EA029504B1

EA029504B1 - Способ индуцирования иммунного ответа против филовирусного антигена у пациента с использованием аденовирусов серотипа 26 и серотипа 35

Info

Publication number: EA029504B1
Application number: EA201390866A
Authority: EA
Inventors: Нэнси Дж. Салливан; Гари Дж. Нейбел; Клемент Асиеду; Чэн Чэн; Мария Грация Пау; Яап Гоудсмит
Original assignee: Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В.
Priority date: 2010-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2018-04-30
Also published as: US9701718B2; EA201390866A1; KR20140019304A; JP2017048207A; JP6054876B2; US20140017278A1; PL2655604T3; BR112013014712A2; KR101879892B1; CA2821289A1; AU2011343798B2; AU2011343798A1; JP2014503206A; ES2676196T3; CA2821289C; ZA201304260B; CN103370411A; CN103370411B; EP2655604B1; EP2655604A4

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против филовирусного антигена у пациента с использованием рекомбинантных аденовирусных векторов (серотипа 26 и серотипа 35), кодирующих филовирусные антигены.

Description

изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа против филовирусного антигена у пациента с использованием рекомбинантных аденовирусных векторов (серотипа 26 и серотипа 35), кодирующих филовирусные антигены.

029504

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к аденовирусным векторам, используемым для индуцирования протективного иммунитета против филовирусной инфекции.

Предшествующий уровень техники

Дефектные по репликации аденовирусные векторы (гАй) являются сильными индукторами иммунных ответов, а поэтому они могут служить ценными векторами для получения генных вакцин, в частности вакцин против лентивирусов и филовирусов, а также против других невирусных патогенов (§Ыуег, е! а1., (2002) ЫаЫге 415(6869): 331-5; (НШ, е! а1., Нит Уассш 6(1): 78-83; 8иШуаи, е! а1., (2000) ХаПие 408(6812): 605-9; 8иШуаи е! а1., (2003) Ыа1иге 424(6949): 681-4; 8иШуаи, е! а1., (2006) РЬо§ Мей 3(6): е177; Кайокеую, е! а1., (2007); §аи!га, е! а1., (2009) Уассте 27(42): 5837-45). Вакцины на основе аденовирусов имеют несколько преимуществ с точки зрения их введения человеку, так как эти вакцины могут быть продуцированы с высокими титрами в соответствии с условиями СМР, и было показано, что они безопасны и являются иммуногенными для человека (АктиШ, е! а1., 1 1пГес1 Όίκ 201(1): 132-41; КлЪиика, е! а1., 1 1пГес! Όίκ 201(4): 600-7; Коир, е! а1., РЬо§ Опе 5(2): е9015.; Саит/аго, е! а1., (2006) 1 1пГес! Όίκ 194(12): 1638-49; Нагго, е! а1., (2009) СПп Уассте 1ттипо1 16(9): 1285-92). Хотя большинство первичных разработок вакцин проводили с использованием гАй5, что обусловлено их высокой активностью вырабатывать антитела широкого спектра действия и СЭ8⁺-Т-клеточные ответы, однако эффективность такой вакцины может быть ограничена уже существующим у человека иммунитетом к гАй5 (Са1ап/аго. (2006); СНепд. е! а1., (2007) РоЬ§ Ра!Нод 3(2): е25; МсСоу, е! а1., (2007) 1. Уио1 81 (12): 6594-604; ВисЬЪшаег, е! а1., (2008) Ьапсе! 372(9653): 1881-93). Это свойство может служить ограничением для клинического применения гЛб5 во многих вакцинах, которые разрабатываются в настоящее время, включая вакцины против вируса Эбола (ЕВОУ) и вируса Марбург (МАКУ).

В настоящее время, для решения проблемы, связанной с уже существующим у индивидуума иммунитетом к гАй5, было проведено исследование нескольких альтернативных векторов. Такими векторами являются аденовирусные векторы, происходящие от редких человеческих серотипов, и векторы, происходящие от других животных, таких как шимпанзе (Уоде1к, е! а1., (2003) 1. Упо1. 77(15): 8263-71; АЪЪшк, е! а1., (2007) 1. Упо1. 81: 4654-63; §ап!га, (2009)). В настоящее время проводится все больше исследований по использованию аденовирусных векторов, происходящих от животных, хотя человеческие аденовирусы имеют то преимущество, что они имеют хорошо охарактеризованные биологические функции и тропизм в отношении человеческих клеток, а также подтвержденные документально хорошие технологические свойства (Уоде1к, е! а1., (2007) 1. Сеп. У1го1. 88 (Р! 11): 2915-24). Иммуногенность этих векторов и их активность как вакцин были продемонстрированы на животных-моделях, главным образом, путем их "прайм-буст"-вакцинации комбинацией с гетерологичными векторами (АЪЫик, е! а1., 2007; §Но!! е! а1., (2008) Уассте 26: 2818-23).

Частота встречаемости серотипов аденовирусов зависит от группы индивидуумов (Мак!, е! а1., (2010) Уассше 28(4): 950-7), и у большой группы из 51 человека, протестированных на аденовирусы в 6 географических регионах, в сыворотке реже всего нейтрализовались аденовирусы АЙ35 и АЙ11 (Уоде1к е! а1., 2003). Было показано, что вакцины на основе гАй35 являются иммуногенными у мышей, у приматов, не являющихся человеком, и у человека, и их использование помогло бы решить проблемы, связанные с иммунитетом к Ай5 (ВагоисН, е! а1., (2004) 1. 1ттипо1. 172(10): 6290-7; Хапйа, е! а1., (2005) 1. Упо1. 79(22): 14161-8; ОрНогк!, е! а1., (2006) 1пГес! 1ттип 74(1): 313-20; ТЬотег, е! а1., (2006) 1. У1го1 80(24): 12009-16; КоШгдце/, е! а1., (2009) Уассте 27(44): 6226-33). Векторы гАй35 реплицируются до высоких титров на клеточных линиях, подходящих для продуцирования клинически эффективных вакцин (Науепда, е! а1., (2006) 1. Сеп. Упо1. 87 (Р! 8): 2135-43), и эти вакцины были получены в виде препаратов для инъекций, а также в виде стабильного порошка для ингаляции (Лп, е! а1., Уассше 28(27): 4369-75). Эти векторы способны эффективно встраиваться в человеческие дендритные клетки (йе Сгцу1, е! а1., (2006) 1. 1ттипо1 177(4): 2208-15; Боге, е! а1., (2007) 1. 1ттипо1. 179(3): 1721-9), и поэтому они способны опосредовать доставку и презентацию антигена на высоком уровне. АЙ26 подгруппы Ό представляет собой другой аденовирус, выбранный исходя из его способности "ускользать" от "иммунного надзора", обеспечиваемого уже существующим иммунитетом к Ай5. Хотя доминирование серотипа АЙ26 может быть значительным у некоторой группы взрослого населения, однако, титры Ай26-нейтрализующих антител остаются на заметно более низком уровне, чем титры Ай5-нейтрализующих антител (АЪЫик е! а1., 2007; Мак!, е! а1., 2010). Исследования показали, что гАй26 может реплицироваться до высоких титров в Ай5 Е1-комплементирующих клеточных линиях, подходящих для продуцирования этих векторов в широком масштабе и на клинически эффективном уровне (АЪЪшк, е! а1., 2007), и было показано, что этот вектор индуцирует гуморальные и клеточно-опосредуемые иммунные ответы в стратегии вакцинации методом "прайм-буст" (АЪЪшк, е! а1., 2007; Ьш, е! а1. (2009) ЫаЫге 457(7225): 87-91).

Краткое описание сущности изобретения

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того факта, что векторы гАй35 и гАй26, после их введения по отдельности, а также в виде гетерологичных комбинаций типа "прайм-буст", вырабатывают протективные иммунные ответы против филовирусной инфекции.

Таким образом, настоящее изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа

- 1 029504

против филовирусного антигена у пациента. Эти способы включают введение пациенту иммунологически эффективного количества аденовирусного вектора согласно изобретению. Обычно аденовирусный вектор вводят внутримышечно.

В некоторых вариантах изобретения векторы вводят путем первичной вакцинации, а затем вторичной вакцинации. Так, например, сначала может быть введен аденовирусный вектор, содержащий капсидный белок аденовируса 26, а затем может быть введен аденовирусный вектор, содержащий капсидный белок аденовируса 35.

Определения

Термин "капсидный белок аденовируса" означает белок, который присутствует на капсиде аденовируса (например, Л626 или ЛД35) и который определяет серотип и/или тропизм конкретного аденовируса. Аденовирусными капсидными белками обычно являются фибриллярные белки, пентон и/или гексон. Используемый здесь термин "капсидный белок ЛД26" или "капсидный белок ЛД35" может, например, означать химерный капсидный белок, который включает по меньшей мере часть капсидного белка ЛД26 или ЛД35. В некоторых вариантах изобретения капсидный белок представляет собой полноразмерный капсидный белок ЛД26 или ЛД35. В некоторых вариантах изобретения гексон, пентон и фибриллярный белок являются компонентами вируса ЛД26 или ЛД35.

Используемые здесь термины "адъювант" и "иммунный стимулятор" являются синонимами и означают одно или несколько веществ, которые стимулируют иммунную систему. В контексте настоящего описания адъювант используется для усиления иммунного ответа на аденовирусные векторы согласно изобретению.

Термин "соответствующий ...", если он употребляется по отношению к положениям аминокислотных остатков в последовательностях, относится к соответствующим положениям во множестве последовательностей, которые были подвергнуты оптимальному выравниванию.

Термины "идентичный" или "процент идентичности", если они употребляются по отношению к двум или более последовательностям нуклеиновых кислот или к полипептидным последовательностям (например, аденовирусных капсидных белков согласно изобретению и полинуклеотидов, кодирующих эти белки), относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются идентичными или имеют определенный процент идентичных аминокислотных остатков или нуклеотидов, как было определено путем сравнения и выравнивания на максимальное соответствие и измерено с использованием одного из указанных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки.

"Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты или аденовирусный вектор представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК) или вирус, которые были удалены из их природного окружения. Так, например, для осуществления настоящего изобретения рассматриваются выделенные рекомбинантные молекулы ДНК, содержащиеся в векторе. Другими примерами выделенных молекул ДНК являются рекомбинантные молекулы ДНК, присутствующие в гетерологичных клеткаххозяевах, либо очищенные (частично или почти полностью) молекулы ДНК в растворе. Выделенными молекулами РНК являются ίη νίνο или ίη νίίτο РНК-транскрипты молекул ДНК согласно изобретению. Выделенные молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению также включают молекулы, которые были получены путем синтеза.

Термин "функционально присоединенный" означает, что два или более сегмента ДНК были связаны друг с другом так, чтобы они осуществляли нужную функцию. Так, например, кодирующие последовательности функционально присоединены к промотору в "правильной" рамке считывания так, чтобы транскрипция инициировалась в данном промоторе и осуществлялась по всему (всем) кодирующему(им) сегменту(ам) до терминатора.

"Полинуклеотид" представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный полимер из дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, которые обычно считываются в направлении от 5'до 3'-конца. Полинуклеотиды представляют собой РНК и ДНК, которые могут быть выделены из природных источников и синтезированы ίη νίίτο или получены из комбинаций природных и синтетических молекул. Если этот термин употребляется по отношению к двухцепочечным молекулам, то он относится ко всей последовательности, и, очевидно, что он эквивалентен термину "пары оснований".

"Полипептид" представляет собой полимер, состоящий из аминокислотных остатков, связанных пептидными связями, которые могут быть природными или синтетическими. Полипептиды, состоящие приблизительно из менее чем 50 аминокислотных остатков, определяются общим термином "олигопептиды".

Используемый здесь термин "промотор" понятен специалистам и означает часть гена, содержащего последовательности ДНК, которые связываются с РНК-полимеразой и инициируют транскрипцию функционально присоединенной кодирующей последовательности. Промоторные последовательности обычно присутствуют в 5'-некодирующих областях генов.

"Белок" представляет собой макромолекулу, содержащую одну или более полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводные группы. Углеводы и другие непептидные заместители могут быть присоединены к белку клеткой, в которой этот белок продуци- 2 029504

руется, и могут варьироваться в зависимости от типа клетки. "Белки" определяются здесь по структурам их аминокислотных остовов; причем заместители, такие как углеводные группы, обычно не указываются, но, тем не менее, они могут присутствовать.

Выражение "по существу, идентичный", если оно употребляется по отношению к двум нуклеиновым кислотам или полипептидам согласно изобретению (например, к аденовирусным капсидным белкам или филовирусным антигенам), относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые, при их сравнении и выравнивании на максимальное соответствие, имеют по меньшей мере 60%, более предпочтительно 65%, еще более предпочтительно 70%, еще более предпочтительно 75%, еще более предпочтительно 80%, а наиболее предпочтительно 90-95% идентичных аминокислотных остаток или нуклеотидов, как было измерено с использованием одного из указанных ниже алгоритмов сравнения последовательностей или путем визуальной оценки. По существу, идентичными областями последовательности являются предпочтительно области, имеющие идентичные последовательности длиной по меньшей мере приблизительно в 50 остатков, предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 100 остатков, а наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно в 150 остатков. В наиболее предпочтительном варианте указанные последовательности являются по существу идентичными по всей длине кодирующих областей.

Для сравнения последовательностей, одну последовательность, которая является эталонной, обычно сравнивают с тестируемой последовательностью. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, задают координаты субпоследовательностей и, если это необходимо, назначают параметры программы-алгоритма сравнения последовательностей. Затем по алгоритму сравнения последовательностей вычисляют процент идентичности тестируемой(ых) последовательности(ей) по отношению к сравниваемой последовательности, исходя из установленных параметров программы.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть осуществлено, например, с использованием алгоритма локальной гомологии διηίΐΐι & \Уа1сгтап. Αάν. Αρρί. Ма!й. 2: 482 (1981), алгоритма гомологичного выравнивания №ей1етап & ^ипксй, 1. Μοί. Βίοί. 48: 443 (1970), методом поиска сходства, описанным Реагкоп & Ыртап, Ргос. Ναΐί. Аса4. δα. υδΑ 85: 2444 (1988), методом компьютерной реализации этих алгоритмов (САР, ΒΕδΤΡΙΤ, ΡΑδΤΑ и ΤΡΑδΤΑ ίη 1йе ХУйсопкт Сепейск δοΠ\\4ΐΌ Раскаде, Сепейск Сотри!ег Сгоир, 575 δ^ι^ Ότ., Майкоп, ^Ι), или путем визуальной оценки (в общих чертах, см., Сиггеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Вю1оду, Р.М. ΑикиЬеί е! а1., ейк., СиггеШ Рго!осо1к, а )ош1 νеη!и^е ЬеЫееп Сгеепе РиЬйкЫпд Ακ^α;·^^ 1пс. апй 1ойп \Уйеу & δοηк, 1пс., (1995 δиρρίетеηΐ) (ΑυкиЬе1)).

Примерами алгоритмов, которые являются подходящими для определения процента идентичности последовательностей и сходства последовательностей, являются алгоритмы ΒΕΑδΤ и ΒΕΑδΤ 2.0, описанные в публикации Α1ΐκΠιιι1 е! а1. (1990) ί. Мо1. Β^ί 215: 403-410 и Α1ΐ8θΗ.υβ1 е! а1. (1977) ШПею Ααάκ Кек. 25: 3389-3402 соответственно. Компьютерная программа для осуществления анализов ΒΕΑδΤ является общедоступной и имеется на сайте Национального Центра биотехнологической информации. Этот алгоритм включает идентификацию пар последовательностей с высокими "весовыми" коэффициентами (ЖР) путем определения длины коротких "слов" в запрашиваемой последовательности, которые соответствуют или удовлетворяют некоторым положительным пороговым величинам Т при выравнивании со "словом" той же самой длины в последовательности базы данных. Т означает пороговую "цену" соседнего слова (Α1ΐκΠιιι1 е! а1., см. выше). Эти предварительные наилучшие соответствия соседних слов играют роль "затравки" для начала поиска более длинных ЖР-содержащих слов. Затем "слова" с наилучшими соответствиями удлиняют в каждой последовательности в обоих направлениях до тех пор, пока не повысится кумулятивная "цена" выравнивания. Для нуклеотидных последовательностей кумулятивные "цены" вычисляют с использованием параметров М ("премия" за пару соответствующих остатков; всегда >0) и N ("штраф" за несоответствующие остатки; всегда <0). Для аминокислотных последовательностей при вычислении кумулятивной "цены" используют весовую матрицу. Удлинение слов с наилучшими соответствиями в каждом направлении прекращают, если кумулятивная "цена" выравнивания при данной величине X не доходит до ее максимально достижимого значения; если кумулятивная "цена" доходит до нуля или до значения ниже нуля, что обусловлено аккумуляцией одного или более остатков с отрицательным "весом" по выравниванию; или если достигается конец любой последовательности. Параметры алгоритма ΒΕΑδΤ ^, Т и X определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе ΒΕΑδΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) используются параметры по умолчанию, а именно: длина слова (^)=11, математическое ожидание (Е)=10, М=5, N=-4, и проводится сравнение по обеим цепям. Для аминокислотных последовательностей в программе Β^ΑδΤР используются параметры по умолчанию, а именно длина слова (^)=3, математическое ожидание (Е)=10, и оценочная матрица Β^ΟδυΜ62 (см., НешкокТ& НешкоГГ, Ргос. Νίώ. Αсаά. δе! υδΑ 89: 10915 (1989)).

Помимо вычисления процента идентичности последовательностей, алгоритм ΒΕΑδΤ также включает статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Катйп & Α1!κΛυ1, Ргос. Ν;·ιΐ1. Αсаά. δα. υδΑ 90:5873-5787 (1993)). Одним из критериев сходства, определяемого с помощью алгоритма ΒΕΑδΤ, является наименьшая сумма вероятностей ^(Ν)), которая служит показателем веро- 3 029504

ятности наличия соответствия между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями. Так, например, считается, что нуклеиновая кислота аналогична сравниваемой последовательности, если наименьшая сумма вероятностей при сравнении тестируемой нуклеиновой кислоты со сравниваемой нуклеиновой кислотой составляет приблизительно менее чем 0,1, более предпочтительно приблизительно менее чем 0,01, а наиболее предпочтительно приблизительно менее чем 0,001.

Кроме того, если указано, что две последовательности нуклеиновой кислоты или две полипептидных последовательности являются по существу идентичными, то это означает, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, подвергается иммунологической перекрестной реакции с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, обычно полипептид по существу идентичен второму полипептиду в случае, когда, например, два пептида отличаются друг от друга только консервативными заменами. Кроме того, если указано, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются по существу идентичными, то это означает, что две молекулы гибридизуются друг с другом в жестких условиях, как описано ниже.

Термин "по существу аналогичный", если он употребляется по отношению к капсидным белкам или филовирусным антигенам согласно изобретению, означает, что полипептид содержит последовательность, которая по меньшей мере на 90%, а предпочтительно по меньшей мере на 95% идентична сравниваемой последовательности в окне сравнения в 10-20 аминокислот. Процент идентичности последовательностей определяют путем сравнения двух оптимально выровненных последовательностей в окне сравнения, где часть полинуклеотидой последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (то есть "пробелы") по сравнению со сравниваемой последовательностью (которая не содержит добавлений или делеций) при оптимальном выравнивании двух последовательностей. Процент идентичности вычисляют путем определения числа положений, в которых присутствуют идентичные основания нуклеиновых кислот или аминокислотные остатки в обеих последовательностях, с получением числа соответствующих положений, а затем это число соответствующих положений делят на общее число положений в окне сравнения, и полученный результат умножают на 100, в результате чего получают процент идентичности последовательностей.

Краткое описание графического материала

Фиг. 1. Генетическая классификация аденовирусов и организация векторов. (А) Филогенетическое дерево иллюстрирует родство гексоновых последовательностей аденовирусов. Представлены различные подгруппы А-Р и показаны человеческие аденовирусы серотипов 26 и 35. Это дерево было сконструировано с применением метода присоединения соседних остатков с помощью пакета программ С1и51а1Х (Ьагкш е1 а1., 2007) и построено в виде схемы с помощью пакета программ Рйуйр Рйу1одепу 1пТегепее уегкюп 3.68. Величины доверительных интервалов представлены во внутренних ветвях как процент 1000кратного формирования бустреп-выборок. (В) Схематически представлен геном рекомбинантного вектора Л626 и рекомбинантного вектора Л635. Оба вектора имеют полную делецию Е1 и включают экспрессионный кластер, содержащий ген гликопротеина ЕВОУ, находящийся под контролем промотора СМУ. В областях Е3 были сделаны дополнительные делеции, а соответствующие последовательности Е4 огГ6 были заменены последовательностями Л65 Е4огГ6 для облегчения репликации этих вакцинных векторов на Л65 Е1-комплементирующих клеточных линиях, таких как клетки РЕК.С6®.

Фиг. 2. Иммунные ответы, индуцированные вакциной гЛб35-ОР (с использованием

Лб35В§и.ЕЬо.ОР(2)РЬ;№1), и контрольное инфицирование вирусом ЕВОУ. (А) Количество анти-ЕВОУ ОР 1дО в пробах плазмы, взятых через 3 недели после вакцинации собакоподобных обезьян, не инфицированных Л65 (серые столбцы), и иммунизованных Л65 (черные столбцы), а также вирусом гЛб35-ОР, определяли с помощью ЕЫ§Л. Титры ЕС₉₀ антител определяли как описано в разделе "Методы". (В, С) Частота антиген-специфических СЭ4+- и СЭ8⁺-Т-лимфоцитарных ответов, пронумерованных в субсериях клеток памяти по 1С8 для 1Ь-2 (СЭ4) или ΤΝΡ-α (СЭ8), и проточный цитометрический анализ, проводимый после стимуляции, осуществляемой через 3 недели после МКПК-вакцинации. (Ό) Уровни печеночного фермента ΆδΤ в плазме у гЛб35-ОР-вакцинированных макак (синим, не инфицированные Л65; красным, Лб5-иммунизованные) и у контрольных макак (черным) после контрольного инфицирования 1000 б.о.е. 2ЕВОУ.

Фиг. 3. Дозозависимый ответ на гЛб35-ОР-индуцирование иммунного ответа у макак (с использованием Αб35Вδυ.ЕЬо.ОР(Ζ)Ρ^.\γι и Αά35Вδυ.ЕЬо.ОР(δ/О)Ρ^). (А) Титры ОР-специфичных антител 1дО в анализе ЕЕ-ΙδΑ (ЕС₉₀) в плазме, взятой у макак через 3 недели после вакцинации 10¹⁰ или 10¹¹ вирусных частиц каждого из гАб35-ОР-векторов (Αб35Вδυ.ЕЬо.ОР(Ζ)Ρ^.\γι и Αά35Вδυ.ЕЬо.ОР(δ/О)Ρ^). (В, С) Частота антиген-специфических СЭ4'- и СЭ8⁺-Т-клеточных ответов, оцениваемых методом ΙΤ'δ. как показано на фиг. 2. Серые столбцы, 10¹⁰ вирусных частиц гАб35-ОР; черные столбцы, 10¹¹ вирусных частиц гАб35-ОР. (Ό, Е) Уровни печеночного фермента ΑδΤ в плазме после контрольного заражения 1000 б.о.е. ΖЕВОУ. Синим, 10¹⁰ вирусных частиц гАб35-ОР; красным, 10¹¹ вирусных частиц гАб35-ОР, и черным, контроль.

Фиг. 4. Способность гАб26-ОР-векторов индуцировать вырабатывание антиген-специфического антитела и Т-лимфоцитарных ответов у собакоподобных макак (с использованием Аб26.ЕЬо.ОР^)РЬ.М и

- 4 029504

Ай26.ЕЪо.СР(8/С)ЕЕ.\у1). (А) Титры антител 1дС в ЕБ18А (ЕС₉₀). и (В, С) Частота СР-специфических С'Э4'- и СЭТ-Т-клеточных ответов. (Ό) Показаны уровни печеночных ферментов А8Т в плазме для отдельных собакоподобных макак в двух отдельных исследованиях. В исследовании 1 обезьяны получали дозу вакцины, содержащей либо 10¹⁰, либо 10¹¹ вирусных частиц гАб26 каждого из гАб26-СР-векторов (Ай26.ЕЪо.СР(Х)ЕЕ.\у1 и Ай26.ЕЪо.СР(8/С)ЕЕ.\у1). а в исследовании 2 обезьяны получали дозу 10¹² вирусных частиц каждого из гАб26-СР-векторов (Αά26.ΕϋοΌΡ(Ζ)ΡΕ.νΐ и Ай26.ЕЪо.СР(8/С)РЬ.М).

Фиг. 5. Кривые выживаемости Каплана-Мейера для гАй26-СР-вакцинированных макак (построенные с использованием Ай26.ЕЪо.СР(Х)ЕЕ.\у1 и Ай26.ЕЪо.СР(8/С)РЬ.М). Невакцинированный контроль и животные. вакцинированные гАб26-СР, были инфицированы через четыре недели после вакцинации 1000 б.о.е. ΖΕΒΟV в двух отдельных экспериментах по контрольному заражению. как показано на фиг. 4. Панель А: черными линиями показаны невакцинированные обезьяны. а темно-синими линиями показаны Аб26-вакцинированные обезьяны в указанных дозах. Панель В: одна группа гАб35-вакцинированных обезьян (светло-синим) показана для сравнения активности А626 в дозе 10¹¹ вирусных частиц каждого из гАб26-СР-векторов (Ай26.ЕЪо.СР(Х)ЕЕ.\у1 и Ай26.ЕЪо.СР(8/С)РЬ.М). Панель С: число выживших А65вакцинированных макак (красным) по сравнению с макаками. вакцинированными 10¹² вирусных частиц каждого из гАб26-СР-векторов (Ай26.ЕЪо.СР(Х)ЕЕ.\у1 и Ай26.ЕЪо.СР(8/С)ЕЕ.\у1).

Фиг. 6. Сравнение первичного иммунного ответа и вторичного иммунного ответа после гАб26СР/гАб35-СР-вакцинации (с использованием Ай26.ЕЪо.СР(Х)ЕЕ.\у1 и Ай26.ЕЪо.СР(8/С)ЕЕ.\у1. а затем Ай35В5>и.ЕЪо.СР(Х)ЕЕ.\у1 и Аб35В8и.ЕЪо.СР(8/С)РЬ). (А) Количество анти-ЕВОУ СР 1дС в пробах плазмы, взятых через 3 недели после вакцинации собакоподобных макак, не инфицированных А65 (серые столбцы), и иммунизованных АЙ5 (черные столбцы), а также вирусом гАб35-СР, определяли с помощью ЕБ18А. Титры ЕС₉₀ антител определяли, как описано в разделе "Методы". (В, С) Частота антигенспецифических СЭ4'- и СО8⁺-Т-лимфоцитарных ответов, пронумерованных в субсериях клеток памяти по 1С8 для 1Ь-2 (СЭ4) или ΤΝΡ-α (СЭ8). и проточный цитометрический анализ, проводимый после стимуляции, осуществляемой через 3 недели после МКПК-вакцинации. (Ό, Е) Результаты контрольного заражения вирусом ЕВОУ. Уровни печеночного фермента А8Т в плазме (Ό), и кривая выживаемости Каплана-Мейера (Е) для гАб26-СР/гАб35-СР-вакцинированных макак после контрольного заражения 1000 б.о.е. ΖΕВОV (синим, гАб26-СР/гАб35-СР; красным, А65-СР, и черным, невакцинированный контроль).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на обнаружении того факта, что векторы гАб35 и гАб26, после их введения по отдельности, а также в виде гетерологичных комбинаций типа "прайм-буст", вырабатывают протективные иммунные ответы против филовирусной инфекции. В частности, настоящее изобретение было разработано исходя из того неожиданно обнаруженного факта, что гетерологичные комбинации, вводимые методом "прайм-буст" (в частности, путем первичной вакцинации вирусом А626, с последующей вторичной вакцинацией вирусом А635), являются эффективными в вырабатывании протективных иммунных ответов. Такая неожиданно обнаруженная эффективность этих "прайм-буст"-комбинаций не могла быть предсказана до появления настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение относится к рекомбинантным аденовирусным векторам (гАб35 или гАб26), которые экспрессируют филовирусные антигены. Аденовирусные векторы, взятые либо отдельно, либо в виде "прайм-буст"-комбинаций, могут быть приготовлены в виде вакцин и использованы для индуцирования протективного иммунитета к филовирусным инфекциям.

Филовирусные антигены

Вирус Эбола и генетически родственный вирус Марбург представляют собой филовирусы, ассоциирующиеся со вспышками в высокой степени летальной геморрагической лихорадки у человека и приматов в Северной Америке, в Европе и в Африке (Рс1сгь. С.Т с1 а1., ίη: Ρίβΐάδ Уйо1о§у, еЙ8. Ρίβΐάδ, Β.Ν. с1 а1., 1161-1176, РЫ1абе1рЫа, Ырршсой-Кауеп, 1996; Ре1ег8, С.Т е1 а1., 1994 8етш Уио1 5: 147-154). Было определено несколько подтипов этого вируса, в результате чего было установлено, что их генетическая организация имеет сходство, то есть, каждый из этих вирусов содержит семь линейно расположенных генов. У вирусных белков оболочечный гликопротеин существует в двух альтернативных формах, то есть в форме секреторного белка в 50-70 килодальтон (кДа) (§СР) и трансмембранного гликопротеина в 130 кДа (СР), генерируемых РНК, которые, как известно, опосредуют проникновение вируса в клетку (Ре1ег8, О. е1 а1., Р1е1Й8 У1го1оду, еЙ8. Р1е1Й8, Β.Ν. е1 а1., 1161-1176, РЫ1айе1рЫа, Ырршсой-Кауеп, 1996; 8апсНе/. А. е1 а1., 1996 ΡNА8 И8А 93: 3602-3607). Другими продуктами структурного гена являются нуклеопротеин (№), матриксные белки УР24 и УР40, предполагаемые неструктурные белки УР30 и УР35 и вирусная полимераза (см., Ре1ег8, С.Т е1 а1., Р1е1Й8 Уио1о§у, еЙ8. Р1е1Й8, Β.Ν. е1 а1., 1161-1176, РЫ1айе1рЫа, Ырршсой-Кауеп, 1996).

Молекулы нуклеиновой кислоты могут кодировать продукты структурного гена филовируса любого вида. Такими вирусами являются вирусы Эбола пяти видов, а именно, вирус Заир (также обозначаемый здесь ΖΕΒОV), вирус Судан (также обозначаемый здесь 8ЕВОУ), вирус Рестон, вирус Бундибуджио и вирус Кот-д'Ивуар (Берег Слоновой кости). Одним из таких видов является вирус Марбург (также обозначаемый здесь МАКУ).

Конкретный антиген, экспрессируемый в векторах согласно изобретению, не является важным ас- 5 029504

пектом настоящего изобретения. Аденовирусные векторы согласно изобретению могут быть использованы для экспрессии белков, содержащих антигенную детерминанту филовирусных антигенов широкого ряда. В обычном и предпочтительном варианте векторы согласно изобретению включают нуклеиновую кислоту, кодирующую трансмембранную форму вирусного гликопротеина (ОР). В других вариантах изобретения векторы согласно изобретению могут кодировать секреторную форму вирусного гликопротеина (8ОР) или вирусного нуклеопротеина (ΝΡ).

Для специалиста в данной области очевидно, что молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие филовирусный антигенный белок, могут быть модифицированы, например, описанные здесь молекулы нуклеиновой кислоты могут быть мутированы, при условии, что модифицированный экспрессируемый белок будет вырабатывать иммунный ответ против патогена или заболевания. Таким образом, используемый здесь термин "филовирусный антигенный белок" означает белок, который содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту филовирусного белка, описанного выше. Этот термин охватывает филовирусные антигены (то есть генные продукты филовируса), а также рекомбинантные белки, содержащие одну или более филовирусных антигенных детерминант.

В некоторых вариантах изобретения белок может быть мутирован так, чтобы он обладал меньшей токсичностью для клеток (см., например, АО 2006/037038). Настоящее изобретение также включает вакцины, содержащие комбинацию молекул нуклеиновой кислоты. В качестве примеров могут служить, но не ограничиваются ими, молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют ОР, 8ОР и ΝΡ штаммов вирусов Эбола Заир, Судан и Берег Слоновой кости, и которые могут быть объединены в любой комбинации в одной вакцинной композиции.

Аденовирусные векторы

Как указывалось выше, обработка некоторыми аденовирусами приводит к вырабатыванию иммунных ответов против аденовирусов некоторых серотипопов, которые могут влиять на эффективность вакцин, полученных на основе аденовирусов. Настоящее изобретение относится к аденовирусным векторам, содержащим капсидные белки, происходящие от двух редких серотипов: ЛД26 и ЛД35. В типичном варианте вектором является вирус гЛб26 или гЛб35.

Таким образом, векторы согласно изобретению содержат капсидный белок АД26 или Л635 (например, фибриллярный белок, пентон или гексон). Для специалиста в данной области очевидно, что в векторах согласно изобретению необязательно должен присутствовать весь капсидный белок вируса Л626 или Л635. Так, например, в векторах согласно изобретению могут быть использованы химерные капсидные белки, включающие по меньшей мере часть капсидного белка Л626 или Л635. Векторы согласно изобретению могут также содержать капсидные белки, в которых каждый из фибриллярных белков, пентонов и гексонов происходит от различных серотипов, при условии, что по меньшей мере один капсидный белок происходит от Л626 или Л635. В предпочтительных вариантах изобретения каждый из фибриллярных белков, пентонов и гексонов происходит от Л626 или от Л635.

Для специалиста в данной области очевидно, что элементы, происходящие от множества серотипов, могут быть объединены в одном рекомбинантном аденовирусном векторе. Так, например, может быть получен химерный аденовирус, который будет объединять в себе все нужные свойства различных серотипов. Таким образом, в некоторых вариантах изобретения химерный аденовирус согласно изобретению может не вырабатывать иммунный ответ на серотипы Л626 и Л635. и при этом он может обладать такими свойствами, как термостабильность, способность к сборке, способность к заякориванию, высокая продуктивность, переориентированная или улучшенная инфекционность, стабильность ДНК в клеткемишени и т.п.

В некоторых вариантах изобретения рекомбинантный аденовирусный вектор согласно изобретению был получен, в основном или полностью, из Л635 или Л626 (то есть указанным вектором является гЛб35 или гЛб26). В некоторых вариантах изобретения аденовирус является дефектным по репликации, поскольку он содержит, например, делецию в области Е1 генома. Для аденовирусов согласно изобретению, полученных из Л626 или Лб35, обычно Е4-огТ6-кодирующую последовательность аденовируса заменяют последовательностью Е4-ог£6 аденовируса, принадлежащего к подгруппе человеческого вируса С, такого как Л65. Это позволяет таким аденовирусам размножаться в хорошо известных комплементирующих клеточных линиях, которые экспрессируют гены Е1 Л65, таких как, например, клетки 293, клетки РЕК..С6 и т.п. (см., например, Науепда е! а1., 2006, I. Оеп У1го1 87: 2135-43; АО 03/104467). В некоторых вариантах изобретения аденовирусом является человеческий аденовирус серотипа 35, имеющий делецию в области Е1, в которую была клонирована антиген-кодирующая нуклеиновая кислота, и в области Е4 огГ6 Л65. В некоторых вариантах изобретения аденовирусом является человеческий аденовирус серотипа 26, имеющий делецию в области Е1, в которую была клонирована антиген-кодирующая нуклеиновая кислота, и в области Е4 ог£6 Л65. В аденовирусе Л635 обычно сохраняется 3'-конец открытой рамки считывания Е1В55К, например, область в 166 п.н., расположенная непосредственно выше открытой рамки считывания р1Х, или фрагмента, содержащего эту область, такого как 243 п.н.-фрагмент, расположенный непосредственно выше старт-кодона р1Х и помеченный у 5'-конца рестрикционным П8и361-сайтом, поскольку это повышает стабильность аденовируса, что обусловлено частичным сохранением промотора гена р1Х в этой области (см., например, Науепда е! а1., 2006, см. выше; АО 2004/001032).

- 6 029504

Метод получения рекомбинантных аденовирусных векторов хорошо известен специалистам. Получение векторов гЛб26 описано, например, в заявке ЖО 2007/104792 и в публикации АЪЪтк е! а1., (2007) νΐΓοΙ 81(9): 4654-63. Репрезентативные геномные последовательности Л626 имеются в базе данных СепВапк под регистрационным номером ЕР 153474 и в ЗЕС) ΙΌ ΝΟ: 1 заявки ЖО 2007/104792. Получение векторов гАб35 описано, например, в патенте США № 7270811 и в публикации νο^1δ е! а1. (2003) I. VIго1. 77(15): 8263-71. Репрезентативная геномная последовательность А635 имеется в базе данных СепВапк под регистрационным номером АС_000019.

Обычно вектор согласно изобретению получают с использованием нуклеиновой кислоты, содержащей полноразмерный рекомбинантный аденовирусный геном (например, плазмиды, космиды или бакуловирусного вектора). Таким образом, настоящее изобретение также относится к выделенным молекулам нуклеиновой кислоты, которые кодируют аденовирусные векторы согласно изобретению. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению могут присутствовать в форме РНК или в форме ДНК, полученных путем клонирования или продуцированных методами синтеза. ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной.

Аденовирусные векторы согласно изобретению обычно являются дефектными по репликации. В этих вариантах вирус становится дефектным по репликации в результате делеции или инактивации областей, играющих важную роль в репликации вируса, таких как область Е1. Такие области могут быть, в основном, делетированы или инактивированы, например, путем встраивания представляющего интерес гена (обычно присоединенного к промотору). В некоторых вариантах изобретения векторы согласно изобретению могут содержать делеции в других областях, таких как области Е2, Е3 или Е4, или инсерции гетерологичных генов, присоединенных к промотору. В случае Е2- и/или Е4-мутированных аденовирусов, для получения рекомбинантных аденовирусов обычно используют Е2- и/или Е4-комплементирующие клеточные линии. Мутации в области Е3 аденовируса необязательно должны быть комплементированы клеточной линией, поскольку Е3 не является необходимой для репликации.

Для продуцирования достаточного количества аденовирусных векторов согласно изобретению обычно используют упаковывающую клеточную линию. Упаковывающая клетка представляет собой клетку, содержащую гены, которые были делетированы или инактивированы в дефектном по репликации векторе, что позволяет вирусу реплицироваться в клетке. Подходящими клеточными линиями являются, например, РЕК.С6, 911, 293 и Е1 А549.

Как указывалось выше, в векторах согласно изобретению могут экспрессироваться филовирусные антигенные белки широкого ряда. При необходимости, гетерологичный ген, кодирующий филовирусный антигенный белок, может быть оптимизирован по кодонам для гарантии "правильной" экспрессии у хозяина (например, у человека), которому был введен этот ген. Оптимизация по кодонам представляет собой технологию, широко применяемую специалистами. Обычно гетерологичный ген клонируют в области Е1 и/или в области Е3 аденовирусного генома.

Гетерологичный филовирусный ген может находиться под контролем аденовирусного промотора (то есть, функционально присоединен к этому промотору, например, к главному позднему промотору) или под контролем гетерологичного промотора. Примерами подходящих гетерологичных промоторов являются промотор ΟΜν и промотор Κ3ν. Предпочтительно, чтобы такой промотор был расположен выше представляющего интерес гетерологичного гена в экспрессионном кластере.

Как указывалось выше, аденовирусные векторы согласно изобретению могут содержать филовирусные антигены широкого ряда, известные специалистам. Репрезентативные векторы согласно изобретению систематизированы в табл. 1.

Таблица 1

Название вектора	Номер УК6 источника плазмиды для вставки	Последовательность вставки	Описание

Αά5.ЕЬо.6Р(Ζ )ЕЬ.мЬ	6001	ЗЕО Ю ΝΟ: 1	Гликопротеин (6Р) вируса ΖΕΒΟν дикого типа
Αά5.ЕЬо.6Р(3/6) ЕЬ. мЬ	6610	ЗЕО Ю ΝΟ: 3	Гликопротеин (6Р) вируса ЗЕВОУ дикого типа

- 7 029504

АЬ5.Маг.6Р (А) ЕЬ	6712	ЗЕО Ю ΝΟ: 4	Оптимизированный по кодону вирус МАКУ «Ангола»

Αά26.ЕЬо.6Р(Ζ)ЕЬ.мЬ	6001	5Е0 Ю ΝΟ: 1	Гликопротеин (6Р) вируса ΖΕΒΟν дикого типа
Αά26.ЕЬо.6Р(5/6)ЕЬ. мЬ	6610	5Е0 Ю N0: 3	Гликопротеин (6Р) вируса ЗЕВОУ дикого типа
АЬ26.Маг.6Р (А) ЕЬ	6712	ЗЕО Ιϋ ΝΟ: 4	Оптимизированный по кодону вирус МАКУ «Ангола»

Αά35Β5υ.ЕЬо.6Р(Ζ ) ЕЬ .мЬ	6001	5Е0 Ю ΝΟ: 1	Гликопротеин (6Р) вируса ΖΕΒΟν дикого типа
АЬ35В5и.ЕЬо.6Р(5/6) ЕЬ	6611	5Е0 Ю N0: 2	Оптимизированный по кодону 6Р вирус ЗЕВОУ
АЬ35В5и.Маг.6Р(А)ЕЬ	6712	5Е0 Ю N0: 4	Оптимизированный по кодону вирус МАКУ «Ангола»

Иммуногенные композиции

Очищенные или частично очищенные аденовирусные векторы согласно изобретению могут быть приготовлены в виде вакцины (также называемой "иммуногенной композицией") методами, хорошо известными специалистам. Такие композиции могут включать адъюванты для усиления иммунных ответов. Оптимальные отношения каждого компонента в указанной композиции могут быть определены методами, хорошо известными специалистам.

Методы получения и применения иммуногенных композиций хорошо известны специалистам. Жидкие фармацевтические композиции обычно включают жидкий носитель, такой как вода, нефтяные фракции, масла животного происхождения или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть также включены физиологический раствор, раствор декстрозы или другого сахарида, или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Такие композиции могут быть использованы для одного введения или для серии введений. В случае серии введений, вакцинации, проводимые после первого введения (первичной вакцинации), усиливают иммунный ответ и обычно называются бустер-вакцинациями. Композиции согласно изобретению могут быть использованы в виде бустер-композиций, примированных антигеном с использованием любого из ряда различных примирующих композиций или в виде композиции для первичной вакцинации. Таким образом, в одном из своих аспектов настоящее изобретение относится к способу первичной иммунизации и/или бустер-иммунизации для усиления иммунного ответа на данный антиген у индивидуума. Так, например, в некоторых предпочтительных вариантах изобретения, после первичного введения одного аденовирусного вектора согласно изобретению (например, гЛб26) проводят бустер-иммунизацию вторым аденовирусным вектором (например, гЛ435).

Схемы введения бустер-композиций хорошо известны специалистам. Бустер-композиции обычно вводят через несколько недель или месяцев после первичного введения композиции, например, приблизительно через 2-3 недели, или 4 недели, или 8 недель, или 16 недель, или 20 недель, или 24 недель, или 28 недель, или 32 недели или через один или два года.

Композиции согласно изобретению могут содержать и другие филовирусные антигены, либо первичная или бустер-иммунизация может быть проведена с использованием других антигенов. Другие антигены, используемые в комбинации с аденовирусными векторами согласно изобретению, не играют важной роли в осуществлении настоящего изобретения, и такими антигенами могут быть, например, филовирусные антигены, нуклеиновые кислоты, экспрессирующие эти антигены, вирусоподобные частицы (УЬР), или известны вирусные векторы. Такими вирусными векторами являются, например, другие аденовирусные векторы; векторы на основе вируса коровьей оспы; векторы на основе вируса оспы птиц, такого как вирус оспы домашней птицы или вирус оспы канареек; векторы на основе герпесвируса; векторы на основе вируса везикулярного стоматита или альфавирусные векторы. Специалистам в данной области известно, что иммуногенные композиции согласно изобретению могут содержать множество антигенов и векторов.

- 8 029504

Антигены в соответствующих примирующих и бустер-композициях (обычно используется много бустер-композиций) необязательно должны быть идентичными, но они должны иметь общие антигенные детерминанты.

Как указывалось выше, иммуногенные композиции согласно изобретению могут содержать адъюванты. Адъюванты, подходящие для совместного введения в соответствии с настоящим изобретением, должны быть потенциально безопасными, должны хорошо переноситься пациентом и должны быть эффективными для пациентов, и такими адъювантами являются 08-21. ОсЮх-РС. МРЬ-δΕ, МоСМ-С8Р, ТйегМах-С, СКЬ-1005, СЕКВИ, ТЕК-амид, Р8С97В, Аф)итег, РС-026, С8К-1, СсМАР, В-алетин, МРС026, Афиуах, СрС ΟΌΝ, бетафектин, квасцы и МР59.

Другими адъювантами, которые могут быть введены, являются лектины, факторы роста, цитокины и лимфокины, такие как альфа-интерферон, гамма-интерферон, тромбоцитарные факторы роста (РЭСР), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (дС8Р), гранулоцитарный-макрофагальный колониестимулирующий фактор (дМС8Р), фактор некроза опухоли (ΊΝΡ), эпидермальный фактор роста (ЕСР), 1Ь-1, 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-10 и 1Ь-12 или кодирующие их нуклеиновые кислоты.

Как указывалось выше, композиции согласно изобретению могут содержать фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель, буфер, стабилизатор или другие вещества, хорошо известные специалистам. Такие вещества должны быть нетоксичными и не должны негативно влиять на эффективность активного ингредиента. Конкретный тип носителя или другого вещества может зависеть от способа введения, которым может быть, например, пероральное введение, внутривенное введение, кожное или подкожное введение, введение в слизистую (например, в кишку), интраназальное введение, внутримышечное введение или внутрибрюшинное введение. Типичным введением является внутримышечное введение.

Внутримышечное введение иммуногенных композиций может быть осуществлено иглой для инъекций суспензии аденовирусного вектора. Альтернативой может служить безыгольное устройство для инъекции композиции (с использованием, например, В1о)ес1ог(ТМ)) или лиофилизованного порошка, содержащего вакцину.

Аденовирусный вектор для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в участок поражения может быть приготовлен в форме парентерально приемлемого водного раствора, который является апирогенным и имеет подходящий рН, а также подходящую изотоничность и стабильность. Специалист в данной области может легко получить подходящие растворы с использованием, например, изотонических носителей, таких как раствор хлорида натрия для инъекции, раствор Рингера для инъекции, лактатсодержащий раствор Рингера для инъекции. При необходимости могут быть включены консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Может быть также использована композиция с пролонгированным высвобождением.

Обычно введение осуществляют в профилактических целях для вырабатывания иммунного ответа против филовирусного антигена до инфицирования или развития симптомов заболевания. Заболеваниями и расстройствами, которые могут быть подвергнуты лечению или которые могут быть устранены в соответствии с настоящим изобретением, являются заболевания и расстройства, в которых иммунный ответ может играть протективную или терапевтическую роль. В других вариантах изобретения аденовирусные векторы могут быть введены для профилактики после иммунизации.

Иммуногенные композиции, содержащие аденовирусные векторы, вводят индивидууму для вырабатывания иммунного ответа против филовируса у индивидуума. Количество композиции, достаточное для индуцирования детектируемого иммунного ответа, определяют как "иммунологически эффективную дозу". Как описано ниже, иммуногенные композиции согласно изобретению индуцируют гуморальный, а также клеточно-опосредуемый иммунный ответ. В типичном варианте иммунным ответом является протективный иммунный ответ.

Фактически вводимое количество и частота и время введения зависят от природы и тяжести заболевания, подвергаемого лечению. Назначение лечения, например, выбор дозы, находится в компетенции врачей общей практики и других медиков, или ветеринарных врачей, и обычно зависит от расстройства, подвергаемого лечению, состояния здоровья конкретного пациента, участка введения, способа введения и других факторов, известных практическим врачам. Примеры вышеупомянутых способов и протоколов введения можно найти в руководстве РеннпдЮп'х Рйагтасеибса1 8с1епсе5, 16'¹' ебйюп, Οδοί, А. еб., 1980.

После получения аденовирусных векторов и, необязательно, препаратов таких частиц в виде композиций, аденовирусные векторы могут быть введены индивидууму, а в частности, человеку или примату другого вида. Аденовирусные векторы могут быть введены человеку или другому млекопитающему, такому как, например, мышь, крыса, хомячок, морская свинка, кролик, овца, коза, свинья, лошадь, корова, осел, обезьяна, собака или кошка. Доставка млекопитающему, не являющемуся человеком, необязательно, должна проводиться в терапевтических целях, то есть, она может быть осуществлена в экспериментальных целях, например, для исследования механизмов иммунных ответов на аденовирусный вектор.

В одной репрезентативной схеме введения аденовирусный вектор вводят (например, внутримышечно) в дозе, составляющей приблизительно в пределах от 100 мкл до 10 мл физиологического раствора, содержащего концентрации приблизительно 10⁴-10¹² вирусных частиц/мл. Обычно аденовирусный

- 9 029504

вектор вводят человеку в количестве приблизительно 10⁹-10¹² вирусных частиц (в.ч.), а обычно приблизительно 10¹⁰-10¹² в.ч. за одно введение. После первичной вакцинации может быть осуществлена бустервакцинация, как описано выше. При необходимости композиция может находиться в наборе, в упаковке или в раздаточном устройстве, которые могут содержать одну или более унифицированных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Так, например, набор может содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Набор, упаковка или раздаточное устройство могут быть снабжены инструкциями по введению.

Композиции согласно изобретению могут быть введены отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами для лечения, вводимыми либо одновременно, либо последовательно в зависимости от состояния, подвергаемого лечению.

Примеры

Нижеследующие примеры приводятся в целях иллюстрации и не ограничивают объема заявленного изобретения.

При оптимизации схем иммунизации должны быть учтены конкретные преимущества иммунизации с введением однократной дозы или "прайм-буст"-иммунизации, в зависимости от необходимости достижения немедленного или длительного иммунитета. Вспышки заболеваний, вызываемых вирусом ЕВОУ и другими филовирусами, могут происходить внезапно и быстро распространяются на другие группы населения, проживающие в регионах, в которых отсутствуют медицинские учреждения. Так, например, в таких случаях могут оказаться желательными схемы вакцинации с вырабатыванием кратковременного иммунного ответа. По этой причине вакцинация с введением однократной дозы гАб5-векторов, содержащих гены гликопротеина (ОР) ЕВОУ и нуклеопротеина (ΝΡ) ЕВОУ, была проведена на приматах, не являющихся человеком (ЗиШуап, с( а1., 2006). Было показано, что такие вакцины индуцируют сильные иммунные ответы в течение одного месяца (ЗиШуап, с( а1., 2003), что, вероятно, обусловлено высокими уровнями экспрессии вставок и тропизмом Аб5 по отношению к дендритным клеткам. С другой стороны, для вырабатывания длительного протективного иммунитета, может потребоваться схема "прайм-буст"вакцинации, включающая две или более вакцинации, которые могут индуцировать длительную Тклеточную память. Поэтому авторами настоящего изобретения была разработана серия экспериментов в целях тестирования иммуногенности и активности для одной инокуляции и для "прайм-буст"комбинаций с использованием векторов гАб35 и гАб26, и результаты этих исследований представлены в настоящей заявке.

Материалы и методы

Получение вакцин на основе гАб вируса Эбола. Е1/Е3-делетированные вакцинные векторы, сконструированные на основе гАб26 и гАб35 с низким доминированием серотипа, и экспрессирующие ОР ЕВОУ, были размножены и очищены, как описано ранее (АЪЪшк, с( а1., 2007). Аб5-вектор, не экспрессирующий ОР ЕВОУ, был сконструирован, размножен и очищен тем же самым методом, а затем использован для вырабатывания иммунитета к Аб5 у отобранных животных, как описано в каждом эксперименте. Вставки ОР ЕВОУ, охватывающие открытые рамки считывания штаммов Заир (ЗЕО ГО N3: 1) и Судан/Гулу (ЗЕО ГО NО: 2), клонировали под транскрипционным контролем промотора человеческого СМУ, и последовательность полиаденилировани ЗУ-40 встраивали в плазмиду, содержащую левую часть генома Аб, включая левую ΙΤΚ и сигнал упаковки. После котрансфекции этой плазмиды с космидой, содержащей остальную часть последовательности Лб (Е3-делетированную), в клетки РЕК.С6® получали Е1/Е3-делетированный и дефектный по репликации рекомбинантный вакцинный вектор на основе Аб26 или Аб35. Для облегчения репликации гАб26- и гАб35-векторов в клетках РЕК.С6®, нативные области Е4 огГ6 заменяли последовательностью Аб5 Е4огГ6 (Науепда, с( а1., 2006). гАб-вирусы очищали методом бляшек, и одну бляшку каждого вируса размножали до продуцирования вируса в масштабе приблизительно 2,4 л. Для очистки векторов гАб ЕВОУ проводили двухстадийное ультрацентрифугирование в градиенте хлорида цезия. Очищенные гАб ЕВОУ-вакцины хранили в виде аликвот для одноразового применения при температуре ниже -65°С. Титры вирусных частиц определяли путем измерения оптической плотности при 260 нм (Ма1/е1. е( а1., 1968, УиШоду 36 (1): 115-25). Инфекционность оценивали по ТСГО50 с использованием клеток 911 (Ра11аих, е( а1., (1996) Нит. Оепе ТЬег. 7 (2): 215-22). Опосредуемую аденовирусом экспрессию ОР ЕВОУ оценивали путем инфицирования клеток А549 с последующей оценкой культуральных лизатов с помощью вестерн-блот-анализа. Идентичность очищенных векторов подтверждали с помощью ПЦР, а полноразмерные трансгенные области, включая фланкирующие последовательности, оценивали методом секвенирования ДНК.

Филогенетический анализ. Филогенетическое дерево конструировали с использованием полноразмерных аминокислотных последовательностей гексона аденовируса. Аминокислотные последовательности выравнивали с использованием программы С1и8(а1 X (Ьаткт, е( а1. (2007) ВюШоттабск 23(21): 29478), а затем строили филогенетическое дерево с применением метода присоединения соседних остатков С1и81а1 X, и проводили бустреп-тест построенного дерева путем 1000-кратного формирования выборки. Это дерево визуализировали и строили схему с использованием программы ПтаМтее из пакета программ РЬуЬр РЬу1одепу 1пГегепсе версии 3.68.

- 10 029504

Исследования по контрольному заражению животных и испытания на безопасность. Эксперименты на животных проводили при полном соблюдении всех соответствующих Федеральных руководств и правил, утвержденных Национальным Институтом здравоохранения (ΝΙΗ). Для всех исследований использовали собакоподобных макак (Масаса ГаксюЫапк) в возрасте 3-5 лет и массой 2-3 кг, полученных от Соуаисе. Обезьяны содержались в отдельном помещении и регулярно получали корм в соответствии с рекомендациями Комитета по уходу и использованию лабораторных животных (ΌΗΕ\ν номер по ΝΙΗ 8623). Перед взятием проб крови или вакцинацией животных анестезировали кетамином. В этом исследовании каждая вакцинируемая группа содержала три собакоподобные макаки, а каждая контрольная группа содержала одну собакоподобную макаку. Через четыре недели после ΕΒΟν-вакцинации, животных переносили в лабораторию с соблюдением максимальных мер предосторожности (В§Ь-4) в целях инфицирования нужной дозой в 1000 б.о.е. вируса ΕΒΟν Заир, вводимой внутримышечно в хвостовую часть бедра. Штамм ΖΕΒΟν для контрольного заражения брали от умершего человека после вспышки инфекции в 1995 году в бывшем Заире. Животные оставались в лаборатории до окончания исследования. Обезьяны, находящиеся в лаборатории В§Ь-4, получали корм и подвергались мониторингу минимум один раз в день.

Исследования на животных, проводимые в биокамере В§Ь-4 при υδΆΜΚΙΙΟ, были разрешены Комитетом по уходу и использованию животных при институте υδΆΜΚΙΙΟ. Исследования на животных проводили в соответствии с законом о надлежащем уходе за животными и в соответствии с другими Федеральными правилами и положениями по использованию животных и в соответствии с нормами проведения экспериментов на животных, а также в соответствии с утвержденными правилами законодательства, утвержденного комитетом по уходу и использованию лабораторных животных, Ошйе Гог !йе Саге апй и§е оГ ЬаЬота1оту АштаЛ, №-10опа1 Кекеатсй Соипсй, 1996. Используемое оборудование полностью утверждено ассоциацией по проведению анализов и международной комиссией по аккредитации специалистов по уходу за лабораторными животными.

Иммунизация животных. Животным в билатеральную дельтовидную мышцу иглой и шприцем вводили вакцину, содержащую дозу и векторы, определенные для каждого эксперимента. Животных, отобранных для каждого эксперимента, предварительно иммунизировали 10¹¹ б.о.е. "пустого" вектора Ай5 для индуцирования иммунитета к Ай5. У этих животных титры анти-Ай5 антитела определяли с помощью ΕΟδΑ до их ΕΒΟν-вакцинации.

ΕΕΙδΑ-анализ с использованием 1дО против ОР ΕΒΟν. ЕЬКА-планшеты из поливинилхлорида (Бупа1ес1т У1еппа. νΑ, или Шпс. Косйе81ег, ΝΥ) покрывали 100 мкл антигена на лунку и инкубировали при 4°С в течение ночи. Последующие инкубирования проводили при комнатной температуре. Трансмембранный делетированный ОР ΕΒΟν (ΕΒΟν ОРАТМ), полученный методом опосредуемой фосфатом кальция временной трансфекции клеток 293Т, служил в качестве антигена. После покрытия антигеном планшеты шесть раз промывали ΡΒδ, содержащим твин 20. Тестируемую сыворотку серийно разводили до получения 7 концентраций в отношениях 1:50-1:50000 и добавляли в покрытые антигеном лунки в течение 60 мин. Планшеты шесть раз промывали, а затем инкубировали с детектирующим антителом, то есть козьим антителом против человеческих 1дО (Η+Ь; Сйетюоп/МПНроте, Βί1^Γ^ί·ι„ МА), конъюгированным с пероксидазой хрена. Затем в лунки добавляли субстрат дигидрохлорида а-фенилендиамина δίβηκι Рак! Л^та, δΐ^^δ, МО) и определяли оптическую плотность (при 450 нм). В каждом эксперименте брали пробу сыворотки у каждого животного перед вакцинацией. В каждом эксперименте у одного животного, у которого наблюдался 1§О-ответ на ОР известного вируса ΕΒΟν Заир, брали пробу сыворотки, используемую в качестве позитивного контроля. РЕ^А-титры за вычетом фона выражали как ЕС₉₀, то есть как величины, обратные оптической плотности, представляющие собой разведение, при котором наблюдается 90% снижение уровня связывания с антигеном.

Внутриклеточное окрашивание цитокинами. Пробы цельной крови, взятые у собакоподобных макак, подвергали центрифугированию в градиенте плотности фиколла для выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).

Приблизительно 1х10⁶ клеток в 100 мкл среды КРМ1, содержащей 10% термоинактивированную фетальную телячью сыворотку, в течение 6 ч при 37°С стимулировали анти-СБ28 (клон СБ28.2) и антиСБ49й (клон Ь25) антителами (ПБ Β^оδс^еηсеδ), брефелдином-А (Ьщта-АИпск δΐ. Ьошк, МО), и либо ДМСО, либо пулом пептидов, охватывающих открытую рамку считывания полноразмерного ОР вируса ΕΒΟν Заир. Эти пептиды представляли собой 15-меры с перекрывающимися 11 аминокислотами, разведенные в свежем стерильном ДМСО в конечной концентрации 2,5 мкг/мл для каждого пептида. Аликвоту для каждого эквивалентного образца стимулировали δΕΒ, используемым в качестве позитивного контроля. После шестичасовой стимуляции МКПК окрашивали смесью антител против маркеров клеточной дифференцировки (СБ3-Су7-АРС, клон δΡ34-2 (ΒΩ Β^оδс^еηсеδ), СБ4-ОБ605, клон М-Т477 (ΒΩ ΒώδΟепсек), С^8-ТΚΡΕ, клон КРА-Т8, СБ95 Су5-РЕ, клон БХ2 (ΒΩ Β^оδс^епсеδ), СБ45ВА ^^655, клон 5Н3) при комнатной температуре в течение 20 мин. Антитела против СБ45КА ОБ655 и СБ8-ТКРБ конъюгировали в соответствии со стандартизированными протоколами, описанными ранее (Коир е! а1., 2010, Ргйшпд Ептиш/айоп \νί11ι ^NΑ АпдтеШк 1ттиподешсИу оГ КесотЬшап! Айепоуиа! УесЮгк Гог ΒоίЬ

- 11 029504

Н1У-1 8ресШс АпйЬобу апб Т-Се11 Кекропкек. РЬоЗ Опе 5(2): е9015. бог10.1371/)оита1.ропе.0009015). После 2 промывок клетки фиксировали и делали проницаемыми с использованием реагентов СуЮП.\/Су1орегт (ΒΌ Вюкаепсек), а затем окрашивали антителами против цитокинов ΤΝΡα-АРС, клон МАЬ 11 (ΒΌ Вюкаепсек), и 1Ь-2 РЕ, клон МО17Н12 (ΒΌ Вюкаепсек). В целях идентификации живых и погибших клеток использовали краситель νίνίΌ (1пуйгодеп) для оценки жизнеспособности (РегГебо, е1 а1. (2006) I. 1ттипо1. Мебюбк. 313(1-2): 199-208). Пробы пропускали на цитометре Ь8К II (ΒΌ Вюкаепсек) с детектированием до 1000000 сигналов и анализировали с помощью программ Р1о\\бо 9.1 и 8Р1СЕ 5.0 (Тгее 81аг). Позитивные по цитокинам клетки определяли как процент субсерий СИ4+- и СЭ8'-Т-клеток памяти. Субсерии клеток памяти определяли как СО45КА±/СП95+ или СЭ28±/СЭ95+. В последнем случае. для стимуляции. вместо неконъюгированных анти-СИ28 тАЬ использовали анти-СИ28 антитело А1еха488 (клон 28.2, Β^о^едеηб).

Биохимический анализ сыворотки. Для проведения контрольных исследований кровь брали у Ν№ на дни 0, 3, 6, 10, 14 и 28 после инициирования вирусом ΕΒΟν Заир. Общее лейкоцитарное число, лейкоцитарную формулу, эритроцитарное число, тромбоцитарное число, гематокрит, общий гемоглобин, средний объем клеток, средний корпускулярный объем и среднюю корпускулярную концентрацию гемоглобина определяли в пробах крови, собранных в пробирки, содержащие ΕΌΤΑ, на лазерном гематологическом анализаторе (СоиНег Е1ес1гои1ск, Н1а1еай, РЬ, И8А). Пробы сыворотки тестировали на концентрации аспартат-аминотрансферазы (АЗТ) на анализаторе крови Рюсо1о РоиН-ОГ-Саге Е1ооб Апа1у/ег (АЬа\1к, 8иппууа1е, СА, ИЗА).

Детектирование ΕΒΟν. Титрование вирусов осуществляли методом бляшек на клетках Vе^о. Вкратце, возрастающие 10-кратные разведения проб плазмы адсорбировали на монослоях клеток Сего в лунках в дубликатах (0,2 мл на лунку); при этом предел детектирования составлял 25 б.о.е./мл.

Статистика. Сравнение титров анти-СР 1§С в ЕЬ13А и продуцирование внутриклеточных цитокинов субсериями Т-клеток памяти осуществляли с использованием двухстороннего Т-критерия в компьютерной программе СгарЬРаб Рпкт.

Результаты

Филогенетика аденовирусов и конструирование вектора. гАб5-генные вакцины на основе ΕΒΟν продуцировали сильный протективный иммунитет у макак, и в клинических испытаниях, проводимых с участием человека, было подтверждено, что они являются безопасными и иммуногенными (АктиШ, е1 а1.; КлЬиика, е1 а1.; Нагго, е1 а1., 2009). Исследования, проводимые на макаках и с участием человека, показали, что уже существующий регулируемый вектором иммунитет может ограничивать эффективность вакцин на основе вирусных векторов (МсСоу, е1 а1., 2007; ΒисЬЬ^ηбе^, е1 а1., 2008). Поскольку данные по доминированию серотипов дают основание предположить, что у большого числа людей во всем мире наблюдается природное инфицирование вирусом Аб5, то авторами настоящего изобретения была проведена оценка других аденовирусных серотипов на возможность их применения в качестве вакцинных векторов (фиг. 1А). Аденовирусы Аб35 группы В и аденовирусы Аб26 группы И представляют собой генетически сегрегированные группы, происходящие от гАб5 группы С, поэтому авторами настоящего изобретения было высказано предположение, что вакцинные векторы, происходящие от этих серотипов, являются менее чувствительными к иммунитету против Аб5 у приматов. Хотя векторы на основе Аб35 и Аб26 используют рецепторы, отличающиеся от рецепторов, обычно используемых Аб5, тем не менее было продемонстрировано, что у мышей наблюдается эффективная трансдукция происходящих от моноцитов дендритных клеток и их "ускользание" от иммунитета к Аб5. Поэтому СР-вставки вируса ΕΒΟν вида Заир или Судан/Гулу клонировали под транскрипционным контролем человеческого промотора СМУ в область Ε1 векторов гАб35 и гАб26 (фиг. 1В). Геномы обоих векторов были делетированы в генах Ε1 в целях сообщения им дефектности по репликации и снижения вероятности рекомбинации у вакцинированных индивидуумов.

гАб35-вакцинация и индуцирование иммунных ответов у макак

Начальные исследования проводили с использованием одной вакцины на основе вируса ΕΒΟν, кодирующего СР вируса Эбола Заир (ΖΕΒΟν), СР(Х), для оценки способности гАб35-векторов индуцировать иммунные ответы у макак, которые ранее не подвергались инфицированию вирусом Аб5, а также для оценки активности вектора при уже имеющимся иммунитете к Аб5. Каждую из шести собакоподобных макак, а именно, трех макак, которые ранее не были инфицированы Аб5, и трех макак с иммунитетом к Аб5, внутримышечно вакцинировали 10¹⁰ частицами гАб35-СР(Х) (Αб35ΒЗυ.ΕЬо.СР(Ζ)Р^.№ΐ) с помощью иглы для инъекций. Через три недели после вакцинации уровни антигенспецифических антител и Т-клеточных ответов оценивали в пробах периферической крови, взятых у конкретных индивидуумов. Антитела против ΕΒΟν-СР (Ζ), оцененные с помощью РиЗА, были индуцированы у всех индивидуумов, в результате чего была продемонстрирована успешная трансдукция ш νί\Ό клеток-мишеней, опосредуемая гАб35-СР^)-векторами, и эффективная презентация антигена (фиг. 2А). У индивидуумов, которые не были инфицированы Аб5, и у индивидуумов с иммунитетом к Аб5 продуцировались титры сывороточных антител в отношении приблизительно 1:700-1:3000. Уровни этих антител составляют в пределах, которые наблюдались для Аб5-вакцин, содержащих СР^)-вставки, и превышают минималь- 12 029504

ное число (1:500), которое соответствует протективному иммунитету против ЕВОУ-инфекции у Айвакцинированных макак-моделей (ЗиШуаи, 2009). Хотя значимые титры антител были индуцированы во всех вакцинах, однако, ни у одного из индивидуумов титр не превышал пороговой величины (приблизительно 1:3500), что позволяет предсказать 100% защиту после введения макакам вакцинных векторов на основе АЙ5-ОР. Однако интересно отметить, что сравнение титров антител у индивидуумов, которые не были инфицированы Ай5, и индивидуумов с иммунитетом к Ай5 указывало на отсутствие какого-либо значимого различия средних значений титров, продуцируемых у этих групп (1:1600 и 1:1800, соответственно), что позволяет предположить, что гАй35-векторы являются эффективными вакцинами у индивидуумов, которые были предварительно обработаны Ай5.

Клеточные иммунные ответы оценивали путем внутриклеточного окрашивания цитокинами (1С8) на ΤΝΕ-α (СИ8+) или 1Ь-2 (СИ4+) после стимуляции МКПК индивидуума перекрывающимися пептидами, охватывающими открытую рамку считывания ЕВОУ ΟΡ(Ζ). Поверхностное окрашивание лимфоцитов с использованием СИ45КА и СО95 осуществляли для анализа антиген-специфических иммунных ответов в субпопуляциях СИ4+- и СЭ8⁺-Т-клеток памяти (фиг. 2, В-С). Как наблюдалось в анализе на гуморальные ответы, у макак, вакцинированных гАй35-вектором, вырабатывался клеточный иммунный ответ против ЕВОУ-ΟΡ, а иммунный статус Ай5 не влиял на число антиген-специфических Т-клеток. Порядок ранговой величины клеточных ответов в СЭ4+- и СЭ8⁺-лимфоцитах обоих видов у всех индивидуумов был аналогичен гуморальным ответам, хотя число антиген-специфических Т-клеток для одного индивидуума У3 было ниже детектируемых уровней. Предварительные исследования на макаках показали, что вакцинные векторы на основе гАй5 индуцируют СИ8+-Т клетки в количестве, превышающем количество СЭ4'-клеток при клеточном ответе. В настоящем исследовании у гАй35-вакцинированных индивидуумов продуцировались ΟΡ-специфические СИ4+- и СЭ8'-лимфоциты на одинаковых уровнях. Однако, при тестировании относительно небольшого числа индивидуумов, различия, если они существуют, могут быть не выявлены. В целом, полученные результаты показали, что гАй35-ОР является иммуногенным у собакоподобных макак, и что активность вектора в отношении индуцирования антигенспецифических гуморальных ответов и клеточно-опосредуемых иммунных ответов не снижалась у индивидуумов с уже имеющимся иммунитетом к Ай5.

Контрольное инфицирование гАй35-вакцинированных макак вирусом ΖΕΒΟν. Авторами настоящего изобретения был проведен анализ для того, чтобы определить, может ли гАй35-ОР-вакцинация обеспечивать защиту против контрольного заражения высокими дозами вируса ΖΕΒΟν. Через одну неделю после оценки иммунных ответов, описанных выше, шесть гАй35-ОР-вакцинированных собакоподобных макак и одну не вакцинированную собакоподобную макаку обрабатывали 1000 б.о.е. штамма Κίίονίΐ 1995 вируса ΖΕΒΟν путем внутримышечной инъекции. После контрольного заражения регулярно измеряли уровни печеночных ферментов, поскольку увеличение уровней этих маркеров является характерным событием при ЕВОУ-инфицировании у макак. Уровни аспартат-трансаминазы (А8Т) в кровотоке оценивали через каждые 3-4 дня в течение периода острого инфицирования в течение 10-14 дней (фиг. 2Ό), и наконец, в последний день 28-дневного периода исследований (данные не приводятся). Уровни А8Т в плазме сохранялись на базовых уровнях в течение 3 дней после инфицирования у всех индивидуумов, что указывало на нормальное функционирование печени сразу после контрольного инфицирования вирусом ЕВОУ. Через 6 дней после инфицирования вирусом ЕВОУ, у невакцинированного контрольного индивидуума наблюдалось 10-кратное увеличение уровней ферментов, что указывало на острое инфицирование данного индивидуума. В пробах крови, взятых у двух индивидуумов в группе, которая не была инфицирована Ай5/Ай35-вакцинированной группы (У1, У3), также наблюдалось резкое увеличение А8Т, а у третьего индивидуума в этой группе У2 наблюдалось лишь очень незначительное увеличение уровней ферментов в конкретный момент времени, а затем эти уровни возвращались к базовым уровням. Аналогичным образом, у двух из трех индивидуумов группы с иммунитетом к Ай5/гАй3 5-вакцинированной группы (У4, У5) наблюдалось увеличение уровней А8Т, хотя эти уровни были гораздо ниже, чем у невакцинированного контроля, а у одного индивидуума группы У6, такие уровни были нормальными для инфицирования при указанных параметрах. В целом, уровни А8Т у индивидуумов, не инфицированных Ай5, были выше, чем у вакцинированных индивидуумов с иммунитетом к Ай5. Интересно отметить, что у каждого индивидуума, у которого наблюдались нормальные результаты клинических анализов, была обнаружена самая высокая предсенсибилизация и самые высокие антиген-специфические СЭ8⁺-ответы и гуморальные ответы, соответствующие этой вакцинированной группе. Уровни виремии в плазме (фиг. 2Е) подтвердили наличие ЕВОУ-инфекции у всех животных, у которых наблюдались повышенные уровни А8Т.

Результаты этого эксперимента показали, что гАй35 является иммуногенным при его введении в дозе 10¹⁰ частиц на индивидуума. Эта вакцина индуцировала протективные иммунные ответы, но такая доза и схема иммунизации были недостаточно оптимальными для обеспечения постоянной защиты всех индивидуумов. В вакцинированных группах протективный иммунитет ассоциировался с наивысшими значениями антигенспецифических гуморальных ответов и СИ8⁺-Т-клеточных ответов.

Зависимость "доза гАй35-ОР-ответ" влияет на индуцирование протективного иммунитета. Векторы на основе гАй обычно вводили макакам в дозах, составляющих в пределах от 10¹⁰ до 10¹² частиц. Пред- 13 029504

варительные результаты для τΑά5-ΟΡ продемонстрировали, что введение 10¹⁰ вирусных частиц в качестве минимальной дозы позволяет обеспечить 100% защиту собакоподобных макак от ЕВОУ-инфекции (8иШуаи, 2006). Поскольку описанные выше исследования проводили при более низкой дозе, входящей в этот интервал доз, и эта доза не обеспечивала постоянной защиты, то возможно, что минимально низкая экспрессия антигена ίη νίνο достигается с использованием τΑ435-вектора, а не τΑ45-векторов, которые могут давать субоптимальные иммунные ответы. Поэтому авторы настоящего изобретения решили узнать, может ли введение более высокой дозы вакцины вырабатывать более высокий уровень иммунной защиты. В этом эксперименте в эту вакцину был также включен τΑ435, экспрессирующий СР от вируса ЕВОУ Судан (δ/С), для того чтобы сравнить имеющиеся данные об эффективности гЛб35-вакцин с данными τΑ45-вакцин, содержащих СР вируса Судан и Заир. В настоящем исследовании собакоподобных макак (η=3 на группу) вакцинировали 10¹⁰ или 10¹¹ вирусных частиц Α435Β8υ.ΕϋοΌΡ (Ζ) РЕ\\1 и 10¹⁰или 10¹¹ вирусных частиц Αά35Β8υ.Ε6ο.ΟΡ(3/Π)ΡΕ, и иммунные ответы определяли через три недели после вакцинации, проводимой в предыдущем эксперименте.

СР-специфические антитела продуцировались у всех индивидуумов (фиг. 3А), и этот результат был ожидаемым, поскольку доза вакцины была равна дозе, вводимой в предыдущем эксперименте, или превышала эту дозу. Однако, в этом эксперименте, титры у двух индивидуумов, вакцинированных 10¹⁰ частиц (У8, У9), составляли 1:340 и 1:500, соответственно, то есть на уровне, близком или ниже нижнего предела, наблюдаемого ранее у Αά5-СΡ-вакцинированных индивидуумов в эксперименте по предсказанию протективного иммунитета (δυΙΙίναη, с1 а1., 2009). Наблюдаемый максимальный титр антител составлял 1:2900 (индивидуум У10), и этот титр был аналогичен максимальным титрам, наблюдаемым у ^Αά35-вакцинированных индивидуумов, как показано на фиг. 2. Средние титры антител были выше у группы, которой вводили дозу 10¹¹ (1:1500 по сравнению с 1:700), но это различие не было статистически значимым (р=0,02). В группе, которой вводили более низкие дозы, был выявлен один индивидуум, у которого титры антител были близки к пограничным титрам антител, при которых ιΑύ5^Ρ-вакцина сообщала протективный иммунитет (индивидуум У11, 1:540).

С.П4'- и СО8⁺-Т-клеточные ответы наблюдались у обеих дозовых групп через три недели после вакцинации. Какого-либо явного дозозависимого ответа не наблюдалось в случае С.П4'- или СЭ8+-Тклеточных ответов. Поскольку кинетика клеточных иммунных ответов варьировалась у различных индивидуумов, а в частности, у аутбредных животных, и определение ответа не было кумулятивным на протяжении всего определенного периода времени как это наблюдалось в случае антител, то иногда трудно было выявить групповые тенденции в какой-либо момент времени. У каждого индивидуума число антигенспецифических Т-клеток было выше в случае СЭ4⁺-клеток, чем в случае СЭ8⁺-клеток, но при объединении этих результатов с результатами, полученными в первом эксперименте, не было выявлено какойлибо тенденции в отношении доминирования СП4'- или С.П8'-Т-клеток, индуцируемого τΑ435-ΟΡвекторами в этих экспериментах.

Через одну неделю после оценки иммунных ответов, всем шести вакцинированным макакам и одной невакцинированной макаке были внутримышечно инъецированы 1000 б.о.е. ΖΕΒΟν, а затем этих животных оценивали на признаки продуктивной инфекции. Геморрагические манифестации ЕВОУинфекции обычно приводили к появлению пятнисто-паппулярной сыпи на лице и конечностях инфицированных макак; причем у этих животных обычно также наблюдалось снижение потребления пищи и наступало обезвоживание. Самые ранние проявления симптомов у двух невакцинированных индивидуумов наблюдались на 6-й день после ЕВОУ-инфицирования, и у каждого индивидуума наблюдалась полная констелляция всех симптомов на день 7 (данные не приводятся). В табл. 2 представлены результаты контрольного заражения, и указан день гибели невыживших животных в исследованиях с использованием τΑ435. Невакцинированные животные погибали от летального действия инфекции на 9-й и 8-й дни (эксперименты 1 и 2 соответственно). Число вакцинированных индивидуумов было аналогичным числу контрольных невакцинированных индивидуумов, за исключением того, что они погибали в среднем на два дня позже, чем контрольные индивидуумы, что позволяет предположить, что при наблюдаемой общей смертности вакцинация все же может индуцировать частичный иммунный ответ. Число выживших животных было больше только в группе, получавшей τΑ435-ΟΡ(Ζ), по сравнению с группой, получавшей ΟΡ(Ζ) плюс ΟΡ(8/Ο) независимо от дозы вакцины, однако, различия в показателях выживаемости не были значимыми для всех вакцинированных групп в двух контрольных экспериментах.

- 14 029504

Таблица 2

Эксперимент	Индиивидуум, Ю	Вакцинировнная группа	Симптомы	Резудь тат
1	VI	Невакцинированный/ Αά35Β3υ.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ при ΙΟ¹⁰	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день 7
	У2	Невакцинированный/ АЬ35ВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ при 1О¹⁰	анорексия на день б,	Выжил
	УЗ	Невакцинированный/ Αά35Β3υ.ЕЪо.СР(Ζ )ЕЬ. мВ при 1О¹⁰	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день 8
	ν4	Иммунизованный/ АД35ВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ при 1О¹⁰	Сыпь на день 7, анорексия на день б, обезвоживание на день 7	Умер на день 8
	ν5	Иммунизованный/ Αά35Β3υ.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ при 1О¹⁰	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день 7	Умер на день 9
	V 6	ухММу НИа ип а ННЫИ / АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ при 1О¹⁰	анорексия на день б	Выжил
2	ν7	АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ и АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(3/С) ЕЬ, каждая при 1О¹⁰	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день б
	νδ	АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ и АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(3/С) ЕЬ, каждая при 1О¹⁰	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день 9	Умер на день 10
	ν9	АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ и АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(3/С) ЕЬ, каждая при 1О¹⁰	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день б
	VI0	АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ и АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(3/С) ЕЬ, каждая при 10¹¹	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день 7	Умер на день 7
	VII	АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ и АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(3/С) ЕЬ, каждая при 10¹¹	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день 7	Умер на день 7
	νΐ2	АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(Ζ)ЕЬ. мВ и АДЗЬВЗи.ЕЬо.СР(3/С) ЕЬ, каждая при 10¹¹	Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день 8
1	С1		Сыпь на день б, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день 9
2	С2		Сыпь на день 7, анорексия на день б, обезвоживание на день б	Умер на день 8

В целом, исследования, проводимые с использованием гЛб35 в качестве вакцинного вектора, содержащего только ΘΡ(Ζ) или его комбинацию с ОР(8/О), показали, что доставка антигена и его презентация были достаточными для вырабатывания антигенспецифических иммунных ответов, но на уровне ниже требуемого для достижения абсолютной иммунной защиты. Более низкий протективный иммунитет ассоциируется с уровнями антител, детектируемых у некоторых животных, что соответствует минимальной защите, которая достигалась с использованием гЛб5-векторов.

Иммуногенность гЛб26-ОР-вакцины и ее способность обеспечивать защиту против ΕΒΘΥ- 15 029504

инфекции. Затем, авторами настоящего изобретения была оценена рекомбинантная вакцина на основе Ά426, то есть аденовируса группы Ό, на ее способность вырабатывать протективный иммунитет против ЕВОУ-инфекции. Этот серотип использует такой же клеточный рецептор (СЭ46). как и Ά435, однако было показано, что он вырабатывает несколько более высокие иммунные ответы при его использовании в качестве первичного вакцинного вектора (Ьш, с1 а1., 2009). В этих исследованиях два отдельных эксперимента по контрольному инфицированию проводили с эскалацией доз в пределах трех порядков величин. В первом исследовании авторами настоящего изобретения была протестирована вакцина в дозах 10¹⁰ или 10¹¹ частиц для каждого вектора, Άύ26.ΕόοΌΡ(Ζ)ΡΕ\νΙ и Άά26.Εϋο.ΟΡ(8/Ο)ΡΕ/№ί, а во втором исследовании авторами настоящего изобретения была использована доза 10¹² частиц, каждая. В первом исследовании была протестирована вакцина на собакоподобных макаках с иммунитетом к Άά5 для того, чтобы определить, может ли τΆά26, подобно τΆά35, вырабатывать антигенспецифический иммунный ответ при наличии уже существующего иммунитета к Άά5. Четыре собакоподобных макаки на группу, имеющие иммунитет к Άά5, были вакцинированы путем внутримышечной инъекции, и через три недели у них брали пробы крови для оценки ответов с вырабатыванием антител в кровотоке и клеточных иммунных ответов против ЕВОУ ΟΡ (фиг. 4А). Средние титры анти-ΟΡ антител в кровотоке показали зависимость "доза-ответ" для всех групп; 1:700 для 10¹⁰ вакцин и 1:4500 для индивидуумов, которые получали 10¹¹ частиц (р=0,06). Средний титр для трех из четырех индивидуумов в 10¹⁰-дозовой группе был чуть выше минимального порога для иммунной защиты у τΆά5-вакцинированных индивидуумов (1:500), а у индивидуума У16 вырабатывался лишь минимальный гуморальный ответ 1:100, который был явно ниже минимального предельного ответа, предсказанного для А45-ОР-вакцины. В противоположность этому, у индивидуума У19, который был вакцинирован 10¹¹ частиц гА426-вакцины, продуцировался очень высокий титр антител 1:10500, что почти в три раза превышает уровень, ассоциированный с полной иммунной защитой (1:3500), а у других индивидуумов в этой вакцинированной группе наблюдались промежуточные титры, которые не позволяли окончательно предсказать вероятность выживания. Во втором исследовании у четырех индивидуумов, вакцинированных 10¹² частиц каждого гА426-вектора, наблюдались гуморальные ответы, которые были почти аналогичны гуморальным ответам, наблюдаемым в группе, получавшей дозу 10¹¹ частиц, при этом у большинства индивидуумов титры составляли 1:10001:4000. Средний титр анти-СР антител для этой группы составлял 1:3000.

Т-клеточные иммунные ответы (фиг. 4В, С) измеряли путем внутриклеточного окрашивания цитокинами (1С8) как в исследованиях с использованием τΆά35, и была также определена тенденция к изменению зависимости "доза-ответ" в исследовании 1, и было установлено, что различия между группами, получавшими дозу 10¹⁰ и 10¹¹ частиц, не были статистически значимыми (р=0,12 и 0,26 для СЭ4' и СЭ8+ соответственно). Среднее число антигенспецифических СЭ4⁺-Т-клеток составляло 0,14% для вакцинированных индивидуумов, получавших дозу 10¹⁰ частиц гА426-СР, и 0,24% для вакцинированных индивидуумов, получавших более высокую дозу, а у одного индивидуума из группы, получавшей более низкую дозу, индивидуума У14, не обнаруживался детектируемый СЭ4'-ответ (фиг. 4В). При введении τΆά26вакцины не обнаруживалось какого-либо предпочтения в отношении доминирования клеточного СЭ4+или СЭ8⁺-ответа; при этом число СЭ8⁺-клеток составляло 0,13% и 0,25% (для доз 10¹⁰ и 10¹¹ вакцинных частиц соответственно), и, в основном, соответствовало уровню СЭ4'-ответов. В случае СЭ8⁺-Т-клеток, в группе, получавшей низкую дозу, было выявлено два индивидуума, У13 и У14, у которых не был детектирован антигенспецифический ответ (фиг. 4В, С). В исследовании 2, проводимом с использованием τΆά26, средний уровень антигенспецифического СЭ8⁺-ответа (0,34%) был выше, чем СЭ4'-ответ (0,08%), но такое отклонение в сторону СЭ8 '-ответа можно, в основном, отнести на счет одного индивидуума, У24, у которого наблюдался очень высокий уровень СЭ8 '-ответа и низкий уровень СЭ4 '-ответа. В остальных случаях общие клеточные иммунные ответы были аналогичны иммунным ответам, наблюдаемым в исследовании 1 с использованием τΆά26.

В каждом исследовании, проводимом с использованием МД^-вакцины, контрольное инфицирование вирусом ЕВОУ осуществляли посредством внутримышечной (ΙΜ) инъекции 1000 б.о.е. ΖΕВОУ через 4 недели после вакцинации, и для мониторинга течения заболевания измеряли уровни печеночных ферментов (фиг. 4Ό). У невакцинированных индивидуумов наблюдались симптомы поражения печени через 3-6 дней после инфицирования. Все индивидуумы, получавшие самую низкую дозу τΆά26вакцины, то есть 10¹⁰ частиц, обнаруживали аналогичные признаки заболевания, хотя их уровни Ά8Τ повышались медленнее. Как и ожидалось, исходя из этих клинических показателей, все индивидуумы этой группы умирали от летального действия инфекции на 8-ой день после заражения вирусом ΖΕВОУ (фиг. 5А). У некоторых индивидуумов этой группы, гуморальные и Т-клеточные ответы были очень низкими или вообще не детектировались. Различия в уровнях иммунных ответов между группами, получавшими различные дозы Ά426 в исследовании 1 (10¹⁰ и 10¹¹), обычно определялись продолжительностью жизни, то есть более высокая продолжительность жизни была зарегистрирована у 2 из 4 индивидуумов, вакцинированных 10¹¹ частицами М.д26-СР (р=0,01). Άά26-вакцина, вводимая в дозе 10¹¹ частиц, давала лучший результат не только потому, что она была более низкой, а потому, что она также обеспечивала лучшую защиту, чем М.д35-СР при тех же самых дозах (фиг. 5В). И наконец, ^Άά26-вакцина, вводимая в дозе 10¹² частиц, давала самый лучший результат по выживаемости (3 из 4) для любых схем вакцинации

- 16 029504

в этих исследованиях, а уровни протективного иммунитета не обнаруживали значимого отличия от уровней, наблюдаемых ранее для гЛй5-векторов (р=0.32. фиг. 5С), однако такой уровень выживаемости был достигнут с использованием более высокой дозы гЛй26 по сравнению с дозой гЛД5. то есть 10¹² частиц по сравнению с 10¹⁰ частиц соответственно. что позволяет предположить. что для данных животныхмоделей. между этими векторами. возможно. существует различие.

Прайм-буст-вакцинация гетерологичной вакциной на основе гЛй26- и гЛй35-векторов. Дозозависимые характеристики гЛй26-СР-опосредуемого протективного иммунитета и высокие показатели выживаемости. достигаемые с использованием 10¹² векторных частиц. позволяют предположить. что этот вектор эффективно индуцирует экспрессию СР-антигена. Поскольку. как уже наблюдалось для ЕВОУ и других патогенов у индивидуумов. не являющихся человеком. и у человека. прайм-буст-вакцинация гетерологичными вакцинами может индуцировать более сильный иммунитет. чем однократная иммунизация (§иШуап №-Иигс 2000; §атрга е! а1.. Уассше 27 (2009) 5837-5845; Коир. е! а1.. РЬо8 Опе 2010; Се18Ьей е! а1.. (2010) Уио1 84(19): 10386-94). то авторы настоящего изобретения попытались выяснить. можно ли усилить вырабатывание иммунных гЛй26-СР-ответов против ЕВОУ-инфекции путем повторного введения гетерологичного вектора. Четырем собакоподобным макакам вводили 10¹¹ частиц каждого из Лй26.ЕЬо.СР(2)РЕ/№1 и А626.ЕЬо.СР(8/С)РЪ.\у1. Через один месяц все индивидуумы подвергались бустер-вакцинации той же самой дозой Аб35В8и.ЕЬо.СР(2)ЕЕ.\\1 и Ай35В§и.ЕЬо.СР(8/С)РЬ. Иммунные ответы оценивали непосредственно до бустер-вакцинации и через три недели после бустер-вакцинации. На фиг. 6А показано. что иммунные ответы против ЕВОУ-СР(2) эффективно индуцировались путем первичной вакцинации. У отдельных индивидуумов вырабатывались титры анти-СР антител ЕС₉₀ от 1:2700 до 1:7100. а средний титр для группы составлял 1:4000. что соответствовало ответам. наблюдаемым в предыдущем исследовании по тестированию 10¹¹ гАй26. используемого в качестве моновакцины для инокуляции (1:4500). Для сравнения. в это исследование был включен один индивидуум. которому вводили 10¹⁰ частиц каждого из гАй5-СР(2) и гАй5-СР(8/С). и титр антител после такой вакцинации составлял 1:6800. Последующая инокуляция гАй26-СР-примированных индивидуумов 10¹¹ частиц гАй35СР-векторов приводила к повышению уровней антигенспецифического антитела приблизительно на один порядок величины для большинства вакцинированных индивидуумов. то есть. в среднем. титр антител составлял 1:32000. за исключением индивидуума У27. у которого титры антител после первичной вакцинации были исключительно высокими. Интересно отметить. что бустер-вакцинация приводила к вырабатыванию почти одинаковых титров антител у всех индивидуумов. причем стандартное отклонение у индивидуумов составляло лишь менее 10%. тогда как титры после первичной вакцинации давали стандартное отклонение 54%.

Клеточные иммунные ответы также заметно усиливались после введения гАй35-СР-вектора гАй26вакцинированным макакам (фиг. 6В. С). Число СЭ4'-Т-клеток увеличивалось у всех индивидуумов. за исключением одного. У25; причем среднее число клеток после введения гАй35-СР увеличивалось в 2 раза у всех индивидуумов. а бустер-вакцинация приводила к вырабатыванию детектируемого ответа у индивидуума У27. у которого ответ не детектировался до бустер-иммунизации. И наконец. число СЭ4'Т-клеток после бустер-вакцинации было сравнимо с числом клеток. продуцируемых после гАй5-СРвакцинации. Бустер-эффект был самым высоким для СЭ8'-Т-клеток. и такой бустер-эффект был обнаружен у всех индивидуумов для клеток этого типа. а у двух индивидуумов (У27 и У28) ответы превышали ответы. наблюдаемые при гАй5-СР-вакцинации. Среднее число СР-специфических СЭ8'-Т-клеток. измеренное по 1С8. составляло 0.09% после первичной иммунизации. и возрастало в 4.7 раз. то есть до 0.41%. через 3 недели после вторичной вакцинации вектором гАй35-СР.

В целом. результаты по иммуногенности. описанные выше. показали. что гАй35-СР-векторы являются эффективными для бустер-вакцинации гАй26-СР-примированных макак. Бустер-вакцинация приводила к вырабатыванию анти-СР антител до среднего уровня. который на логарифмическом уровне превышал уровень. предсказанный для 100% протективного иммунитета у гАй5-СР-вакцинированных приматов (§иШуап. е! а1.. 2009). Важно отметить. что бустер-вакцинация вектором гАй35-СР приводила к значимому увеличению числа СО8'-Т-клеток. а также. очевидно. следует отметить. что такое увеличение связано с повышением протективного иммунитета к ЕВОУ-инфекции. Поэтому через одну неделю после оценки иммунных ответов (через 4 недели после бустер-вакцинации). все вакцинированные макаки и одна невакцинированная контрольная макака были инфицированы 1000 б.о.е. 2ЕВОУ путем внутримышечной инъекции. У контрольного индивидуума наблюдались клинические симптомы. характерные для ЕВОУ-инфекции. и этот индивидуум погиб от летального действия этой инфекции на 6-й день после контрольного заражения (фиг. 6С. Ό). В противоположность этому. у всех вакцинированных индивидуумов сохранялись нормальные уровни ΑδΤ в кровотоке (фиг. 6С). и при этом не наблюдалось какого-либо геморрагического заболевания. на что указывал общий анализ патологических изменений в организме в конечной стадии исследования (данные не приводятся). Все четыре вакцинированных индивидуума выживали после инфекционного заражения. и у этих индивидуумов отсутствовали какие-либо симптомы заболевания в течение всего 28-дневного периода проведения исследований. Полученные результаты показали. что τΑά26/τΑά3 5-векторы. используемые в качестве гетерологичной прайм-буст-вакцины. вырабатывали устойчивый протективный иммунитет против 2ЕВОУ-инфекции. и продемонстрировали. что

- 17 029504

такой способ вакцинации комбинированными вакцинами может быть применен для достижения аддитивных или синергических эффектов.

Обсуждение

Аденовирусы являются достаточно эффективными в качестве вакцинных векторов при их использовании для доставки различных вирусных, бактериальных и паразитарных антигенов (Ьакато е! а1. (2009) Мо1. Тйег. 17(8): 1333-9). В частности, гЛй5-векторы индуцируют сильные антигенспецифические иммунные ответы у мышей, у приматов, не являющихся человеком, и у человека, как было показано авторами при использовании ЕВОУ-ОР в качестве антигена-мишени. Однако преклинические исследования и клинические исследования с участием человека позволяют предположить, что активность векторов на основе гЛй5 может быть снижена у индивидуумов, которые ранее были инфицированы Лй5, в том случае, если они имеют высокий уровень иммунитета против этого вектора. Целью настоящих исследований является идентификация гЛй-векторов, которые способны доставлять антиген ОР ЕВОУ индивидуумам, которые ранее не были инфицированы, и индивидуумам с иммунитетом к Лй5. Поскольку уже имеющийся иммунитет против любого вирусного вектора может ограничивать эффективность вакцины, то авторы настоящего изобретения сосредоточили свое внимание на вирусах, которые относительно редко инфицируют человека, на что указывают преобладание серопозитивных индивидуумов и/или низкие уровни нейтрализующих антител. В настоящей работе для разработки вакцины были отобраны редкие человеческие аденовирусные серотипы ЛЙ35 и ЛЙ26.

гЛй35-ОР-вакцинация макак приводила к вырабатыванию антигенспецифического антитела и Тклеточных ответов у отдельных индивидуумов на уровнях, наблюдаемых ранее при использовании гЛй5 в качестве вектора для доставки. Средний титр анти-ОР антитела для всех гЛй35-вакцинаций (независимо от дозы), составляющий 1:1400, был ниже среднего титра, наблюдаемого ранее для всех индивидуумов, вакцинированных 10¹⁰ гЛй5-ОР (1:11000, п=17), что является первым признаком того, что активность вектора для двух серотипов может отличаться, если титр антитела является аналогичным коррелятом как для тЛй35-вакцин, так и для тЛй5 ЕВОУ-вакцин. СИ4+- и СИ8⁺-Т-клеточные ответы были детектированы у большинства индивидуумов до их контрольного заражения, но поскольку их абсолютные величины нельзя сравнивать в случае тЛй5-вакцин, то они не были включены в эти исследования, которые проводились в отсутствие образцов МКПК для осуществления перекрестных контрольных анализов.

Вакцинация тЛй3 5-векторами эффективно индуцировала вырабатывание антигенспецифических антител и Т-лимфоцитарных иммунных ответов у индивидуумов, не вакцинированных тЛй5-вектором, или у тЛй5-иммунизованных индивидуумов, что позволяет предположить, что геномы векторов редких серотипов значительно отличаются от геномов широко распространенных серотипов, сообщающих резистентность к вырабатыванию иммунитета гетерологичными векторами. Такая отличительная способность вектора является важным свойством, позволяющим ему "ускользать" от имеющегося иммунного надзора, вырабатываемого не только природной вирусной инфекцией, но также и гетерологичными векторами при первичной иммунизации или вакцинации против других патогенов. Действительно, тЛй35ОР-вакцинация приводила к вырабатыванию сильного бустер-эффекта в отношении ответов, опосредуемых клетками, и гуморальных ответов у макак, примированных вектором тЛй26-ОР. Такой результат был очень неожиданным, поскольку было продемонстрировано явное различие в активности вектора для индуцирования вторичного и первичного иммунных ответов, причем способность тЛй35-ОР усиливать иммунный ответ не могла быть предсказана по величине ответов, наблюдаемых после первичной иммунизации. Полученные данные могут указывать на то, что тЛй3 5 и другие тЛй-векторы имеют более высокую эффективность трансдукции у некоторых групп или в дендритных клетках-мишенях со стабильной активностью, как недавно было описано в публикации Ыпйкау е! а1., 1. 1шшипо1. 185(3): 1513-21, и в данном случае такой эффект будет более заметным или более приемлемым при достижении вторичных иммунных ответов.

Было обнаружено, что тЛй26 является более активным, чем тЛй35, если он используется в качестве одной единственной вакцины против ЕВОУ-инфекции, на что указывает выживание до 75% вакцинированных макак при самой высокой тестируемой дозе. тЛй26-ОР-вакцины продемонстрировали четкую зависимость "доза-ответ" в индуцировании протективного иммунитета, что позволяет предположить, что минимальное повышение уровня экспрессии антигена может повышать эффективность вакцин на основе тЛй26 и вырабатывать стабильный протективный ответ против высоких доз ЕВОУ-инфекции, таких как дозы, используемые в настоящей заявке. Интересно отметить, что чем выше степень протективного ответа, сообщаемого тЛй26-ОР-векторами, по сравнению с тЛй35-ОР-векторами, взятыми в соответствующей дозе (10¹¹ частиц), тем выше ЕЫ§Л-титры анти-ОР антител, то есть 1:4500 и 1:1400, соответственно. Полученные данные указывают на вероятность того, что титры предсенсибилизированных антител могут служить в качестве коррелята протективного иммунного ответа против 2ЕВОУ-инфекции для всех тЛйсеротипов, а также для всех групп векторов, используемых для приготовления тЛй5-ОР-вакцин. Порядок активности для индуцирования гуморальных ответов позволил предсказать ранговый порядок для протективного ответа по всем группам векторов.

В описанных здесь исследованиях были протестированы вакцинные векторы, которые сравнивались по отдельности и в комбинации, и было показано, что тЛй альтернативного серотипа могут быть

- 18 029504

использованы для приматов в качестве вакцинных векторов. Полученные результаты позволяют предположить, что эти вакцины могут быть наиболее эффективными, если они используются в "прайм-буст"комбинации.

Высокий уровень антигенспецифических ответов, достигаемых при гетерологичной вакцинации типа "прайм-буст", дает основание предположить, что длительный иммунитет может быть достигнут на оптимальном уровне путем ДНК-примирования тЛй (Байта, с1 а1. (2005). 1. νίτοί. 79(10): 6516-22). Поскольку ДНК требует множества инициаторов для вырабатывания иммунного ответа и не индуцирует быстрого иммунитета, подобно тЛй-векторам, то прайм-буст-вакцинация гетерологичным тЛй позволит достичь оптимального баланса между индуцированием быстрого и длительного протективного иммунитета.

Следует отметить, что описанные здесь примеры и варианты приводятся лишь в иллюстративных целях, и для специалиста в данной области очевидно, что в них могут быть внесены различные модификации или изменения, не выходящие за рамки существа и объема прилагаемой формулы изобретения. Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте и во всех целях вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЗиШуап, Иапсу Л.

ЫаЬе1, Сагу Л.

АзФеДи, С1етепЕ СЬепд, СЬепд Раи, МагФа СгавФа СоиДзтФЕ, Лаар

Тйе ОоиегптепЕ о£ ЕЬе ипФЕеД ЗЕаЕез о£ АтегФса аз гергезепЕеД Ьу Тйе ЗесгеЕагу о£ ЕЬе ЬерагЕтепЕ о£ Неа1ЕЬ апД Нитап ЗегиФсез

Сгисе11 Но11апД Β.ν.

<120> Филовирусные вакцины на основе аденовирусов

серотипа 25 и серотипа 35

<130> 77867-827790

<140> ИО РСТ/ИЗ11/64944

<141> 2011-12-14

<150> ИЗ 61/422,954

<151> 2010-12-14

<160> 4

<170> ЕазЕЗЕ12 £ог ИФпДо»з Vе^зίоп 4.0

<210> 1

<211> 2302

<212> ДНК

<213> Вирус Эбола

<220>

<223> Трансмембранный оболочечный гликопротеин (СР) филовирусного антигена дикого типа вируса Эбола (ΕΒΟν) типа Заир (ΖΕΒΟν)

<400> 1

сдЕсдЕсдас асдЕдЕдаЕс адаЕаЕсдсд дссдсЕсЕад ассаддсссЕ ддаЕсдаЕсс 60

аасаасасаа ЕдддсдЕЕас аддааЕаЕЕд садЕЕассЕс дЕдаЕсдаЕЕ саададдаса 120

ЕсаЕЕсЕЕЕс ЕЕЕдддЕааЕ ЕаЕссЕЕЕЕс сааадаасаЕ ЕЕЕссаЕссс асЕЕддадЕс 180

аЕссасааЕа дсасаЕЕаса ддЕЕадЕдаЕ дЕсдасааас ЕадЕЕЕдЕсд ЕдасааасЕд 240

ЕсаЕссасаа аЕсааЕЕдад аЕсадЕЕдда сЕдааЕсЕсд аадддааЕдд адЕддсаасЕ 300

дасдЕдссаЕ сЕдсаасЕаа аадаЕддддс ЕЕсаддЕссд дЕдЕсссасс аааддЕддЕс 360

ааЕЕаЕдаад сЕддЕдааЕд ддсЕдаааас ЕдсЕасааЕс ЕЕдаааЕсаа аааассЕдас 420

дддадЕдадЕ дЕсЕассадс адсдссадас дддаЕЕсддд дсЕЕсссссд дЕдссддЕаЕ 480

- 19 029504

дбдсасааад бабсаддаас дддассдбдб дссддадасб ббдссббсса бааададддб 540

дсбббсббсс бдбабдабсд асббдсббсс асадббабсб ассдаддаас дасбббсдсб 600

дааддбдбсд ббдсабббсб дабасбдссс саадсбаада аддасббсбб садсбсасас 660

сссббдадад адссддбсаа бдсаасддад дасссдбсба дбддсбасба ббсбассаса 720

аббадабабс аддсбассдд ббббддаасс аабдадасад адбасббдбб сдаддббдас 780

аабббдассб асдбссаасб бдаабсаада ббсасассас адбббсбдсб ссадсбдааб 840

дадасаабаб абасаадбдд дааааддадс аабассасдд даааасбааб ббддааддбс 900

аассссдааа ббдабасаас аабсддддад бдддссббсб дддааасбаа аааааассбс 960

асбадааааа ббсдсадбда ададббдбсб ббсасадббд бабсааасдд адссааааас 1020

абсадбддбс ададбссддс дсдаасббсб бссдасссад ддассаасас аасаасбдаа 1080

дассасаааа бсабддсббс адааааббсс бсбдсаабдд ббсаадбдса садбсаадда 1140

адддаадсбд садбдбсдса бсбаасаасс сббдссасаа бсбссасдад бссссаабсс 1200

сбсасаасса аассаддбсс ддасаасадс асссабааба сасссдбдба бааасббдас 1260

абсбсбдадд саасбсаадб бдаасаасаб сассдсадаа садасаасда садсасадсс 1320

бссдасасбс ссбсбдссас дассдсадсс ддасссссаа аадсададаа сассаасасд 1380

адсаададса сбдасббссб ддассссдсс ассасаасаа дбссссаааа ссасадсдад 1440

ассдсбддса асаасаасас бсабсассаа дабассддад аадададбдс садсадсддд 1500

аадсбаддсб бааббассаа басбаббдсб ддадбсдсад дасбдабсас аддсдддада 1560

адаасбсдаа дадаадсааб бдбсаабдсб саасссаааб дсаасссбаа бббасаббас 1620

бддасбасбс аддабдаадд бдсбдсаабс ддасбддссб ддабассаба бббсдддсса 1680

дсадссдадд даабббасаб ададдддсба абдсасаабс аадабддббб аабсбдбддд 1740

ббдадасадс бддссаасда дасдасбсаа дсбсббсаас бдббссбдад адссасаасб 1800

дадсбасдса ссббббсааб ссбсаассдб ааддсааббд абббсббдсб дсадсдабдд 1860

ддсддсасаб дссасаббсб дддассддас бдсбдбабсд аассасабда ббддассаад 1920

аасабаасад асааааббда бсадаббабб сабдаббббд ббдабаааас ссббссддас 1980

садддддаса абдасааббд дбддасадда бддадасааб ддабассддс аддбаббдда 2040

дббасаддсд ббдбааббдс адббабсдсб ббаббсбдба бабдсааабб бдбсббббад 2100

бббббсббса даббдсббса бддаааадсб садссбсааа бсаабдааас саддабббаа 2160

ббабабддаб басббдаабс баадаббасб бдасааабда баабабааба сасбддадсб 2220

ббааасабад ссаабдбдаб бсбаасбссб ббааасбсас адббаабсаб ааасааддбб 2280

бдаддбассд адсбсдаабб да 2302

<210> 2

<211> 2031

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный оболочечный гликопротеин (ОР) оптимизированного по кодонам филовирусного антигена синтетического вируса Эбола (ΕΒΟν) типа Судан/Гулу (ЗЕВОУ)

<400> 2

абддадддсс бдадссбдсб дсадсбдссс адддасаадб бсаддаадад садсббсббс 60

дбдбдддбда бсабссбдбб ссадааддсс ббсадсабдс сссбдддсдб ддбдассаас 120

адсасссбдд аддбдассда дабсдассад сбддбдбдса аддассассб ддссадсасс 180

дассадсбда ададсдбддд ссбдаассбд дадддсадсд дсдбдадсас сдасабсссс 240

адсдссасса ададдбдддд сббсаддадс ддсдбдссбс ссааддбддб дадсбасдад 300

дссддсдадб дддссдадаа сбдсбасаас сбддадабса адаадсссда сддсадсдад 360

бдссбдссбс сбссбссбда сддсдбдадд ддсббсссса ддбдсаддба сдбдсасаад 420

дсссадддса ссддссссбд ссссддсдас басдссббсс асааддасдд сдссббсббс 480

сбдбасдаса ддсбддссад сассдбдабс басаддддсд бдаасббсдс сдадддсдбд 540

абсдссббсс бдабссбддс саадсссаад дадассббсс бдсададссс бсссабсадд 600

даддссдбда асбасассда даасассадс адсбасбасд ссассадсба бсбададбас 660

дадабсдада асббсддсдс ссадсасадс ассасссбдб бсаадабсда саасаасасс 720

ббсдбдаддс бддасаддсс ссасассссб садббссбдб бссадсбдаа сдасассабс 780

сассбдсасс адсадсбдад саасассасс ддсаддсбда бсбддасссб ддасдссаас 840

абсаасдссд асабсддсда дбдддссббс бдддадааса адаадаассб дадсдадсад 900

сбдаддддсд аддадсбдад сббсдаддсс сбдадссбда асдадассда ддасдасдас 960

дссдссадса дсаддабсас саадддсадд абсадсдаса дддссассад даадбасадс 1020

дассбддбдс ссаадаасад ссссддсабд дбдссссбдс асабссссда дддсдадасс 1080

асссбдссса дссадаасад сассдадддс аддадддбдд дсдбдаасас ссаддадасс 1140

абсассдада ссдссдссас сабсабсддс ассаасддса ассасабдса дабсадсасс 1200

- 20 029504

абсддсабса ддсссадсад сссдаддссс адасссссас сссассассс сбсссддсад ссбдадааса бсассассдс сбдабсасса дсассдбдас аддсадасса асассааддс саддадсадс асаасдссдс ддсабсбаса ссдадддссб сбддссаасд адассассса ассбасасса бссбдаасад бдсаддаббс бдддссссда дасаадабса ассадабсаб дасдасаасб ддбддассдд абсабсабсд ссабсабсдс

<210> 3

<211> 2028

<212> ДНК

<213> Вирус Эбола

<220>

<223> Трансмембранный антигена дикого

<400> 3

абддддддбс ббадссбасб дбббдддбса бсабсббабб адсасбббад аадбаасада дассадсбда аабсадббдд бсбдсаасаа адсдббдддд дсдддадааб дддсбдаааа бдсббасссс сассдссада дсссааддаа ссдддсссбд сбсбабдаса ддсбддсббс аббдсаббсб бдабаббддс даддсадбаа асбасасбда дааабсдааа аббббддбдс бббдббсдбс бддасаддсс сассббсасс аасадббдад абсаабдсбд абаббддбда сбасдбддад аададсбдбс дсддсабсдб сдадааббас дассбддббс сааадааббс асаббдссдб сбсадааббс аббасадада садсбдсаас абсдддабаа дассдадсбс ссбдаддсбс адасссссас ссаасаасас сассдддаад ссадааааба баасаасадс сбаабаасбб саасадбаас адасааасба асассааадс саадаасаас абаабдсбдс ддсабабаса сбдааддссб сббдсааабд ааасаасбса асабабасса басбсаабад бдсаддабсс бдддассада дабаааабса ассааабсаб дабдабаабб ддбддасддд аббаббаббд сааббаббдс

садссадабс сссадсадса дссссассас сдссссбадс 1260 сасссасасс адсддассса дсдбдабддс сассдаддад 1320 садссссдда сссассассд аддссссбас ссбдассасс 1380 сдбдаадасс дбдсбдсссс аддададсас садсаасддс 1440 сддсабссбд ддсадссбдд дссбдаддаа даддадсадд 1500 сассддсаад бдсаасссса ассбдсасба сбддассдсс 1560 сддсабсдсс бддаббсссб асббсддссс сддсдссдад 1620 дабдсасаас садаасдссс бддбдбдсдд ссбдаддсад 1680 ддсссбдсад сбдббссбда дддссассас сдадсбдадд 1740 дааддссабс дасббссбдс бдаддаддбд дддсддсасс 1800 сбдсбдсабс дадссссасд асбддассаа даасабсасс 1860 ссасдасббс абсдасаасс сбсбдсссаа ссаддасаас 1920 сбддсддсад бддабассбд ссддсабсдд сабсассддс 1980 бсбдсбдбдс дбдбдсаадс бдсбдбдсбд а 2031

оболочечный гликопротеин (ОР) филовирусного типа вируса Эбола (ΕΒΟν) типа Судан/Гулу (ВЕБОУ)

ссааббдссс адддасаааб ббсддаааад сбсбббсббб 60 ссааааддсс ббббссабдс сбббдддбдб бдбдасбаас 120 даббдассад сбадбсбдса аддабсабсб бдсабсбасб 180 бсбсаассбс даддддадсд дадбабсбас бдабабссса 240 сббсадабсб ддбдббссбс ссааддбддб садсбабдаа 300 ббдсбасааб сббдааабаа адаадссдда сдддадсдаа 360 бддбдбсада ддсбббссаа ддбдссдсба бдббсасааа 420 сссаддбдас басдссбббс асааддабдд адсбббсббс 480 аасбдбаабб басададдад бсааббббдс бдадддддба 540 бааассаааа дааасдббсс ббсадбсасс ссссаббсда 600 ааабасабса адббаббабд ссасабссба сббддадбаб 660 бсаасасбсс асдасссббб бсааааббда саабаабасб 720 ссасасдссб садббссббб бссадсбдаа бдабассабб 780 баабасаасб дддадасбаа бббддасасб адабдсбааб 840 абдддсбббб бдддааааба ааааааабсб сбссдаасаа 900 бббсдаадсб ббабсдсбса асдадасада адасдабдаб 960 ааадддаада абсбссдасс дддссассад даадбаббсд 1020 сссбдддабд дббссаббдс асабассада аддддаааса 1080 дасадааддб сдаададбад дбдбдаасас бсаддадасс 1140 ааббабаддс асбаасддса ассабабдса дабсбссасс 1200 садссааабс ссдадббссб сассдассас ддсассаадс 1260 аасссасаса бсаддбссаб садбдабддс сассдаддаа 1320 сбсссссддс ссаасаасад аадсасссас бсбсассасс 1380 ддббаааасб дбссбдссас аддадбссас аадсаасддб 1440 адддаббсбб дддадбсббд ддсббсдааа асдсадсада 1500 сасдддбаад бдсаабссса асббасасба сбддасбдса 1560 бдддаббдсс бддабсссдб асбббддасс дддбдсддаа 1620 дабдсабаас саааабдссб бадбсбдбдд асббаддсаа 1680 адсбсбдсад сббббсббаа дадссасаас ддадсбдсдд 1740 дааддссаба дабббссббс бдсдасдабд дддсдддаса 1800 ббдббдсабб дадссасабд аббддасааа ааасабсасб 1860 ссабдабббс абсдасаасс ссббассбаа бсаддабааб 1920 сбддадасад бддабсссбд саддаабадд саббасбдда 1980 бсббсбббдс дбббдсаадс бдсбббдс 2028

<210> 4 <211> 2043 <212> ДНК

- 21 029504

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Трансмембранный оболочечный гликопротеин (СР) оптимизированного по кодонам филовирусного антигена синтетического вируса Марбург (МАКУ) типа Ангола

<400> 4

аЕдаадасса ссЕдссЕдсЕ даЕсадссЕд аЕссЕдаЕсс адддсдЕдаа дасссЕдссс 60

аЕссЕддада Есдссадсаа саЕссадссс садаасдЕдд асадсдЕдЕд садсддсасс 120

сЕдсадаада ссдаддасдЕ дсассЕдаЕд ддсЕЕсассс Едадсддсса дааддЕддсс 180

дасадсссЕс Еддаддссад саададдЕдд дссЕЕсаддд ссддсдЕдсс ссссаадаас 240

дЕддадЕаса ссдадддсда ддаддссаад ассЕдсЕаса асаЕсадсдЕ дассдасссс 300

адсддсаада дссЕдсЕдсЕ ддасссЕссс ассаасаЕса дддасЕассс ЕаадЕдсаад 360

ассаЕссасс асаЕссаддд ссадаасссЕ сасдсссадд дсаЕсдсссЕ дсассЕдЕдд 420

ддсдссЕЕсЕ ЕссЕдЕасда саддаЕсдсс адсассасса ЕдЕасададд аааадЕдЕЕс 480

асададддаа асаЕсдсЕдс ЕаЕдаЕсдЕд аасаадассд ЕдсаЕаадаЕ даЕсЕЕсадс 540

адасадддас адддаЕаЕад асаЕаЕдаас сЕдасаЕсса сааасаадЕа сЕддасаадс 600

адсаасддаа сасадасааа сдаЕасадда ЕдЕЕЕЕддаа сасЕдсадда аЕасаасЕсс 660

ассаадаасс адасаЕдЕдс сссЕадсаад аадссЕсЕдс сЕсЕдссЕас адсЕсаЕссЕ 720

даадЕдаадс ЕдасаЕссас аадсасадаЕ дссасааадс Едаасасаас адаЕссЕааЕ 780

адсдасдасд аддаЕсЕдас аасаадсдда ЕссддаЕссд дадаасадда ассЕЕаЕаса 840

асаадсдасд сЕдсЕасааа асадддасЕд ЕссЕссасаа ЕдссЕссЕас ассЕадсссЕ 900

садссЕадса сассЕсадса дддаддсаас аасасааасс аЕЕсссаддд адЕддЕдаса 960

даассЕддаа адасааасас аасадсссад ссЕадсаЕдс сЕссЕсаЕаа сасаасааса 1020

аЕсадсасаа асаасассЕс саадсасааЕ сЕдадсасас сЕадсдЕдсс ЕаЕЕсадааЕ 1080

дссассаасЕ асаасасаса дЕссасадсс ссЕдаааасд аасадассЕс сдссссЕЕсс 1140

аааасаассс ЕдсЕдссЕас адаааасссЕ асаасадсса ададсасааа садсасааад 1200

адсссЕасаа саасадЕдсс Еаасасааса аасаадЕаЕа дсасаадссс ЕадсссЕаса 1260

ссЕааЕЕсса садсЕсадса ЕсЕддЕдЕаЕ ЕЕЕадаадаа ададааасаЕ ссЕдЕддада 1320

дааддадаЕа ЕдЕЕсссЕЕЕ ЕсЕддаЕдда сЕдаЕсаасд сЕссЕаЕсда ЕЕЕЕдаЕссЕ 1380

дЕдссЕааса сааадасааЕ сЕЕЕдаЕдаа адсадсадса дсддадссЕс сдссдаадаа 1440

даЕсадсаЕд ссЕссссЕаа саЕсадссЕд асасЕдадсЕ аЕЕЕЕссЕаа ддЕдаасдаа 1500

аасасадссс аЕЕссддада ааасдаааас даЕЕдЕдаЕд ссдаасЕдад ааЕсЕддадс 1560

дЕдсаддаад аЕдаЕсЕддс сдссддасЕд адсЕддаЕсс сЕЕЕЕЕЕЕдд дсссддааЕЕ 1620

дааддасЕдЕ асассдссдд ссЕдаЕсаад аассадааса ассЕддЕдЕд саддсЕдадд 1680

аддсЕддсса ассадассдс саададссЕд дадсЕдсЕдс ЕдадддЕдас сассдаддад 1740

аддассЕЕса дссЕдаЕсаа саддсасдсс аЕсдасЕЕсс ЕдсЕддсЕад дЕддддсддс 1800

ассЕдсаадд ЕдсЕдддссс сдасЕдсЕдс аЕсддсаЕсд аддассЕдад саддаасаЕс 1860

адсдадсада ЕсдассадаЕ саадааддас дадсадаадд адддсассдд сЕддддссЕд 1920

ддсддсаадЕ ддЕддассад сдасЕдддда дЕдсЕдасаа ассЕдддааЕ ссЕдсЕдсЕд 1980

сЕдадсаЕЕд ссдЕдсЕсаЕ ЕдсЕсЕдЕсс ЕдЕаЕсЕдЕа дааЕсЕЕЕас саадЕасаЕс 2040

дда 2043

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ индуцирования иммунного ответа против филовирусного антигена у пациента, включающий осуществление первичной вакцинации с помощью иммунологически эффективного количества рекомбинантного аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую филовирусный гликопротеин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую капсидный белок аденовируса 26, и последующей бустер-вакцинации с помощью аденовирусного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую филовирусный гликопротеин, и нуклеиновую кислоту, кодирующую капсидный белок аденовируса 35, где указанная нуклеиновая кислота, кодирующая филовирусный гликопротеин, имеет полинуклеотидную последовательность, выбранную из 8ЕО ГО N0: 1, 8Е0 ГО N0: 2, 8Е0 ГО N0: 3 и 8ЕО ГО N0: 4.
2. Способ по п.1, где аденовирусные векторы вводят внутримышечно.
3. Способ по п.1 или 2, где указанный аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую капсидный белок аденовируса 26, представляет собой вектор тА426, а аденовирусный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую капсидный белок аденовируса 35, представляет собой вектор тА435.

- 22 029504