ES2215192T3 - Metodo para identificar substancias moleculares. - Google Patents

Abstract

UN METODO PARA IDENTIFICAR SUSTANCIAS INDIVIDUALES DENTRO DE UNA MEZCLA DE SUSTANCIAS QUE CONSISTE EN HACE QUE LA MEZCLA PASE POR UNA SERIE DE DETECTORES SEPARADOS, CADA UNO DE LOS CUALES ESTA DISPUESTO PARA GENERAR UNA SEÑAL REPRESENTATIVA DE UNA CARACTERISTICA DE LA MEZCLA CONFORME PASA, MEDIR REPETIDAMENTE LAS SEÑALES PROCEDENTES DE CADA DETECTOR UNA PLURALIDAD DE VECES, TRANSFORMARLAS EN ESPACIO DE VELOCIDAD E IDENTIFICAR LAS SUSTANCIAS INDIVIDUALES DENTRO DE LA MEZCLA SEGUN LOS PICOS QUE CREAN EN EL ESPACIO DE VELOCIDAD.

Description

Método para identificar substancias moleculares.

La presente invención se refiere a un método para identificar substancias moleculares dentro de una mezcla y en particular, aunque no exclusivamente, a la identificación de biomoléculas.

En aplicaciones electroforéticas y otras dentro de las cuales han de identificarse substancias moleculares, por supuesto, se conoce bien la medida de la velocidad de una banda molecular particular y la identificación de especies moleculares identificadas de acuerdo con esa velocidad. Típicamente, eso se realiza midiendo el tiempo que emplea una banda particular en moverse entre sensores fijos primero y segundo. Ejemplos típicos de esta técnica se describen en WO-A-94/01581, y también en Beckers y otros: Use of a Double-Detector System for the Measurement of Mobilities in Zone Electrophoresis, Journal of Chromatograph, 452(1988) 591-600. También se sabe, según se describe, por ejemplo, en los extractos de Patentes de Japón, volumen 6, número 82 (P-116) [960], 11 de Julio de 1980, el uso de detectores múltiples para rastrear la velocidad de partículas individuales dentro de una mezcla
móvil.

Se considera que la referencia de Beckers y otros previa representa la técnica anterior más cercana. Esta describe un método para identificar substancias moleculares dentro de una mezcla según se indica en las porciones de precaracterización de las reivindicaciones 1 y 2.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para identificar substancias moleculares dentro de una mezcla, caracterizado por los rasgos indicados en la porción de caracterización de la reivindicación 1.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para identificar substancias moleculares dentro de una mezcla, caracterizado por los rasgos indicados en la porción de caracterización de la reivindicación 2.

Transformando en velocidad-espacio e integrando a lo largo del tiempo, las substancias moleculares (por ejemplo, biomoléculas) individuales pueden identificarse rápidamente como puntas o picos individuales en velocidad-espacio. El tamaño y/o la anchura de cada pico puede usarse para obtener una medida de la cantidad de cada substancia molecular.

Al transformar a velocidad-espacio, puede realizarse un cálculo de la velocidad que se necesita para que una substancia molecular dentro de la mezcla que se desplaza alcance un detector I_{k} dado en el tiempo t en el que se ha registrado la señal de ese detector. Esta velocidad nominal puede calcularse como Z_{k} a lo largo de t donde Z_{k} es la distancia desde un origen al detector I_{k} y t es el tiempo transcurrido. Sin embargo, puede haber otros métodos para determinar velocidades nominales, por ejemplo midiendo el tiempo transcurrido para que una substancia conocida se mueva entre un detector y el siguiente. También sería posible determinar la velocidad identificando una secuencia particular de bandas en un detector y midiendo cuánto necesita esa secuencia de bandas para moverse, de media, al siguiente detector. De ese modo, una banda individual dentro de la secuencia puede identificarse y cronometrarse exactamente en dos detectores separados, calculándose a continuación la velocidad a partir de un conocimiento de la distancia entre los detectores.

En una modalidad preferida de la presente invención, pueden obtenerse imágenes de las moléculas detectando su absorción intrínseca de luz UV. En esta modalidad preferida, se usa la imagen intrínseca de la propia molécula, ya sea un fragmento de ácido nucleico, una proteína o incluso una cadena polipeptídica. La imagen viene de la molécula de absorción, usando espectrometría de absorción UV molecular, en contraste con la técnica bien conocida de la espectrometría óptica. La ventaja clave es la falta de marcador.

Esta modalidad preferida tiene muchas consecuencias importantes. Quizás la más obvia es que ya no se necesita un marcador peligroso, ya sea radiactivo o un carcinógeno bien conocido como el bromuro de etidio. Otro punto es que, para reacciones de secuenciación, la falta del marcador elimina una de las restricciones principales sobre el número de bases que puede someterse a secuenciación: esto es, la cantidad de radiactividad que puede incorporarse dentro de la muestra.

Preferiblemente, las moléculas de interés se someten a obtención de imágenes directamente detectando su absorción al obtener imágenes del ácido nucleico o la proteína sobre un detector de diamante. Esto puede efectuarse iluminando el objeto que ha de someterse a obtención de imágenes - ya sean ácidos nucleicos o proteínas - con luz UV de brillo constante procedente de un dispositivo de amplio espectro como un tubo de descarga de helio o un láser monocromático como un láser Excimer a 196 nm. Se observan las diferentes cantidades de luz que alcanzan un detector colocado detrás del objeto que ha de someterse a obtención de imágenes. En el caso de obtención de imágenes di- o tri-dimensionales, la sombra se somete a obtención de imágenes simultáneamente y el objeto se identifica de ese modo. Esto requiere un detector bidimensional, como un dispositivo de píxeles o un dispositivo de estrías pixeladas.

Cuando la invención se aplica a la identificación de ácidos nucleicos, la tipología preferida permitirá una diferenciación cuantitativa entre energía transmitida y absorbida. La cuantificación de DNA bajo estas condiciones tiene importantes aplicaciones en la construcción de vectores de expresión que se usan para producir proteínas especializadas usadas en terapéutica.

Cuando la presente invención se aplica a la identificación de péptidos y proteínas, puede usarse el mismo equipo que se usaba para obtener imágenes de mapas de enzimas de restricción de DNA. La velocidad de identificación proporcionada por la presente invención ofrece ventajas significativas sobre técnicas existentes, algunas de las cuales pueden llevar hasta tres meses.

La invención puede ponerse en práctica en un número de modos y una modalidad específica se describirá ahora, a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos, en los que:

la figura 1 muestra un detector de la técnica anterior;

la figura 2 es una sección transversal a través de un detector adecuado para usar con el método de la presente invención;

la figura 3 es una vista en perspectiva del detector de la figura 2;

la figura 4a muestra otro detector, estando conectados los electrodos en una configuración de voltaje bipolar;

la figura 4b muestra el detector de 4a, estando conectados los electrodos en una configuración de cadena de resistores;

la figura 5 muestra adicionalmente otro detector adecuado para usar con el método de la presente invención;

la figura 6 muestra, esquemáticamente, un secuenciador de DNA automatizado también adecuado para usar con el método de la presente invención;

la figura 7 es una sección esquemática a través del secuenciador mostrado en la figura 6;

la figura 8 ilustra esquemáticamente la modalidad preferida para aislar biomoléculas; y

la figura 9 muestra los resultados del análisis preferido como una gráfica en velocidad-espacio.

Antes de describir el método preferido de la invención, se revisarán en primer lugar algunos tipos de aparatos adecuados para usar con el método.

Se hará referencia en primer lugar a las figuras 6 y 7 que muestran esquemáticamente un secuenciador de DNA automatizado adecuado para usar con el método de la presente invención.

Las figuras 6 y 7 muestran una subunidad de una máquina de secuenciación propuesta. La máquina como un todo comprende cuatro o cinco de tales subunidades. Cada subunidad comprende un depósito 810 superior para tampón que contiene solución 820 tamponadora; un depósito inferior que contiene solución 840 tamponadora; una fuente 870 de UV o una pluralidad de tales fuentes; un detector 860 de UV conectado a una lectura de salida 865; un cátodo conectado a la solución 820 tamponadora y un ánodo 842 conectado a la solución 840 tamponadora. El dispositivo también incluye cuatro tubos 850 de matriz de fase sólida que se extienden entre los depósitos superior e inferior.

Los depósitos 810, 830 tanto superior como inferior pueden estar construidos de un material plástico transparente, y contienen soluciones 820, 840 tamponadoras simples para prevenir la acumulación excesiva de acidez en el sistema. Los tubos 850 de matriz de fase sólida entran en contacto con la solución 820 tamponadora en la parte superior y la solución 840 tamponadora en el fondo.

La fuente 870 de luz comprende una lámpara UV o una lámpara de deuterio o de descarga. Alternativamente, podría comprender un láser capaz de funcionar en el intervalo entre 220 nm y 180 nm, o incluso un diodo.

El detector 860 comprende cualquier detector óptico adecuado, adaptado a la longitud de onda de la fuente 870 de luz. El detector comprende preferiblemente un detector de estrías de diamante, como se describirá con más detalle más adelante con referencia a las figuras 2 a 5. Las anchuras de las estrías pueden estar entre 5 y 200 \mum dependiendo de las longitudes de onda que han de detectarse y la resolución requerida. La estrechez de las estrías y el hecho de que se use iluminación substancialmente plana permite gran precisión y resolución.

El detector 860 está conectado a dispositivos electrónicos apropiados que proporcionan una lectura de salida digital en una salida 865. Una lectura de salida estándar tal como Labview (™) alimenta directamente a un procesador de bases de datos adecuado tal como MacVector (™) o MacDNAsys (™).

Los tubos 850 de matriz de fase sólida comprenden cuatro tubos de cuarzo que contienen un material en fase sólida adecuado. Materiales adecuados incluyen matrices de gel preexistentes basadas en silicio tales como el grupo Sephadex (™). La fase sólida es relativamente transparente a UV, y también es reutilizable. La longitud de los tubos depende de la naturaleza exacta de la fase sólida elegida, pero típicamente no será mayor que de 15 a 20 cm.

Durante el uso, se aplica un voltaje entre el ánodo y el cátodo para producir una diferencia de potencial a lo largo de la longitud de los tubos 850 de matriz en fase sólida. Las cuatro reacciones individuales que han de detectarse son cargadas, cada una a su columna separada, y se someten a electrofóresis hacia el ánodo. A medida que las bandas pasan entre la fuente 870 y el detector 860, una imagen cualitativa simple de cada banda se digitaliza a una base de datos. La información digital resultante puede leerse en tiempo real o puede almacenarse dentro del dispositivo electrónico del sistema de detección, hasta que la electrofóresis sea completa. Toda la información puede leerse entonces de una vez.

Después de que la mezcla de secuenciación se haya hecho pasar a través de la columna, todas las trazas del DNA pueden retirarse mediante exposición continua a un campo eléctrico y una solución tamponadora. Después del lavado a fondo, la fase sólida puede reutilizarse.

Debe apuntarse que la simplicidad de la operación del presente dispositivo, y la capacidad de reutilización de la fase sólida, viene al menos en parte del hecho de que ya no se requiera un marcaje radiactivo.

Se apreciará, por supuesto, que el aparato adecuado no está restringido a las características específicas descritas previamente. Dispositivos equivalentes adecuados pueden ser construidos fácilmente por un experto en la técnica, dependiendo los detalles exactos de esas estructuras del área específica de interés. Áreas específicas en las que el dispositivo y el método de la presente invención pueden encontrar aplicación incluyen la interrogación y la cartografía de ácidos nucleicos, incluyendo secuenciación, cartografía de enzimas de restricción, cuantificación, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y purificación de oligonucleótidos; y obtención de imágenes de proteínas, incluyendo análisis de péptidos y control de la manipulación de ácidos nucleicos y diagnóstico médico.

Para aplicaciones adecuadas, puede usarse un sensor UV tal como el que se describe más adelante con referencia a las figuras 1 a 5. Es probable que tales aplicaciones sean aquellas en las que la obtención de imágenes puede alcanzarse en el intervalo aproximado de 220 a 190 nm. Sin embargo, no es esencial usar una topología estriada, tal como la que se describe específicamente, y, para ciertas aplicaciones, serán totalmente adecuados detectores de diamante planos. La ventaja de un detector de diamante es su falta casi total de ruido, su excelente eficacia cuántica y su linealidad.

En regiones que no son adecuadas para usar con detectores de diamante, tales como, por ejemplo, la región de 220 a 290 nm (donde se absorbe DNA), pueden usarse semiconductores no diamantinos. Tales detectores incluirían detectores de silicio de mejora UV y fotomultiplicadores.

Los métodos preferidos de la presente invención pueden hacer uso de las propiedades de absorción intrínsecas de moléculas, cuando se exponen a la luz, o alternativamente pueden hacer uso de las propiedades de absorción de las moléculas, cuando se exponen a la luz, o alternativamente pueden hacer uso de las propiedades de absorción de marcadores unidos a las moléculas de interés. Pueden usarse absorbentes moleculares especializados con unión molecular diferencial para mejorar la sensibilidad. Tales absorbentes pueden ser atóxicos.

Un detector conocido típico de partículas cargadas se muestra en la figura 1. El detector comprende una lámina 10 plana de un material aislante tal como diamante, que tiene revestimientos 12, 14 de electrodo de oro delgado sobre sus superficies superior e inferior. El revestimiento 12 de electrodo superior comprende una pluralidad de tiras de lectura paralelas que están alineadas en una dirección perpendicular al plano del papel en la figura, y el revestimiento 14 de electrodo inferior comprende una pluralidad adicional de tiras de lectura alineadas en una dirección paralela con el plano del papel. Una diferencia de potencial V grande se mantiene entre los revestimientos de electrodo. El electrodo superior o inferior puede ser continuo y las tiras pueden tener polaridad alterna.

Una partícula cargada que sigue un camino 16 a través del diamante produce pares 18,20 de huecos electrónicos, que se separan bajo la influencia del campo eléctrico e inducen una carga en las tiras de lectura. La energía de la partícula puede ser determinada por la cantidad de carga que se recoge, y su posición mediante la intersección de las tiras superior e inferior que reciben las cargas inducidas mayores.

Otro detector preferido, adecuado para usar con el método de la presente invención, se describirá con detalle ahora, con referencia particular a las figuras 2 y 3. Es un detector de diamante y comprende un substrato 30 de diamante que tiene, sobre una superficie, una pluralidad de estrías 40 de diamante mordentadas paralelas. Sobre una cara de cada estría hay un electrodo 50 de lectura de salida positivo y sobre la otra un electrodo 60 negativo. Preferiblemente, estos son conductores, pero podrían ser en cambio de un material semiconductor impurificado de alta conductividad.

Durante el uso, el detector se sitúa de modo que el substrato esté substancialmente normal a un haz 70 de partículas o radiación que ha de detectarse. Una partícula individual que pasa a una de las estrías crea portadores ionizados, que rápidamente son impulsados a los electrodos 50,60 en virtud de la gran diferencia de potencial que se mantiene entre ellos. Se induce de ese modo una carga sobre los electrodos, siendo leída esta carga por dispositivos de lectura (no mostrados) en los extremos de las estrías.

El substrato y las estrías son preferiblemente de diamante, que puede ser natural o producido artificialmente. Las estrías pueden producirse, con el substrato, o pueden mordentarse (por ejemplo con un láser Eximer). Los electrodos 50, 60 pueden ser de cualquier material o combinación de materiales (por ejemplo titanio, vanadio, cromo y/u oro) que forme un contacto óhmico con la superficie de diamante con un procesamiento apropiado (por ejemplo ablación, implantación iónica o recocido). Pueden usarse técnicas de deposición estándar para aplicar el metal como un revestimiento delgado a las caras de las estrías. Típicamente, el dispositivo puede elaborarse mordentado las estrías. Típicamente, el dispositivo puede elaborarse mordentando las estrías, depositando el material y a continuación uniendo la superficie superior.

Se apreciará a partir de la figura 2 que la sensibilidad del dispositivo mostrado puede incrementarse haciendo mayor el valor de D (o la altura de las estrías). Cuanto mayor sea la altura de las estrías, mayor es la cantidad de material que tiene que atravesar una partícula, incrementando de ese modo la ionización dentro del dispositivo. La altura de la estría normalmente se adaptará a la profundidad de penetración esperada de las partículas o los fotones que han de detectarse. La velocidad y la eficacia de lectura están determinadas por la anchura L de cada una de las estrías. Dependiendo de la aplicación particular, el valor de L puede ser tan poco como unos pocos micrómetros o un valor mayor de hasta aproximadamente 200 \mum, y el valor de D 10 \mum o más. La relación de señal a ruido es grande ya que existen réplicas insignificantes entre señales que emanan de estrías individuales. Una altura de substrato típica es alrededor de 10 \mum, suficientemente gruesa para soportar las estrías y para ser autoestable sin requerir una base de soporte adicional. Preferiblemente, el dispositivo hace uso de un diamante de calidad relativamente pobre, que tiene una longitud de recombinación quizás de 6 \mum o así.

La impedancia de los dispositivos de lectura (no mostrados) en el extremo de las estrías está adaptada preferiblemente a la impedancia de los electrodos 50,60, incrementando de ese modo la velocidad de lectura y reduciendo las pérdidas de señal.

Existe un número de modos en los que puede aplicarse una diferencia de potencial entre los electrodos 50,60 mostrados en la figura 2. En su forma más simple, una fuente de voltaje puede conectarse simplemente entre los dos electrodos. Alternativamente, los electrodos pueden aplicarse a una cadena de resistores (no mostrada), estando definida de ese modo la diferencia de potencial entre los electrodos por la caída de potencial a través del resistor correspondiente.

Otro dispositivo adecuado se muestra en la figura 4, en la que los electrodos están formados sobre la base y las caras del espacio entre las estrías 40 de diamante. Esto significa, efectivamente, que cada electrodo 50' en la cara izquierda de la estría 40 está acoplado eléctricamente con un electrodo 60' correspondiente en la cara derecha de la siguiente estría de la secuencia, de modo que juntos forman un solo electrodo 61 con conformación de U. En la modalidad de la figura 4a, primeros pares alternativos de electrodo 61 con conformación de U se acoplan a través de una primera fuente V_{1} de voltaje, y segundos pares de electrodos alternativos se acoplan mediante una segunda fuente V_{2} de voltaje. Tal configuración de voltaje bipolar asegura que siempre existe una diferencia de potencial constante V_{1}-V_{2} a través de cada una de las estrías 40.

Un método alternativo para aplicar voltajes a los electrodos 61 con conformación de U se muestra en la figura 4b. Aquí, se usa una cadena de resistores para introducir el voltaje V de entrada a través de una pluralidad de resistores R en serie. El voltaje a través de cada estría 40 puede elegirse seleccionando valores apropiados para V y R.

Por supuesto, se entenderá que puede usarse una configuración de voltaje bipolar o configuración de voltaje de cadena de resistores similar junto con la modalidad de la figura 2.

Una diferencia de potencial típica a través de la estría 40 puede estar en la región de 1 voltio por \mum. Podrían usarse voltajes substancialmente superiores, si se desea (ya que el diamante tiene una resistencia dieléctrica muy alta), pero generalmente no hay necesidad de diferencias de potenciales altas ya que a voltajes mayores la velocidad del portador se satura rápidamente.

En un dispositivo adecuado adicional (no mostrado), se proporciona un grupo paralelo adicional de estrías, ortogonales al primer grupo, sobre la superficie interior del substrato 30. Estos dos grupos perpendiculares de estrías permiten el posicionamiento x-y exacto de cada partícula detectada.

Los espacios entre las estrías pueden rellenarse con un material plástico, u otro absorbente, mejorando de ese modo la capacidad del detector para detectar partículas neutras.

Un dispositivo adecuado adicional más se muestra en la figura 5. Aquí, los espacios entre las estrías 40 se han hecho extremadamente estrechos, y contienen cada uno un electrodo 62 separado. Tal dispositivo se prefiere en muchas circunstancias, ya que la estrechez de los huecos entre las estrías 40 produce sólo una pequeña pérdida de recepción en comparación con las modalidades de las figuras 2, 3 y 4. La anchura del hueco, y de ahí la anchura del electrodo 62, puede depender principalmente de cuán estrecha pueda cortarse una ranura en el substrato de diamante. Los electrodos 62 pueden acoplarse entre sí de cualquier manera conveniente a fin de producir una diferencia de potencial adecuada entre las estrías 40, por ejemplo usando el sistema de la figura 4a o de la figura 4b.

El detector de radiación ionizante descrito previamente puede proporcionar una lectura de carga extremadamente rápida, probablemente en 35 ps y ciertamente en 50 ps.

Se vuelve ahora a un análisis del modo en el que puede usarse el aparato previo en la práctica para identificar moléculas individuales dentro de una mezcla, de acuerdo con la modalidad preferida de la invención.

La figura 8 ilustra el sistema esquemáticamente. Sobre una cara de un substrato 910 alargado junto con el que se moverán las moléculas está una lámpara 920 UV mientras que sobre la otra cara hay una serie de detectores I_{1}, I_{2}, I_{3}, ... I_{n} UV espaciados. Como se ha analizado previamente, la secuenciación se alcanza detectando el paso de bandas de biomoléculas frente a los elementos detectores. Puesto que las biomoléculas absorben luz UV en la región de interés, el paso de cualquier banda frente a un detector induce una caída en la corriente nominalmente continua que está provocada por la iluminación 930 constante de ese elemento detector por la fuente 920 de luz UV. La caída en la corriente se mide y se marca y se trata como una señal individual que puede relacionarse con una banda de biomoléculas dada. Nominalmente, en un gel electroforético, la velocidad de una banda es inversamente proporcional a la raíz de la masa de la secuencia de ácido nucleico en la banda; la carga de la secuencia se desacopla de su longitud mediante fuerzas de reparto de fricción que imponen una "velocidad terminal" provocada por aquellas fuerzas que son proporcionales a la longitud.

Para identificar las moléculas individuales, el sistema recoge automáticamente una secuencia de señales S_{k}(t) para la serie de detectores S_{k} en los tiempos t = t_{1}, t_{2}, t_{3} .... Ahora, puesto que se conoce la posición de cada elemento detector y también se conoce el tiempo transcurrido, es posible calcular la velocidad que habría necesitado una molécula particular para alcanzar un detector particular en ese tiempo transcurrido dado. Si se supone, por ejemplo, que el tiempo transcurrido se mide a partir de t_{0} = 0 y que el detector I_{k} está a una distancia Z_{k} del origen O, puede calcularse la velocidad nominal V_{k}(t) por medio de la expresión Z_{k}/t.

Cada señal S_{k}(t) se añade a continuación a un depósito apropiado en un histograma de desarrollo ponderado que se agrupa por la velocidad nominal. Las señales individuales pueden añadirse al depósito apropiado de cualquier manera convencional, pero en la modalidad preferida se añade un peso w al depósito para cada señal, siendo el peso proporcional al tamaño de la señal S_{k}(t). Una gráfica o histograma correspondiente de los pesos representados en velocidad-espacio se muestra en la figura 9.

Puesto que cada biomolécula diferente que ha de detectarse es de una longitud diferente, se trasladará a una velocidad diferente y, de ahí, aparecerá en un lugar diferente en el histograma de la figura 9. Las moléculas individuales aparecen como puntas o picos separados en el histograma; en los ejemplos mostrados se han detectados las moléculas A, B y C. En una disposición posible, las señales S_{k} pueden recogerse repetidamente durante los tiempos t_{1}, t_{2}, t_{3}, etc. Una vez que se han recogido todos los datos, a continuación pueden representarse y analizarse como se muestra en la figura 9. Sin embargo, en una disposición alternativa y preferida, los datos se agrupan a medida que se recogen. La ventaja de tal disposición es que puede representarse una gráfica tal como la mostrada en la figura 9, por ejemplo en una pantalla de ordenador, y puede actualizarse en tiempo real. A medida que avanza la recogida de datos los picos representativos de moléculas detectadas se hacen más claros.

Se entenderá que el período de tiempo entre muestreos sucesivos de los detectores puede elegirse de acuerdo con la aplicación. En la modalidad preferida, el muestreo se produce cada cien milisegundos, pero para otras aplicaciones el período podría ser tan pequeño como unos pocos microsegundos o tan grande como varios minutos o incluso horas. Con tal de que el dispositivo electrónico de lectura pueda manejar el flujo de datos, no tiene precio ir a tiempos cada vez mas cortos. Además, no hay necesidad de que los períodos de tiempo sean contiguos, aunque en la práctica es probable que los períodos de medida contiguos sean más convenientes, particularmente con la presente aplicación en la que el período está definido por la velocidad de arrastre, el tamaño de las bandas y ciertos otros factores.

Se recordará que la señal S_{k} en cada detector I_{k} es representativa de la transferencia de corriente desde el nivel de corriente continua nominal que está presente cuando no hay moléculas en el camino del haz 930. Las fluctuaciones estadísticas pueden hacer a esta señal negativa (que está por encima del nivel de corriente continua medio) o positiva (que está por debajo del nivel de corriente continua). De media, estas tenderán a cancelarse, y, a medida que se recojan más datos, el ruido se suprime gradualmente. Al no tratar de seguir objetos individuales, sino en cambio sumar "ciegamente" los valores en velocidad-espacio en cada etapa, los objetos se encuentran automáticamente en un modo que es natural, muy rápido y que minimiza el ruido. El hardware necesario es muy simple y el software y el análisis incluso más. El hardware podría estar proporcionado, por ejemplo, por la carga de un elemento capacitativo por una cantidad proporcional a la señal S_{k}.

Una ventaja adicional del método es que no solo se lleva a cabo la substracción automática del fondo, sino que la precisión obtenida es mucho mayor de la que sería posible mediante el uso simple de información procedente de elementos detectores individuales. La información procedente de la serie S_{k} como un todo proporciona una información, y de ahí una precisión, mucho mayor de la que podría obtenerse a partir de una consideración de los detectores individualmente.

Además, el método también permite la cuantificación. Al considerar la altura y la anchura de cada una de las puntas en la figura 9, puede determinarse con alguna exactitud cuánto de cada substancia detectada estaba contenido en la mezcla original.

El uso de un haz 930 de luz esencialmente plano, y detectores direccionales, asegura que las moléculas puedan situarse de forma extremadamente precisa a medida que pasan por los detectores. Aunque, por supuesto, sería posible usar el método descrito con las moléculas que emiten una señal que ha de detectarse, tal como radiactividad o luz UV, es probable que la precisión sea inferior debido a la dispersión adicional y el hecho de que la concentración de moléculas tiene que ser mayor para producir la misma señal (puesto que la mayoría de la luz o la radiactividad emitida se desperdicia ya que se emite en todas las direcciones). Usando absorción UV para producir la señal, pueden usarse moléculas mucho más pequeñas de modo que se mueven más rápidamente y se separan más rápidamente. Esto permite que el tiempo de lectura se acorte drásticamente quizás hasta minutos en vez de las horas convencionales.

Se apreciará que el método descrito puede tener aplicaciones distintas a la secuenciación de biomoléculas. El método general permite no sólo identificar substancias moleculares individuales dentro de una mezcla, sino también calcular sus proporciones.

Claims (12)

1. Un método para identificar substancias moleculares dentro de una mezcla, que comprende:

(a) hacer que la mezcla se traslade por una pluralidad espaciada de detectores, estando dispuesto cada detector I_{k} para producir una señal S_{k} representativa de una característica de la mezcla a medida que pasa por el detector I_{k};

(b) medir repetidamente la señal S_{k}(t) en cada detector I_{k} en una pluralidad de tiempos t = t_{1}, t_{2}, t_{3} ...; caracterizado por

(c) agrupar las señales S_{k}(t) por velocidad nominal V_{k}(t), la velocidad necesaria para que una substancia molecular dentro de la mezcla que se traslada alcance el detector I_{k} en el tiempo t, y

(d) identificar substancias moleculares dentro de la mezcla de acuerdo con picos dentro de la colección de señales agrupadas.

2. Un método para identificar substancias moleculares dentro de una mezcla, que comprende:

(a) hacer que la mezcla se traslade por una pluralidad espaciada de detectores, estando dispuesto cada detector I_{k} para producir una señal S_{k} representativa de una característica de la mezcla a medida que pasa por el detector I_{k};

(b) medir repetidamente la señal S_{k}(t) en cada detector I_{k} en una pluralidad de tiempos t = t_{1}, t_{2}, t_{3} ...; caracterizado por

(c) agrupar las señales S_{k}(t) en velocidad-espacio; y

(d) identificar substancias moleculares dentro de la mezcla de acuerdo con picos dentro de las señales agrupadas en velocidad-espacio.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las señales S_{k}(t) se recogen en conjunto y a continuación se agrupan en una etapa subsiguiente.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que las señales S_{k}(t) se agrupan a medida que se recogen.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes cuando dependen de la reivindicación 1, en el que la velocidad nominal V_{k}(t) se determina a partir de un conocimiento de la distancia atravesada desde un punto original hasta el detector I_{k} y el tiempo transcurrido.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la velocidad nominal se calcula como Z_{k}/t, donde Z_{k} es la distancia desde el origen hasta el detector I_{k} y t es el tiempo transcurrido.

7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las señales S_{k}(t) se agrupan sumando los valores dentro de una pluralidad de depósitos de velocidad nominal.

8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las señales S_{k} son representativas de la disminución de luz recibida por los detectores como resultado de absorción de luz por las substancias moleculares que han de identificarse.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las señales S_{k} son representativas de emisiones recibidas a partir de las substancias moleculares que han de identificarse.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las emisiones son emisiones radiactivas.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que las emisiones son emisiones UV.

12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las proporciones de las substancias moleculares dentro de las mezclas se determinan de acuerdo con los tamaños relativos de los picos dentro de las señales agrupadas.