

II(П) _χΝ—СН₂—С— Ζ!— Агд—Ζ₃—Ζ₄—Ζ₅

Κ₂ где Ζ1 обозначает гистидиновый или пролиновый остаток,

Агд обозначает аргининовый остаток,

Ζ3 обозначает пролиновый или валиновый остаток,

Ζ4 обозначает лейциновый или валиновый остаток,

Ζ5 обозначает пептидный фрагмент или белковый фрагмент, в частности, содержащий от 2 до 30 аминокислот, или спиртовую группу, включающую в себя от 1 до 10, в частности от 1 до 3, атомов углерода, или остаток органического или неорганического основания.

Более того, предпочтительно используют пептид, в котором Ζ₅ представляет собой пептидный фрагмент, полученный из альфа-цепи или Вр-цепи фибрина.

Более того, предпочтительно используют пептид, в котором

Ζ5 представляет собой пептидный компонент, содержащий аминокислотную последовательность

Азр Буз Буз Агд О1и О1и А1а Рго 8ег Беи Агд Рго А1а Рго Рго 11е 8ег О1у О1у О1у Туг Агд,

Ζ1 представляет собой гистидиновый остаток,

Агд представляет собой аргининовый остаток,

Ζ3 представляет собой пролиновый остаток,

Ζ4 представляет собой лейциновый остаток.

Ζ5 представляет собой пептидный фрагмент, содержащий последовательность аминокислот О1и Агд Н1з О1п 8ег А1а Суз Буз Азр 8ег Азр Тгр Рго РЬе Суз 8ег Азр О1и Азр Тгр Азп Туг Буз, Ζ1 представляет собой пролиновый остаток, Агд представляет собой аргининовый остаток,

- 2 008799

Ζ₃ представляет собой валиновый остаток,

Ζ₄ представляет собой валиновый остаток.

Кроме того, изобретение относится к применению пептида, который имеет Ν-концевую последовательность С1у-Н1з-Агд-Рго-Ееи-Азр-Еуз-Еуз-Агд-С1и-С1и-А1а-Рго-8ег-Ееи-Агд-Рго-А1а-Рго-Рго-Рго-11е-8егС1у-С1у-С1у-Туг-Агд и биологическое свойство соответствия индуцируемому фрагменту, связывающему УЕ-кадгерин на ββ-цепи (т.е. Вв_!5-42) человеческого фибрина для получения фармацевтического препарата для лечения шока.

Следующий предпочтительный вариант воплощения применения по изобретению отличается тем, что пептидом является С1у-Н18-Агд-Рго-Ьеи-А8р-Ьу8-Ьу8-Агд-С1и-С1и-А1а-Рго-8ег-Ьеи-Агд-Рго-А1а-РгоРго-Рго-11е-8ег-С1у-С1у-С1у-Туг-Агд.

Было показано, что, в частности, шоковые состояния могут быть вылечены вышеупомянутыми пептидами, где шок ассоциирован с одной или более из группы, содержащей бактериальные токсины, диссеминированную сосудистую коагулопатию, некротизирующий фасциит, геморрагический шок после вирусной инфекции, в частности, вызываемой Д1оу1гиз, агепаушбае, Ьипуаушбае, Πηνίνίπίδ. денге, острую геморрагическую дыхательную недостаточность, вызванную инфекционными агентами или аутоиммунными заболеваниями, органную недостаточность после повреждения органа, в частности инфаркта миокарда, сосудистое хирургическое вмешательство, фиксацию органов, геморрагический шок, инфаркт легкого, инфаркт печени, инфаркт кишечника, хирургические вмешательства и инсульт, и органную дисфункцию пересаженных органов.

Подробное описание изобретения

Пептиды и белки.

Пептиды получали твердофазным пептидным синтезом и очищали ВЭЖХ с обратной фазой с использованием нуклеозильной колонки 100-10С18 (Р1Сйет, Стах, Аиз!па). Необходимо отметить, что в_15-42-участок является на 100% подобным среди видов, когда делают поправку на замещения консервативных аминокислот. Ν-концевой дисульфидный узел фибриногена (ΝΏ8Κ), состоящий из аминокислот Аа1-51, Εβ 1-118 и γ1-78, получали, как описано ранее (\УО 02/48180). Ν-концевой дисульфидный узел фибрина (ΝΏ8Κ-ΙΙ, в котором отсутствуют фибринопептиды А и В), состоящий из аминокислот Аа17-51, Вв15-118 и γ1-78, получали обработкой ΝΏ8Κ тромбином (20 ед./1 мг ΝΌ8Κ) в течение 3 ч при 37°С. Остаточный тромбин нейтрализовали 10 мМ диизопропилфторфосфатом (Р1ика, МДгаикее, XVI) в течение 2 ч при 37°С. Затем все продукты диализировали в фосфатном буферном растворе (РВ8).

ЕЫ8А.

Пептид Ββ_15-42 связывается с УЕ-кадгерином.

Взаимодействие Вв-цепи 03βι_5-42) фибрина с эндотелиальными клетками вызывает морфологические изменения (Випсе е! а1. 1. С1ш. 1пуез!. 89:842-50; Васй е! а1. Ехр. Се11 Кез. 238:324-34; С11а1иро\\зсх е! а1. 1. Се11 Вю1. 130:207-15; НатадисЫ е! а1. В1ооб. 81:2348-56; Егапс1з е! а1. В1ооб се11з 19:291-306), пролиферацию (8ротп е! а1. В1ооб. 86:1802-10), высвобождение фактора фон Виллебранда (К1Ьез е! а1. 1. С11п. 1пуез!. 79:117-23, КтЬез е! а1. 1. С1ш. 1пуез!. 84:435-42; ЕгЬап апб Vадпе^, 1. Вю1. Сйет. 267, 2451-58) и возможно ИЛ-8 е! а1. В1ооб. 90:3593-3602) и мембранную экспрессию СИ54 (Наг1еу е! а1. Аг! ТйготЬ. Уазс. Вю1. 20:652-658). УЕ-кадгерин был идентифицирован как связывающий лиганд последовательности Вв1_5-42, и были разработаны ЕБ18Л для демонстрации такого взаимодействия эндотелиальных клеток и/или УЕ-кадгерина с фибрином или фрагментами фибрина. МагЦпех е! а1. использовали противокюветные антитела к кадгерину для захвата кадгеринов из эндотелиальных клеток после инкубации с фибрином (МагЦпех е! а1. Апп ΝΥ Асаб. 8сЕ 936:386-405), на монослои НИУЕС (которые экспрессируют УЕкадгерин) накладывали меченные радиоактивным лигандом фрагменты пептида В β_45-42 (Васй е! а1. 1. Вю1. Сйет. 273:30719-28; Наг1еу е! а1. Аг!. ТйготЬ. Уазс. Вю1. 20:652-658) и использовали рекомбинантный УЕ-кадгерин(Сог1а!оу и Мебуеб. Вюс11еппз1гу. 41:4107-16). Другие использовали ЕЫ8А для обнаружения фрагментов фибрина в крови, преимущественно с использованием антител к отдельным последовательностям в молекуле фибриногена, включая антитела против компонента В βι_5-42 (описано в Еагееб е! а1. С11п. (Лет. 8:1845-53).

Авторы разработали модифицированный ЕЫ8А, работающий по таким же принципам, описанным другими, но целью рассмотренного здесь ЕЫ8А является не определить количество продуктов деградации фибрина, а обнаружить белки, пептиды или соединения, которые вмешиваются в связывание последовательности Вв_15-42 и УЕ-кадгерина. Принцип состоит в том, что УЕ-кадгерину как усеченному белку и как цельному белку или сшитому с другими белками, которые не вмешиваются в участок связывания Вв15_-42, позволяют взаимодействовать с Вв_15-42 последовательностью фибрина. В эту систему можно ввести любое другое дополнительное вещество и измерить, ингибирует ли это вещество связывание УЕ-кадгерина/В β_!5-42.

Подробно, 96-луночные планшеты с иммобилизованным белком (Ех1цоп, УебЬаек, ΌΚ) покрывали рекомбинантным человеческим сшитым белком УЕ-кадгерином ЕС (8 нМ/мл; К & Ό 8уз!етз, М1ппеаро11з) в РВ8 и оставляли на ночь при 4°С. Затем планшеты промывали и инкубировали с пептидом Вв_15-42(СНКР^^ΚΚКЕЕАР8^КРАРРРI8СССΥК), меченным ЕЬАС-последовательностью (ΌΥΚΌΌΌΌΚ) на С- 3 008799 конце пептида, или с ЕБАСг-меченным произвольным пептидом (ϋΚΟΑРАНКРРКСР18(тК8ТРЕКЕКЬЕР(т) в концентрации 0-80 мкмоль. После промывания связанный ЕБАСгмеченный пептид определяли инкубацией с анти-ЕБАС антителом, меченным пероксидазой (81§ша, 8ΐ. Бошз, США) и хромогенным субстратом. Оптическую плотность определяли посредством спектрофотометра для чтения планшетов ЕЫ8А, установленного на длину волны 450 нм. Данные представляют собой среднее трех независимых экспериментов, каждый проведенный три раза. В табл. 1 показано, что пептид Ββΐ5_4₂ связывается с УЕ-кадгерином образом, зависимым от концентрации. Наоборот, произвольный пептид демонстрировал только незначительное связывание.

Таблица 1

Дозозависимое связывание пептида Ββι₅_4₂ с УЕ-кадгерином

мкМ		0	0,23	0,7	2,3	7	14	21	35	46	70
15-42 РЬАО	среднее	0	0,01	0,02	0,08	0,33	0,92	1,3	1,5	1,93	2,1
	8ϋ	0	0,01	0,01	0,03	0,17	0,19	0,2	0	0	0

Произвольный ЕБАСг	среднее	0	0,01	0	0,01	0,03	0,12	0,2		0,35	0,5
	8ϋ	0	0,01	0	0,01	0,02	0,04	0,1		0	0

Пептид Ββ₁₅.₄2 и фрагменты фибрина соревнуются в связывании с УЕ-кадгерином.

На следующей стадии авторы анализировали, может ли этот ΕΕΙ8Α быть использован для отсеивания других пептидов/соединений для конкуренции со связыванием последовательности Ββ₁₅.₄2 с УЕкадгерином. Как ожидали, пептид Ββι₅_4₂ полностью ингибировал связывание ЕБАСт-меченного пептида Ββΐ5_42, и его использовали в качестве положительного контроля, и произвольные пептиды или растворитель не имели эффекта и их использовали в качестве отрицательного контроля. Более короткие пептиды частично ингибировали связывание Ββ₁₅.₄2 с УЕ-кадгерином. ΝΏ8Κ-ΙΙ ингибировал связывание Вбета15.42 образом, зависимым от концентрации. Равновесия между Ββι₅_4₂ и ΝΏ8Κ-ΙΙ (50% ингибирование) достигали в молярном соотношении 24: 1. ΝΏ8Κ имел небольшой эффект или не имел его.

УЕ-кадгерином покрывали пластиковую поверхность в концентрации 8 нМ. Затем указанные пептиды добавляли в концентрациях 200 мкМ, Νϋ8Κ или ΝΏ8Κ-ΙΙ добавляли в указанных концентрациях. Определение связывания ЕБАСт-меченного Ββ₁₅_4₂(12 мкМ) проводили, как описано выше.

Таблица 2

Блокирующий реагент % ингибирования связывания

15-42ГЬАС с УЕ-кадгерином среднее + 30

пептид	15-42	(28мер)			100 ± 10
Произвольный	пептид	[4мер)	3±3
Произвольный	пептид	(28мер)	10 + 3
Растворитель				0 ± 0
пептид	15-18	(4 мер)	200	мкМ	65 + 12
пептид	15-26	(12мер)	200	мкМ	64 ± 10
пептид	15-30	(16мер)	200	мкМ	61 ± 13
пептид	15-34	(2Омер)	200	мкМ	67 ± 17
пептид	15-37	(24мер)	200	мкМ	17 ± 19
пептид	16-42	(27мер)	200	мкМ	55 ± 13
пептид	15-18	(4мер)	12 мкМ	7 + 2
пептид	15-26	(12мер)	12	мкМ	6 ± 1
пептид	15-30	(16мер)	12	мкМ	6 ± 3
пептид	15-34	(2Омер)	12	мкМ	7 ± 1

-4008799

пептид 15-37	(24мер)	12 мкМ
пептид 16-42	(27мер)	12 мкМ
ΝΟΞΚ-ΙΙ 0,06	мкМ
ΝϋΒΚ-ΙΙ 0,12	мкМ
Νϋ3Κ-ΙΙ 0,20	мкН
Ν03Κ-ΙΙ 0,60	мкМ

ΝΟΞΚ-ΙΙ 1,2 мкМ

ΝϋΞΚ-ΙΙ 2,4 мкМ

ΝϋΒΚ-ΙΙ 4,0 мкМ

Ν05Κ	0,06	мкМ
ΝΡ3Κ	0, 12	мкН
Ν03Κ	0,20	мкН
ЦЦЗК	0,60	МКМ

Νϋ5Κ 1,2 мкМ

Νϋ3Κ 2,4 мкМ «03Κ 4,0 мкМ анти-УЕ-кадгерин АЬ (ТЕА1/31, мг/мл)

39	+	18
42	+	14
52	+	16
63	+	13
79	-ь	9
82	+	12

+ 0 + 1 + 1 + 6 + 13 + 9 + 10 + 1

Эффективность пептида Ββι5.42 для лечения мышей, зараженных вирусом денге.

Материалы и методы.

Вирус. Вирус денге типа 2 (ϋΕΝ-2), штамм Р23085, получали из Государственной коллекции вирусов, Россия, Москва в форме инфицированной лиофилизированной суспензии головного мозга мышей 1СЯ. Полученный вирус денге подвергали пассажам в головном мозге новорожденных мышей 1СЯ, как описано ранее (АЧабйеибкауа с) а1. ЕЕМБ 1ттипо1о§у апй Мей1са1. М1сгоЫо1о§у. 35, 33-423). 10% суспензия головного мозга служила в качестве запаса вируса и хранилась при -40°С. Титр вируса определяли серийными разведениями суспензии головного мозга. Суспензию головного мозга вносили интраперитонеально (и.п.) в группах из 10 мышей (4-недельные ВАЕВ/с) каждая и записывали смертность. Титр вируса рассчитывали, и он был 7,41§ Ш50/мл. Все работы с инфекционным вирусом проводили в лаборатории с максимальным защитным уровнем биобезопасности-3 (В§Ь-3) НРЦ ВБ «Вектор» (Россия).

Животные.

Четырехнедельных инбредных самцов мышей ВАЕВ/с (гаплотип Н-2й) получали из вивария Национального исследовательского центра вирусологии и биотехнологии «Вектор». Животных помещали в отдельные клетки с неограниченным доступом к пище и воде.

Анализы.

Кровь брали у мышей под анестезией метоксифлураном из полости орбиты перед инфекцией и после воздействия ϋΕΝ-2. Троих мышей использовали в каждой временной точке для получения крови.

Циркулирующие тромбоциты (РЬТ), эритроциты (ВВС), лейкоциты (АВС), гемоглобин (НОВ) и гематокрит (НСТ) определяли с использованием анализатора гематологии СсП-Эуп 900 (8сс|ио1а-Тигпсг со грога! ίο и, США, СА).

Часть собранной крови центрифугировали для получения сыворотки, которую хранили при -80°С до конца эксперимента. Уровни цитокинов в сыворотке измеряли с использованием наборов для иммуноферментного анализа, создаваемых В & Э Бу8!еш8 (КИппеаройб, США) в соответствии с инструкциями производителя. Пределы обнаружения были следующие: ФНО-α менее 5,1 пг/мл; интерлейкин (ИЛ)-1р - 3,0 пг/мл; ИЛ-6 - 3,1 пг/мл; ИФНу - менее 20 пг/мл.

Вирус денге в крови животных определяли ОТ-ПЦР, как описано ранее (Нагле е! а1. 1. СНи. М1сгоЫо1. 36, 2634-2639). Общую РНК из крови выделяли с использованием набора от Ошалей (Германия). Праймеры были следующие: верхний 5'ААТАТССТСАААССССАСАСАААССС (положение 136-161), нижний 5'ААССААССССАССААССССАТС (положение 237-258), амплифицируя продукт 119 пн. Для количественной оценки вирусной нагрузки ϋΕΝ-2 титровали на культуры клеток Уего Е6, как описано ранее (Нагле е! а1.1. СНи. М1сгоЫо1. 36, 2634-2639). В день 0 и 22 после инфицирования кровь выживших мышей анализировали на ;ιητιι-ΟΕΝ-2 антитела (1§С) посредством ЕЫБА, как описано ранее (Щпа!у см е! а1.1. Вю!ес1шо1о§у. 44, 111-118).

Схема эксперимента.

Инбредных четырехнедельных мышей самцов ВАЕВ/с делили на 6 основных групп. Каждая группа содержала 50 мышей. Всех животных инфицировали интраперитонеально адаптированным для мышей штамма ϋΕΝ-2 Р23085 (как описано выше) с дозой 1 ЬО50 и исследовали ежедневно в отношении при

-5008799 знаков заболеваемости. Мышей из первых подгрупп всех основных групп (А1-Р1) использовали для контроля смертности. Каждая подгруппа содержала 20 мышей. Животных из вторых подгрупп (А2-Р2) использовали для получения образцов сыворотки. Каждая подгруппа содержала 30 мышей.

Описание группы, п=50 в каждой группе.

Контрольная группа получала только вирус.

Лечение пептидом Вр_15-42 проводили два раза в сутки, 4800 мкг/кг каждое внутрибрюшинной инъекцией от дня 3 после инфицирования до дня 8 после инфицирования. Образцы крови и сыворотки получали в выбранные временные точки: день 1, 3, 5, 7, 11, 22 после инфицирования.

Статистический анализ проводили с использованием ΐ-критерия Стьюдента или теста Хи-квадрат, р<0,05 расценивали статистически значимыми.

Таблица 3

Смертность и титр 1§С, р<0,05 между группами

Группа\^	смертность (%)	Выживаемость (%)	Среднее время до смерти	Титр 1дС
нелеченные	40	60	6,800+0,245	1:160
Ββ15-42	0	100	Все мыши выжили	1:20

Таблица 4

	Контроль	Леченные Ββΐ5-₄₂
	день 3	5	7	день 3	5	7
Гемоглобин г/мл	14	10	10	15	10	15
Гематокрит %	15	22	35	15	33	43
ФНО пг/мл	33	71	65	32	65	45
ИЛ-6 пг/мл	210	210	150	140	110	100
ИЛ-1 пг/мл	32	55	59	32	29	28

Таблица 5

Вирусемия 1д БОЕ/мл

Грамотрицательный шок.

Самцы крыс Ш1813Г, весящие 230-280 г, содержались в виварии (Университет Дюссельдорфа) и получали стандартное питание и воду без ограничений. Все процедуры проводили в соответствии с руководствами ААЛРАС и Сниде Гог 11зе Саге апд Изе оГ БаЬога1огу Ашта1з (Эераг1теп1 оГ 11еа111з апд Нитап 8егу1сез, Ыа11опа1 1пз11'1и1ез оГ Неа11й, РиЬНсайоп Ыо. 86-23). Кроме того, все эксперименты были одобрены этической и исследовательской коллегией Университета Дюссельдорфа и округа. Как описано ранее (/.асКаго\\ък1 е1 а1. Сгй. Саге Мед. 2000, /,асКаго\\ък1 е1 а1. Сгй. Саге Мед. 2001; 29:1599-1608), крыс анестезировали тиопентоном натрия (120 мг/кг и.п.) и анестезию поддерживали дополнительными дозами тиопентона натрия по требованию.

Трахею катетеризировали для облегчения дыхания и ректальную температуру поддерживали на уровне 37°С с помощью гомотермического одеяла. Правую сонную артерию катетеризировали и соединяли с датчиком давления для измерения фазового и среднего артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС), которые отображались на регистрирующей системе (МасБаЬ 8-е, АРЭ1 1п81гитеп1з, Германия), встроенной в компьютер 1ВМ. Правую яремную вену катетеризировали для введения лекарственных средств. Мочевой пузырь также катетеризировали для облегчения тока мочи и для

- 6 008799 предотвращения возможности развития острой почечной недостаточности. Все животные получали общее замещение жидкости 1,0 мл/кг/ч (0,9% хлорида натрия, физиологический раствор, в виде в/в инфузии в яремную вену) на протяжении эксперимента. После завершения хирургического вмешательства сердечно-сосудистым параметрам позволяли стабилизироваться в течение 15 мин и постоянно записывали в течение 6 ч. В такой модели индуцированной ЛПС полиорганной недостаточности период 6 ч является необходимым для достижения значительного повышения уровня АсТ и АлТ в сыворотке, тогда как значительное повышение уровня мочевины и креатинина в сыворотке уже можно наблюдать через 2 ч.

Исследовали три группы.

Крыс подвергали ложной операции: (симуляция).

Крыс подвергали грамотрицательному шоку. Липополисахарид Е. сой, серотип 0,127:В8 (6 мг/кг в/в) вводили в течение 5 мин в/в, через 1 ч животные получали солевой раствор (2,4 мл/кг): (ЛПС+солевой раствор).

Крыс подвергали грамотрицательному шоку. Липополисахарид от Е. сой, серотип 0,127:В8 (6 мг/кг в/в) вводили в течение 5 мин в/в, животные получали Вр_15-42 (2,4 мг/кг): (ЛПС+Вр_15-42).

Таблица 6

Выживаемость п=20 в каждой группе, р<0,05

Симуляция	ЛПС плюс солевой раствор	ЛПС ПЛЮС Ββΐ5-42
100%	25%	88%

Через 6 ч после индукции грамотрицательного шока собирали кровь из катетера, помещенного в правую сонную артерию. Образцы крови центрифугировали (1610хд в течение 3 мин при комнатной температуре) для отделения плазмы. Следующие маркерные ферменты измеряли в плазме как биохимические индикаторы множественного органного повреждения/дисфункции:

Повреждение печени оценивали, измеряя повышение уровня в плазме аланинаминотрансферазы (АлТ, специфического маркера повреждения паренхимы печени) и аспартатаминотрансферазы (АсТ, неспецифического маркера повреждения печени).

Дисфункцию почек оценивали, измеряя повышение уровня в плазме мочевины (индикатора нарушенной экскреторной функции почек и/или повышенного катаболизма) и креатинина (индикатора сниженной скорости клубочковой фильтрации и, следовательно, дисфункции почек). Уровень в плазме глюкозы и амилазы измеряли как непрямые маркеры функции и повреждения поджелудочной железы.

Кроме того, измеряли артериальное рО2 как непрямой маркер функции/повреждения легких. Лабораторные значения приведены в табл. 7.

Таблица 7

Лабораторные значения

	Симуляция	Контроль	Ββ15-42
АлТ	39, 8	542,3	261, 9
5 ЕМ	5,2	117,2	42,7

АсТ	194,1	908,8	529, 0
ЗЕМ	30, 8	140,9	75,7

Креатинин	0,5	0,9	0,6
ЗЕМ	0,0	0,1	0,1
Мочевина	49,1	123,2	107,8
ЗЕМ	5, 8	4,6	5,9
Глюкоза	131,5	75,3	45,8
ЗЕМ	7,5	5,4	9,1
Амилаза	1713,3	1837,4	1945,1
ЗЕМ	131,5	122,7	176, 8

рО₂	90,0	67,0	98,7
ЗЕМ	1,8	3,7	8,2

- 7 008799

Таблица 8

Среднее артериальное давление

Время	симуляция	ЛПС	ЛПС + ^Ββ15-42

(ч)	среднее	5 ЕМ	среднее	5 ЕМ	среднее	ЗЕМ
0	120,9	5,5	118,9	5,4	128,9	5,2
1	111,5	10, 6	90,7	5, 5	83,7	4,6
2	113,2	7,3	100,2	5,1	102,3	4
3	116,4	5,4	90	7,4	103,2	4
4	108,7	8,9	81,1	7,9	101,2	3
5	104,1	9,6	60,1	10, 8	97,1	5,4
6	104,1	9,6	34,1	7,7	107,7	9,6

Таблица 9

Частота сердечных сокращений

время	Симуляция	ЛПС	ЛПС
					Ββ15-42
(ч)	Среднее	ЗЕМ	среднее	ЗЕМ	среднее	ЗЕМ
0	482,2	17	457	18,1	436, 9	6,4
1	461,7	12,1	511,2	27,4	484,8	18,6
2	488,1	13, 6	523,3	27,3	484,1	10,3
3	506, 6	26, 6	518,5	24,9	509,8	12
4	488,9	17,4	516,7	32,1	516,7	13,4
5	470,4	13, 9	515,5	26,1	533, 7	30,7
6	443,7	0,7	530,1	27,7	541, 6	24,4

Биопсии органов (легкие, печень, сердце и почки) всех исследуемых групп брали в конце эксперимента и фиксировали в буферизованном растворе формальдегида (4% в фосфатном буферном растворе) при комнатной температуре и посылали в Вену. Стандартные окрашенные гематоксилином и эозином сечения не выявили различий. В сечениях, окрашенных на отложения фибрина с использованием кислого фукцина - оранжевого С, авторы обнаружили значительно повышенное количество фибриновых тромбов в контрольной группе, получавшей только ЛПС, по сравнению с животными, получавшими лечение ЛПС плюс В31_5-42 (р<0,05). У животных, леченных симуляционно, не присутствовали фибриновые тромбы.

Таблица 10 Среднее количество фибриновых тромбов в сосудах

	ЛПС плюс солевой раствор	ЛПС ПЛЮС Ββΐ5-42
Сердце	28 + 13	5 + 2
Почки	17 + 8	2 + 9
Печень	47 + 41	78 + 37
Легкие	1,7 + 1	1 + 0

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims

1. Применение пептида общей формулы I о о

II (I) _χΝ—СН₂—С——Ζ₂

К₂ где К₁ и К₂, будучи одинаковыми или разными, обозначают водород, насыщенную или ненасыщенную углеводородную группу, включающую от 1 до 10, в частности от 1 до 3, атомов углерода,

Ζ₁ обозначает гистидиновый или пролиновый остаток,

Ζ₂ обозначает аргининовый остаток, пептидный фрагмент или белковый фрагмент, включающий исходный аргининовый остаток, в частности, содержащий от 2 до 30 аминокислот, указанный пептид обладает биологическим свойством соответствия индуцибельному фрагменту Вв-цепи

- 8 008799 (т.е. Ββΐ5.₄₂) человеческого фибрина, связывающему УЕ-кадгерин, для получения фармацевтического препарата для лечения шока.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что пептид имеет общую формулу II оо

II(П) _ΖΝ—СН₂—с— Ζ!— Агд— Ζ₃—Ζ₄—Ζ₅

К₂ где Ζ₁ обозначает гистидиновый или пролиновый остаток,

Агд обозначает аргининовый остаток,

Ζ₃ обозначает пролиновый или валиновый остаток,

Ζ₅ обозначает пептидный фрагмент или белковый фрагмент, в частности, включающий от 2 до 30 аминокислот, или спиртовую группу, включающую от 1 до 10, в частности от 1 до 3, атомов углерода, или остаток органического или неорганического основания.

3. Применение по п.2, отличающееся тем, что Ζ₅ представляет собой пептидный фрагмент, полученный из Аа-цепи фибрина.

4. Применение по п.2, отличающееся тем, что Ζ₅ представляет собой пептидный фрагмент, полученный из Вв-цепи фибрина.

5. Применение по п.2, отличающееся тем, что

Ζ₅ представляет собой пептидный фрагмент, включающий последовательность аминокислот Азр Руз Руз Агд С1и С1и А1а Рго 8ег Реи Агд Рго А1а Рго Рго 11е 8ег С1у С1у С1у Туг Агд,

Ζ3 представляет собой пролиновый остаток и

Ζ4 представляет собой лейциновый остаток.

6. Применение по п.2, отличающееся тем, что

Ζ₅ представляет собой пептидный фрагмент, включающий последовательность аминокислот С1и Агд Ηΐδ С1п 8ег А1а Суз Руз Азр 8ег Азр Тгр Рго Рйе Суз 8ег Азр С1и Азр Тгр Азп Туг Ьуз,

Ζ1 представляет собой пролиновый остаток,

Ζ3 представляет собой валиновый остаток и

Ζ4 представляет собой валиновый остаток.

7. Применение пептида, который содержит Ν-концевую последовательность С1у-Н1з-Агд-Рго-ЕеиАзр-Еуз-Еуз-Агд-С1и-С1и-А1а-Рго-8ег-Ееи-Агд-Рго-А1а-Рго-Рго-Рго-11е-8ег-С1у-С1у-С1у-Туг-Агд, указанный пептид обладает биологическим свойством соответствия индуцибельному фрагменту Ββ-цепи (т.е. Вв_15-42) человеческого фибрина, связывающему УЕ-кадгерин, для получения фармацевтического препарата для лечения шока.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что пептидом является С1у-Н1з-Агд-Рго-Ееи-Азр-Еуз-ЕузАгд-С1и-С1и-А1а-Рго-8ег-Ееи-Агд-Рго-А1а-Рго-Рго-Рго-11е-8ег-С1у-С1у-С1у-Туг-Агд.

9. Применение по любому из пп.1-8, где шок связан с одним или более из группы, включающей бактериальные токсины, диссеминированную внутрисосудистую васкулопатию, некротизирующий фасциит, геморрагический шок после вирусной инфекции, в частности, вызванной Рйоупиз, агепауитбае, Ьипуауитбае, Пау1У1гиз, денге, острую геморрагическую дыхательную недостаточность, вызванную инфекционными агентами или аутоиммунными заболеваниями, органную недостаточность после повреждения органов, в частности инфаркта миокарда, сосудистое хирургическое вмешательство, фиксацию органов, геморрагический шок, инфаркт легких, инфаркт печени, инфаркт кишечника, хирургические вмешательства и инсульт и органную дисфункцию пересаженных органов.