EA009528B1 - Пептид (варианты), содержащая его композиция и лекарственный препарат для профилактики и лечения атеросклероза - Google Patents

Abstract

В данном изобретении представлены новые пептиды, которые уменьшают интенсивность по крайней мере одного симптома атеросклероза. Пептиды являются высокостабильными и их легко вводить перорально.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области биорганической химии, фармакологии и медицины, более конкретно, к разработке лекарственных средств для профилактики и лечения атеросклероза. В частности, данное изобретение имеет отношение к идентификации класса пептидов, которые уменьшают интенсивность по крайней мере одного симптома атеросклероза.

Уровень техники

Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной заболеваемости и смертности, в особенности в Соединенных Штатах и странах Западной Европы. В развитии сердечно-сосудистого заболевания участвуют несколько этиологических факторов, включая наследственную предрасположенность к заболеванию, пол, факторы, связанные с образом жизни, такие как курение и питание, возраст, гипертензия и гиперлипидемия, в том числе гиперхолестеринемия. Некоторые из данных факторов, особенно гиперлипидемия и гиперхолестеринемия (высокие концентрации холестерина в крови) представляют собой существенный фактор риска, связанный с атеросклерозом.

Холестерин присутствует в крови в виде свободного (неэтерифицированного) и этерифицированного холестерина в липопротеиновых частицах, обычно называемых хиломикронами, липопротеинах очень низкой плотности (УЕОЕ), липопротеинах низкой плотности (ΕΌΕ) и липопротеинах высокой плотности (НОЬ). На концентрацию общего холестерина в крови влияют (1) всасывание холестерина из пищеварительного тракта, (2) синтез холестерина из компонентов пищи, таких как углеводы, белки, жиры и этанол, и (3) удаление холестерина из крови тканями, особенно печенью, и последующее превращение холестерина в желчные кислоты, стероидные гормоны и желчный холестерин.

На поддержание концентраций холестерина в крови воздействуют генетические факторы и факторы окружающей среды. Генетические факторы включают в себя концентрацию ферментов, ограничивающих скорость в биосинтезе холестерина, концентрацию рецепторов для липопротеинов низкой плотности в печени, концентрацию ферментов, ограничивающих скорость для конверсии холестеринов желчных кислот, скорости синтеза и секреции липопротеинов и пол субъекта. Факторы окружающей среды, влияющие на гемостаз концентрации холестерина в крови у человека, включают в себя состав пищи, эффект курения, физическую активность и применение ряда фармацевтических агентов. Изменения в питании включают в себя количество и тип жира (насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты), количество холестерина, количество и тип волокна и, возможно, количества витаминов, таких как витамины С и Ό, и минералов, таких как кальций.

Эпидемиологические исследования показывают обратную корреляцию уровней липопротеина высокой плотности (НОЬ) и аполипопротеина (аро) А-Ι и наличия атеросклеротических событий (см. статью ХУбюп и соавт., Аг1спо5с1сго515. 8:737-741, (1988)). Показано, что инъекция НЭЬ кроликам, получавшим атерогенный корм, ингибирует образование атеросклеротических повреждений (см. статью Ваб1топ и соавт., I. Сйп. 1пуе81., 85:1234-1241, (1990)).

Человеческий аро А-Ι являлся объектом интенсивных исследований, что обусловлено его антиатерогенными свойствами. Заменяемые аполипопротеины, включая аро А-Ι, имеют липид-ассоциированные домены (см. статьи ВгоиШейе и Апап!йагаша1ай, Вюсй1ш. Вюрйук. Ас!а, 1256:103-129, (1995); 8едге51 и соавт., ЕЕВ8 Ьей., 38:247-253, (1974)). Принято считать, что аро А-Ι имеет восемь тандемно повторяющихся 22-мерных последовательностей, большинство из которых потенциально способны к образованию амфипатических спиральных структур класса А (см. статью 8едгей и соавт., ЕЕВ8 Ьей., 38:247-253, (1974)). Характеристики амфипатической спирали класса А включают в себя присутствие положительно заряженных остатков на разделе полярной и неполярной поверхностей и отрицательно заряженных остатков в центре полярной поверхности (см. статьи 8едгей и соавт., ЕЕВ8 Ьей., 38:247-253, (1974); 8едгей и соавт., Рго1еш8; 81гис1иге, Еипсйоп, апб Оепейск, 8:103-117, (1990)). Показано, что аро А-Ι сильно связывается с фосфолипидами с образованием комплексов и способствует оттоку холестерина из богатых холестерином клеток. Ранее считали, что доставка и поддержание сывороточных уровней аро А-Ι недостаточна для эффективного уменьшения по крайней мере одного симптома атеросклероза.

Сущность изобретения

В данном изобретении представлены новые пептиды, введение которых уменьшает интенсивность по крайней мере одного симптома атеросклероза.

В частности, открытием, сделанным в данном изобретении, является то, что пептиды, описанные ниже, могут быть введены в организм, в том числе перорально, легко всасываются и доставляются в сыворотку и являются эффективными в плане уменьшения интенсивности по крайней мере одного симптома атеросклероза.

Таким образом, в первом варианте осуществления данное изобретение представляет пептид, который уменьшает интенсивность симптома атеросклероза, где пептид имеет длину, которая лежит в интервале от приблизительно 10 до приблизительно 30 аминокислот, содержит по меньшей мере одну амфипатическую спираль класса А, содержит по меньшей мере один остаток Ό-аминокислоты, защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом и отличен от пептида Ό-18Λ (например, Ό-Ψ-Е-К-А-Е-У-ОК-У-А-Е-К-Е-К-Е-А-Е (8ЕО ΙΌ N0: 1), имеющим все остатки аминокислот Ό-формы).

- 1 009528

Во втором варианте осуществления данное изобретение представляет пептид, который уменьшает интенсивность симптома атеросклероза, где пептид имеет аминокислотную последовательность Ό-Ψ-ΡΚ-Α-Ρ-Υ-Ό-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ (8ΕΟ ΙΌ N0: 5), содержит все остатки Ь-аминокислоты, по крайней мере одну защитную группу и при этом защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом.

В особенно предпочтительных вариантах изобретения пептид дополнительно содержит защитную группу, присоединенную к аминоконцу и/или карбоксильному концу. Предпочтительные защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, ацетил, амид и алкильные группы, содержащие от 3 до 20 атомов углерода, Ртос, ΐ-Ьос, 9-флуоренацетильную группу, 1-флуоренкарбоксильную группу, 9-флуоренкарбоксильную группу, 9-флуоренон-1-карбоксильную группу, бензилоксикарбонил, ксантил (Хап), тритил (Тг(), 4-метилтритил (Μΐΐ), 4-метокситритил (Мт1), 4-метокси-2,3,6триметилбензолсульфонил (Μΐτ), мезитилен-2-сульфонил (Μΐκ), 4,4-диметоксибензгидрил (МЬй), тозил (Ток), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (Ртс), 4-метилбензил (ΜοΒ/Ι), 4-метоксибензил (ΜοΟΒζΙ), бензилоксигруппу (Βζ10), бензил (Βζΐ), бензоил (Βζ), 3-нитро-2-пиридинсульфенил Щрук), 1-(4,4-диметил-2,6-диаксоциклогексилиден)этил (Обе), 2,6-дихлорбензил (2,6^^Ο1-Βζ1), 2хлорбензилоксикарбонил (2-Ο1-Ζ), 2-бромбензилоксикарбонил (2-Βγ-Ζ), бензилоксиметил (Вот), ΐбутоксикарбонил (Вос), циклогексилоксигруппу (сНхО), ΐ-бутоксиметил (Вит), ΐ-бутоксигруппу (1Ви0), ΐ-бутил (1Ви), ацетил (Ас) и трифторацетил (ТРА).

В ряде особенно предпочтительных вариантов пептид дополнительно содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.

В ряде особенно предпочтительных случаев первого варианта осуществления пептиды близко напоминают амфипатическую спираль класса А человеческого или мышиного аро Α-Ι.

В ряде вариантов осуществления эти предпочтительные пептиды содержат последовательность аминокислот, идентичную более чем на 50% полипептиду, кодируемому экзоном, который кодирует амфипатическую спираль класса А человеческого или мышиного аро Α-Ι.

В некоторых предпочтительных случаях первого варианта осуществления по меньшей мере приблизительно 10%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 50%, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% и даже 100% энантиомерных аминокислот представлено Όаминокислотами.

Пептид может быть объединен с фармакологически приемлемым наполнителем (например, наполнителем, подходящим для перорального введения млекопитающему).

В ряде особенно предпочтительных случаев первого варианта осуществления пептид содержит одну или более из следующих последовательностей аминокислот:

0-УУ-1_-К-А-Р-У-0-К-У-А-Е-К-Е-К-Е-А-Р-
(ЗЕО Ю N0:2), 0-УУ-Р-К-А-Р-У-0-К-У-А-Е-К-1_-К-Е-А-Р- (ЗЕО	Ю N0:3),
О-УУ-Ь-К-А-Е-У-О-К-У-А-Е-К-Б-К-Е-А-Е-	(ЗЕО	Ю	N0:4),
ϋ-νν-Ρ-Κ-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ-	(ЗЕО	ю	N0:5),
Ο-νν-Ι-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Ε-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-Ε-Ρ-	(ЗЕО	ю	N0:6),
0-УУ-1.К-А-Р-У-0-К-Р-Р-Е-К-Р-К-Е-Р-Р-	(ЗЕО	ю	N0:7),
О-УУ-Ρ-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-Ρ-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-	(ЗЕО	ю	N0:8),
О-УУ-Ь-К-А-Р-У-О-К-У-А-Е-К-к-К-Е-Р-Р-	(ЗЕО	ю	N0:9),
Ο - УУ Ь - К - А - Ρ - Υ ϋ - К-V - Ρ-Ε - К-Ρ - К - Ε - А - Ρ-	(ЗЕО	10	N0:10),

- 2 009528

О-М-1_-К-А-Р-У-Э-К-V-Р-Е-К-Ь-К-Е-Р-Р- (ЗЕО ГО N0:11), Ο-νν-ί-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ- (ЗЕО ГО N0: 12),

□.уу - К - А - Е - У - ϋ - К - V - Р - Е - К-Р-К-Е - Р-Р- (ЗЕО ГО N0:13), Е-1Л/-1_-К-1_-Р-У - Е-К-V-1_-Е-К-Р-К-Е - А-Р - (ЗЕО ГО N0:14), Е-\Л/-ί-К-А-Р-У-Э-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:15), Е - \Л/-1. - К - А - Р - У - Э - К - V - А - Е - К -1_-К - Е - Е - Р (ЗЕО ГО N0:16), Е-УУ-1_-К-А-Р-Υ-О-К-V-Р-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:17), Е-УУ-К-А-Р-У-ϋ- К-V-Р-Е-К-1--К-Е-Р-Р- (ЗЕО ГО N0:18), Е-УУ-1_-К-А-Р-У-ϋ-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-Р-Р- (ЗЕО ГО N0: 19),

Е-УУ-1_-К-А-Р-У-Э- К-V-Р-Е-К-Р-К-Е-Р-Р- (ЗЕО ГО N0:20), А-Р-УГО-К-У-А-Е-К-Ь-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:21), А-Р-У-О-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-А-Р(ЗЕО ГО N0:22), А-Р-УГО-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:23),

Α-Ρ-Υ-ϋ-Κ-Ρ-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ- (ЗЕО ГО N0:24), А-Р-УГО-К-Р-Р-Е-К-Р-К-Е-Р-Р(ЗЕО ГО N0:25), А-Р-УГО-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:26),

А-Р-У-О-К-У-А-Е-К-Ь-К-Е-Е-Р- (ЗЕО ГО N0:27), Α-Ρ-Υ-ϋ-К-У-Р-Е-К-Р-К-Е-А-Р(ЗЕО ГО N0 :28), А-Р-УГО-К-У-Р-Е-К-Ь-К-Е-Р-Е- (ЗЕО ГО N0:29),

Д-Р-У-О-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-Е-Р- (ЗЕО ГО N0:30), Κ-Α-Ρ-Υ-ϋ-К-У-Р-Е-К-Р-К-Е-Р(ЗЕО ГО N0:31), Ь-Р-У-Е-К-У-Ь-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:32),

А-Р-У-Э-К-У-А-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:33), А-Р-У-О-К-У-А-Е-К-ЬК-Е-Р-Р(ЗЕО ГО N0:34), А-Р-У-О-К-У-Р-Е-К-Р-К-Е-А-Р- (ЗЕО ГО N0:35),

А-Р-УГО-К-У-Р-Е-К-Ь-К-Е-Р-Р- (ЗЕО ГО N0:36), Α-Ρ-Υ-ϋ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-Ρ-Ρ(ЗЕО ГО N0:37), А-Р-УГО-К-У-Р-Е-К-Р-К-Е-Е-Е- (ЗЕО ГО N0:38), ϋ - УУ-1_-К-Α-1_-У-ϋ-К-V-А-Е-К-1--К-Е-А-Ь- (ЗЕО ГО N0:39), □ -ν^-Ρ-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-У-А-Е-К-Ь-К-Е-Р-Р- (ЗЕО ГО N0:40),

- 3 009528

О-М-Е-К-А-Р-У-Е-К-Е-Р-Е-К-Р-К-Е-Е-Р-	(8ΕΟ	Ю	N0:41 ),
Е-)Л/-1_-К - Α-1_-Υ-Е-К-V - А-Е-К-1_-К-Е-А-1_-	(8ΕΟ	Ю	N0:42),
Ε-\Λ/-Ι_-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ©-Α·Ε-Κ-1-Κ-Ε-Α-Ρ-	(5ΕΟ	Ю	N0:43),
Ε-νν-Ε-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ь-К-Е-Р-Е-	(3ΕΟ	Ю	N0:44),
Ε-\ΛΜ--Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-Ε-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:45),
Ε-Υν-Ι-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-Ρ-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ε-	(8Ε0	ΙΟ	N0:46),
Ε-νν-Ρ-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-Ρ-Ε-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:47),
ϋ-Γ-ί-Κ-Α-νν-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-νν-	(δΕΟ	Ю	N0:48),
Е-Е-к-К-А-У/-У-Е-К-У-А-Е-К-1_-К-Е-А-У/-	(8ΕΟ	Ю	N0:49),
Ο-Ε-νν-Κ-Α-νν-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-νν-νν-	(8ΕΟ	Ю	N0:50),
Ε-Ε-νν-Κ-Α-νν-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-νν-νν-	(8ΕΟ	Ю	N0:51 ),
Ο-Κ-Ι-Κ-Α-Ε-Υ-ϋ-Κ-ν-Ε-Ε-νν-Α-Κ-Ε-Α-Ρ-	(8Ε0	Ю	N0:52),
Ο-Κ-νν-Κ-Α-ν-Υ-ϋ-Κ-Ε-Α-Ε-Α-Ρ-Κ-Ε-Ε-Ι--	(8ΕΟ	ΙΟ	N0:53),
Ε-Κ-Ι_-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Ρ-Ε-\ΐν-Α-Κ-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:54),
Ε-Κ-νν-Κ-Α-ν-Υ-Ε-Κ-Ρ-Α-Ε-Α-Ρ-Κ-Ε-Ρ-1-	(8ΕΟ	Ю	N0:55),
□-©-Ь-Κ-Α-Ρ-ν-ϋ-Κ-Ρ-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Υ-	(8ΕΟ	Ю	N0:56),
Ε-Κ-νν-Κ-Α-ν-Υ-Ε-Κ-Р-А-Е-А-Р-К-Е-Р-Ь-	(8Ε0	Ю	N0:57),
ϋ-νν-1.-Κ·Α-Ρ-ν-Υ-Ο-Κ-ν-Ρ-Κ-Ι--Κ-Ε·Ρ-Ρ·	(5ΕΟ	Ю	N0:58),
Ε-νν-ϋ-Κ-Α-Ρ-ν-Υ-Ε-Κ-ν-Ρ-Κ-Ι-Κ-Ε-Ρ-Ρ-	(8ΕΟ	Ю	N0:59),
Ο-νν-ί-Β-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-	(8Ε0	Ю	N0:60),
Ε-νν-ί-Β-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-	(8ΕΟ	Ю	N0:61 ),
Ο-νν-Ι-Κ-Α-Ρ-Υ-ϋ-Η-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-	(3Ε0	Ю	N0:62),
Ε-νν-Ι-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Β-ν-Α-Ε-Κ-Ь-К-Е-А-Р-	(3ΕΟ	Ю	N0:63),
□ _νν-Ι_-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Ρ!-Ι--Κ-Ε-Α·Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:64),

- 4 009528

Ε-νν-ί-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Η-Ι-Κ-Ε-Α-Ε-	(5ΕΟ	Ю	N0:65),
Ο-νν-Ι-Κ-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ь-В-Е-А-Р-	(8ΕΟ	Ю	N0:66),
Ε-νν-Ι_-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι_-Α-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:67),
0-У7-1_-К-А-Е-У-0-А-У-А-Е-А-1_-К-Е-А-Е-	(8ΕΟ	Ю	N0:68),
Ε-νν-Ι-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Α-ν-Α-Ε-Β-ί-Κ-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:69),
Ρ-νν-Ι_-Α-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι--Α-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:70),
Ε-νν-Ι-Η-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Η-Ε-Α-Ε-	(6ΕΟ	Ю	N0:7 1),
Ο-νν-ί-Β-Α-Ε-Υ-Ο-Β-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:72),
Ε-1Α/-(_-Α-Α-Ε-Υ-Ε-Α-ν-Α-Ε-Κ-1_-Κ-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:73),
0-νν.|_.Κ-Α-Ε-Υ-0-Κ-ν-Α-Ε-Α-1.-Εί-Ε-Α-Ε-	(δΕΟ	Ю	N0:74),
Ε-νν-ί-Κ-Α-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Β-Ι-Α-Ε-Α-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:75),
Ο-νν-Ι-Α-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Α-ί-Κ-Ε-Α-Ε-	(6Ε0	Ю	N0:76),
Ε-νν-Ь-Α -Α-Ε-Υ-Ε- К-V-Α-Ε-Α -1_-Κ-Ε-А-Ε-	(8ΕΟ	Ю	N0:77),

О-Щ-ЬК-А-Е-У-О-К-У-А-Е-К-Ь-К-Е-А-Е-Р-О-Щ-Ь-К-А-Е-У-О-К-У-А-Е-К-ЬК-Е-А-Р (δΕΟ Ю N0:78),

Ο-νν-ί-Κ-Α-Ε-ΥΌ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Ε-Ρ-Ρ-Ο-νν-Ι-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Ε-Ε (8Ε0 Ю N0:79),

0-\ΛΓ-Ρ-Κ-Α-Ε-Υ-0-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-Ρ-0-νν-Ρ-Κ-Α-Ρ-Υ-0-Κ-ν-Α-Ε-Κ-1-Κ-Ε-Α-Ε (δΕΟ Ю N0:80),

Ο-Κ-ί-Κ-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Ε-Ε-νν-Α-Κ-Ε-Α-Ε-Ρ-Ο-Κ-ί-Κ-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Ε-Ε-νν-ί-Κ-Ε-Α-Ε (8Ε0 10 N0:81),

Ο-Κ-νν-Κ-Α-ν-Υ-ϋ-Κ-Ε-Α-Ε-Α-Ε-Κ-Ε-Ε-Ι-Ρ-ϋ-Κ-νν-Κ-Α-ν-Υ-Ο-Κ-Ε-Α-Ε-Α-Ε-Κ-Ε-Ε-Ι (8Ε0 ΙΟ N0:82),

□.νν-Ρ-Κ-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-Α-Ε-Ρ-ϋ-νν-Ε-Κ-Α-Ε-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-Α-Ε (8Ε0 Ю N0:83),

□.νν-ΐ-Κ-Α-Ε-ν-Υ-ϋ-Κ-ν-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Ε-Γ-Ρ-Ο-νν-Ι-Κ-Α-Ε-ν-Υ-Ο-Κ-ν-Γ-Κ-ί-Κ-Ε-Ε-Ε (3Ε0 Ю N0:84), □_уу.|_.К-А-Е-У-О-К-Е-А-Е-К-Е-К-Е-Е-Е-Р-О-УМ_-К-А-Е-У-О-К-Е-А-Е-К-Е-К-Е-Е-Е (δΕΟ Ю N0:85), укороченные варианты вышеуказанных последовательностей, мультимерные комбинации (например, предпочтительно находящиеся в интервале от димеров до тримеров, тетрамеров, 5-меров, 8-меров или 10-меров) вышеуказанных последовательностей, консервативные замены вышеуказанных последовательностей и/или вышеуказанные последовательности, содержащие аналоги аминокислот. Энантиомерные аминокислоты данных последовательностей предпочтительно содержат по меньшей мере одну Όаминокислоту. В ряде предпочтительных вариантов осуществления по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% и даже 100% энантиомерных аминокислот представлено Ό-аминокислотами, как описано в данном контексте.

Патентуемые пептиды могут также включать защитную группу (например, амид, ацетил, пропеонил и алкил, содержащий от 3 до 20 атомов углерода, и т.п.), присоединенную к аминоконцу или карбоксильному концу. В ряде вариантов осуществления защитная группа, присоединенная к карбоксильному концу, представлена амидом. В ряде вариантов осуществления защитная группа, присоединенная к аминоконцу, представлена ацетилом, пропеонилом или алкилом, содержащим от 3 до 20 атомов углерода. Некоторые пептиды содержат как карбокси-, так и аминоконцевую защитную группу. В одном из таких вариантов осуществления аминоконцевая защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы, состоящей из ацетила, пропеонила и алкила, содержащего от 3 до 20 атомов углерода, и карбоксиконцевая защитная группа представлена амидом.

- 5 009528

В ряде вариантов осуществления пептид представляет собой пептид, который защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом, выбранным из группы, состоящей из окисляющих агентов, таких как пероксид водорода, 13(8)-ΗΡ0ΌΕ, 15(8)-ΗΡΕΤΕ, ΗΡ0ΌΕ, ΗΡΕΤΕ, Η0ΌΕ и НЕТЕ. Фосфолипид может быть представлен фосфолипидом, выбранным из группы, состоящей из 1-пальмитоил-2арахидоноил-кп-глицеро-3 -фосфорилхолина (РАРС), 1 -стеароил-2-арахидоноил-§п-глицеро-3 фосфорилхолина (8АРС), 1-стеароил-2-арахидонил-§п-глицеро-3-фосфорилэтаноламина (8ΑΡΕ). Таким образом пептид препятствует образованию липидов, таких как окисленный 1-пальмитоил-2арахидоноил-кп-глицеро-3 -фосфорилхолин (Ох-РАРС), 1 -пальмитоил-2-оксовалероил-8и-глицеро-3 фосфорилхолин (ΡϋνΡί.’). 1-пальмитоил-2-глутароил-§п-глицеро-3-фосфорилхолин (Ρ6ΡС),

1-пальмитоил-2-эпоксиизопростан-8и-глицеро-3-фосфорилхолин (ΡΕIΡС), окисленный 1-стеароил-2арахидоноил-кп-глицеро-3-фосфорилхолин (Οx-8ΑΡС), 1-стеароил-2-оксовалероил-§и-глицеро-3фосфорилхолин (8ΘνΡΟ), 1-стеароил-2-глутароил-§п-глицеро-3-фосфорилхолин (86ΡС), 1-стеароил-2эпоксиизопростан-8и-глицеро-3-фосфорилхолин (8ΕIΡС), окисленный 1-стеароил-2-арахидонил-§пглицеро-3 -фосфорилэтаноламин (Ох-8ΑΡΕ), 1 -стеароил-2-оксовалероил-§и-глицеро-3 -фосфорилэтаноламин (80νΡΕ), 1-стеароил-2-глутароил-§п-глицеро-3-фосфорилэтаноламин (86ΡΕ) и 1-стеароил-2эпоксиизопростан-8и-глицеро-3-фосфорилэтаноламин (8ΕΙΡΕ).

В другом варианте осуществления данное изобретение представляет композицию, уменьшающую интенсивность симптома атеросклероза и пригодную предпочтительно для перорального, а также назального, ректального, внутрибрюшинного, внутрисосудистого, подкожного, чрескожного и внутримышечного введения.

Композиция содержит один из вариантов указанного выше пептида.

Кроме того, композиция может содержать фармацевтически приемлемый наполнитель (например, наполнитель, пригодный для перорального введения, или наполнитель, пригодный для инъекций).

Предпочтительные пептиды, используемые в композиции, способны защищать фосфолипид [1-пальмитоил-2-арахидоноил-8п-глицеро-3-фосфорилхолина (РАРС), 1-стеароил-2-арахидоноил-8пглицеро-3 -фосфорилхолина (8 ΑΡΟ), 1 -стеароил-2-арахидонил-§п-глицеро-3 -фосфорилэтаноламина (8ΑΡΕ)] от окисления окисляющим агентом (например, пероксидом водорода, 13(8)-ΗΡ0ΌΕ, 15(8)ΗΡΕΤΕ, ΗΡ0ΌΕ, НРЕТЕ, Η0ΌΕ и НЕТЕ).

Пептид препятствует также образованию окисленного 1-пальмитоил-2-арахидоноил-8п-глицеро-3фосфорилхолина (Ох-РАРС), 1-пальмитоил-2-оксовалероил-8п-глицеро-3-фосфорилхолина (Ρ0ν^), 1-пальмитоил-2-глутароил-8п-глицеро-3 -фосфорилхолина (Ρ6ΡΟ), 1-пальмитоил-2-эпоксиизопростан-8пглицеро-3-фосфорилхолина (ΡΕIΡС), окисленного 1-стеароил-2-арахидоноил-§п-глицеро-3фосфорилхолина (Оx-8ΑΡС), 1-стеароил-2-оксовалероил-§п-глицеро-3-фосфорилхолина (80νΡΟ), 1-стеароил-2-глутароил-§п-глицеро-3 -фосфорилхолина (86ΡС), 1 -стеароил-2-эпоксиизопростан-§пглицеро-3-фосфорилхолина (8ΕIΡС), окисленного 1-стеароил-2-арахидонил-§п-глицеро-3-фосфорилэтаноламина (0χ-8ΑΡΕ), 1-стеароил-2-арахидонил-§п-глицеро-3-фосфорилэтаноламина (80νΡΕ), 1-стеароил-2-глутароил-§п-глицеро-3 -фосфорилэтаноламина (86ΡΕ), 1 -стеароил-2-эпоксиизопростан-§пглицеро-3 -фосфорилэтаноламина (8ΕΙΡΕ).

Композицию предпочтительно вводят в организм перорально, и организм предпочтительно представлен организмом с диагнозом или риском развития по крайней мере одного симптома атеросклероза. В ряде вариантов осуществления используемый пептид может быть представлен в виде выделенного пептида или комбинации с фармакологическим наполнителем, как описано в данном контексте. Введение предпочтительно проводят в дозе, достаточной для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза и/или существенного снижения вероятности появления по крайней мере одного симптома атеросклероза.

Данное изобретение представляет также использование указанных выше пептидов для производства лекарства для профилактики и лечения атеросклероза.

Лекарственное средство может быть получено в том числе в виде лекарственной формы, при которой пептид объединен с фармацевтически приемлемым наполнителем в унифицированном лекарственном препарате.

Лекарственное средство пригодно предпочтительно для перорального, а также назального, ректального, внутрибрюшинного, внутрисосудистого, подкожного, чрескожного и внутримышечного введения.

В ряде вариантов осуществления в данном изобретении исключены любые пептиды, описанные в патенте США 4643988 и/или статье СагЬег и соавт., ΑΡοΓίοδοΕτοδίδ апб ТйготЬояк, 12:886-894, (1992). В некоторых вариантах в данном изобретении исключены любые пептиды, описанные в патенте США 4643988 и/или статье СагЬег и соавт., (1992), которые были синтезированы при использовании всех энантиомерных аминокислот в форме Ь-аминокислот или синтезированы при использовании Ό-аминокислот, когда пептиды являются блокирующими группами. В ряде вариантов осуществления в данном изобретении исключены пептиды, имеющие формулу Α₁-Β₁-Β₂-^-Ό-Β₃-Β₄-Α₂-^-Β₅-Β₆-Α₃-^-Β₇-^-Α₄-Β₈-Β₉ (8ΕΟ ΙΌ N0:87), где А₁, А₂, А₃ и А₄ независимо представлены аспарагиновой или глутаминовой кислотами или их гомологами или аналогами; В₁, В₂, В₃, В₄, В₅, В₆, В₇, В₈ и В₉ независимо представлены триптофаном, фенилаланином, аланином, лейцином, тирозином, изолейцином, валином или

- 6 009528 α-нафтилаланином или их гомологами или аналогами; С], С₂, С₃ и С₄ независимо представлены лизином или аргинином и Ό представлено серином, треонином, аланином, глицином, гистидином или их гомологами или аналогами, при условии, что, если А! и А₂ представлены аспарагиновой кислотой, то А₃ и А₄ представлены глутаминовой кислотой, В₂ и В₉ представлены лейцином, В₃ и В₇ - фенилаланином, В₄ тирозином, В₅ - валином, В₆, В₈ и Ό - аланином, а С_ь С₂, С₃ и С₄ - лизином, и В! отличен от триптофана.

Определения

Термины полипептид, пептид и белок в данном контексте используют взаимозаменяемо для обозначения полимера из остатков аминокислот. Термины применимы к полимерам аминокислот, в которых по крайней мере один остаток аминокислоты представлен искусственным химическим аналогом соответствующей природной аминокислоты, а также к полимерам природных аминокислот.

Термин амфипатическая спираль класса А относится к белковой структуре, которая формирует αспираль с образованием сегрегации полярных и неполярных поверхностей с положительно заряженными остатками, которые находятся на разделе полярной и неполярной поверхностей и отрицательно заряженными остатками, находящимися в центре полярной поверхности (см., например, статью ЗедгеЧ и соавт., РгсИспъ: 81гис1иге, Еиисйои, апб Оепейск, 8:103-117, (1990)).

Термин улучшение при использовании в контексте облегчение по крайней мере одного симптома атеросклероза касается уменьшения, предупреждения или устранения по крайней мере одного симптома, характерного для атеросклероза и/или связанных с ним патологий. Данное уменьшение включает, без ограничения перечисленным, уменьшение или элиминацию окисленных фосфолипидов, уменьшение образования и разрушение атеросклеротических бляшек, уменьшение частоты клинических событий, таких как сердечный приступ, стенокардия или инсульт, снижение гипертензии, уменьшение биосинтеза воспалительного белка, снижение уровня холестерина в плазме и т. п.

Термин энантиомерные аминокислоты относится к аминокислотам, которые могут существовать по меньшей мере в двух формах, которые не являются накладывающимися одно на другое зеркальными изображениями друг друга. Большинство аминокислот (за исключением глицина) являются энантиомерными и существуют в так называемой Ь-форме (Ь-аминокислота) или Ό-форме (Ό-аминокислота). Большинство природных аминокислот являются Ь-аминокислотами. Термины Ό-аминокислота и Ьаминокислота используют в отношении абсолютной конфигурации аминокислоты, а не определенного направления вращения плоско-поляризованного света. Применение в данном контексте соответствует стандартному применению термина компетентными специалистами в данной области.

Термин защитная группа относится к химической группе, которая, будучи присоединенной к функциональной группе в аминокислоте (например, к боковой цепи, α-аминогруппе, α-карбоксильной группе и т. п.), блокирует или маскирует свойства данной функциональной группы. Предпочтительные аминоконцевые защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, ацетил или аминогруппы. Другие аминоконцевые защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропеонил, формил и другие. Предпочтительные карбоксиконцевые защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, группы, которые образуют амиды или сложные эфиры.

Выражение защищает фосфолипид от окисления окисляющим агентом относится к способности соединения снижать скорость окисления фосфолипида (или количество образованного окисленного фосфолипида) при контактировании данного фосфолипида с окисляющим агентом (например, пероксидом водорода, 13-(8)-ΗΡΟΌΕ, 15-(8)-ΗΡΕΊΈ, ΗΡΟΌΕ, ΗΡΕΤΕ, ΜΟΌΕ, НЕТЕ и т.п.).

Термины липопротеин низкой плотности или 'ΈΌΕ определены в соответствии с общепринятым применением компетентными специалистами в данной области. Как правило, термин ЬПЬ относится к липидно-белковому комплексу, который при выделении ультрацентрифугированием находится в диапазоне удельных масс от 6=1,019 до 6=1,063.

Термины липопротеин высокой плотности или ΗΌΕ определены в соответствии с общепринятым их применением компетентными специалистами в данной области. Как правило, термин ЬПЬ относится к липидно-белковому комплексу, который при выделении ультрацентрифугированием находится в диапазоне удельных масс от 6=1,063 до 6=1,21.

Термин ΗΌΌ группы I относится к липопротеину высокой плотности или его компонентам (например, аро А-Ι, параоксоназе, ацетил гидролазе тромбоцит-активирующего фактора и т.п.), которые восстанавливают окисленные липиды (например, в липопротеинах низкой плотности) или защищают окисленные липиды от окисления окисляющими агентами.

Термин ΗΌΕ группы II относится к ΗΌΌ, которые обладают пониженной активностью или не имеют активности в плане защиты липидов от окисления или репарации (например, восстановления) окисленных липидов.

Термин компонент ΗΌΌ относится к компоненту (например, молекулам), который входит в состав липопротеина высокой плотности (ΗΌΌ). Анализы на ΗΌΌ, который защищает липиды от окисления или репарирует их (например, восстанавливает окисленные липиды), включают в себя также анали

- 7 009528 зы компонентов НЭЬ (например, аро А-Ι, параоксоназы, ацетилгидролазы тромбоцит-активирующего фактора и т.п.), которые проявляют данную активность.

Термин человеческий пептид аро А-Ι пептид относится к человеческому пептиду аро А-Ι полной длины, или его фрагменту или домену, которые содержат амфипатическую спираль класса А.

Термин реакция моноцитов (моноцитарная реакция), как используют в данном контексте, относится к активности моноцитов, характеризующей воспалительную реакцию, связанную с образованием атеросклеротических бляшек. Реакция моноцитов характеризуется адгезией моноцитов к клеткам стенки сосуда (например, к клеткам сосудистого эндотелия) и/или хемотаксисом в субэндотелиальное пространство и/или дифференцировкой моноцитов в макрофаги.

Термин отсутствие изменений касательно количества окисленного фосфолипида относится к отсутствию определяемого изменения, более предпочтительно к отсутствию статистически значимого изменения (например, при доверительном уровне по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98 или 99%). Отсутствие определяемого изменения может также относиться к анализам, в которых уровень окисленного фосфолипида изменяется, но не на такую величину, как в отсутствие белка(ов), описанного в данном контексте, или со ссылкой на другие положительные или отрицательные контроли.

В данном контексте используют следующие сокращения: РАРС: Ь-а-1-пальмитоил-2-арахидоноил8и-глицеро-3-фосфорилхолин, РОУРС: 1-пальмитоил-2-(5-оксовалерил)-8и-глицеро-3-фосфорилхолин, РОРС: 1-пальмитоил-2-глутарил-8и-глицеро-3-фосфорилхолин, РЕ1РС: 1-пальмитоил-2-(5,6эпоксиизопростан Е₂)-зи-глицеро-3-фосфорилхолин, С’11С’18:2: холестерил линолеат, С’11С’18:2-ООН: холестерил линолеат гидропероксид, ЭМРС: 1,2-дитетрадеканоил-гас-глицерол-3-фосфохолин, РОЫ: параоксоназа, НРЕ: стандартизованное поле зрения при большом увеличении микроскопа, ВЬ/6: С57ВЬ/61; С3Н:С3Н/НеЕ

Термин консервативная замена используют в отношении белков или пептидов с целью отражения замен аминокислот, которые практически не изменяют активность (например, специфичность в отношении липопротеинов) или аффинность связывания (например, в отношении липидов или липопротеинов) молекулы. Как правило, консервативные замены аминокислот включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой с близкими химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). Каждая из следующих шести групп содержит аминокислоты, представляющие собой типичные консервативные замены друг для друга:

1) аланин (А), серин (8), треонин (Т);

2) аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е);

3) аспарагин (Ν), глутамин (О);

4) аргинин (В), лизин (К);

5) изолейцин (Т), лейцин (Ь), метионин (М), валин (У) и

6) фенилаланин (Е), тирозин (Υ), триптофан (№).

Термины идентичный или процент идентичности в контексте двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые являются одинаковыми при сравнении и сопоставлении (выравнивании) для выявления максимального соответствия, которое измеряют с использованием следующих алгоритмов для сравнения последовательностей или посредством визуального изучения. Что касается пептидов, соответствующих данному изобретению, то идентичность определяют для пептида полной длины.

При сравнении последовательностей, как правило, одна последовательность служит эталонной последовательностью, с которой сравнивают тест-последовательность. При использовании алгоритма для сравнения последовательностей данные о тест-последовательности и эталонной последовательности вводят в компьютер, при необходимости определяют координаты субпоследовательности и определяют параметры программы алгоритма. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей вычисляют процент идентичности последовательности для тест-последовательности(ей) относительно эталонной последовательности на основе заданных параметров программы.

Оптимальный элайнмент (способ анализа первичной структуры последовательностей, основанный на сопоставлении, выравнивании последовательностей друг относительно друга) последовательностей с целью сравнения может быть проведен, например, с помощью алгоритма локальной гомологии, описанного в статье 8ιηί11ι и №а1егшаи, Αάν. Арр1. Ма!й., 2:482, (1981), алгоритма сопоставления гомологии, описанного в статье №еб1ешаи и №ии8сй, 1. Мо1 Вю1., 48:443 (1970), способом поиска аналогий, описанным в статье Реагзои и Ыршаи, Ргос. Асаб. 8с1. И8А, 85:2444, (1988), путем компьютеризированного применения данных алгоритмов (ОАР, ΒΕ8ΤΕΙΤ, ЕА8ТА и ТЕА8ТА в Пакете Программного оборудования №18сои81и Оеиейсз, Оеиейсз Сошри1ег Огоир, 575 8с1еисе Όγ., МаФзои, №1) или путем визуального изучения (см. в основном работу Аи8иЬе1 и соавт., зирга).

Одним из примеров эффективного алгоритма является РГЬЕИР. РГЬЕИР проводит элайнмент (сопоставление) множества последовательностей из группы близких последовательностей, используя постепенные попарные сопоставления, чтобы показать близость и процент идентичности последовательно

- 8 009528 стей. Он также рисует дерево или дендрограмму, демонстрирующие образование групп родства, которые используют для сопоставления. В РГБЕИР используют упрощение способа постепенного сопоставления, описанного в статье Реид и Όοοίίΐΐίθ, I. Μοί. Ενοί., 35:351-360, (1987). Используемый способ близок способу, описанному в статье Шддшк и 8йагр, САВ1О8, 5:151-153, (1989). Программа может сопоставить до 300 последовательностей с максимальной длиной 5000 нуклеотидов или аминокислот каждая. Процедура элайнмента (сопоставления) множества последовательностей начинается с попарного сопоставления (выравнивания) двух самых близких между собой последовательностей с получением кластера двух сопоставленных последовательностей. Затем данный кластер сопоставляют со следующей наиболее близкой последовательностью или кластером сопоставленных последовательностей. Два кластера последовательностей сопоставляют путем простого продолжения попарного сопоставления (выравнивания друг относительно друга) двух отдельных последовательностей. Заключительное сопоставление достигается в серии постепенных попарных сопоставлений. Программа работает путем определения специфических последовательностей и координат их аминокислот или нуклеотидов на участках сравнения последовательностей и посредством определения параметров программы. Например, эталонную последовательность можно сравнить с другими тест-последовательностями, с целью установления близости по проценту идентичности последовательностей с использованием следующих параметров: вес пропущенных гэпов (3,00), вес длины пропущенных гэпов (0,10) и взвешенные концевые гэпы.

Другим примером алгоритма, который пригоден для определения процента идентичности последовательностей и близости последовательностей, является алгоритм ВЬА8Т, который описан в статье А11кс1ш1 и соавт., 1. Μοί. Βίοί., 215:403-410, (1990). Программное обеспечение для проведения анализов ВЬА8Т имеется в открытом доступе в Национальном Центре Информации по Биотехнологии (111е ΝαΙίοηαί СеШег Рэг ΒίοΕοΙιηο^ν ΙηΓοηηηΙίοη) (1ΠΙρ://\ν\ν\ν.η<±ί.η1ιη.ηί1ι^ον/). Данный алгоритм включает в себя первую идентификацию часто встречающихся пар последовательностей (Н8Р) по идентификации коротких слов длины в запрашиваемой последовательности, которая либо соответствует, либо удовлетворяет некоторому положительно оцениваемому пороговому значению Т при сопоставлении со словом такой же длины в последовательности из базы данных. Т считают пороговым значением соседнего слова (А11ксйи1 и соавт., кирга). Данные исходные удачные находки соседних слов действуют как затравка для инициации поиска, с целью обнаружения содержащих их более длинных Н8Р. Удачные слова затем удлиняют в обоих направлениях каждой последовательности настолько далеко, насколько может быть продолжено кумулятивное сопоставление. Кумулятивные значения вычисляют, используя для нуклеотидных последовательностей параметры М (положительная величина для пары правильно спаренных остатков, всегда > 0) и N (отрицательная величина для ошибочно спаренных остатков, всегда < 0). Для последовательностей аминокислот используют ту же матрицу для вычисления кумулятивного значения. Удлинение удачных слов в каждом направлении тормозится, когда кумулятивное значение сопоставления уменьшается до количества X от его максимально достигнутой величины; кумулятивное значение доходит до нуля или ниже вследствие накопления одного или более сопоставлений остатков с отрицательным значением или при достижении конца какой-либо последовательности. Параметры алгоритма ВЬА8Т ^, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ΒΕΆ8ΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) в качестве пропусков используют длину слова (^)=11, ожидание (Е)=10, М=5, N=-4 и сравнение обоих нитей. Для последовательностей аминокислот в программе ВЬА8ТР в качестве пропусков используют длину слова (^)=3, ожидание (Е)=10 и основу для подсчета ВЬО§иМ62 (см. статью ΝηίΚοΓΓ и НемИоГТ, Ргос. №11. Асаб. 8е1. И8А, 89:10915, (1989)).

Кроме вычисления процента идентичности последовательности, алгоритм ВЬА8Т проводит также статистический анализ близости двух последовательностей (см., например, статью Каг1т и А11ксйи1, Ргос. N11. Асаб. 8с1. И8А, 90:5873-5787, (1993)). Одно измерение близости с помощью алгоритма ВЬА8Т представляет собой наименьшую суммарную вероятность (РЩ)), которая указывает на вероятность, с которой случайно могло бы встретиться соответствие между двумя последовательностями нуклеотидов или аминокислот. Например, нуклеиновую кислоту считают близкой эталонной последовательности, если минимальная суммарная вероятность при сравнении тест-нуклеиновой кислоты и эталонной нуклеиновой кислоты не превышает приблизительно 0,1, более предпочтительно не превышает приблизительно 0,01 и наиболее предпочтительно не превышает приблизительно 0,001.

Термин пептид Э-18А относится к пептиду, имеющему последовательность: Ц-^-Ь-К-А-Р-У-ЦК-У-А-Е-К-Е-К-Е-А-Р (8ЕО ΙΌ N0:1), в котором все энантиомерные аминокислоты являются аминокислотами в Ό-форме.

- 9 009528

Перечень фигур чертежей и иных материалов

На фиг. 1, панели А, В, С и Ό, представлено связывание ¹⁴С-О-5Е с компонентами крови у мышей, нуллисомных по аро Е. Пептидный миметик аро Α-Ι - Ό-5Ε, меченный ¹⁴С-аминокислотами, вводили перорально через зонд аро Е-дефицитным мышам (п=5) или инкубировали с их плазмой ίη νίίτο. Отбор крови проводили натощак через 6 ч после введения и определяли связывание ¹⁴С с кровью, плазмой и липопротеинами.

Фиг. 2А и 2В иллюстрируют, что перорально введенный пептид Ό обладает активностью. Пептидные миметики аро Α-Ι - Ό-5Ε и Ь-5Е (в дозе 100 мкг/животное) вводили перорально через зонд мышам, нуллисомным по рецептору ЬВЬ (п=5). Отбор крови проводили через 6 ч, ЬВЬ и НОЬ выделяли гельфильтрацией (ЕРЬС - жидкостная экспресс-хроматография белков) и исследовали в модельной системе артериальной стенки в отношении защитной способности НОЬ (фиг. 2А) и устойчивости ЬВЬ (фиг. 2В) к окислению путем определения генерации хемотактической активности моноцитов. Как видно, Ό-5Ε, но не Ь-5Е значительно повышал защитные свойства НОЬ, а ЬВЬ после воздействия Ό-5Ε становился высокоустойчивым к окислению.

На фиг. 3Α и 3В представлены концентрации в плазме пептида Ό относительно Ь после введения через зонд. Пептидные миметики аро Α-Ι - Ό-4Ε (фиг. 3В) и Ь-4Е (фиг. 3В) были помечены ¹²⁵Ι и введены перорально через зонд мышам, нуллисомным по рецептору ЬВЬ (п=4). Отбор крови проводили через 3 ч, плазму фракционировали с помощью ЕРЬС и определяли радиоактивность в элюированных фракциях. Меньше 15% пептида Ь элюировалось в виде интактного 18-мера, тогда как больше 70% Ό-4Ε было интактным. Данные исследования демонстрируют, что пептид Ό является значительно более устойчивым к деградации ίη νί\Ό по сравнению с пептидом Ь

Фиг. 4 иллюстрирует отсутствие антитела против Ό-4Ε у леченых мышей. Никакое антитело (белая преципитационная линия) против Ό-4Ε не было обнаружено в плазме мышей, нуллисомных по рецептору ЬВЬ, через 6 недель после лечения пептидом в дозе 5 мг/сутки (нижняя панель).

Положительный контроль (верхняя панель) демонстрирует наличие преципитационной линии для аро Α-Ι в мышиной плазме. Верхняя панель: Центр: антитело кролика против аро Α-Ι и периферия: плазма мышей, содержащих Ό-4Ε. Нижняя панель: Центр: Плазма мышей ЬВЬ В-/-, леченных Ό-4Ε, и Периферия: Очищенный пептид Ό-4Ε в концентрации 0-80 мкг.

На фиг. 5 представлен случай поражений в виде жировых штрихов в корне аорты мышей, нуллисомных по рецептору ЬВЬ, получающих западный корм. Группы мышей, нуллисомных по рецептору ЬВЬ, содержали на корме западного типа и вводили перорально носитель (Контроль) (п=9) или пептид Ό-4Ε (п=6), два раза в день в течение 6 недель. Впоследствии мышей умерщвляли, фиксировали дугу аорты, готовили срезы и количественно оценивали поражения в виде жировых штрихов. У мышей, получавших Ό-4Ε, площадь поражения уменьшалась на 81% (р<0,01).

На фиг. 6 панели А, В и С иллюстрируют распределение в плазме пептида 5Ε или аро Α-Ι после внутрибрюшинной инъекции. Человеческий аро Α-Ι, мышиный аро Α-Ι и пептид 5Ε метили ¹²⁵Ι и инъецировали внутрибрюшинно мышам С57ВЬ/6, которые получали атерогенный корм в течение по меньшей мере трех недель. Образцы отбирали во время кинетических исследований, описанных в табл. 3. Репрезентативные образцы анализировали способом СЬ1Р и собирали фракции для определения радиоактивности. Объем элюции основывался только на скорости насоса колонки; объемом, обусловленным насосом с ферментативным реагентом, пренебрегали. Данные представляют холестерин (в виде поглощения при длине волны 500 нм в произвольных единицах, сплошная линия) и радиоактивность (в ударах/мин; пунктир). На панелях представлено: А: человеческий аро Α-Ι (1 ч после инъекции); В: мышиный аро Α-Ι (1 ч), Ο5Ε (1,5 ч).

На фиг. 7 на панелях А и В проиллюстрировано взаимодействие мышиных липопротеинов с человеческими клетками артериальной стенки. ЬВЬ и НОЬ выделяли с помощью ГРЕС из плазмы мышей, которые получали атерогенный корм и инъекции носителя (РВ8 - забуференный фосфатом солевой раствор) или пептида 5Ε в дозе 20 мкг/мышь/сутки. Кокультуры обрабатывают без использования (без добавления) или с использованием человеческого ЬВЬ (ΗΕΌΕ) в концентрации 200 мкг/мл белка ЬВЬ или мышиного ЬВЬ (МоЕПЬ) в концентрации 200 мкг/мл или человеческого ЬВЬ в концентрации 200 мкг/мл + человеческого НПЬ (ИНОЕ) в дозе 350 мкг/мл белка НПЬ или мышиного НПЬ (МоНПЬ) в концентрации 300 мкг/мл. Кокультуры инкубировали с вышеуказанными добавками в течение 8 ч при 37°С в присутствии 10% сыворотки с пониженным содержанием липопротеина (ЬРО8). Супернатанты собирали и анализировали на содержание эквивалентов гидропероксидов липидов по Α^ι^εΗ (панель А). Затем кокультуры промывали и инкубировали в свежей среде для культивирования без сыворотки или ЬРО8 в течение дополнительных 8 ч. Кондиционированную среду собирали и анализировали на хемотактическую активность моноцитов (панель В). Для сравнения в обе панели включен контрольный образец без клеток (Контроль без клеток).

На фиг. 8 показаны средние площади поражений на поперечных срезах. Приведенные данные представляют среднюю площадь поражения на поперечном срезе для каждого животного ( О и среднее значение±8ЕМ (стандартная ошибка) для всех животных в каждой группе · ) с границами ошибки. Сокра

- 10 009528 щения: РВ8 - мыши получали атерогенный корм, и им ежедневно делали инъекцию 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора; 5Р - мыши получали атерогенный корм и им ежедневно делали инъекцию 20 мкг 5Р в 200 мкл РВ8; ΜοΑΙ - мыши получали атерогенный корм и им ежедневно делали инъекцию 50 мкг мышиного аро Α-Ι в 200 мкл РВ8. *=р<0.002. как определено с помощью двустороннего критерия Стьюдента. Достоверная разница также была показана с использованием одностороннего анализа дисперсии в классах (р<0,001).

На фиг. 9 показано, что как Э-. так и Б-изомеры пептидных миметиков аро А-Ι препятствуют хемотактической активности моноцитов. индуцируемой слабо окисленным БОБ ίη νίίτο. Представлены следующие варианты: только среда (БОБ при отсутствии клеток или клетки при отсутствии БОБ). контроль БОБ от нормальных субъектов в концентрации 250 мкг/мл (БОБ) и БОБ + контроль НЭБ от нормальных субъектов в концентрации 350 мкг/мл (+НЭБ). Другие кокультуры инкубировали с контролем БЭБ вместе с различными количествами (показано в мкг на оси абсцисс) Э-2Р либо Б-2Р (третья панель слева. 2Р) или Ω-37-рА либо Б-37рА (последняя панель справа. 37рА). Данные представляют среднее значение+ЗЭ (стандартное отклонение) значений. полученных на кокультурах в четырех повторностях. Все значения для НЭБ или добавленных пептидов достоверно отличались от БОБ в виде монокомпонента (первая панель слева) на уровне р < 0.01.

Фиг. 10 А и 10В иллюстрируют. что кормление мышей пептидными миметиками аро А-Ι. соответствующими данному изобретению. делает красные клетки устойчивыми к лизису ίη νίίτο. На фиг. 10А и 10В приведены результаты анализа лизиса красных клеток ίη νίίτο на 18 ч (фиг. 10А) и 48 ч (фиг. 10В). Звездочки отражают наличие достоверной разницы (р<0.001) между лизисом красных клеток у животных. которые получали носитель. относительно животных. которые получали пептиды.

На фиг. 11 показано. что кормление мышей Э-пептидными миметиками αρο А-Ι. соответствующими данному изобретению. делает циркулирующий в крови БОБ устойчивым к окислению. Группам мышей с дефицитом рецептора БОБ (η=3) через зонд вводили Э-пептиды или носитель в виде солевого раствора. Каждое животное получало 100 мкл солевого раствора. 100 мкг/100 мкл пептида Э-2Р или пептида ϋ37рА. Забор крови проводили из ретроорбитального синуса под мягкой анестезией через 17 ч. БОБ выделяли из плазмы с помощью РРБС. Кокультуры клеток артериальной стенки инкубировали со средой без добавок (БЕЗ ДОБАВОК). контролем БОБ от нормальных субъектов (БОБ). БОБ + контроль НЭБ от нормальных субъектов (+НЭБ). Другие кокультуры инкубировали с мышиным БОБ после введения через зонд солевого раствора (δΑΜΝΕ БОБ). с пептидом Э-2Р (О-2Р БОБ) или Э-37рА (Э-37рА БОБ). Кокультуры инкубировали в течение 4 ч при температуре 37°С в присутствии 10% БРЭ8. Затем супернатанты отбрасывали. кокультуры промывали и инкубировали со средой для культивирования. не содержащей сыворотку или БРЭ8. в течение дополнительных 4 ч. Данную кондиционированную среду собирали и анализировали на хемотактическую активность моноцитов. Значения представлены. как среднее+5О по кокультурам в четырех повторностях. Звездочки указывают на р<0.001.

Фиг. 12 иллюстрирует результаты анализа хемотаксиса. в котором сравнивают липопротеины. полученные от мышей. которым вводили пептиды в Э-форме и/или Б-форме через зонд.

Фиг. 13А иллюстрирует результаты анализа хемотаксиса. в котором сравнивают контроли НЭБ и НЭБ. полученные от мышей. которым через зонд вводили пептид Э. Фиг. 13В иллюстрирует результаты анализа хемотаксиса. в котором сравнивают БОБ и УБОБ/ОБ. полученные от мышей. которым через зонд вводили пептид Э.

На фиг. 14А и 14В представлены результаты электрофореза 2Р. показывающие его самоассоциацию. На фиг. 14А показаны результаты 8Э8 РАСЕ (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) (18%) 2Р. На дорожке 1 представлен стандарт молекулярной массы. а на дорожке 2 представлена полоса. соответствующая 2Р (молекулярная масса составляет 2242). движущийся несколько медленнее. чем стандарт с самой низкой молекулярной массой (3.5-2.5 кД). На фиг. 14В представлены результаты РАСЕ в неденатурирующих условиях (4-12%). показывающие подвижности 2Р в концентрациях 100 мкг/мл (дорожка 2) и 250 мкг/мл (дорожка 1). указывающие на самоассоциацию в растворе. Дорожка 3 представляет подвижность высокомолекулярного стандарта.

На фиг. 15 показано. что гомологичные серии пептидов стабилизируют шестифазовый переход двухслойного ^^РοРΕ. Сдвиг в Т_н ^^РοРΕ показан как функция мольной фракции добавленного пептида. Измерено с помощью Ω8Ο (дифференциальный сканирующий калориметр) при тепловой скорости сканирования 37°/ч.

Обозначения:

• - 2Р; о - ЗЕ³;

- 4Г; □ - 5Р; ▼ - 6Е; *. - 7Е; δ - аро А-1.

На фиг. 16 представлено мониторирование с помощью относительного прямоугольного рассеяния света растворения МБУ ЕРС гомологичными сериями пептидов как функции времени. Репрезентативная кривая осветления МБУ ЕРС представлена для каждого из гомологичных пептидов. Использовали эквимолярную концентрацию пептида и ЕРС (105 мкМ). Длины волн возбуждения и эмиссии составляли 400

- 11 009528 нм. При использовании Тгйоп Х-100 достигали полного растворения в конечной концентрации 1 мМ. Обозначения: · - ЕР8; ° - 2Е; - ЗЕ³: □ - ЗЕ¹⁴; * - 4Е;

δ - 5Е; τ - 6Е; ν - 7Е; О - человеческий аро Α-Ι; ♦ - Тгйоп Х-100.

Фиг. 17 иллюстрирует способность БСАТ активировать гомологичные пептиды. Представлены гистограммы, представляющие активацию ЬСЛТ Е-пептидами. Активность БСАТ измеряли с использованием маленьких однослойных носителей ЕРС-холестерина и выражали данную активность в процентах относительно активности аро А-Ι, где активность аро А-Ι принимали за 100%. Каждое значение представляет собой среднее значение по трем повторностям. Используемая концентрация пептида составляла 20 мкг/мл.

На фиг. 18 показано, что индуцируемый БББ хемотаксис моноцитов ингибируется гомологичными сериями пептидов. БББ в виде монокомпонента или БББ, инкубированный либо с человеческим НББ, либо с гомологичной серией пептидов, добавляли в кокультуры человеческих клеток артериальной стенки на 8 ч в присутствии 10% БРБ8. Супернатанты удаляли и кокультуры промывали средой для культивирования без добавления сыворотки или БРБ8. Кондиционированную среду собирали и анализировали на хемотактическую активность моноцитов. Данные представляют среднее значение±ЗЕМ (п=9 в каждом случае). При попарных сравнениях с БОБ все пептиды, за исключением пептидов 3Е, были достоверно более эффективны (по меньшей мере р<0,001, отмечено ΐ и *). Сравнения всех пептидов между собой анализировали с помощью одностороннего ΑΝΟνΑ (вариационный анализ). Звездочка указывает, что пептиды 4Е, 5Е и 6Е были значительно более эффективны, чем гомологи 2Е и 7Е (р<0,05 при сравнении методом БискеИ). Скобка указывает на отсутствие достоверной разницы в способности ингибировать БББ-индуцированный хемотаксис среди трех данных пептидов.

На фиг. 19 показано, что инфекция гриппа А вызывает повышение уровня окисленных фосфолипидов в печени через два дня после инфекции. Мышей С57ВБ/6, находящихся на смешанном корме, интраназально инфицировали дозой вируса гриппа А таким образом, чтобы не развивалась виремия, как описано в статье ναη Беп1еп и соавт., Спси1а1юп, 103:2283-2288, (2001). На 0, 2, 3, 5, 7 и 9 сутки после инфекции удаляли печени и определяли содержание окисленных фосфолипидов с помощью Е81-М8.

На фиг. 20 показано, что Б-4Е препятствует снижению активности параоксоназы после инфекции гриппа А. Нескольким мышам, приведенным на фиг. 19, ежедневно делали внутрибрюшинную инъекцию 20 мкг Б-4Е, а другим мышам делали инъекцию забуференного фосфатом солевого раствора (РВЗ). Активность параоксоназы (ΡΟΝ) измеряли в плазме на 0, 2, 7 и 9 сутки после инфекции.

На фиг. 21 показано, что Б-4Е препятствует индукции окисленных фосфолипидов в аортах мышей, инфицированных вирусом гриппа А. Нескольким мышам, приведенным на фиг. 19, ежедневно делали внутрибрюшинную инъекцию 20 мкг Б-4Е, а другим мышам делали инъекцию забуференного фосфатом солевого раствора (РВЗ). Аорты мышей брали на 2, 7 и 9 сутки после инфекции и определяли содержание окисленных фосфолипидов с помощью Е81-М8.

На фиг. 22А-22С показано, что после перорального введения Б-4Е в отличие от Б-4Е остается интактным в циркулирующей крови мышей, нуллисомных по рецептору БББ, повышает способность НББ защищать БББ от окисления человеческими клетками артериальной стенки и снижает индуцированную БББ хемотактическую активность моноцитов. На фиг. 22А представлены пептиды Б-4Е и Б-4Е, в которые были введены радиоактивные метки с использованием реагента в виде йода, иммобилизованного на гранулах. Пептиды вводили перорально через зонд мышам, нуллисомным по рецептору БББ (100 мкл солевого раствора, содержащего 100 мкг немеченого пептида + пептид, меченный ¹²⁵Ι со специфической активностью 11х10⁶ срт (число импульсов/мин)/мкг пептида/животное, п=3). Кровь отбирали через 4 ч, плазму отделяли, делипидировали и анализовали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано в ссылке 12. На панелях В и С представлено введение пептидов Б-4Е и Б-4Е (100 мкг в 100 мкл солевого раствора/животное) мышам с дефицитом рецептора БББ с помощью перорального зонда. Кровь отбирают через 6 ч, плазменный НББ и БББ выделяют гель-фильтрацией (ЕРБС) и исследуют на кокультурах. На фиг. 22В представлена способность мышиного и человеческого НББ защищать контрольный человеческий (11БББ) от окисления человеческими клетками артериальной стенки и ингибировать индуцированную БББ хемотактическую активность моноцитов. Человеческий БББ в концентрации 200 мкг белка/мл добавляли в кокультуры человеческих клеток артериальной стенки вместе с человеческим НББ (КНОБ) в концентрации 350 мкг белка/мл или мышиным НББ (тНББ) в концентрации 100 мкг холестерина/мл, взятого от мышей, которые получали солевой раствор (Солевой раствор Ех), или Б4Е (Б-4Е Ех), или Б-4Е (Б-4Е Ех), хемотактическую активность моноцитов определяли, как описано в данном контексте. На фиг. 22С показана способность мышиного БББ индуцировать хемотактическую активность моноцитов. Контроли анализа представлены слева на панели В. Справа представлено, что мышиный БББ (тБББ) выделен у мышей, получающих солевой раствор (Солевой раствор Ех), или Б-4Е (Б-4Е Ех), или Б-4Е (Б-4Е Ех) и добавлен в концентрации 100 мкг холестерина/мл в кокультуры клеток артериальной стенки, не содержащие НББ, и определена хемотактическая активность моноцитов. Значения представляют собой среднее±8Б для четырех лунок в двух независимых экспериментах.

- 12 009528

На фиг. 23 показано, что пероральное введение Ό-4Ε резко снижает поражения у мышей, нуллисомных по рецептору БОБ, находящихся на западном корме. Группы мышей, нуллисомных по рецептору БОБ, выдерживали на западном корме и вводили им через зонд 100 мкл солевого раствора в виде монокомпонента (Солевой раствор) (п=4 животных) или 100 мкл липосом, не содержащих Ό-4Ε (Липосомы) (п=5 животных), или 2,5 тд пептида Ό-4Ε в 100 мкл липосом Ό-4Ε в липосомах (п=6 животных), два раза в день в течение 6 недель. У мышей забирали кровь, впоследствии умерщвляли, фиксировали корень аорты, делали срезы и определяли количество материала, окрашенного масляным красным О в повреждениях в виде жировых штрихов.

На фиг. 24 показано, что пероральное введение Ό-4Ε резко снижает поражения у мышей, нуллисомных по рецептору БОБ, находящихся на смешанном корме. В возрасте 4 недели в воде для питья нескольким мышам, нуллисомным по аро Е, добавляют Ό-4Ε в концентрации 1 мг/мл (п=4 мыши). Ό-4Ε в концентрации 2 мг/мл добавляют в воду для питья другой группе мышей (п=4 мыши) и никакой пептид на добавляют в воду для питья третьей группе мышей (п=5 мышей). Все мыши употребляли приблизительно 2,5 мл воды в день, при этом первая группа не получала пептид (Вода), вторая группа получала 2,5 мг О-4Е/мышь/день (2,5 мг Ό-4Ε) и третья группа получала 5,0 мг О-4Е/мышь/день (5,0 мг Ό-4Ε). Все группы продолжали получать смешанный корм в течение 5 недель, в течение которых у мышей забирали кровь, впоследствии их умерщвляли, фиксировали корень аорты, делали срезы и определяли количество материала, окрашенного масляным красным О в повреждениях в виде жировых штрихов.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Ι. Уменьшение интенсивности симптома атеросклероза.

Данное изобретение касается обнаружения того, что синтетические пептиды, сконструированные для имитации мотива амфипатической спирали класса А (8едгей и соавт., РгсЛепъ: 8йис1иге, Еипсйоп, апб Сепейск, 8:103-117, (1990)), способны связываться с фосфолипидами и проявляют многие биологические свойства, близкие свойствам человеческого аро А-Ι. В частности, в данном изобретении было обнаружено, что, когда данные пептиды получают с использованием Ό-аминокислот, пептиды демонстрируют резкое увеличение длительности полужизни в сыворотке и их можно даже вводить перорально, в особенности, когда аминоконцы и/или карбоксильные концы блокированы.

Более того, удивительным фактом, обнаруженным в данном изобретении, было то, что данные Όформы пептидов сохраняют биологическую активность Б-форм пептидов. Исследования на животных ш У1уо с использованием данных Ό-форм пептидов показали эффективность пероральной доставки, увеличенный период полужизни в сыворотке и способность уменьшать интенсивность или предупреждать/подавлять по крайней мере один симптом атеросклероза.

Обнаружено, что нормальный НББ ингибирует три стадии образования мягко окисленного БОБ. В данных исследованиях (см. одновременно рассматриваемую заявку υδδΝ 09/541,468, поданную 31 марта 2000 г.) продемонстрировано, что обработка человеческого БББ ш \йго аро А-Ι или пептидным миметиком аро А-Ι (37рА) удаляет из БОБ затравочные молекулы, которые включали НР0БЕ и НРЕТЕ. Данные затравочные молекулы были необходимы для кокультур человеческих клеток артериальной стенки, чтобы получить способность к окислению БОБ, и для БОБ, чтобы индуцировать в клетках стенок артерии продукцию хемотактической активности моноцитов. Было также продемонстрировано, что после инъекции мышам или инфузии человеку аро А-Ι БОБ, выделенный у мышей и людей-добровольцев после данной инъекции/инфузии аро А-Ι, был устойчив к окислению человеческими клетками артериальной стенки и не индуцировал хемотактическую активность моноцитов в кокультурах клеток артериальной стенки.

Защитная функция Ό-пептидов, соответствующих данному изобретению, проиллюстрирована на фиг. 1-5. На фиг. 1, на панелях А, В, С и Ό, представлено связывание ¹⁴С-О-5Е с компонентами крови мышей, нуллисомных по аро Е. В данном контексте показано также, что НББ мышей, которые получали атерогенный корм и которым делали инъекцию РВ8, не мог ингибировать окисление человеческого БОБ и не мог ингибировать индуцированную БОБ хемотактическую активность моноцитов в кокультурах человеческих клеток артериальной стенки. Напротив, НББ мышей, которые получали атерогенный корм и которым ежедневно инъецировали пептиды, описанные в данном контексте, был эффективным в плане ингибирования окисления человеческого БОБ и предупреждения индуцированной БОБ хемотактической активности моноцитов в кокультурах, как нормальный человеческий НББ (см. фиг. 2А и 2В). Кроме того, БОБ, взятый от мышей, получавших атерогенный корм, которым ежедневно делали инъекцию РВ8, легче окислялся и легче индуцировал хемотактическую активность моноцитов, чем БОБ, взятый от мышей, получавших такой же корм, но которым ежедневно инъецировали 20 мкг пептида 5Е. Ό-пептид, очевидно, не был иммуногенным (см. фиг. 4).

Реакции ш \йго человеческих клеток артериальной стенки на НББ и БОБ мышей, получавших атерогенный корм, которым инъецировали пептид, соответствующий данному изобретению, соответствуют защитному действию, показанному данными пептидами ш у1уо. Несмотря на близкие уровни общего холестерина, ООБ-холестерина, ГОБ+УБОБ-холестерина и пониженный уровень НББ-холестерина в виде процента от общего содержания холестерина, у животных, получавших атерогенный корм, которым делали инъекции пептида, имели значительно более низкое число повреждений (см. фиг. 5). Пептиды,

- 13 009528 соответствующие данному изобретению, предупреждали таким образом развитие атеросклеротических повреждений у мышей, получавших атерогенный корм.

Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение представляет способы облегчения и/или предупреждения по крайней мере одного симптома атеросклероза. Способы предпочтительно включают введение в организм, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно человека, по крайней мере одного пептида, соответствующего данному изобретению (или миметика данного пептида). Пептид(ы) могут вводиться, как описано в данном контексте, в соответствии с любым из многочисленных стандартных способов, включая, без ограничения перечисленным, инъекцию, суппозиторий, назальный спрей, имплантат с замедленным выделением, чрескожный пластырь и т.п. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления пептид(ы) вводят перорально (например, в виде сиропа, капсулы или таблетки).

Способы включают введение одного полипептида, соответствующего данному изобретению, или введение двух или более различных полипептидов. Полипептиды могут быть представлены в виде мономеров или в димерных, олигомерных или полимерных формах. В ряде вариантов осуществления мультимерные формы могут содержать ассоциированные мономеры (например, связанные ионными или гидрофобными связями), тогда как ряд других мультимерных форм содержит ковалентно связанные мономеры (связанные непосредственно или через линкер).

Хотя изобретение описано в плане применения для человека, оно может быть также пригодно для животного, например для ветеринарных нужд. Таким образом, предпочтительные организмы включают в себя, без ограничения перечисленным, человека, приматов, собак, лошадей, кошек, свиней, копытных, зайцеобразных и т.п.

Способы, соответствующие данному изобретению, не ограничены человеком и животными, проявляющими по крайней мере один симптом атеросклероза (например, гипертензию, образование и разрушение бляшек, повторение таких клинических событий, как сердечный приступ, стенокардия или инсульт, высокие уровни холестерина в плазме, высокие уровни липопротеина низкой плотности, высокие уровни липопротеина очень низкой плотности или воспалительных белков и т.п.), но являются эффективными в контексте профилактики. Так, пептиды, соответствующие данному изобретению (или их миметики), можно вводить в организм с целью предупреждения начала/развития по крайней мере одного симптома атеросклероза. В данном контексте особенно предпочтительными являются субъекты с проявлениями одного или более факторов риска развития атеросклероза (например, семейный анамнез, гипертензия, ожирение, злоупотребление алкоголем, курение, высокий уровень холестерина в крови, высокий уровень триглицеридов в крови, повышенный уровень в крови ЬПЬ, УЪПЬ, ШЬ, или низкий уровень ΗΌΤ, диабет или наличие диабета в семейном анамнезе, высокий уровень липидов в крови, сердечный приступ, стенокардия или инсульт и т. п.).

Кроме способов с использованием подавляющих атеросклероз пептидов, соответствующих данному изобретению, в данном изобретении представлены также указанные пептиды, пептиды, приготовленные в виде фармацевтических препаратов, особенно для пероральной доставки, и наборы для лечения и/или предупреждения по крайней мере одного симптома атеросклероза.

II. Уменьшение интенсивности симптома атеросклероза, связанного с острым воспалительным ответом.

Пептиды, подавляющие атеросклероз, соответствующие данному изобретению, эффективны также в ряде других контекстов. В частности, отмечено, что сердечно-сосудистые осложнения (например, атеросклероз, инсульт и т. п.) часто сопровождают или следуют за началом воспалительной реакции острой фазы. Данная воспалительная реакция острой стадии часто ассоциируется с рецидивирующим воспалительным заболеванием (например, лепрой, туберкулезом, системной красной волчанкой и ревматоидным артритом), вирусной инфекцией (например, гриппом), бактериальной инфекцией, грибковой инфекцией, трансплантатом органа, раной или иной травмой, имплантированным протезом, биопленкой и т.п.

Удивительный факт, обнаруженный в данном изобретении, состоит в том, что введение по крайней мере одного пептида, описанного в данном контексте, может снижать или предотвращать образование окисленных фосфолипидов во время или после ответной реакции острой фазы и, вследствие этого, уменьшать или устранять сердечно-сосудистые осложнения, связанные с данным состоянием.

Так, например, продемонстрировано, что последствием инфекции гриппа является снижение активности параоксоназы и тромбоцит-активирующей ацетилгидролазы в ΗΌΤ. Не будучи связанными определенной теорией, авторы полагают, что в результате потери в ΗΌΤ активностей данных ферментов, а также в результате связывания прооксидантных белков с ΗΌΤ во время ответной реакции острой фазы ΗΌΤ более не способен препятствовать окислению ЬПЬ и более не способен препятствовать индуцированной ЬПЬ продукции хемотактической активности моноцитов в эндотелиальных клетках.

Показано, что у субъекта, которому ежедневно делают инъекции очень низких доз полипептидов, соответствующих данному изобретению, (например, 20 мкг/мышь) после инфекции вируса гриппа А не падают уровни параоксоназы и не образуются биологически активные окисленные фосфолипиды на уровне, превышающем фоновый. Данные факты свидетельствуют о том, что Ό-4Ε (и/или другие пептиды, соответствующие данному изобретению) могут быть введены (например, перорально или путем инъ

- 14 009528 екции) больным с установленным заболеванием коронарной артерии во время инфекции гриппа или других событий, которые могут создать воспалительную ответную реакцию острой фазы (например, вследствие вирусной инфекции, бактериальной инфекции, травмы, трансплантата, различных аутоиммунных состояний и т.п.), и таким образом можно посредством данного краткосрочного лечения предупредить повышенную вероятность сердечного приступа и инсульта, связанных с патологиями, которые приводят к созданию данных воспалительных состояний.

Так, в некоторых вариантах осуществления в данном изобретении предполагают введение по крайней мере одного пептида, соответствующего данному изобретению, субъекту с риском развития или в состоянии острой воспалительной реакции и/или с риском развития или с симптомом атеросклероза.

Так, например, субъекту с коронарной болезнью или с риском развития данной болезни можно профилактически ввести полипептид, соответствующий данному изобретению, в течение периода повышенной заболеваемости гриппом. Человека (или животное) с рецидивирующим воспалительным состоянием, например ревматоидным артритом, различными аутоиммунными заболеваниями и т.п., можно лечить полипептидом, соответствующим данному изобретению, с целью смягчения или предупреждения развития атеросклероза или инсульта. Человека (или животное) с травмой, например острым повреждением, трансплантатом ткани и т.п. можно лечить полипептидом, соответствующим данному изобретению, с целью смягчения развития атеросклероза или инсульта.

В ряде случаев данные способы будут приводить к диагностике появления или риска развития острого воспалительного ответа. Острый воспалительный ответ, как правило, включает в себя изменения в метаболизме и регуляции генов в печени. Именно динамический гомеостатический процесс включает все главные системы организма в дополнение к иммунной, сердечно-сосудистой и центральной нервной системе. Обычно ответная реакция острой фазы продолжается только несколько дней, однако, в случаях хронического или рецидивирующего воспаления аберрантная продолжительность некоторых аспектов ответной реакции острой фазы может участвовать в повреждении основных тканей, которое сопровождает заболевание, и может также приводить к дальнейшим осложнениям, например сердечно-сосудистым заболеваниям или заболеваниям, связанным с отложением белка, таким как амилоидоз.

Важным аспектом ответа острой фазы является измененный коренным образом биосинтетический профиль в печени. В нормальных условиях печень синтезирует характерный для нее круг белков плазмы в постоянных концентрациях. Многие из данных белков имеют важные функции, и необходимы повышенные уровни в плазме данных реагентов острой фазы (ΆΡΒ) или белков острой фазы (АРР) во время ответной реакции острой фазы, следующей после стимуляции воспаления. Хотя большинство ΛΡΚ.8 синтезируются гепатоцитами, некоторые образуются клетками других типов, включая моноциты, эндотелиальные клетки, фибробласты и адипоциты. Большинство ΛΡΡ индуцируются на уровне между 50% от нормы и превышением нормы в несколько раз. Напротив, уровни основных ΛΡΡ могут повышаться в 1000 раз относительно нормы. Данная группа включает в себя сывороточный амилоид А (8АА) и либо Среактивный белок (ΟΡΡ) у человека, либо его гомолог у мышей, сывороточный компонент амилоида Р (8ΑΡ). Концентрации в плазме так называемых негативных ΛΡΡ снижаются во время ответной реакции острой фазы, обеспечивая повышение способности печени синтезировать индуцированные ΑΡΡ.

В ряде вариантов осуществления ответную реакцию острой фазы или риск ее развития оценивают путем измерения одного или более АРР. Измерение данных маркеров хорошо известно компетентным специалистам в данной области, и существуют компании-поставщики, которые проводят данное измерение (например, ΑΟΡ, измеренное Саг6ю1ес11 Зегуюек, ЬошкуШе, ΚΥ).

III. Смягчение симптома или состояния, связанного с кальцификацией коронарной артерии и остеопорозом.

Идентифицированы также окисленные липиды, которые являются причиной кальцификации коронарной артерии и остеопороза. Более того, не будучи связанными определенной теорией, авторы полагают, что те же самые механизмы участвуют в патогенезе кальцификационного аортального стеноза.

Таким образом, в ряде вариантов осуществления данное изобретение предполагает использование пептидов, описанных в данном контексте, для подавления или предупреждения развития симптома заболевания, такого как ревматическая полимиалгия, нодозный полиартериит, склеродерма, идиопатический легочный фиброз, хроническое обструктивное легочное заболевание, болезнь Альцгеймера, СПИД, кальцификация коронарной артерии, кальцификационный аортальный стеноз, остеопороз и т.п.

IV. Предпочтительные пептиды и их получение.

Предпочтительные пептиды.

В данном изобретении обнаружено, что пептиды класса А способны смягчать по крайней мере один симптом атеросклероза. Пептиды класса А характеризуются образованием α-спирали, которая дает сегрегацию полярных и неполярных остатков, формируя таким образом полярную и неполярную поверхности с положительно заряженными остатками, находящимися на разделе полярной и неполярной поверхностей, и отрицательно заряженными остатками, находящимися в центре полярной поверхности (см., например, статью АпаиШагата1ай, Ме111. Εиζуто1., 128:626-668, (1986)). Замечено, что четвертый экзон аро АЧ при складывании с использованием 3,667 остатков/поворот спирали образует структуру амфипатической спирали класса А.

- 15 009528

Один особенно предпочтительный пептид класса А, обозначенный 18А (см. табл. 1, а также статью Апап111агата1а11. Ме111. Επζνιηοΐ. 128: 626-668, (1986)), был модифицирован, как описано в данном контексте, с целью получения пептидов, пригодных для перорального введения и высокоэффективных для подавления или предупреждения по крайней мере одного симптома атеросклероза. Вне связи с определенной теорией, полагают, что действие пептидов, соответствующих данному изобретению, ίπ νίνο может заключаться в улавливании затравочных молекул(ы), которые снижают окисление ЬПЬ.

Определено, что повышение числа остатков РЬе на гидрофобной поверхности 18А теоретически должно было бы повысить аффинность к липидам, что установлено с помощью вычислений, описанных в статье РаЦипасЕап и соавт., Айегю8с1его8Щ, ТБготЬомк & Уа§си1аг Вю1оду, 16: 328-338, (1996). Теоретически методичная замена остатков на неполярной поверхности 18А на РЬе могла бы привести к образованию шести пептидов. Пептиды с дополнительными 2, 3 и 4 РЬе теоретическим имели бы значение аффинности к липидам (λ) 13, 14 и 15 единиц соответственно. Однако значения 1 увеличились бы на четыре единицы, если бы число дополнительных РЬе возросло от 4 до 5 (до 19 λ единиц). Увеличение до 6 или 7 РЬе привело бы к менее резкому повышению (до 20 и 21 λ единиц соответственно). Вследствие этого, было выбрано 5 дополнительных РЬе (и поэтому пептиды обозначены, как 5Т). В одном особенно предпочтительном варианте осуществления пептид 5Т был блокирован тем, что аминоконцевой остаток был ацетилирован, а карбоксильный конец был амидирован.

Новый пептидный аналог класса А, 5Р, ингибировал развитие повреждения у чувствительных к атеросклерозу мышей. Новый пептидный аналог 5Т сравнивали с мышиным аро А-Ι (МоА-Ι) по эффективности подавления индуцированного кормом атеросклероза у данных мышей, используя дозировки пептида, основанные на исследованиях, проведенных Бе^зпе и соавт. (см. статью Бе^зпе и соавт., Ргос. ЫаБ. АсаБ. 8сЕ И8А, 90:12040-12044, (1993)).

Был также получен ряд других пептидов класса А, которые показали различные, но значительные степени эффективности в плане уменьшения интенсивности по крайней мере одного симптома атеросклероза. Ряд данных пептидов приведен в табл. 1.

- 16 009528

Таблица 1

Предпочтительные пептиды для использования в данном изобретении

Название пептида	Последовательность аминокислот	5ΕΟ Ю ΝΟ.
18А	ϋ-νίΖ-Ι-Κ-Α-Ρ-ΥΌ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Α-Ρ	1
2Е	Αε·Ο·ν/·Ε-Κ-Α-Ρ-Υ·Ο·Κ·ν-Α-Ε-Κ·ί-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	2
ЗР	Αε-ϋ-νι/·Ρ·Κ·Α-Ρ-Υ·Ο·Κ·ν·Α-Ε·Κ-1.-Κ-Ε·Α-Ρ-ΝΝ2	3
ЗР14	Ас-Ο-νν-1-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	4
4Р	Ас-О-УС-Р-К-А-Р-У-О-К-У-А-Е-К-Е-К-Е-А-Г-НН?	5
5Р	Ас-О-УЛЕ-К-А-Р· Υ-Ο-Κ-У-Р-Е- Κ· Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ- ΝΗ2	6
6Р	ΑοΟ-νΜ-.Κ-ΑΡ-Υ-Ο-Κ-Ε-Ε-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ^	7
7Р	Αο·Ο-ν/-Ρ·Κ·Α·Ρ-Υ-0-Κ-Ρ.Ρ·Ε-Κ-Ρ-Κ·Ε·Ρ-Ρ·ΝΗ2	β
	Αο·Ο·νΛΙ_·Κ·Α·Ρ·Υ-Ο-Κ-ν·Α-Ε-Κ·Ι--Κ-Ε-Ρ·Ρ·ΝΗ2	9
	Αο-Ο-νν-1-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	10
	Αο-0-νν-1-Κ-Α-Ρ-Υ-0-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-1-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	11
	Α0·ΟΛν·1·Κ·Α·Ρ·Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ε·ΚΈ·Ρ-Ρ-ΝΗ2	12
	Αο·Ο·Λ-ί-Κ-Α-Ρ·Υ-Ο-Κ-ν-Ε-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	13
	ΑΟ-Ε-Λ-ί-Κ-Ε-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-ί-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ;	14
	Α€-Ε-νν.ί·Κ·Α·Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α·Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	15
	Αο-Ε-νΥ-Ε-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ε-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ;	16
	Ас-Е-УМ- Κ-Α- Ρ-Υ-β-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α- Ρ-ΝΚ2	17
	Α€-Ε-νν-ί-Κ-Α-Ρ-Υ·Ο-Κ-ν·Ρ-Ε·Κ·1·Κ·Ε-Ρ·Ρ-ΝΗζ	16
	Αο-Ε-νν.ί.Κ-Α-Ρ-Υ-0-Κ·ν-Α·Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΚ2	19
	Αθ-Ε-νΜ-Κ-Α-Ρ-Υ·Ο·Κ·ν-Ρ-Ε·Κ-Ρ-Κ-Ε·Ε·Ρ-ΝΗ2	20
	Αο-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ;,	21
	Ас-А-Р-Υ- О-К-У-ΑΈ-Κ-Ρ- Κ- Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	22
	Ас-А-Ρ-Υ- ϋ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ- Ε-Α·Ρ-ΝΗ2	23
	Ас-АР-Υ- ϋ-Κ-Ρ-Ρ- Ε-Κ- Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ- ΝΗ2	24
	Ас-А-Ρ-Υ [)-Κ-Ρ-Ρ-Ε-Κ-Ρ·Κ·Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	25
	Ас-А-Р-У-О-К-У-А.Е-К-Р-К-Е-А-Р-МНг	26
	Αο-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι.-Κ·Ε-Ρ-Ε-ΝΗ2	27
	Αο-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ·Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ·ΝΗ2	28
	Ас-А-Р-У-О-КА/-Р-Е-К-ЬК-Е-Р-Р-Шг	29
	Αο-Α·Ε-Υ-0-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε·Ρ-Ρ-ΝΗ2	30
	Α€·Κ·Α'Ρ-Υ·Ο·Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ·ΝΗ2	31

- 17 009528

	Ас-ЬР-Υ- Ε-Κ-ν-Ι_-Ε-Κ- Р-К-Е-А- Ρ-ΝΗ2	32
	Αο-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε·Α-Ρ-ΝΗ2	33
	Αϋ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι--Κ-Ε-Ε-Ρ-ΝΗϊ	34
	Αο-Α·Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ε-ΝΗζ	35
	Αο-Α-Ε-ΥΌ-Κν-Ρ-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ;,	36
	Αο-Α-Ρ-Υ-ϋ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ;	37
	Αο-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν·Ε-Ε-Κ-Γ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	38
	Αο-Ο-νν<-Κ-Α-ί-Υ-ϋ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-1-Κ-Ε-Α-1-ΝΗ2	39
	Αο-Ο-νν-Ε-ΚΑ-Ε-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-ΚΑ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ;,	40
	Αο·Ο-ν/-Ρ-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε·Κ-Ρ-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ·Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	41
	Α0-Ε-νν-ί·Κ·Α-1-Υ-Ε-Κ-ν-Α·Ε-Κ-ί-Κ-Ε·Α-1·ΝΗ2	42
	Αο-Ε-νν-ί-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ^	43
	Ас-Ε-νν-Ε-Κ-Α- Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	44
	Αο-Ε-νν-1-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ2	45
	Αο-Ε-ΙΝ-ί-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-Ρ-Ρ-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ-ΝΗ;	46
	Ас-Е-«-Р-К-А-Р-¥-Е-К-Р-Р-Е-К-Р-К-Е-Р-Р-МНг	47
	Αο-Ο-Ρ-ί-Κ-Α-νν-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Α-νν-ΝΗ;	4Β
	Ас-Е-Р-Ь-К-А Λν-Υ·Ε-Κ-ν-Α-Ε·Κ-1-Κ-Ε-Α-νν·ΝΗ2	49
	Αο·β-Ρ-νν·Κ-Α-νΐ/-Υ-Ο-Κ·ν-Α·Ε-Κ·Ε-Κ·Ε-νμ-^-ΝΗ;	50
	Α0-Ε-Ρ-νΐί-Κ.Α.νν-Υ-Ε-Κ.ν.Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-νΐί4Μ-ΝΗ2	51
	Αο-Ο-Κ-1-Κ-Α-Ρ·Υ-Ο·Κ-ν-Ρ·Ε-Υ/-Α-Κ-Ε·Α·Ρ-ΝΗ2	52
	Αο-Ο-Κ-\ν-Κ-Α-ν-Υ-Ο-Κ·Ρ-Α-Ε·Α-Ρ·Κ·Ε-Ρ·ί-ΝΗ2	53
	Αο-Ε-Κ-ί-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Ρ-Ε-'ή*-Α-Κ-Ε·Α-Ρ-ΝΗ2	54
	Αο-Ε-Κ-Λ'-Κ-Α-ν-Υ-Ε-Κ·Ρ-Α-Ε-Α-Ρ-Κ-Ε-Ρ·ί-ΝΗ2	55
	Αθ-0-νν-ί-Κ-Α-Ρ·ν-Ο-Κ-Ε-Α-Ε·Κ-Ρ-Κ-Ε·Α·Υ-ΝΗ2	56
	Αο-Ε-Κ·νΐ/·Κ·Α·ν·Υ-Ε·Κ·Ρ·Α-Ε-Α-Ρ·Κ-Ε-Ρ-1-ΝΗ2	57
	Αο-0-νΐ/-1·Κ·Α·Ρ-ν-Υ·0·Κ·ν-Ρ.Κ.ί-Κ.Ε-Ρ-Ρ·ΝΗ2	58
	Αο-Ε·νΥ·ί·Κ.Α-Ρ.ν-Υ.Ε·Κ·ν-Ρ-Κ-1·Κ·Ε-Ρ’Ρ·ΝΗ2	59
	Αο-0-ν^Ι-Β-Α-Ρ-Υ-0·Κ·ν-Α-Ε-Κ-Ι.-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	60
	Αο-Ε-νν-Ι.-Η-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν·Α-Ε·Κ-Ι--Κ-Ε-Α-Ρ·ΝΗ2	61
	Αο-0-νι/·ί-Κ-Α-Ρ·Υ-Ο·Α-ν·Α·Ε-Κ-ί-Κ-Ε·Α·Ρ-ΝΗ2	62
	Αο-Ε·Υν·1--Κ-Α-Ρ·Υ·Ε-Β-ν-Α-Ε·Κ·Ι.-Κ-Ε-Α·Ρ·ΝΗ2	63
	Αθ-Ρ-νν-Ε-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α·Ε·Α-ί-Κ-Ε·Α·Ρ-ΝΗ2	64
	Αθ-Ε-«·ί-Κ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ·ν-Α·Ε-Α·ί-Κ-Ε·Α·Ρ-ΝΗ2	65
	Αο-Ο-νν-ί-Β-Α-Ρ-Υ-ΟΚ-ν-Α-Ε-Κ-ί-ΡΙ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ;	66
	Αο·Ε-ν/-ί-Ρ-Α-Ρ-Υ-Ε-Κ-ν-Α·Ε·Κ-ί-Α-Ε·Α-Ρ-ΝΗ2	67
	Αο-Ο-νΥ^-Β-Α·Ρ-ΥΌ-ΡΑΛΑ-Ε-Κ-Ι.-Κ·Ε-Α-Ε·ΝΗ2	68

- 18 009528

	Αΰ·Ε·\ν·ί·Α.Α-Ρ-Υ-Ε·Β·ν·Α·ε-Κ·ί·Κ-Ε-Α-Ε-ΝΜ?	69
	Αο-Ο-νν-ί-Ρ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Α-Ε-Α-Ρ-ΝΗ;	70
	Ас-Е-У|/-к-Н-А-Р-У-Е-К-У-А-Е-К-к-Р-Е*А-Р-ИНг	71
	Αο-0-1Λ/-1-Α-Α-Ρ-Υ-0-Α-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	72
	Ас-Ε-νν-ί- В-Α-Ρ-Υ-Ε- Н-У-А-Е- К- ί- К- Е-А-Р- ΝΗ3	73
	Ас-О-ИУ-ЬК-А-Р-УО-К-У-А-Е-А-ЬР-Е-А-Р-МНг	74
	Αο-Ε-νΐΜ.-Κ-Α-Ρ·Υ-Ε-Κ-ν-Α-Ε-Α-Ι--Α-Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	75
	Αο-0-\ν-ί-Α-Α-Ρ-Υ-0-Κ-ν-Α-Ε-Β-1-Κ-Ε-Α-Ρ-ΝΗ:	76
	Αο·Ε·νν·Ι_·Ρ·Α-Ρ·Υ-Ε·Κ·ν-Α·Ε-Α-1-Κ·Ε-Α-Ρ-ΝΗ2	77
	Ο-νΥ-ί-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ-Ρ-Ο-νν-Ι-Κ- Α-Ρ-Υ-0-К-У-АЕ-К-ЬК-Е-А-Р	76
	Ο.νΖ-Ι-ΚΑΡ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε.Κ.υΚ-Ε-Ρ-Ρ-Ρ-ϋ-’Λ'-Ι-Κ- Α-Ρ-Υ-ϋ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Ρ-Ρ	79
	Ο-νΚ-Ρ-Κ-Α-Ε-Υ-Ρ-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ι-Κ-Ε-Α-Ρ-Ρ-ϋ-νΐί-Ρ-Κ. Α-Ρ-ΥΌ-ΚΎ-Α-Ε-Κ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ	80
	О-К-Ь-К-А-Р-У-О-К-У-Р-Е-ИА-К-Е-А-Р-Р-О-К-к-К- Α-Ρ-Υ-ϋ-Κ-ν-Ρ-Ε-νΖ-ί-Κ-Ε-Α-Ρ	81
	Ο.Κ-νν-Κ-Α.ν-Υ.Ο-Κ-Ρ-Α-Ε.Α-Ρ.Κ-Ε-Ρ-Ι-Ρ-Ο-Κ-νν-Κ- Α-ν-Υ-ϋ-Κ-Ρ-Α-Ε-Α-Ρ-Κ-Ε-Ρ-ί	82
	0-νν-Ε-Κ-Α.ρ.Υ·0·Κ-ν·Α.Ε-Κ.Ρ-Κ·Ε-Α-Ρ-Ρ-0-νν-Ρ-Κ- Α-Ρ-Υ-Ο-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ	83
	О-Щ-к-К-А-Р-У-У-Р-К-У-Р-К-к-К-Е-Р-Р-Р-ОАУ-к-К- Α-Ρ-ν-Υ-Р-К-У-Р-К-к-К-Е-Р-Р	84
	0.ν^-1-Κ-Α-Ρ-Υ-Ο-Κ·Ρ·Α·Ε-Κ·Ρ-Κ·Ε-Ρ-Ρ-Ρ-0-\¥-1-Κ- Α-Ρ-Υ-ϋ-Κ-Ε-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Ρ-Ρ	85

¹ Линкеры подчеркнуты

Хотя различные пептиды, приведенные в табл. 1, представлены с ацетильной группой, защищающей аминоконец, и амидной группой, защищающей карбоксильный конец, одна или обе защитные группы могут быть удалены и/или заменены другой защитной группой, как описано в данном контексте. В особенно предпочтительном варианте осуществления пептиды содержат одну или более аминокислот в Ό-форме, как описано в данном контексте. В ряде вариантов осуществления каждая аминокислота (например, каждая энантиомерная аминокислота) в пептидах, приведенных в табл. 1, является Ό-формой аминокислоты.

Отмечено также, что табл. 1 не является полной. Используя описание, представленное в данном контексте, можно рутинным образом получить подходящие пептиды (например, путем консервативных или полуконсервативных замен (например, Ό заменить на Е), удлинений, делеций и т.п.). Так, например, в одном варианте осуществления используют укорочения любого по крайней мере одного пептида, идентифицированного в 8ЕО ΙΌ N0: 2-20 и 39-85. Так, например, 8ЕЦ ΙΌ N0: 21 представляет пептид, содержащий 14 аминокислот С-конца 18А, содержащий одну или более Ό-аминокислот, тогда как 8Е0 ΙΌ N0: 22-38 представляют другие варианты укорочения. Более длинные пептиды также подходят. Данные более длинные пептиды могут полностью образовывать амфипатическую спираль класса А или амфипатическая спираль класса А может образовывать по крайней мере один домен пептида. Кроме того, в данном изобретении рассмотрены мультимерные варианты пептидов. Так, например, пептиды, приведенные в табл. 1, могут быть связаны друг с другом (непосредственно или через линкер (например, углеродный линкер или одну или более аминокислот) с одной или более промежуточных аминокислот). Иллюстративные полимерные пептиды включают в себя 18А-Рго-18А и пептиды 8ЕЦ ΙΌ N0: 79-85, предпочтительно содержащие одну или более Ό-аминокислот, более предпочтительно содержащие каждую из аминокислот в форме Ό-аминокислоты, как описано в данном контексте, и/или имеющие один или оба защищенных конца.

Неожиданный факт, соответствующий данному изобретению, состоит в том, что при инкорпорации Ό-аминокислот в пептиды класса А (например, как показано в табл. 1) последние сохраняют свою активность, но при этом могут вводиться перорально. Более того, данное пероральное введение в результате

- 19 009528 обеспечивало относительно эффективное всасывание и значительный период полужизни, представляя таким образом эффективный способ смягчения по крайней мере одного симптома атеросклероза.

При использовании представленного описания в данном контексте компетентный специалист в данной области может рутинным образом модифицировать проиллюстрированные пептиды класса А, с целью получения других пептидов класса А, соответствующих данному изобретению. Например, можно осуществить рутинные консервативные или полуконсервативные замены (например, Е на Ό) имеющихся аминокислот. Эффект различных замен на аффинность полученного в результате пептида в отношении липидов можно предсказать, используя вычислительный способ, описанный Ра1дипасИап и соавт., Лг1спо5с1сго515. ТИготЬок1к & Уакси1аг Вю1о§у, 16: 328-338, (1996). Пептиды можно удлинить или укоротить настолько, чтобы сохранилась структура α-спирали класса А. Кроме того, можно осуществить замены, делающие конечный пептид более близким пептиду(ам), эндогенно образующемуся в организме субъекта.

В ряде вариантов осуществления пептиды, соответствующие данному изобретению, содержат Όформы пептидов, описанных в патенте США 4643988, более предпочтительно Ό''-формы, в которых один или оба конца связаны с защитными группами. Данные пептиды включают в себя пептиды, имеющие формулуА₁-В₁-В₂-С1-О-Вз-В₄-А₂-С₂-В5-В₆-Аз-Сз-В7-С₄-А₄-В₈-В₉ (8Еф ΙΌ N0: 86), где А_ь А₂, А₃ и А₄ независимо представлены аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой или их гомологами или аналогами; В1, В2, В3, В4, В5, В6, В7, В8 и В9 независимо представлены триптофаном, фенилаланином, аланином, лейцином, тирозином, изолейцином, валином или α-нафтилаланином или их гомологами или аналогами; С1, С₂, С₃ и С₄ независимо представлены лизином или аргинином и Ό представлено серином, треонином, аланином, глицином, гистидином или их гомологами или аналогами, при условии, что, если А1 и А2 представлены аспарагиновой кислотой, то А3 и А4 представлены глутаминовой кислотой, В2 и В9 представлены лейцином, В₃ и В₇ - фенилаланином, В₄ - тирозином, В₅ - валином, В₆, В₈ и Ό - аланином, а С1, С2, С3 и С4 - лизином, и В1 не является триптофаном, где одна из энантиомерных аминокислот находится в форме Ό''-аминокислоты. Предпочтительно, когда по меньшей мере 50% энантиомерных аминокислот находятся в Ό''-форме, более предпочтительно, когда по меньшей мере 80% энантиомерных аминокислот находятся в Ό''-форме и наиболее предпочтительно, когда по меньшей мере 90% или даже все энантиомерные аминокислоты находятся в Ό''-форме.

Хотя в предпочтительных вариантах осуществления в пептидах, соответствующих данному изобретению, используют природные аминокислоты или Ό-формы природных аминокислот, предусмотрены замены неприродными аминокислотами (например, метионинсульфоксидом, метионинметилсульфонием, норлейцином, эпсилон-аминокапроновой кислотой, 4-аминобутановой кислотой, тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислотой, 8-аминокапроновой кислотой, 4-аминомасляной кислотой, Ενκ(Ν(ξ)трифторацетилом), α-аминоизомасляной кислотой и т.п.).

Кроме пептидов класса А в данном контексте предусмотрены пептидомиметики. Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности как непептидные лекарственные вещества со свойствами, аналогичными свойствам матричных пептидов. Данные типы непептидных соединений называют миметиками пептидов или пептидомиметиками (см. статьи ΕаисИе^е, Αάν. Όπι§ Век., т.15,

с. 29, (1986); УеЬег и Ε^е^б^ηде^, ΤΙΝ8, с.392, (1985) и Еνаηк и соавт., 1. Меб. СИет., т. 30, с. 1229, (1987)) и обычно создают с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Миметики пептидов со структурой, близкой терапевтически эффективным пептидам, могут быть использованы для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта.

В общем пептидомиметики являются близкими по структуре полипептиду-образцу (т.е. 5Ε, описанному в данном контексте,), но они имеют одну или более пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из -СН₂NН-, -СН₂8-, -СН₂-СН₂-, -СН=СН-(цис и транс), -СОСН₂-, -СН(ОН)СН₂-, -СН₂80-, и т.п., известными в данной области способами, далее описанными в следующих ссылках: главе, написанной 8раТо1а в монографии под ред. В. УешкТет, Химия и биохимия аминокислот, пептидов и белков (СИетМгу апб ВюсИетШту ок Αт^ηο Α^κ, Рерйбек апб РгоТешк), Магсе1 Оеккег, Νο\ν Уогк, с. 267, (1983); работе 8раТо1а, Уеда ΌηΙη 1(3) Модификации пептидного скелета (Рерббе ВаскЬопе МобШсайопк), (общий обзор), (1983); статье Мог1еу, Тгепбк РИагт. 8ск, с. 463-468, (1980), (общий обзор); статье Нибкоп и соавт., Тпк. Е РерТ. РтоТ. Век., 14:177-185, (1979), (-СН₂NН-, СН₂СН₂-); статьях 8раТо1а и соавт., Ь1ке 8ск, 38:1243-1249, (1986) (-СН₂-8); Напп, Е СИет. 8ос. Реткш Тгапк., τ.Ι, с. 307-314, (1982) (-СН-СН-, цис и транс); Α^₄υίκΐ и соавт., Е Меб. СИет., 23:1392-1398, (1980), (-СОСН₂-); .Тепптдк-УЫТе и соавт., ТеТтаИебтоп Ьей., 23:2533, (1982), (-СОСН₂-); заявка 8хе1ке М. и соавт., Еигореап Αрр1η. ЕР 45665, (1982), СА: 97:39405 (1982) (-СН(ОН)СН₂-); статье Но11абау и соавт., ТеТтакебтоп Ьей., 24:4401-4404, (1983) (-С(ОН)СН₂-) и НгиЬу, Ь1ке 8ск, 31:189-199, (1982), (-СН₂-8-).

Особенно предпочтительной непептидной связью является -Ο^ΝΉ-. Данные миметики пептидов могут иметь существенные преимущества перед полипептидными вариантами осуществления, включая, например, такие, как более экономически выгодное получение, повышенную химическую стабильность, улучшенные фармакологические свойства (период полужизни, всасывание, активность, эффективность и

т. п.), пониженную антигенность и др.

- 20 009528

Кроме того, круговые перестановки пептидов, описанные в данном контексте, или ограниченные пептиды (включая циклизованные пептиды), содержащие консенсусные последовательности или варианты, практически идентичные консенсусным последовательностям, могут быть получены способами, известными в уровне техники (см. статью Κίζο и С1сга8сН. Αηη. Реу. Вюсйеш., т. 61, с. 387, (1992)); например, посредством введения внутренних остатков цистеина, способных к образованию внутримолекулярных дисульфидных мостиков, которые циклизуют пептид.

Получение пептидов.

Пептиды, используемые в данном изобретении, синтезированы химическим путем с использованием стандартных методик химического синтеза пептидов или, в особенности, в случаях, когда пептид не содержит остатки Ό-аминокислот, экспрессированы рекомбинантным образом. При рекомбинантной экспрессии полипептидов организм-хозяин (например, бактерию, растение, грибные клетки и т.п.) культивируют в среде, где одну или более аминокислот представляют организму исключительно в Ό-форме. Тогда рекомбинантно экспрессируемые в данной системе пептиды включают в себя данные Όаминокислоты.

В предпочтительных вариантах осуществления пептиды синтезируют химическим путем с помощью ряда жидко- или твердофазных методик синтеза пептидов, известных компетентным специалистам в данной области. Предпочтительным способом химического синтеза полипептидов, соответствующих данному изобретению, является твердофазный синтез, в котором С-концевую аминокислоту последовательности присоединяют к нерастворимой основе с последующим последовательным добавлением остальных аминокислот последовательности. Методики твердофазного синтеза хорошо известны компетентным специалистам в данной области и описаны, например, в разделе, написанном Вагапу и МегпГ1е1б, Твердофазный синтез пептидов (Зо11б-Рйа8е Рерббе Зуп1йе818) в монографии Пептиды: анализ, синтез, биология (Тйе РерИбек: Апа1у818, Зуп1йе818, Вю1оду), т. 2 Специальные способы синтеза пептидов, (8рес1а1 Ме1йобк ίη Рерйбе ЗупШеМк), часть А, с. 3-284, (1963); см. также статью МегпПе1б и соавт., 1. Ат. Сйет. Зос., 85:2149-2156, (1963) и раздел, написанный З1е^аг1 и соавт. в монографии Твердофазный синтез пептидов (Зо11б Рйаке Рерйбе 8уп1йек1к), 2 изд., Р1егсе Сйет. Со., РоскГогб, III, (1984).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления пептиды синтезируют с помощью процедуры твердофазного синтеза пептидов, используя в качестве твердого носителя бензгидриламинную смолу (Весктап ВюргобисК 0,59 ммоль ΝΗ₂/γ смолы). СООН-концевую аминокислоту (например, 1бутилкарбонил-Рйе) присоединяют к твердому носителю через 4-(оксиметил)фенацетильную группу. Данная связь более стабильна, чем принятая связь на основе бензилового сложного эфира, при этом конечный пептид можно таким же образом отщепить путем гидрирования. Для этой цели используют гидрирование с переносом при использовании муравьиной кислоты в качестве донора водорода. Детальные протоколы, используемые при синтезе пептидов и анализе синтезированных пептидов, описаны в печатном приложении к статье Апап1йагаша1ай и соавт., 1. Вю1. Сйеш., 260(16): 10248-10255, (1985).

Отмечено, что при химическом синтезе пептидов, в частности пептидов, содержащих Όаминокислоты, данный синтез часто приводит к образованию ряда укороченных пептидов в дополнение к желательному продукту полной длины. Процесс очистки (например, ВЭЖХ), как правило, приводит к потере значительного количества продукта полной длины.

В данном изобретении обнаружено, что при синтезе Ό-пептидов (например, Ό-4) для того, чтобы предотвратить потерю при очистке самой длинной формы, можно провести диализ и использовать смесь, устраняя таким образом последнюю стадию очистки с использованием ВЭЖХ. При этом потери смеси составляют приблизительно 50% активности высокоочищенного продукта (например, от массы белкового продукта), но смесь содержит приблизительно в 6 раз больше пептида, обладая таким образом более высокой общей активностью.

Ό-формы аминокислот.

Ό-аминокислоты инкорпорируют в одно или более положений в пептиде, просто используя дериватизированный остаток Ό-формы аминокислоты в химическом синтезе. Остатки Ό-формы для твердофазного синтеза пептидов поставляются в продажу рядом фирм (см., например, Абуапсеб Сйет Тесй, ЬошкУ111е; №уа Вюсйеш, Зап Э1едо; Зщта, З1. Ьошк; Васйет Са1гГогша 1пс., Тоггапсе, и т.п.). Ό-формы аминокислот можно инкорпорировать в любое положение пептида, как это желательно. Так, например, в одном варианте осуществления пептид может содержать одну Ό-аминокислоту, тогда как в других вариантах осуществления пептид содержит по меньшей мере две, как правило, по меньшей мере три, более обыкновенно по меньшей мере четыре, наиболее обыкновенно по меньшей мере пять, предпочтительно по меньшей мере шесть, более предпочтительно по меньшей мере семь и наиболее предпочтительно по меньшей мере восемь Ό-аминокислот. В особенно предпочтительных вариантах осуществления практически каждая другая (энантиомерная) аминокислота является аминокислотой в Ό-форме. В ряде вариантов осуществления по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% энантиомерных аминокислот представлены Ό-формой аминокислот. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления, практически каждая из энантиомерных аминокислот является Ό-формой аминокислоты.

- 21 009528

Защитные группы.

В ряде вариантов осуществления одна или более Р-групп на составляющих пептид аминокислотах и/или концевых аминокислотах блокированы защитной группой. Вне связи с определенной теорией в данном изобретении обнаружено, что блокирование, в особенности, амино- и/или карбоксиконцов данных пептидов, соответствующих данному изобретению, значительно улучшает пероральную доставку и существенно увеличивает период полужизни в сыворотке.

Для этой цели используют широкий ряд защитных групп. Данные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, ацетил, амид и алкильные группы, при этом ацетильная и алкильная группы являются особенно предпочтительными для Ν-концевой защиты, а амидные группы являются предпочтительными для защиты карбоксильного конца. В ряде особенно предпочтительных вариантов осуществления защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропеонил, формил и др. Особенно предпочтительные карбоксилзащитные группы включают в себя амиды, сложные эфиры и образующие простой эфир защитные группы. В одном предпочтительном варианте осуществления ацетильную группу используют для защиты аминоконца, а амидную группу используют для защиты карбоксильного конца. Данные блокирующие группы усиливают тенденции пептидов к образованию спирали. Определенные особенно предпочтительные блокирующие группы включают в себя алкильные группы различной длины, например, группы, имеющие формулу СН₃-(СН₂)_п-СО-, где π лежит в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 20, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 16 или 18, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 13 и наиболее предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 10.

В ряде особенно предпочтительных вариантов осуществления защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, алкильные цепи, как в жирных кислотах, пропеонил, формил и др. Особенно предпочтительные карбоксилзащитные группы включают в себя амиды, сложные эфиры и образующие простой эфир защитные группы. В одном предпочтительном варианте осуществления ацетильную группу используют для защиты аминоконца, а амидную группу используют для защиты карбоксильного конца. Данные блокирующие группы усиливают тенденции пептидов к образованию спирали. Определенные особенно предпочтительные блокирующие группы включают в себя алкильные группы различной длины, например, группы, имеющие формулу СН3-(СН2)п-СО-, где п лежит в интервале от приблизительно 1 до приблизительно 20, предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 16 или 18, более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 13 и наиболее предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 10.

Другие защитные группы включают в себя, без ограничения перечисленным, Ртос, ΐбутоксикарбонил (Вос), 9-флуоренацетильную группу, 1-флуоренкарбоксильную группу, 9флуоренкарбоксильную группу, 9-флуоренон-1-карбоксильную группу, бензилоксикарбонил, ксантил (Хап), тритил (Тй), 4-метилтритил (Мй), 4-метокситритил (Мт1), 4-метокси-2,3,6триметилбензолсульфонил (Мй), мезитилен-2-сульфонил (Мй), 4,4-диметоксибензгидрил (МЬЬ), тозил (Ток), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил (Ртс), 4-метилбензил (МеΒζ1), 4-метоксибензил (МеΟΒζ1), бензилоксигруппу (Βζ1Ο), бензил (Βζί), бензоил (Βζ), 3-нитро-2-пиридинсульфенил (Νργκ), 1-(4,4-диметил-2,6-диоксоциклогексилиден)этил (ББе), 2,6-дихлорбензил (2,6-диС1-Βζ1), 2-хлорбензилоксикарбонил (2-Ο1-Ζ), 2-бромбензилоксикарбонил (2-Βτ-Ζ), бензилоксиметил (Βοт), циклогексилоксигруппу (сНхО), 1-бу1оксиметил (Βит), ΐ-бутоксигруппу (ίΒυΟ), ΐ-бутил (ΐΒυ), ацетил (Ас) и трифторацетил (ТРА).

Защитные/блокирующие группы хорошо известны компетентным специалистам, так же, как способы присоединения данных групп к соответствующему остатку(ам), входящему в состав пептидов, соответствующих данному изобретению (см., например, монографию Сгеепе и соавт., Защитные группы в органическом синтезе (Рго1ес1йе Сгоирк ш Отдашс 8уп1Бекй), 2-ое изд., 1оЬп \УПеу & 8опк, 1пс. 8отегке1, Ν.Γ, (1991)). В одном из предпочтительных вариантов осуществления, например, ацетилирование осуществляют во время синтеза, когда пептид находится на смоле, при использовании уксусного ангидрида. Амидная защита может достигаться посредством выбора подходящей смолы для синтеза. При синтезе пептидов, описанных в данном контексте, в примерах использовали амидную смолу. После окончания синтеза все полупостоянные защитные группы на кислых бифункциональных аминокислотах, таких как Акр и С1и, основной аминокислоте Ьук и гидроксиле Туг одновременно удаляют. Пептиды, снятые с данной смолы путем обработки кислотой, получают с Ν-концом, защищенным ацетилом, и карбоксилом, защищенным ΝΗ₂, и при одновременном удалении всех других защитных групп.

V. Усиление всасывания пептидов.

Удивительным фактом, обнаруженным в данном изобретении, является то, что при введении пептида, состоящего только из Ь-аминокислот (например, если бы это было не так, то он имел бы последовательность пептида, соответствующего данному изобретению), в сочетании с Б-формой (т.е. пептидом, соответствующим данному изобретению), всасывание Б-формы пептида повышается. Так, в ряде вариантов осуществления данное изобретение предусматривает использование комбинаций Б-форм и Ь-форм пептидов в способах, соответствующих данному изобретению. Пептид в Б-форме и пептид в Ь-форме могут иметь различные последовательности аминокислот, однако, в предпочтительных вариантах осуще

- 22 009528 ствления они обе имеют последовательности аминокислот пептидов, описанных в данном контексте, и в еще более предпочтительном варианте осуществления они имеют одну и ту же последовательность аминокислот.

Фактом, обнаруженным в данном изобретении, является то, что конкатамеры пептидов алифатической спирали класса А, соответствующих данному изобретению, также эффективны в плане смягчения по крайней мере одного симптома атеросклероза. Мономеры, входящие в состав конкатамеров, могут быть непосредственно связаны друг с другом или соединены с помощью линкера. В ряде вариантов осуществления линкер представлен аминокислотным линкером (например, пролином) или пептидным линкером (например, 61у₄8ег₃). В ряде вариантов осуществления конкатамер представляет собой 2-мер, более предпочтительно 3-мер, еще более предпочтительно 4-мер и наиболее предпочтительно 5-мер, 8-мер или 10-мер.

νΙ. Фармацевтические препараты.

Для реализации способов, соответствующих изобретению, по крайней мере один пептид или миметик пептидов, соответствующих данному изобретению, вводят, например, субъекту, у которого диагностирован по крайней мере один симптом атеросклероза или риск развития атеросклероза. Пептиды или миметики пептидов могут быть введены в нативной форме или, если это желательно, в форме солей, сложных эфиров, амидов, пролекарств, производных и т. п., при условии, что соль, сложный эфир, амид, пролекарство или производное являются фармакологически приемлемыми, т.е. эффективными в данном способе. Соли, сложные эфиры, амиды, пролекарства и другие производные активных агентов можно приготовить с использованием стандартных процедур, известных компетентным специалистам в области синтетической органической химии, как описано, например, в монографии Магсй, Успехи органической химии, реакции, механизмы и структура (Абуапсеб Огдашс СйетМгу; Веасбопк, МесйапЦтк апб 81гнс1иге), 4-ое изд., Ν.Υ., ^йеуЧШегкшепсе, (1992).

Например, соли, полученные добавлением кислоты, готовят из свободного основания с использованием традиционной методики, которая обычно включает в себя реакцию с подходящей кислотой. Как правило, лекарственное вещество в форме основания растворяют в полярном органическом растворителе, таком как метанол, и добавляют кислоту. Полученная в результате соль выпадает в осадок или может быть выделена из раствора при добавлении менее полярного растворителя. Подходящие кислоты для получения солей при добавлении кислот включают в себя как органические кислоты, например уксусную кислоту, пропионовую кислоту, гликолевую кислоту, пировиноградную кислоту, щавелевую кислоту, яблочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, бензойную кислоту, коричную кислоту, миндальную кислоту, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, р-толуолсульфоновую кислоту, салициловую кислоту и т.п., так и неорганические кислоты, например хлористо-водородную кислоту, бромистоводородную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и т.п. Соль, полученная добавлением кислоты, может быть снова превращена в свободное основание при обработке подходящим основанием. Особенно предпочтительными солями активных агентов, полученными добавлением кислоты, в данном контексте являются галиды, такие, которые могут быть получены при использовании хлористо-водородной и бромисто-водородной кислот. Напротив, получение основных солей пептидов или миметиков проводят аналогичным образом с использованием фармацевтически приемлемого основания, такого как гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония, гидроксид кальция, триметиламин и т.п.

Особенно предпочтительные основные соли включают в себя соли щелочных металлов, например соль натрия, а также соли меди.

Получение сложных эфиров, как правило, включает в себя функционализацию гидроксильных и/или карбоксильных групп, которые могут присутствовать в молекулярной структуре лекарственного вещества. Сложные эфиры обычно представляют собой ацилзамещенные производные свободных спиртовых групп, т.е. структуры, производные от карбоновых кислот формулы ВСООН, где В - алкил и, предпочтительно, низший алкил. Сложные эфиры, если это желательно, могут быть снова превращены в свободные кислоты посредством традиционных процедур гидрогенолиза или гидролиза.

Амиды и пролекарства также могут быть приготовлены с использованием методик, известных компетентным специалистам в данной области или описанных в соответствующей литературе. Например, амиды можно получить из сложных эфиров, используя подходящие реагенты-амины, или они могут быть получены из ангидрида или кислого хлорида при реакции с аммиаком или амином низшего алкила. Пролекарства, как правило, готовят посредством ковалентного присоединения молекулы, которое приводит к образованию соединения, являющегося терапевтически неактивным до его модификации в метаболической системе субъекта.

Пептиды или миметики, идентифицированные в данном контексте, используют для парентерального, наружного, перорального, назального (или иначе ингаляционного), ректального или местного введения, такого как с помощью аэрозоля или чрескожного, с целью профилактического и/или терапевтического лечения атеросклероза и/или его симптомов. Фармацевтические композиции могут применяться в множестве унифицированных лекарственных форм в зависимости от способа введения. Подходящие

- 23 009528 унифицированные лекарственные формы включают в себя, без ограничения перечисленным, порошки, таблетки, пилюли, капсулы, лепешки, суппозитории, пластыри, назальные спреи, инъекционные препараты, имплантационные препараты с задержанным выходом, липидные комплексы и т. п.

Пептиды и/или миметики пептидов, соответствующие данному изобретению, обычно комбинируют с фармацевтически приемлемым носителем (наполнителем) для образования фармакологической композиции. Фармацевтически приемлемые носители могут содержать по крайней мере одно физиологически приемлемое соединение, действие которого заключается, например, в стабилизации композиции или усилении или снижении всасывания активного агента(ов). Физиологически приемлемые соединения могут включать, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, хелатирующие агенты, низкомолекулярные белки, агенты, усиливающие защиту и всасывание, такие как липиды, композиции, которые снижают клиренс или гидролиз активных агентов, или наполнители или другие стабилизаторы и/или буферы.

Другие физиологически приемлемые соединения включают в себя увлажняющие агенты, эмульгаторы, диспергирующие агенты или консерванты, которые в особенности эффективны для предупреждения роста микроорганизмов. Различные консерванты хорошо известны и включают в себя, например, фенол и аскорбиновую кислоту. Компетентный специалист в данной области должен понимать, что выбор фармацевтически приемлемого носителя(ей), включая физиологически приемлемое соединение, зависит, например, от способа введения активного агента(ов) и от специфических физико-химических характеристик активного агента(ов).

Наполнители предпочтительно стерильны и, как правило, не содержат нежелательный материал. Данные композиции можно стерилизовать с помощью обычных хорошо известных способов.

При терапевтическом применении композиции, соответствующие данному изобретению, вводят больному, страдающему от по крайней мере одного симптома атеросклероза или с риском развития атеросклероза, в количестве, достаточном для лечения или по меньшей мере частичного предупреждения или остановки развития заболевания и/или его осложнений. Количество, адекватное для осуществления этого, определяют, как терапевтически эффективную дозу. Количества, эффективные для данного применения, будут зависеть от тяжести заболевания и общего состояния здоровья больного. Может быть проведено одно или множество введений композиций в зависимости от дозы и частоты, необходимых для больного или переносимых им. В любом случае композиция должна обеспечивать достаточное количество активных агентов препаратов, соответствующих данному изобретению, для эффективного лечения (облегчения по крайней мере одного симптома) больного.

Концентрация пептида или миметика может широко варьировать и будет выбрана в основном на базе объемов жидкостей, вязкостей, массы тела и т.п. в соответствии с определенным избранным способом введения и нуждами больного. Однако концентрации, как правило, будут выбраны, чтобы обеспечить дозировки, находящиеся в интервале от приблизительно 0,1 или 1 мг/кг/сутки до приблизительно 50 мг/кг/сутки или несколько выше. Обычные дозировки находятся в интервале от приблизительно 3 мг/кг/сутки до приблизительно 3,5 мг/кг/сутки, предпочтительно от приблизительно 3,5 мг/кг/сутки до приблизительно 7,2 мг/кг/сутки, более предпочтительно от приблизительно 7,2 мг/кг/сутки до приблизительно 11,0 мг/кг/сутки и наиболее предпочтительно от приблизительно 11,0 мг/кг/сутки до приблизительно 15,0 мг/кг/сутки. В ряде предпочтительных вариантов осуществления дозировки находятся в интервале от приблизительно 10 мг/кг/сутки до приблизительно 50 мг/кг/сутки. Будет понятно, что данные дозировки могут варьировать, с целью оптимизации терапевтической схемы для определенного субъекта или группы субъектов.

В ряде предпочтительных вариантов осуществления пептиды или миметики пептидов, соответствующие данному изобретению, вводят перорально (например, в виде таблеток) или в виде инъекций в соответствии со стандартными способами, хорошо известными компетентным специалистам в данной области. В других предпочтительных вариантах осуществления пептиды могут также доставляться через кожу с использованием принятых чрескожных систем доставки лекарственных веществ, т.е. чрескожных пластырей, в которых активный агент(ы) обычно содержится в ламинированной структуре, служащей устройством для доставки лекарственного вещества, которое следует прикреплять к коже. В данной структуре лекарственная композиция обычно содержится в слое или резервуаре, лежащем под последним снизу слоем. Будет понятно, что термин резервуар в данном контексте относится к количеству активного ингредиента(ов), которое в конечном счете имеется для доставки на поверхность кожи. Так, например, резервуар может включать активный ингредиент(ы) в клее на заднем слое пластыря или в любом из множества различных препаратов основы, известных компетентным специалистам в данной области. Пластырь может содержать один резервуар или он может содержать множество резервуаров.

В одном из вариантов осуществления резервуар содержит полимерную основу из фармацевтически приемлемого для контактирования с кожей липкого материала, который служит для прикрепления системы к коже во время доставки лекарственного вещества. Примеры пригодных для контактирования с кожей липких материалов включают в себя, без ограничения перечисленным, полиэтилены, полисилоксаны, полиизобутилены, полиакрилаты, полиуретаны и т. п. Альтернативно содержащий лекарственное вещество резервуар и контактирующий с кожей клей присутствуют в виде индивидуальных отдельных

- 24 009528 слоев. при этом клей лежит под резервуаром. который в данном случае может представлять собой либо полимерную основу. как описано выше. либо может быть жидким или гидрогелевым резервуаром. либо может принимать какую-нибудь иную форму. Слой основы данных ламинатов. который служит верхней поверхностью устройства. предпочтительно действует как основной структурный элемент пластыря и в значительной степени обеспечивает гибкость устройства. Материал. выбранный для слоя основы. предпочтительно является практически непроницаемым для активного агента(ов) и любых других присутствующих материалов.

Другие предпочтительные препараты для наружной доставки лекарственного вещества включают в себя. без ограничения перечисленным. мази и кремы. Мази представляют собой полутвердые препараты. основой которых. как правило. является вазелин или другие производные нефти. Кремы. содержащие выбранный активный агент. обычно представляют собой вязкие жидкие или полутвердые эмульсии. часто либо типа масло в воде. либо типа вода в масле. Основы кремов обычно смываются водой и содержат масляную фазу. эмульгатор и водную фазу. Масляная фаза. иногда называемая также внутренней фазой. в основном состоит из вазелина и жирного спирта. такого как цетиловый или стеариловый спирт; водная фаза обыкновенно. хотя не обязательно. превышает масляную фазу по объему и обычно содержит влагоудерживающее вещество. Эмульгатор в составе крема в основном представлен неионным. анионным. катионным или амфотерным поверхностно-активным веществом. Как это будет понятно компетентным специалистам в данной области. следует использовать специальную основу мази или крема. которая будет обеспечивать оптимальную доставку лекарственного вещества. Как и другие носители или средства переноса. основа мази должна быть инертной. стабильной. нераздражающей и несенсибилизирующей.

В отличие от типичных пептидных препаратов. пептиды. соответствующие данному изобретению. содержащие Э-формы аминокислот. можно вводить даже перорально без защиты от протеолиза желудочной кислотой и т.п. Тем не менее. в ряде вариантов осуществления доставка пептида может быть повышена за счет применения защитных наполнителей. Обычно это осуществляют либо путем комплексирования полипептида с композицией. чтобы сделать его устойчивым к кислотному и ферментативному гидролизу. либо путем упаковки полипептида в соответствующий устойчивый носитель. такой как липосома. Средства защиты полипептидов для пероральной доставки хорошо известны в уровне техники (см.. например. патент США 5391377. в котором описаны липидные композиции для пероральной доставки терапевтических агентов).

Повышенная продолжительность полужизни в сыворотке может быть достигнута за счет использования систем упаковки белков с задержанным выходом. Данные системы с задержанным выходом хорошо известны компетентным специалистам в данной области. В одном предпочтительном варианте осуществления представлена система доставки для белков и пептидов на основе биодеградируемых микросфер РгоБеаке (см. статьи Тгасу. ΒίοΐβοΗηοΙ. Ргсщ.. т. 14. с. 108. (1998); ίοΐιηδοη и соавт.. №11игс Меб.. т. 2. с. 795. (1996); НегЬей и соавт.. РйагтасеиБ Кек.. т. 15. с. 357. (1998)) в виде сухого порошка. состоящего из биодеградируемых полимерных микросфер. содержащих белок в полимерной основе. Система может быть составлена из сухого препарата. содержащего или не содержащего другие агенты.

Способ получения микросфер РгоБеаке специально разработан для достижения высокой эффективности инкапсуляции белка при поддержании целостности белка. Способ состоит из (1) приготовления лиофилизированных белковых частиц из общего объема белка путем распылительной сушки с вымораживанием раствора лекарственного вещества без стабилизирующих наполнителей. (ίί) приготовления суспензии лекарственного вещества и полимера с последующей обработкой ультразвуком или гомогенизацией с целью уменьшения размера частиц лекарственного вещества. (ίίί) получения замороженных микросфер из лекарственного вещества и полимера путем разбрызгивания в жидком азоте. (ίν) экстракции растворителя полимера этанолом и (ν) фильтрации и вакуумной сушки. с целью получения конечного продукта в виде сухого порошка. Полученный в результате порошок содержит белок в твердой форме. который гомогенно и жестко диспергирован в пористых полимерных частицах. Полимер. который наиболее часто используют в данном процессе. поли(лактид-со-гликолид) (РБС). является как биосовместимым. так и биодеградируемым.

Инкапсуляция может достигаться при низких температурах (например. при -40°С). При инкапсуляции белок поддерживают в твердом состоянии в отсутствие воды. минимизируя таким образом индуцируемую водой конформационную мобильность белка. препятствуя реакциям деградации белка. которые включают в себя воду в качестве реагента. и позволяя избежать образования границ разделов органических веществ и воды. на которых может происходить денатурация белков. В предпочтительном процессе используют растворители. в которых не растворимо большинство белков. что приводит таким образом к высокой эффективности инкапсуляции (например. больше чем 95%).

В другом варианте осуществления по крайней мере один компонент раствора может быть представлен в виде концентрата. например. в контейнере для хранения (например. в заранее отмеренном объеме) в готовом для разведения виде или в растворимой капсуле. готовой для введения в объем воды.

- 25 009528

Вышеописанные препараты и способы применения предназначены для иллюстрации, а не ограничения. Следует понимать, что при использовании представленного в данном контексте описания можно легко изобрести другие подходящие препараты и способы применения.

νΙΙ. Препараты на основе липидов.

В ряде вариантов осуществления пептиды, соответствующие данному изобретению, вводят в сочетании с одним или более липидов. Липиды могут быть приготовлены как наполнитель для защиты и/или усиления транспорта/поглощения пептидов или их можно вводить отдельно.

Вне связи с определенной теорией в данном изобретении было обнаружено, что введение (например, пероральное введение) некоторых фосфолипидов может значительно повысить соотношения НББ/БББ. Кроме того, полагают, что транспорт некоторых фосфолипидов средней длины осуществляется процессом, отличным от процесса, участвующего в основном транспорте липидов. Так, совместное введение некоторых фосфолипидов средней длины с пептидами, соответствующими данному изобретению, несет ряд преимуществ: они защищают фосфолипиды от разложения или гидролиза, они улучшают всасывание пептидов и они улучшают соотношения НББ/БББ.

Липиды могут быть сформированы в виде липосом, которые инкапсулируют полипептиды, соответствующие данному изобретению, и/или они могут быть просто комплексированы/смешаны с полипептидами. Способы получения липосом и инкапсуляции реагентов хорошо известны компетентным специалистам в данной области (см., например, статьи Майш и Рарайай)орои1о8, 1. Вю1. СКет., 257:286288, (1982); Рара11аб)орои1о5 и соавт., Ргос. №И. Асаб. 8с1. И8А, 88:11460-11464, (1991); Ниапд и соавт., Сапсег Еее., 52:6774-6781, (1992); Баас и соавт., ЕЕВЗ Бей., 312:255-258, (1992) и т.п.).

Предпочтительные для применения в данных способах фосфолипиды содержат жирные кислоты длиной от приблизительно 4 атомов углерода до приблизительно 24 атомов углерода в положениях 5п-1 и Ы1-2. В ряде предпочтительных вариантов осуществления жирные кислоты являются насыщенными. В других предпочтительных вариантах осуществления жирные кислоты могут быть ненасыщенными. Различные предпочтительные жирные кислоты представлены в табл. 2.

Таблица 2 Предпочтительные жирные кислоты в положении 5п-1 и/или 5п-2 предпочтительных фосфолипидов для введения Ό-полипептидов

Νο. атома углерода Принятое название Название в системе ЮРАС*

3:0	Пропионоил	Триановая
4:0	Бутаноил	Тетрановая
5:0	Пентаноил	Пентановая
6:0	Капроил	Гексановая
7:0	Гептаноил	Гептановая
8:0	Каприлоил	Октановая
9:0	Нонаноил	Нонановая
10:0	Каприл	Декановая
11:0	Унде каноил	Ундекановая
12:0	Лауроил	Додекановая
13:0	Тридека ноил	Тридекановая
14:0	Миристоил	Тетрадекановая
15:0	Пентадеканоил	Пентадекановая
16:0	Пальмитоил	Гексадекановая
17:0	Гептаде каноил	Гептадекановая
18:0	Среароил	Октадекановая
19:0	Нонадеканоил	Нонадекановая
20:0	Арахидоил	Эйкозановая
21:0	Хенайкозаноил	Хенайкозановая
22:0	Бегеноил	Докозановая
23:0	Труцизаноил	Трокозановая
24:0	Лигноцероил	Тетракозановая
14:1	Миристолеоил (9-цис)
14:1	Миристелаидоил (9-транс)
16:1	Пальмитолеоил (9-цис)
16:1	Пальмителаидоил (9-транс)

♦ГОРАС - Международный союз по теоретической и прикладной химии

Жирные кислоты в данных положениях могут быть одинаковыми или различными. Особенно предпочтительные фосфолипиды содержат фосфорилхолин в положении 5п-3.

νΙΙΙ. Дополнительные фармакологически активные агенты.

Дополнительные фармакологически активные агенты могут доставляться вместе с основными активными агентами, например, пептидами, соответствующими данному изобретению. В одном варианте осуществления данные агенты включают в себя, без ограничения перечисленным, агенты, которые снижают риск атеросклеротических событий и/или их осложнения. Данные агенты включают в себя, без ограничения перечисленным, β-блокаторы, комбинации β-блокаторов и тиазидных диуретиков, статины,

- 26 009528 аспирин, ингибиторы АПФ (ангиотензин-превращающего фермента), ингибиторы рецепторов АПФ (АКБ) и т.п.

Подходящие β-блокаторы включают в себя, без ограничения перечисленным, кардиоселективные препараты (селективные в1-блокаторы), например, ацебутолол (Сектрал™), атенолол (Тенормин™), бетаксолол (Керлон™), бисопролол (Цебета™), метопролол (Лопрессор™) и т.п. Подходящие неселективные блокаторы (блокируют в равной степени β 1 и β2) включают в себя, без ограничения перечисленным, картеолол (Картрол™), надолол (Коргард™), пенбутолол (Леватол™), пиндолол (Вискен™), пропранолол (Индерал™), тимолол (Блокадрен™), лабеталол (Нормодин™, Трандат™) и т.п.

Подходящие комбинации β-блокаторов с тиазидными диуретиками включают в себя, без ограничения перечисленным, Лопрессор НСТ, /^С, Теноретик, Корзид, Тимолид, Индерал ЬА 40/25, Индерид, Нормозид и т.п.

Подходящие статины включают в себя, без ограничения перечисленным, правастатин (Правахол/Вг181о1-Муег8 8дшЬЬ), симвастатин (Зокор/Мегск), ловастатин (Мевакор/Мегск), и т.п.

Подходящие ингибиторы АПФ включают в себя, без ограничения перечисленным, каптоприл (например, Капотен™, производимый 8дшЬЬ), беназеприл (например, Лотензин™, производимый Ыоуагйк), эналаприл (например, Вазотек™, производимый Мегск), фосиноприл (например, Моноприл™, производимый Вп81о1-Муег8), лизиноприл (например, Принивил™, производимый Мегск или Цестрил™, производимый А8кга-2епеса), хинаприл (например, Аккуприл™, производимый Ρа^ке-^аν^8), рамиприл (например, Альтаце™, производимый ИоескЧ Мапоп Копеек Ктд Ρйа^тасеиΐ^са18), имидаприл, периндоприл, эрбумин (например, Ацеон™, производимый Кйоηе-Ρо1еηс Когег), трандолаприл (например, Мавик™, производимый Кпо11 Ρйа^тасеиΐ^са18) и т.п. Подходящие АКВ (блокаторы рецептора АПФ) включают в себя, без ограничения перечисленным, лосартан (например, Козаар™, производимый Мегск), ирбесартан (например, Авапро™, производимый 8апой), кандесартан (например, Атаканд™, производимый Айга Мегск), валсартан (например, Диован™, производимый Ыоуагйк) и т.п.

IX. Наборы для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза.

В другом варианте осуществления данного изобретения представлены наборы для облегчения по крайней мере одного симптома атеросклероза или для профилактического лечения субъекта (человека или животного) с риском развития атеросклероза. Наборы предпочтительно включают в себя контейнер, содержащий по крайней мере один пептид или миметик пептидов, соответствующих данному изобретению. Пептид или миметик пептида может быть представлен в унифицированном лекарственном препарате (например, суппозитории, таблетке, капсуле, пластыре и т.п.) и/или необязательно может быть в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

Набор, кроме того, может необязательно содержать по крайней мере один другой агент, используемый при лечении сердечных заболеваний и/или атеросклероза. Данные агенты включают в себя, без ограничения перечисленным, β-блокаторы, вазодилататоры, аспирин, статины, ингибиторы АПФ или ингибиторы рецепторов АПФ (АКВ) и т.п., например, как описано выше.

Кроме того, наборы необязательно включают в себя маркировку и/или инструкционные материалы, в которых представлены указания (т. е. протоколы) по реализации способов или применению терапевтических или профилактических препаратов, соответствующих данному изобретению. В предпочтительных инструкционных материалах описано применение по крайней мере одного полипептида, соответствующего данному изобретению, с целью смягчения по крайней мере одного симптома атеросклероза и/или для предупреждения появления или усиления по крайней мере одного такого симптома у субъекта с риском развития атеросклероза. В инструкционных материалах также могут быть необязательно описаны предпочтительные дозировки/схемы лечения, показания счетчика и т.п.

Хотя инструкционные материалы, как правило, содержат письменные или печатные материалы, они не ограничены этим. Данным изобретением предусматривается любая среда, способная хранить данные инструкции и передавать их конечному пользователю. Данные среды включают в себя, без ограничения перечисленным, электронные среды для хранения информации (например, магнитные диски, магнитофонную ленту, картриджи, чипы), оптические среды (например, СИ КОМ) и т.п. Данные среды могут включать адреса сайтов в Интернете, которые представляют такие инструкционные материалы.

Примеры

Следующие примеры представляют для иллюстрации, но не для ограничения заявленного объема изобретения.

Пример 1.

Показано, что несколько синтетических аналогов пептидов класса А имитируют многие свойства человеческого аро АЛ ш уйго. В данном примере новый пептид (5Р) с повышенной амфипатией вводят путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 20 мкг/сутки в течение 16 недель мышам С57ВЬ/61, которые получают атерогенный корм. Другим мышам делают инъекции мышиного аро АЛ (МоАЦ (50 мкг/сутки) или забуференного фосфатом солевого раствора (ГВ5>) в качестве контроля. Уровни общего холестерина в плазме и профили липопротеинов различаются незначительно между леченой группой и контрольными

- 27 009528 группами за исключением того, что у мышей, получающих 5Е или МоАф наблюдают пониженный уровень липопротеина высокой плотности (НББ)-холестерина при вычислении процента общего холестерина. Не наблюдают никакой токсичности или образования антител против инъецированных материалов. БББ, взятый у животных, которым делают инъекции 5Е, и внесенный в человеческие клетки артериальной стенки 1п уйго, приводит к образованию меньшего количества гидропероксидов липидов и более низкой индуцированной БББ хемотактической активности, чем БББ, взятый от контролей. Кроме того, НЭЕ взятый у мышей, которым делают инъекции 5Е, и внесенный в человеческие клетки артериальной стенки 1п νίΙΐΌ вместе с человеческим БОБ, приводит к значительному снижению образования гидропероксидов липидов и значительному уменьшению индуцированной БОБ хемотактической активности моноцитов. У мышей, получающих пептид 5Е, отмечают значительное уменьшение площади атеросклеротического повреждения по сравнению с мышами, получающими РВ8. Площадь повреждения у мышей, получающих МоАф аналогична площади повреждения у мышей, которым делают инъекцию РВ8. Делают заключение о том, что 5Е может обладать активностью в плане профилактики и лечения атеросклероза.

Материалы и способы.

Пептиды.

Пептид 5Е (Ас-18А [Акр Тгр Ьеи Бук А1а Рйе Туг Акр Бук Уа1 Рйе С1и Бук Рйе Бук С1и Рйе Рйе]ОН₂) синтезируют способом твердофазного синтеза пептидов (см., например, статьи Апап!йагата1ай и СагЬег, Ме1й. ЕпхутоБ 263: 267-282, (1996); Ра1дипасйап и соавт., Айегюкс1егок1к, ТйготЬошк & Уакси1аг Вю1оду, 16:328-338, (1996)). Степень чистоты синтетического пептида определяют с помощью аналитической ВЭЖХ и электроспрей масс-спектрометрии. Пептид диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют перед использованием.

МοАI выделяют из плазмы мышей С57ВБ/61 (плазму в ЕБТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) приобретают в Наг1ап Вюргобисй £ог 8с1епсе, Шбхапаройк, ΙΝ). МοАI выделяют, используя комбинацию гель-фильтрации и колоночной хроматографии с обращенной фазой. Вкратце, удельную массу плазмы подводят до 1,21 г/мл добавлением КВг и центрифугируют при 50000 об/мин в течение 24 ч при 4°С (ротор Т170, Весктап, Еи11епоп, СА). Верхнюю фракцию собирают, диализуют против воды для удаления КВг, лиофилизируют и делипидируют. Осадок растворяют в растворе Сп:БТТ:Трис (3 М гуанидин НС1, 1 мМ дитиотреитол и 10 мМ Трис; рН 8,0), затем диализуют против того же раствора, используя диализные трубки, отсекающие вещества молекулярной массы 12000, с целью удаления из образца большей части аро А-Н и аполипопротеинов С. Затем образец диализуют против воды и лиофилизируют. Осадок растворяют в свежем растворе Сп:БТТ:Тпк и выделяют белки с помощью гель-фильтрации и колоночной хроматографии, используя колонку ХК26/100 (2,6 X 100 см), заполненную насыпной фазой 8црегоке 12 (Рйагташа Вю1есй, Р1кса1а^ау, N1), уравновешенную раствором Сп:БТТ:Трис. Скорость потока составляет 0,5 мл/мин, собирают фракции по 2,5 мл. Фракции, соответствующие пику аро А-Ι, анализируют с использованием δΌδ-РАСЕ (электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия) и затем очищают препаративной ВЭЖХ с С-18 обращенной фазой (см. статью Апап!йагата1ай и СагЬег, Ме1й. Епхуток, 263:267-282, (1996)).

Мыши.

Все эксперименты проводят с использованием самок мышей С57ВБ/61 Цасккоп БаЬога1огу, Ваг НагЬог, МЕ). Мышей приобретают в возрасте шести недель, и исследования с различными диетами начинают проводить с мышами в возрасте восьми недель. В исследованиях метаболизма используют мышей с массой тела 20-22 г. Все исследования на животных заранее рецензируют и утверждают в Институционном Комитете по защите и использованию животных Алабамского университета в Бирмингеме.

Исследования кинетики.

Пептид 5Е, МοАI и человеческий аро А-Ι метят ¹²⁵Ι способом, предложенным Вййетег и соавт., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 260:212-221, (1972). Мыши получают модифицированный атерогенный корм Тйотак-Найгой (#ТЛ88051; Тек1аб, Маб1коп, νΙ) в течение четырех недель, в течение которых им начинают делать внутрибрюшинные инъекции пептида или белка, растворенного в 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (РВ8). Животным инъекционно вводят МοАI или человеческий аро А-Ι в дозе 50 мкг/животное; животные, которым инъецируют 5Е, получают дозу 20 мкг. Для кинетических исследований животных не иммобилизуют, образцы крови берут из ретроорбитального синуса при анестезии ксилазином:кетамином на 15, 30 и 45 мин и 1, 1,5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 и 24 ч после инъекции. От каждого животного получают три образца крови в различные точки времени (все из ретроорбитального синуса при чередовании глаз) и в каждой точке времени отбирают по меньшей мере три образца (у разных животных). Образцы отбирают в гепаринизированные капиллярные трубки, затем помещают в пробирки для микроцентрифуги, плазму отделяют центрифугированием. Повторные аликвоты по 10 мкл каждого образца берут для определения радиоактивности с использованием счетчика γ-излучения (СоЬга; Раскагб ШкйитеШк, Бо^пегк Сгоуе, ББ) в течение 10 мин/образец. Общий объем плазмы рассчитывают как 4,2% от массы тела. Каждый образец выражают как процент инъецированного СРМ в общем объеме плазмы. Свободный ¹²⁵Ι определяют осаждением трихлоруксусной кислотой (ТСА) (1 мл 10% ТСА/10 мкл образца плазмы). Подбор кривой в соответствии с кинетической моделью проводят при использовании всех

- 28 009528 точек данных, а не средних значений по каждой временной точке (см. программу ΡΚΑπαΙνδΙ МюгоМаШ 8с1еп(1Пс 8ойгаге, 8а11 Ьаке Сйу, ИТ).

Протокол инъекций и сбор образцов для исследования повреждений.

Мышей приобретают в возрасте шести недель и рандомизированным образом распределяют в группы по 20 животных, за исключением группы отрицательного контроля из 10 животных, которая не получает лечения и которой дают стандартный смешанный корм для грызунов. В возрасте восьми недель группы, предназначенные для лечения, переводят на модифицированный атерогенный корм ТйотакΗай^οй (#ΤΏ88051; Тек1аб, МабЕоп, XVI) и начинают инъекции. Корм хранят при 4°С и используют не больше трех месяцев после изготовления, чтобы снизить до минимума окисление липидов. Животным делают внутрибрюшинные инъекции ежедневно в течение 16 недель, включая выходные дни и праздники. Двадцати мышам в каждой группе ежедневно инъекционно вводят 200 мкл ΡΒ8 (в качестве положительных контролей), или 20 мкг 5Р в 200 мкл ΡΒ8, или 50 мкг МοΑI в 200 мкл ΡΒ8.

Лиофилизированный пептид 5Р готовят во флаконах, при этом каждый флакон содержит пептид в количестве, достаточном для инъекции на один день. Пептид 5Р лиофилизируют в ΡΒ8 и растворяют в автоклавированной воде МШ1-Ц (Мбйроге Согр., ЕебГогб, ΜΑ) в день инъекции. Объем инъекции для всех групп поддерживают на уровне 200 мкл/мышь/сутки.

Образцы крови берут под анестезией при кровотечении из ретроорбитального синуса при начале исследований (перед введением корма) и во время забора органов. В конце исследования (16 неделя) при последнем кровотечении вырезают сердце и печень. Сердца хранят в 0,9% солевом растворе в течение 1 ч для удаления крови и обеспечения релаксации сердечной мышцы. Затем их фиксируют в забуференном фосфатом 4% формальдегиде в течение по меньшей мере одной недели до получения срезов. Печени удаляют и взвешивают.

Гистологическое определение.

Гистологические определения проводят в соответствии со способом, предложенным Ρίΐί^ΐ'ΐ и соавт. (см. статью Ρа^деη и соавт., Α^ιе^^Ο8с1е^Ο8^8. 10: 316-323, (1990)) с некоторыми модификациями. Вкратце, сердца фиксируют в течение по меньшей мере одной недели в растворе формальдегида, забуференного фосфатом. После удаления нижних 2/3 сердец оставшуюся ткань замораживают в среде ОСТ (Т1ккие-Тек, Мйек 1пс., Ε1кйай, ΙΝ) и делают срезы в криостате при -20°С. Последовательность срезов толщиной 20 мкм хранят на предметных стеклах и наблюдают начало корня аорты. Затем отбирают срезы дополнительных 600 мкм или до округления поперечного среза аорты и до того уровня, пока не исчезнут створки клапанов. Препараты на стеклах окрашивают Масляным Красным О и контрастно окрашивают гематоксилином. Окрашенные площади поперечных срезов поражений измеряют на последовательных препаратах на предметных стеклах, отдаленных друг от друга на 80 мкм путем анализа изображения (81дта8сап Ρ^ο, 8Ρ88 8с1епбйс, СЫсадо, 1Ь) и определяют среднюю площадь поражения для каждого синуса аорты на длине 400 мкм (пять препаратов), получая максимальную среднюю площадь поражения.

Кокультуры. Выделение моноцитов. Выделение липопротеинов. Определение гидропероксидов липидов и хемотактической активности моноцитов.

Кокультуры человеческих клеток артериальной стенки, выделение моноцитов, выделение липопротеинов ультрацентрифугированием из плазмы здоровых людей-доноров или с помощью ΡΡΡΟ из мышиной плазмы и определение гидропероксидов липидов и хемотактической активности моноцитов проводят согласно стандартным способам. Участие всех людей проходит с их информированного согласия, утвержденного Комитетом защиты человека Калифорнийского Университета в Лос-Анжелесе (ΡΟΤΑ) (РС1А ^.1111311 8иЬ)ес15 Ρ^οΐесΐ^οη СоттШее). Протокол тестирования мышиных липопротеинов в кокультуре осуществляют следующим образом. Вкратце, ЬПЬ и ΗΌΕ выделяют с помощью ΡΡΡΟ' из мышиной плазмы, выделенной у мышей, получающих атерогенный корм и инъекции носителя (ΡΒ8) или пептида 5Р в дозе 20 мкг/мышь/день. Кокультуры обрабатывают человеческим ЬПЬ в концентрации 200 мкг/мл белка ЬВЬ, или мышиным ЬПЬ в концентрации 200 мкг/мл, или человеческим ЬПЬ в концентрации 200 мкг/мл + человеческим ΗΌΕ в концентрации 350 мкг/мл белка ΗΌΕ, или мышиным ΗΌΕ в концентрации 300 мкг/мл, или мышиным ΗΌΕ в виде монокомпонента в концентрации 300 мкг/мл. Кокультуры инкубируют с вышеуказанными добавками или без добавок в течение 8 ч при 37°С в присутствии 10% сыворотки, дефицитной по липопротеину (ΕΡΌ8). Супернатанты собирают и анализируют на эквиваленты гидропероксидов липидов по ΑικΛ;κ1ι. Затем кокультуры промывают и инкубируют в свежей среде для культивирования без сыворотки или ΕΡΌ8 в течение дополнительных 8 ч. Кондиционированную среду собирают и анализируют на хемотактическую активность моноцитов.

Химические и аналитические способы - профили липропротеинов холестерина, полученные на колонках (СЬШ)-.

Профили липопротеинов холестерина плазмы измеряют, используя недавно разработанный способ ΟΌΙΡ (см. статью СагЬег и соавт., I Ыр1б Век., 41:1020-1026, (2000)). Вкратце, анализируют 5-10 мкл плазмы, используя одну колонку 8ирегоке 6 (Ρйа^тас^а, Ρίί^;·ιΙ;·ι\ν;·κ N1). Сразу после колонки реагент на холестерин вводят в Т-образную емкость для смешивания, и смесь элюента и реагента входит в реакционный змеевик, расположенный после колонки. Содержание холестерина в смеси элюента определяют спектрофотометрически при длине волны 500 нм и данные для построения точек вводят в компьютер.

- 29 009528

Полученные в результате профили разделяют по пикам компонентов и анализируют по относительной площади. используя программу РеакРй (8Р88 Заемсе. СШса^. 1Б); абсолютные величины холестерина для общего содержания холестерина и пика каждого компонента определяют путем сравнения с контрольным образцом с известными величинами. В ряде случаев фракции собирают. чтобы определить распределение радиоактивности. Способ СЫР позволяет анализировать образцы. полученные от отдельных мышей. избегая использования объединенных образцов.

Определение антител.

Для определения. вызывают ли ежедневные инъекции пептидов иммунный ответ у мышей. проводят непрямое титрование способом ЕБ18А (см. статью Εημνηΐΐ. Ме(11. Εηζутο1.. 70:419-439. (1980)) плазмы. взятой у мышей во время забора органов (после шестнадцати недель ежедневных инъекций). Платы покрывают инъецируемыми пептидами или ΜοΑI (10 мкг/мл). Платы инкубируют в течение ночи. После тщательного промывания забуференным боратом солевым раствором (рН 8.2). содержащим 0.05% Т\уееи 20. и блокирования буфером (0.1% желатина и 0.1% ВЗА в боратном буфере) в течение 1 ч. образцы по 200 мкл разведенной мышиной плазмы (разведение 1:100) серийно разводят 1:1 забуференным боратом солевым раствором. Затем биотинилированное козье антитело против мышиного 1дС (0.1 мкг/мл) вносят в лунки и обрабатывают платы ЗА-НКР (комплексом стептавидина и пероксидазой корня хрена) в течение часа и проявляют с помощью АВТЗ пероксидазы в качестве субстрата. Платы инкубируют в течение ночи при комнатной температуре после каждого добавления антигена/антитела и тщательно промывают забуференным боратом солевым раствором (рН 8.2). содержащим 0.05% Т\уееи 20. и блокируют буфером (0.1% желатин и 0.1% ВЗА в боратном буфере) в течение 1 ч перед добавлением следующего компонента.

Статистические методы.

Группы лечения сравнивают с помощью двустороннего критерия Стьюдента или одностороннего анализа дисперсии (при нормальном распределении данных) или с помощью одностороннего анализа дисперсии в классах (31дта3(а(; 5Р55 Заемсе. СШса^. 1Б). Кинетику метаболизма пептида или белка анализируют путем подбора однокамерной кинетической модели первого порядка. допускающей неравные скорости входа и выхода (РКАиаСЧ; МкгоМаШ ЗскииГк 8οΠ\\τ^. 8а1( Баке С11у. ИТ).

Результаты.

Кинетические исследования.

Кинетика клиренса пептида 5Р человеческого и мышиного аρο А-Ι из мышиной плазмы после внутрибрюшинной инъекции суммирована в табл. 3.

Таблица 3

Краткие итоги кинетических экспериментов на основании обработанных данных

Инъецированный материал	Т1/2 (час.)	Время (час.)/макс. СРМ	Макс. % в плазме	г2
Человеческий аро	15,6	3,61	23,7	0,947
А-1 (50 мкг/мышь)
Мышиный аро А-1	15,7	1,74	13,5	0,928
(50 мкг)
5Р (20 мкг)	6,22	2,36	14,29	0,895

Приведенные данные представляют результаты. полученные при обработке данных в соответствии с однокамерной кинетической моделью первого порядка. допускающей неравные скорости входа и выхода (РКАпаАЧ; МкгоМаШ ЗскШШс 8οΠ\\τ^. 8а1( Баке С11у. ИТ). Сокращения: Т1/2 - половина периода клиренса из плазмы; Макс. % в плазме - процент инъецированной дозы. обнаруженный в общей плазме на уровне пиков; г² - соответствие статистических данных кинетической модели.

Клиренс человеческого и мышиного аρο А-Ι сильно пролонгирован по сравнению с пептидом 5Р. Человеческий аρο А-Ι и 5Р имеют более длительное время выхода на пик в плазме. чем мышиный аρο АΙ. хотя уровни достигнутых пиков в основном близки (пик человеческого аρο А-Ι достигает более высоких уровней. чем другие материалы). Анализ образцов плазмы с помощью колоночной хроматографии демонстрирует. что пептид 5Р и аρο А-Ι (как человеческие. так и мышиные) связываются с липопротеинами плазмы. особенно с частицами в области величины НЭБ (фиг. 6). Соотношение НЭБ:УБОБ по радиоактивности пептидов через 1.5 ч после инъекции 5Р составляет 4.19+0.58 (η=3. р<0.05). Аналогичные результаты обнаруживают через 5 ч после инъекции 5Р (6.44+1.10. р<0.02). Инъецированный пептид сначала содержит меньше 3% свободного ¹²⁵Ι по данным осаждения ТСА. Однако через 1.5 ч после инъек

- 30 009528 ции радиоактивность свободного ¹²⁵Ι в плазме, выраженная как процент от общей элюированной радиоактивности, значительно повышается для 5Р, составляя 26,9±9,4% и к 5 ч составляет 34,4±4,8%, отражая ожидаемый клиренс липопротеинов и связанных с липопротеинами пептидов. Скорость увеличения радиоактивности, обусловленной свободным иодом, от 1,5 до 5 ч меньше, чем при инъекции, что, возможно, предполагает значительную исходную деградацию пептида в брюшной полости.

Выживаемость и общая морфология при смешанном или атерогенном корме.

В ходе длительных диетических исследований только три мыши погибают по невыясненным причинам. Два животных получают МоА1 и одно получает пептид 5Р. Во время забора органов между группами не отмечают никаких различий в общей морфологии. У всех животных, получающих атерогенный корм, печени увеличены, но ни массы печеней, ни масса печени в процентах от массы тела не отличаются между группами (табл. 4). Все животные, получающие атерогенный корм (включая животных, которым делают инъекцию ΓΒ^), имеют более низкую массу тела, чем контрольные животные, получающие смешанный корм (см. табл. 4).

Таблица 4

Массы тела и печени после лечения

Корм и Подгруппа	Масса тела, г	Масса печени, г	Печень/Тело, %
Смешанный	23,38 + 0,52	0,99±0,02	4,24±0,04%
Атерогенный	20,55 ±0,32*	1,60±0,04	7,84+0,26%
ΡΒδ (п=14)
5Е (п=15)	21,60±0,28	1,61 ±0,04	7,46±0,23%
ΜοΑΙ (п=14)	21,16 + 0,34	1,72±0,04	8,15+0,23%*

* р<0,05 в отношении 5Р; двусторонний ΐ-тест

Приведенные данные представляют среднее значение±8ЕМ масс, полученных во время забора органов (через 16 недель лечения). Животные, находящиеся на смешанном корме, не получают инъекции. Других мышей держат на атерогенном корме, как описано в разделе Способы. Группа РΒ8 получает ежедневные внутрибрюшинные инъекции 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора. Группа 5Р получает ежедневные внутрибрюшинные инъекции 20 мкг 5Р в 200 мкл РΒ8Р и группа МоА1 ежедневно получает 50 мкг МоА1 в 200 мкл РΒ8.

Антигенность.

Образцы крови, взятые в заключение 16-недельного периода инъекций, тестируют на присутствие антител против пептидов. Антитела против пептида 5Р или против МоА1 не обнаружены (данные не приводят). Перекрестные эксперименты, в которых платы для проведения ЕЬ18А покрывают пептидом или белком, которые не инъецируют серии животных, приводят к результатам, в основном идентичным результатам, полученным при прямом определении присутствия антител (данные не приводят).

Характеризация липопротеина и аполипопротеина.

Значения общего холестерина и липопротеинов холестерина, определенные способом С11Р, представлены в табл. 3. Точность значения общего холестерина подтверждают путем анализа холестерина вручную (С1ю1ек1его1 1000; 81дта, 8ΐ. Ьошк, МО) (данные не приводят). Между группами лечения не наблюдают значительной разницы в уровнях общего холестерина и липопротеиновых фракций холестерина. Однако, когда липопротеиновые фракции выражают как процент от общего холестерина (см. табл. 5), НБЬ-холестерин составляет значительно более низкий процент в группах 5Р и МоА1 по сравнению с группой РΒ8.

- 31 009528

Таблица 5 Уровни общего холестерина и липопротеинов холестерина (мг/дл и процент от общего холестерина)

через 16 недель получения смешанного или атерогенного корма
νωι.	οοί+ил.	НОЬ	ТС
Смешан-	11,66 ±2,34	23,68±3,51	37,30±2,52	72,64 ±5,58
ный корм	(16,61 ±3,55%)	(31,66 ±3,61%)	(51,73 ± 1,75%)
Атерогенный корм
РВ5	88,36 ±5,48	75,82±7,64	24,36 ±2.19	188,54± 14,22
	(47,26± 1,37%)	(39,83± 1,34%)	(12,91 ±0,68%)
5Р	100,34 ±15.72	83,37 ±8,15	17,92±2,91	201,63 ±25,21
	(47,96 ±3,26%)	(42,80 ±2,51%)	(9,24± 1,18%')
МоА1	100,08±9,73	87,86±8,34	19,50±3,07	207,45 ±16,94
	(48,23 ±2,75%)	(42,44±2,46%)	(9.34 ±1,19%')

* р<0,05 или меньше в сравнении с РВЗ с помощью двустороннего ΐ-теста

Данные выражены как среднее значение мг/дл ±ЗЕМ и (в скобках) как процент от общего холестерина.

Сокращения: νΣΌΕ - липопротеин очень низкой плотности; БББ - липопротеин средней плотности; БББ - липопротеин низкой плотности; НББ - липопротеин высокой плотности; ТС - общий холестерин; МоА1 - мышиный аро А-Ι; РВЗ - забуференный фосфатом солевой раствор.

Животные, находящиеся на смешанном корме, не получают инъекции. Других мышей держат на атерогенном корме, как описано в разделе Способы. Группа РВЗ получает ежедневные внутрибрюшинные инъекции 200 мкл забуференного фосфатом солевого раствора. Группа 5Б получает ежедневные внутрибрюшинные инъекции 20 мкг 5Б в 200 мкл РВЗР и группа МоА1 ежедневно получает 50 мкг МоА1 в 200 мкл РВЗ. Число мышей, как показано в табл. 4.

Взаимодействие мышиных липопротеинов с человеческими клетками артериальной стенки.

Недавно обнаружено, что нормальный НББ ингибирует три стадии в образовании мягко окисленного БББ. В данных исследованиях (см. одновременно рассматриваемую заявку υδδΝ 09/541468, поданную 31 марта 2000 г.) продемонстрировано, что обработка человеческого БББ ш ν Иго аро А-Ι или пептидным миметиком аро А-Ι (37рА) удаляет молекулы-затравки из БББ, включающие НРОБЕ и НРЕТЕ. Данные молекулы-затравки сообщают кокультурам человеческих клеток стенок артерий способность окислять БББ и БББ способность индуцировать продукцию в клетках артериальной стенки хемотактической активности моноцитов. Продемонстрировано также, что БББ, выделенный у мышей или людейдобровольцев после инъекции/инфузии им аро А-Ι, является устойчивым к окислению человеческими клетками артериальной стенки и не индуцирует хемотактическую активность моноцитов в кокультурах клеток артериальной стенки. На фиг. 7 демонстрируют, что НББ, полученный в данном исследовании у мышей, получающих атерогенный корм и которым делают инъекции РВЗ, не подавляет окисление человеческого БББ (см. фиг. 7 А) и не ингибирует индуцируемую БББ хемотактическую активность моноцитов (см. фиг. 7В) в кокультурах человеческих клеток артериальной стенки. Напротив, НББ мышей, получающих атерогенный корм и которым делают ежедневные инъекции пептида 5Б, эффективен в плане подавления окисления человеческого БББ и предупреждает индуцируемую БББ хемотактическую активность моноцитов в кокультурах, как нормальный человеческий НББ. На фиг. 7 показано также, что БББ, полученный от мышей, находящихся на атерогенном корме и получающих ежедневные инъекции РВЗ, легче окисляется и легче индуцирует хемотактическую активность моноцитов, чем БББ, полученный от мышей, находящихся на том же корме, но которым делают ежедневную инъекцию 20 мкг пептида 5Б. В клетках артериальной стенки, обработанных любым из липопротеинов, не отмечают цитотоксичность (данные не приводят). Аналогичные результаты получают в трех из трех отдельных экспериментах (данные не приводят).

- 32 009528

Образование повреждений.

Средние поперечные площади повреждений представляют на фиг. 8. Как ожидают, в группе, получающей нормальный мышиный смешанный корм, повреждения не наблюдают (данные не представляют). Как показывают ранее (см. статью Ращеп и соавт., Айепокс1егок1к, 10:316-323, (1990)), значительные вариации площади поражения наблюдают во всех группах, получающих атерогенный корм. Однако животные, которым инъецируют 5Р, имеют достоверно более низкую среднюю площадь повреждения, чем животные, которым инъецируют РВЗ, что показано как при анализе с использованием двустороннего ΐтеста (Р<0,002), так и при одностороннем анализе дисперсии в классах (Р<0,001; определено вследствие ненормального распределения средних поверхностей повреждений). Инъекция МоА1 не дает разницы в площади повреждения сравнительно с инъекцией РВЗ, и площадь повреждения значительно больше, чем у животных, которым делают инъекцию 5Р, что определяют с помощью ΐ-теста (р<0,002) и одностороннего анализа дисперсии в классах (р<0,001).

Обсуждение.

Ранее показано, что синтетические пептиды, разработанные для имитации мотива амфипатической спирали класса А, способны связываться с фосфолипидами и проявляют многие биологические свойства, близкие человеческому аро А-Ι (3, 8, 10, 14, 15, 20). Показывают также, что при внутривенном введении данных пептидов животным они, как обнаружено, связываются с липопротеинами плазмы (11). Данное исследование предпринимают для поддержки гипотезы о том, что новый пептид 5Р с теоретически повышенной аффинностью к липидам должен был бы обладать антиатерогенными свойствами.

Представленные исследования демонстрируют, что данный пептид 5Р проникает в плазму после внутрибрюшинной инъекции и достигает в плазме уровней, примерно сопоставимых с МоА1, но меньших, чем у человеческого аро А-Ι (см. табл. 3 и фиг. 6). Полупериод плазменного клиренса 5Р короче, чем у мышиного или человеческого аро А-Ι после внутрибрюшинной инъекции. После инъекции большую часть 5Р обнаруживают в области НИЬ (см. фиг. 6), несмотря на то, что при атерогенном корме преобладание циркулирующего холестерина отмечают в областях УЪОЬ, ГОЬ и ЬОЬ.

Уровни и распределение плазменного холестерина существенно не различается в получающих инъекции группах, находящихся на атерогенном корме (см. табл. 5). Однако, когда липопротеиновые фракции выражают как процент от общего холестерина (см. табл. 5), НИЬ-холестерин составляет значительно меньший процент в группах 5Р и МоА1 по сравнению с группой РВЗ.

Нормальный НИЬ ингибирует три стадии образования мягко окисленного ЬОЬ. Демонстрируют, что обработка человеческого ЬОЬ ш ν 11го аро А-Ι или пептидным миметиком аро А-Ι удаляет из ЬОЬ молекулы-затравки, которые включают НРОИЕ и НРЕТЕ. Данные молекулы-затравки сообщают кокультурам человеческих клеток артериальной стенки способность окислять ЬОЬ и ЬОЬ-способность индуцировать продукцию в клетках артериальной стенки хемотактической активности моноцитов (см. одновременно рассматриваемую заявку υ33Ν 09/541468, поданную 31 марта 2000 г.). Продемонстрировано также, что после инъекции аро А-Ι мышам или инфузии человеку ЬОЕ выделенный у мышей или людейдобровольцев, является устойчивым к окислению человеческими клетками артериальной стенки и не индуцирует хемотактическую активность моноцитов в кокультурах клеток артериальной стенки. В данных исследованиях НИЬ от мышей, получающих атерогенный корм и которым делают инъекции РВЗ, не подавляет окисление человеческого ЬОЬ (см. фиг. 7А) и не ингибирует индуцируемую ЬОЬ хемотактическую активность моноцитов (см. фиг. 7В) в кокультурах человеческих клеток артериальной стенки. В противоположность этому обнаружено, что НИЬ мышей, получающих атерогенный корм и которым делают инъекции пептида 5Е, эффективен в плане подавления окисления человеческого ЬОЬ и предупреждает индуцируемую ЬОЬ хемотактическую активность моноцитов в кокультурах, как нормальный человеческий НИЬ (см. фиг. 7). ЬОЕ полученный от мышей, находящихся на атерогенном корме и получающих инъекции 5Е, менее легко окисляется и хуже индуцирует хемотактическую активность моноцитов, чем ЬОЕ полученный от мышей, находящихся на том же корме, но которым делают ежедневную инъекцию РВЗ (см. фиг. 7). Возможно, что 5Е взаимодействует с ЬОЬ в кровотоке (либо перед, либо после связывания с НИЬ) и удаляет молекулы-затравки, необходимые для окисления ЬОЬ и индуцированной ЬОЬ хемотактической активности моноцитов способом, аналогичным описанному для близкого пептида 37рА ш νΐΐΐΌ (одновременно рассматриваемая заявка υЗЗN 09/541468, поданная 31 марта 2000 г.).

Реакции ш νίΙΐΌ человеческих клеток артериальной стенки с НИЬ и ЬОЬ мышей, получающих атерогенный корм и которым делают инъекцию пептида 5Е, согласуется с защитным действием 5Е ш νί\Ό. Несмотря на близкие уровни общего холестерина, ЕОЬ-холестерина, ШЬ+УЕПЬ-холестерина и пониженный уровень НОЬ-холестерина как процента от общего холестерина, у животных, получающих атерогенный корм и инъекции 5Е, число повреждений значительно меньше (см. фиг. 8). Данные результаты до некоторой степени аналогичны результатам, полученным Зйай и соавт. (см. статью Зйай и соавт., С1гси1а!юп, 97:780-785, (1998)), которые обнаружили, что несмотря на наличие гиперхолестеринемии, аро А-Ι^^ препятствует развитию атеросклеротических повреждений у аро Е-дефицитных мышей.

Причина, по которой человеческий аро А-Ι успешно используют для предупреждения/уменьшения атеросклероза у животных (см. статьи ХУПкоп и соавт., Айепокс1егок1к, 8:737-741, (1988); РиЫп и соавт., Шине, 353:265-267, (1991); Ра^1у и соавт., 1. С1т. [псек!., 94:899-903, (1994); Р1итр и соавт., Ргос. №И.

- 33 009528

Асаб. 8сг И8А, 91:9607-9611, (1994); δΐιηΐι и соавт., Спси1айоп, 97:780-785, (1998)), но ежедневная инъекция ΜоΑI в дозе 50 мкг в данных исследованиях не приводит к таким результатам, неясна. Показывают, что ΜоΑI не образует такие стабильные белково-липидные комплексы, как человеческий аро АЛ (см. статью Сопд и соавт., ВюсЫт. ВюрЬук. Ас1а, 1213:335-342, (1994)). Как показывают, мышиный ИОЬ легче денатурируется гуанидингидрохлоридом, чем человеческий ИОЬ (см. статью Сопд и соавт., ВюсЫт. ВюрЫъ. Ас1а, 1213:335-342, (1994)), позволяя предположить, что пептиды амфипатической спирали могли бы замещать ΜоΑI из мышиного ИОЬ легче, чем человеческий аро АЛ из человеческого ИОЬ. Данные различия могут или не могут объяснить, почему ΜоΑI не уменьшает в значительной мере повреждения в данном исследовании. Может также быть, что в используемых условиях требуется повышенная доза МоАЬ В любом случае пептид 5Е является в данных условиях высокоэффективным, а ΜоΑI - не является.

В заключение протокола инъекций анализ плазмы показывает, что против пептида 5Е не образуются антитела. Это неудивительно, поскольку показано, что связывающие липиды белки не вызывают образование антител, по-видимому, поскольку данные пептиды связывают липиды так, что эпитопы, необходимые для того, чтобы вызывать иммунный ответ, оказываются закрытыми (см. статьи МигапЙЫ, I. Ρΐιηηη. 8ос. 1арап, 117:394-404, (1997); Ейскег и Эге^ег, I. Ρерй6е 8сг, 2:195-211, (1996)).

Проведенное предварительное исследование предполагает, что трансгенные мыши, экспрессирующие пептид амфипатической спирали класса А (37рА) с теоретически более низкой аффинностью, чем у пептида, используемого в данном исследовании, могут быть устойчивыми к атеросклерозу (см. статью СагЬег и соавт., С1гси1айоп, 96:1-490, (1997)). Данное исследование предполагает, что пептид 5Е, вероятно, обладает большими возможностями в плане разъяснения механизмов, участвующих в атерогенезе, и обладает также терапевтической активностью.

Пример 2. Эффективность Ό-пептидов.

Данный пример демонстрирует эффективность Ό-пептидов, соответствующих данному изобретению. Кокультуры человеческих клеток стенки аорты инкубируют со средой без добавления иных компонентов (ΕΌΕ БЕЗ КЛЕТОК или КЛЕТКИ, БЕЗ ΌΌΌ), с контрольным ΌΌΌ здоровых субъектов в концентрации 250 мкг/мл (ΌΌΌ) и ЬОЬ + контрольный ΗΌΌ здоровых субъектов в концентрации 350 мкг/мл (+ΗΌΌ). Другие кокультуры инкубируют с контрольным ЬОЬ вместе с различными количествами (показанными в мкг на оси абсцисс) либо Ό-2Ρ, либо Ь-2Е (третья панель слева, 2Е) или Ό-37-рА, либо Ь-37рА (последняя панель справа, 37рА). Данные представляют среднее+δΌ значений, полученных на кокультурах в четырех повторностях. Все значения, полученные с ΗΌΌ или добавлением пептидов, достоверно отличаются от опыта с ЬОЬ без добавления иных компонентов (первая панель слева) на уровне р < 0,01.

Кокультуры инкубируют в течение 4 ч при 37°С в присутствии 10% ΌΡΌ8 для получения мягко окисленного ЬОЬ. Затем отбрасывают супернатанты, кокультуры промывают и инкубируют со средой для культивирования, не содержащей сыворотку или ΌΡΌ8, в течение дополнительных 4 ч. Кондиционированную среду собирают и анализируют на хемотактическую активность моноцитов. Как показывают, на фиг. 9, обработка ЬОЬ Ό-пептидами ш уйго предупреждает их окисление клетками артериальной стенки.

На фиг. 10 демонстрируют, что введение Ό-пептидов мышам делает их красные кровяные клетки устойчивыми к гемолизу (феномен, обусловленный окислением, поскольку его проявлению может препятствовать витамин Е, данные не представляют). Группам мышей, дефицитных по рецептору ЬОЬ (п=3), которых обычно используют в качестве модели образования атеросклеротических повреждений на животных, вводят через зонд Ό-пептиды или носитель в форме солевого раствора. Каждому животному вводят 100 мкг солевого раствора, 100 мкг/100 мкл пептида Ό-2Ρ или пептида О-37рА. Кровь отбирают из ретроорбитального синуса под мягкой анестезией через 17 и 48 ч. Красные клетки, отделенные центрифугированием, разводят в 10% гематокрите с ΡВ8 и инкубируют при 37°С при осторожном встряхивании. Аликвоты отбирают в точках времени 1=0, 2, 6 и 18 ч, отбрасывают и измеряют оптическую плотность выделившегося гемоглобина.

На фиг. 11 демонстрируют, что введение зондом Ό-пептидов мышам и последующее выделение их ЬОЬ делает ЬОЬ устойчивым к окислению клетками артериальной стенки, что измеряют с помощью биоанализа хемотаксиса моноцитов.

Другой эксперимент демонстрирует, что Ό-пептид всасывается из желудка и делает ЬОЬ не способным индуцировать хемотактическую активность моноцитов на модели кокультуры человеческих клеток артериальной стенки, тогда как Ь-пептид 2Е не обладает данным свойством. Солевой раствор, либо 2Е, синтезированный из Ό-аминокислот или из Ь-аминокислот, вливают в желудки мышей с помощью зонда (инстилляция в желудок с помощью трубки). После вливания с помощью зонда у мышей берут кровь и их ЬОЬ выделяют и добавляют в кокультуры человеческих клеток артериальной стенки. Όпептид, будучи введенным через зонд, защищает ЬОЬ, что доказывают на основании пониженного хемотаксиса моноцитов, индуцируемого ЬОЬ, выделенного у мышей, которые получают пептид Ό-2Ρ (Ό2ΡΕΌΕ) (синтезированный из Ό-аминокислот), тогда как ЬОЬ, выделенный у мышей, которые получают Ь-2Е (синтезированный из природных Ь-аминокислот) (Ь2ЕЬОЬ), легко индуцирует хемотаксис моноцитов (см. фиг. 12).

- 34 009528

2Ε, синтезированный из Ь-аминокислот, при воздействии на ЬОЬ ш νίΙΐΌ является эффективным в той же мере, что 2Ε, синтезированный из Ό-аминокислот (см. фиг. 9). Так, разница в результатах с данным экспериментом, в котором пептиды вводят ш νί\Ό через зонд, показывает, что 2Ε, синтезированный из Ό-аминокислот, должен всасываться из желудка интактным, тогда как пептид 2Ε, синтезированный из природных Ь-аминокислот, должен разлагаться в желудке в процессе переваривания и/или в плазме, что, как предполагают, могло бы быть в данном случае. В других исследованиях доказательств образования антитела против пептида Ό-2Ε не наблюдают.

Фиг. 13А и 13В представляют собой два графических отображения экспериментов, в которых мышам с выбитым (нокаутированным) рецептором ЬОЬ с помощью зонда вводят 50 мкг Ό-5Ε. У животных берут кровь через 1,5, 3 или 6 ч и выделяют их НОЬ, ЬОЬ и УЬОЬ/ГОЬ. Как показывают на графике, НОЬ, взятый через 1,5 ч после введения зонда, не защищает контрольный ЬОЬ от модификации, но НОЬ, взятый через 3 ч и немного меньше, чем через 6 ч после введения зонда, обладает теми же защитными свойствами в отношении продукции индуцированной ЬОЬ хемотактической активности моноцитов в человеческих клетках артериальной стенки, что контрольный НОЬ (см. фиг. 13 А). На другом графике (см. фиг. 13В) представляют выделение мышиного ЬОЬ и УЬОЬ/ГОЬ через 1,5, 3 или 6 ч после введения через зонд 50 мкг Ό-5Ε. На левой панели показывают, что контрольный ЬОЬ добавляют к человеческим клеткам артериальной стенки без контрольного НОЬ или с контрольным НОЬ и измеряют хемотактическую активность моноцитов, образуемую клетками артериальной стенки. На средней панели представляют добавление ЬОЬ, взятого через 1,5, 3 или 6 ч после введения через зонд 50 мкг Ό-5Ε, к клеткам артериальной стенки. Результаты показывают, что через 3 и 6 ч ЬОЬ индуцирует значительно меньшую хемотактическую активность моноцитов. На правой стороне графика показывают, что добавление фракции УЬОЬ/ГОЬ липопротеинов (У/ГОЬ), как представлено во временной точке 3 ч, индуцирует значительно меньшую хемотактическую активность моноцитов.

Пример 3. Эффекты повышения гидрофобности на физико-химические и биологические свойства пептида амфипатической спирали класса А.

Список сокращений: Ас₂О - уксусный ангидрид; аро Α-Ι - аполипопротеин Α-Ι; β8Α - бычий сывороточный альбумин; САО - заболевание коронарной артерии; СО - круговой дихроизм; ОМРС - димиристоилфосфатидилхолин; О1РоРЕ - ди-(16:1) пальмитолеоилфосфатидилэтаноламин; О8С - дифференциальная сканирующая калориметрия; Е^ΤΑ - этилендиаминтетрауксусная кислота; ЕРС - яичный фосфатидилхолин; ΕМ0С - флуоренилметилоксикарбонил; Сбп НС1 - гуанидин гидрохлорид; НАЕС - человеческие эндотелиальные клетки аорты; НΑ8МС - человеческие клетки гладкой мускулатуры аорты; НВТи - 2-(Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуронийгексафторфосфат; НОЬ - липопротеин высокой плотности; НРЬС (ВЭЖХ) - высокоэффективная жидкостная хроматография; ЬСАТ - лецитинхолестерин-ацилтрансфераза; МСР-1 - моноцитарный хемотактический белок-1; М-С8Ε - макрофагеальный колониестимулирующий фактор; МЬУ - мультиламеллярные (многослойные) носители; NММ Ν-метилморфолин; РВ8 - забуференный фосфатом солевой раствор; РГОЕ8 - пиперазин-НИ-бис|2этансульфоновая кислота]; ВР-НРЬС - высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой; ТРА - трифторуксусная кислота.

Резюме.

Недавно показано, что амфипатический пептид 5Ε класса А с повышенной амфипатичностью защищает мышей от индуцируемого кормом атеросклероза. Теперь исследуют эффекты повышения гидрофобности серии гомологичных амфипатических пептидов класса А, включая 5Ε, на физические и функциональные свойства, связанные с подавлением атеросклероза путем методичной замены имеющихся неполярных аминокислот фенилаланином. Пептиды на основе последовательности Α^Ό-№-ΕΚΑ-Ε-Υ-^-Κ-У-Α-Е-Κ-^-Κ-Е-Α-Ε-NН₂ (81Т) ГО N0:1, Α^^Α-Ν^ или 2Ε) представляют 3Ε³ (Α^Ε³18ΑN^0, 3Ε¹⁴ 4Ε (Α^Ε^^Α-Ν^), 5Ε 6Ε (Α^Ε^10,11,14,17^-^^ и

7Ε (Αс-Ε^{3,10,11,14,17}18Α-NН₂). Измерения растворимости в воде, времени удерживания при ВЭЖХ, исключающего давление проникновения в монослой яичного РС и скорости солюбилизации яичного РС, показывающие резкое повышение гидрофобности между пептидами 4Ε и 5Ε, осуществляют на основании повышения способности связываться с фосфолипидами. Пептиды 6Ε и 7Ε являются менее эффективными, что указывает на ограничение стимуляции взаимодействия липидов с данными пептидами при повышении гидрофобности. Несмотря на данное заметное повышение аффинности к липидам, данные пептиды являются менее эффективными, чем аро Α-Ι в плане активации плазменного фермента лецитинхолестерин-ацилтрансферазы (^СΑΤ), при этом 5Ε лучше других активирует ЬСАТ (80% от уровня аро Α-Ι). Пептиды 4Ε, 5Ε и 6Ε являются в равной степени сильными ингибиторами индуцированной ЬОЬ хемотактической активности моноцитов. Данные исследования предполагают, что для оптимальной биологической активности амфипатических пептидов необходим соответствующий баланс между пептиднопептидными и пептидно-липидными взаимодействиями. Данные исследования представляют рациональную основу для конструирования маленьких миметиков аро Α-Ι с повышенной способностью подавления атеросклероза.

- 35 009528

Введение.

Показана обратная корреляция плазменных уровней липопротеинов высокой плотности (НОЬ) и аполипопротеина А-Ι (аро А-Ι), основного белкового компонента НОЬ, с заболеванием коронарной артерии (САО) (см. статьи 8ргесйег и соавт., Аг1епозс1ег. ТйготЬ., 13:495-504, (1993); РЫ11рз и соавт., Спси1аΙίοη. 88:2762-2770, (1993)). Человеческий аро А-Ι представляет собой белок из 243 остатков, содержащий восемь повторов 22-мера амфипатической спирали, большинство из которых, как показано, содержат мотив класса А (см. статью 8ещез1 и соавт., Рго1ешз, 8:103-117, (1990); материал Апап1йагата1ай и соавт. в монографии Амфипатическая спираль (Т1е АтрЫра1Ыс Не11х), под ред. Ерапб В. М., СЯС Ргезз, Воса Ва1оп, РЬ, с. 109-142 (1993)). Амфипатические спирали класса А имеют характерное распределение заряда; они содержат кластер положительно заряженных аминокислот на границе полярной и неполярной поверхностей α-спирали и отрицательно заряженные остатки в центре полярной поверхности (см. статью 8ещез1 и соавт., Рго1ешз, 8:103-117, (1990); материал Апап1йагата1ай и соавт. в монографии Амфипатическая спираль (Т1е АтрЫра1Ыс Нейх), под ред. Ерапб В. М., СВС Ргезз, Воса Ва1оп, РЬ, с. 109-142 (1993), статью 8едгез1 и соавт., 1. Ырй Вез., 33:141-166, (1992)). Считают, что данный уникальный мотив вторичной структуры отвечает за свойство аро А-Ι связывания с липидом (см. статью 8едгез1 и соавт., Рго1ешз, 8:103-117, (1990)). Многие исследования с синтетическими аналогами амфипатических спиралей класса А поддерживают данную концепцию (см. статьи 8ещез1 и соавт., Абу. Рго1. С1ет., 45:303-369, (1994); ВгошИейе и Апап1йагата1ай, ВюсЫт. Вюрйуз. Ас1а, 1256:103-129, (1995)). Недавно синтезированы спирали каждого из 22-меров, присутствующих в качестве мономеров и тандемных димеров в человеческом аро А-Ι, и показано, что Ν- и С-концевые амфипатические спирали обладают максимальной способностью связывания с липидами (см. статью М1зйга и соавт., В1осйет1з1гу, 37:10313-10324, (1998)). Исследования рентгено-кристаллической структуры и молекулярное моделирование экзона 4 (остатки 44-243) аро А-Ι предполагают, что состояние самоассоциации целого аро А-Ι необходимо для связывания с липидом (см. статьи Вогйаш и соавт., Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А., 94:12291-12296, (1999); 8ещез1 и соавт., Сиггеп! Орш. Ыр1бо1., 11:105-115, (2000)). В данной модели две молекулы аро А-Ι выстраивают в форме димера голова к хвосту с помощью мономеров, взаимодействующих друг с другом, с целью стабилизации связанной с липидом структуры аро А-Ι.

Экспериментальное доказательство предполагает, что защитный эффект аро А-Ι и НОЬ в отношении заболевания коронарной артерии может быть обусловлен их ролью в обратном транспорте холестерина (см. статьи Р1е1бшд и Р1е1бшд, 1. Ыр1б Вез., 36:211-228, (1995); С1отзе1, 1. Ыр1б Вез., 9:155-167, (1968)). Обратный транспорт холестерина - это сумма трех стадий, включающих НОЬ/аро А-Ι:

a) выход холестерина из клеток хх (см. статьи 1о1шзоп и соавт., ВюсЫт. Вюрйуз. Ас1а., 1085:273298, (1991); Огат и Уокоуата, 1. Ыр1б Вез., 37:2473-2491, (1996)),

b) этерификацию с помощью ЬСАТ связанного с НОЬ холестерина (см. статьи Р1е1бшд и соавт., Вюсйет. Вюрйуз. Вез. Сотт., 46:1493-1498, (1972); 1опаз, ВюсЫт. Вюрйуз. Ас1а, 1084: 205-220, (1991)) и

c) рецептор-опосредованную доставку сложного эфира холестерина в печень (см. статью Кгефег, Апп. Веу. Вюсйет., 68:523-558, (1999)).

Исследования ίη угуо показывают, что как человеческий аро А-Ι, так и синтетический пептид амфипатической спирали класса А подавляют атеросклероз без изменения уровней плазменного холестерина посредством механизма, не зависимого от обратного транспорта холестерина (см. статью 8Ы-111 и соавт., С1гси1а1юп, 97:780-785, (1998)). Недавно сделано предположение, что ингибирование индуцируемого ЬОЬ хемотаксиса моноцитов в клетки артериальной стенки является другой основной ролью, которую играют аро А-Ι и НОЬ в предупреждении атеросклероза (см. статьи №п^гаЬ и соавт., 1. Ыр1б Вез., 41:14811494, (2000); УпаЬ и соавт., 1. Ыр1б-Вез., 41:1495-1508, (2000)).

Показано, что пептид, который, как демонстрируют, имитирует свойства человеческого аро А-Ι, 18 А, обладает также способностями активировать ЬСАТ (см. статьи Апап1йагата1ай и соавт., Аг1епозс1егоз1з, 10:95-105, (1990); Ерапб и соавт., 1. Вю1. С1ет., 262:9389-9396, (1987)) и вызывать выход холестерина (см. статьи Оау1бзоп и соавт., 1. Вю1. С1ет., 269:22975-22982, (1994); Уапсеу и соавт., Вюсйет1з1гу, 34:7955-7965, (1995)). Нейтрализация концевых зарядов 18А с образованием Ас-18А-NН₂, как показано, повышает его аффинность к липидам и биологическую активность (см. статьи Уапсеу и соавт., Вюсйет1з1гу, 34:7955-7965, (1995); Уепка1асйа1ара1Ы и соавт., Рго1ешз: 81гисЫге, Рипсбоп апб Сепебсз, 15:349359, (1993)). Некоторые модификации последовательности аминокислот данной родительской молекулы 18А делают в попытке улучшения ее свойств, имитирующих аро А-Ι (см. статьи Вгош11ебе и Апап1йагаша1ай, ВюсЫт. Вюрбуз. Ас1а, 1256:103-129, (1995); М1зЫа и соавт., 1. Вю1. С1ет., 269:7185-7191, (1994); М1зЫа и соавт., 1. Вю1. С1ет., 270:1602-1611, (1995)). В более ранних исследованиях (см. Статьи ВгошПебе и Апап1багата1ай, ВюсЫт. Вюрйуз. Ас1а, 1256:103-129, (1995); Ерапб и соавт., 1. Вю1. С1ет., 262:9389-9396, (1987)) показывают, что повышение гидрофобности данного пептида повышает аффинность к липидам и свойства, имитирующие аро А-Ι. Синтетический пептид 5Р, аналог Ас-18А^Н₂ с повышенной амфипатичностью, как показывают, подавляет индуцированный кормом атеросклероз у мышей (см., например, примеры 1 и 2). Однако пептид 2Р не подавляет в значительной мере индуцированное кормом образование повреждений у мышей С57 ВЬ6 (см. статью СагЬег и соавт., Спси1абоп,

- 36 009528

100:1538, (1999)). Исследование димеров пептида 18А показывает, что усиление пептидно-пептидной связи снижает пептидно-липидную связь (см. статью МйЬгка и соавт., 1 Βω! СЬет., 270:1602-1611, (1995)). Для определения максимальной степени, до которой может доходить аффинность пептида 18А к липидам при положительном эффекте в плане связывания липидов и имитации свойств аро А-Ι, создают серию гомологичных пептидов, в которой число остатков РЬе методично увеличивают путем замещения гидрофобных аминокислот, таких как Ьеи и А1а, на неполярной поверхности на РЬе. В соответствии с экспериментально определенной шкалой гидрофобности \Упп1еу и ХУНПе (см. статью \Упп1еу и ^УЬ11е, №11иге 81гис. Β^Κ 3:842-848, (1996)), Тгр и РЬе являются наиболее гидрофобными аминокислотами в том смысле, что они отличаются максимальным распределением в мембране из водной фазы. Для повышения гидрофобности пептида выбирают РЬе, поскольку он является наиболее кислотоустойчивой гидрофобной аминокислотой в пептидах, активных в мембране, и РЬе-содержащие пептиды можно синтезировать проще, чем Тгр-содержащие пептиды. Изучают эффекты данного повышения гидрофобности на физические свойства и свойства связывания липидов, а также на биологические свойства, имитирующие аро А-Ι, такие как активация ЬСАТ и подавление индуцированной ЬБЬ хемотактической активности.

Экспериментальные методики.

Синтез пептидов.

Пептиды синтезируют твердофазным способом, используя автоматизированный твердофазный синтезатор (Р83 Рго1ею ТесЬпо1од1ек, ^оЬит, МА). РМОС-аминокислоты присоединяют к амидной смоле [0,536 мЭкв./г], (Решпки1а ЬаЬогаФпек, 1пс. Βе1тοпΐ, СА) в присутствии ΗΒΈυ и NММ и ацетилируют уксусным ангидридом по Ν-концу. Пептиды отщепляют от твердой основы, используя 70% ТРА в дихлорметане в присутствии анизола (1%), меркаптоэтанола (0,1%) и триптофана (20 мас.% от смолы для пептида) и очищают на колонке νΥΟΛΟ С-4 (22 ммх25 см, размер частиц 10 мкм) для ВЭЖХ с обращенной фазой при использовании градиента 25-58% ацетонитрила в воде, содержащем 0,1% ТРА в течение 66 мин при скорости потока 4,8 мл/мин. Чистоту пептидов проверяют с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой, используя колонку с С18 (VΥ^АС, 4,6 ммх25см, 5 мкм) и линейный градиент ацетонитрил-вода (в присутствии 0,1% ТРА) 25-58% в течение 33 мин, а также масс-спектральным анализом.

Круговой дихроизм.

СБ-спектры регистрируют на спектрополяриметре АVIV 62Б8, как описано в статье М1кЬга и соавт., I. ΒωΓ СЬет., 269:7185-7191, (1994). Вкратце, спектры получают, используя камеру с длиной дорожки 0,1 см, измерения проводят с интервалом 1 нм от 260 до 190 нм при 25°С. Для всех СБ-спектров сигнал усредняют путем введения четырех сканирований, корректируют базовую линию и сглаживают. Растворы пептидов в РΒ8, рН 7,4, используют в концентрации 11 мкМ. Комплексы пептид-БМРС (1:20 моль:моль) используют для определения эффекта связывания липида на спиральность данных пептидов. Данные комплексы готовят добавлением соответствующего объема раствора пептида к многослойным носителям БМРС. Многослойные носители БМРС готовят следующим образом: известное количество липида растворяют в этаноле и удаляют растворитель медленным выпариванием под слабым током азота. Остаточный растворитель удаляют путем хранения липидной пленки под вакуумом в течение ночи. Соответствующий объем РΒ8, рН 7,4 добавляют к тонкой липидной пленке, получая необходимую конечную концентрацию БМРС. Липидно-пептидные комплексы готовят добавлением объема пептидных растворов, требующегося для получения молярного соотношения липида к пептиду 20:1. Вследствие плохой растворимости данных пептидов используют концентрацию пептидов 11 мкМ. Среднюю остаточную эллиптичность [0]_МРЕ (град. см², дмоль^-1) при 222 нм рассчитывают, используя следующее уравнение:

[е]М№=МК№[е]/10с1, где МК^ - средняя остаточная масса пептида, θ - обнаруженная эллиптичность в градусах, с - концентрация пептида в г/мл и 1 - длина дорожки камеры в сантиметрах.

Процент спиральности пептида определяют из следующего уравнения, как описано в статье МогпкеИ и соавт., Β^οсЬет^кΐ^у, 12:1290-1299, (1973):

% а-спиральности=([е]₂₂₂+3000)/(36000+3000), где [е]222 - средняя остаточная эллиптичность при 222 нм.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Исследования Б8С проводят с использованием сканирующего калориметра Мюгоса1 МС-2 (МюгоСа1, 1пс., АтЬегкЕ МА) при скорости сканирования 20°С-ч^-1 для БМРС и 37°С-ч^-1 для Б1РоРЕ с помощью процедуры, описанной в статье МйЬга и соавт., 1 ΒωΓ СЬет., 269:7185-7191, (1994). Известное количество фосфолипида растворяют в хлороформе. Для одной партии образцов пептид растворяют в метаноле и добавляют в раствор Б1РоРЕ в системе хлороформ/метанол (2:1, об.:об.). В обоих случаях, как в случае образцов чистых липидов, так и в случае органических растворов липида и пептида, растворитель удаляют под медленным током азота. Остаточный растворитель удаляют под вакуумом. К высушенной пленке добавляют чистый буфер (ΤΒ8, рН 7,4 для БМРС или 20 мМ Р1РЕ8, 1 мМ ЕБТА, 150 мМ №1С1 и 0,002% NаNз, рН 7,4 для Б1РоРЕ) или раствор пептида в буфере известной концентрации для получения

- 37 009528 специфического молярного соотношения липида/пептида и гидратируют ее интенсивным перемешиванием при комнатной температуре в течение 30 мин. Для БМРС проводят четыре последовательных сканирования при времени уравновешивания 60 мин. Термограммы Б8С анализируют с использованием программного обеспечения М1сгоСа1 Шс., Ашйегк!, МА и Опдт, версия 5.0.

Измерения поверхностного давления.

Измерение монослоя с исключением давления дает значение аффинности пептидов к границе раздела липида и воды; эксперимент проводят согласно процедуре, описанной РЫШрк и КгеЬк (см. статьи РЫШрк и КгеЬк, Ме1йобк Епхуто1., 128:387-403, (1986); Шбай и соавт., ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а, 1004:300308, (1989)). Нерастворимый монослой яичного фосфатидилхолина (ЕРС) распределяют на границе раздела воздуха и воды в тефлоновой чашке при комнатной температуре, получая исходное поверхностное давление (π₁) в интервале 5-45 дин/см. Раствор пептидов в РВ8, содержащий 1,5 М Сбп.НС1, осторожно инъецируют в субфазу до конечной концентрации 50 мкг/дл. Сбп.НС1 разводят в субфазе до конечной концентрации < 1 мМ для создания возможности ренатурации пептидов. Субфазу постоянно перемешивают и регистрируют возрастание поверхностного давления монослоя ЕРС (Δπ) до получения постоянной величины. Величину исходного поверхностного давления (π₁), при котором пептиды более не проникают в монослой ЕΥРС, т.е. исключающее давление (п_е), вычисляют путем экстраполяции π₁ относительно линейной регрессии Δπ, соответствующей уравнению Δπ=0 дин/см.

Измерения прямоугольного рассеяния света.

Связывание данных пептидов с яичным фосфатидилхолином определяют путем последующего растворения многослойных носителей ЕРС (МЬУ) с помощью прямоугольного рассеяния света с использованием считающего фотоны спектрофлуорометра 8ЬМ 8000С, как описано в статье М1кбга и соавт., 1. Вю1. Сйет., 269:7185-7191, (1994)). МЬУ ЕРС получают выпариванием раствора ЕРС (Ауапб Ро1аг, АЬ) под азотом и гидратацией липидной пленки забуференным фосфатом солевым раствором (рН 7,4). Образец, содержащий 105 мкМ ЕРС и эквимолярное количество пептида, поддерживают при 25°С и постоянно перемешивают. Уменьшение мутности мониторируют в течение 30 мин. Полного растворения носителей ЕРС достигают добавлением Тгйоп Х-100 до конечной концентрации 1 мМ.

Очистка лецитин-холестерин-ацилтрансферазы (ЬСАТ).

ЬСАТ выделяют из свежей нормолипидемической плазмы способом, предложенным в статье А1Ьегк и соавт., Ме1йобк Еп/утоС 129:763-783, (1986) с некоторыми модификациями. Плотность плазмы доводят до 1,21 г/мл и центрифугируют ее при 175000 д в течение 24 ч. Фракцию, содержащую ЬСАТ, подвергают хроматографии на ΛΓΓ^-Се1 В1ие с последующей хроматографией на БЕ-52. ЬСАТ элюируют с колонки БЕ-52, используя градиент 75-200 мМ №1С1 в Тпк буфере (10 мМ, рН 7,6). Данные 8Б8-РАСЕ показывают, что фермент имеет более чем 90% чистоту и не содержит примеси человеческого аро А-Ι.

Анализ активности ЬСАТ.

Субстрат готовят путем обработки ультразвуком яичного РС/холестерина (90:20 моль/моль), содержащего следовые количества 7а-3Н-холестерина, в устройстве для ультразвуковой обработки Вгапкоп 250 в течение 12 мин для получения маленьких однослойных носителей. Субстрат (50 мкл) инкубируют с 5 мкг пептида или человеческого аро А-Ι и 50 мкл В8А (40 мкг/мл) в течение 1 ч при 37°С. Общий объем доводят до 150 мкл. После инкубирования в течение 1 ч добавляют 100 мкл ЬСАТ и инкубируют в течение 1 ч при 37°С, затем реакцию останавливают нанесением 10 мкл в виде пятна на полоску силикагеля. Холестерин и холестериновый сложный эфир разделяют с помощью тонкослойной хроматографии на полосках силикагеля в системе гексан:хлороформ (2:1 об./об.). Стандарты холестерина и холестерилолеата визуализируют, погружая пластинку для ТСХ (тонкослойной хроматографии) в буфер, содержащий 3% ацетата меди, 8% фосфорной кислоты и нагревая ее. Положения стандартов используют для того, чтобы разрезать полоску на две, и две части полоски подсчитывают в сцинтилляционной жидкости при использовании Раскагб Тб СагЬ 4530. Все реакции делают в трех повторностях. Активацию ЬСАТ пептидами выражают как процент от общей активации посредством аро А-Ι.

Электрофорез.

Неденатурирующий 8Б8-РАСЕ проводят, используя способ, описанный в статье Баеттб, №Ыге, 227:680-685, (1970). Используют гели Ргетабе №хех и, с целью идентификации белковых полос, гель окрашивают Кумасси синим.

Индуцированная ЬБЬ хемотактическая активность моноцитов.

Получение кокультур человеческих клеток артериальной стенки, выделение моноцитов, выделение липопротеинов из плазмы нормальных доноров-людей ультрацентрифугированием или из мышиной плазмы с помощью ЕРЬС и определение гидропероксидов липидов и хемотактической активности моноцитов осуществляют, как описано в работах №1хаЬ и соавт. (см. статьи №1хаЬ и соавт., 1. Сбп. Шуекб, 88:2039-2046, (1991); №1хаЬ и соавт., 1. Сбп. Шуекб, 99:2005-2019, (1977)). Вкратце, ЬБЬ и НБЬ выделяют из человеческой плазмы способом, предложенным Науе1 и соавт. (см. статью Науе1 и соавт., 1. Сбп. Шуекб, 43:1345-1353, (1955)). Человеческие эндотелиальные клетки аорты (НАЕС) и клетки гладкой мускулатуры (НА8МС) выделяют, как описано в статье №1хаЬ и соавт., 1. Сбп. Шуекб, 88:2039-2046, (1991). Платы для микротитрования обрабатывают 0,1% желатином при 37°С в течение ночи. НА8МС добавля

- 38 009528 ют до конфлуэнтной густоты 1х10⁵ клеток/см^{1 2}. Клетки культивируют в течение двух суток. за это время они покрывают всю поверхность лунки и образуют достаточное количество экстрацеллюларного матрикса. НАЕС последовательно добавляют при густоте 2х10⁵ клеток/см² и позволяют расти. образуя полный монослой конфлуэнтных НАЕС. в течение двух суток. Во всех экспериментах НАЕС и аутологичные НАЗМС (от одного донора) используют на уровне четырех-шести пассажей. Моноциты выделяют из крови нормальных доноров. как описано в статье Γο^ΐιηηη и соавт.. 1. Ыр|б Кек.. 29:1243-1247. (1988). Кокультуры обрабатывают нативным БОБ (250 мкг белка/мл) или введением НЭБ (350 мкг белка/мл) или пептидов в течение 8 ч. Затем кокультуры промывают и инкубируют со средой 199 в течение дополнительных 8 ч. Супернатанты полученных кокультур анализируют на хемотактическую активность моноцитов. как описано в статье NаνаЬ и соавт.. 1. С1ш. БтгекБ. 99:2005-2019. (1997).

Результаты.

Анализ пептидов.

В табл. 6 представлены последовательности различных аналогов 18А. которые синтезируют. Пептид Ас-18А-NН₂. который содержит 2 остатка РЬе в положениях 6 и 18 (близко к находящимся на границе раздела остаткам Бук). обозначают 2Р. Синтезируют два пептида 3Р. 3Р³ или 3Р¹⁴. где Беи в положении 3 и 14 (оба находятся в центре неполярной поверхности) замещены РЬе соответственно. Пептид 4Р содержит два остатка РЬе в центре неполярной поверхности. что является результатом замены двух центральных остатков Беи. Замены в пептидах (3Р-7Р) представляют в табл. 6. С увеличением числа остатков РЬе теоретическая гидрофобность/остаток на неполярной поверхности повышается от 2.05 для пептида 2Р до 3.15 для 7Р.

Таблица 6

Модификации Ас-18А-NН₂ для повышения гидрофобности

Пептид	Последовательность1	Г идрофобность2	Теоретическая аффинность к липидам (Л)3
2Р	Αο-18Α-ΝΗ2	2,05	13,03
ЗР3	Ас-[Р318А]-ЫН2	2,20	13,84
ЗР14	Αο-[ΡΙ418Α]-ΝΗ2	2,20	13,79
4Р	Αο-[Ε3·,418Α]-ΝΗ2	2,35	14,59
5Р	Αο-[Ε,1,14,,718Α]-ΝΗ2	2,81	19,07
6Р	Αο-[Ρ,ο'11,14'1718Α]-ΝΗ2	2,96	19,87
7Р	Αο-[Ρ310',1',4’,718Α]-ΝΗ2	3,15	20,78

¹ - Базовая последовательность 18А ОХУБКАБУОКУАЕКБКЕАБ (8ЕО О N0:2).

² - Гидрофобность выражают. как гидрофобность/остаток на неполярной поверхности.

³ - Теоретическую аффинность к липидам рассчитывают. как показано в статье Ра1дипасйа^^ и соавт.. Айегюкс1ег. ТНготЬ. Уакс. Вю1.. 16:328-338. (1996).

Пептиды очищают на препаративной колонке Уубас С₄ с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой. используя воду (с 0.1% трифторуксусной кислотой) и ацетонитрил (0.1% трифторуксусной кислоты). Чистоту и время удерживания пептидов определяют на аналитической колонке Уубас С₁₈. используя градиент 25-58% ацетонитрила в воде. содержащей 0.1% ТРА. Чистоту данных пептидов подтверждают также масс-спектрометрией. Масса согласуется с вычисленной молекулярной массой. Время удерживания пептидов приведено в табл. 7. Хотя оба пептида. как 3Р. так и 4Р. содержат дополнительные остатки РЬе по сравнению с 2Р. время удерживания данных пептидов на колонке с С₁₈ не очень отличается (~22 мин). Резкое увеличение времени удерживания является очевидным для 5Р. 6Р и 7Р (~26 мин). При увеличении числа остатков РЬе снижается растворимость данных пептидов в РВЗ. Как можно заметить из табл. 7. растворимость 2Р. 3Р³. 3Р¹⁴ и 4Р (1.25-1.4 мг/мл) значительно выше. чем у 5Р. 6Р и 7Р (0.03-0.1 мг/мл).

- 39 009528

Таблица 7

Физические свойства Р-пептидов.

Пептид	Молекулярная масса1	Время удерживания (мин.)2	Растворимость (мг/мл)3	Исключающее давление МОНОСЛОЯ (ί7β)4
аро А-1	28000	28,0	>2,0	34
18А	2200	19,8	>2,0	30
37рА	4580	26,0	>2,0	41
2Е	2242	22,5	>2,0	38
ЗЕ3	2276	21,0	1,25	38
ЗЕ14	2276	21,2	1,45	39
4Е	2310	22,0	1,30	40
5Е	2429	26,5	0,10	45
6Е	2462	27,0	0,03	46
7Е	2510	26,0	0,10	45

¹ - Масса, как определяют путем масс-спектроскопии, является очень близкой к теоретически рассчитанной молекулярной массе.

² - Время удерживания представляет собой время, необходимое для элюции пептидов с колонки Vубас С₁₈ при использовании градиента 25-58% ацетонитрила в воде, содержащего 0,1% ΤРΑ в течение 33 мин.

³ - Растворимость определяют в ΡΒ8.

⁴ - Воспроизводимость данных измерений составляет ±1 дин/см.

Самоассоциацию данных амфипатических пептидов исследуют с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (ΡΑ6Ε). На фиг. 14 показывают подвижность 2Р как в денатурирующем 8Ό8 (см. фиг. 14А), так и в неденатурирующем (см. фиг. 14В) гелях. Молекулярная масса 2Р составляет 2242, что можно наблюдать в виде одной полосы на 808-геле (см. фиг. 14А), которая движется немного ниже, чем стандарт с самой низкой молекулярной массой (3,5-2,5 кД). Однако в неденатурирующих условиях он образует агрегаты в зависимости от концентрации, как видно на фиг. 14В. При более низких концентрациях (100 мкг/мл) он образует агрегаты двух размеров, тогда как в более высоких концентрациях (250 мкг/мл) наблюдают только более крупные агрегаты (см. фиг. 14В). Все другие изученные пептиды также демонстрируют агрегацию в неденатурирующих условиях, что предполагает наличие у пептидов сильной тенденции к самоассоциации.

Круговой дихроизм.

Вторичную структуру пептидов определяют с помощью спектроскопии кругового дихроизма. В табл. 8 представлен процент спиральности пептидов в ΡΒ8 и в присутствии ОМ^С. В ΡΒ8 гомологи 2Р, 4Р, 5Р, 6Р и 7Р имеет более высокий процент спиральности, чем 3Р3 и 3Р¹⁴ (см. табл. 8). Поскольку 5Р, 6Р и 7Р плохо растворимы в ΡΒ8, исследования СО проводят с использованием 11 мкМ пептидов (концентрация, при которой все они растворимы). Пептид 2Р демонстрирует спиральность 55%, сравнимую с 5Р в растворе. Оба пептида, как 6Р, так и 7Р, являются несколько более спиральными (67 и 58% соответственно), тогда как 4Р обладает немного меньшей спиральностью (45%). Оба пептида 3Р являются значительно менее спиральными (»20%). Однако связывание с ОМ^С значительно повышает спиральность всех пептидов за исключением 6Р (см. табл. 8). В жидкой среде 2Р, 5Р и 7Р демонстрируют высокое содержание спирали (68-76%). Хотя пептиды 3Р³ и 3Р¹⁴ имеют очень маленькое содержание спиралей в ΡΒ8, наблюдают значительное повышение спиральности в липидной среде (от приблизительно 22 до 42% для 3Р³ и от 19 до 55% для 3Р¹⁴). Спиральность пептидов 6Р и 4Р не изменяется в значительной степени в присутствии липида. Однако данные пептиды являются еще менее спиральными, чем пептиды 2Р и 5Р. По результатам СО предполагают, что системное изменение спиральности пептидов при повыше- 40 009528 нии числа замен на РКе отсутствует; пептиды 2Е и 5Е демонстрируют максимум спиральности в растворе и в присутствии фосфолипида.

Таблица 8

Спиральность Е-пептидов в водной и липидной среде

Пептиды Процент спиральности

РВ5* ОМРС'

2Е	55	72
ЗЕ3	22	42
ЗЕ14	19	55
4Р	45	44
5Р	55	76
6Р	67	50
7Р	58	68

- используют 11 мкМ растворы пептида.

Используемое соотношение пептид:БМРС составляет 1:20 (моль/моль). Произведено три измерения с получением ошибки ±10%.

Исследования Б8С с БМРС и Б1РоРЕ.

Эффект данных аналогов 18А на переход плавления цепи многослойных носителей БМРС изучают с помощью Б8С, используя пептидно-липидные смеси в молярном соотношении липид/пептид 100:1. В табл. 9 представлены температуры перехода и значения энтальпии перехода плавления цепи БМРС в присутствии и в отсутствие пептидов. Чистый липид проходит предпереходное состояние при 13°С и главный переход плавления цепи при 23°С. Добавление пептидов к БМРС приводит к расширению состояния геля до перехода из жидкости в кристалл и снижению энтальпии перехода (см. табл. 9). В присутствии каких-либо пептидов предпереходное состояние не отмечают. Среди исследованных пептидов 2Е, 3Е³, 5Е и 6Е снижают энтальпию перехода в максимальной степени (см. табл. 9). Ни один из пептидов не изменяет температуру перехода более чем на 0,2°С.

Таблица 9 Эффект Е-пептидов на параметры перехода плавления цепи БМРС

Пептид	ТСм(°С)	ДНСМ (ккал/моль)	Δτι/2 (°С)
ЭМРС	23,1	6,4	0,2
2Е	23,2	4,5	0,5
ЗЕ3	23,2	4,9	0,4
ЗЕ14	23,2	5,5	0,3

Пептид	Тсм(°С)	ДНСМ (ккал/моль)	Δτι/2 <°С)
4Е	23,2	5,3	0,4
5Е	23,2	4,9	0,5
6Е	23,1	4,0	0,5
7Е	23,2	4,5	0,5

Используют соотношение БМРС/пептид 100:1 (моль/моль). Используемая концентрация БМРС составляет 1,5 мМ. Т_СМ - температура, при которой происходит переход плавления цепи, АН_СМ - энтальпия перехода и А_Т1/2 - ширина половины максимума перехода.

Сдвиг в двухслойной структуре относительно гексагональной фазы температуры перехода (ТН) используют для оценки эффектов пептидов на свойство внутренней кривизны фосфолипидов (см. статью Ерапб, ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1376:353-368, (1998)). Ранее было показано, что 2Е приводит к повышению Т_Н Б1РоРЕ (см. статью Ту11ег и соавт., 1. Вю1. СКет., 268:22112-22118, (1993)). В настоящем исследовании пептидно-липидные смеси готовят двумя путями. Один путь - это добавление пептида в органи ческом растворителе к липиду в органическом растворителе, затем выделение материала в виде пленки с последующей гидратацией буфером. Согласно другому методу пептид и липид смешивают после раздельной гидратации каждого из них. Если смесь уравновешивается до проведения анализа Б8С, вопрос об исходном смешивании пептида и липида не является важным. Однако, системы мембран могут уравновешиваться медленно, в данном случае в системе может быть больше пептида в липиде при его инкорпорации в липидную пленку в высоких концентрациях. В целом результаты приготовления образцов обоими способами близки (не представлено), но сдвиг в ТН имеет тенденцию к увеличению для образцов, в которых пептид инкорпорируют в пленку, содержащую липид и пептид. Изменение ТН в зависимости от молярной фракции пептида представлено для различных пептидов и аро А-Ι (см. фиг. 15). Линейное

- 41 009528 повышение наблюдают для 2Р и 5Р, тогда как поведение 4Р ближе к аро А-Ι в плане более быстрого повышения, отмечаемого при более низких концентрациях пептида. С другой стороны, два аналога 3Р, а также 6Р и 7Р не влияют на в значительной степени.

Взаимодействие пептидов с фосфолипидными монослоями.

Исключающее давление в монослое п_е представляет собой поверхностное давление, при котором пептиды более не способны проникать в монослой ЕРС. Значение п_е отражает теоретическую аффинность пептида к липиду. Исключающее давление пептидов Р повышается с увеличением числа остатков Ρ1κ (см. табл. 7). Все пептиды, исследованные в данном контексте, имеют более высокое исключающее давление, чем аро А-Ι и исходный пептид 18 А. Величина п_е постепенно возрастает от 2Р до 4Р (от 38 до 40 дин/см). Это возрастание находится в интервале, показанном для 37рА, тандемного повтора 18А, прерываемого пролином. Величина исключающего давления значительно возрастает для 5Р, 6Р и 7Р (от 40 до 45 дин/см). Очевидно, что гомологи 5Р, 6Р и 7Р обладают близкой способностью взаимодействовать с монослоями ЕРС, как определяют с помощью исключающего давления. Интересно, что время удерживания при ВЭЖХ и величины исключающего давления в монослоях для Р-пептидов, приведенных в табл. 7, имеют тенденцию к параллельному развитию с резким увеличением между пептидами 4Р и 5Р.

Прямоугольное рассеяние света.

Как можно видеть на фиг. 16, все пептиды способны к осветлению МЬМ ЕРС в отличие от аро Α-Ι, который не осветляет МЬМ ЕРС. Два гомолога пептида 3Р являются наименее эффективными в плане осветления МЬМ ЕРС. Все гомологичные пептиды 2Р, 5Р, 6Р и 7Р осветляют МЬМ ЕРС в близкой степени. Пептид 4Р является наиболее эффективным в осветлении МЬМ ЕРС при активности, близкой активности Тгйоп Х-100. Для гомолога 4Р время 50% осветления мутности МЬМ ЕРС также является самым коротким. Самое длительное время, требуемое для достижения 50% осветления, у пептида 7Р, что обусловлено исходным 1ад-периодом, приблизительно 300 с (см. фиг. 16). Возможно, этот эффект объясняется необходимостью диссоциации самоассоциированных молекул 7Р перед тем, как они смогут взаимодействовать с МЬМ ЕРС и солюбилизировать их. Более низкие скорости осветления, показанные гомологами 2Р, 5Р и 6Р, могут быть также обусловлены более высокой степенью самоассоциации данных пептидов.

Активация плазменного фермента ЬСАТ.

Способность данных пептидов активировать плазменный фермент ЬСАТ определяют путем измерения исходной вязкости реакции ЬСАТ с носителями из яичного ΡС-холестерина в качестве субстрата (см. фиг. 17). Активацию ЬСАТ выражают относительно активации ЬСАТ с помощью аро Α-Ι, которую принимают за 100%. Активация ЬСАТ 20 мкг/мл пептидов и аро Α-Ι показана на фиг. 4. При данной концентрации аро Α-Ι активирует ЬСАТ лучше, чем любой из пептидов. Однако среди пептидов, исследованных в данном контексте, 5Р является наилучшим активатором (80% от аро Α-Ι). В плане активации ^ΑΧ пептиды 3Р³ и 3Р¹⁴ имеют близкие активирующие способности. Вследствие этого они представлены в виде одного столбика (см. фиг. 17).

Индуцированная ЬЭЬ хемотактическая активность моноцитов.

При инкубировании ЬЭЬ с системой кокультуры человеческих клеток артериальной стенки он захватывается в субэндотелиальном пространстве и окисляется с образованием биологически активных липидов. Данные липиды индуцируют хемотаксис моноцитов. Так, хемотаксис кокультуры моноцитов является хорошо разработанным тестом на образование биологически активных липидов. Показывают, что подавление хемотаксиса прямо коррелирует с удалением молекул-затравок, которые отвечают за секрецию моноцитарного хемотактического белка-1 (ΜСΡ-I) (см. статьи №1уаЬ и соавт., I. Ыр1б Век., 41:1481-1494, (2000); №1таЬ и соавт. I Ыр1б Век., 41:1495-1508, (2000)) и фактора дифференцировки макрофагеального колониестимулирующего фактора (М-С8Р). На фиг. 18 показывают, что ЬЭЬ после инкубирования с пептидами проявляет различные эффекты с гомологами 4Р, 5Р и 6Р, снижая хемотактические свойства ЬЭЬ в наибольшей степени. Пептиды 3Р не настолько эффективны в сравнении с 2Р и 7Р, которые являются менее эффективными, чем пептиды 4Р, 5Р и 6Р.

Обсуждение.

Эффект повышения гидрофобности аналога амфипатического спирального пептида класса А на его физико-химические свойства и свойство связывания липидов.

Пептиды, исследуемые в данной работе, являются гомологами исходного пептида 18А. Рассчитанная гидрофобность/остаток (в соответствии с модифицированной шкалой вычислительного способа (ΡηΙдипасйап и соавт., Α^ιе^^οксΙе^. ТйготЬ. ®акс. ΒωΙ., 16:328-338, (1996)) на неполярной поверхности повышается с повышением числа остатков Ρίκ. Данное повышение гидрофобности (см. табл. 6) отражается в теоретической аффинности к липидам, Λ (ΙΝ6.). Однако величина Λ постепенно повышается от 2Р до 4Р (от 13,03 до 14,59) при резком повышении величины от 14,59 (для 4Р) до 19,07 для 5Р. После 5Р снова отмечают постепенное повышение величин Λ для 6Р и 7Р (см. табл. 6). Данный факт обусловлен заменой Ьеи в положениях 3 и 14 в Α^18Α-ΝΗ₂ на Ρίκ, что приводит к небольшому повышению гидрофобности неполярной поверхности и, таким образом, небольшому повышению величин Λ для двух аналогов 3Р и 4Р. Однако в гомологах 5Р, 6Р и 7Р, кроме замен Ьеи на Ρΐι;, в положениях 11 и 17 ΑΙη также замещены

- 42 009528 на ГНе, что приводит к значительному повышению величин Λ (см. табл. 6). Поскольку А1а является менее гидрофобным, чем Ьеи, и Ьеи является менее гидрофобным, чем йНе, замена А1а на йНе вызывает большее изменение в гидрофобности и теоретической аффинности к липидам у полученного пептида, чем замена Ьеи на йНе.

Время удерживания в колонке для ВЭЖХ с обращенной фазой С₁₈, растворимость данных пептидов и их способность проникать в монослой ЕРС демонстрируют тенденции, близкие тем, что отмечены в теоретических величинах аффинности к липидам (см. табл. 7). Время удерживания пептидов 2Р, 3Р³, 3Р¹⁴ и 4Р приблизительно равно (21-22 мин) и существенно меньше, чем у 5Р, 6Р и 7Р, которые составляют вторую группу (26-27 мин). Пептиды 2Р-4Р имеют значительно большую растворимость в воде, чем гомологи 5Р-7Р, которые плохо растворимы (см. табл. 7). Постепенное повышение исключающего давления наблюдают от 2Р до 4Р, после чего происходит резкое повышение от 40 до 45 дин/см. Величины исключающего давления для пептидов 5Р, 6Р и 7Р не очень отличаются друг от друга и значительно превышают данные величины для аро АЛ (табл. 7). Исходный пептид 18А (30 дин/см) и даже димер 18А, 37рА (40 дин/см) также значительно менее эффективны в плане проникновения в монослой яичного Ρ^ находящегося на границе раздела воздуха и воды. На основе вышеуказанных физических свойств пептиды Р можно разделить на две группы: группу I, содержащую 2Е, 3Е³, 3Е¹⁴, 4Е, и группу II, содержащую пептиды 5Р, 6Р и 7Р.

Данные по СО (см. табл. 8) показывают, что величина процента спиральности всех пептидов возрастает в присутствии ОМЬС, что предполагает связывание всех пептидов с липидами. Связывание данных пептидов с ОМЬС, по-видимому, аналогично тому, которое предполагают для Э8С (см. табл. 9). Однако эффект данных пептидов на стабилизацию двухслойной структуры ^^ΡоΡΕ имеет иной характер. Очевидно, 4Р и 5Р лучше взаимодействуют с ^^ΡоΡΕ, поскольку они, по-видимому, являются лучшими стабилизаторами, чем другие пептиды.

Хотя аро АЛ не обладает способностью осветлять МР-ν ЕРС, все аналоги пептида обладают такой способностью, но в различной степени. Среди пептидов группы I, которые хорошо растворяются в водном буфере и имеют величину исключающего давления в монослое в интервале 38-40 дин/см (аналоги 2Р, 3Р и 4Р), 4Р, по-видимому, является наиболее эффективным и при исследовании соотношения пептид:липид проявляет кинетические характеристики, близкие ТгПоп Х-100 (см. фиг. 16). Хотя величины исключающего давления в монослое у пептидов 2Р и 3Р близки, гомологи 3Р медленнее всех осветляют МР-ν ЕРС. Причина пониженной способности гомологов 3Р осветлять ЕРС в данное время неясна. Пептиды группы II (5Р, 6Р и 7Р), которые плохо растворяются в водном буфере и имеют величины поверхностного давления 45 дин/см, солюбилизируют МР-ν ЕРС относительно медленно. Данные результаты согласуются с необходимостью диссоциации пептидных агрегатов перед взаимодействием с ЕРС. Высокую реактивность 4Р можно объяснить тем фактом, что его гидрофобность является оптимальной, при этом гидрофобные взаимодействия типа пептид:пептид, для которых предпочтительна самоассоциация, не препятствуют взаимодействиям типа пептид: липид.

Эффект повышенной гидрофобности на активацию ЬСАТ.

Активация ЬСАТ представляет собой сложный процесс и зависит не только от аффинности к липидам, но также от взаимодействия амфипатического спирального белка с ферментом ЬСАТ (см. статью 1опак, ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а, 1529:245-256, (2000)). В соответствии с этими данными показано, что способность активировать ЬСАТ должна быть различной у гомологичных пептидов. Пептид 5Р проявляет максимальную способность активации ЬСАТ, что согласуется с физическими свойствами, приведенными в табл. 7, в которой видно резкое повышение от 4Р до 5Р, включая величины исключающего давления на границе раздела яичного ΡС-воды. Тот факт, что пептиды 6Р и 7Р не настолько эффективны, как 5Р, можно было бы объяснить повышенным взаимодействием типа пептид: пептид (что выражается в низкой растворимости в воде данных пептидов), которое не позволяет осуществляться взаимодействию типа пептид:липид или пептид:ЬСАТ. Данные результаты согласуются с более ранними исследованиями димерных пептидов 18А, в которых показано, что повышенная самоассоциация димера пептида 18А-18А (36А) снижает его способность взаимодействовать с липидами по сравнению с пептидом ^А-Его-^А (см. статью 1опак, ВюсЫт. Вюрйук. Ас1а, 1529:245-256, (2000)). Хотя активация ЬСАТ пептидами сравнима с активацией аро АЛ, следует заметить, что аро АЛ и пептиды различным образом взаимодействуют с субстратом, поскольку все они имеют различные реактивности с ЕРС (см. фиг. 16). Аналогичные наблюдения делают СНипд и соавт., которые показывают, что синтетический пептид 18А-Ρ^о-18А и аро АЛ различным образом взаимодействуют с ЕРС (см. статью СНипд и соавт., I. Вю1. СНет., 260:1025610262, (1985)).

Эффект повышенной гидрофобности неполярной поверхности на индуцированный ЬОЬ хемотаксис моноцитов.

Поскольку удаление молекул-затравок зависит от амфипатичности пептида, как описано разными авторами (см. статьи ЫауаЬ и соавт., I. Ыр16 Кек., 41: 1481-1494, (2000); ЫауаЬ и соавт., I. Ыр16 Кек., 41:1495-1508, (2000)), исследуют способность данных пептидов ингибировать индуцированный ЬОЬ хемотаксис моноцитов. В данном эксперименте на базе одностороннего дисперсионного анализа, пептиды 4Р, 5Р и 6Р на уровне 100 мкг/мл проявляют значительное и близкое по величине подавление индуциро

- 43 009528 ванного ЬОЬ хемотаксиса. Хотя гомолог 2Ε проявляет некоторую ингибирующую активность, пептидные аналоги 3Ε по неясным причинам не проявляют ингибирования по сравнению с одним ЬОЬ. Данные результаты согласуются с тем фактом, что пептид 3Ε не способен удалять липидные гидропероксиды (результаты не приводят) и имеет пониженную способность осветлять МЬУ ЕРС. Пептид 7Ε является значительно менее эффективным, чем пептиды 4Ε, 5Ε и 6Ε (Р<0,001). Пониженная способность 7Ε снова может быть объяснена повышенной самоассоциацией пептида, что снижает его способность взаимодействовать с липидом, как видно из исследований по осветлению МЬУ ЕРС. Данные результаты снова демонстрируют, что тонкое равновесие, существующее между вкладом гидрофобности пептида в самоассоциацию, может оказывать важное воздействие на свойства, имитирующие аро Α-Ι.

Введение ш νί\Ό пептида 5Ε, который обладает повышенной способностью активации ^СΑΤ и повышенной способностью удаления молекул-затравок, защищает мышей от индуцированного кормом атеросклероза. Напротив, введение 2Ε, который по способности активировать ^СΑΤ близок 4Ε, но менее эффективен, чем 4Ε и 5Ε в плане удаления молекул-затравок из ЬОЬ, не подавляет в значительной степени индуцированное кормом образование повреждений у мышей С57 ВЬ6 (средняя площадь повреждения для контрольных мышей, получающих РВ8, 14,7±1,8мкм²х10^-3 относительно мышей, получающих 2Ε, 13,2±1,7мкм²х10^-3, п=15). Из этого следует, что в данной модели на мышах подавление индуцированного ЬОЬ хемотаксиса моноцитов более атерогенно, чем активация ЬСАТ. Поскольку пептиды 2Ε и 4Ε близки по активации ЬСАТ, а пептиды 4Ε и 5Ε близки в плане удаления затравочных молекул из ЬОЬ, пептид 4Ε может служить реагентом для дифференцирования важности активации ЬСАТ и подавления индуцируемого ЬОЬ хемотаксиса моноцитов в различных моделях на мышах, чувствительных к атеросклерозу. Если подавление индуцированного ЬОЬ хемотаксиса является более важным, чем способность активации ЬСАТ, то 4Ε был бы более удачным пептидом для применения в качестве ингибитора атеросклероза, поскольку данный пептид лучше растворим, чем пептиды 5Ε, 6Ε и 7Ε.

Пример 4. Пептиды Ό-4Ε поддерживают уровни пароксиназы и блокируют образование окисленных фосфолипидов в период острой воспалительной ответной реакции.

Показывают, что интраназальное вливание вируса гриппа А мышам вызывает зависимую от времени потерю противовоспалительных свойств НОЬ, которая длится максимум 7-9 дней после введения. Выбранная доза является дозой, не вызывающей виремию, поэтому изменения не обусловливаются непосредственно вирусом, но связаны с воспалительным состоянием, индуцируемым системной реакцией хозяина на вирусную инфекцию. Данная реакция является частью природной иммунной системы и известна как ответная реакция острой фазы или ответ острой фазы.

Одним из последствий является снижение активности параоксоназы и тромбоцит-активирующей ацетилгидролазы в НОЬ мышей после инфекции гриппа. В результате потери данных ферментативных активностей НОЬ, а также в результате ассоциации прооксидантных белков с НОЬ во время ответа острой фазы, НОЬ не способен более предупреждать окисление ЬОЬ и не способен более предотвращать индуцируемое ЬОЬ образование эндотелиальными клетками хемотактической активности моноцитов. Нормальный НОЬ способен предупреждать индуцируемое ЬОЬ образование хемотактической активности моноцитов эндотелиальными клетками, поскольку нормальный НОЬ имеет достаточно активности параоксоназы и тромбоцит-активирующей ацетилгидролазы для разрушения биологически активных окисленных фосфолипидов.

В данном примере демонстрируют, что вскоре (через два дня) после инфекции гриппа А печени инфицированных мышей образуют данные окисленные фосфолипиды (см. фиг. 19) и позднее (через 7-9 дней после инфекции) данные биологически активные окисленные фосфолипиды появляются в аорте мышей. Однако, если мышам ежедневно инъецируют 20 мкг Ό-4Ε после инфекции вируса гриппа А, уровни параоксоназы не снижаются (см. фиг. 20) и биологически активные окисленные фосфолипиды не образуются на уровне выше фонового (см. фиг. 21).

Данные результаты показывают, что Ό-4Ε (и/или другие пептиды, соответствующие данному изобретению) могут быть введены перорально или путем инъекции больным с диагностированным заболеванием коронарной артерии во время инфекции гриппа или других событий, которые могут вызывать воспалительную ответную реакцию острой фазы (например, вследствие вирусной инфекции, бактериальной инфекции, травмы, трансплантата, различных аутоиммунных состояний и т.п.), и, таким образом, можно с помощью кратковременного курса лечения предупредить повышенную вероятность сердечного приступа и инсульта, связанных с патологиями, которые создают данные воспалительные состояния.

Пример 5. Пероральное применение пептидных миметиков аро Α-Ι, синтезированных из Όаминокислот, резко снижает атеросклероз у мышей.

Пептидные миметики аро Α-Ι, как из Ό-, так и из Ь-аминокислот, эффективны ш νίΙΐΌ в плане защиты липопротеина низкой плотности (ЬОЬ) от окисления клетками артериальной стенки. Однако, когда мышам, нуллисомным по рецептору ЬОЬ, перорально вводят данные пептиды и их НОЬ выделяют и тестируют на способность защищать ЬОЬ от окисления ш νίΐΐΌ, эффективными оказываются только пептиды, синтезированные из ϋ-аминокислот. Пептид, синтезированный из ϋ-аминокислот, стабилен в кровотоке и его обнаруживают во фракциях, связанных с липопротеинами высокой плотности (НОЬ). Пептид,

- 44 009528 синтезированный из Ь-аминокислот, быстро разлагается и выделяется с мочой. Когда пептид, синтезированный из Ό-аминокислот, известный как Ό-4Ρ, два раза в день перорально вводят мышам, нуллисомным по рецептору ЬОЬ, которые получают западный корм, повреждения снижаются на 79%. Добавление Ό4Р в воду для питья мышам, нуллисомным по аρο Е, приводит к снижению повреждений более чем на 84%. В заключение отмечают, что пероральное применение пептидных миметиков аρο А-Ι, синтезированных из Ό-аминокислот, эффективно для профилактики и лечения атеросклероза и других хронических воспалительных заболеваний, которые вызывают окисленные липиды.

Технические предпосылки.

Концентрации НОЬ-холестрина находятся в обратной зависимости от риска атеросклеротического заболевания коронарной артерии (см. статью М111ег и МШет, Батек 1:16-19, (1975)). Вливание (см. статью Вабтюг! и соавт., I. С1ш. 1тек1., 85:1234-1241, (1990)) или трансгенная экспрессия (см. статью Р1итр и соавт., Ргос. N11. Асаб. 8ск, И8А, 91:9607-9611, (1994)) аρο А-Ι, основного аполипопротеина ΗΌΌ, как показано в моделях на животных, защищают от атеросклероза. Считают, что механизмы, с помощью которых аρο А-Ι защищает от развития атеросклероза, включают обратный транспорт холестерина (см. статью 81ι;·ι1ι и соавт., СйсиЩюп, 103:3047-3050, (2001)) и удаление низких уровней окисленных липидов, молекул-затравок, которые необходимы для окисления БОБ (см. статьи NаνаЬ и соавт., I. Ыр1б Кек., 41: 1481-1494, (2000); NаνаЬ и соавт., I. Όίρί6 Кек., 41:1495-1508, (2000); NаνаЬ и соавт., Айегюк1сег. ТЬготЬ Уакс. Вю1., 21:481-488, (2001)). Показывают, что аналоги амфипатических спиральных пептидов класса А имитируют ίη νίΐτο ряд свойств аρο А-Ι, в том числе удаление молекул-затравок, которые требуются для окисления БОБ (см. статьи NаνаЬ и соавт., I. Όίρί6 Кек., 41:1481-1494, (2000); NаνаЬ и соавт., I. Όίρί6 Кек., 41:1495-1508, (2000)). Внутрибрюшинное введение амфипатического спирального пептида класса А, как недавно показано, защищает мышей от индуцированного кормом атеросклероза, не изменяя уровней плазменного холестерина (см. статью СатЬет и соавт., I. Όίρί6 Кек., 42:545-552, (2001)). Уменьшение повреждений связывают со значительным повышением способности ΗΌΌ подавлять окисление БОБ ίη νίΐτο (Ι6.). До настоящего времени основным ограничением применения аρο А-Ι или пептидных миметиков аρο А-Ι в качестве фармакологического агента является необходимость парентерального введения.

Ферменты млекопитающих, такие как протеазы, распознают пептиды и белки, синтезированные из Ь-аминокислот, но редко распознают данные материалы, синтезированные из Ό-аминокислот. В данном контексте показывают, что специфические препараты пептидных миметиков аρο А-Ι, синтезированных их Ό-аминокислот, могут вводиться перорально, и они резко подавляют атеросклероз у мышей.

Методы.

Мыши.

Самок мышей на основе мышей С57ВБ/61, нуллисомных по рецептору БОБ или аρο Е, приобретают в фирме ^^οη ^аЬο^а1ο^у, Ваг ΝΦογ, МЕ. Мышей, нуллисомных по рецепору БОБ, поддерживают на смешанном корме Ригта (Каίк1οπ Ригта Сс.) до достижения ими возраста 4 недель, после чего переводят их на западный корм (Тек1аб, Маб^щ ^Ι, б1е1 # 88137) на период 6 недель. Мышей, нуллисомных по аρο Е, поддерживают на смешанном корме Ригта в течение всего периода исследований. Мышам, нуллисомным по рецептору ЬОЬ, два раза в день с помощью желудочного зонда вводят тест-пептид или носитель в качестве контроля в период времени, указанный в надписях на фигурах. В возрасте четырех недель тест-пептид добавляют к воде для питья некоторым мышам, нуллисомным по аρο Е, в концентрациях, указанных в надписях на фигурах, при этом мыши, нуллисомные по аρο Е, продолжают получать смешанный корм.

У мышей берут кровь под анестезией из ретроорбитального венозного плексуса в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по исследованиям на животных (Ашта1 Кекеагск Сοтт^11ее) ИСЬА. Атеросклеретические повреждения измеряют, как описывают выше.

Липопротеины.

БОБ и ΗΌΌ выделяют, как описано (см. статью NаνаЬ и соавт., I. Ыр1б Кек., 41:1481-1494, (2000) и примеры в данном контексте), у людей-добровольцев, после получения от них подтвержденного согласия, и из мышиной крови, как указано выше.

Кокультуры, клеточное окисление БОБ, выделение моноцитов и анализ хемотаксиса моноцитов.

Человеческие клетки эндотелия и гладкой мускулатуры аорты выделяют и культивируют, как описано ранее (Ι6.). Клеточное окисление ЬОЬ в присутствии и в отсутствие НОЬ определяют, как описано (Ι6.). Человеческие кровяные моноциты выделяют после получения подтвержденного согласия и хемотаксис моноцитов определяют, как описано ранее.

Синтез и получение пептидных миметиков аρο А-Ι.

Пептидные миметики аρο А-Ι синтезируют, как описано ранее за исключением того, что в ряде случаев каждая аминокислота в пептиде является О-стереоизомером аминокислоты. Основой пептидов является последовательность Ас-О-^-Б-К-А-Р-У-О-К-У-А-Е-К-Б-К-Е-А-Р-ЫН (8ЕС) ГО N0: 1) (Ас-18АΝΗ₂ или 2Р). В исследованиях, описываемых в данном контексте, используют 2Р или аналог 2Р с первичной последовательностью аминокислот Ас-^-^-Ρ-К-А-Ρ-Υ-^-К-У-А-Ε-К-Ρ-К-Ε-А-Ρ-NΗ₂ (8ЕС ГО N0:5, обозначаемой также 4Р). Пептиды, синтезированные из Ь-аминокислот, обозначают буквой Ь (например, Ь-4Р), а пептиды, синтезированные из О-аминокислот, обозначают буквой О (например, О-4Р).

- 45 009528

В некоторых случаях пептиды иодируют, используя реагент ΙΟΌΟ-ВЕАО (Р1егсе, ЯоскГогб, ЕЬ) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Липосомы из Ь-а-1-пальмитоил-2-олеил-кп-глицеро-3фосфохолина (АсапН Ро1аг Ыр1бк, А1аЬак1ег, АЬ), содержащие или не содержащие Ό-4Ρ, получают в соответствии с рекомендациями изготовителя. Экстракцию и детекцию интактных пептидов из мышиной плазмы проводят, как описано в статье СагЬег и соавт., Айепокс1ег. ТЬтошЬ., 12:886-894, (1992), используя ВЭЖХ с обращенной фазой.

Другие методы.

Содержание белка (см. статью №саЬ и соавт., 1. Ыр1б Рек., 41: 1481-1494, (2000)) и холестерина (см. статью Уап Ьеп1еп и соавт., С1гси1аБоп, 103:2283-2288, (2001)) в липопротеинах и статистические анализы проводят, как описано в статье Уап Ьеп1еп и соавт., С1гси1а1юп, 103:2283-2288, (2001) с достоверностью Р<0,05.

Результаты.

Ш νίΙΐΌ, как Ь-2Р, так и Ό-2Ρ в равной степени способны блокировать окисление ЬЭЬ и индуцируемую ЬЭЬ хемотактическую активность моноцитов в кокультурах человеческих клеток артериальной стенки (данные не приводят). Однако ш с1со, как показывают на фиг. 22А, после перорального введения только Ό-4Ρ сохраняется интактным в кровотоке и способен повышать защитную активность НЭЬ (см. фиг. 22В) и снижать индуцированную ЬЭЬ хемотактическую активность моноцитов (см. фиг. 22С). Через 2 ч после перорального введения ¹²⁵Ι-Ό-4Ρ или ¹²⁵Ι-Ό-4Ρ моча мышей, получающих Ь-4Р, содержит приблизительно в 15 раз больше радиоактивности, чем в случае мышей, получающих Ό-4Ρ (данные не приводят).

На фиг. 23 демонстрируют, что введение два раза в сутки Ό-4Ρ с помощью зонда уменьшает атеросклеротические повреждения у мышей, нуллисомных по рецептору ЬОЬ, получающих западный корм, до 79%. Уровни общего плазменного холестерина не отличаются в значительной степени у мышей, нуллисомных по рецептору ЬОЬ, которые получают Ό-4Ρ, и у мышей, получающих только липосомы или только солевой раствор. Общий холестерин составляет 761±69 мг/дл для группы Ό-4Ρ, 677±52 мг/дл для группы, получающей липосомы, и 699±31 мг/дл для группы, получающей солевой раствор. Средний уровень ΗΌΌ-холестерина несколько выше в группе Ό-4Ρ и составляет 73±8,7 мг/дл против 65,9±9,2 мг/дл для группы, получающей липосомы, и 67,1±6,3 для группы, получающей солевой раствор, поданные различия не достигают статистической значимости.

На фиг. 24 демонстрируют, что у мышей, нуллисомных по аро Е, получающих Ό-4Ρ в воде для питья, происходит уменьшение повреждений более чем на 84%, при этом в случаях, когда мыши получают 2,5 мг/сутки/мышь или 5,0 мг/сутки/мышь, отсутствует достоверная разница. Достоверная разница отсутствует также в количестве потребляемой воды (2,5 мл/сутки/мышь) между мышами, нуллисомными по аро Е, которые не получают пептид, или мышами, получающими 2,5 мг О-4Р/мышь/сутки или 5,0 мг О-4Е/мышь/сутки, и отсутствует также достоверная разница в массах тела, сердца или печени мышей, нуллисомных по аро Е, в трех группах (данные не приводят). Более того, концентрация плазменного общего холестерина достоверно не различается у мышей, нуллисомных по аро Е, которые получают Ό-4Ρ (478±149 мг/дл для мышей, получающих воду без пептида, 534±12,3 мг/дл для мышей, получающих Ό-4Ρ в дозе 2,5 м г/мышь/сутки, и 579±4,6 мг/дл для мышей, получающих Ό-4Ρ в дозе 5,0 м г/мышь/сутки). Средний уровень ΗΌΌ-холестерина немного повышается у мышей, получающих Ό-4Ρ, но разница не достигает статистической значимости (32,2±7 мг/дл для мышей, получающих воду без пептида, 38,7±5 для мышей, получающих Ό-4Ρ в дозе 2,5 м г/мышь/сутки, и 43,4+6 мг/дл для мышей, получающих Ό-4Ρ в дозе 5,0 мг/мышь/сутки).

Обсуждение.

До настоящего времени применение аро А-Ι и пептидных миметиков аро А-Ι в качестве фармакологических агентов была ограничена необходимостью парентарельного введения. Заметное снижение атеросклеротических повреждений в данном исследовании происходит несмотря на отсутствие значительных изменений в уровне общего плазменного холестерина. Хотя имеется тенденция к небольшому повышению уровней ΗΌΌ-холестерина у мышей, получающих Ό-4Ρ, она не достигает статистической значимости. Представленные в данном контексте исследования предлагают, что введенные перорально пептидные миметики аро А-Ι, синтезированные из Ό-аминокислот, могут быть использованы для профилактики и лечения атеросклероза и других хронических воспалительных заболеваний, которые вызывают окисленные липиды.

Подразумевается, что примеры и варианты осуществления, описанные в данном контексте, служат только для иллюстративных целей и что различные модификации или изменения в свете различных модификаций, которые могут быть предложены компетентными специалистами в данной области, должны быть включены в сущность и сферу действия данного изобретения и объем прилагаемых пунктов формулы. Все публикации, патенты и патентные заявки, приведенные в данном контексте, включены таким образом в виде ссылки во всей их полноте для всех целей.

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Пептид, уменьшающий интенсивность симптома атеросклероза, содержащий последовательность аминокислот

   Ό-^-Ρ-Κ-Α-Ρ-Υ-Ό-Κ-ν-Α-Ε-Κ-Ρ-Κ-Ε-Α-Ρ (8Ер ΙΌ N0: 5), содержащую все остатки Ь-аминокислоты, по крайней мере одну защитную группу и защищающую фосфолипид от окисления под воздействием окисляющего агента.
2. 2. Пептид по п.1, отличающийся тем, что содержит первую защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и вторую защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу.
3. 3. Пептид по п.2, отличающийся тем, что указанная защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы, состоящей из ацетила, амида, алкильных групп, содержащих от 3 до 20 атомов углерода, Ртос, ΐ-Ьос, 9-флуоренацетильной группы, 1-флуоренкарбоксильной группы, 9флуоренон-1-карбоксильной группы, бензилоксикарбонила, ксантила (Хап), тритила (Тй), 4метилтритила (Мй), 4-метокситритила (Мт1), 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (М1г), мезитилен-2-сульфонила (Мй), 4,4-диметоксибензгидрила (МЫ1). тозила (Ток), 2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6сульфонила (Ртс), 4-метилбензила (МеВ/1), 4-метоксибензила (Ме0В/1), бензилоксигруппы (Βζ10), бензила (Βζ1), бензоила (Βζ), 3-нитро-2-пиридинсульфенила (№ук), 1-(4,4-диметил-2,6диаксоциклогексилиден)этила (Обе), 2,6-дихлорбензила (2,6^^Ο1-Βζ1), 2-хлорбензилоксикарбонила (201-Ζ), 2-бромбензилоксикарбонила (2-Βγ-Ζ), бензилоксиметила (Вот), ΐ-бутоксикарбонила (Вос), циклогексилоксигруппы (сНхО), ΐ-бутоксиметила (Вит), ΐ-бутоксигруппы (1Ви0), ΐ-бутила (1Ви), ацетила (Ас), бензоильной группы, карбобензоксигруппы, пропила, бутила, пентила, гексила и трифторацетила (ТРА).
4. 4. Пептид по п.1, отличающийся тем, что он содержит защитную группу, присоединенную к аминоконцу, и указанная аминоконцевая защитная группа представляет собой защитную группу, выбранную из группы, состоящей из бензоильной группы, ацетила, пропеонила, карбобензоксигруппы, пропила, бутила, пентила, гексила и алкила, содержащего от 3 до 20 атомов углерода.
5. 5. Пептид по п.4, отличающийся тем, что он содержит защитную группу, присоединенную к карбоксильному концу, и указанная карбоксильная концевая защитная группа представлена амидом.
6. 6. Пептид по п.4, отличающийся тем, что указанная аминоконцевая защитная группа представляет собой ацетил.
7. 7. Пептид по п.1, отличающийся тем, что окисляющий агент выбран из группы, состоящей из пероксида водорода, 13(8)-ΗΡ0ΌΕ, 15(8)-ΗΡΕΤΕ, ΗΡ0ΌΕ, ПРЕТЕ, Η0ΌΕ и НЕТЕ.
8. 8. Пептид по п.1, отличающийся тем, что фосфолипид выбран из группы, состоящей из 1пальмитоил-2-арахидоноил-кп-глицеро-3 -фосфорилхолина (РАРС), 1 -стеароил-2-арахидоноил-кпглицеро-3 -фосфорилхолина (8 АРС), 1 -стеароил-2-арахидонил-кп-глицеро-3 -фосфорилэтаноламина (8АРЕ).
9. 9. Пептид по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что он предназначен для использования в профилактике и лечения атеросклероза.
10. 10. Пептид по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что он предназначен для использования в профилактике и лечения коронарного осложнения, связанного с ответной реакцией острой фазы на воспаление.
11. 11. Фармацевтическая композиция, уменьшающая интенсивность симптома атеросклероза, отличающаяся тем, что она содержит пептид по любому из пп.1-8 в эффективном количестве и фармакологически пригодный наполнитель.
12. 12. Композиция по п.11, отличающаяся тем, что указанный наполнитель представляет собой наполнитель, пригодный для перорального введения.
13. 13. Применение пептида по любому из пп.1-8 в качестве фармацевтического ингредиента при производстве лекарства для профилактики или лечения атеросклероза.
14. 14. Применение по п.13, при котором пептид объединен с фармацевтически приемлемым наполнителем в унифицированном лекарственном препарате.
15. 15. Применение по п.13, при котором пептид предназначен для перорального, назального, ректального, внутрибрюшинного, внутрисосудистого, подкожного, чрескожного и внутримышечного введения.