ES2267132T3 - Dimero de subtilisina con actividad mejorada y proceso para producirlo. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN MULTIMERO ENZIMATICO, EL CUAL COMPRENDE DIVERSAS UNIDADES MONOMERICAS QUE INCLUYEN UNA PRIMERA UNIDAD MONOMERICA CON ACTIVIDAD ENZIMATICA Y UNA SEGUNDA UNIDAD ENZIMATICA CON ACTIVIDAD ENZIMATICA, COMPRENDIENDO CADA UNA DE DICHAS PRIMERA Y SEGUNDA UNIDADES MONOMERICAS, UN RESIDUO DE CISTEINA, Y ESTANDO UNIDOS COVALENTEMENTE ENTRE SI LOS RESIDUOS DE CISTEINA DE CADA UNIDAD MONOMERICA, A TRAVES DE UN PUENTE DISULFURO QUE UNE LAS DOS UNIDADES ENTRE SI.

Description

Dímero de subtilisina con actividad mejorada y proceso para producirlo.

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a la producción de un agregado enzimático que presenta unas prestaciones mejoradas y las características de uso. Más concretamente, la presente invención se refiere a un multímero enzimático que comprende unidades monoméricas de origen homólogo o heterólogo que han sido enlazadas unas a otras covalentemente. El multímero enzimático de la invención presenta ventajas tales como unas prestaciones mejoradas en térmicos de actividad, alergenicidad o interacciones enzima-sustrato.

2. Estado de la técnica

Se han sugerido múltiples agregados enzimáticos para disminuir la alergenicidad de la(s) enzima(s) componente(s) aumentando su tamaño. Por ejemplo, la Publicación PCT Nº 94/10191 describe proteínas oligoméricas que presentan una menor alergenicidad que la proteína monomérica original, y propone varias técnicas generales para aumentar el tamaño de la enzima original. Adicionalmente, los agregados enzimáticos han demostrado mejores características en circunstancias aisladas. Por ejemplo, Naka y col., Chem. Lett., vol. 8, pag. 1303-1306 (1991) describe un agregado de peroxidasa de rábano picante preparado mediante la formación de un copolímero bloque a través de una copolimerización en bloque de 2 etapas entre 2-butil-2-oxazolina y 2-metil-2-oxazolina. El agregado presentó una actividad más de 200 veces superior en cloroformo saturado en agua que la enzima nativa.

Se ha sugerido que las enzimas entrecruzadas preparadas mediante la adición de glutaraldehído pueden ser un medio para estabilizar enzima. Sin embargo, el entrecruzamiento a menudo conduce a pérdidas de actividad en comparación con la enzima nativa.

Se ha sugerido que las enzimas entrecruzadas preparadas mediante la adición de glutaraldehído constituyen un medio de estabilizar enzimas. Sin embargo, el entrecruzamiento a menudo conduce a una pérdida de actividad, en comparación con la enzima nativa. Por ejemplo, Khare y col., Biotechnol. Bioeng., vol. 35, nº 1, pag. 94-98 (1990), describe un agregado de \beta-galactosidasa de E. coli producido con glutaraldehído. El agregado de enzima, aunque muestra una mejoría en la estabilidad térmica a 55ºC, presentó una actividad únicamente del 70,8% de la correspondiente a la enzima nativa, que sin embargo se consideró un buen mantenimiento de la actividad tras el entrecruzamiento.

Wells y Powers (J. Biol. Chem. 15 de mayo de 1986; 261 (14): 6564-70) describen la introducción de un enlace intramolecular de disulfuro entre las posiciones 22 y 87, o 24 y 87, en la subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens.

Como debe entenderse a partir de lo anteriormente expuesto, los especialistas en la técnica han desarrollado varias alternativas que buscan producir enzimas agregadas con el propósito de disminuir la alergenicidad o de alterar los parámetros de actividad. Sin embargo, un problema común a todos estos procesos es que, cuando se preparan enzimas agregadas de acuerdo con estas técnicas anteriores, no se cree que sea posible predecir cómo se comportarán determinadas enzimas en forma agregada.

Además, la formación de un agregado de enzima de acuerdo con estas técnicas anteriores es una ciencia inexacta que es altamente dependiente de la casualidad, y por tanto presenta una barrera significativa a la preparación de un agregado multienzimático que tenga actividades preseleccionadas.

Para solucionar estos problemas, los investigadores han desarrollado agregados enzimáticos que comprenden proteínas de fusión predeterminadas. En una proteína de fusión típica, el gen correspondiente a una proteína se fusiona con el gen correspondiente a una segunda proteína y la enzima de combinación resultante se expresa como una unidad integral. Dichas proteínas de fusión, aplicadas a enzimas, aunque proporcionan una ventaja importante en términos de proporcionar una única proteína que combina múltiples actividades enzimáticas, son problemáticas en términos de expresión y/o de secreción en una célula hospedante adecuada. Por ejemplo, la ruptura proteolítica, el despliegue indebido y los problemas de secreción dentro de la célula que resultan del tamaño o de la estructura terciaria, constituyen unas significativas desventajas de la tecnología enzimática de fusión.

Del mismo modo, sería deseable desarrollar un nuevo medio para preparar múltiples sistemas enzimáticos útiles con fines médicos, diagnósticos o industriales, que sean capaces de ser adaptados en términos de actividades enzimáticas incluidas y de interrelaciones posicionales de dichas enzimas, de tal modo que se maximice la cinética de la aplicación específica. Además, sería deseable desarrollar un nuevo medio de preparación de sistemas de enzimas múltiples que no presente los problemas de expresión y de característica de secreción de las proteínas de fusión, y que permita una flexibilidad en la determinación de la conformación de la enzima múltiple resultante. Sin embargo, la técnica anterior no proporciona un medio para producir un sistema de enzima múltiple que tenga dichas
características.

Resumen de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un multímero enzimático que tenga una actividad alterada, un perfil de actividad alterado, unos requerimientos medioambientales alterados u otras características de prestaciones alteradas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un multímero enzimático que pueda ser producido fácilmente e incorporado a procesos y a productos ya existentes.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un multímero enzimático que pueda poseer una pluralidad de actividades enzimáticas.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una actividad enzimática que pueda tener características de alergenicidad mejoradas.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un multímero enzimático que comprende una pluralidad de unidades monoméricas que incluyen una primera unidad monomérica que tiene actividad enzimática y una segunda unidad monomérica que tiene actividad enzimática, en la que dicha primera unidad monomérica y dicha segunda unidad monomérica comprenden un residuo de cisteína y dichos residuos de cisteína están unidos covalentemente unos a otros a través de un enlace mediado por un grupo tio, para unir covalentemente dicha primera unidad monomérica con dicha segunda unidad monomérica.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra un modelo de la estructura terciaria de un dímero deducida a partir de medidas de estructura cristalina real de unidades monoméricas GG36. El centro activo de las unidades monoméricas se designa región "A", los iones de calcio se designan región "B" y la posición de la cisteína introducida y del enlace covalente mediado por grupos tio se designa región "C".

La Figura 2 ilustra los resultados comparativos de actividad de hidrólisis de proteína de la leche desnatada de S24C (monómero) y de GG36 (monómero) a 4 ppm y a 8 ppm en presencia de DTT.

La Figura 3 ilustra los resultados comparativos de actividad de hidrólisis de proteína de la leche desnatada del dímero GG36-S24C y de GG36 (monómero) a 4 ppm y a 8 ppm.

La Figura 4 ilustra el transcurso de la reacción de hidrólisis de queratina con S24C (dímero) y con GG36 (monómero) a 8 ppm durante 120 minutos.

La Figura 5 ilustra la actividad de S24C (dímero) y de GG36 (monómero) sobre la queratina a 0-8 ppm tras 120 minutos.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un multímero enzimático que comprende una pluralidad de unidades monoméricas que incluyen una primera unidad monomérica que tiene actividad enzimática y una segunda unidad monomérica que tiene actividad enzimática, en la que cada una de la primera unidad monomérica y de la segunda unidad monomérica comprende un residuo de cisteína, y los residuos de cisteína de cada unidad monomérica están unidos covalentemente unos a otros a través de un enlace de disulfuro que une covalentemente la primera unidad monomérica a la segunda unidad monomérica. Sorprendentemente, los Solicitantes han descubierto que el multímero enzimático de acuerdo con la invención presenta una actividad mejorada.

"Multímero enzimático" significa una única molécula proteica compuesta por al menos dos enzimas individuales que están unidas covalentemente. Por tanto, un multímero enzimático de acuerdo con la presente invención tendrá al menos dos centros distintos capaces de catalizar una reacción química, es decir, al menos dos centros activos. Las enzimas individuales, denominadas "unidades monoméricas" en la presente memoria, comprenden variantes de una subtilisina de Bacillus original enzimáticamente activa. Otras unidades monoméricas comprenden una hidrolasa tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una estearasa, una lipasa o una hemicelulasa; una enzima que cataliza una reacción de oxidación-reducción (una oxido-reductasa) tal como una peroxidasa, una microperoxidasa, una lacasa, una ligninasa, una oxidasa, una NADH reductasa, una 2,5 DKG reductasa; una transferasa; una isomerasa tal como una glucosa isomerasa o una xilosa isomerasa; una lipasa; o una ligasa o sintetasa. Se contempla que las unidades monoméricas de la enzima multimérica puedan ser la misma enzima, la misma actividad procedente de una proteína enzimática diferente, o enzimas completamente diferentes. Por tanto, las unidades monoméricas pueden ser "homólogas" o "heterólogas". En una realización preferida, las unidades monoméricas comprenden una proteasa o amilasa bacteriana, más preferiblemente una proteasa o amilasa bacteriana derivada de un Bacillus, y más preferiblemente de Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus stearothermophilus o Bacillus amyloliquefaciens.

"Proteína homóloga" o "enzima homóloga" tal como se usa en la presente memoria significa dos o más proteínas o enzimas que derivan de organismos taxonómicamente idénticos, o que tienen propiedades idénticas. Por ejemplo, dos celulasas idénticas derivadas de una cepa específica de Bacillus serían homólogas. Por el contrario, "proteínas heterólogas" o "enzimas heterólogas" tal como se usan en la presente memoria significan dos o más proteínas o enzimas que derivan de organismos taxonómicamente distintos. Por ejemplo, una proteína derivada de distintos géneros, tales como E. coli y Bacillus licheniformis, en la presente memoria se considera heteróloga. Adicionalmente, proteínas derivadas de especies taxonómicamente distintas, tales como Bacillus amyloliquefaciens y Bacillus subtilisin, se consideran heterólogas para los propósitos de la presente invención. Tal como se usan en la presente memoria, dos enzimas diferentes derivadas del mismo microorganismo, por ejemplo la EGI celulasa y la EGII celulasa derivadas de T. longibrachiatum, se consideran heterólogas.

Se contempla que un multímero homólogo puede ser útil para dichos procesos como mejora de la actividad o de la eficacia catalítica o para disminuir la alergenicidad cuando se compara con la enzima individual precursora. Por ejemplo, en un dímero enzimático producido a partir de dos proteasas homólogas, el dímero de proteasa resultante puede exhibir una actividad mejorada o una menor alergenicidad con respecto al monómero de proteasa. Alternativamente, se puede producir un multímero en el que una unidad monomérica exhibe características enzimáticas diferentes a las de la segunda unidad monomérica, y que aún así funcionan de modo complementario. Por ejemplo, en la Patente de EE.UU. Nº 4.933.279, se alega que la mezcla de amilasa natural de Bacillus licheniformis y de amilasa natural de Bacillus amyloliquefaciens proporciona un beneficio en las prestaciones en la licuefacción de almidón. Como resultado, se contempla que un dímero enzimático que comprende una primera unidad monomérica derivada de amilasa de Bacillus licheniformis y una segunda unidad monomérica derivada de Bacillus stearothermophilus sería de especial valor. De forma similar, una primera unidad monomérica derivada de una lipasa precursora y una segunda unidad monomérica derivada de una proteasa precursora tendrían beneficios particulares para detergentes de lavandería debido a su actividad complementaria esperada sobre una cepa que comprende una matriz proteína/lípido.

La enzima multimérica de la presente invención difiere de las enzimas naturales en que incluye dos o varias subunidades. Estas enzimas naturales a menudo se caracterizan porque todas las subunidades deben estar presentes en una orientación específica para que se produzca la actividad enzimática, y contendrán únicamente un centro activo en la combinación de subunidad. De hecho, la actividad de algunas enzimas depende de que la enzima esté en una forma multimérica en la que los monómeros que constituyen el multímero no presente actividad enzimática por sí mismos. Los monómeros específicos que constituyen el multímero a menudo se mantienen juntos mediante interacciones iónicas o hidrofóbicas, y no mediante interacciones intermoleculares covalentes de disulfuro o de o mediante otros enlaces químicos mediados a través de reacciones de azufre de cisteína como en la presente invención. Además, la presente invención contempla la unión de distintas unidades enzimáticas (definidas en la presente memoria como unidades monoméricas) mediante enlace(s) de disulfuro, formando de este modo una enzima multimérica que tiene múltiples centros activos.

En la invención, el multímero enzimático comprende una primera unidad monomérica que ha sido modificada a partir de la enzima precursora correspondiente para incluir un residuo de cisteína en la posición apropiada. La primera unidad monomérica es un derivado de una enzima precursora y difiere en la sustitución o adición específica de posición de al menos un residuo de cisteína. Por "derivado" se entiende que el precursor comprende una secuencia de aminoácidos que ha sido modificada a partir de su secuencia progenitora u original, por medios bioquímicos, genéticos o químicos, para efectuar la sustitución, eliminación o inserción de uno o más aminoácidos. Un "derivado" dentro del alcance de la presente definición debería poseer las propiedades enzimáticas deseadas observadas en la forma nativa u original hasta el punto de que se pretende que el derivado sea útil para propósitos similares a los del precursor. La enzima precursora puede ser cualquier enzima o variante de la misma que posea la actividad enzimática deseada.

La posición dentro de la enzima en la que se localiza el residuo de cisteína añadido o sustituido debería seleccionarse de tal modo que se asegure la no interferencia con el mecanismo de reacción del centro activo. Por tanto, en una realización preferida, la localización del residuo de cisteína añadido o sustituido se selecciona para que no esté en estrecha proximidad con los residuos que se encuentran en el centro activo, o que sean críticos para la unión del sustrato, más preferiblemente, la cisteína añadida o sustituida se encuentra a una distancia superficial relativamente grande del centro activo y/o de la posición de unión del sustrato con respecto al tamaño total de la molécula. De este modo, en una realización, el enlace de disulfuro incluirá dos residuos de cisteína que están sobre o cerca de la superficie de la unidad monomérica a una distancia en la superficie de la proteína que es máxima con respecto a la posición del residuo de centro activo o del residuo de unión de sustrato. Diferentes enzimas tendrán diferentes estructuras terciarias, lo que cambiará la distancia óptima para la adición o sustitución de cisternas de tal modo que se limite la interferencia catalítica o con la unión de sustrato.

Sin embargo, con una enzima tal como la proteasa procedente de Bacillus lentus, que tiene unas dimensiones generales de 45\ring{A} x 45\ring{A} x 45\ring{A}, debería ser posible colocar una cisteína añadida o sustituida a una distancia de al menos 10 Angstroms, preferiblemente de 15 Angstroms y más preferiblemente de 20 Angstroms. Aunque la existencia de una estructura terciaria desarrollada mediante cristalografía de rayos-X facilitará la elección de una posición para la cisteína añadida o sustituida, es posible obtener dicha información sobre la posición sin tales datos. Por ejemplo, es posible mapear la localización del centro activo o de la posición de unión de sustrato mediante entrecruzamiento o mediante otros métodos reconocidos tales como la modificación con tirosina y posterior medida de la actividad, como en Svendsen, Carlsberg Res. Communication, vol. 41, nº 5, pág. 237-291 (1976). Con estos datos, será posible seleccionar aminoácidos que se sabe que no son del centro activo que se encuentren en la superficie de la proteína.

Generalmente, cuando se desea una actividad incrementada, los centros activos de las unidades monoméricas deberían alinearse de un modo apropiado para permitir un acceso máximo a los centros activos de las unidades monoméricas del sustrato. Por ejemplo, una proteasa multimérica que se pretende que actúe sobre un sustrato de alto peso molecular o de poca difusividad, por ejemplo, queratina, preferiblemente se produciría de tal modo que los centros activos de las unidades monoméricas estuvieran alineadas de forma similar para exponer de forma máxima los centros activos al sustrato planar. De forma similar, se espera que la actividad de una \alpha-amilasa multimérica sobre almidón, de celulasa sobre celulosa o de hemicelulasa sobre pulpa de madera se vea potenciada cuando los centros activos están alineados de tal como que permitan el acceso a la misma superficie del sustrato. Se pueden incluir múltiples actividades dentro de la enzima multimérica con propósitos complementarios o sinérgicos. Por ejemplo, una enzima multimérica que comprende una peroxidasa y una celulosa para su uso en detergentes sería útil para el doble propósito de tratar un tejido celulósico con la celulasa y de evitar la transferencia de colorante del colorante eliminado de la celulosa mediante la actividad de una peroxidasa. En ese caso, puede ser ventajoso colocar el centro activo de peroxidasa de tal modo que el colorante liberado desde el tejido por acción de la celulasa sea atacado por la peroxidasa.

A modo de ejemplo específico, los inventores descubrieron que alterando un residuo de serina de la posición +24 de la molécula enzimática de proteasa GG36 de Bacillus lentus por cisteína, era posible mejorar el perfil de actividad de la proteasa. En referencia a la Figura 1, es evidente que la localización de los residuos de cisteína introducidos parece ser de tal modo que se encuentra en la parte posterior con respecto a la localización del centro catalítico.

La formación de la enzima multimérica a partir de unidades monoméricas individuales se puede llevar a cabo en condiciones oxidantes conocidas en la técnica por facilitar la formación de un enlace mediado por grupos tio entre los residuos de cisteína. En general, se formará un enlace de disulfuro de forma espontánea en las condiciones apropiadas bien conocidas (por ejemplo, al entrar en contacto con oxígeno o con aire), en el que la cisteína sustituida o añadida de cada unidad monomérica es capaz de formar un enlace de disulfuro. Otros enlaces mediados por grupos tio que se encuentran dentro del alcance de la invención incluyen el uso de ligandos producidos con N-etilmaleimida; N,N'-p-fenilendimaleimida o bis-maleimidohexano.

Se contempla que las enzimas multiméricas de acuerdo con la presente invención tendrán uso en cualquier aplicación en la que las enzimas tengan uso. Por ejemplo, las enzimas multiméricas serían útiles en cualquier aplicación reconocida de enzimas. Por ejemplo, la degradación de celulosa o de almidón a oligosacáridos o a glucosa, detergentes para limpieza, fabricación y lavado de textiles, alimentación, aditivos de piensos para animales y la fabricación de pulpa y papel, son ejemplos bien conocidos de procesos y productos industrialmente importantes en los que la aplicación de enzimas ha encontrado utilidad y, por tanto, en los que la presente invención proporcionaría ventajas.

Un resultado especialmente sorprende de la presente invención es que la actividad de una enzima o enzimas específicas se puede aumentar mediante la formación de una enzima multimérica que comprende la actividad o actividades deseadas. Tal como se muestra en los siguientes ejemplos, es posible producir una enzima multimérica que presenta una actividad mejorada en términos de velocidad de reacción en comparación con una concentración igual de centros activos de enzima monomérica siguiendo las enseñanzas de la invención. De forma similar, se contempla que la actividad global, la vida media y las características de prestaciones tales como la dependencia con el pH o con la temperatura, se pueden alterar en una enzima multimérica en comparación con la enzima unitaria monomérica, o con la enzima precursora, de la cual deriva.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la invención y no deberían interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de Dímero de Proteasa GG36

La clonación y la construcción de la expresión de gen de subtilisina (GG36) de Bacillus lentus se describe esencialmente en la Patente de EE.UU. Nº 5.185.258, cuya descripción se incluye a modo de referencia en la presente memoria. La construcción de la variante S24C de GG36 se llevó a cabo de conformidad con la mutagénesis estándar dirigida por oligonucleótidos, tal como se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.185.258 y en la Publicación PCT Nº WO 95/10615 (Genencor Internacional, Inc.), usando el primero de oligonucleótido

5' CGTGGATTGACCGGTTGTGGTGTAAAAGTT 3'

para crear el cambio de Ser por Cys en la posición 24 de la secuencia de subtilisina madura. El residuo de C subrayado creó la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción Agel y el G subrayado denotó el cambio del codón TCT (ser) al codón TGT (cys). Las condiciones de fermentación para la preparación del mutante y de las enzimas naturales fueron como se describe en el documento de EE.UU. 5.185.258. El mutante GG36-S24C preparado como se ha indicado anteriormente a continuación fue expuesto a aire para permitir la formación del mutante dimerizado.

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Ejemplo 2

Purificación del Dímero GG36 de Proteasa

Un concentrado de ultrafiltrado de caldo de GG36-S24C preparado como en el Ejemplo 1 y tratado con DTT fue desalado (columna G-25) y pasado por una columna cromatográfrica de intercambio catiónico (columna BioCad HS/M) a pH 8,0. El análisis en un sistema de gel SDS-Phast reveló que una fracción contenía una enzima dimerizada que tenía un peso molecular de aproximadamente el doble que la proteasa GG36 monomérica natural, lo que indica la presencia de una forma dimerizada de GG36-S24C. Después de ser sometido a cromatografía de intercambio catiónico, el dímero se ha separado suficientemente de cualquier proteasa no dimerizada en el caldo como para proporcionar una única banda en los geles nativo y de SDS.

Ejemplo 3

Comparación de Dímero de Proteasa, Monómero Mutante y Enzima Natural en la Hidrólisis de Leche Desnatada

La caseína es la principal proteína en la leche desnatada, comprendiendo aproximadamente el 80% del total de proteínas. La hidrólisis de la leche desnatada es un método excelente para cuantificar la actividad de proteasa debida a la presencia de muchas proteínas además de la caseína en la leche desnatada. El dímero GG36-S24C obtenido y purificado como se ha indicado en los Ejemplos 1 y 2 se evaluó en un ensayo de hidrólisis de caseína y se comparó con el monómero de GG36. El GG36 natural y el GG36-S24C fueron preparados por separado con la misma concentración (medida por actividad de proteasa) y cada disolución se mezcló con DTT 50 mM en Tris-HCl 100 mM (pH 8,6) a 4ºC. Como control se usó Tris-HCl 10 mM (pH 8,6) con DTT 50 mM sin enzima. Se usó DTT para romper cualquier enlace de disulfuro presente en el dímero GG36-S24C.

Se ajustó la leche desnatada a pH 10-10,3 con NaOH y se combinaron alícuotas de 180 \muL con 20 \muL de disolución de la enzima apropiada (GG36 con o sin adición de DTT, y GG36-S24C con o sin adición de DTT) hasta una concentración final de 2, 4 u 8 ppm. También se usó un control con y sin DTT. A continuación, las mezclas fueron colocadas en una placa de microtitulación de 96 pocillos y sometidas a agitación a 37ºC. Se midió la turbidez de la disolución a 650 nm cada 15 minutos durante un periodo de una hora en un lector de microplaca cinético (Molecular Devices, Inc. Mountain View, CA). Un descenso en la turbidez es indicativo de hidrólisis de la proteína en la leche desnatada.

Los resultados se muestran en las Figuras 2 y 3. La Figura 2 demuestra que los resultados del monómero S24C fueron equivalentes a los del monómero GC36. Esto fue necesario debido a que no era posible evaluar el monómero S24L frente al dímero S24C en idénticas condiciones, es decir, en ausencia o en presencia de DTT en ambos casos. Del mismo modo, el dímero S24C fue comparado con el monómero GC36 en ausencia de DTT, como se muestra en la Figura 3. El dímero GG36-S24C superó de forma consistente al monómero GG36 a lo largo del experimento. En concreto, merece la pena comparar el tiempo necesitado por el dímero para alcanzar un grado específico de pérdida de turbidez y compararlo con el tiempo necesario para que el GG36 natural alcance el mismo grado de pérdida de turbidez. Por ejemplo, en la Figura 3 a un tiempo de 15 minutos, la concentración de 2 ppm de dímero GG36-S24C dio como resultado una pérdida de turbidez de aproximadamente el 20%. El tiempo requerido por la enzima GG36 natural para alcanzar una pérdida de turbidez del 20% fue aproximadamente el doble, es decir, aproximadamente 30 minutos. Este efecto se observa consistentemente en la comparación del dímero y del monómero natural con leche desnatada.

Ejemplo 4

Comparación de Dímero de Proteasa, Monómero Mutante y Enzima Natural en la Hidrólisis de Queratina

El dímero GG36-S24C obtenido y purificado como se indica en los Ejemplos 1 y 2 se evaluó en un ensayo de hidrólisis de queratina, y se comparó con el monómero GG36. Tanto el GG36 natural como el GG36-S24C fueron preparados a la misma concentración y combinados con DTT 50 mM en Tris-HCl 100 mM (pH 8,6) a 4ºC. Como control se usó Tris-HCl (pH 8,6) con DTT 50 mM sin enzima.

Se suspendió queratina en polvo de pezuña bovina y de cuerno bovino (ICN Biomedicals Inc., Cat. Nº 90211) en tampón de carbonato sódico 100 mM a pH 10,3, y se agitó vigorosamente durante 15 minutos. Se colocaron 1,5 mL de la disolución de queratina en cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se añadieron 15 \muL de disolución enzimática en diversas concentraciones (0,8; 0,4; 0,2; 0,1 ó 0,0 mg/mL de enzima) para dar lugar a una concentración final de 8, 4, 2 y 0 ppm de proteína. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente y se extrajeron dos alícuotas de 15 \muL de cada pocillo cada 30 minutos durante un periodo de dos horas. Cada alícuota se colocó en 15 \muL de reactivo A (20:1 borato 0,25M y NaOH 2,5M) en una placa de microtitulación de 96 pocillos, y se mezclaron con 15 \muL de TNBS con una concentración de 3,5 mg/mL. Se agitó la placa de microtitulación a temperatura ambiente durante 10 minutos y se añadieron 230 \muL de reactivo B (105,52 mg de Na_{2}SO_{3} en 200 mL de fosfato 0,212M, pH 4,0). Se leyó la absorbancia a 405 nm en un lector cinético de microplacas (Molecular Devices, Inc., Mountain View, CA) para determinar la cantidad de grupos amino libres liberados por la hidrólisis de la queratina en cada pocillo.

Los resultados se muestran en las Figuras 4 y 5.

Claims (8)

1. Un dímero enzimático que tiene una actividad de subtilisina mejorada, que comprende una primera unidad monomérica que tiene actividad enzimática y una segunda unidad monomérica que tiene actividad enzimática, siendo la primera unidad enzimática y la segunda unidad enzimática variantes de una subtilisina de Bacillus original enzimáticamente activa,

cada una de dichas unidades monoméricas difiere de la subtilisina de Bacillus original en la sustitución o adición de un residuo de cisteína,

y los residuos de cisteína están unidos covalentemente unos con otros mediante enlaces de disulfuro que unen la primera unidad de subtilisina con la segunda unidad de subtilisina,

estando localizados los residuos de cisteína en una posición que no es el centro catalíticamente activo ni la posición de unión del sustrato de cada unidad monomérica.

2. El dímero enzimático de la reivindicación 1, en el que la primera unidad monomérica de subtilisina y la segunda unidad monomérica de subtilisina son homólogas.

3. El dímero enzimático de la reivindicación 1, en el que la primera unidad monomérica de subtilisina y la segunda unidad monomérica de subtilisina son heterólogas.

4. El dímero enzimático de la reivindicación 1, en el que el precursor de subtilisina de Bacillus enzimáticamente activa se selecciona del grupo que consiste en una subtilisina derivada de Bacillus lentus, Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus stearothermophilus y Bacillus licheniformis.

5. El dímero enzimático de la reivindicación 2, en el que la primera unidad monomérica de subtilisina y la segunda unidad monomérica de subtilisina derivan de una subtilisina de Bacillus lentus.

6. El dímero enzimático de la reivindicación 1, en el que la primera unidad monomérica y la segunda unidad monomérica están unidas covalentemente una a la otra a través de un enlace de disulfuro localizado en una posición que corresponde con la posición del residuo 24 de la subtilisina de Bacillus lentus designada GG36.

7. Un método para producir un dímero enzimático de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a) preparar los monómeros primero y segundo, que tienen actividad enzimática, mediante la adición de o la sustitución con un residuo de cisteína, en posiciones que no sean el centro catalíticamente activo ni la posición de unión del sustrato, en los monómeros primero y segundo de un precursor de subtilisina original de Bacillus enzimáticamente activa; y

(b) mezclar los monómeros primero y segundo en las condiciones que den lugar a la formación de un enlace de disulfuro entre dicho residuo de cisteína añadido o sustituido de dichos monómeros primero y segundo.

8. Una composición detergente que comprende la enzima dimérica de la reivindicación 1.