ES2295087T3

ES2295087T3 - Heparinas desulfatadas no anticoagulantes como medicamentos.

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Publication number: ES2295087T3
Application number: ES01115601T
Authority: ES
Inventors: Thomas P. Kennedy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-07-24
Filing date: 1993-07-23
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2013-07-23
Also published as: ATE213636T1; DK1164145T3; WO1994002107A3; AU4782493A; DE69334190D1; ATE380047T1; WO1994002107A2; JPH08511764A; PT1164145E; CA2140890C; DE69331633D1; AU688272B2; CA2140890A1; EP0651645B1; EP0651645A1; EP1164145A2; EP1164145A3; DE69334190T2; DE69331633T2; ES2173893T3

Abstract

Heparina desulfatada no anticoagulante, que se puede obtener ajustando una solución acuosa de heparina al pH 13 con hidróxido sódico de tal manera que se produce O-desulfatación en la posición 2-O seguida por la liofilización de la solución y eliminando el exceso de hidróxido sódico para su utilización en terapia.

Description

Heparinas desulfatadas no anticoagulantes como medicamentos.

La presente invención se refiere al tratamiento médico de mamíferos y más en particular a medicamentos para el control de elastasa neutrófila y catepsina G en mamíferos.

Los neutrófilos activados desempeñan un papel importante en varias enfermedades que pueden padecer los humanos u otros mamíferos al liberar, después de la migración hacia el órgano afectado, una serie de productos químicos oxidantes y enzimas. Así como los oxidantes, tales como el anión superóxido, el hidrógeno peróxido y el ácido hipocloroso son ellos mismos nocivos, los elementos más destructivos producidos por los neutrófilos activados son las proteasas catiónicas, cuya masa se compone de elastasas y catepsina G. Cuando los neutrófilos liberan estas proteasas, se produce una destrucción del tejido, a no ser que se neutralicen las proteasas con una cantidad suficiente de antiproteínasas extracelulares, tales como la \alpha-1-antiproteínasa.

Los individuos con una deficiencia hereditaria de \alpha-1-antiproteínasa padecen inevitablemente, a lo largo de su vida, una destrucción proteolítica del pulmón que finalmente puede desembocar en el desarrollo de enfisemas pulmonares. El consumo de cigarrillos da lugar a un influjo de leucocitos activados en el pulmón, con la subsiguiente desgranulación y liberación de proteasas. Los oxidantes procedentes de los cigarrillos dejan también inactiva la \alpha-1-antiproteinasa, al oxidarse una metionina importante cerca de la zona activa. La elastasa que llega a la unidad pulmonar alveolar debido al influjo causado por el consumo de cigarrillos, junto con la inactivación por oxidación de la actividad de la \alpha-1-antiproteínasa, provocan un desequilibrio en la actividad de la proteasa/antiproteasa que parece ser el factor más importante causante del enfisema humano debido al consumo de cigarrillos.

Cuando este desequilibrio se produce en un conducto de aire, aparece una inflamación crónica del conducto de aire, y se cree que la elastasa y la catepsina G procedentes de los neutrófilos desempeñan un papel importante en la patogenesis de la bronquitis crónica. Si el desequilibrio se produce en la vasculatura pulmonar, el daño microvascular resultante origina la formación de un edema pulmonar. Así pues, el influjo de leucocitos activados y la liberación de elastasa y otras proteasas neutrófilas son las causas más importantes de las lesiones pulmonares que aparecen en los síndromes de insuficiencia respiratoria en adultos. La elastasa procedente de los neutrófilos es también una de las causas importantes de la destrucción proteolítica del pulmón en la fibrosis cística, una enfermedad que se caracteriza por una bronquitis mucopurulenta intensa y uno de los niveles más altos de actividad de elastasa que se han llegado a medir en una enfermedad humana.

También, las enfermedades como el infarto y accidente cerebrovascular, causados por una pérdida súbita del flujo sanguíneo en el órgano, seguida de una recuperación del flujo sanguíneo (lesión por isquemia-reperfusión), se caracterizan por un aumento de la destrucción de tejido durante la fase de reperfusión, cuando los leucocitos activados invaden rápidamente el tejido ya dañado. Se ha podido demostrar que la elastasa neutrófila, que se libera en los órganos reperfusionados por isquemia, desempeña un papel principal en la patogénesis de la lesión por reperfusión de miocardio, intestinos y otros tejidos. El papel que desempeña la catepsina G en los procesos mencionados anteriormente no ha llegado a estudiarse aún tan detenidamente, pero es muy probable que tenga una importancia muy similar ya que en los neutrófilos se encuentran dos veces más catepsina G que elastasa.

Debido a que la elastasa y la captesina G son los mediadores de una variedad de enfermedades humanas importantes, el desarrollo de unos inhibidores efectivos de estas enzimas es un objetivo que se persigue insistentemente en la farmacología experimental. Sin embargo, hasta la fecha, no existe ningún inhibidor que sea completamente efectivo y seguro tanto en el caso de la elastasa como en el de la catepsina G. Se desarrolló un inhibidor orgánico de la elastasa (C.P. Sommerhoff, et al, European Journal of Pharmacology (1991) 193:153-158), pero éste no llegó a presentar una actividad contra la catepsina G. Hay dos biomoléculas, un inhibidor de \alpha-1-antiproteínasa y un inhibidor de secreciones bronquiales, que son sensibles a la inactivación por medio de oxidantes neutrófilos pero que no parecen ser efectivas en los entornos biológicos en los que hay simultáneamente oxidantes neutrófilos y proteasas (D. C. Flenley, Quarterly Journal of Medicine (1986) 61:901-909; C. Vogelmeier, et al, Journal of Clinical Investigation (1991) 87:482-488). Se requiere un inhibidor que sea simultáneamente efectivo contra la elastasa y la catepsina G y que, en cambio, sea insensible tanto a la inactivación proteolítica como a la inactivación por oxidación. Los polisacáridos sulfatados poseen todas estas propiedades buscadas.

Se ha publicado anteriormente que la heparina y otros polisacáridos sulfatados son unos inhibidores no competitivos potentes de la elastasa y de la catepsina G procedentes de leucocitos humanos polimorfonucleares (N. V. Rao, et al, A. M. Rev. Respir. Dis. (1990) 142:407-412; A. Baici, et al, Biochem. Pharmacol. (1980) 29:1723-1727; A. Baichi, et al, Biochem. Pharmacol. (1981) 30:703-708; K. Marossy, Biochim. Biophys. Acta. (1981) 659:351-361; A. Bacici, et al, Chem-Biol. Interactions (1984) 51: 1-11; A. Lutini, et al, Biochem. Int. (1985) 10:221-232; F. Redini, et al, Biochem. J. (1988) 252:515-519; y F. Redini, et al, Biochem. Pharmacol. (1988) 37:4257-4261.) Se cree que esta inhibición se basa en la formación de unos enlaces electrostáticos entre los grupos sulfato, de carga negativa, del polisacárido y los grupos guanidinio, de carga positiva, de los residuos de arginina situados en la superficie de aquellas enzimas que son muy básicas, como son la elastasa o la catepsina G. La interacción no tiene ninguna influencia sobre el centro activo de la enzima, pero implica una pérdida indirecta de la actividad elastolítica.

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De todos los polisacáridos sulfatados, la heparina es la que tiene el historial más largo y seguro en cuanto a su uso en seres humanos. Desde un punto de vista toxicológico, la heparina es el inhibidor de elastasa y catepsina G más apropiado, pero tiene el inconveniente de que se trata de un anticoagulante, incluso cuando se libera selectivamente en el pulmón por medio de un aerosol. Se cree que la heparina se comporta como un anticoagulante debido a una secuencia repetida de sacáridos que forma un enlace con la proteína antitrombina III del plasma, acelerándose así enormemente la velocidad a la que la antitrombina inhibe el efecto procoagulante de la trombina en el proceso en cascada de la coagulación de la sangre. Sólo una parte de la heparina comercial forma un enlace con la antitrombina III, y el paso de la heparina por una columna de afinidad de antitrombina III-sefarosa elimina la fracción anticoagulante, dejando una fracción no del todo sulfatada que no posee la actividad anticoagulante. Sin embargo, el uso de este proceso para eliminar la actividad anticoagulante de la heparina no es lo suficientemente eficiente como para implantarlo a nivel comercial.

En la técnica anterior, se ha observado el hecho de que la actividad de un polisacárido como inhibidor de la elastasa de leucocitos polimorfonucleares humanos (ELH) y de la catepsina G depende directamente de la presencia de grupos de sulfato intactos. El sulfato de dextrano es un inhibidor potente de la elastasa, mientras que el dextrano no sulfatado no lo es. Además, se deduce de la bibliografía existente que incluso una desulfatación parcial de los polisacáridos ya elimina la actividad inhibidora frente a la ELH y catepsina G, mientras que una sobresulfatación química aumenta la actividad inhibidora. Se estudió la importancia de los grupos sulfato utilizando unos fragmentos de heparina obtenidos por medio de una despolimerización química con HNO_{2}, seguida de un filtrado del gel (F. Redini, et al, Biochem. J., (1988) 252:515-519). Los fragmentos de heparina sin modificar que se obtuvieron por medio de este último proceso resultaron ser unos inhibidores muy potentes de la elastasa, sin embargo, mantenían una capacidad anticoagulante importante. Al aumentar el grado de sulfatación por medio de una O-sulfatación química de los fragmentos, se incremetó su capacidad como inhibidores de la elastasa, pero no se consiguió modificar la actividad anticoagulante de los fragmentos. Por otra parte, con una N-desulfatación, seguida de una N-acetilación (para cubrir la carga positiva restante y reducir la actividad antigoagulante de los fragmentos), se eliminó completamente la actividad inhibidora respecto a la elastasa y captesina G de leucocitos humanos. Una sobre-O-sulfatación química de los fragmentos N-desulfatados no sólo permitió recuperar la actividad inhibidora, sino que proporcionó a los fragmentos una capacidad de inhibición superior en comparación con la de los equivalentes originales que tienen un grado de sulfatación similar, pero que incluyen grupos de N-sulfato. Se sugirió que no sólo el grado de sulfatación es un factor importante en la actividad inhibidora, sino que la presencia de O-sulfatos es incluso más importante que la de N-sulfatos. Sin embargo, ninguna de estas heparinas modificadas altamente efectivas es apropiada para su uso con mamíferos, debido a que siguen teniendo una actividad anticoagulante muy potente.

Existen varios procedimientos químicos para inactivar la heparina como anticoagulante. La mayoría de ellos se basan en técnicas de desulfatación química, ya que, como es bien sabido, el grado de sulfatación es un factor determinante en la actividad anticoagulante.

La N-desulfatación basada en el tratamiento de la sal de piridinio heparina con dimetilsulfóxido (DMSO) en metanol al 5% durante 1,5 horas a 50ºC y la desulfatación completa por medio de un tratamiento similar con DMSO en metanol al 10% durante 18 horas a 100ºC son las alteraciones químicas que suelen utilizarse generalmente para eliminar la actividad anticoagulante de la heparina. Otro procedimiento para eliminar la actividad anticoagulante de la heparina es la hidrólisis de ácido a 55-60ºC durante 72 horas que permite una N-desulfatación parcial. Sin embargo, la eliminación de todos los sulfatos o incluso la desulfatación parcial por medio de la eliminación de N-sulfatos tienen como efecto la inactivación de la heparina y de otros polisacáridos sulfatados como inhibidores de la elastasa y la catepsina G humanas. El estado de la técnica anterior indica pues que los procedimientos de desulfatación que se emplean hasta la fecha para eliminar la actividad anticoagulante de la heparina también destruyen la capacidad de la heparina para inhibir las proteasas catiónicas de los leucocitos, tales como la elastasa y la catepsina G.

Así, la técnica anterior muestra por lo tanto claramente que una sobresulfatación implica una mayor actividad contra la elastasa y la catepsina G, manteniéndose efectiva la actividad anticoagulante, mientras que una desulfatación implica una menor actividad anticoagulante y una actividad contra la elastasa y la catepsina G muy reducida. En contraposición a lo que cabría esperar conforme al estado de la técnica anterior, los autores de la presente invención han encontrado que la 2-O-desulfatación selectiva del 2-sulfato de ácido \alpha-L-idurónico elimina la actividad anticoagulante de la heparina sin destruir la actividad de la heparina modificada como inhibidora de la elastasa y la catepsina G.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico que inhiba la elastasa y la catepsina G en los mamíferos.

Otro objetivo de la presente invención es conseguir esta inhibición con un agente terapéutico que sustancialmente no induce ninguna actividad anticoagulante.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico para la inhibición de elastasa y catepsina G adaptadas a la administración por aerosol o intravenosa (IV).

Una ventaja de la presente invención consiste en que proporciona un agente terapéutica que inhibe sustancialmente la elastasa y la catepsina G sin inducir actividad anticoagulante.

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Otra ventaja adicional de la presente invención es que el agente terapéutico se produce a partir de un compuesto caracterizado toxicológicamente.

El hecho de tener en cuenta la memoria, que incluye varias figuras y ejemplos que se deben seguir, permitirá a un experto en la materia determinar objetivos y ventajas adicionales de la invención.

La presente invención proporciona un medicamento destinado a la inhibición de elastasa neutrófila y catepsina G en mamíferos que comprende una cantidad eficaz de tratamiento de heparina desulftada preparada mediante la eliminación de del 2-O-sulfato de las unidades sacáridas de 2-sulfato de ácido \alpha-L-idurónico de heparina. En las formas de realización preferidas de la invención, el medicamento se administra por aerosolización o por inyección intravenosa (IV). En otras formas de realización de la invención, la proporción efectiva de heparina 2-O-desulfatada y catepsina G se selecciona para que sea superior a aproximadamente 0,4 e inferior a aproximadamente 2,0. Preferentemente, el medicamento incluye un vehículo fisiológicamente aceptable que puede ser seleccionado de entre el grupo constituido por una solución salina tamponada fisiológicamente, solución salina normal, y agua destilada.

La referencia a la siguiente descripción detallada puede ayudar a explicar mejor la invención junto con los dibujos en los que:

La figura 1 muestra una fórmula química de ácido 2-0-desulfatado de ácido \alpha-L-idurónico en la secuencia de unión de pentasacáridos de la heparina;

la figura 2 muestra un esquema de reacción propuesto para la desulfatación de la posición 2-0 de ácido \alpha-L-idurónico en la secuencia de unión de pentasácaridos de la heparina;

la figura 3 representa gráficamente el número de células de leucocitos polimorfonucleares (PMN) que se encuentran en el líquido de lavado broncoalveolar 24 horas después de administrar, una solución salina (control), o bien elastasa de leucocitos humanos (ELH), ELH junto con heparina, o bien ELH junto con heparina desulfatada;

la figura 4 representa gráficamente el contenido de hemoglobina que se ha detectado en el líquido de lavado broncoalveolar 24 horas después de administrar, una solución salina (control), o bien ELH, ELH junto con heparina, o bien ELH junto con heparina desulfatada; y

la figura 5 representa gráficamente la concentración de proteína que se encuentra en el líquido de lavado broncoalveolar 24 horas horas después de administrar, una solución salina (control), o bien ELH, ELH junto con heparina, o bien ELH junto con heparina desulfatada.

La eliminación de 2-O-sulfato de un ácido \alpha-L-idurónico en la secuencia de unión de pentasacáridos de la heparina, tal como se ilustra en la fígura 1, se produce debido a la química de los carbohidratos sulfatados en condiciones alcalinas, química que describió por primera vez E.G.V. Percival en Quarterly Rev. (1949) 3:369-384, y que luego se revisó en J.P.R. Turvey, Adv. Carbohydrate Chem. (1965) 20:183-218. Un grupo de sulfato en un grupo secundario de hidroxil es susceptible de una hidrólisis alcalina si hay un grupo hidroxil adyacente, trans, y libre para formar un epóxido intermedio cuando se elimina el sulfato. Esto se muestra en la figura 2. Este esquema de reacción propuesto para la 2-O-desulfatación está representado en la figura 2. En el caso de la heparina, se ha publicado recientemente que esta reacción se produce junto con una hidrólisis alcalina durante la liofilización. Véase R. Rej et al, Thromb. Haemostas. (1989) 61:540 y M. Jaseja et al, Can. J. Chem. (1989) 67:1449-1456. La modificación de estos procedimientos mediante la presente invención produjo una heparina que resulta eficaz contra la elastasa y la catepsina G pero sin las propiedades anticoagulantes de la heparina no tratada.

Para facilitar la compresión de la invención, los ejemplos siguientes ilustran principalmente determinados detalles específicos de la misma.

Ejemplo I

(Referencia)

N-desulfatación parcial de la heparina

Se convirtió la heparina de mucosa intestinal porcina (Scientific Protein Laboratories, Waunakee, WI) en ácido heparínico por paso de la solución acuosa al 4% por una columna de resina de intercambio catiónico Dowex 50W x 8X (H^{+}). En un aparato de reflujo químico estándar, se mantuvo la solución del ácido heparínico durante 72 horas a 55ºC para eliminar aproximadamente el 70% de los N-sulfatos, tal como se describe en L. Levy et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1962) 109:901-905 y E. Sache et al, Tromb. Res. (1989) 55:247-258. Se recuperó la heparina N-desulfatada por paso de la solución por una columna de resina IR-400 (OH^{-}) para extraer el exceso de SO_{4}^{-}, ajustando a continuación el pH a 7,0 y realizando luego una liofilización.

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Ejemplo II

(Referencia)

Interacción de la heparina parcialmente N-desulfatada con la ELH

Se midió la inhibición de la ELH originada por la heparina parcialmente N-desulfatada del ejemplo I, incubando para ello, durante 30 minutos a 25ºC, una cantidad constante de ELH (100 pmol) con cantidades cada vez mayores de heparina parcialmente N-desulfatada (10-50 pmol, relación I:E 0,1-0,5) en 500 microlitros de un tampón de Hepes (0,125 M, 0,125% Triton-X-100, pH 7,5) que se fue diluyendo hasta alcanzar el volumen final de 900 microlitros. Se midió la actividad enzimática restante añadiendo 100 microlitros de 3 mM de N-Suc-Ala-Ala-Val-NA (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, fabricado en dimetilsulfóxido [DMSO]) y registrando la absorbancia a 405 nm del cromógeno 4-nitroanilina liberado proteolíticamente. Se calculó el porcentaje de inhibición tomando como referencia la actividad enzimática en ausencia de inhibidor.

Los resultados obtenidos en la interacción de la heparina parcialmente N-desulfatada y de la heparina con ELH se indican en la tabla I.

TABLA I Porcentaje de inhibición de la ELH

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Tal como puede deducirse de la tabla I, la heparina presentaba un efecto inhibidor importante sobre la elastasa de leucocitos humanos (ELH) siempre que la relación I:E era superior a 0,2. Por el contrario, la heparina parcialmente N-desulfatada según el ejemplo I tenía una capacidad muy reducida para inhibir la ELH, incluso cuando la relación I:E era igual a 0,5. Resulta pues que la actividad de la heparina como inhibidora de la ELH disminuyó sustancialmente con la desulfatación parcial y uniforme de los polisacáridos que se realizó aplicando el mismo tratamiento que suele utilizarse generalmente para eliminar el efecto anticoagulante de la heparina. Estos resultados son compatibles con los correspondientes al estado de la técnica anterior y que sugieren que la desulfatación destruye la actividad de la heparina como inhibidora de la ELH y catepsina G.

Ejemplo III

2-O-desulfatación de la heparina

Se ajustó a 13.0 el pH de una solución acuosa al 0,4% de heparina de mucosa intestinal porcina (Scientific Protein Laboratories, Waunakee, WI) utilizando para ello 0,1 N NaOH congelado y luego liofilizado en alícuotas de 40 ml. Después de disolver de nuevo el producto en agua y luego pasarlo por la resina de intercambio catiónico (H^{+}) Amberlite IR-120 plus con el fin de extraer el hidróxido de sodio en exceso, se ajustó el pH final a 7,0, y luego se realizó una filtración al vacío dejando pasar la solución a través de un filtro Millipore de 0,2 micras con el fin de asegurar la esterilidad bacteriológica antes de realizar la reliofilización final para el secado.

Para la preparación comercial de mayores cantidades de heparina 2-O-desulfatada, se añadió NaOH a las soluciones acuosas (hasta 5% en peso/volumen) de heparina de mucosa intestinal porcina (Scientific Protein Laboratories, Waunakee, WI) y sal de sodio para ajustar así el pH a 13,0, y luego se procedió a realizar una liofilización. Para extraer el NaOH en exceso, se redisolvió el producto seco en una solución acuosa y se indujo la precipitación de la heparina añadiendo tres volúmenes de etanol frío (4ºC). Se guardó la mezcla durante 12 horas a 4ºC con el fin de completar la formación del precipitado y, a continuación, se procedió a centrifugarla. Después del secado para evaporar el etanol en exceso, se redisolvió la heparina precipitada en una solución acuosa, pH 7,0, se procedió a filtrarla mediante un filtro Millipore de 0,2 micras y se reliofilizó para su secado.

Ejemplo IV

Efecto de la heparina 2-O-desulfatada sobre la coagulación de la sangre

Se estudió la capacidad anticoagulante de la heparina desulfatada del ejemplo III determinando in vitro su efecto sobre el tiempo de tromboplastina parcial activada (TPPA). El ensayo se realizó aplicando el procedimiento usual para verificar clínicamente con pacientes el efecto anticoagulante de la heparina. El ensayo se realizó utilizando 0,1 y 1,0 mg/ml de heparina o de heparina 2-O-desulfatada según el ejemplo III que se añadió in vitro al suero humano de prueba.

TABLA II

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Se estudió también la heparina 2-O-desulfatada del ejemplo III para determinar si las disoluciones en plasma de 0,1 mg/ml de heparina o de heparina desulfatada según el ejemplo III inhibían el factor Xa. Se prolongó para ello el tiempo de ensayo en la verificación de la actividad Xa, utilizando para ello plasma tratado con veneno de víbora de Russell.

TABLA III

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En contraposición a la heparina, la heparina desulfatada según el ejemplo III mostraba una capacidad muy reducida para prolongar el TPPA, así como un antifactor de actividad Xa muy pequeño.

La heparina 2-O- desulfatada presentaba pues una actividad anticoagulante muy reducida en comparación con la de la heparina no desulfatada.

Ejemplo V

Interacción de la heparina 2-O-desulfatada con la ELH y la catepsina G

Se midió la inhibición de ELH que induce la heparina 2-O-desulfatada del ejemplo III incubando, durante 30 minutos a 25ºC, una cantidad constante de ELH (100 pmol) con cantidades cada vez mayores de heparina 2-O-desulfatada (10-60 pmol, relación I:E 0,1-0,6) en 500 microlitros de una solución tampón de Hepes (0,125 M, 0,125% Triton-X-100, pH 7,5) que se fue diluyendo hasta alcanzar el volumen final de 900 microlitros. Se midió la actividad enzimática restante añadiendo 100 microlitros de 3 mM de N-Suc-Ala-Ala-Val-NA (Sigma Chemicals, St. Louis, MO, preparado en dimetilsulfóxido [DMSO]) y registrando la absorbancia a 405 nm del cromógeno 4-nitroanilina liberado proteolíticamente. El porcentaje de inhibición se calculó tomando como referencia la actividad enzimática en ausencia de inhibidor.

Se midió la inhibición de la catepsina G que induce la heparina 2-O-desulfatada del ejemplo III aplicando el mismo procedimiento anterior, salvo que se utilizó como substrato 3 mM de Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA (Sigma Chemicals, en DMSO).

Asimismo, se preparó la elastina de ligamentos bovinos conforme a B. C. Starcher, Anal. Biochem. (1976) 74:441-447. Se comprobó la pureza de la elastina realizando un análisis de aminoácido. Se verificó su degradación utilizando elastina con *H-NaBH_{4} como indicador radiactivo, aplicando para ello los procedimientos descritos en P. J. Stone, et al., Methods Enzymol. (1982) 82:588-605. Se homogeneizó la elastina pulverizada y tritiada y se procedió a lavarla en una solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 justo antes de utilizarla para eliminar la radioactividad no incorporada. Se preincubó, durante 30 minutos a 37ºC, una cantidad constante de elastasa de leucocitos humanos (ELH) (67 pmol) con cantidades cada vez mayores de heparina 2-O-desulfatada (6,7-134 pmol) en una solución tampón de Hepes cuyo volumen final era 1,0 ml (0,125 M, 0,125% Triton-X-100, pH 7,5). Se incubó a 37ºC una alícuota de 900 microlitros de cada mezcla de la reacción con 5 mg de ^{3}H-elastina y 100 microlitros de una solución salina al 0,9%. Los péptidos solubilizados se separaron luego filtrando la suspensión de elastina con un filtro de papel de porosidad mediana. La velocidad de degradación se determinó cuantificando los ^{3}H péptidos solubilizados.

Los resultados correspondientes a las interacciones de la heparina 2-O-desulfatada y de la heparina con la ELH y la catepsina G se indican en la tabla IV.

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TABLA IV Porcentaje de inhibición

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Tal como muestra la tabla IV, cuando las relaciones de inhibidor a sustrato (I:E) son mayores que 0,2, se produce una inhibición importante de la elastasa de leucocitos humanos (ELH); las relaciones I:E mayores que 0,4 proporcionan también una inhibición considerable de la catepsina, tanto en el caso de la heparina, como en el de la heparina 2-O-desulfatada según el ejemplo III. En todas las relaciones consideradas, la diferencia entre la inhibición efectiva de la heparina y la heparina 2-O-desulfatada según el ejemplo III es muy pequeña. La heparina 2-O-desulfatada proporciona, por consiguiente, básicamente la misma inhibición que la heparina no desulfatada. Además, la heparina 2-O-desulfatada presentaba una actividad anticoagulante muy pequeña. Esto contrasta con el hecho de que la heparina no modificada es un agente anticoagulante muy activo.

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Ejemplo VI

Estudios in vivo

Se estudió con hamsters sirios dorados hembra, que pesaban entre 90 y 110 g, la capacidad que tiene la heparina desulfatada de prevenir las lesiones pulmonares en las que interviene la elastasa de leucocitos humanos (ELH). A estos hamsters anestesiados fenobarbitúricamente, se les inyectó, por vía intratraqueal, 0,25 ml de una solución salina estéril al 0,9% (SE), 0,25 ml de SE que contenía ELH (100 \mug), ó 0,25 ml de SE que contenía 500 \mug de heparina (Sigma) o heparina 2-O-desulfatada conforme al ejemplo III seguidos de otros 0,25 ml de SE con ELH. Después de 24 horas de tratamiento, se procedió a sacrificar los animales por exsanguinación. Se abrió la garganta y se diseccionaron los pulmones en bloque. Se canuló la traquea con un tubito de polietileno y se realizó el lavado con cinco alícuotas secuenciales de 3 ml de SE. Se centrifugó el líquido del lavado a 200 Xg durante 10 minutos. Se resuspendió la bolita celular así obtenida en 1 ml de una solución salina equilibrada de Hank (SSEH) con el fin de contar las células y proceder a su diferenciación. Se evaluó la proteína y hemoglobina del sobrenadante al ser éstos unos indicadores de lesión aguda. Los resultados que se obtuvieron son:

TABLA V

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Tanto la heparina como la heparina 2-O-desulfatada según el ejemplo III eran unos inhibidores potentes de las lesiones inducidas in vivo por la elastasa.

Se realizó un ensayo para determinar la toxicidad de la heparina 2-O-desulfatada del ejemplo III. Otros inhibidores polisacáridos sulfatados de la elastasa y la catepsina G, tales como el sulfato de dextrano, producían unas hemorragias en los sacos de aire pulmonares (hemorragia alveolar) cuando se inyectaban a unas ratas, por vía intratraqueal, unas dosis tan pequeñas como las de 0,5 mg/kg. La heparina 2-O-desulfatada del ejemplo III no producía hemorragias alveolares en las ratas, incluso cuando las dosis intratraqueales eran de unos 10 mg/kg.

La heparina alcalina hidrolizada obtenida según el ejemplo III puede utilizarse para el tratamiento de enfermedades respiratorias, tales como el enfisema, la bronquitis crónica, el síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos (SRDA) y la fibrosis cística, administrándola directamente en el árbol respiratorio por medio de un aerosol. Se aerosoliza el pulmón aproximadamente cada 6 horas (o cada 4 horas diariamente) con una dosis de unos 10 hasta 100 mg de heparina 2-O-desulfatada disueltos en 3 ml de una solución salina estéril al 0,9%, utilizando para ello cualquiera de los dispositivos de aerosol que suelen encontrarse normalmente en las clínicas (como el Devilbiss o el nebulizador de Acorn), acoplándolo a una fuente de presión positiva (un compresor de aire o oxígeno comprimido) para generar un aerosol compuesto de partículas con un diámetro medio másico inferior a las 10 micras.

Las dosis más pequeñas serán efectivas en enfermedades como la bronquitis crónica, mientras que en la fibrosis cística se tendrán que utilizar las dosis mayores, dado que las secreciones respiratorias presentan en este caso unos niveles de elastasa mucho más elevados.

En el tratamiento de las enfermedades por isquemia-reperfusión, tales como el infarto y accidente cerebrovascular, se tendrá que administrar la heparina 2-O-desulfatada por vía intravenosa (i.v.) realizando una infusión continua. Después de suministrar por vía intravenosa una dosis de carga rápida de 0,5 mg/kg, se mezclan 2,5-5,0 mg/kg de heparina 2-O-desulfatada con 250-500 ml de dextrosa al 5%, NaCl al 0,45%, ó NaCl al 0,9%, para administrarla por infusión continua, durante 24 horas, con el fin de mantener así constante el nivel de la droga en sangre en el sistema vascular.

Claims

1. Heparina desulfatada no anticoagulante, que se puede obtener ajustando una solución acuosa de heparina al pH 13 con hidróxido sódico de tal manera que se produce O-desulfatación en la posición 2-O seguida por la liofilización de la solución y eliminando el exceso de hidróxido sódico para su utilización en terapia.

2. Heparina desulfatada según la reivindicación 1 para su utilización en el tratamiento de enfisemas, bronquitis crónica, síndrome de insuficiencia respiratoria en adultos o fibrosis cística.

3. Heparina desulfatada según la reivindicación 1 para su utilización en el tratamiento de enfermedades causadas por isquemia-reperfusión.

4. Heparina desulfatada según la reivindicación 1 para su utilización en el tratamiento del infarto de miocardio o accidente cerebrovascular.

5. Medicamento, que comprende una heparina desulfatada según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. Medicamento según la reivindicación 5, adaptado para poder administrarlo por aerosolización.

7. Medicamento según la reivindicación 5, adaptado para poder administrarlo por inyección intravenosa.

8. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que comprende un vehículo seleccionado de entre una solución salina tamponada fisiológicamente, una solución salina normal y agua destilada.

9. Utilización de una heparina desulfatada según la reivindicación 1, para preparar un medicamento destinado al tratamiento de enfisemas, bronquitis crónica, síndrome de dificultad respiratoria en adultos o fibrosis cística.

10. Utilización de una heparina desulfatada según la reivindicación 9 para la fabricación de un medicamento para su utilización en el tratamiento de enfermedades causadas por isquemia-reperfusión.

11. Utilización según la reivindicación 10, en la que la enfermedad es infarto de miocardio o accidente cerebrovascular.

12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que el medicamento se ha adaptado para poder administrarlo por aerosolización.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que el medicamento se ha adaptado para poder administrarlo por inyección intravenosa.

14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en la que el medicamento comprende un vehículo seleccionado de entre una solución salina tamponada fisiológicamente, una solución salina normal y agua destilada.