ES2247642T3 - Neuropeptidos procedentes del escorpion. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA UN PEPTIDO CAPAZ DE BLOQUEAR LOS CANALES DEL CALCIO (K + PASADOS POR TENSION, E INHIBIR LA PRODUCCION DE IL-2, Y QUE ESTA REPRESENTADO POR UNA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE: ALA - SER - CYS - ARG - THR - PRO - LYS - ASP - CYS - ALA - ASP PRO - CYS - ARG - LYS GLU - THR - GLY - SYS - PRO - TYR - GLY - LYS - CYS - MET - ASN ARG - LYS - CYS LYS CYS - ASN - ARG - CYS; EN LA QUE EL TERMINAL C ESTA AMIDADO, Y EN LA MOLECULA SE ENCUENTRAN PRESENTES CUATRO PUENTES DE DISULFURO, Y SUS PEPTIDOS RELACIONADOS, AISLADOS DE LA GLANDULA DEL VENENO DEL ESCORPION HETEROMETRUS SPINNIFER. LOS PEPTIDOS PROPORCIONADOS POR LA PRESENTE INVENCION SON NEUROPEPTIDOS QUE PUEDEN BLOQUEAR LOS CANALES DEL K + ENVIADO POR TENSION, INHIBIR LA PRODUCCION DE IL-2 A UNA CONCENTRACION SUMAMENTE BAJA Y, EN CONSECUENCIA, SE ESPERA QUE PUEDAN CONTRIBUIR A LA APLICACION DE TOXINAS DE ESCORPION A LAS MEDICINAS Y A OTROS PRODUCTOS.
Description
Neuropéptidos procedentes de escorpión.
La invención se refiere a nuevos neuropéptidos,
más específicamente péptidos relacionados con toxinas de escorpión
que se obtienen a partir de la glándula venenosa de Heterometrus
spinnifer, una especie de escorpión.
"Escorpión" es un término general para
artrópodos pertenecientes a la clase Arachnida, el orden
Scorpionida y aproximadamente 600 especies de escorpiones
que existen actualmente en el mundo. Los escorpiones se han
considerado generalmente como virulentamente venenosos; sin embargo,
actualmente aquéllos que poseen toxinas fatales están limitados
sólo a unas pocas especies, que incluyen Buthus ustralis
(que vive en los desiertos de África), Centruroides
exilicauda (nativo de México), y B. occitauda (nativo de
Europa del Sur), etc. Hasta ahora, se han aislado diversos tipos de
toxinas de escorpión (Dreyer, F., Rev. Physiol Biochem. Pharmacol.,
vol. 15, pp. 94-128, 1990), que están consideradas
como neurotoxinas.
A partir de los estudios sobre propiedades
farmacológicas de estas toxinas, se ha concentrado la atención en
las acciones de las toxinas contra los canales K^{+}. Por
ejemplo, se sabe que la margatoxina (MgTX) aislada de la glándula
venenosa de Centruroides margaritatus
(García-Calvo et al. J. Biol. Chem. vol.
268, pp. 18866, 18874, 1993) y la agitoxina 2 (AgTX2) aislada de la
glándula venenosa de Leiurus quinquestriatus herbraes (García
et al., Biochemistry, vol. 33, pp.
6834-6839, 1994) actúan como bloqueadores de los
canales K^{+} con compuertas de voltaje. Estas toxinas son
péptidos compuestos de 38 residuos de aminoácidos y que contienen
tres puentes disulfuro de sus moléculas. Recientemente, se ha
informado también de un péptido, la toxina 1 de Pandinus
imperator (Pi1), que es un péptido que contiene cuatro puentes
disulfuro en la molécula y compuesto de 35 residuos de aminoácidos
(Olamendi-Portugal et al., Biochem. J. vol.
315, pp. 977-981, 1996).
Por otra parte, se ha considerado que la
producción de interleuquina-2 (IL-2)
por las células T requiere la afluencia de Ca^{2+} a las células
T. Recientemente, se ha descubierto que K^{+}v1.3, que es un tipo
de los canales K^{+}, está implicado en la afluencia de Ca^{2+}
a las células T acompañada por activación de las células T (Leonard
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 89, pp.
10094-1098, 1992). Adicionalmente, Lin et al.
han informado que la inhibición de los canales K^{+}v1.3 suprime
la afluencia de Ca^{2+} a las células T, la proliferación de las
células T y la producción de IL-2 por las células T
(J. Exp. Med., vol. 177, pp. 637-645, 1993).
En estas circunstancias, es de esperar que las
toxinas de escorpión sean aplicables a medicamentos en vista de sus
diversas actividades farmacológicas. Sin embargo, para aplicación a
medicamentos, es necesario separar las actividades farmacológicas
útiles de las toxinas de su toxicidad indeseable y, por
consiguiente, se hace necesario aislar gran cantidad de toxinas de
escorpión y clarificar la relación
estructura-actividad de las mismas. En estas
condiciones, el objeto de la presente invención es proporcionar
nuevos péptidos afines a las toxinas de escorpión para contribución
a la aplicación de las toxinas de escorpión a medicamentos.
Olamendi-Portugal et al.
(Biochem. J. (1996) 315, 977-981) describen una
nueva clase estructural de toxina bloqueadora de los canales K^{+}
del escorpión Pandinus imperator. De acuerdo con estos
autores, se ha purificado y caracterizado un nuevo péptido a partir
del veneno del escorpión Pandinus imperator. El análisis de
su estructura primaria revela que el mismo pertenece a una nueva
clase estructural de péptido bloqueador de los canales K^{+},
compuesto de solo 35 aminoácidos, pero reticulado por cuatro puentes
disulfuro.
Kharrat et al. (Eur. J. Biochem. 242,
491-498 (1996) describen la síntesis química y
caracterización de maurotoxina, una toxina corta de escorpión con
cuatro puentes disulfuro que actúa sobre los canales K^{+}. De
acuerdo con estos autores, la maurotoxina es una toxina aislada del
veneno del escorpión cactoide tunecino Scorpio maurus. Se
trata de un péptido de 34 aminoácidos reticulado por cuatro puentes
disulfuro.
Adicionalmente, la solicitud de patente
internacional WO 95/03065 describe un péptido de 39 aminoácidos,
Margatoxina (MgTX), que se purifica hasta homogeneidad a partir del
veneno del escorpión Centruroides margaritatus. De acuerdo
con este documento, MgTX es un inhibidor potente y selectivo de un
canal K^{+} dependiente del voltaje presente en los linfocitos
humanos, exhibe actividad inmunosupresora con los linfocitos T
humanos, y es útil como inmunosupresor.
Los inventores han realizado estudios intensos y
extensos sobre el aislamiento de nuevos péptidos afines a las
toxinas de escorpión de la glándula venenosa de un escorpión
Heterometrus spinnifer, sobre la base de la capacidad para
bloquear los canales K^{+} K^{+}v1.3 con compuertas de voltaje
del cerebro de la rata (denominados también "RC K3")
expresados en oocitos de Xenopus. Como resultado, los
autores de la invención han alcanzado éxito en el aislamiento y la
purificación de un nuevo péptido, denominado HsTX1, representado
por SEQ ID NO: 1, en el cual están presentes en la molécula cuatro
puentes disulfuro. Los inventores han alcanzado éxito también en la
determinación de las estructuras primaria y de orden superior de
HsTX1. Se ha encontrado que HsTX1 exhibe una capacidad mucho más
fuerte para bloquear los canales K^{+} en comparación con las
toxinas de escorpión consignadas previamente e inhibe la producción
de IL-2 por las células T de la sangre periférica
humana. De este modo se ha culminado la invención.
De acuerdo con la presente invención, se
proporciona un péptido representado por una secuencia de
aminoácidos:
en la cual están presentes en la
molécula 0 a 4 puentes disulfuro seleccionados del grupo
constituido por Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34} y el terminal C puede estar
amidado, como bloqueador de los canales K^{+} con compuertas de
voltaje o un inhibidor de la producción de
IL-2.
En una realización muy preferida, la presente
invención proporciona un péptido representado por la secuencia de
aminoácidos anterior en la cual el terminal C está amidado y están
presentes en la molécula cuatro puentes disulfuro,
Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34}.
Fig. 1 es un gráfico que ilustra la actividad
bloqueadora de los péptidos de acuerdo con la invención sobre los
canales K^{+}v1.3 de la rata, dependiendo de la concentración de
los péptidos; en el cual el círculo vacío (\medcirc) indica los
datos para HsTX1 natural, el cuadrado lleno (\sqbullet) indica los
datos para HsTX1 sintético, y el triángulo lleno (\blacktriangle)
indica los datos para HsTX1-COOH que tiene el
terminal C de -COOH.
Fig. 2 es un gráfico que ilustra la acción
inhibidora de HsTX1 sobre la producción de IL-2 por
las células T de sangre periférica humana estimuladas con PMA y
ionomicina, dependiendo de la concentración de HsTX1.
Los péptidos de la presente invención pueden
obtenerse por extirpación de la glándula venenosa de un escorpión
que contiene el péptido de la presente invención, tal como
Heterometrus spinnifer, sometiendo la misma a extracción
con, por ejemplo, aproximadamente 0,5 M de ácido acético para dar un
extracto bruto del péptido, seguido por aislamiento y purificación
del péptido a partir del extracto bruto por una técnica
convencional tal como cromatografía de intercambio iónico y
cromatografía en fase inversa.
En cuanto a HsTX1, que es un péptido existente
naturalmente y uno de los péptidos de la presente invención, se
aprecia claramente que el terminal C está amidado y están presentes
cuatro puentes disulfuro en la molécula, teniendo en cuenta lo
siguiente:
(1) el análisis de la secuencia de aminoácidos
del péptido reveló la presencia de ocho residuos Cys en la
molécula;
(2) la espectrometría de masas del péptido reveló
que el péptido se encuentra en forma de monómero; y
(3) la concordancia satisfactoria entre el peso
molecular del péptido determinado experimentalmente y el peso
molecular del péptido calculado partiendo de la suposición de que el
terminal C está amidado y están presentes en la molécula cuatro
puentes disulfuro.
En los péptidos de la presente invención, el
número de puentes disulfuro no está limitado particularmente. Entre
los péptidos de la presente invención, se encontró que el existente
naturalmente contiene cuatro puentes disulfuro en la posición
Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34}, como se aprecia claramente
por los ejemplos mencionados más adelante. Este péptido natural
puede obtenerse también introduciendo aleatoriamente cuatro puentes
disulfuro en un péptido que no contiene ningún puente disulfuro,
seguido por escrutinio y purificación de un péptido que tiene la
misma estructura que la del péptido natural.
Un péptido que no contiene ningún puente
disulfuro puede sintetizarse convenientemente por un método en fase
sólida utilizando un sintetizador de péptidos convencional (v.g.,
el sintetizador de péptidos 433A, disponible de Applied
Biosystems). Los puentes disulfuro pueden introducirse en la
molécula del péptido por una reacción de oxidación tal como
oxidación por exposición al aire o con ferricianuro de potasio
(Hope et al., J. Biol. Chem., vol. 237, pp.
1563-1566, 1962). El escrutinio y la purificación
del péptido idéntico al péptido natural a partir de los péptidos
introducidos con puentes disulfuro puede conducirse, por ejemplo,
por un método que utiliza cromatografía líquida de alta resolución
C-18 en fase inversa (C-18 HPLC), en
el cual se aísla(n) la o las fracciones que registran el
mismo tiempo de retención que el del péptido natural.
Los péptidos de la presente invención pueden
obtenerse también por empleo adecuado de una técnica de
recombinación de genes de manera convencional.
Los métodos de síntesis arriba mencionados
permiten también producir otro tipo de péptidos que tienen las
mismas estructuras primarias que la del péptido natural pero tienen
el número de puentes disulfuro diferente de los del péptido
natural. Por esta razón, tales péptidos están abarcados también
dentro del alcance de la invención, siempre que los mismos estén
representados por SEQ ID NO: 1 en la cual están presentes 0 a 4
puentes disulfuro de tal manera que los residuos Cys en
cualesquiera posiciones de la molécula están enlazados a través de
puentes disulfuro.
Los péptidos pueden incluir deleciones, adiciones
o sustituciones de una porción del residuo de aminoácido, siempre
que aquéllos tengan las mismas actividades farmacológicas que la
del péptido natural de la presente invención. Dichos péptidos
pueden ser también útiles como bloqueadores de los canales K^{+}
con compuertas de voltaje o inhibidores de la producción de
IL-2.
Como se demuestra en el Ejemplo de Evaluación 2
que se presenta más adelante, los péptidos que tienen el terminal C
de -COOH poseen también una actividad inhibidora de los canales
K^{+}, y por consiguiente están abarcados también dentro del
alcance técnico de la invención.
Entre ellos, el péptido natural es el primer
neuropéptido descubierto de neuropéptidos de 34 residuos de
aminoácidos y que contienen cuatro puentes disulfuro en la
molécula. El péptido natural puede bloquear los canales K^{+}v1.3
de K^{+} con compuertas de voltaje del cerebro de la rata
expresados en oocitos de Xenopus a una concentración
extremadamente baja y puede inhibir también la producción de
IL-2 por las células T de la sangre periférica
humana. De acuerdo con ello, los péptidos proporcionados por la
presente invención y análogos de los mismos podrían contribuir a la
aplicación de péptidos afines a las toxinas de escorpión a
reactivos bioquímicos en neurofisiología así como la aplicación a
medicamentos humanos o veterinarios. Ejemplos de medicamentos a los
cuales pueden aplicarse los péptidos y análogos de los mismos
incluyen agentes inmunosupresores para trasplante de órganos,
enfermedades de rechazo inverso (GVHD) y enfermedades
autoinmunológicas.
Cuando los péptidos de la presente invención se
utilizan como medicamentos, las formas de dosificación no están
limitadas particularmente, y pueden utilizarse para administración
oral o parenteral. Los péptidos se pueden preparar en diversos
tipos de formulaciones, con inclusión de soluciones de inyección,
soluciones de infusión, polvos, gránulos, tabletas, cápsulas,
jarabes, recubrimientos entéricos, inhaladores, trociscos,
ungüentos, supositorios y tabletas sublinguales. Estas
formulaciones pueden utilizarse solas o en combinación, dependiendo
de las condiciones del individuo. La preparación de las
formulaciones puede realizarse por cualquiera de los métodos
conocidos utilizando aditivos conocidos apropiados que se emplean
convencionalmente en la formulación de medicamentos (v.g.,
excipientes, aglomerantes, desintegradores, lubricantes,
saborizantes), dependiendo de los usos propuestos.
En la administración del péptido como medicamento
a un humano, la dosis eficaz no está limitada particularmente, y
puede variar dependiendo del grado de actividad efectiva del
péptido, la edad, el sexo y el peso corporal del paciente a tratar
y de las condiciones de las enfermedades del paciente. En el caso de
administración a un adulto humano, como regla general la dosis
puede seleccionarse adecuadamente dentro del intervalo de 0,1 a 100
mg por día para administración oral o el intervalo de 0,01 a 10 mg
por día para administración parenteral.
La presente invención se ilustrará con mayor
detalle por los ejemplos que siguen. Debe comprenderse que la
presente invención no está limitada a los ejemplos.
50 mg de glándula venenosa de Heterometrus
spinnifer liofilizada (obtenida de Latoxan, Francia) se
homogeneizaron con aproximadamente 5 ml de una solución 0,5 M de
ácido acético, y el homogeneizado se centrifugó a 3.000 x g durante
20 min. El precipitado se sometió a homogeneización y centrifugación
tres veces del mismo modo. El sobrenadante resultante se pasó a
través de un filtro de 0,45 \mum para obtener un extracto
bruto.
El extracto bruto obtenido en el paso (a)
anterior se sometió a C18-HPLC utilizando un paquete
Capcell C18 SG-120 (Shiseido Co., Ltd.,
\phi10 x 250 mm) por lotes de 12,5 mg, se reveló con una
solución acuosa de TFA al 0,1% (pH 2,2) a un caudal de 3 ml/min
durante 6 min, y se eluyó luego con un gradiente lineal de
acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 0% a 50%
en 100 min. Mientras se observaba la absorbancia UV a 230 nm, se
agruparon las fracciones que indicaban la absorbancia pico. Estas
fracciones se ensayaron respecto a la actividad inhibidora sobre
los canales K^{+} K^{+}v1.3 con compuertas de voltaje del
cerebro de la rata expresados en oocitos de Xenopus, y se
recogieron las fracciones activas que se eluían para los tiempos de
retención de 38-41 min.
Las fracciones activas obtenidas en el paso (b)
se disolvieron en un tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 6,8). La
solución resultante se sometió a cromatografía en columna con
intercambio de iones catiónicos utilizando el gel TS K
SP-5PW (Tosoh Corporation, \phi7,5 x 75 mm), se
reveló en un tampón de fosfato de sodio 10 mM (pH 6,8) a un caudal
de 0,5 ml/min durante 5 min, y se eluyó luego con un gradiente
lineal de NaCl desde 0 M a 0,80 M en 80 min. Mientras se observaba
la absorbancia UV a 230 nm, se agruparon las fracciones que
indicaban la absorbancia pico. Estas fracciones se ensayaron del
mismo modo que en el paso (b) y se recogieron las fracciones
activas que se eluían para los tiempos de retención de
64-69 min.
La fracción activa obtenida en el paso (c) se
sometió a HPLC utilizando una columna C-18 (Merck
& Co., Inc., Lichrospher de 100 angstroms, tamaño de las
perlas: 5 \mum, \phi4 x 125), se reveló con una solución acuosa
de TFA al 0,1% (pH 2,2) a un caudal de 1,0 ml/min durante 3 min, y
se eluyó luego con un gradiente lineal de disolvente B (una
solución mixta de 2-propanol:acetonitrilo = 2:1) en
una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 5% a 18% en 35 min mientras
se observaba la absorbancia UV a 230 nm. Se eluyó HsTX1 como un
pico simple para un tiempo de retención de 27,5 min.
Estas fracciones se agruparon y se liofilizaron
luego para dar HsTX1 con un rendimiento global de 130 \mug.
El HsTX1 obtenido del Ejemplo 1 se hidrolizó con
HCl 6 N de punto de ebullición constante en un tubo sellado a 110ºC
durante 20 h y el producto resultante se sometió a determinación de
la composición de aminoácidos utilizando un analizador de
aminoácidos. La composición de aminoácidos se muestra a
continuación en la Tabla 1.
| Aminoácido | HstX1 |
| Asx | 3,6(4) |
| Glx | 1,1(1) |
| Ser | 1,0(1) |
| Gly | 2,3(2) |
| His | 0 |
| Thr | 2,0(2) |
| Ala | 2,1(2) |
| Pro | 3,0(3) |
| Arg | 3,8(4) |
| Tyr | 0,8(1) |
| Val | 0 |
| Met | 0,9(1) |
| ½ cistina | 7,4(8) |
| Ile | 0 |
| Leu | 0 |
| Phe | O |
| Lys | 5,0(5) |
Los números entre paréntesis indican el número de
residuos determinado por cálculo.
Paso
1
Se hizo reaccionar HsTX1 con 5 equivalentes de
tributil-fosfina basados en el número de los puentes
disulfuro y 2 equivalentes de 4-vinilpiridina
basados en la cantidad de la tributil-fosfina en
n-propanol al 20% en un tampón de bicarbonato 0,5 M
a 37ºC durante 2 h en corriente de nitrógeno en la condición
sombreada, con lo cual los residuos Cys estaban piridiletilados en
S. El péptido piridiletilado en S (al que se hace referencia en lo
sucesivo simplemente como "péptido PE") se purificó por HPLC
utilizando una columna C-18 (Merck & Co., Inc.,
Lichrospher 100 angstroms, tamaño de las perlas: 5 \mum, \phi4 x
125), con un gradiente lineal de acetonitrilo en una solución mixta
0,1% TFA/agua desde 5% a 60% en 55 min a un caudal de 1,0
ml/min.
Paso
2
El péptido PE obtenido en el paso 1 se sometió a
determinación de la secuencia de aminoácidos utilizando un
secuenciador de aminoácidos Shimadzu PPSQ10 (Shimadzu Corp.). Como
resultado, se encontró que HsTX1 es un péptido representado por SEQ
ID NO: 1 en el cual están presentes cuatro puentes disulfuro en la
molécula.
Paso
3
El peso molecular de HsTX1 determinado por el
tiempo de desorción láser asistido por matriz de la espectrometría
de masas de vuelo (MALDI-TOF-MS) era
3815,63. Este resultado estaba en concordancia satisfactoria con el
valor determinado por cálculo para la formulación
C_{149}H_{246}N_{54}O_{46}S_{9} en la cual están
presentes cuatro puentes disulfuro (3815,61).
Paso
4
Se realizó la
reducción-alquilación parcial de HsTX1 de acuerdo
con el método de Jones et al. (Jones et al., Rapid
Commun. Mass Spectrum., vol. 10, pp, 138-143, 1996)
con ligera modificación. Resumidamente, 2 a 3 nanomoles de HsTX1
obtenido en el Ejemplo 1 en 25 \mul de una solución 0,1 M de
acetato de amonio/acetonitrilo (90:10, pH 4) se incubaron con 2
equivalentes molares de
tris-(2-carboxietil)-fosfina (TCEP)
a 50ºC durante 10 min. Se añadió luego a la mezcla un exceso de 100
equivalentes molares de
N-fenil-maleimida y se dejó
reaccionar a 50ºC durante 30 min. Después de añadir 200 \mul de
una solución acuosa de TFA al 0,1%, la mezcla de reacción se aplicó
a una columna C-18 de fase inversa (Merck &
Co., Inc., Lichrospher, \phi4 x 125 mm), y se eluyó luego con un
gradiente lineal de acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al
0,1% desde 5% a 45% en 80 min a un caudal de 1 ml/min. El análisis
MALDI-TOF-MS permitió identificar el
péptido alquilado, parcialmente reducido. Este péptido se secuenció
luego sin procedimientos adicionales de
reducción-alquilación.
Como resultado del análisis
MALDI-TOF-MS del péptido alquilado
parcialmente reducido, se confirmó que uno de los puentes disulfuro
en la molécula se había reducido y estaban presentes dos residuos
cisteína alquilados. Se identificó que el derivado
3-fenil-2-tiohidantoína
(PTH) de los residuos cisteína alquilados estaba presente en las
posiciones 19 y 34. Estos resultados revelaron que uno de los
puentes disulfuro presentes en HsTX1 es Cys^{19}- Cys^{34}.
Se llevó a cabo la escisión tríptica de HsTX1
utilizando un cartucho de tripsina inmovilizada Poroszyme®
(PerSeptive Biosystems, USA). Resumidamente, el cartucho se montó
en un sistema HPLC en un horno ajustado a 40ºC, y se equilibró luego
en tampón de digestión (CaCl_{2} 10 mM, Tris-HCl
50 mM; pH 8): acetonitrilo (95:5, v/v) a un caudal de 1 ml/min. Un
nanomol del MsTX1 sintético sintetizado en el Ejemplo 3 siguiente
se disolvió en 50 \mul del tampón de digestión y se inyectó en la
columna a un caudal de 50 \mul/min. Un flujo de parada permitió
un tiempo de reacción de 20 min. La mezcla de reacción se eluyó con
3 volúmenes de columna (3 x 100 \mul) de la solución tampón de
digestión:acetonitrilo (95:5, v/v). Los materiales eluidos se
recogieron en un tubo de polietileno que contenía 6 \mul de HCl 6N
(pH final: no mayor que 2) y se guardó inmediatamente después a
-80ºC.
La mezcla de reacción resultante se aplicó a una
columna C-18 de fase inversa (Merck & Co., Inc.,
\phi4 x 125 mm), y se eluyó con un gradiente lineal de
acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al 0,1% desde 0% a 45% en
80 min a un caudal de 1 ml/min. Tres minutos después del comienzo
de la elución, se inició la observación de la absorbancia UV a 230
nm de cada fracción y se recogieron las fracciones que indicaban
valores pico. Estas fracciones se liofilizaron antes de las
caracterizaciones fisico-químicas (a saber,
espectrometría de masas, secuenciación). El fragmento tríptico
eluido a 24 min se escindió ulteriormente con
AspN-endopeptidasa (en 1 \mul de
Tris-HCl 10 mM, pH 8,1; la relación de la peptidasa
para aproximadamente 40 picomoles de péptido era aproximadamente 4%
p/p), y se sometió luego a la determinación directa
MALDI-TOF-MS en una microplaca.
Estos procedimientos de escisión enzimática
dieron cuatro fragmentos. El rendimiento de la reacción era
cuantitativo y no se observó transposición aleatoria alguna de los
puentes disulfuro intramoleculares. Los fragmentos resultantes se
sometieron a espectrometría de masas y se secuenciaron para
analizar el patrón de puentes disulfuro. Como resultado, se reveló
que el péptido que se obtuvo a partir de las fracciones digeridas
con tripsina y se eluyó a los 24 min contenía dos puentes disulfuro
que incluían residuos de semi-cistina en las
posiciones 9, 13, 29 y 31. Aproximadamente 40 picomoles de los
fragmentos anteriores se eluyeron ulteriormente con
AspN-endopeptidasa y se sometieron luego a la
determinación directa MALDI-TOF-MS
en una microplaca. El resultado indicó que dos de estos fragmentos
contenían puentes disulfuro correspondientes a
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{9}-Cys^{29}, respectivamente.
Estos resultados demuestran claramente que el
HsTX1 de la presente invención contiene cuatro puentes disulfuro,
Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34}.
Paso
5
Los espectros de dicroísmo circular (CD) de los
péptidos de la presente invención (es decir, HsTX1 natural, HsTX1
sintético obtenido en el Ejemplo 3 siguiente y
HsTX1-COOH, que es un derivado de HsTX1 que tiene el
terminal C de -COOH) y caribdotoxina (ChTX) (Peptide Institute,
Inc., Japón) se determinaron utilizando un espectrómetro Jasco
J-600 CD (Jasco Corporation) con ácido
(+)-canfo-10-sulfónico
como patrón.
En la determinación, los espectros se midieron en
un tampón de fosfato 20 mM (pH 7,1) a la temperatura ambiente a
160-190 nm de longitud de onda utilizando una
celdilla de 1 mm de recorrido. Los datos del espectro se recogieron
a intervalos de 0,1 nm con una tasa de barrido de 100 nm/min
durante 500 min. La concentración de cada péptido se hizo igual (80
\mug/ml) con ayuda del análisis de aminoácidos. Los datos se
expresaron como elipticidad molecular por residuo y se analizaron
por el método de Compton y Johnson (Anal Biochem., vol. 155, pp.
155-167, 1986).
El espectro CD de cada uno de los HsTX1 y
HsTX1-COOH sintéticos (péptidos de la presente
invención) era casi el mismo que el del HsTX1 natural. Cuando se
comparó el espectro CD de ChTX con el de HsTX1 para comparación de
la estructura secundaria entre ellos, la absorbancia mínima y la
absorbancia máxima del espectro CD de ChTX estaban desplazadas
ligeramente, con el mínimo a 218 nm y el máximo a 195 nm (frente a
220 nm y 190 nm, respectivamente, para HsTX1).
Estos resultados revelaron que HcTX y
HsTX1-COOH, HsTX1 sintético y HsTX1 natural de la
presente invención tienen todos hélice \alpha (36, 29, 34 y 28%,
respectivamente), hoja \beta (18, 21, 20 y 20%, respectivamente) y
vuelta \beta (19, 14, 12 y 14%, respectivamente) en ellos. Estos
datos del análisis estructural demuestran que la estructura plegada
de HsTX1 es similar a la de ChTX.
Se ha sabido que tanto Pi1 (supra) como
maurotoxina (Kharrat et al., Eur. J. Biochem., vol. 242, pp.
491-498, 1996) tienen la estructura plegada similar
a la de ChTX, pero la maurotoxina tiene un patrón de puentes
disulfuro específico. Este hecho ilustra la validez de la
estructura de HsTX1 arriba mencionada, deducida por utilización de
los parámetros de la ChTX.
La síntesis del péptido se realizó por el método
en fase sólida FastMoc® en un sintetizador automático de péptidos
433A (Applied Biosystems) utilizando resina
Fmoc-aminoetil-SAL (Watanabe
Chemical Industries, Ltd.) como soporte y Fmoc-Ala,
Fmoc-Arg (Pmc), Fmoc-Asp (OtBu),
Fmoc-Asn (Trt), Fmoc-Cys (Trt),
Fmoc-Gly, Fmoc-Glu (OtBu),
Fmoc-Lys (Boc), Fmoc-Met,
Fmoc-Pro, Fmoc-Ser (tBu),
Fmoc-Thr (tBu) y Fmoc-Tyr (tBu), en
donde las abreviaturas utilizadas son como sigue: Fmoc =
9-fluorenilmetoxi-carbonilo, SAL =
super ácido lábil, Pmc =
2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo,
Trt = tritilo, tBu = t-butilo, Boc =
t-butiloxicarbonilo.
Los procedimientos para escisión del péptido del
conjugado péptido-resina y desprotección del péptido
bruto se realizaron por adición de una solución mixta
TFA:tioanisol:etanoditiol (90:5:5, v/v) al conjugado
péptido-resina en una cantidad de aproximadamente
10 ml por 1 g del conjugado y reacción posterior de la mezcla a la
temperatura ambiente durante 1,5 a 3 horas. A la solución de
reacción resultante, se añadió dietil-éter para precipitar el
péptido. El precipitado se lavó tres veces con dietil-éter para dar
un péptido bruto. El péptido bruto se purificó por HPLC
C-18 en fase inversa.
El péptido purificado se disolvió en un tampón
Tris-HCl 0,5 mM (pH 8,2) complementado con glutatión
1 mM oxidado y glutatión 1 mM reducido, y la solución se expuso
luego al aire durante 30 horas para oxidar el péptido, por lo cual
se introdujeron en el péptido puentes disulfuro. Después que se hubo
completado la reacción de oxidación, la solución de reacción se
sometió a HPLC utilizando una columna C-18 (Merck
& Co., Inc., Lichro-spher 100 angstroms, tamaño
de las perlas: 5 \mum, \diameter 4 x 125 mm), se reveló con
acetonitrilo al 5% en una solución acuosa de TFA al 0,1% (pH 2,2) a
un caudal de 1,0 ml/min durante 3 min, y se eluyó luego con un
gradiente lineal de acetonitrilo en una solución acuosa de TFA al
0,1% desde 5% a 20% en 30 min mientras se observaba la absorbancia
UV a 230 nm. Basándose en el hecho de que el HsTX1 natural se eluye
con este sistema HPLC con el tiempo de retención de 26,6 min en un
solo pico, las fracciones pico eluidas para el mismo tiempo de
retención (es decir, 26,6 min) se agruparon para dar HsTX1
sintético.
El HsTX1 sintético obtenido se mezcló con el
natural, y la mezcla se co-eluyó en el mismo sistema
HPLC que se ha mencionado arriba. Como resultado, se detectaron
HsTX1s tanto naturales como sintéticos para el tiempo de retención
de 26,6 min en un solo pico bien definido. El peso molecular del
HsTX1 sintético determinado por
MALDI-TOF-MS era 3815,67, que estaba
en concordancia satisfactoria con el del péptido natural
(3815,63).
Se disolvió 1 miligramo del HsTX1 sintético
obtenido en el Ejemplo 3 en 20 ml de agua para inyección y la
solución resultante se pasó a través de un filtro de 0,22 \mum
para esterilización. Después de ello, la solución se envasó en
ampollas de 1 ml cada una en condiciones esterilizadas, obteniéndose
así preparaciones para inyección que comprendían HsTX1.
Ejemplo de Evaluación
1
El ensayo de la actividad inhibidora de los
péptidos sobre los canales K^{+} se realizó de la manera
siguiente. El gen del canal K^{+} K^{+}v1.3 con compuertas de
voltaje del cerebro de la rata (Stuhmer et al., EMBO J., 8,
vol. 11, pp. 3235-3244, 1988) que fue aportado
generosamente por el Prof. O. Pongs (Institute für Neurale
Signalverarbeitung, Hamburgo, Alemania) se insertó en el vector
pAS18 de acuerdo con una técnica convencional. Este vector se trató
con EcoRI y el clon resultante se transcribió después in
vitro con RNA-polimerasa SP6 utilizando un kit
de transcripción (Stratagene Inc., USA). El cRNA obtenido se inyectó
en oocitos de Xenopus 16-72 h antes de los
experimentos electrofisiológicos.
Los oocitos en los que se había expresado el gen
K^{+}v1.3 se añadieron a una cámara de 100 \mul llena con una
solución ND96 (CaCl_{2} 0,3 mM, MgCl_{2} 1 mM, KCl 2 mM, y NaCl
96 mM en tampón Hepes 5 mM, pH 7,6) complementada con 50 mg/ml de
seroalbúmina bovina (BSA), y la solución ND96 se perfundió
continuamente a través de depósitos a un caudal de 4 ml/min. La
muestra a ensayar se disolvió por separado en una solución ND96 y
se añadió luego a la cámara por perfusión a través de un depósito.
El cambio de un depósito a otro para cada experimento se realizó
por medio de válvulas de Teflón. Todas las medidas se realizaron a
la temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC).
Los oocitos se atravesaron con dos
microelectrodos llenos con KCl 3M (resistencia interna:
0,5-2 M\Omega) y se seleccionaron por voltaje
utilizando un amplificador seleccionado por voltaje de dos
electrodos Axoclamp-2 (Axon Instruments, Inc.) en
un modo en el cual el voltaje de la cámara se seleccionó a 0 V. Las
corrientes se sometieron a filtración de paso bajo a 1 kHz
utilizando un filtro Bessel de 8 polos (CiberAmp, Axon Instruments
Inc.; -3 dB), se muestrearon y digitalizaron a 10 kHz utilizando
una Interfaz Digidate 1200 (Axon Instruments Inc.), y los datos se
registraron en un disco fotomagnético para análisis subsiguiente
fuera de la línea. La programación y el registro del potencial y el
análisis de los datos registrados se realizaron ejecutando el
soporte lógico Pclamp (Axon Instruments Inc.) en un ordenador PC
Compaq. La medida se realizó con un potencial de retención de -80
mV y una corriente de retención no mayor que -40 nA.
Como resultado, se encontró que el HsTX1 de la
presente invención exhibía una acción bloqueadora extremadamente
potente sobre los canales K^{+}, a saber, la concentración
bloqueadora del 50% (CI_{50}) de 12 \pm 1,6 pM, que es
aproximadamente 800 veces más potente que la de Pi1 (supra)
que es otra toxina de escorpión que exhibe la misma actividad.
Ejemplo de Evaluación
2
La actividad inhibidora del HsTX1 de la presente
invención sobre los canales K^{+}v1.3 se examinó por medida de la
inhibición dependiente de la concentración de la corriente de
salida con compuertas de voltaje sobre los canales K^{+} con
compuertas de voltaje expresados en el sistema de oocitos de
Xenopus. Como resultado, se encontró que en presencia de 10
pM de HsTX1, la corriente de salida era inhibida aproximadamente en
un 50% para todos los voltajes ensayados, en comparación con un
control (sin péptido alguno). La perfusión transitoria con 100 pM
de HsTX1 seguida por perfusión sin péptido alguno como control
causaba más de 85% de recuperación de la corriente K^{+} a lo
largo del tiempo. Este resultado revela que la actividad inhibidora
de HsTX1 sobre el canal K^{+} es prácticamente reversible.
La Fig. 1 muestra la curva de actividad
inhibidora dependiente de la concentración del péptido de la
presente invención sobre los canales K^{+}v1.3 de la rata.
Como se aprecia claramente a partir de la Fig. 1,
puede comprenderse que los péptidos de la presente invención, es
decir, HsTX1 natural y HsTX1 sintético obtenido en el Ejemplo 3,
exhiben prácticamente el mismo patrón de inhibición, en el cual la
concentración de inhibición del 50% (CI_{50}) era 12 pM para el
HsTX1 natural y aproximadamente 13 pM para el HsTX1 sintético y
ambos péptidos exhiben una actividad inhibidora muy potente sobre
los canales K^{+}.
Por el contrario, HsTX1-COOH, que
es un derivado de HsTX1 con el terminal C no amidado, exhibía un
valor CI_{50} de 69 pM, que es aproximadamente un quinto del
correspondiente al HsTX1 de la presente invención. De acuerdo con
ello, puede comprenderse que los péptidos de la presente invención
pueden exhibir la actividad inhibidora incluso cuando el terminal C
es -COOH, pero la amidación del terminal C mejora la actividad
inhibidora específica sobre los canales K^{+}.
Ejemplo de Evaluación
3
La actividad inhibidora de HsTX1 de la presente
invención sobre otros canales K^{+} con compuertas de voltaje se
examinó del mismo modo. Los canales ensayados fueron K^{+}v1.1 y
K^{+}v1.6, los dos cuales son subtipos del canal K^{+} con
compuertas de voltaje del cerebro de la rata. El experimento en el
sistema de oocitos de Xenopus se realizó del mismo modo que
se ha mencionado arriba utilizando los clones de los genes
K^{+}v1.1 y K^{+}v1.6. Aunque ambos canales K^{+}v1.1 y
K^{+}v1.6 eran bloqueados por el HsTX1 sintético, el valor
CI_{50} para ambos canales era aproximadamente 300 pM, que es
aproximadamente una trigésima parte más pequeño que el
correspondiente al canal K^{+}v1.3.
Como resultado, se reveló que el HsTX1 de la
presente invención exhibe una actividad bloqueadora específica sobre
los canales K^{+}v1.3.
Ejemplo de Evaluación
4
La actividad inhibidora de HsTX1 sobre la
producción de IL-2 por las células T activadas se
examinó de la manera siguiente. Se aislaron leucocitos
mononucleares de sangre periférica heparinizada de un donante normal
por una técnica de centrifugación con un medio de resolución
mono-poli (Dainippon Pharmaceuticals Co., Ltd.), y
se aplicaron luego a una columna de lana de nailon. La columna se
incubó a 37ºC durante 30 min y las células no adherentes se
aislaron luego a partir de la misma. Las células T purificadas
obtenidas se suspendieron en medio RPMI 1640 complementado con suero
de ternero fetal desactivado al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100
\mug/ml de estreptomicina. Esta suspensión se extendió sobre una
placa de 96 pocillos con fondo plano en una concentración final de
1 x 10^{6} células/ml. Se añadieron ulteriormente a la misma 1
ng/ml de miristato-acetato de forbol (PMA) y 250
ng/ml de ionomicina como estimulantes, y la placa se cultivó en una
incubadora con 5% de CO_{2} gaseoso a 37ºC.
En el momento del comienzo del cultivo, se añadió
HsTX1 a cada pocillo en concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 nM,
respectivamente, al volumen final para cada pocillo de 200 \mul.
Después de 20 h, se recogió el sobrenadante de cultivo y se
determinó luego la concentración de IL-2 en el mismo
utilizando un kit ELISA de IL-2 humana
(Endogen).
Los resultados se muestran en la Fig. 2.
Como se aprecia claramente por la Fig. 2, el
HsTX1 de la presente invención inhibía significativamente la
producción de IL-2 por las células T periféricas
humanas para todas las concentraciones anteriores (ensayo de
Dunnett).
La tasa de inhibición del HsTX1 de la presente
invención contra la producción de IL-2 a
concentraciones de 0,1, 1, 10 y 100 nM era 28,6, 45,7, 46,0 y 46,7%,
respectivamente.
En los ejemplos y ejemplos de evaluación
mencionados anteriormente, los autores de la presente invención
alcanzaron éxito en el aislamiento y la síntesis de una nueva clase
de péptido afín a la toxina de escorpión, denominado HsTX1, y
alcanzaron asimismo éxito en el aclaramiento de las estructuras
primaria y de orden superior de los péptidos y las actividades
fisiológicas sobre los canales K^{+} con compuertas de voltaje y
la inhibición de la producción de IL-2 de los
mismos. De acuerdo con ello, péptidos que tengan estructuras
similares primaria y/o de orden superior a las de HsTX1, aun cuando
los mismos incluyan deleciones, adiciones o sustituciones de una
porción del aminoácido, pueden ser útiles también como péptidos que
tienen actividad bloqueadora sobre los canales K^{+} con
compuertas de voltaje y actividad inhibidora sobre la producción de
IL-2.
De acuerdo con la presente invención, se pueden
proporcionar, como péptidos afines a la toxina de escorpión,
péptidos representados por SEQ ID No: 1 en la cual están presentes
0-4 puente disulfuro y sus péptidos afines. Entre
ellos, HsTX1 es el primer péptido descubierto de neuropéptidos que
tienen cuatro puentes disulfuro en la molécula y compuestos de 34
residuos de aminoácidos. Basándose en el hecho de que la actividad
inhibidora de HsTX1 sobre los canales K^{+}v1.3 es prácticamente
reversible, se espera que HsTX1 tenga una toxicidad
satisfactoriamente baja.
Entre los péptidos de acuerdo con la presente
invención, HsTX1 inhibía significativamente la producción de
IL-2 por las células T de la sangre periférica
humana a una concentración de al menos 0,1 nM. Dado que
IL-2 es una citoquina que promueve la
diferenciación y proliferación de las células T, dicha inhibición
de la producción de IL-2 podría conducir a la
inhibición de la activación de las células T.
De acuerdo con ello, es de esperar que los
péptidos de la presente invención y sus análogos contribuyan a la
aplicación de péptidos afines a la toxina de escorpión para
reactivos bioquímicos en neurofisiología así como a la aplicación a
medicamentos humanos y veterinarios con inclusión de los
correspondientes a las enfermedades de rechazo inverso (GVHD),
enfermedades autoinmunológicas y trasplante de órganos.
| INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1 |
| LONGITUD: 34 |
| TIPO: aminoácido |
| TIPO DE MOLÉCULA: péptido |
| FUENTE ORIGINAL: |
| \hskip1cm ORGANISMO: escorpión (Heterometrus spinnifer) |
| CARACTERÍSTICA: |
| \hskip1cm OTRA INFORMACIÓN: el terminal C está amidado |
| \hskip1cm LOCALIZACIÓN: 34 |
| \hskip1cm MÉTODO PARA DETERMINACIÓN: E |
| DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1: |
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ser Cys Arg Thr Pro Lys Asp Cys Ala Asp
Pro Cys Arg Lys Glu}
\sac{Thr Gly Cys Pro Tyr Gly Lys Cys Met Asn Arg
Lys Cys Lys Cys Asn}
\sac{Arg Cys}
Claims (9)
1. Un péptido representado por una secuencia de
aminoácidos de:
en el cual el terminal C puede
estar amidado y están presentes 0 a 4 puentes disulfuro en la
molécula, en
donde
dichos puentes disulfuro se seleccionan del grupo
constituido por Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34}.
2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual están presentes cuatro puentes disulfuro en
Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34}.
3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1,
en el cual están presentes cuatro puentes disulfuro en
Cys^{3}-Cys^{24},
Cys^{9}-Cys^{29},
Cys^{13}-Cys^{31} y
Cys^{19}-Cys^{34}, y el terminal C está
amidado.
4. Un agente bloqueador de los canales K^{+}
con compuertas de voltaje, que comprende el péptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Uso del péptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un agente
bloqueador de los canales K^{+} con compuertas de voltaje.
6. Un inhibidor de la producción de
interleuquina-2, que comprende el péptido de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. Uso del péptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un inhibidor de
la producción de interleuquina-2.
8. Un agente inmunosupresor que comprende el
péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
3.
9. Uso del péptido de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un agente
inmunosupresor.
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