EA048934B1

EA048934B1 - Способы лечения рака

Info

Publication number: EA048934B1
Application number: EA202192718
Authority: EA
Inventors: Гэвин Беннетт; Джиллиан Лэнгфорд; Питер ПАРК; Йоханна Лахденранта
Original assignee: Бисайклерд Лимитед
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2025-02-05

Abstract

Изобретение относится к способу лечения рака у пациента.

Description

Настоящее изобретение испрашивает приоритет согласно § 119(e) главы 35 Свода законов США на основании предварительной заявки на патент США № 62/846064, поданной 10 мая 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящее изобретение посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение относится к применению конъюгата токсина Bicycle (англ. Bicycle toxin conjugate) BT1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в комбинации с ингибитором контрольной точки, для лечения рака. В настоящем изобретении также предложены фармацевтически приемлемые композиции, содержащие ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор контрольной точки.

Уровень техники

МТ1-ММР представляет собой трансмембранную металлопротеазу, которая играет важную роль в ремоделировании внеклеточного матрикса: непосредственно - путем разрушения нескольких его компонентов, и опосредованно - путем активации про-ММР2. МТ1-ММР играет ключевую роль в ангиогенезе опухоли (Sounni et al. (2002) FASEB J. 16(6), 555-564) и сверхэкспрессируется во различных солидных опухолях. Соответственно, по-прежнему существует большая неудовлетворенная потребность в разработке ингибиторов МТ1-ММР для лечения рака.

Краткое описание изобретения

Было обнаружено, что комбинация ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки значительно улучшает противоопухолевую активность по сравнению с лечением каждым из указанных агентов в отдельности. Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор контрольной точки. В другом аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано изменение массы тела после лечения мышей C57BL/6 с опухолью 3LL с помощью ВТ1718 и PD-1. Точки на графике представляют собой среднюю массу тела для группы. Планки погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM).

На фиг. 2 показано изменение объема опухоли после введения ВТ1718 и PD-1 мышам C57BL/6 с опухолью 3LL. Точки на графике представляют собой среднее значение по группе, планки погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM). На фиг. 3 показаны изменение объема опухоли и выживаемость в процентах (определяемая как 20-кратное увеличение объема опухоли) после введения ВТ1718 и PD-1 мышам C57BL/6J с опухолью 3LL. Точки на графике представляют собой среднее значение по группе, планки погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM). Показатели выживаемости в группах, получавших комбинацию ВТ1718/ингибитора контрольной точки, были значительно лучше по сравнению с лечением любым из этих агентов в отдельности.

На фиг. 4 показано изменение объема опухоли после введения ВТ1718, паклитаксела и PD-1 мышам C57BL/6 с ортотопической карциномой молочной железы мыши Е0771. Точки на графике представляют собой среднее значение по группе, планки погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM). Лечение с помощью ВТ1718 в дозе 6,2 мг/кг или 4,8 мг/кг в комбинации с антителом к PD-1 в дозе 10 мг/кг было несколько более эффективным, чем лечение любым из этих агентов в отдельности и приводило к увеличению времени до прогрессирования на 13,2 дня (59,0%) и 7,7 дня (34,5%). Указанное комбинированное лечение приводило к частоте 12,5% (1/8) случаев полного регресса в каждой из групп, получавших комбинацию ВТ1718/антитела к PD-1. Для паклитаксела или aPD-1, применявшихся в отдельности или в комбинации, наблюдался плохой ответ. На фиг. 5 показаны изменение объема опухоли и выживаемость в процентах (определяемая как 20-кратное увеличение объема опухоли) после введения ВТ1718 и антитела к CTLA4 мышам BALB/c с опухолью СТ-26, и процент повторного роста опухоли после повторной инокуляции клеток. Точки на графике представляют собой среднее значение по группе, планки погрешности представляют собой стандартную ошибку среднего (SEM). У 8/10 мышей с сингенными опухолями СТ26 наблюдался полный ответ после лечения с помощью BT1718/aCTLA-4 (4/10 после aCTLA-4) и отторжение имплантированных затем СТ26-клеток.

На фиг. 6 показано, что функциональный анализ обогащения указывает на увеличение содержания маркеров, связанных с Т-клетками (Th1 -клетками, истощенными CD8-клeтками, цитотоксическими клетками, Т-клетками, Т-клетками CD8), в опухолях у животных, получавших лечение комбинацией ВТ1718/ PD-1. Эти изменения становятся заметны через 48 ч. Оценка GSVA относится к анализу вариаций набора генов (Gene Set Variation Analysis). На фиг. 7 показано, что при аннотировании транскриптов в соответствии с функциями противоракового иммунитета функциональный анализ обогащения указывает на увеличение локализации иммунных клеток в опухолях, активность миелоидных клеток, распознавание раковых клеток Т-клетками, праймирование и активацию Т-клеток, презентацию ракового антигена и уничтожение раковых клеток у животных, получавших комбинацию ВТ1718/ PD-1. Сигнатура активности NK-клеток также увеличивается при указанном комбинированном лечении. Неожиданно, сигнатура высвобождения антигена раковых клеток уменьшается при указанном комбинированном лечении.

- 1 048934

Эти изменения становятся заметны через 48 ч. Цветовые обозначения относятся к той же оценке GSVA, что и на фиг. 6. Для локализации иммунных клеток в опухолях, активности миелоидных клеток, активности NK-клеток и высвобождения антигена раковых клеток скорректированный р<0,1 (PD1/Combo через 48 ч). Для активности NK-клеток скорректированный р<0,05 (CTR/Combo через 48 ч).

На фиг. 8 показано, что функциональная аннотация транскриптов и аннотация по пути сигнализации указывают на модуляции в нескольких различных функциях тканей. Активность антитела к PD-1 в отношении индуцирования сигнализации цитокинов и хемокинов заметна через 24 ч, тогда как активность ВТ1718, применяемого в виде монотерапии, становится заметна через 48 ч с увеличением сигнатур цитотоксичности и сигнализации IFN, а также ремоделирования матрикса и метастазирования. Изменения сигнатур транскрипции в ответ на указанное комбинированное лечение, опять же, заметны через 48 ч. К ним относятся увеличение адгезии и миграции иммунных клеток, лимфоидного компартмента, презентации антигена и ко-стимулирующей сигнализации. Указанные изменения транскрипционных сигнатур свидетельствовали о снижении сигнализации hedgehog, ангиогенеза и сигнализации WNT. Цветовые обозначения относятся к той же оценке GSVA, что и на фиг. 6. Для цитотоксичности скорректированный р<0,05 (CTR/BT1718 через 48 ч).

Подробное описание некоторых вариантов реализации

1. Описание некоторых вариантов реализации изобретения.

Было обнаружено, что комбинация ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки продемонстрировала неожиданное и значительное улучшение противоопухолевой активности по сравнению с лечением любым из указанных агентов в отдельности. Например, комбинация ВТ1718 и антитела к PD-1 значительно улучшает выживаемость в модели карциномы легкого по сравнению с лечением любым из указанных агентов в отдельности (см., например, пример 2). Кроме того, комбинация ВТ1718 и антитела к PD-1 продемонстрировала повышенную противоопухолевую активность по сравнению с монотерапией в модели аденокарциномы молочной железы (см., например, пример 3). Кроме того, комбинация ВТ1718 и антитела к CTLA-4 продемонстрировала высокую противоопухолевую активность: полный регресс, повышенную выживаемость и иммунологическую память в модели карциномы толстой кишки (см., например, пример 4). Соответственно, в одном аспекте в настоящем изобретении предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложено применение ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения рака, где указанное лекарственное средство применяют в комбинации с ингибитором контрольной точки.

В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 3-46 мг/м². В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 3-13 мг/м², примерно 14-24 мг/м², примерно 25-35 мг/м² или примерно 36-46 мг/м². В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 9-36 мг/м², примерно 9-30 мг/м², примерно 9-24 мг/м² или примерно 9-18 мг/м². В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 9 мг/м². В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 14,4 мг/м². В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 18,6 мг/м². В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе примерно 19,2 мг/м².

В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой 1-4 раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой 2, 3 или 4 раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в 1,5 недели. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в 2 недели. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в 2,5 недели. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в 3 недели. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в 4 недели.

В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 1-4 недели. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 5-8 недель. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 9-12 недель. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 13-20 недель. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 21-28 недель. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение пе

- 2 048934 риода лечения, составляющего примерно 4, 8, 12, 16, 20, 24 или 28 недель. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 30 недель или более. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту путем внутривенной болюсной инъекции. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят пациенту путем внутривенной инфузии. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 5-10 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 10-20 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 20-40 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 45, или 50, или 55 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 1 час. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 1-1,5 ч. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 1,5-2 ч. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью примерно 2-3 ч. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ВТ1718 или его фармацевтически приемлемой соли представляет собой инфузию продолжительностью более 3 ч.

Ингибитор контрольной точки вводят в соответствии с режимом дозирования, рекомендованным или одобренным Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA). В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в дозе примерно 120 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в дозе примерно 1-5 мг/кг, примерно 6-10 мг/кг, примерно 11-15 мг/кг или примерно 16-20 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в дозе примерно 1-10 мг/кг, примерно 5-15 мг/кг или примерно 10-20 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в дозе примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в дозе примерно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой 1-4 раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой 2, 3 или 4 раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 1,5 недели. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 2 недели. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 2,5 недели. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 3 недели. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 4 недели. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 1-4 недели. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 9-12 недель, примерно 13-20 недель, примерно 21-28 недель или примерно 29-36 недель. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в течение периода лечения, составляющего примерно 36 недель или более. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят пациенту путем внутривенной инъекции. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят пациенту путем внутривенной инфузии. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ингибитора контрольной точки представляет собой инфузию продолжительностью примерно 5-10 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ингибитора контрольной точки представляет собой инфузию продолжительностью примерно 10-20 минут или примерно 20-40 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ингибитора контрольной точки представляет собой инфузию продолжительностью примерно 30, 40, 45, 50, 55 или 60 минут. В некоторых вариантах реализации внутривенная инфузия ингибитора контрольной точки представляет собой инфузию продолжительностью примерно 1-1,5 ч, примерно 1,5-2 ч или примерно 2-3 ч.

В некоторых вариантах реализации лекарственное средство, содержащее ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль, выбрано из составов на основе ВТ1718, приведенных в примерах в настоящем изобретении. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство, содержащее ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль, дополнительно содержит гистидин. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство, содержащее ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и гистидин, имеет рН примерно 7. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство, содержащее ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль, дополнительно содержит сахарозу. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство, содержащее ВТ1718 или его фармацевтически приемле

- 3 048934 мую соль, дополнительно содержит примерно 10% масс/об, сахарозы. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство, содержащее ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль, дополнительно содержит воду. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложено лекарственное средство, содержащее ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, гистидин, сахарозу и воду, при этом указанное лекарственное средство имеет рН примерно 7. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложено лекарственное средство, содержащее

ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, гистидин, сахарозу и воду, при этом указанное лекарственное средство имеет рН примерно 6,6. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство содержит ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль в концентрации примерно 0,48 мг/мл. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство содержит ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль в концентрации примерно 0,62 мг/мл. В некоторых вариантах реализации лекарственное средство содержит ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль в концентрации примерно 0,96 мг/мл. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки выбран из опи санных в настоящем документе.

В некоторых вариантах реализации рак выбран из описанных в настоящем документе.

2. Соединения и определения.

ВТ1718 (или BT17BDC-18) имеет следующую химическую структуру. Получение ВТ1718 подробно описано в заявке WO 2016/067035, поданной 29 октября 2015 года, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

Используемый в настоящем изобретении термин фармацевтически приемлемая соль относится к солям, которые, в рамках разумного медицинского суждения, подходят для применения в контакте с тканями людей и животных, не вызывая чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции и тому подобного, и обладают разумным соотношением ожидаемой пользы и риска. Фармацевтически

- 4 048934 приемлемые соли хорошо известны в данной области техники. Например, S.M. Berge et al. подробно описывают фармацевтически приемлемые соли в работе в J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, включенной в настоящий документ посредством ссылки. Фармацевтически приемлемые соли соединений согласно настоящему изобретению включают соли, полученные из подходящих неорганических и органических кислот и оснований. Примерами фармацевтически приемлемых, нетоксичных солей присоединения кислот являются соли аминогрупп с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота, серная и хлорная кислоты, или с органическими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, винная кислота, лимонная кислота, янтарная кислота или малоновая кислота, или при помощи других методов, применяемых в данной области техники, таких как ионный обмен. Другие фармацевтически приемлемые соли включают адипат, альгинат, аскорбат, аспартат, бензолсульфонат, бензоат, бисульфат, борат, бутират, камфарат, камфорсульфонат, цитрат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, формиат, фумарат, глюкогептонат, глицерофосфат, глюконат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактобионат, лактат, лаурат, лаурилсульфат, малат, малеат, малонат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, нитрат, олеат, оксалат, пальмитат, памоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, фосфат, пивалат, пропионат, стеарат, сукцинат, сульфат, тартрат, тиоцианат, п-толуолсульфонат, ундеканоат, валератные соли и им подобные.

Соли, полученные путем взаимодействия с подходящими основаниями, включают соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, соли аммония и соли N⁺(С_1-4алкил)₄. Примеры солей щелочных или щелочноземельных металлов включают натриевые, литиевые, калиевые, кальциевые, магниевые и другие подобные соли. Дополнительные фармацевтически приемлемые соли включают, при необходимости, нетоксичные аммониевые, четвертичные аммониевые и аминные катионы, полученные с помощью противоионов, таких как галогенид, гидроксид, карбоксилат, сульфат, фосфат, нитрат, сульфонат низшего алкила и арилсульфонат. Если не указано иное, структуры, приведенные в настоящем изобретении, также подразумевают включение всех изомерных (например, энантиомерных, диастереомерных и геометрических (или конформационных)) форм; например, R- и S-конфигурации для каждого центра асимметрии, Z- и Е-изомеры двойной связи и Z- и Е-конформационные изомеры. Поэтому в объем настоящего изобретения входят как отдельные стереохимические изомеры, так и энантиомерные, диастереомерные и геометрические (или конформационные) смеси соединений согласно настоящему изобретению. Если не указано иное, в объем настоящего изобретения входят все таутомерные формы соединений согласно изобретению. Кроме того, если не указано иное, структуры, приведенные в настоящем изобретении, также подразумевают включение соединений, которые отличаются лишь наличием одного или нескольких изотопно обогащенных атомов. Например, в объем настоящего изобретения также входят соединения, имеющие приведенные в настоящем изобретении структуры, в которых водород заменен на дейтерий или тритий, или углерод заменен ¹³С- или ¹⁴С-обогащенным углеродом. Такие соединения подходят для применения, например, в качестве аналитических инструментов, в качестве зондов в биологических исследованиях или в качестве терапевтических агентов в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах реализации реакционноспособный фрагмент - R¹ - в предложенном соединении содержит один или более атомов дейтерия. Используемый в настоящем изобретении термин примерно относится к диапазону в пределах 20% от данного конкретного значения. В некоторых вариантах реализации термин примерно относится к диапазону в пределах 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% от данного конкретного значения. Используемый в настоящем изобретении термин мг/кг относится к миллиграмму лекарственного средства на килограмм массы тела субъекта, принимающего лекарственное средство. Как указано в руководстве FDA, доза в мг/кг для животного может быть преобразована в соответствующую эквивалентную дозу для человека (Human Equivalent Dose, HED) в мг/м². Например, преобразование доз для мыши в HED показано ниже:

Доза для мыши (мг/кг)	Эквивалентная доза для человека (мг/м²)
2,4	7,2
3,0	9,0
4,8	14,4
6,4	19,2
10,0	30,0

3. Фармацевтически приемлемые композиции.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор контрольной точки. В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция для применения для лечения рака, содержащая ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор контрольной точки.

В некоторых вариантах реализации композиция содержит фармацевтически приемлемую переносящую среду, адъювант или носитель. Термин фармацевтически приемлемая переносящая среда, адъю- 5 048934 вант или носитель относится к нетоксичной переносящей среде, адъюванту или носителю, которые не приводят к утрате фармакологической активности соединения, в составе с которым они содержатся. Фармацевтически приемлемые переносящие среды, адъюванты или носители, которые можно использовать в композициях согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протамина сульфат, динатрия гидрофосфат, калия гидрофосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидную двуокись кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, блок-полимеры полиэтилена-полиоксипропилена, полиэтиленгликоль и ланолин.

Используемый в настоящем изобретении термин пациент означает животное, предпочтительно млекопитающее, и наиболее предпочтительно - человека. Композиции согласно настоящему изобретению можно вводить перорально, парентерально, при помощи ингаляционного спрея, местно, ректально, назально, буккально, вагинально или при помощи имплантированного резервуара. Используемый в настоящем документе термин парентеральный включает в себя подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, внутрисиновиальную, интрастернальную, интратекальную, внутрипеченочную, внутрипочечную и внутричерепную инъекцию или инфузию. В некоторых вариантах реализации указанные композиции вводят перорально, внутрибрюшинно или внутривенно. Стерильные инъецируемые формы композиций согласно настоящему изобретению могут представлять собой водную или масляную суспензию. Эти суспензии могут быть приготовлены в соответствии с методиками, известными в данной области техники, с применением подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. Приемлемые носители и растворители, которые можно применять, включают воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла.

С этой целью может быть использовано любое мягкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Для приготовления инъекционных лекарственных средств подходят жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, а также натуральные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных вариантах. Эти масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергатор, такой как карбоксиметилцеллюлоза или подобные диспергирующие агенты, которые обычно используются в рецептуре фармацевтически приемлемых дозированных лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Для приготовления состава можно также применять и другие традиционно используемые поверхностно-активные вещества, такие как Твины (Tweens), Спаны (Spans) и другие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, которые обычно используются при изготовлении фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм.

Фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению можно вводить перорально в любой перорально приемлемой лекарственной форме, включая, но не ограничиваясь ими, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения традиционно используемые переносящие среды включают лактозу и кукурузный крахмал. Также обычно добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсулы подходящие разбавители включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального применения требуются водные суспензии, активный ингредиент комбинируют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании также могут быть добавлены определенные подсластители, ароматизаторы или красители.

Альтернативно, фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению можно вводить в форме суппозиториев для ректального введения. Их можно получать путем смешивания агента с подходящим нераздражающим вспомогательным веществом, которое является твердым при комнатной температуре, но жидким при ректальной температуре и, следовательно, расплавляется в прямой кишке с высвобождением лекарственного средства. Такие вещества включают какао-масло, пчелиный воск и полиэтиленгликоли.

Фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению можно также вводить местно, особенно когда лечение направлено на области или органы, легко доступные для местного применения, включая заболевания глаз, кожи или нижнего отдела кишечного тракта. Для каждой из этих областей или органов легко приготовить подходящие составы для местного применения.

Местное применение для нижнего отдела кишечного тракта можно осуществлять в виде ректального суппозитория (см. выше) или в виде подходящего состава для клизмы. Также можно применять трансдермальные пластыри для местного применения.

Для местного применения предложенные фармацевтически приемлемые композиции могут быть

- 6 048934 приготовлены в виде подходящей мази, содержащей активный компонент, суспендированный или растворенный в одной или более переносящих средах. Переносящие среды для местного введения соединений согласно настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, полиоксипропиленовое соединение, эмульгирующий воск и воду. Кроме того, предложенные фармацевтически приемлемые композиции могут быть приготовлены в виде подходящего лосьона или крема, содержащего активные компоненты, суспендированные или растворенные в одной или более фармацевтически приемлемых переносящих средах. Подходящие переносящие среды включают, но не ограничиваются ими, минеральное масло, моностеарат сорбитана, полисорбат 60, цетилэфирный воск, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.

Для офтальмологического применения предложенные фармацевтически приемлемые композиции могут быть приготовлены в виде микронизированных суспензий в изотоническом стерильном физиологическом растворе с рН, доведенным до нужного значения, или, предпочтительно, в виде растворов в изотоническом стерильном физиологическом растворе с рН, доведенным до нужного значения, без консерванта или с консервантом, таким как бензилалконийхлорид. В альтернативном варианте, фармацевтически приемлемые композиции для офтальмологических применений могут быть приготовлены в составе мази, такой как вазелин.

Фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению также можно вводить с помощью назального аэрозоля или ингаляции. Такие композиции готовят в соответствии со способами, хорошо известными в области приготовления фармацевтических составов, например, в виде растворов в физиологическом растворе, с использованием бензилового спирта или других подходящих консервантов, промоторов абсорбции для повышения биодоступности, фторуглеродов и/или других традиционных солюбилизирующих или диспергирующих агентов.

Фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению также могут быть приготовлены в форме для перорального введения. Такие композиции можно вводить с пищей или без нее. В некоторых вариантах реализации фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению вводят без пищи. В других вариантах реализации фармацевтически приемлемые композиции согласно настоящему изобретению вводят совместно с пищей.

Следует также понимать, что конкретная дозировка и схема лечения для любого конкретного пациента будут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, скорость экскреции, комбинацию лекарств и мнение лечащего врача, а также тяжесть конкретного заболевания. Количество соединения согласно настоящему изобретению в указанной композиции также будет зависеть от конкретного соединения в составе композиции.

4. Способы лечения рака.

В соответствии с некоторыми вариантами реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложено применение ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в комбинации с ингибитором контрольной точки, для лечения рака.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак легкого. В некоторых вариантах реализации рак легкого представляет собой met-амплифицированный плоскоклеточный НМРЛ, плоскоклеточный НМРЛ с EGFR дикого типа или аденокарциному легкого с экспрессией Т790М EGFR.

В некоторых вариантах реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения рака легкого у пациента, включающий введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и антитела к PD1. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе 9 мг/м² с частотой 2 раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе 30 мг/м² с частотой 2 раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе 14,4 мг/м² с частотой один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации антитело к PD1 вводят в дозе и с частотой, описанными в настоящем изобретении. В некоторых вариантах реализации ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и/или антитело к PD1 вводят путем в/в инъекции или в/в инфузии, как описано в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации рак молочной железы представляет собой трижды отрицательный рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации рак молочной железы представляет собой базалоидный трижды отрицательный рак молочной железы. В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способу лечения рака молочной железы у пациента, включающему введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и антитела к PD1. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе 14,4 мг/м² с частотой один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в до

- 7 048934 зе 18,6 мг/м² с частотой один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации антитело к PD1 вводят в дозе и с частотой, описанными в настоящем изобретении. В некоторых вариантах реализации ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и/или антитело к PD1 вводят путем в/в инъекции или в/в инфузии, как описано в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак толстой кишки. В некоторых вариантах реализации рак представляет собой колоректальную аденокарциному. В некоторых вариантах реализации колоректальная аденокарцинома представляет собой колоректальную аденокарциному с высокой экспрессией Pgp.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к способу лечения рака толстой кишки у пациента, включающему введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и антитела к CTLA4. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят в дозе 19,2 мг/м² с частотой один раз в неделю. В некоторых вариантах реализации антитело к CTLA4 вводят в дозе и с частотой, описанными в настоящем изобретении. В некоторых вариантах реализации ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и/или антитело к CTLA4 вводят путем в/в инъекции или в/в инфузии, как описано в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак желудка. В некоторых вариантах реализации рак желудка представляет собой FGFR-амплифицированный рак желудка.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак головы и шеи. В некоторых вариантах реализации рак головы и шеи представляет собой плоскоклеточную карциному носовой перегородки.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой саркому. В некоторых вариантах реализации саркома представляет собой фибросаркому. В некоторых вариантах реализации фибросаркома представляет собой саркому мягких тканей (СМТ) с мутацией N-RAS/мутацией IDH1.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак мочевого пузыря. В некоторых вариантах реализации рак мочевого пузыря выбран из группы, состоящей из базального, р53-подобного и люминального рака мочевого пузыря.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак эндометрия. В некоторых вариантах реализации рак эндометрия выбран из группы, состоящей из MMR-D, POLE EDM, p53 WT, р53 абнормального, типа I, типа II, карциномы, карциносаркомы, эндометриоидной аденокарциномы, серозной карциномы, светлоклеточной карциномы, муцинозной карциномы, смешанной или недифференцированной карциномы, смешанного серозного и эндометриоидного, смешанного серозного и низкодифференцированного эндометриоидного, и недифференцированного рака эндометрия.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак пищевода. В некоторых вариантах реализации рак пищевода выбран из группы, состоящей из аденокарциномы (ЕАС), плоскоклеточной карциномы (ESCC), хромосомной нестабильности (CIN), вируса Эпштейна-Барр (EBV), геномно стабильного (GS) рак пищевода и микросателлитной нестабильности (MSI).

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой глиобластому. В некоторых вариантах реализации глиобластома выбрана из группы, состоящей из проневральной, невральной, классической и мезенхимальной глиобластомы.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой мезотелиому. В некоторых вариантах реализации мезотелиома выбрана из группы, состоящей из плевральной, перитонеальной, перикардиальной, эпителиоидной, саркоматоидной, двухфазной и злокачественной мезотелиомы.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой множественную миелому. В некоторых вариантах реализации множественная миелома выбрана из группы, состоящей из гипердиплоидной, негипердиплоидной, множественной миеломы с транслокацией в циклине D, с транслокацией MMSET, с транслокацией MAF, и неклассифицированной множественной миеломы.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак яичников. В некоторых вариантах реализации рак яичников выбран из группы, состоящей из светлоклеточного, эндометриоидного, муцинозного, высокодифференцированного серозного и низкодифференцированного серозного рака яичников.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак поджелудочной железы. В некоторых вариантах реализации рак поджелудочной железы выбран из группы, состоящей из плоскоклеточного рака поджелудочной железы, предшественника панкреатита, иммуногенного рака поджелудочной железы и рака поджелудочной железы с аберрантной эндокринно-экзокринной дифференцировкой (ADEX).

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах реализации рак предстательной железы выбран из группы, состоящей из AZGP1 (подтип I), MUC1 (подтип II) и MUC1 (подтип III).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой антитело к PD1. В некоторых вариантах реализации антитело к PD1 выбрано из ниволумаба (антитело к PD-1, Opdivo®, Bristol-Myers Squibb); пембролизумаба (антитело к PD-1, Keytruda®, Merck); дурвалумаба (антитело к PD-L1, Imfinzi®, AstraZeneca); и атезолизумаба (антитело к PD-L1, Tecentriq®, Genentech).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой антитело к

- 8 048934

CTLA-4. В некоторых вариантах реализации антитело к CTLA-4 представляет собой ипилимумаб (антитело к CTLA-4, Yervoy®, Bristol-Myers Squibb).

В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в дозе примерно 3 мг/кг и ингибитора контрольной точки в дозе примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации каждый из ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки вводят с частотой два раза в неделю. В некоторых вариантах реализации каждый из ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки вводят с частотой один раз в 3 дня.

В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в дозе примерно 10 мг/кг и ингибитора контрольной точки в дозе примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации каждый из ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки вводят с частотой два раза в неделю. В некоторых вариантах реализации каждый из ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки вводят с частотой один раз в 3 дня.

В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в дозе примерно 4,8 мг/кг и ингибитора контрольной точки в дозе примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю, а ингибитор контрольной точки вводят с частотой два раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю, а ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 3 дня.

В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в дозе примерно 6,2 мг/кг и ингибитора контрольной точки в дозе примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю, а ингибитор контрольной точки вводят с частотой два раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю, а ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 3 дня.

В некоторых вариантах реализации предложен способ лечения рака у пациента, включающий введение пациенту ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, в дозе примерно 6,4 мг/кг и ингибитора контрольной точки в дозе примерно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю, а ингибитор контрольной точки вводят с частотой два раза в неделю. В некоторых вариантах реализации ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль вводят с частотой один раз в неделю, а ингибитор контрольной точки вводят с частотой один раз в 3 дня.

Примеры видов рака.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой солидную опухоль. В некоторых вариантах реализации рак ассоциирован с МТ1-ММР. В некоторых вариантах реализации рак характеризуется высокой экспрессией МТ1-ММР. Например, в работе Adley et al. сообщалось, что высокий уровень экспрессии МТ1-ММР наблюдался при светлоклеточных карциномах яичника (Adley et al. Expression of Membrane Type 1 Matrix Metalloproteinase (MMP-14) in Epithelial Ovarian Cancer: High Level Expression in Clear Cell Carcinoma Gynecol Oncol. 2009 February; 112(2): 319-324).

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак эндометрия. В некоторых вариантах реализации указанный рак эндометрия выбран из группы, состоящей из MMR-D, POLE EDM, p53 WT, р53 абнормального, типа I, типа II, карциномы, карциносаркомы, эндометриоидной аденокарциномы, серозной карциномы, светлоклеточной карциномы, муцинозной карциномы, смешанной или недифференцированной карциномы, смешанного серозного и эндометриоидного, смешанного серозного и низкодифференцированного эндометриоидного, и недифференцированного рака эндометрия. В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак пищевода. В некоторых вариантах реализации указанный рак пищевода выбран из группы, состоящей из аденокарциномы (ЕАС), плоскоклеточной карциномы (ESCC), хромосомной нестабильности (CIN), вируса Эпштейна-Барр (EBV), геномно стабильного (GS) рака пищевода и микросателлитной нестабильности (MSI).

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой глиобластому. В некоторых вариантах реализации указанная глиобластома выбрана из группы, состоящей из проневральной, невральной, классической и мезенхимальной глиобластомы.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой мезотелиому. В некоторых вариантах реализации указанная мезотелиома выбрана из группы, состоящей из плевральной, перитонеальной, перикардиальной, эпителиоидной, саркоматоидной, двухфазной и злокачественной мезотелиомы.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой множественную миелому. В некоторых

- 9 048934 вариантах реализации указанная множественная миелома выбрана из группы, состоящей из гипердиплоидной, негипердиплоидной, множественной миеломы с транслокацией в циклине D, с транслокацией MMSET, с транслокацией MAF, и неклассифицированной множественной миеломы.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак яичников. В некоторых вариантах реализации указанный рак яичников выбран из группы, состоящей из светлоклеточного, эндометриоидного, муцинозного, высокодифференцированного серозного и низкодифференцированного серозного рака яичников.

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак поджелудочной железы. В некоторых вариантах реализации указанный рак поджелудочной железы выбран из группы, состоящей из плоскоклеточного рака поджелудочной железы, предшественника панкреатита, иммуногенного рака поджелудочной железы и рака поджелудочной железы с аберрантной эндокринно-экзокринной дифференцировкой (ADEX).

В некоторых вариантах реализации рак представляет собой рак предстательной железы. В некоторых вариантах реализации указанный рак предстательной железы выбран из группы, состоящей из рака предстательной железы AZGP1 (подтип I), MUC1 (подтип II) и MUC1 (подтип III).

Совместное введение ВТ1718 и ингибитора контрольной точки.

ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить отдельно от ингибитора контрольной точки, как часть многокомпонентной схемы дозирования. В альтернативном варианте ВТ1718, или его фармацевтически приемлемая соль, и ингибитор контрольной точки могут быть смешаны в составе одной композиции. При введении в рамках многокомпонентной схемы дозирования ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор контрольной точки можно вводить одновременно, последовательно или через некоторое время друг от друга, например, в пределах 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 20, 21, 22, 23 или 24 ч друг от друга. В некоторых вариантах реализации ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, и ингибитор контрольной точки вводят в рамках многокомпонентной схемы дозирования с интервалом более 24 ч друг от друга. Используемый в настоящем изобретении термин комбинация, комбинированный и связанные с ними термины относятся к одновременному или последовательному введению терапевтических агентов в соответствии с настоящим изобретением. Например, ВТ1718 или его фармацевтически приемлемую соль можно вводить с ингибитором контрольной точки одновременно или последовательно в составе отдельных дозированных лекарственных форм или совместно в составе единой дозированной лекарственной формы. Соответственно, в настоящем изобретении предложена единая дозированная лекарственная форма, содержащая ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, ингибитор контрольной точки и, необязательно, фармацевтически приемлемую переносящую среду, адъювант или носитель.

Количество ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки, которое можно комбинировать с переносящей средой с получением единой дозированной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от пациента и конкретного способа введения. Предпочтительно композиция согласно настоящему изобретению должна быть составлена таким образом, чтобы можно было вводить дозу соединения согласно настоящему изобретению, составляющую от 0,01 до 100 мг/кг массы тела/день.

ВТ1718, или его фармацевтически приемлемая соль, и ингибитор контрольной точки могут действовать синергетически. Следовательно, количество ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и ингибитора контрольной точки в таких композициях может быть меньше, чем требуется при монотерапии с применением только этого терапевтического агента.

Количество ингибитора контрольной точки, присутствующего в композициях согласно настоящему изобретению, может не превышать количество, которое обычно вводят в составе композиции, содержащей указанный ингибитор контрольной точки в качестве единственного активного агента. Предпочтительно количество ингибитора контрольной точки в композициях согласно настоящему изобретению составляет от примерно 50 до 100% от количества, обычно присутствующего в композиции, содержащей этот агент в качестве единственного терапевтически активного агента. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки вводят в дозе примерно 50%, примерно 55%, примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90% или примерно 95% от количества, обычно вводимого в виде монотерапии. Используемый в настоящем изобретении термин обычно вводимый означает количество одобренного FDA терапевтического агента, одобренное для дозирования в соответствии с инструкцией по применению от FDA.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению также могут быть включены в состав композиций для нанесения покрытия на имплантируемое медицинское устройство, такое как протезы, искусственные клапаны, сосудистые имплантаты, стенты и катетеры. Например, сосудистые стенты используются для борьбы с рестенозом (повторным сужением стенки сосуда после травмы). Тем не менее, у пациентов, использующих стенты или другие имплантируемые устройства, существует риск тромбообразования или активации тромбоцитов. Эти нежелательные эффекты можно предотвратить или смягчить за счет предварительного покрытия устройства фармацевтически приемлемой композицией, содержащей ингибитор киназы. Имплантируемые устройства с покрытием из соединения согласно на

- 10 048934 стоящему изобретению являются еще одним вариантом реализации настоящего изобретения.

5. Примеры ингибиторов контрольных точек.

Используемый в настоящем изобретении термин ингибитор контрольной точки относится к агентам, подходящим для предотвращения уклонения раковых клеток от иммунной системы пациента. Один из основных механизмов подрыва противоопухолевого иммунитета известен как истощение Т-клеток, которое возникает в результате хронического воздействия антигенов, что приводит к повышенной регуляции ингибирующих рецепторов. Эти ингибирующие рецепторы выступают в качестве контрольных точек иммунного ответа для предотвращения неконтролируемых иммунных реакций.

PD-1 и коингибирующие рецепторы, такие как цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4, аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (BTLA; CD272), Т-клеточный иммуноглобулин и домен-3 муцина (TIM-3), ген активации лимфоцитов 3 (Lag-3; CD223) и другие, часто называют регуляторами контрольных точек. Они действуют как молекулярные привратники, позволяющие внеклеточной информации диктовать, должно ли протекать прогрессирование клеточного цикла и другие внутриклеточные сигнальные процессы. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой антитело к PD-1. PD-1 связывается с рецептором программируемой клеточной гибели 1 (PD-1) для предотвращения связывания указанного рецептора с ингибирующим лигандом PDL-1, тем самым не позволяя опухолям подавлять противоопухолевый иммунный ответ хозяина.

В одном аспекте ингибитор контрольной точки представляет собой биотерапевтический препарат или малую молекулу. В другом аспекте ингибитор контрольной точки представляет собой моноклональное антитело, гуманизированное антитело, полностью человеческое антитело, слитый белок или их комбинацию. В дополнительном аспекте ингибитор контрольной точки ингибирует белок контрольной точки, выбранный из лигандов семейства CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2В4, CD160, CGEN-15049, CHK1, CHK2, A2aR, B-7 или их комбинации. В дополнительном аспекте ингибитор контрольной точки взаимодействует с лигандом белка контрольной точки, выбранным из лигандов семейства CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2В4, CD160, CGEN-15049, CHK1, СНК2, A2aR, B-7 или их комбинации. В одном аспекте ингибитор контрольной точки представляет собой иммуностимулирующий агент, фактор роста Т-клеток, интерлейкин, антитело, вакцину или их комбинацию. В дополнительном аспекте интерлейкин представляет собой IL-7 или IL-15. В конкретном аспекте интерлейкин представляет собой гликозилированный IL-7. В дополнительном аспекте вакцина представляет собой вакцину на основе дендритных клеток (ДК).

Ингибиторы контрольных точек включают любой агент, который статистически значимым образом блокирует или подавляет ингибирующие пути иммунной системы. Такие ингибиторы могут включать низкомолекулярные ингибиторы или могут включать антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с рецепторами контрольных точек иммунного ответа и блокируют или ингибируют их, или антитела, которые связываются с лигандами рецепторов контрольных точек иммунного ответа и блокируют или ингибируют их. Примеры молекул контрольных точек, которые могут быть мишенями для блокирования или ингибирования, включают, но не ограничиваются ими, CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, HVEM, GAL9, LAG3, TIM3, VISTA, KIR, 2B4 (относится к семейству молекул CD2 и экспрессируется на всех NK, γδ и CD8+ (αβ) Т-клетках памяти), CD160 (также называемый BY55), CGEN-15049, киназы CHK1 и CHK2, A2aR и различные лиганды семейства В-7. Лиганды семейства В7 включают, но не ограничиваются ими, В7-1, В7-2, B7-DC, В7-Н1, В7-Н2, В7-Н3, В7-Н4, В7-Н5, В7-Н6 и В7-Н7. Ингибиторы контрольных точек включают антитела, или их антигенсвязывающие фрагменты, другие связывающие белки, биопрепараты или малые молекулы, которые связываются и блокируют или ингибируют активность одного или более из CTLA-4, PDL1, PDL2, PD1, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VTSTA, KIR, 2B4, CD160 и CGEN-15049. Примеры ингибиторов контрольных точек включают тремелимумаб (антитело, блокирующее CTLA-4), анти-ОХ40, моноклональное антитело PD-L1 (анти-В7Н1; MEDI4736), MK-3475 (блокатор PD-1), ниволумаб (антитело к PD1), СТ-011 (антитело к PD1), моноклональное антитело BY55, АМР224 (антитело к PDL1), BMS-936559 (антитело к PDL1), MPLDL3280A (антитело к PDL1), MSB0010718C (антитело к PDL1) и ипилимумаб (ингибитор контрольной точки антиCTLA-4). Лиганды белков контрольных точек включают, но не ограничиваются ими, PD-L1, PD-L2, В7Н3, В7-Н4, CD28, CD86 и TIM-3.

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки выбран из антагониста PD-1, антагониста PD-L1 и антагониста CTLA-4. В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки выбран из группы, состоящей из ниволумаба (Opdivo®), ипилимумаба (Yervoy®) и пембролизумаба (Keytruda®). В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки выбран из ниволумаба (антитело к PD-1, Opdivo®, Bristol-Myers Squibb); пембролизумаба (антитело к PD-1, Keytruda®, Merck); ипилимумаба (антитело к CTLA-4, Yervoy®, Bristol-Myers Squibb); дурвалумаба (антитело к PD-L1, Imfinzi®, AstraZeneca); и атезолизумаба (антитело к PD-L1, Tecentriq®, Genentech).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки выбран из группы, состоящей из ламбролизумаба (мК-3475), ниволумаба (BMS-936558), пидилизумаба (СТ-011), АМР-224, MDX-1105,

- 11 048934

MEDI4736, MPDL3280A, BMS-936559, ипилимумаба, лирлумаба, IPH2101, пембролизумаба (Keytruda®) и тремелимумаба.

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой REGN2810 (Regeneron) - антитело к PD-1, которое исследовалось у пациентов с базально-клеточной карциномой (NCT03132636), NSCLC (NCT03088540), плоскоклеточной карциномой кожи (NCT02760498), лимфомой (NCT02651662) и меланомой (NCT03002376); пидилизумаб (CureTech), также известный как СТ-011 антитело, которое связывается с PD-1, которое проходит клинические испытания для лечения диффузной В-крупноклеточной лимфомы и множественной миеломы; авелумаб (Bavencio®, Pfizer/Merck KGA), также известный как MSB0010718C) - полностью человеческое антитело IgG1 к PD-L1, которое проходит клинические испытания для лечения немелкоклеточного рака легких, карциномы Меркеля, мезотелиомы, солидных опухолей, рака почек, рака яичников, рака мочевого пузыря, рака головы и шеи, и рака желудка; или PDR001 (Novartis) - ингибирующее антитело, которое связывается с PD-1, проходящее клинические испытания для лечения немелкоклеточного рака легких, трижды отрицательного рака молочной железы и солидных опухолей на поздней стадии или метастазирующих солидных опухолей. Тремелимумаб (СР-675,206; Astrazeneca) представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело к CTLA-4, которое исследовалось в клинических испытаниях для ряда показаний, включая: мезотелиому, колоректальный рак, рак почек, рак молочной железы, рак легких и немелкоклеточный рак легких, протоковую аденокарциному поджелудочной железы, рак поджелудочной железы, эмбриональный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи, гепатоцеллюлярную карциному, рак предстательной железы, рак эндометрия, метастатический рак печени, рак печени, В-крупноклеточную лимфому, рак яичников, рак шейки матки, метастатический анапластический рак щитовидной железы, уротелиальный рак, рак фаллопиевых труб, множественную миелому, рак мочевого пузыря, саркому мягких тканей и меланому. AGEN-1884 (Agenus) представляет собой антитело к CTLA4, которое проходит фазу 1 клинических испытаний для лечения солидных опухолей на поздних стадиях (NCT02694822).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой ингибитор белка-3, содержащего Т-клеточный иммуноглобулин и муцин/домен муцина (TIM-3). Ингибиторы TIM3, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают TSR-022, LY3321367 и MBG453. TSR-022 (Tesaro) представляет собой антитело к TIM-3, которое исследуется для лечения солидных опухолей (NCT02817633). LY3321367 (Eli Lilly) представляет собой антитело к TIM-3, которое исследуется для лечения солидных опухолей (NCT03099109). MBG453 (Novartis) представляет собой антитело к TIM3, которое исследуется для лечения распространенных злокачественных новообразованиий (NCT02608268).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой ингибитор иммунорецептора Т-клеток с доменами Ig и ITIM, или TIGIT - иммунного рецептора на некоторых Тклетках и NK-клетках. Ингибиторы TIGIT, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают BMS-986207 (Bristol-Myers Squibb) -моноклональное антитело к TIGIT (NCT02913313); ОМР313М32 (Oncomed); и моноклональное антитело к TIGIT (NCT03119428).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки представляет собой ингибитор гена активации лимфоцитов 3 (LAG-3). Ингибиторы LAG-3, которые можно применять в настоящем изобретении, включают BMS-986016 и REGN3767 и IMP321. BMS-986016 (Bristol-Myers Squibb), представляющий собой антитело к LAG-3, исследуется для применения при глиобластоме и глиосаркоме (NCT02658981). REGN3767 (Regeneron) также является антителом к LAG-3 и исследуется для применения при злокачественных новообразованиях (NCT03005782). IMP321 (Immutep S.A.) представляет собой слитый белок LAG-3-Ig, который исследуется для лечения меланомы (NCT02676869), аденокарциномы (NCT02614833) и метастатического рака молочной железы (NCT00349934).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно применять в настоящем изобретении, включают агонисты ОХ40. Агонисты ОХ40, которые исследуются в клинических испытаниях, включают PF04518600/PF-8600 (Pfizer) - агонистическое антитело к ОХ40 - для лечения метастатического рака почки (NCT03092856) и раковых заболеваний и новообразований на поздних стадиях (NCT02554812; NCT05082566); GSK3174998 (Merck) - агонистическое антитело к ОХ40, проходящее фазу 1 клинических испытаний для лечения рака (NCT02528357); MEDI0562 (Medimmune/AstraZeneca) - агонистическое антитело к ОХ40 - для лечения распространенных солидных опухолей (NCT02318394 и NCT02705482); MEDI6469 -агонистическое антитело к ОХ40 (Medimmune/AstraZeneca) - у пациентов с колоректальным раком (NCT02559024), раком молочной железы (NCT01862900), раком головы и шеи (NCT074155) и метастатическим раком предстательной железы (NCT01303705); и BMS-986178 (Bristol-Myers Squibb) агонистическое антитело к ОХ40 - для лечения раковых заболеваний на поздних стадиях (NCT02737475).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно применять в настоящем изобретении, включают агонисты CD137 (также называемого 4-1ВВ). Агонисты CD137, которые исследуются в клинических испытаниях, включают утомилумаб (PF-05082566, Pfizer) - агонистическое антитело к CD137 - для лечения диффузной В-крупноклеточной лимфомы (NCT02951156) и раковых заболеваний и новообразований на поздних стадиях (NCT02554812 и nCt05082566); урелумаб (bMS-663513, Bristol-Myers Squibb) - агони

- 12 048934 стическое антитело к CD137 - для лечения меланомы и рака кожи (NCT02652455), и глиобластомы и глиосаркомы (NCT02658981).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают агонисты CD27. Агонисты CD27, которые исследуются в клинических испытаниях, включают варлилумаб (CDX-1127, Celldex Therapeutics) - агонистическое антитело к CD27 - для лечения плоскоклеточного рака головы и шеи, карциномы яичников, колоректального рака, почечно-клеточного рака и глиобластомы (NCT02335918), лимфом (NCT01460134), и глиомы и астроцитомы (NCT02924038).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают агонисты индуцируемого глюкокортикоидами рецептора фактора некроза опухоли (GITR). Агонисты GITR, которые исследуются в клинических испытаниях, включают TRX518 (Leap Therapeutics) - агонистическое антитело к GITR - для лечения злокачественной меланомы и других злокачественных солидных опухолей (NCT01239134 и NCT02628574); GWN323 (Novartis) - агонистическое антитело к GITR для лечения солидных опухолей и лимфомы (NCT02740270); INCAGN01876 (Incyte/Agenus) - агонистическое антитело к GITR - для лечения раковых заболеваний на поздних стадиях (NCT02697591 и NCT03126110); МК-4166 (Merck) - агонистическое антитело к GITR - для лечения солидных опухолей (NCT02132754), и MEDI1873 (Medimmune/AstraZeneca) - агонистическую гексамерную молекулу GITRлиганд с доменом Fc IgG1 человека - для лечения солидных опухолей на поздних стадиях (NCT02583165).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают агонисты индуцибельных костимуляторов Т-клеток (ICOS, также известных как CD278). Агонисты ICOS, которые исследуются в клинических испытаниях, включают MEDI-570 (Medimmune) - агонистическое антитело к ICOS - для лечения лимфом (NCT02520791); GSK3359609 (Merck) - агонистическое антитело к ICOS, в фазе 1 (NCT02723955); JTX-2011 (Jounce Therapeutics) - агонистическое антитело к ICOS, в фазе 1 (NCT02904226).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают ингибиторы IgG-подобного рецептора киллерных клеток (KIR). Ингибиторы KTR, которые исследуются в клинических испытаниях, включают лирилумаб (IPH2102/BMS-986015, Innate Pharma/Bristol-Myers Squibb) - антитело к KIR - для лечения лейкозов (NCT01687387, NCT02399917, NCT02481297, NCT02599649), множественной миеломы (NCT02252263) и лимфомы (NCT01592370); IPH2101 (1-7F9, Innate Pharma) - для лечения миеломы (NCT01222286 и NCT01217203); и IPH4102 (Innate Pharma) - антитело к KIR, которое связывается с тремя доменами длинного цитоплазматического хвоста (KIR3DL2) для лечения лимфомы (NCT02593045).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают ингибиторы взаимодействия между CD47 и сигнальным регуляторным белком альфа (SIRPa). Ингибиторы CD47/SIRPa, которые исследуются в клинических испытаниях, включают ALX-148 (Alexo Therapeutics) - антагонистический вариант (SIRPa), который связывается с CD47 и предотвращает опосредованную CD47/SIRPa передачу сигнала - в фазе 1 (NCT03013218); TTI-621 (SIRPa-Fc, Trillium Therapeutics) растворимый рекомбинантный слитый белок, созданный путем связывания N-концевого CD47связывающего домена SIRPa с Fc-доменом IgG1 человека, действующий путем связывания CD47 человека и предотвращающий доставку его сигнала не ешь макрофагам, находящийся в фазе 1 клинических испытаний (NCT02890368 и NCT02663518); СС-90002 (Celgene) - антитело к CD47 - для лечения лейкозов (NCT02641002); и Hu5F9-G4 (Forty Seven, Inc.) - для лечения колоректальных новообразований и солидных опухолей (NCT02953782), острого миелоидного лейкоза (NCT02678338) и лимфомы (NCT02953509).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно применять в настоящем изобретении, включают ингибиторы CD73. Ингибиторы CD73, которые исследуются в клинических испытаниях, включают MEDI9447 (Medimmune) - антитело к CD73 - для лечения солидных опухолей (NCT02503774), и BMS986179 (Bristol-Myers Squibb) - антитело к CD73 -для лечения солидных опухолей (NCT02754141).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают агонисты белка-стимулятора генов интерферона (STING, также известного как трансмембранный белок 173 или ТМЕМ173). Агонисты STING, которые исследуются в клинических испытаниях, включают MK1454 (Merck) - агонистический синтетический циклический динуклеотид - для лечения лимфомы (NCT03010176), и ADU-S100 (MIW815, Aduro Biotech/Novartis) - агонистический синтетический циклический динуклеотид - в фазе 1 (NCT02675439 и NCT03172936).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно применять в настоящем изобретении, включают ингибиторы CSF1R. Ингибиторы CSF1R, которые исследуются в клинических испытаниях, включают пексидартиниб (PLX3397, Plexxikon) низкомолекулярный ингибитор CSF1R - для лечения колоректального рака, рака поджелудочной железы, метастатического рака и раковых заболеваний на поздних стадиях (NCT02777710), и меланомы, немелкоклеточного рака легких, плоскоклеточного рака головы и шеи, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (GIST) и рака яичников (NCT02452424); и IMC-CS4 (LY3022855, Lilly) - антитело к CSF-1R - для лечения рака поджелудочной железы (NCT03153410), меланомы (NCT03101254) и солидных опухолей (NCT02718911); и BLZ945 (метиламид 4-[2((1R,2R)-2

- 13 048934 гидроксициклогексиламино)бензотиазол-6-илоксил]пиридин-2-карбоновой кислоты, Novis) - пероральный ингибитор CSF1R - для лечения солидных опухолей на поздних стадиях (NCT02829723).

Ингибиторы контрольных точек, которые можно применять в настоящем изобретении, включают ингибиторы рецептора NKG2A. Ингибиторы рецепторов NKG2A, которые проходят клинические испытания, включают монализумаб (IPH2201, Innate Pharma) - антитело к NKG2A - для лечения новообразований головы и шеи (NCT02643550) и хронического лимфоцитарного лейкоза (NCT02557516).

В некоторых вариантах реализации ингибитор контрольной точки выбран из ниволумаба, пембролизумаба, ипилимумаба, авелумаба, дурвалумаба, атезолизумаба или пидилизумаба.

Примеры

Следующие примеры иллюстрируют изобретение, описанное выше; однако они никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Полезные эффекты фармацевтических соединений, комбинаций и композиций согласно настоящему изобретению также могут быть определены с помощью других тестовых моделей, известных специалисту в данной области техники.

Пример 1.

Исследование эффективности in vivo BT1718, отдельно или в комбинации с антителом к pd-1, для лечения сингенной модели 3LL у мышей C57BL/6.

Задача исследования.

Задача исследования заключалась в оценке противоопухолевой эффективности in vivo BT1718, отдельно или в комбинации с антителом к PD-1, для лечения подкожной сингенной модели 3LL у мышей C57BL/6.

Дизайн эксперимента.

Таблица 1.1

Дизайн эксперимента

Гр	η	Вх./Вых.	Доза (мг/кг)	частота	соединение	Доза (мг/кг)	частота
1	6	Носитель		2 раза/нед.*2 недели	Носитель		2 раза/нед.*2 недели
2	6	Носитель		2 раза/нед.*2 недели	ВТ1718	3	2 раза/нед.*2 недели
3	6	Носитель		2 раза/нед.*2 недели	ВТ1718	10	2 раза/нед.*2 недели
4	6	aPD-1	10	2 раза/нед.*2 недели	Носитель		2 раза/нед.*2 недели
5	6	aPD-1	10	2 раза/нед.*2 недели	ВТ1718	3	2 раза/нед.*2 недели
6	6	aPD-1	10	2 раза/нед.*2 недели	ВТ1718	10	2 раза/нед.*2 недели

Материалы.

Животные.

Вид: Mus Musculus.

Штамм: мыши C57BL/6.

Возраст: 6-10 недель.

Пол: женский.

Масса тела: 18-22 г.

Количество животных: 36 плюс запасное.

Условия содержания.

Животных содержали в вентилируемых клетках при постоянных температуре и влажности, по 3 животных в каждой клетке.

Температура: 20~26°С.

Влажность: 40-70%.

Клетки: изготовлены из поликарбоната. Размер 300 мм х 180 мм х 150 мм. Подстилочный материал был из кукурузного початка, который меняли два раза в неделю. Питание: животные имели свободный доступ к стерилизованному облучением сухому гранулированному корму в течение всего периода иссле

- 14 048934 дования.

Вода: животные имели свободный доступ к стерильной питьевой воде.

Идентификация клетки: идентификационные этикетки для каждой клетки содержали следующую информацию: количество животных, пол, штамм, дата получения, лечение, номер исследования, номер группы и дата начала лечения.

Идентификация животного: животные были промаркированы с помощью бирки на ухе.

Испытуемые образны и положительный контроль.

Идентификация продукта: ВТ1718.

Физические свойства: лиофилизированный порошок.

Упаковка и условия хранения: хранили при температуре -80°С.

Идентификация продукта: антитело к PD-1.

Физические свойства: жидкость.

Концентрация: 11,5мг/мл.

Упаковка и условия хранения: хранили при температуре -80°С

Экспериментальные методы и процедуры клеточная культура.

Опухолевые клетки 3LL поддерживали при 37°С in vitro в виде монослойной культуры в среде с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки в атмосфере 5% CO2 на воздухе. Опухолевые клетки обычно пересевали два раза в неделю с помощью обработки трипсиномЭДТА. Клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, собирают и подсчитывают для инокуляции опухоли.

Инокуляция опухоли.

Каждой мыши инокулировали подкожно в правый бок опухолевые клетки 3LL (1 х 10⁶) в 0,1 мл PBS для развития опухоли. Животных распределяли случайным образом, и для исследования эффективности лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал приблизительно 105 мм³. Введение исследуемого образца и количество животных в каждой группе были приведены в таблице, относящейся к дизайну эксперимента (табл. 1.1).

Приготовление состава исследуемого образца.

Исследу емый образец	Конц, (мг/мл)	Состав	Буфер
Носитель 1	—	25 мМ гистидин рН7, 10% сахароза	—
Носитель 2	—	20 мМ гистидин pH 5, 5% сахароза	-
ВТ1718	1,0	Добавляют 10 мг ВТ1718 в 10 мл буфера, обрабатывают ультразвуком и встряхивают до получения прозрачного раствора.	25 мМ гистидин рН7, 10% сахароза
о,з	Добавляют 900 мкл 1,0 мг/мл ВТ1718 в 2,1 мл буфера, встряхивают до получения прозрачного раствора
0,1	Добавляют 300 мкл 1,0 мг/мл ВТ1718 в 2,7 мл буфера, встряхивают до получения прозрачного раствора
PD-1	1	Добавляют 348 мкл 11,5 мг/мл PD-1 в буферный раствор объемом 3,652 мл, встряхивают до получения прозрачного раствора.	20 мМ гистидин pH 5, 5% сахароза

Наблюдения.

Все процедуры, связанные с обращением с животными, уходом за ними и лечением в ходе исследования, проводились в соответствии с рекомендациями Ассоциации по оценке и аккредитации работы с лабораторными животными (AAALAC). В ходе рутинного мониторинга животных ежедневно проверяли на наличие какого-либо влияния роста опухоли и лечения на нормальное поведение, в частности, оценивали подвижность, потребление пищи и воды (только визуально), увеличение/потерю массы тела (массу тела измеряли каждый день), помутнение глаз/потускнение шерсти и любое другое патологическое влияние, как указано в протоколе. Смерть и наблюдаемые клинические признаки регистрировали на основании количества животных в каждой подгруппе.

Измерения опухоли и конечные точки.

Основная конечная точка заключалась в определении того, можно ли замедлить рост опухоли или можно ли вылечить мышей. Размер опухоли измеряли три раза в неделю в двух направлениях с помощью штангенциркуля, и объем выражали в мм³ по формуле: V=0,5xb² , где а и b - длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Затем указанный размер опухоли использовали для расчета значения Т/С. Значение Т/С (в процентах) является показателем противоопухолевой эффективности; Т и С - это средние объемы для группы, получавшей лечение, и контрольной группы, соответственно, в данный

- 15 048934 конкретный день.

TGI рассчитывали для каждой группы по формуле: TGI (%)=[1-(Ti-T₀)/ (Vi-V₀)]x100; Ti - средний объем опухоли в получавшей лечение группе в данный конкретный день, Т₀ - средний объем опухоли в получавшей лечение группе в день начала лечения, Vi - средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, в тот же день, что и T_i, и V₀ - средний объем опухоли в группе, получавшей носитель, в день начала лечения.

Статистический анализ.

Сводная статистика, включая среднее значение и стандартную ошибку среднего (SEM), приведена для объема опухоли в каждой группе в каждой временной точке.

Статистический анализ разницы в объеме опухоли между группами проводили на основании данных, полученных для лучшей с терапевтической точки зрения временной точки после окончательной дозы.

Для сравнения объема опухоли между группами проводили однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA), и при получении значимой F-статистики (отношение дисперсии лечения к дисперсии ошибки) проводили сравнение между группами с помощью теста Геймса-Ховелла (Games-Howell test). Все данные анализировали с использованием Prism. P < 0,05 считали статистически значимым.

Результаты.

Кривая массы тела представлена на фиг. 1.

Кривая роста опухоли показана на фиг. 2.

Изменение объема опухоли.

Средний объем опухоли с течением времени у самок мышей C57BL/6, несущих 3LL, показан в табл. 1.2.

Таблица 1.2

Изменение объема опухоли с течением времени

Г Р·	Лечение	Дни после начала лечения
0	3	7	10	14	17	21
1	Носитель, в/б, 2 раза в нед. +Носитель, в/в, 2 раза в нед.	96± 9	170 ± 14	474 ± 44	825± 105	2001 ± 289
2	Носитель, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 3 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	96± 7	167 ± 29	320 ± 71	396± 79	612± 133	968 ± 211	1177 ± 196
3	Носитель, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 10 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	96± 6	134 ± 17	141 ± 18	128± 16	132± 26	129 ± 33	104± 41
4	PD-1, 10 мг/кг массы тела, в/б, 2 раза в нед. +Носитель, в/в, 2 раза в нед.	96± 6	175 ± 14	470 ± 87	672± 161	1549 ± 423
5	PD-1, 10 мг/кг массы тела, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 3 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	96± 9	148 ± 17	196 ± 31	23 7± 68	265± 78	311 ± 93	447± 136
6	PD-1, 10 мг/кг массы тела, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 10 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	96± 6	133 ± 13	133 ± 35	104± 29	69±2 1	45± 17	36±1 3

Анализ ингибирования роста опухоли

Скорость ингибирования роста опухоли для ВТ1718 и антитела к PD-1 в сингенной модели 3LL рассчитывали на основе измерений объема опухоли на 14-й день после начала лечения.

- 16 048934

Таблица 1.3

Анализ ингибирования роста опухоли (Т/С и TGI)

Гр	Лечение	Опухоль Объем (мм³)^а	т/с^ь(%)	TGI (%)	Значение Р (относительно носителя)	ЗначениеР (относительно одной группы)
1	Носитель, в/б, 2 раза в нед.,	2001±289	-	—	—
	+Носитель, в/в, 2 раза в нед.
2	Носитель, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 3 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	612±133	30,6	72,9	р<0,001
3	Носитель, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 10 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	132±26	6,6	98,1	р<0,001
4	PD-1, 10 мг/кг массы тела, в/б, 2 раза в нед. +Носитель, в/в, 2 раза в нед.	1549±423	77,4	23,7	р>0,05
5	PD-1, 10 мг/кг массы тела, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 3 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	265±78	13,2	91,2	р<0,001	Р<0,05
6	PD-1,10 мг/кг массы тела, в/б, 2 раза в нед. +ВТ1718, 10 мг/кг массы тела, в/в, 2 раза в нед.	69±21	3,4	101,4	р<0,001	Р>0,05

а. Среднее ± SEM.

b. Ингибирование роста опухоли рассчитывали путем деления среднего объема опухоли в группе, получавшей лечение, на средний объем опухоли в контрольной группе (Т/С).

Обобщение результатов и обсуждение.

В данном исследовании оценивали противоопухолевую эффективность ВТ1718 in vivo, отдельно или в комбинации с антителом к PD-1, в сингенной модели 3LL у мышей C57BL/6. Измеренные массы тела приведены на фиг. 1. Объем опухоли для всех групп, получавших лечение, в различные моменты времени приведен в табл. 1.2 и 1.3 и на фиг. 2.

Средний объем опухоли у мышей, получавших носитель, достиг 2001 мм³ на 14 день после начала лечения. У 2/6 мышей наблюдался явный ответ на лечение антителом к PD-1, в то время как у 4/6 мышей не наблюдалось какого-либо ответа. ВТ1718 в дозах 3 мг/кг и 10 мг/кг вызывал дозозависимый противоопухолевый эффект, с размером опухоли 612 мм³ (TGI=72,9%, р<0,001) и 132 мм³ (TGI=98,1%, p<0,001). Антитело к PD-1 в комбинации с ВТ1718 в дозе 3 мг/кг и 10 мг/кг дополнительно улучшало терапевтический эффект ВТ1718, и измеренный размер опухолей составил 265 мм³ (TGI=91,2%, p<0,001 по сравне

- 17 048934 нию с носителем; р<0,05 по сравнению с ВТ1718 в дозе 3 мг/кг) и 69 мм³ (TGI=101,4%, p<0,001 по сравнению с носителем; р>0,05 по сравнению с ВТ1718 в дозе 10 мг/кг), соответственно.

В данном исследовании у всех мышей масса тела сохранялась на хорошем уровне.

Пример 2.

Исследование эффективности in vivo исследуемых образцов для лечения сингенной модели 3LL (LLC)

Цель исследования.

Целью проекта является оценка терапевтической эффективности исследуемых образцов in vivo для лечения сингенной модели 3LL (LLC) у мышей C57BL/6J.

Дизайн исследования.

Клеточная культура: опухолевые клетки 3LL поддерживают при 37°С в среде с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки в атмосфере воздуха с 5% СО2. Опухолевые клетки рутинным образом пересевают два раза в неделю.

Клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, собирают и подсчитывают для инокуляции опухоли.

Животные: C57BL/6J, самки, 6-8 недель, масса тела примерно 18-22 г.

Инокуляция опухоли: каждой мыши инокулировали подкожно в правый бок опухолевые клетки 3LL (2*10⁶) для развития опухоли. Животных распределяли случайным образом, и лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал приблизительно 80-100 мм³. Введение исследуемого образца и количество животных в каждой группе приведены в таблице ниже, относящейся к дизайну эксперимента.

Дизайн эксперимента.

Группа	Лечение	Доза (мг/кг)	N	Способ дозиро вания	График
1	Носитель	-	10	в/в	2 раза в нед.*4 недели
2	ВТ1718	4,8	10	в/в	1 раз в нед.*4 недели (2 недели единичной дозы + 2 недели комбинированной терапии с анти-PDl)
3	Анти-PD-l	10	10	в/б	2 раза в нед.*4 недели (2 недели единичной дозы + 2 недели комбинированной терапии с ВТ 1718)
4	ВТ1718 + Анти-PD1	4,8 + 10	10	в/в + в/б	1 раз в нед.4 недели + 2 раза в нед.4 недели

Примечание.

В/В / В/Б инъекция: объем инъекции для каждой мыши составляет 10 мл/кг.

Продленное наблюдение: продление на 2 недели для групп 2, 3, 4 после 28 дней лечения.

Изменение графика: группам 2, 3 добавили бы антитело к PD-1 или ВТ1718, когда у группы TV, получавшей наполнитель, было бы достигнуто значение 2000 мм³ (примерно через 2 недели после первого введения дозы).

Содержание животных: для адаптации животных к лабораторной среде между поступлением животных и инокуляцией опухоли допускался акклиматизационный период продолжительностью примерно одну неделю. Мышей содержат в специальной беспатогенной среде в отдельных вентилируемых клетках (по 5 мышей в клетке). Все клетки, подстилки и воду стерилизуют перед применением. При работе в комнате, где содержатся мыши, исследователи носят лабораторный халат и латексные или виниловые перчатки. Каждую клетку четко маркируют с помощью идентификационной карточки, где указаны количество животных, пол, штамм, дата получения, лечение, номер исследования, номер группы и дата начала лечения. Клетки с пищей и водой меняют два раза в неделю. Заданные условия окружающей среды в помещении, где содержатся животные, и период освещенности являются следующими:

температура 20~26°С;

влажность 40~70 %;

световой цикл 12 ч света и 12 ч темноты.

Пищевые материалы: все животные имеют свободный доступ к стандартной сертифицированной

- 18 048934 коммерческой лабораторной пище. Предельно допустимые концентрации загрязняющих веществ в рационе контролируются и регулярно анализируются производителями. Автоклавированная водопроводная вода, подходящая для употребления человеком, доступна животным ad libitum. Считается, что в пищевых материалах не содержится известных загрязняющих веществ, которые могли бы влиять на рост опухоли.

Распределение по группам: Перед началом лечения всех животных взвешивают и измеряют объемы опухоли. Поскольку объем опухоли может влиять на эффективность любого выбранного лечения, мышей распределяют по группам с использованием рандомизированного блочного плана на основе объема опухоли у них. Это гарантирует, что все группы сопоставимы на исходном уровне.

Наблюдения: Протокол и любые изменения или процедуры, связанные с уходом за животными и их использованием в данном исследовании, рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC). В ходе исследования уход за животными и их использование осуществляют в соответствии с правилами Ассоциации по оценке и аккредитации работы с лабораторными животными (AAALAC). После инокуляции проверяют заболеваемость и смертность среди животных. В ходе рутинного мониторинга животных проверяют на наличие какого-либо влияния роста опухоли и лечения на нормальное поведение, в частности, оценивают подвижность, потребление пищи и воды, помутнение глаз/потускнение шерсти и любое другое патологическое влияние. Смерть и наблюдаемые клинические проявления регистрируют на основании количества животных в каждой подгруппе.

Объем опухоли выражают в мм³ по формуле: V = 0,5 а х b² , где а и b - длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно.

Завершение.

1. Потеря массы тела: любое животное, у которого потеря массы тела в любой день составит 20%, будет гуманно умерщвлено или показано ветеринарам.

2. Опухолевая нагрузка: опухолевая нагрузка не должна превышать 10% от массы тела животного. Исследование прекращали, и всех животных умерщвляли, когда средний объем опухоли у контрольной группы, получавшей носитель, достигал значения 2000 мм³.

Изъязвление: при возникновении изъязвления опухоли применяются следующие процедуры.

Животных с изъязвленными опухолями проверяют не реже 3 раз в неделю с возрастающей частотой, вплоть до ежедневной проверки, в зависимости от клинических проявлений.

Изъязвленные опухоли, которые не покрылись коркой, следует промывать подходящим раствором для очистки ран (например, Новалсаном). Крем с антибиотиком следует наносить на изъязвление/поражение только по указанию ветеринаров.

Критерии для эвтаназии включают следующие - если поражение:

не заживает или не покрывается коркой в течение 1 недели;

более 5 мм в диаметре;

становится кавернозным.

Демонстрирует признаки развивающейся инфекции (например, наличие гноя) или кровотечения, или если животное демонстрирует признаки дискомфорта (например, чрезмерно вылизывает и выкусывает это место) или системные симптомы заболевания (вялость, снижение активности, снижение потребления пищи, снижение физических показателей или потерю веса). Свяжитесь с ветеринарным персоналом, чтобы обсудить любые возможные исключения.

3. Клинические признаки: Животные должны быть подвергнуты эвтаназии, если у них обнаружена агония (за исключением случаев, когда IACUC выдано специальное разрешение с достаточным обоснованием, которое должно быть включено в протокол, и обеспечен усиленный поддерживающий уход, такой как теплые растворы для подкожного введения (SQ fluids), миска с питательным гелем рядом с животным, чтобы оно могло дотянуться до пищи, клетка с подогревом для обеспечения дополнительного тепла и т. д.). Примечание: состояние агонии указывает на то, что животное вряд ли выживет.) По вопросам, касающимся этих конечных точек, обращайтесь к ветеринарному персоналу. Клинические примеры болезненного состояния могут включать:

съеживание;

по стоянное нахождение в лежачем положении и отсутствие реакции на манипуляции или другие раздражители;

пр изнаки тяжелой органной или системной недостаточности;

исхудание;

гипотермию;

со стороны ЦНС: судороги;

со стороны дыхательной системы: быстрое дыхание, затрудненное дыхание, кашель, хрипы;

со стороны желудочно-кишечного тракта: диарею продолжительностью > 2 дней, желтуху.

Любое животное, у которого наблюдаются вышеуказанные клинические проблемы, гуманно умерщвляют с помощью CO2.B случае неожиданной смерти аутопсия не проводится. Количество животных: 27 мышей плюс запасная.

Примечание.

- 19 048934

В случае исследований, направленных на оценку эффективности или переносимости/ исследований МИД тяжелые клинические проявления и ПМТ (потерю массы тела) у участвующих в исследовании животных регистрируют в файлах обновления данных, которые отправляют руководителю исследования три раза в неделю, при этом ПМТ более 10, 15 и 20% от первого измерения помечают разными цветами.

В клетке, в которой содержатся любые животные с ПМТ более 10% должен быть обеспечен питательный гель.

Информация об испытуемых образцах.

ВТ1718: лиофилизированный порошок; упаковка и условия хранения: -80°С.

Состав на основе носителей и ТА.

Соединение	Конц, (мг/мл)	Состав
Носитель	-	25 мМ гистидин, 10% сахароза, pH 7
ВТ1718	0,48	порошок растворяют в гистидиновом буфере
Антитело к PD-1	1	Разбавляют PD-1 АЬ физиологическим раствором

Противоопухолевая активность и процент выживаемости показаны на фиг. 3. Показатели выживаемости в группах, получавших комбинацию ВТ1718/ингибитора контрольной точки, были значительно лучше по сравнению с лечением любым из этих агентов в отдельности.

Пример 3.

Оценка эффективности BT17BDC-18, отдельно и в комбинации с анти-mPD-1, в отношении установленной ортотопической мышиной карциномы молочной железы Е0771 у самок мышей C57BL/6.

Цель данного исследования заключалась в оценке противораковой активности BT17BDC-18, отдельно и в комбинации с анти-mPD-1, в отношении установленной ортотопической мышиной карциномы молочной железы Е0771 у самок мышей C57BL/6.

Исследуемые агенты и носители:

BT17BDC-18:

физические свойства: прозрачный бесцветный раствор;

концентрация: 0,96 мг/мл;

условия хранения: -80°С;

носитель: 25 мМ гистидин / 10% сахароза в воде;

состав с высокой дозой 0,62 мг/мл; рН состава: 6.6;

описание состава: прозрачный бесцветный раствор;

объем дозы 0,2 мл/20 г;

хранение: дозировали сразу после приготовления.

Примечание:

группы 2 и 6 получали дозу 6,2 мг/кг;

группы 3 и 7 получали дозу 4,8 мг/кг.

Для получения дозировки BT17BDC-18, равной 6,2 мг/кг, маточный раствор с концентрацией 0,96 мг/мл разбавляли путем добавления 2,125 мл носителя к 3,875 мл 0,96 мг/мл маточного раствора с получением раствора с концентрацией 0,62 мг/мл

Для получения дозировки BT17BDC-18, равной 4,8 мг/кг, маточный раствор с концентрацией 0,96 мг/мл разбавляли 1:1 носителем с получением раствора с концентрацией 0,48 мг/мл.

Паклитаксел: белый гигроскопичный порошок;

хранение: -20°С;

носитель: 10% EtOH/10% кремафор/ 80% физиологический раствор;

состав с высокой дозой: 1,5 мг/мл; рН состава: 5,5;

хранение: дозировали сразу после приготовления;

объем дозы 0,2 мл/20 г.

Антитело к мышиному PD-1 (клон: RMP1-14):

концентрация: 7,24 мг/мл;

хранение: 4°С, в защищенном от света месте;

носитель: фосфатно-солевой буфер (PBS);

состав с высокой дозой: 1 мг/мл;

состав: рН 7,3;

хранение: 4°С;

- 20 048934 объем дозы: 0,2 мл/20 г.

Животные и содержание.

Все процедуры, проводимые в этом эксперименте, были проведены с соблюдением всех применимых законов, постановлений и руководящих принципов Национальных Институтов Здоровья (НИЗ) и с одобрения Комитета по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных при MI Bioresearch (MI Bioresearch's Animal Care and Use Committee). MI Bioresearch является аккредитованным центром AAALAC.________________________

Вид	Мышь
Штамм	Мышь C57BL/6 (C57BL/6J)	Пол	Женский
Возраст на момент имплантации	6-7 недель	В исследовании/Всего	76/152
Питание	Корм для грызунов Teklad 2918.15	Вода	Ad libitum
Добавки	Не применимо	Натощак	Не применимо
Акклиматизация	9 дней	Содержание	Инновационная одноразовая вентилируемая клетка с подстилкой из кукурузного початка внутри чистых зон Biobubble® Clean Rooms
Животные/клетку	4 мыши	Световой цикл	12/12ч
Темп.	70±2°F (примерно 2ГС)	Влажность воздуха	30-70%
Метод идентификации	Перфорация уха	Частота взвешивания	3 раза в неделю
Частота измерения	3 раза в неделю	Средняя масса (D15)	19,2 г (диапазон средних значений по группе, 18,5-19,6 г)

Мин. масса тела (D15)	16,6 г	Хирургические вмешательства	Не применимо
Введена в исследование при	105 мм³ (диапазон значений в группе - 102-107 мм³), день 15	Умерщвлена при	Объем опухоли >2000 мм³, или завершение исследования по требованию клиента(день 60)
Аутопсия	Да	Проверка состояния здоровья	Ежедневно
Коммент арии	Группу 9 не учитывали при оценке объема опухолей в начале исследования, поскольку критерии отбора в эту группу были иными. Группа 9 была включена при сборе образцов, 6 опухолей <250 мм³ и еще 6 опухолей >500 мм³.

- 21 048934

Приготовление клеток/имплантация.

Модель	Е0771	Гистотип	Мышиная карцинома молочной железы
Тип имплантата	Клетки
Среды	Среда RPMI 1640, модифицированная 1 мМ пируватом Na, 10 мМ буфером HEPES, 2,8 мл 45% глюкозы (1,25 г) и 1% GlutaMAX (Gibco) с добавлением 10% нетермоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (FBS) и IX пенициллина/стрептомицина/ L-глутамина (PSG)	Раствор для диссоциации	0,25% трипсина /2,21 мМЭДТА bHBSS
Путь	Ортотопический	Расположение	Жировая прослойка
			молочной железы №4
Инокулят	1,0Е+06 трипан-вытесняющих клеток (trypan-excluding cells)	Среда для имплантата	Бессывороточна я среда RPMI 1640
Матригель	Не применимо	Инъец. объем	50 мкл
Жизнеспособность (до)	94%	Жизнеспособность (после)	91%
Комментарии	Мышам делали легкую анестезию путем ингаляции изофлурана/кислорода, и сбривали шерсть над местом имплантации с помощью машинки для стрижки волос за 48 часов до имплантации. Мышам также делали легкую анестезию при имплантации опухоли.

Лечение.

Всех мышей рассортировывали по группам на основании опухолевой нагрузки, которую оценивали с помощью измерения штангенциркулем. Мышей распределяли таким образом, чтобы средняя опухолевая нагрузка для всех групп находилась в пределах 10% от общей средней опухолевой нагрузки для исследуемой популяции.

Группа	N	Лечение	Доза	Введ.	Схема введ.	Дни лечения
1	8	Носитель Контроль	0,2 мл/20 г	ВВ	1 р/7 дн.х4	Дни 15, 22, 29 и 36
2	8	BT17BDC-18	6,2 мг/кг	вв	1 р/7 дн.х4	Дни 15, 22, 29 и 36
3	8	BT17BDC-18	4,8 мг/кг	ВВ	1 р/7 дн.х4	Дни 15, 22, 29 и 36
4	8	Паклитаксел	15 мг/кг	вв	1 р/7 дн.х4	Дни 15, 22, 29 и 36
5	8	анти-mPD-l	10 мг/кг	ВБ	(1 р/3 дн.х2; 2 дня без)х2	Дни 15,18, 21 и 24
6	8	BT17BDC-18 + анти-mPD-l	6,2 мг/кг + 10 мг/кг	ВВ + ВБ	1 р/7 дн.х4 + (1 р/3 дн.х2; 2 дня без)х2	Дни 15, 22, 29 и 36 + Дни 15,18, 21 и 24
7	8	BT17BDC-18 + анти-mPD-l	4,8 мг/кг -ΙΙΟ мг/кг	ВВ + ВБ	1 р/7 дн.х4 + (1 р/3 дн.х2; 2 дня без)х2	Дни 15, 22, 29 и 36 + Дни 15,18, 21 и 24
8	8	Паклитаксел + анти-mPD-l	15 мг/кг -ΙΙΟ мг/кг	ВВ + ВБ	1 р/7 дн.х4 + (1 р/3 дн.х2; 2 дня без)х2	Дни 15, 22, 29 и 36 + Дни 15,18, 21 и 24
9	12	Без лечения	Н/П	Н/П	Н/П	Н/П

-22048934

Сбор образцов.

Группа(ы)	Животные	Ткань(и)	Врем, точки	Продукт	Описание
9	1-12	Опухоль	Объем опухоли <250 мм³и >500 мм³	Замороженная опухоль или FFPEблоки	Были собраны и обработаны: 6 опухолей при малом размере опухоли (<250 мм³) и остальные 6 опухолей - при большом размере (>500 мм³).
Комментар ИИ	Из каждого диапазона опухолей 3 опухоли помещали в 10% NBF, фиксировали в течение 24-48 часов, а затем превращали в FFPE-блоки. Остальные 3 опухоли подвергали шоковой заморозке жидким азотом и хранили при -80°С. (См. Приложение 9)

Фармакология и конечные точки визуализации.

Тип данных	Метод	Основная конечная точка 1	Основная конечная точка 2	Основная конечная точка 3
Фармакология	Штангенциркуль	Время до прогрессирования	Медианное АТ/АС (день 36)	%CR, PR и TFS
Масштабировани е и клинические наблюдения	Изменение массы тела, связанное с лечением (%)	Гибель, связанная с лечением (%)

Результаты.

Рост опухоли/общие наблюдения/контроль.

Средняя расчетная опухолевая нагрузка для всех групп в эксперименте в первый день лечения составила 105 мм³, и все группы в эксперименте были хорошо сопоставимы (диапазон средних значений для групп составлял 102-107 мм³). Все животные весили не менее 16,6 г в начале терапии. Средние значения массы тела в группах при первом лечении также были хорошо сопоставимы (диапазон средних значений для групп составлял 18,5-19,6 г). Для оценки эффективности по времени до прогрессирования (время до эвтаназии/смерти) была выбрана опухолевая нагрузка 2000 мм³.

В контрольной группе медианное время до прогрессирования составило 22,3 дня, а медианное время удвоения объема опухоли составило 4,9 дня. У контрольных животных наблюдалось среднее увеличение массы тела на 1,7 г (9,5%) в ходе лечения. Спонтанных регрессов в контрольной группе не наблюдалось. Все тиогликолятные культуры клеток, использовавшиеся для имплантации в данном исследовании, были отрицательными на наличие заметного бактериального загрязнения.

Вся эта информация соответствовала статистическим нормам, и эксперимент был признан технически удовлетворительным, а данные пригодными для оценки.

Глоссарий.

День 0 - день, когда имплантируют опухоли (не путать с 1-м днем лечения, который всегда указан относительно дня 0).

Летальные исходы, связанные с лечением (%) - предполагается, что гибель животного связана с лечением, если животное обнаружено мертвым или подвергнуто эвтаназии в состоянии агонии во время или в течение двух недель после последнего лечения с опухолевой нагрузкой менее половины наименьшей летальной опухоли в контрольной группе, и только если при аутопсии у указанного животного нет признаков инфекции, механической травмы, связанной с дозированием, или других очевидных причин заболеваемости. Из этого расчета исключаются животные, подвергшиеся эвтаназии в течение того же периода по другим причинам (сбор образцов, случайная травма и т.д.). Это обозначение призвано помочь идентифицировать животных, которые могли пострадать от токсичности, вызванной лекарственным препаратом, но оно не подразумевает непосредственной причинно-следственной связи. (Групповой параметр токсичности)

Изменение массы тела, связанное с лечением - это групповая конечная точка, рассчитанная на основании средних значений массы тела в группе. Она рассчитывается по-разному в зависимости от конкретных обстоятельств следующим образом:

Если (в любой момент между первым днем лечения и двумя неделями после заключительного лечения) средняя масса тела для группы уменьшается более чем на 2%, сообщается о максимальной потере массы тела, даже если масса тела в конечном итоге восстанавливается во время лечения до чистого прироста массы тела. В особом случае возвращения к чистому приросту указанное восстановление подробно фиксируется в разделе результатов.

Если средняя масса тела для группы не уменьшается более чем на 2% в любой момент, изменение массы тела регистрируется как разница между массой тела в первый день лечения и массой через две недели после окончания лечения.

- 23 048934

Обратите внимание, что продолжительность лечения может варьироваться в зависимости от группы, поэтому при прямом сравнении прироста массы тела (в частности) это нужно учитывать.

Когда имеет место потеря массы тела, в моделях, в которых обычно происходит потеря массы тела, индуцированная прогрессированием опухоли, на изменение массы тела влияют несколько факторов. Для оценки вклада исследуемых агентов в потерю массы тела можно использовать чистую потерю массы тела, связанную с лечением. Это делается двумя различными способами в зависимости от степени эффективности, наблюдаемой в исследовании.

Когда эффективность не очевидна, чистую потерю массы тела рассчитывают путем вычитания средней потери массы тела в контрольной группе из средней потери массы тела в группе, получавшей лечение, в каждый день исследования.

Когда эффективность заметна, разница в опухолевой нагрузке между контрольной группой и группой, получавшей лечение, может быть очень значительной. В этом случае чистую потерю массы тела рассчитывают путем нормализации опухолевой нагрузки. Мы делаем это путем построения графика зависимости средней опухолевой нагрузки для контрольной группы относительно средней потери массы тела для контрольной группы, используя все данные по массе тела, доступные для контрольной группы. (Как правило, проще всего использовать логарифмические/линейные графики зависимости опухолевой нагрузки относительно потери массы тела.) В любой конкретный день исследования чистую потерю массы тела в группе, получавшей лечение, оценивают путем поиска значения средней опухолевой нагрузки в группе, получавшей лечение, на референсном графике для контрольной группы и считывания предполагаемой/ожидаемой потери массы тела из-за опухолевой нагрузки. Затем это значение вычитают из средней потери массы тела в группе, получавшей лечение, и получают чистую потерю массы тела для группы, получавшей лечение, в этот день. Рассчитанную таким образом чистую потерю массы тела затем используют для оценки толерантности к лекарственному средству.

Эффективность.

АС и AT представляют собой конечные точки для конкретной мыши, которые рассчитывают для каждой мыши следующим образом:

ΔΤ = Tt-To и ЛС = С_гСо, где T_t и Т₀ представляют собой значения опухолевой нагрузки у мыши, получавшей лечение, в момент времени t или в начале дозирования, соответственно. ΔС отражает аналогичные расчеты для контрольных мышей.

Медианное ΔT/ΔC является групповой конечной точкой. Оно рассчитывается для каждого дня лечения как:

Медианное £1 ₌ . 100 = Ft) . ₁₀₀

ДС \&C_medJ \ Медиан (C_f — %)/

Результаты представлены в %. Когда медианное ΔT/ΔС отрицательно (медианная опухолевая нагрузка в ходе лечения регрессирует), медианное ΔT/ΔС не регистрируют, а вместо этого регистрируют медианный % регресса.

% регресса является групповой конечной точкой. Он показывает процент снижения медианного объема опухоли по сравнению с исходным уровнем. Его рассчитывают как:

% Регресса = — f ] * 100 \Т₀ med)

Время до достижения оцениваемого размера (Time to Evaluation Size, TES) - TES представляет собой конечную точку для конкретной мыши и выражается в днях с момента имплантации опухоли. Это время, за которое опухолевая нагрузка достигает конкретного значения, и его можно рассчитать с помощью любого метода оценки опухолевой нагрузки (измерения с помощью штангенциркуля, биолюминесцентной визуализации (BLI), анатомической визуализации и т.д.). Его рассчитывают с помощью логарифмической линейной интерполяции между двумя ближайшими точками данных, между которыми находится выбранная опухолевая нагрузка.

где DES=TESi - день, когда опухоль достигла оцениваемого размера;

Dh - день, когда было достигнуто первое измеренное значение, большее чем ES;

D_r день, когда было достигнуто последнее измеренное значение перед ES;

Fh - объем опухоли в день Dh;

Vl - объем опухоли в день Dp

ES - оцениваемый размер.

Время до прогрессирования (Time to Progression, TP) - время до прогрессирования используется вместо продолжительности жизни или представляет собой время нахождения в исследовании или продолжительность жизни. Его используют в исследованиях, которые согласно нормам IACUC предусмат

- 24 048934 ривают обязательную эвтаназию животных в случае чрезмерной опухолевой нагрузки (даже если животные в остальном выглядят нормальными). Нормированный предел опухолевой нагрузки зависит от опухолевой модели. Данные о ТР анализируют методами Каплана-Мейера так же, как и традиционные данные о продолжительности жизни. Время до прогрессирования для отдельного животного - это количество дней между началом лечения и смертью или требуемой эвтаназией этого животного. (День первого лечения представляет собой день первого лечения в исследовании в целом и не является специфичным для рассматриваемой группы.) Когда чрезмерная опухолевая нагрузка предполагает эвтаназию (обычно >2000 мм³, но зависит от модели), день эвтаназии рассчитывают на основе логарифмической линейной интерполяции между ближайшими точками данных по обе стороны от предела опухолевой нагрузки, а не на основе фактического дня эвтаназии. Это ставит всех животных в равные условия и устраняет влияние возможной задержки эвтаназии (которая может быть обусловлена сбором образцов или выходными или праздничными днями). Животные, подвергнутые эвтаназии для запланированного сбора образцов или по другим причинам, не связанным с прогрессированием заболевания или терапией, исключаются из этого расчета. Медианное время до прогрессирования для группы используют для расчета % увеличения времени до прогрессирования (% Increase in Time to Progression, %ITP). Обратите внимание, что продолжительность жизни и время до прогрессирования являются взаимоисключающими конечными точками и не могут быть использованы в одном и том же исследовании. Кроме того, TES и ТР не идентичны, даже если оцениваемый размер, выбранный для каждого из них, идентичен. Они отличаются тем, что ТР включает животных, которые умирают (по не посторонним причинам) во время исследования, так и не достигнув выбранной ES, что обеспечивает более сбалансированное отображение терапевтического результата.

% Увеличения времени до прогрессирования (%ITP) - %ITP является групповой конечной точкой. Его рассчитывают как:

([ (Медианное ТР с лечением) _ (Медианное ТР. контроль) 1) %ITS = {---------------------------------------4 * 100 ( Медианное ТР. контроль )

Время удвоения опухоли (Td) - Td представляет собой индивидуальный и групповой параметр, обычно выражаемый как медианное Td группы. Оно измеряется в днях. Td можно рассчитать на основе любого типа данных об объеме (измерения штангенциркулем, сигналов BLI и т.д.). Для целей КК его рассчитывают для экспоненциальной части кривой роста опухоли. Точки данных для любого периода задержки и поздней стадии гомперциана не включают. Типичные пределы опухолевой нагрузки находятся в диапазоне от 100 до 1000 мм³, но фактический выбор зависит от конкретных данных. Td рассчитывают для каждой мыши из лучшего совпадения по методу наименьших квадратов для логарифмического/линейного графика зависимости опухолевой нагрузки от дня, следующим образом:

В редких случаях медианное Td используют в качестве потенциального показателя эффективности. Таким образом, оно рассчитывается как медиана для каждой группы в течение конкретного диапазона дней, который, как полагают, отражает период ответа на терапию. Регресс опухоли

Полный регресс (Complete Regression, CR) - считается, что у животного наступил полный регресс, если его опухолевая нагрузка снижается до неопределяемого объема в любой момент времени после первого лечения. Мы договорились регистрировать любое измеренное значение опухоли менее 5 мм как 0. CR должен оставаться на протяжении не менее 2 последовательных измерений. Это согласуется с правилами Национального института рака (NCI) и отражает неизбежную и недопустимо высокую механическую погрешность при таких измерениях, а также неопределенную биологическую природу измеряемого при таких малых размерах. (Индивидуальный параметр эффективности)

Частичный регресс (Partial regression) - считается, что у животного наступил частичный регресс, если его опухолевая нагрузка снижается до менее половины от опухолевой нагрузки при первом лечении. PR должен оставаться на протяжении не менее 2 последовательных измерений для исследований, проводимых с использованием штангенциркуля. (Для исследований, проводимых с использованием BLI, указанное подтверждение не требуется вследствие динамического диапазона измерений и как правило более длительных интервалов между визуализациями.) Регистрируемые PR не включают CR, и, таким образом, животное, у которого достигнут CR, не учитывается как достигшее PR. (Индивидуальный параметр эффективности)

Выживший без опухоли (Tumor-free Survivor, TFS) - TFS - это любое животное, которое (1) доживает до завершения исследования и (2) не имеет достоверно измеримых признаков заболевания на момент завершения исследования. Мыши, которые в какой-то момент исследования не имели опухолей, но затем были подвергнуты эвтаназии для сбора образцов или для других целей до окончания исследования, не считаются TFS. Они исключены из расчета %TFS. Статус TFS не означает излечение.

Данные.

ВТ1718 с антителом к PD-1 приводит к повышенной противоопухолевой активности по сравнению с монотерапией. Изменение объема опухоли после лечения показано на фиг. 4.

В целом все схемы лечения переносились животными. Было зарегистрировано два летальных исхо

- 25 048934 да как в контрольной группе, получавшей носитель, так и в группе, получавшей паклитаксел в качестве монотерапии (15 мг/кг). Эти летальные исходы считались неспецифическими, и при аутопсии наблюдалась та же картина, что и у мышей с поздней стадией заболевания. Тем не менее, лечение не может быть полностью исключено из возможных причин смерти. В контрольной группе, получавшей носитель, был один летальный исход, который произошел сразу после инъекции и, вероятно, был вызван технической ошибкой дозирования.

Монотерапия BT17BDC-18 в дозе 6,2 мг/кг или 4,8 мг/кг была умеренно эффективной, обеспечивая увеличение времени до прогрессирования на 10,5 дня (47,1%) и 6,6 дня (29,4%) и медианные значения ΔT/ΔС на день 36, равные 38% и 72%, соответственно. Лечение с помощью BT17BDC-18 не привело к каким-либо регрессам или каким-либо выжившим без опухолей.

Лечение антителом к mPD-1 в дозе 10 мг/кг было неэффективным, обеспечивая увеличение времени до прогрессирования на 0,2 дня (0,7%) и медианное значение ΔT/ΔС на день 36, равное 121%. Активность, обусловленная лечением антителом к mPD-1, согласуется со статистическими данными MI Bioresearch.

Лечение с помощью BT17BDC-18 в дозе 6,2 мг/кг или 4,8 мг/кг в комбинации с антителом к mPD-1 в дозе 10 мг/кг было несколько более эффективным, чем лечение любым из них в отдельности, обеспечивая увеличение времени до прогрессирования на 13,2 дня (59,0%) и 7,7 дня (34,5%) и медианные значения ΔT/ΔС на день 36, равные 27 и 54%, соответственно. Каждое комбинированное лечение привело к 12,5% (1/8) случаев полного регресса. Комбинация BT17BDC в дозе 6,2 мг/кг с антителом к mPD-1 также приводила к частоте 12,5% (1/8) случаев выживших без опухолей.

Лечение паклитакселом в дозе 15 мг/кг было умеренно активным, обеспечивая увеличение времени до прогрессирования на 4,0 дня (17,9%) и медианное значение ΔT/ΔC на день 36, равное 94%.

Лечение паклитакселом в дозе 15 мг/кг в комбинации с антителом к mPD-1 в дозе 10 мг/кг приводило к активности, аналогичной монотерапии паклитакселом, обеспечивая увеличение времени до прогрессирования на 3,5 дня (15,5%) и медианное значение ΔT/ΔС на день 36, равное 94%.

Пример 4.

Исследование эффективности IN VIVO BT1718 И анти-CTLA4 для лечения сингенной модели СТ26 у мышей BALB/C.

Задача исследования.

Задача исследования заключалась в оценке противоопухолевой эффективности in vivo BT1718 и анtu-CTLA4 в сингенной модели СТ-26 у мышей BALB/c.

Дизайн эксперимента. ___________________________________________________

Группа	Лечение	η	Доза (мг/кг)	Объем дозирования (мкл/г)	Способ дозирования	График
1	Носитель	10	—	10	Вв	1 раз в нед.х2 недели
2	ВТ1718	10	6,4	10	Вв	1 раз в нед.хЗ недели
3	анти- CTLA4	10	10	10	В/б	2 раза в нед.*4 недели
4	ВТ1718 + антиCTLA4	10	6,4 + 10	10	В/в + в/б	1 раз в нед. + 2 раза в нед. 4 недели

*Мышей из группы 3 и 4 оставляли под наблюдением после 4 недель лечения, и иммунную систему повторно стимулировали клетками СТ-26 на 62-й день.

Материалы.

Животные и условия содержания.

Животные для оценки эффективности.

Вид: Mus Musculus.

Штамм: BALB/C.

Возраст: 6-8 недель (эффективность), 17-20 недель (повторная антигенная стимуляция).

Пол: женский.

Масса тела: 18-22 г (эффективность), 25-30 г (повторная антигенная стимуляция).

Количество животных: 40 мышей плюс запасная.

Животные для контрольной группы повторной антигенной стимуляции.

- 26 048934

Группа 5.

Вид: Mus Musculus.

Штамм: BALB/c.

Возраст: 19-21 неделя.

Пол: женский.

Масса тела: 22-26 г.

Количество животных: 10 мышей.

Группа 6.

Вид: Mus Musculus.

Штамм: BALB/c.

Возраст: 11-12 недель.

Пол: женский.

Масса тела: 21-25 г.

Количество животных: 10 мышей.

Условия содержания.

Мышей содержали в отдельных вентилируемых клетках при постоянной температуре и влажности, по 5 животных в каждой клетке.

Температура: 20~26°С.

Влажность 40-70%.

Клетки: изготовлены из поликарбоната. Размер 300 мм х 180 мм х 150 мм. Подстилочный материал был из кукурузного початка, который меняли два раза в неделю.

Питание: животные имели свободный доступ к стерилизованному облучением сухому гранулированному корму в течение всего периода исследования.

Исследуемые образцы.

Идентификация продукта: ВТ1718.

Молекулярная масса: 3511,38.

Чистота: 97,70%.

Упаковка и условия хранения: хранился при температуре -80°С.

Идентификация продукта: Анти-СТ1А4.

Физические свойства: 8,71 мг/мл.

Упаковка и условия хранения: хранился при температуре 4°С.

Экспериментальные методы и процедуры.

Клеточная культура.

Клетки СТ-26 поддерживали при 37°С в среде с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки в атмосфере воздуха с 5% CO₂. Опухолевые клетки рутинным образом пересевали два раза в неделю. Клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, собирали и подсчитывали для инокуляции опухоли.

Инокуляция опухоли.

Каждой мыши инокулировали подкожно в правый бок опухолевые клетки СТ-26 (3.0х10⁵) в 0,1 мл PBS для развития опухоли. Животных распределяли случайным образом, когда средний объем опухоли достигал 66 мм³. Введение исследуемого образца и количество животных в каждой группе были приведены в таблице, относящейся к дизайну эксперимента.

Через 4 недели лечения и ~4 недели мониторинга мышам в группе 3 и 4 инокулировали подкожно в левый бок опухолевые клетки СТ-26 (3,0х10⁵) в 0,1 мл PBS для повторного стимулирования иммунной системы. Каждой мыши инокулировали подкожно в правый бок фрагмент опухоли (30 мм³) для развития опухоли. Лечение начинали, когда средний объем опухоли достигал 164 мм³.

Исслед. образец	Конц. (мг/мл)	Состав
Носитель	-	25 мМ Гистидин 10% сахароза pH 7
анти-СТЬА4	1	Разбавляют 689 мкл 8,71 мг/мл анти-СТГА-4 5,31 мл PBS
ВТ1718	0,64	Растворяют 22,3 мг ВТ1718 в 34 мл Гис-буфера*
*Гис-буфер: 25 мМГистидин 10% сахароза pH 7

Наблюдения.

Все процедуры, связанные с обращением с животными, уходом за ними и лечением в ходе исследо- 27 048934 вания, проводились в соответствии с рекомендациями, одобренными Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных (IACUC), согласно руководству Ассоциации по оценке и аккредитации работы с лабораторными животными (AAALAC). В ходе рутинного мониторинга животных ежедневно проверяли на наличие какого-либо влияния роста опухоли и лечения на нормальное поведение, в частности, оценивали подвижность, потребление пищи и воды (только визуально), увеличение/потерю массы тела, помутнение глаз/потускнение шерсти и любое другое патологическое влияние, как указано в протоколе. Смерть и наблюдаемые клинические признаки регистрировали на основании количества животных в каждой подгруппе.

Измерения опухоли и конечные точки.

Основная конечная точка заключалась в определении того, можно ли замедлить рост опухоли или можно ли вылечить мышей. Размер опухоли измеряли три раза в неделю в двух направлениях с помощью штангенциркуля, и объем выражали в мм³ по формуле: V = 0,5 а х b², где а и b - длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно. Затем указанный размер опухоли использовали для расчета значения Т/С. Значение Т/С (в процентах) является показателем противоопухолевой эффективности; Т и С это средние объемы для группы, получавшей лечение, и контрольной группы, соответственно, в данный конкретный день.

TGI рассчитывали для каждой группы по формуле: TGI (%)=[1-(T1-T₀)/(Vi-V₀)]x100; Ti - средний объем опухоли в получавшей лечение группе в данный конкретный день, Т₀ - средний объем опухоли в получавшей лечение группе в день начала лечения, V_i - средний объем опухоли в контрольной группе, получавшей носитель, в тот же день, что и T_i, и V₀ -средний объем опухоли в группе, получавшей носитель, в день начала лечения.

Статистический анализ

Для сравнения объема опухоли между группами проводили однофакторный дисперсионный анализ (one-way ANOVA), и при получении значимой F-статистики (отношение дисперсии лечения к дисперсии ошибки) проводили сравнение между группами с помощью теста Геймса-Ховелла (Games-Howell test). Ткритерий использовали для сравнения разницы между 2 группами. Все данные анализировали с использованием GraphPad 5.0. Р < 0,05 считали статистически значимым.

Результаты.

Изменение объема опухоли после лечения показано на фиг. 5.

Средний объем опухоли во время лечения у самок мышей BALB/c с опухолями СТ26 приведен в табл. 4.1.

Таблица 4.1

	Группа 1	Г руппа 2	Группа 3	Группа 4
Дни	Носитель,	ВТ1718, 6,4	анти-СТГА4,	10 ВТ1718+
	1 р/нед.	мг/кг, 1 р/нед.	мг/кг, 2 р/нед.	анти-СТГА4
0	66±8	66±7	66±8	66±7
3	211±22	216±28	208±20	208±28
5	373±43	361±52	318±34	290±43
7	581±64	499±73	399±52	341±56
10	993±120	740±95	487±75	369±68
12	1433±181	848±124	461±84	269±58
14	2090±281	110Н170	468±94	250±62
17		1364±212	439±117	168±48
19		1730±284	430±130	132±45
21		2198±367	421±156	97±32
24			447±190	66±24
26			554±249	61 ±25
28			659±316	62±26

Анализ ингибирования роста опухоли.

Скорость ингибирования роста опухоли для ВТ1718 и антитела к CTLA4 в сингенной модели СТ-26

- 28 048934 рассчитывали на основе измерений объема опухоли на 14-й день после начала лечения.

Таблица 4.2

Анализ ингибирования роста опухоли

Группа	Лечение	Объем Опухоли (мм³)¹	Т/С^ь (%)	TGI (%)	Р-значение (отн. носителя)	Р-значение (отн. комбинации)
1	Носитель, 1 р/нед.	2090±281	—	—	—	—
2	ВТ1718, 6,4 мг/кг, 1 р/нед.	1101±170	52,7	48,9	р< 0,001	р< 0,001
3	анти-СТГА4,	468±94	22,4	80,1	р< 0,001	р< 0,05
10 мг/кг, 2 р/нед.
4	ВТ1718+ анти-СТЬА4	250±62	12,0	90,9	р<0,001	—

Повторная антигенная стимуляция.

Мышей из группы 3 и 4 оставляли под наблюдением после 4 недель лечения, и иммунную систему повторно стимулировали клетками СТ-26 на 62-й день. Рост опухоли после повторной имплантации клеток показан на фиг. 5.

Обзор и обсуждение результатов.

В данном исследовании оценивали терапевтическую эффективность ВТ1718 и анти-CTLA4 в сингенной модели СТ-26. Измеренные масса тела и объем опухоли для всех групп, получавших лечение, в различные моменты времени приведен на фиг. 5 и 4.1 и в табл. 4.1 и 4.2.

Средний объем опухоли у мышей, получавших носитель, достиг 2090 мм³ на 14-й день после начала лечения. ВТ1718 в дозе 6,4 мг/кг, 1 раз в неделю (TV=1101 мм3, TGI=48,9%, р<0,001) вызывал очевидную противоопухолевую активность. Антитело к C TLA4 в дозе 10 мг/кг, 2 раза в неделю отдельно (TV=468 мм3, TGI=80,1%, p<0,001) отдельно или в комбинации с ВТ1718 (TV=250 ммЗ, TGI=90,9%, p<0,001) вызывало мощную противоопухолевую активность.

Комбинация ВТ1718 и антитела к CTLA4 дополнительно улучшала противоопухолевый эффект ВТ1718 6,4 мг/кг (р<0,001) или антитела к CTLA4 (р<0,05) 10 мг/кг в виде монотерапии.

опухоли в группе 3 и 8 опухолей в группе 4 были полностью уничтожены с помощью указанного лечения, и не наблюдалось какого-либо рецидива; иммунная система у этих мышей была повторно стимулирована клетками СТ26. В результате ни у одной мыши не развилась опухоль после лечения антителом к CTLA4 Ab отдельно или в комбинации с лечением ВТ1718 в группах 3 и 4, тогда как в контрольных группах опухоли развились у 100% мышей.

Животные во всех группах хорошо поддерживали массу тела.

Пример 5.

Исследование транскрипции ВТ1718/анти-PD-1.

Задача исследования.

Задачей исследования являлось изучение механизма комбинированного действия ВТ1718 и антитела к PD-1 in vivo. Была получена совокупность данных для исследования молекулярных изменений в ответ на ВТ1718, антитело к PD1 и их комбинацию в сингенной модели опухоли LLC. Наблюдались транскрипционные изменения, указывающие на усиленный противоопухолевый иммунитет, вызванный комбинацией ВТ1718 с антителом к PD1. Транскрипционные изменения указывали на ответ IFN типа I, высвобождение антигенов раковых клеток, презентацию ракового антигена и праймирование и активацию Т-клеток и инфильтрацию иммунных клеток в опухоли.

Мышам линии LLC, несущим опухоль С75В1/6 (n=5), вводили однократную дозу носителя внутривенно, 4,8 мг/кг ВТ1718 внутривенно, 10 мг/кг антитела к PD-1 внутрибрюшинно или указанную комбинацию ВТ1718 и антитела к PD-1. Через 24 и 48 ч после введения дозы собирали опухоли и анализировали РНК с помощью Nanostring с использованием панели nCounter Mouse PanCancer 10 360, которая включает 750 генов, охватывающих ключевые пути на границе опухоли, микросреду опухоли и иммунный ответ. Для анализа данных использовали программное обеспечение nSolver. Несмотря на высокую вариабельность профилей транскрипции опухолей, получавших лечение носителем, усиление иммунной модуляции было очевидным, когда ВТ1718 комбинировали с PD-1.

Данные и анализ показаны на Фиг. 6-8. В целом, транскрипционный анализ комбинированного действия ВТ1718 и антитела к PD1 указывает на повышение.

иммуномодуляции в ранние моменты времени, обусловленное комбинированием конъюгата токсина Bicycle BT1718 с антителом к PD-1. Анализ Nanostring на основании этих данных обеспечивает более экономичный способ всесторонней оценки лекарственного действия в опухолевой ткани (опухолевых клетках, иммунных клетках, проникающих в опухоль, и в микросреде опухоли в целом) по сравнению с анализом методом проточной цитометрии или мультиплексным иммунофлуоресцентным анализом сре

- 29 048934 зов тканей.

Claims

1. Применение комбинации ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и антитела к PD1 для лечения рака легкого, где ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят с частотой один раз в неделю.

2. Применение по п.1, в котором ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят в дозе 14,4 мг/м².

3. Применение комбинации ВТ1718, или его фармацевтически приемлемой соли, и антитела к PD1 для лечения рака, причем рак представляет собой рак молочной железы.

4. Применение по п.3, в котором ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят в дозе 14,4 мг/м².

5. Применение по п.3, в котором ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят в дозе 18,6 мг/м².

6. Применение по любому из пп.3-5 в котором ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят с частотой один раз в неделю.

7. Применение по любому из пп.1-6, в котором антитело к PD1, выбрано из ниволумаба, пембролизумаба, дурвалумаба и атезолизумаба.

8. Применение по любому из пп.1-7, в котором ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят путем внутривенной инфузии.

9. Применение по любому из пп.1-8, в котором комбинация дополнительно содержит гистидин.

10. Применение по любому из пп.1-9, в котором комбинация дополнительно содержит сахарозу.

11. Применение по любому из пп.1-10, в котором комбинация представляет собой состав, содержащий ВТ1718, или его фармацевтически приемлемую соль, гистидин, сахарозу и воду, при рН примерно 7.