EA027441B1

EA027441B1 - Применение хелатирующего агента и антимикробных пептидных соединений

Info

Publication number: EA027441B1
Application number: EA201390489A
Authority: EA
Inventors: Алезандра Мануэла Лоуренку Каррейра; Сара Алезандра Валадаш Да Силва Монтейру; Рикардо Мануэль Ди Сейшаш Боавида Феррейра
Original assignee: Консуму Эм Верди - Биотекноложия Даш Планташ, С.А.
Priority date: 2010-10-12
Filing date: 2011-10-12
Publication date: 2017-07-31
Also published as: CA2814565A1; FR23C1034I2; CN103347387A; DK2627177T3; SMT201600433B; US20190167758A1; MX341698B; HUS2100043I1; BR112013008869B1; CO7230346A2; US11154588B2; PT105332A; CY1119574T1; ES2600970T3; AU2011315527A1; MY162731A; EP2627177A1; EP2627177B1; PT2627177T; MX2013004105A

Abstract

Авторами изобретения предложены применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении; применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма; способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма; и способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом. Также предложены композиция, содержащая хелатирующий агент и антимикробный агент, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма; применение указанной композиции для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении и способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение указанной композиции. Дополнительно предложены применение композиции, содержащей антимикробный полипептид, включающий Blad или его активный вариант, для уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении и способ уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении, указанный способ включает нанесение на указанное растение композиции, содержащей эффективное количество антимикробного полипептида, включающего в себя Blad или его активный вариант.

Description

Настоящее изобретение относится к области антимикробных агентов, которые воздействуют на патогены растений.

Введение.

Борьба с патогенами растений и защита сельскохозяйственных культур являются серьезными общемировыми проблемами, которые вызывают все большую обеспокоенность по мере роста мировой численности населения и связанной с этим нехваткой продовольствия. Кроме того, современные методы ведения сельского хозяйства в части сбора и хранения урожая, как правило, обеспечивают хорошие условия для роста патогенов.

Использование химических пестицидов является стандартным подходом в борьбе с вредителями сельского хозяйства. Однако многие используемые в настоящее время пестициды имеют некоторые существенные недостатки. Например, многие из них оказывают отрицательное влияние на окружающую среду, а многие имеют низкую или снижающуюся эффективность. Особую озабоченность вызывают низкая активность и/или узкий спектр действия некоторых химических соединений, вместе с развитием устойчивости у патогенов.

Одна из целей настоящего изобретения состоит в попытке решения этих проблем и, в частности, например, в разработке средств улучшения активности антимикробных агентов, которые являются эффективными против патогенных для растений микроорганизмов.

Сущность изобретения

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что хелатирующий агент может синергетически усиливать эффективность антимикробных агентов, которые являются эффективными против патогенных для растений микроорганизмов.

Таким образом, авторами настоящего изобретения предложено:

(ί) применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении;

(ίί) применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат наносятся на нуждающееся в этом растение, при этом предпочтительно указанный антимикробный агент и указанный хелатирующий агент наносятся на указанное растение:

a) в составе одной композиции или

b) по отдельности или последовательно или одновременно.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антимикробный агент является эффективным против патогенных для растений бактерии или грибка. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антимикробный агент включает в себя полипептид, при этом предпочтительно указанный полипептид включает В1аб или его активный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА.

Авторами настоящего изобретения также предложены способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма;

способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом.

Кроме того, авторами настоящего изобретения предложена композиция, содержащая хелатирующий агент и антимикробный агент, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма. Предпочтительно антимикробный агент является эффективным против патогенных для растений бактерии или грибка, предпочтительно грибка. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения антимикробный агент включает в себя полипептид, при этом предпочтительно указанный полипептид включает В1аб или его активный вариант. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА.

Авторами настоящего изобретения дополнительно предложены применение композиции настоящего изобретения для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении и способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение композиции настоящего изобретения.

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что полипептид В1аб из Ьиртик обладает мощным антимикробным действием в отношении большого числа разнообразных бактериальных организмов, которые являются патогенными для растений.

Таким образом, авторами настоящего изобретения предложено применение композиции, содержащей антимикробный полипептид, включающий В1аб или его активный вариант, для уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении. Предпочтительно указанная компози- 1 027441 ция дополнительно содержит хелатирующий агент. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная бактерия является патогенным видом одного из следующих родов: Ркеиботоиак, Ег\уийа и §1тер1отусе8. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения композиция наносится на нуждающееся в этом растение.

Авторами настоящего изобретения также предложен способ уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении, указанный способ включает нанесение на указанное растение композиции, содержащей эффективное количество антимикробного полипептида, включающего В1аб или его активный вариант.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 показана кодирующая последовательность предшественника β-конглютина Ьиртик а1Ьи8 (5ЕО ГО N0: 1);

на фиг. 2 показан внутренний фрагмент кодирующей последовательности предшественника β-конглютина, соответствующий В1аб (8Е0 ГО N0: 3).

Подробное описание изобретения

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что при использовании сочетания хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, указанное сочетание особенно эффективно для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма. Таким образом, в одном аспекте авторами настоящего изобретения предложена композиция, содержащая или в основном состоящая из хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма. Композиция, содержащая хелатирующий агент и антимикробный агент, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, может также представлять собой препарат, содержащий другое химическое соединение(я), добавленное в эту композицию специалистом в данной области техники.

Антимикробные агенты.

Антимикробным агентом является любой агент, который уменьшает рост или уничтожает микроорганизм, являющийся патогенным для растения. Указанный микроорганизм предпочтительно является бактерией (грамположительной и грамотрицательной) или грибком, предпочтительно грибком (который может быть дрожжевым или плесневым грибком). Предпочтительно антимикробный агент содержит (или в основном состоит из) полипептид, такой как антигрибковый белок. Подходящие примеры антигрибковых белков включают хитиназы, хитинсвязывающие белки, хитозаназы, в-1,3-глюканазы и β-Νацетил-Э-глюкозаминидазы. Конкретные примеры микроорганизмов, на которые может воздействовать антимикробный агент, приведены ниже.

Полипептитд В1аб.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения, в которых антимикробный агент содержит (или в основном состоит из) полипептид, указанный полипептид включает (или в основном состоит из) В1аб или его активный вариант.

В1аб (Ьапба бе Ьиршик а1Ьи§ босе - полоса из сладкого Ь. а1Ьи§) - это название, данное стабильному промежуточному продукту распада β-конглютина, основного запасного белка, содержащегося в семенах растений рода Ьиртик. Он представляет собой полипептид с массой 20 кДа, состоящий из 173 аминокислотных остатков, который кодируется внутренним фрагментом (519 нуклеотидов, зарегистрирован в ОеиВаик под номером доступа АВВ13526) гена, кодирующего предшественник β-конглютина из Ьиршик (1791 нуклеотидов, зарегистрирован в ОеиВаик под номером доступа АА897865). Когда праймеры, кодирующие концевые последовательности В1аб, были использованы для амплификации последовательности из геномной ДНК Ьиртик, был получен продукт размером ~620 п.н., что указывает на наличие интрона в фрагменте, кодирующем В1аб. Существующий в природе В1аб является основным компонентом гликоолигомера массой 210 кДа, который накапливается (после интенсивного ограниченного протеолиза β-конглютина) исключительно в семядолях растений из рода Ьиртик между 4 и 12 днями после начала прорастания. В то время как указанный олигомер является гликозилированным, существующий в природе В1аб является негликозилированным. Содержащий В1аб гликоолигомер состоит из нескольких полипептидов, основные из которых имеют молекулярную массу 14, 17, 20, 32, 36, 48 и 50 кДа. Полипептид массой 20 кДа В1аб несомненно является наиболее распространенным полипептидом этого олигомера, и по всей видимости только он один обладает лектиновой активностью. Существующий в природе В1аб содержит приблизительно 80% от всех семядольных белков у 8-дневных проростков.

Кодирующая последовательность предшественника β-конглютина Ь. а1Ьи8 (8Е0 ГО N0: 1) приведена на фиг. 1. Кодирующая последовательность исходной субъединицы β-конглютина соответствует остаткам с 70 по 1668. Кодируемые ею 533 аминокислотных остатка исходной субъединицы β-конглютина (8Е0 ГО N0: 2) представляют собой:

- 2 027441

МСКМЕУКРРТЪУ1Л/Ъ<З^РЬМАУ31С1АУаЕКЕУЪК5НЕКРЕЕКЕ0ЕЕЦ0РКЕ<2К Ρ03ΕΚΕΕΕΕ<2Ε0Ε0Ο8Ρ3ΥΡΚΕ<25ΟΥΕΕΕ<2ΥΗΕΕ3Ε0ΕΕΕΕΕ0Ε<20<2σ3Ρ3Υ3ΚΕ 0ΕΝΡΥΗΡ330ΕΡ0ΤΕΥΚΝΕΝΘΚΙΕνΕΕΕΡΟ0ΕΤΝΕΕΕΝΕ0ΝΥΕΐνΕΡ03ΚΡΝΤΕΙ ЬРКНЗБАП ΥνυννΕΝΟΕΑΤ IΤI νΝΡΕΕΕΟΑΥΝΕΕ ΥΟϋΑΕΚ IΡΑΘ3 Τ3 ΥΙШРООИ 0ΚΕΕννΚΙιΑΙΡΙΝΚΡαΥΡΥΏΡΥΡ83ΤΚΟ003ΥΡ3ΟΡ3ΕΝΤΕΕΑΤΡΝΤΕΥΕΕΙ0ΕΙ I^еNΕ^Ε^ΕΥΕΕ^ΚΚ^^Ε^8^^^Ε^VIVIVЗΚΚ^I^Κ^ΤΚΗΑ^ЗЗЗαΚ^ΚΡЗ^Зβ ΡΡΝΕΕ3ΝΞΡΙΥ5ΝΚΥΟΝΡΥΕΙΤΡΟΕΝΡςνζ2ΟΕΝΙ3ΕΤΥΙΚΙΝΕΟΑΕΚΕΡΗΥΝ3ΚΑ ΙΥννννϋΕαΕΟΝΥΞΕνθΙΕΣ)ς0Ε00ΌΕ0ΕΕΚΕΕΕνΐΕΥ3ΑΕΕ3ΕΟΕΙΡνΐΡΑΟΥΡ 151МА53ЦЬЕЬЬСРа1ЫАЕЕЫО1ШРЬАС5КПЦ¥1Е0ЬВЕАУЫЕЬТРРС5АЕБ1ЕЕ ΕΙΚΝΰ003ΥΡΑΝΟ0Ρ00000003ΕΚΕΟΕΕΘΕΕΟ33ΕΡΡ

Внутренний фрагмент кодирующей последовательности предшественника β-конглютина, соответствующий В1аб (ВЕР ΙΌ N0: 3), приведен на фиг. 2. Полипептид В1аб (ВЕР ΙΌ N0: 4) представляет собой:

ΕΕ0ΕΝΡΥΗΡ3 30ΕΡ0ΤΒΥΚΝΕΝΘΚΙЕУЬЕЕРВОЕТЦЕЬЕЫЪОЫУЕIУЕ Ρζ)3 ΚΡΝΤ ЫЪРКНЗВАВУУЪУУЪЫеЕАТ1Т1УЦРВЕЕ0АУМЬЕУСВАЬЕ1РАОЗТЗУ1ЬЫРВ ΌΝΰΚΕΕννΚΕΑΙΡΙΝΝΡαΥΡΥΌΡΥΡ83ΤΚΌΰ03ΥΡ3<3Ρ3ΚΝΤΕΕΑΤΡΝΤΚΥΕΕΙΰ

ΕΙΙΙΛΝΕϋ

Таким образом, когда антимикробный агент содержит (или в основном состоит из) полипептид, включающий в себя (или в основном состоящий из) В1аб или его активный вариант, указанный агент содержит (или в основном состоит из) полипептидную последовательность, включающую в себя (или в основном состоящую из) последовательность ВЕР ΙΌ N0: 4 или ее активный вариант.

Активным вариантом В1аб является вариант В1аб, который сохраняет способность действовать в качестве антимикробного агента (т.е. обладает антимикробной активностью - описание уровня такой активности и способа ее измерения см. ниже). Термин активный вариант В1аб включает в свой объем фрагмент последовательности ВЕС) ΙΌ N0: 4. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения фрагмент последовательности ВЕР ΙΌ N0: 4 выбран таким образом, что он составляет по меньшей мере 10% длины ВЕС) ΙΌ N0: 4, предпочтительно по меньшей мере 20%, предпочтительно по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% длины ВЕР ΙΌ N0: 4. Таким образом, В1аб или его вариант, как правило, имеет длину по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, например по меньшей мере 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 или 173 аминокислотных остатка.

Термин активный вариант В1аб также включает в свой объем полипептидную последовательность, которая обладает гомологией с ВЕР ΙΌ N0: 4, например по меньшей мере 40% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 60%, предпочтительно по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 97% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности, например, по всей последовательности или на участке из по меньшей мере 20, предпочтительно по меньшей мере 30, предпочтительно по меньшей мере 40, предпочтительно по меньшей мере 50, предпочтительно по меньшей мере 60, предпочтительно по меньшей мере 80, предпочтительно по меньшей мере 100, предпочтительно по меньшей мере 120, предпочтительно по меньшей мере 140 и наиболее предпочтительно по меньшей мере 160 или более соседних аминокислотных остатков. Способы измерения гомологии белков хорошо известны из уровня техники, и специалистам в данной области техники будет понятно, что в данном контексте гомология рассчитывается на основе идентичности аминокислот (иногда обозначается как строгая гомология).

Гомологичный активный вариант В1аб, как правило, отличается от полипептидной последовательности ВЕР ΙΌ N0: 4 заменами, инсерциями или делениями, например имеет от 1, 2, 3, 4, 5 до 8 или более замен, инсерций или делеций. Замены являются предпочтительно консервативными, то есть другими словами, аминокислота может быть заменена аналогичной аминокислотой, где аналогичные аминокислоты имеют одинаковой с заменяемой аминокислотой одну из следующих групп: ароматические остатки (Т/Н/^/У), неполярные алифатические остатки (Θ/Α/Ρ/Ι/Ε/ν), полярные незаряженные алифатические остатки (С/В/Т/М/Л/р) и полярные заряженные алифатические остатки (Ό/Е/К/К). Предпочтительные подгруппы включают в себя: Θ/Α/Ρ; Ι/Ε/ν; С/В/Т/М; МР; Ό/Е и К/К

Полипептид, включающий в себя В1аб или его активный вариант (как описано выше), может состоять из В1аб или его активного варианта с любым количеством аминокислотных остатков, добавленных к Оконцу и/или С-концу, при условии, что полипептид сохраняет антимикробную активностью (описание уровня такой активности и способа ее измерения опять см. ниже). Предпочтительно, чтобы к одному или обоим концам В1аб или его активного варианта было добавлено не более 300 аминокислотных остатков, более предпочтительно не более 200 аминокислотных остатков, предпочтительно не более 150 аминокислотных остатков, предпочтительно не более 100 аминокислотных остатков, предпочтительно не более 80, 60 или 40 аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно не более 20 аминокислотных остатков.

- 3 027441

Полипептид, включающий в себя (или в основном состоящий из) В1ай или его активный вариант (как описано выше), может быть использован в настоящем изобретении в очищенном виде (например, выделен из растительного, животного или микробного источника) и/или в виде рекомбинантного белка. Получение рекомбинантной формы позволяет получать активные варианты В1ай. Способы очистки существующего в природе В1ай уже описаны в литературе (например, Катов с1 а1. (1997) Р1аи1а 203(1): 2634 и Мои1е1то с1 а1. (2010) РЬо8 ΟΝΕ 5(1): е8542). Подходящим источником существующего в природе В1ай является растение рода Ьиртив, такое как Ьиртив а1Ъив, предпочтительно семядоли указанного растения, предпочтительно собранные между примерно 4 и примерно 14 днем после начала прорастания, более предпочтительно собранные с 6 по 12 день после начала прорастания (например, на 8 день после начала прорастания). В уровне техники раскрыты способы экстрагирования общего белка, приводящие к получению неочищенного экстракта, содержащего В1ай, и способы выделения белков из такого экстракта, приводящие к получению частично очищенного экстракта, например, включающего В1айсодержащий гликоолигомер, который включает в себя В1ай.

Для того чтобы выделить собственно В1ай, можно затем использовать ДСН-ПААГ и/или предпочтительно обращенно-фазную ВЭЖХ на колонке С-18.

Альтернативным способом получения частично очищенного экстракта, содержащего гликоолигомер, который включает В1ай, является использование хитинсвязывающей активности В1ай. Этот гликоолигомер очень эффективно связывается с хитиновой колонкой, в способе очистки при помощи хитиновой аффинной хроматографии, и элюируется 0,05 Н раствором НС1. Подробное описание примера этого способа очистки приводится ниже.

Семядоли восьмидневных растений люпина собирают и гомогенизируют в воде, очищенной при помощи системы МПП-0 р1ив (значение рН доведено до 8,0), содержащей 10 мМ СаС1₂ и 10 мМ МдС1₂. Гомогенат фильтруют через марлю и центрифугируют при 30000 д в течение 1 ч при температуре 4°С. Затем осадок ресуспендируют в 100 мМ Тпв-НС1 буфере с рН 7,5, содержащем 10% (мас./об.) №С1, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ ЭГТА, перемешивают в течение 1 ч при температуре 4°С и центрифугируют при 30000 д в течение 1 ч при температуре 4°С. Общую глобулиновую фракцию, содержащуюся в надосадочной жидкости, осаждают сульфатом аммония (561 г/л), перемешивают на холоде в течение 1 ч и центрифугируют при 30000 д в течение 30 мин при температуре 4°С. Полученный осадок растворяют в 50 мМ Тг1в-НС1 буфере с рН 7,5, обессоливают на колонке ΡΌ-10, уравновешенной тем же буфером, и пропускают через колонку для хитиновой аффинной хроматографии, предварительно уравновешенную тем же буфером. Эту колонку промывают 50 мМ Тпв-НС1 буфером с рН 7,5, и связавшиеся белки элюируют 0,05 Н раствором НС1. Элюированные фракции сразу нейтрализуют 2 М раствором Ττίβ, и пиковые фракции объединяют, лиофилизируют и анализируют при помощи ДСН-ПААГ.

Для изготовления хитиновой колонки хитиновое сырье было получено от компании Шдта и обработано следующим образом: образец хитина обильно промывали водой, очищенной при помощи системы Μί11ί-0 р1ив, а затем 0,05 Н раствором НС1. Затем его промывали 1% (мас./об.) раствором карбоната натрия и затем этанолом до тех пор, пока поглощение промывочной жидкости не становилось меньше 0,05. После этого хитин помещали в наконечник для пипетки и уравновешивали 50 мМ Тпв-НС1 буфером с рН 7,5.

Способы получения рекомбинантных белков хорошо известны из уровня техники. Такие способы, какие применяются здесь, будут включать вставку полинуклеотида, кодирующего полипептид, включающий в себя В1ай или его активный вариант, в подходящий экспрессионный вектор, позволяющий совмещать указанный полинуклеотид с одним или несколькими промоторами (например, с индуцибельным промотором, таким как Т71ас промотор) и с другими целевыми полинуклеотидами или генами, введение данного экспрессионного вектора в подходящую клетку или организм (например, ЕвсйетюЫа сой), экспрессию полипептида в трансформированной клетке или организме и удаление экспрессированного рекомбинантного полипептида из этой клетки или организма. Для облегчения такой очистки экспрессионный вектор может быть сконструирован так, чтобы полинуклеотид дополнительно кодировал, например, концевую метку, которая может способствовать очистке, например метку из гистидиновых остатков для аффинной очистки. После того как рекомбинантный полипептид был очищен, метка очистки может быть удалена из полипептида, например, путем протеолитического расщепления.

В композиции настоящего изобретения, содержащей антимикробный агент, включающий в себя (или в основном состоящий из) полипептид, указанный полипептид предпочтительно находится в частично очищенном виде, более предпочтительно в очищенном виде. Указанный полипептид является частично очищенным, если он находится в среде, в которой отсутствуют один или несколько других полипептидов, с которыми он связан в естественных условиях, и/или составляет по меньшей мере 10% от всех присутствующих белков. Указанный полипептид является очищенным, если он находится в среде, в которой отсутствуют все или большинство других полипептидов, с которыми он связан в естественных условиях. Например, термин очищенный В1ай означает, что В1ай составляет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% от всех белков в композиции.

- 4 027441

В композиции настоящего изобретения, содержащей антимикробный агент, набор белков Ьиршик может состоять в основном из В1аб-содержащего гликоолигомера, который включает в себя полипептид, который включает в себя (или в основном состоит из) В1аб или его активный вариант.

Патогенные для растений микроорганизмы.

Патогенным для растения микроорганизмом, против которого антимикробный агент является эффективным, является любой микроорганизм, способный вызывать заболевание снаружи или внутри растения. Особенно предпочтительные целевые бактериальные микроорганизмы включают в себя патогенные виды Ркеиботоиак, такие как Ркеиботоиак аетидшока, Ркеиботоиак 8утшдае, Ркеиботоиак 1о1аа8н и Р8еиботопа8 адапа (предпочтительно Р. 8утшдае); патогенные виды Ег\\пиа, такие как Ег\\йиа реглета, РескоЪаскегшт сагоЮуогит, Епуийа ату1оуога, Епуйиа сЕгузаШЕетк Егуйиа ρδίάίί и Егуйиа 1гасПе1рНПа; и патогенные виды §ктеркотусе8, такие как §ктеркотусе8 дп8еи8.

Особенно предпочтительные целевые грибковые микроорганизмы включают в себя патогенные виды ЛЕетапа, такие как ЛЕетапа аЕегпаШ, ЛЕетапа агЬоге8сеи8, ЛЕетапа агЪи8Й, ЛЕетапа Ъга88юае, ЛЕетапа Ьга881сюо1а, ЛЕетапа сатойтсиЕае, ЛЕетапа соищпска, ЛЕетапа баиск ЛЕетапа еирЬогЪйсо1а, ЛЕетапа да18еп, ЛЕетапа Е'ЕесЮпа, ЛЕетапа .) аротса, ЛЕетапа ре1го8еЕш, ЛЕетапа 8еНт, ЛЕетапа 8о1ат и ЛЕетапа 8тугпи; патогенные виды Ршатшт, такие как Ршатшт оху8рогит и Ршатшт дгаттеагит (предпочтительно Р. оху8рогит); патогенные виды ВойуЙ8, такие как Вокгук18 сшегеа; и патогенные виды СоПекойтсЕит, такие как СоПекойтсЕит аскиакит, СоПекойтсЕит соссобе8, СоПекойтсЕит сар8юк, СоЕекойгсЕит сга881ре8, СоЕекойгсЕит д1оео8ротю1бе8, СоПекойтсЕит дгатЕйсо1а, СоПекойтсЕит каЕауае, СоЕекойгсЕит НпбетикЫапит, СоЕекойгсЕит ти8ае, Со11екойтсЕит тдгит, Со11екойтсЕит огЫси1аге, Со11екойтсЕит р181 и СоПекойтсЕит 8иЪ1тео1ит.

Хелатирующие агенты.

Хелатирующий агент (также известный как хелант, хелатор или комплексообразующий агент) представляет собой любое химическое соединение, которое связывает ион металла с образованием нековалентного комплекса и уменьшает активность иона. Подходящие хелатирующие агенты включают в себя полиаминокарбоксилаты, такие как ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) и ЭГТА (этиленгликоль-бис-ф-аминоэтиловый эфир)-Х,Х,№,№-тетрауксусная кислота). Предпочтительно в качестве хелатирующего агента используется ЭДТА, предпочтительно в концентрации по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл или по меньшей мере 100 и до 500 мкг/мл, до 1, до 5, до 10 или до 20 мг/мл. Предпочтительно ЭДТА используется в концентрации от 0,1 до 20 мг/мл, более предпочтительно от 1 до 20 мг/мл.

Результаты.

Антимикробный агент в сочетании с хелатирующим агентом может применяться для подавления роста патогенного для растения микроорганизма (означает, что он обладает микробостатическим действием) или уничтожения указанного микроорганизма (означает, что он обладает микробицидным действием). Специалист в данной области техники при помощи стандартных методов будет способен определить подходящую дозу и/или концентрацию антимикробного агента при конкретной концентрации хелатирующего агента для достижения желаемого подавления роста или уничтожения микроорганизма в каждом конкретном случае. Предпочтительно сочетание антимикробного агента и хелатирующего агента является нетоксичным для людей или животных.

Предпочтительно при использовании сочетания антимикробного агента и хелатирующего агента (например, композиции настоящего изобретения) в качестве микробостатического агента это сочетание уменьшает скорость роста на 10%, более предпочтительно на 50%, более предпочтительно на 75%, более предпочтительно на 90%, более предпочтительно на 95%, более предпочтительно на 98%, более предпочтительно на 99% и еще более предпочтительно на 99,9% по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного сочетания. Наиболее предпочтительно данное сочетание предотвращает любой рост микроорганизма.

Предпочтительно при использовании сочетания антимикробного агента и хелатирующего агента (например, композиции настоящего изобретения) в качестве микробицидного агента это сочетание уничтожает 10% популяции микроорганизмов, более предпочтительно 50% указанной популяции, более предпочтительно 75% указанной популяции, более предпочтительно 90% указанной популяции, более предпочтительно 95% указанной популяции, более предпочтительно 98% указанной популяции, более предпочтительно 99% указанной популяции и еще более предпочтительно 99,9% указанной популяции по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного сочетания. Наиболее предпочтительно данное сочетание уничтожает всю популяцию микроорганизма.

При применении для предотвращения или подавления заражения растения микроорганизмом указанное сочетание предпочтительно используется в эффективном количестве, то есть, другими словами, количестве, которое обеспечивает такой уровень подавления роста и/или уничтожения микроорганизма, при котором достигается определяемый уровень предотвращения или подавления заражения (например, достигается определяемый уровень предотвращения или подавления повреждения растительной ткани), предпочтительно по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного сочетания.

Если выбранный антимикробный препарат содержит полипептид, включающий в себя В1аб или его

- 5 027441 активный вариант, в сочетании с хелатирующим агентом (например, ЭДТА в любой из вышеописанных концентраций), то подходящие концентрации, в которых используется указанный полипептид, включают по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 20 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл, по меньшей мере 100 мкг/мл или по меньшей мере 500 мкг/мл и до 1, до 2,5, до 5 или до 10 мг/мл. Предпочтительно выбранная концентрация указанного пептитда составляет от 50 мкг/мл до 10 мг/мл, более предпочтительно от 500 мкг/мл до 5 мг/мл и еще более предпочтительно от 1 до 5 мг/мл (например, около 2,5 мг/мл).

Например, при концентрации ЭДТА 50 мМ (т.е. примерно 15,8 мг/мл) концентрация В1ай 1 или 2,5 мг/мл может быть использована, например, для подавления роста В. сшетеа или Р. охукротиш соответственно. Это является неожиданным результатом, учитывая, что сам по себе В1ай необходимо применять в концентрациях примерно 5 или 10 мг/мл (соответственно) для подавления роста этих патогенов. Открытия, сделанные авторами настоящего изобретения, позволяют а) эффективно использовать антимикробные агенты (которые эффективны против патогенов растений) в более низких концентрациях, благодаря применению хелатирующего агента, или Ь) повысить эффективность антимикробных агентов (которые эффективны против патогенов растений) при стандартных концентрациях, благодаря применению хелатирующего агента. Это обеспечивает более экономичное/эффективное использование таких антимикробных препаратов для предотвращения или лечения инфекции растения (или его части), вызываемой микроорганизмом.

Применение и способы.

Авторами настоящего изобретения предложено применение композиции настоящего изобретения для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении. В связи с этим, авторами также предложен способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий в себя нанесение на нуждающееся в этом растение композиции настоящего изобретения (например, эффективного количества указанной композиции).

Авторами настоящего изобретения также предложено применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективными против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении. Ими также предложено применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма. В связи с этим, авторами также предложены:

a) способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма (например, эффективного количества сочетания указанных агентов);

b) способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом.

В этих вариантах осуществления изобретения указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат могут быть нанесены на указанное растение в составе одной композиции или по отдельности. Если эти два агента наносятся по отдельности, то это нанесение может быть последовательным (где каждый агент может быть нанесен первым) или одновременным. Нанесение на растение может осуществляться, например, путем наложения (например, распыления) агентов (или композиции, содержащей указанные агенты) на растение (или на любую его часть) или путем погружения растения или его части (например, семян) в соответствующий раствор(ы).

Когда хелатирующий агент используется для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, указанный хелатирующий агент (и его концентрация) предпочтительно выбирается таким образом, чтобы сочетание указанного антимикробного агента и указанного хелатирующего агента обеспечивало повышенный уровень подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма (например, такой, при котором достигается повышенный уровень предотвращения или подавления заражения растения, например, достигается повышенный уровень предотвращения или подавления повреждения растительной ткани) предпочтительно по сравнению с эквивалентными условиями без использования данного хелатирующего агента.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, относящихся к применению/способу, антимикробный агент и хелатирующий агент являются такими, как подробно описано выше.

Растением, нуждающимся в сочетании антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, и хелатирующего агента, может быть любое растение, подверженное риску заражения или уже являющееся зараженным, где указанное заражение вызвано патогенным для растений микроорганизмом. Предпочтительно растение является культурным растением (например, любым растением, которое выращивается, чтобы быть собранным с целью получения пищи, корма для скота, топлива, волокна или любого другого коммерчески ценного продукта). Предпочтительно указанное культурное растение является продовольственным культурным растением, таким как рас- 6 027441 тение, являющееся источником сахара (например, сахарная свекла, сахарный тростник), фруктом (включая орех), овощем или зерном. Конкретные растения, дающие зерно, включают в себя злаки (например, кукуруза, пшеница, ячмень, сорго, просо, рис, овес и рожь) и бобовые (например, фасоль, горох и чечевица).

Авторами настоящего изобретения также предложено применение композиции, содержащей (или в основном состоящей из) антимикробный полипептид, включающий (или в основном состоящий из) В1аб или его активный вариант, для уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении. В связи с этим, авторами также предложен способ уничтожения или подавления роста патогенной для растения бактерии на растении, указанный способ включает в себя нанесение на указанное растение композиции, содержащей (или в основном состоящей из) эффективное количество антимикробного полипептида, включающего (или в основном состоящего из) В1аб или его активный вариант. При необходимости антимикробный полипептид, включающий (или в основном состоящий из) В1аб или его активный вариант, может быть использован в изолированном виде.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанная композиция наносится на нуждающееся в этом растение. Растением, нуждающимся в указанной композиции, может быть любое растение, подверженное риску заражения или уже являющееся зараженным, где указанное заражение вызвано патогенной для растения бактерией. Предпочтительные растения описаны выше. Значения терминов уничтожение/подавление роста бактерии и эффективное количество являются такими же, как описано выше для сочетания антимикробного агента и хелатирующего агента.

Примеры

В следующих примерах ВБЛИ обозначает существующий в природе В1аб-содержащий гликоолигомер, включающий в себя полипептид В1аб массой 20 кДа, очищенный по методике, описанной в Кашоз е! а1. (1997) Р1ап!а 203(1): 26-34: см. разделы Растительный материал и условия выращивания и Очистка белков в параграфе Материалы и методы этого документа.

Определения:

МИК - минимальная ингибирующая концентрация: наименьшая концентрация антимикробного препарата, которая подавляет видимый рост микроорганизма.

МФК/МБК - минимальная фунгицидная/бактерицидная концентрация (или минимальная летальная концентрация): наименьшая концентрация антимикробного агента, необходимая для уничтожения 99,9% первичного инокулума после 24 ч при стандартизированном наборе условий.

Пример 1. Бактерицидное действие ВБЛИ и синергическое влияние на него ЭДТА.

A. Было установлено, что для Р. аетдтоза бактериостатическая концентрация ВБЛИ составляет 100 мкг/мл, а бактерицидная - 250 мкг/мл. ВБЛИ в концентрации 50 мкг/мл или ЭДТА в концентрации 1 мг/мл подавляют рост Р. аешдтоза (т.е. обе концентрации являются бактериостатическими), но сочетание этих двух веществ в данных концентрациях является бактерицидным.

B. Для БгМша рпшета МИК ВБАБ составляет 32 мкг/мл и МИК ЭДТА составляет 15 мМ. Однако в присутствии субподавляющего количества ЭДТА (0,75 мМ) МИК ВБЛИ снижалась до 16 мкг/мл.

C. В случае ЗБерЮшуеез дпзеиз МИК ВБЛИ составляет 1024 мкг/мл и МИК ЭДТА составляет 16 мМ. Однако в присутствии субподавляющего количества ЭДТА (8 мМ) МИК ВБЛИ снижалась до 256 мкг/мл.

Пример 2. Синергическое влияние ЭДТА на фунгицидное действие ВБЛИ.

Зона подавления ВБЛИ совместно и без ЭДТА в отношении Войуйз етегеа на 1,2% (мас./об.) картофельно-декстрозном агаре (РИЛ) (3 суток инкубации при 25°С)

Агент (ы)	Диаметр зоны	Средний диаметр зоны подавления (мм)
подавления	(мм)
В1аД	(200 мкг)		21	21	22	21
В1аД	(100 мкг)		16	16	15	16
В1аД	(50 мкг)		0	0	0	0
В1аД	(20 мкг)		0	0	0	0
ЭДТА	(50 шМ)		0	0	0	0
В1аД	(200 мкг)+ЭДТА	(50 шМ)	23	24	25	24
В1аД	(100 мкг)+ЭДТА	(50 шМ)	19	19	18	19
В1аД	(50 мкг)+ЭДТА ι	(50 шМ)	13	15	14	14
В1аД	(20 мкг)+ЭДТА ι	(50 шМ)	10	12	12	11

Рост В. етега подавлялся при количестве ВБЛИ 200 и 100 мкг. Это подавление усиливалось при добавлении 50 мМ (приблизительно 15,8 мг/мл) ЭДТА.

Отсутствие подавления роста наблюдалось при использовании только ВБЛИ в количестве 20 или 50 мкг или использовании только 50 мМ ЭДТА. Однако подавление имело место, когда каждая из этих двух концентраций ВБЛИ использовалась в сочетании с 50 мМ ЭДТА.

- 7 027441

Зона подавления ВРАЭ совместно и без ЭДТА в отношении Ризапит охузрогит на 1,2% (мас./об.) картофельно-декстрозном агаре (ΡΌΑ) (3 суток инкубации при 25°С).

Агент (ы)	Диаметр зоны подавления (мм)	Средний диаметр зоны подавления (мм)
В1аД	(200 мкг)	25	22	22	23
В1аД	(100 мкг)	0	0	0	0
В1аД	(50 мкг)	0	0	0	0
В1аД	(20 мкг)	0	0	0	0
ЭДТА	(50 шМ)	0	0	0	0
В1аД	(200 мкг)+ЭДТА (50 шМ)	28	27	30	28
В1аД	(100 мкг)+ЭДТА (50 шМ)	22	21	26	23
В1аД	(50 мкг)+ЭДТА (50 шМ)	24	20	15	20
В1аД	(10 мкг)+ЭДТА (50 шМ)	0	0	0	0

Рост Р. охузрогит подавлялся при количестве ВРАЭ 200 мкг. Это подавление усиливалось при добавлении 50 мМ (приблизительно 15,8 мг/мл) ЭДТА.

Отсутствие подавления роста наблюдалось при использовании только ВРАЭ в количестве 20, 50 или 100 мкг или использовании только 50 мМ ЭДТА. Однако подавление имело место, когда 50 или 100 мкг ВЕАЭ использовалось в сочетании с 50 мМ ЭДТА.

Claims

1. Применение хелатирующего агента и антимикробного агента, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, для подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма на растении, причем указанный антимикробный агент включает полипептид, включающий В1аб последовательность ЗРС) ΙΌ ΝΟ: 4, или его активный вариант, который имеет антимикробную активность и который включает последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична или ЗРС) ΙΌ ΝΟ: 4, или фрагменту ЗРС) ΙΌ ΝΟ: 4, длина которого составляет по меньшей мере 60 аминокислот.

2. Применение хелатирующего агента для повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, причем антимикробный агент определен в п. 1.

3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанный хелатирующий агент и указанный антимикробный препарат наносятся на нуждающееся в этом растение.

4. Применение по п.3, в котором указанный антимикробный агент и указанный хелатирующий агент наносятся:

a) на указанное растение в составе одной композиции или

b) на одну и ту же часть растения по отдельности, в частности каждый последовательно или одновременно.

5. Применение по любому из предшествующих пунктов, в котором хелатирующий агент является полиаминокарбоксилатом, предпочтительно ЭДТА.

6. Применение по любому из пп.1-5, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения.

7. Применение по п.6, в котором бактерия является патогенным видом одного из следующих родов: Рзеиботопаз, Ρΐ'\νίηί;··ι и З1гер1отуеез.

8. Способ подавления роста и/или уничтожения патогенного для растений микроорганизма, включающий нанесение на нуждающееся в этом растение хелатирующего агента и антимикробного агента, раскрытых в п.1.

9. Способ по п.8, где микроорганизм является бактерией, патогенной для растения.

10. Способ повышения активности антимикробного препарата, который является эффективным против патогенного для растений микроорганизма, включающий применение указанного антимикробного препарата с хелатирующим агентом, где антимикробный препарат определен в п.1.

- 8 027441

1 даСддсдаСд ааСдаасасС дсдСССдсСд дсСССдаСда аааСсдадСд саассСааСа

61 СааСсаааСа СдддСаадаС дададСдадд СССссаасдС СадСдССддС асСаддааСа 121 дСаССссСса СддсадСдСс ааССддСаСС дсССаСддад ааааадаСдС дсЬааададС 181 саСдададдс сЬдаддааад адаасаадад дадСддсаас скаддадаса асдассСсаа 241 адСадааддд аадададада дсаададсаа дадсадддСС сСсссСсаСа сссасдсадд 301 сададСддТС аСдададдад асааСассаС дададдадСд адсададдда ададададад 361 саадаасаас аасааддССс СсссЪсаСас СсасдСадас аааддаассс ССаСсасССс 421 адсСсСсааа даССссааас СсСССасааа ааСаддааСд дсааааСссд СдСдсСсдад 481 аддСССдасс ааадаассаа СадасССдад ааСсСссааа асСассдсаС СдССдадССс 541 сааСсаааас с±аасас±сЪ саССсСсссС ааасасСсСд аСдсСдасСа сдСссСсдСС 601 дСасСсааСд дСададссас ааСсасдаСа дСааасссСд аСадаадаса адсаСа1аас 661 сССдадСа^д дсдаСдсСсС садааСссса дсСддсСсаа сССсаСаСаС ссССаасссд 721 даСдасаасс адаадсССад адСадСсаад сСсдсааСас ссаСсаасаа СссСддсСас 781 ССССаСдаСС СсСаСссаСс дадСасСааа дассаасааС ссСасССсад СддсСЬсадс 841 аддаасасСС Сададдссас сССсааСасС сдССаСдаад адаСасааад даССа£Х£Са 901 дддааСдадд аСдадсаада аСаСдаддаа саааддсдСд ддсаададса дадсдассаа 961 дасдаддддд СдаСадСдаС адСССсааад ааасадаСсс аааааССдас аааасасдсЪ 1021 сааСсССсаС саддаааада сааасссСсС даС£сСддсс ссССсаасСС дадаадсааС 1081 дадсссаСаС аССсааасаа дСаСдддаас ССссаСдааа СсасСссада СадааасссС 1141 саадССсадд аСГСдааСаС сСсСсСсасс ЪаЪаСааааа ССаасдаддд адсСССдг.Сд 1201 ТТдссасасС аСаасСсааа ддссаСаСаС дСадСсдСдд ССдаСдаадд адааддааас 1261 саСдаасЪдд СаддСаССсд адаСсаасаа сдасаасаад аСдадсаада ададааадад 1321 даадаадСда СааддСаСад ЬдсТадаССа СсадааддСд асаСССССдС ааСЪссадса 1381 ддССаСссаа СССссаСсаа СдсССссСса ааСсССсдсС СдсССддаСС СддсаСсааС 1441 дскдаидааа ассададдаа СССссСсдса ддССсСааад асааСдСдаС ааддсадССа 1501 даСададсад СдааСдадсС сасаСЪсссС ддССсСдсСд аадаСаССда дадаССааСс 1561 ааааассаас аасадСсССа сСССдсаааС ддСсадссСс аасаасааса асаасаасаа 1621 адСдадаадд адддааддсд Сддаадаадд ддССсаСсСс ИссаИИд адсасССССС 1681 асСаадсСдС СГТаааадсС асСаСсаСдС аададсСсаС адСдадсСас СдададааСа 1741 аСаааасСаа адССддассС ССдСасСааС ааСдССааСа аааааааааа а

Фиг. 1

1 сдСадасааа ддаасссгха СсасССсадс £с£сааада£ £ссааас£сЬ ТСасааааа!:

61 аддааСддса аааСссдСдС дсСсдададд СССдассааа даассааСад асССдадааС

121 сСссаааасС ассдсаССдС СдадССссаа СсаааассСа асасСсСсаС СсСсссСааа

181 сасСсСдаСд сСдасСасдС ссСсдССдСа сСсааСддСа дадссасааС сасдаСадСа

241 аасссСдаСа даадасаадс аСаСаассСС дадСаСддсд аЪдсСсСсад ааСсссадсС

301 ддсСсаасСС саЬаЬаСссС СаасссддаС дасаассада адсМададС адГсаадс£с

361 дсааСассса СсаасааСсс СддсСасССС СаСдаСГСсС аСссаСсдад ЪасСааадас

421 саасааСссС асССсадСдд сССсадсадд аасасСССад аддссассСС сааСасСсдС

481 СаСдаадада СасаааддаС СаССССаддд ааСдаддаС

Фиг. 2