ES2351314T3 - Expresión de polipéptidos biológicamente activos en lenteja de agua. - Google Patents
Expresión de polipéptidos biológicamente activos en lenteja de agua. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2351314T3 ES2351314T3 ES01967946T ES01967946T ES2351314T3 ES 2351314 T3 ES2351314 T3 ES 2351314T3 ES 01967946 T ES01967946 T ES 01967946T ES 01967946 T ES01967946 T ES 01967946T ES 2351314 T3 ES2351314 T3 ES 2351314T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- duckweed
- signal peptide
- culture
- nucleotide sequence
- interferon
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 85
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 78
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 62
- 244000207740 Lemna minor Species 0.000 claims abstract description 163
- 235000006439 Lemna minor Nutrition 0.000 claims abstract description 134
- 235000001855 Portulaca oleracea Nutrition 0.000 claims abstract description 114
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 86
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 84
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 72
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 30
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims abstract description 20
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 20
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 10
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims abstract description 8
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 70
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 40
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 22
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 16
- 244000207747 Lemna gibba Species 0.000 claims description 14
- 241000209499 Lemna Species 0.000 claims description 13
- 235000006438 Lemna gibba Nutrition 0.000 claims description 12
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 244000183376 Lemna aequinoctialis Species 0.000 claims description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 4
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims description 3
- 241000209501 Spirodela Species 0.000 claims description 3
- 241000339989 Wolffia Species 0.000 claims description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 3
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000043158 Lens esculenta Species 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 93
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 53
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 53
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 51
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 47
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 41
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 36
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 21
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 7
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 7
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 6
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 6
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241000209524 Araceae Species 0.000 description 5
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 4
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 4
- 241000746966 Zizania Species 0.000 description 4
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 4
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000000442 meristematic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 3
- 108010000700 Acetolactate synthase Proteins 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 230000001651 autotrophic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 3
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940087195 2,4-dichlorophenoxyacetate Drugs 0.000 description 2
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102400000068 Angiostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010079709 Angiostatins Proteins 0.000 description 2
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 2
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 2
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 2
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 2
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 2
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 2
- 102000016267 Leptin Human genes 0.000 description 2
- 108010092277 Leptin Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108050002653 Retinoblastoma protein Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HFCYZXMHUIHAQI-UHFFFAOYSA-N Thidiazuron Chemical compound C=1C=CC=CC=1NC(=O)NC1=CN=NS1 HFCYZXMHUIHAQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N aspergillomarasmine B Natural products OC(=O)CNC(C(O)=O)CNC(C(O)=O)CC(O)=O FZCSTZYAHCUGEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000012499 inoculation medium Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 229940039781 leptin Drugs 0.000 description 2
- NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N leptin Chemical compound O=C([C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CCSC)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O NRYBAZVQPHGZNS-ZSOCWYAHSA-N 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108010082527 phosphinothricin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- GLCIENYSYGDNIL-UHFFFAOYSA-N (2,3-dichlorophenyl) ethaneperoxoate Chemical compound CC(=O)OOC1=CC=CC(Cl)=C1Cl GLCIENYSYGDNIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-M 2,2-Dichloropropanoate Chemical compound CC(Cl)(Cl)C([O-])=O NDUPDOJHUQKPAG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid Chemical compound OC(=O)C(Cl)OC1=CC=C(Cl)C=C1 HXKWSTRRCHTUEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOPBEBWGSGFROG-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-2-yl)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(CC(=O)O)=CC2=C1 QOPBEBWGSGFROG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 2-(2,4-dichlorophenoxy)acetic acid Chemical compound OC(=O)[14CH2]OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-DOMIDYPGSA-N 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 3,5-dihydro-4H-imidazol-4-one Chemical compound O=C1CNC=N1 CAAMSDWKXXPUJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020183 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase Proteins 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- 101150001232 ALS gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 101710187578 Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700037145 Arabidopsis PAT1 Proteins 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 102000003823 Aromatic-L-amino-acid decarboxylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000121 Aromatic-L-amino-acid decarboxylases Proteins 0.000 description 1
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000686404 Australina Species 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000701513 Badnavirus Species 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 241000269333 Caudata Species 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 241000701248 Chlorella virus Species 0.000 description 1
- 241001584859 Colocasia <moth> Species 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108030005585 Cyanamide hydratases Proteins 0.000 description 1
- ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N D-threo-2-Pentulose Natural products OCC(O)C(O)C(=O)CO ZAQJHHRNXZUBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108700016256 Dihydropteroate synthases Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710129170 Extensin Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- 241001315191 Gladiata Species 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- 239000005561 Glufosinate Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 240000005010 Landoltia punctata Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000339552 Lemna disperma Species 0.000 description 1
- 241000339557 Lemna ecuadoriensis Species 0.000 description 1
- 241000339996 Lemna obscura Species 0.000 description 1
- 241000339991 Lemna tenera Species 0.000 description 1
- 240000000263 Lemna trisulca Species 0.000 description 1
- 241000339993 Lemna turionifera Species 0.000 description 1
- 241000339987 Lemna valdiviana Species 0.000 description 1
- 240000004322 Lens culinaris Species 0.000 description 1
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 1
- 241000199616 Lingulata Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 240000005847 Lysimachia japonica Species 0.000 description 1
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241001308575 Neglecta Species 0.000 description 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108010060806 Photosystem II Protein Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 206010040925 Skin striae Diseases 0.000 description 1
- 101800002927 Small subunit Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241000500460 Spirodela intermedia Species 0.000 description 1
- 240000000067 Spirodela polyrhiza Species 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000723677 Tobacco ringspot virus Species 0.000 description 1
- 241000723681 Tomato ringspot virus Species 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000007244 Zea mays Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 description 1
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 201000006824 bubonic plague Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005530 etching Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- JFUIHGAGFMFNRD-UHFFFAOYSA-N fica Chemical compound FC1=CC=C2NC(C(=O)NCCS)=CC2=C1 JFUIHGAGFMFNRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 101150062015 hyg gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003507 interferon alfa-2b Drugs 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000001216 nucleic acid method Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 101150113864 pat gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 101150075980 psbA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M sodium;diiodomethanesulfonate;n-propyl-n-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-carboxamide Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)C(I)I.C1=CN=CN1C(=O)N(CCC)CCOC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1Cl MIXCUJKCXRNYFM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 101150090749 sulI gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical compound OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 241000709655 unidentified tobacco necrosis virus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- -1 β-glucoronidase Proteins 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un método para producir polipéptido recombinante biológicamente activo en un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, que comprende las etapas de: (a) cultivar dentro de un medio de cultivo para lentejas de agua un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o dicho cultivo de nódulos de lenteja de agua se transforma establemente para expresar dicho polipéptido recombinante biológicamente activo, y en donde dicho polipéptido recombinante biológicamente activo se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codificadora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; y (b) recoger dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo para lentejas de agua; en el que dicha secuencia de péptido de señal se selecciona de: (a) el péptido de señal de interferón α-2b humano; (b) el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana; (c) el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y (d) el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.
Description
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la expresión y la secreción de polipéptidos biológicamente activos procedentes de lenteja de agua manipulada genéticamente ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las lentejas de agua son los únicos miembros de la familia de monocotiledóneas Lemnaceae. Los cuatro géneros y las 34 especies son pequeñas plantas de agua dulce que flotan libremente cuyo ámbito geográfico se extiende por todo el mundo (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Aunque son las plantas más reducidas morfológicamente conocidas, la mayoría de las especies de lenteja de agua tiene todos los tejidos y órganos de plantas mucho mayores, incluyendo raíces, tallos, flores, semillas y frondas. Las especies de lenteja de agua se han estudiado intensivamente y existe una bibliografía sustancial que detalla su ecología, sistemática, ciclo vital, metabolismo, propensión a enfermedades y plagas, su biología reproductiva, estructura genética y biología celular. (Hillman (1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).
El hábito de crecimiento de las lentejas de agua es ideal para métodos de cultivo microbiano. La planta prolifera rápidamente a través de la brotación vegetativa de nuevas frondas, de un modo macroscópico análogo a la propagación asexual en la levadura. Esta proliferación se produce mediante brotación vegetativa a partir de células meristemáticas. La región meristemática es pequeña y se encuentra en la superficie ventral de la fronda. Las células meristemáticas están en dos sacos, uno en cada lado del nervio central de la fronda. La pequeña región del nervio central también es el lugar a partir del cual se origina la raíz y surge el tallo que conecta cada fronda con su fronda madre. El saco meristemático está protegido por una aleta de tejido. Las frondas brotan alternativamente de estos sacos. Los tiempos de doblamiento varían según la especie y son tan cortos como 20-24 horas (Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et ál. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko y Mudd (1970) Plant Physiol. 65:16; Venkataraman et ál. (1970) Z. Pflanzenphysiol.
62: 316).
El cultivo intensivo de lenteja de agua da como resultado los grados más altos de acumulación de biomasa por unidad de tiempo (Landolt y Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae-A Monographic Study Vol. 2: Phytochemistry, Physiology, Application, Bibliography, Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich), con una acumulación en peso seco de 6-15% de peso fresco (Tillberg et ál. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, datos no publicados). Se ha presentado que el contenido de proteína de un número de especies de lenteja de agua desarrolladas bajo condiciones variables varía de 15-45% en peso seco (Chang et al (1977) Bull. Inst. Chem. Acad Sin. 24:19; Chang y Chui (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et ál. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et ál. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251). Usando estos valores, el nivel de producción de proteína por litro de medio en lenteja de agua es del mismo orden de magnitud que sistemas de expresión génica de levadura.
La reproducción sexual en la lenteja de agua está controlada por los componentes del medio y las condiciones de cultivo, incluyendo el fotoperíodo y la densidad de cultivo. La inducción de las flores es un procedimiento de laboratorio habitual con algunas especies. Las plantas normalmente se autopolinizan, y la autofecundación puede conseguirse en el laboratorio mediante cultivos que se baten suavemente. Mediante este método, se han desarrollado líneas consanguíneas de Lemna gibba. Se han identificado mutaciones espontáneas (Slovin y Cohen (1988) Plant Physiol. 86, 522), y se ha usado mutagénesis química y por rayos gamma (usando EMS o NMU) para producir mutantes con características definidas. La fecundación cruzada de L. gibba es tediosa pero puede realizarse mediante polinización manual controlada. El tamaño del genoma de las lentejas de agua varía de 0,25-1,63 pg de DNA/2C con conteos cromosómicos que varían de 20 a 80 y que promedian aproximadamente 40 a través de las Lemnaceae (Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). Se estima que los niveles de ploidía varían de 2-12
C. Id. La diversidad genética de las Lemnaceae se ha investigado usando productos secundarios, isozimas y secuencias de DNA (McClure y Alston (1966) Nature 4916:311; McClure y Alston (1966) Amer. J. Bot. 53:849; Vasseur et ál. (1991) Pl. Syst. Evol. 177:139 (1991); Crawford y Landolt (1993) Syst. Bot. 10:389).
Cultivos de plantas de lenteja de agua o nódulos de lenteja de agua pueden transformarse eficazmente con un casete de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos de interés mediante un número de métodos, incluyendo transferencia génica mediada por Agrobacterium, bombardeo balístico o electroporación. Transformantes de lenteja de agua estables pueden aislarse transformando las células de lenteja de agua tanto con la secuencia de nucleótidos de interés como con un gen que confiere resistencia un agente de selección, seguido por cultivo de las células transformadas en un medio que contiene el agente de selección. Véase la Patente de EE. UU. Nº 6.040.498 y WO 99/07210 de Stomp et ál.
Un sistema de expresión génica de lenteja de agua proporciona la tecnología esencial que sería útil para un número de aplicaciones de investigación y comerciales. Para la investigación de la biología molecular de las plantas como un todo, un sistema de plantas diferenciadas que puede manipularse con la comodidad de laboratorio de la levadura proporciona un sistema muy rápido en el que analizar los papeles de desarrollo y fisiológicos de genes aislados. Para la producción comercial de polipéptidos valiosos, un sistema basado en lenteja de agua tiene un número de ventajas sobre los sistemas microbianos o de cultivo celular existentes. Las plantas demuestran un procesamiento postraduccional que es similar a las células de mamífero, venciendo un problema principal asociado con la producción de células microbianas de los polipéptidos de mamífero biológicamente activos, y ha sido mostrado por otros (Hiatt (1990) Nature 334:469) que los sistemas vegetales tienen la capacidad de montar proteínas multisubunitarias, una capacidad a menudo ausente en los sistemas microbianos. El aumento a escala de biomasa de lenteja de agua hasta niveles necesarios para la producción comercial de proteínas recombinantes es más rápido y más económico que el aumento a escala similar de células de mamífero, y, a diferencia de otros sistemas de producción de plantas sugeridos, p. ej. habas de soja y tabaco, la lenteja de agua puede hacerse crecer en recipientes de producción de biomasa completamente contenidos y controlados, haciendo mucho más fácil la integración del sistema en una infraestructura industrial de producción de proteínas existente.
Estas características hacen a la lenteja de agua una elección ideal para desarrollar como un sistema basado en plantas eficaz para la producción de proteínas recombinantes. De acuerdo con esto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para incrementar la eficacia del sistema de expresión génica de lenteja de agua como una herramienta para producir polipéptidos biológicamente activos. SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se dirige a métodos para la expresión y la recuperación de polipéptidos recombinantes biológicamente activos, usando lenteja de agua como el sistema de expresión. Un aspecto de la presente invención proporciona un método para niveles de expresión mejorados de polipéptidos biológicamente activos en lenteja de agua, dando como resultado un rendimiento de polipéptido incrementado y permitiendo la producción de cantidades útiles de polipéptidos biológicamente activos valiosos en este sistema. Otro aspecto de la invención divulga métodos para la secreción dirigida de polipéptidos biológicamente activos a partir de cultivos de planta de lenteja de agua o nódulos de lenteja de agua manipulados genéticamente. La secreción del polipéptido expresado facilita su recuperación y evita la pérdida de actividad que podría resultar de la trituración mecánica o la lisis enzimática del tejido de lenteja de agua.
En una realización, la invención abarca un método para producir polipéptido recombinante biológicamente activo en un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar dentro de un medio de cultivo para lentejas de agua un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o dicho cultivo de nódulos de lenteja de agua se transforma establemente para expresar dicho polipéptido recombinante biológicamente activo, y en donde dicho polipéptido recombinante biológicamente activo se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codificadora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; y
- (b)
- recoger dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo para lentejas
de agua; en el que dicha secuencia de péptido de señal se selecciona de:
- (a)
- el péptido de señal de interferón α-2b humano;
- (b)
- el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana;
- (c)
- el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y
- (d)
- el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.
Preferiblemente, dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos un atributo seleccionado de:
- (a)
- codones preferidos para lenteja de agua en la secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante;
- (b)
- codones preferidos para lenteja de agua en la secuencia codificadora para dicho péptido de señal;
- (c)
- un codón de inicio de la traducción que está flanqueado por una secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción preferida para plantas;
- (d)
- una secuencia de nucleótidos conectada operativamente que comprende un intrón vegetal que está insertado aguas arriba de la secuencia codificadora; y
- (e)
- una secuencia líder 5’ conectada operativamente.
La invención también proporciona un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, transformado establemente para expresar un polipéptido recombinante biológicamente activo a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codificadora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; en donde dicha secuencia del péptido de señal se selecciona de:
- (a)
- el péptido de señal de interferón α-2b humano;
- (b)
- el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana;
- (c)
- el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y
- (d)
- el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.
La invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b indicada en el Nº ID SEC: 2 conectada operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal dada en el Nº ID SEC: 3.
En una realización del método, el péptido de señal es el péptido de señal de αamilasa de arroz cuya secuencia se indica en el Nº ID SEC: 3.
En algunas realizaciones de los métodos anteriores, los codones preferidos para lenteja de agua son codones preferidos para Lemna. En realizaciones adicionales, los codones preferidos para lenteja de agua son codones preferidos para Lemna gibba o codones preferidos para Lemna minor. En realizaciones adicionales, al menos una secuencia codificadora seleccionada de la secuencia codificadora para el polipéptido recombinante biológicamente activo y la secuencia codificadora para el péptido de señal comprende entre 70-100% de codones preferidos para Lemna gibba
o codones preferidos para Lemna minor.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción preferida para plantas consiste en la secuencia de nucleótidos “ACC” o “ACA”, en donde dicho contexto está situado inmediatamente adyacente al extremo 5’ del codón de inicio de la traducción.
En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos conectada operativamente que comprende dicho intrón vegetal es la secuencia indicada en el Nº ID SEC:
1.
En algunas realizaciones, el cultivo de frondas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua expresa y monta todas las subunidades de una proteína multímera biológicamente activa. En realizaciones adicionales, la proteína multímera se selecciona del grupo que consiste en colágeno, hemoglobina, P450 oxidasa y un anticuerpo monoclonal.
En algunas realizaciones, el polipéptido recombinante biológicamente activo es un polipéptido de mamífero. En realizaciones adicionales, el polipéptido de mamífero es un polipéptido terapéutico. En algunas realizaciones, el polipéptido de mamífero se selecciona del grupo que consiste en: insulina, hormona del crecimiento, interferón α, interferón β, β-glucocerebrosidasa, β-glucoronidasa, proteína de retinoblastoma, proteína p53, angiostatina, leptina, anticuerpos monoclonales, citoquinas, receptores, vacunas humanas, vacunas animales, polipéptidos vegetales y albúmina de suero.
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos anteriores, el polipéptido recombinante biológicamente activo es interferón α-2. En realizaciones adicionales, el interferón α-2b es interferón α-2b humano. En realizaciones adicionales, el interferón α-2b humano tiene la secuencia de aminoácidos indicada en el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 5.
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos anteriores, el polipéptido recombinante biológicamente activo es una variante biológicamente activa de interferón α-2b, en donde dicha variante biológicamente activa tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 5.
En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos anteriores, el polipéptido recombinante biológicamente activo es una enzima.
En otras realizaciones, la invención abarca el cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente de cualquiera de los métodos anteriores. En realizaciones adicionales, el cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente se selecciona del grupo que consiste en el género Spirodela, el género Wolffia, el género Wolfiella y el género Lemna. En realizaciones adicionales, el cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente se selecciona del grupo que consiste en Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis y Lemna gibba.
En otras realizaciones, la invención abarca una molécula de ácido nucleico para la expresión y la secreción de interferón α-2b humano in lenteja de agua que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica péptido de señal dada en el Nº ID SEC:3, y la secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b humano maduro dada en el Nº ID SEC:5, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica péptido de señal y dicha secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b humano maduro están conectadas operativamente. En realizaciones adicionales, la molécula de ácido nucleico comprende adicionalmente la secuencia de nucleótidos que comprende el intrón dada en el Nº ID SEC:1, en donde dicha secuencia de nucleótidos que comprende el intrón está conectada operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal y dicha secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b humano maduro.
Estos y otros aspectos de la presente invención se divulgan con más detalle en la descripción de la invención dada posteriormente. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1
La Figura 1 muestra los niveles de interferón (según se determinan mediante
un inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida) en el medio y el tejido de un
cultivo de lenteja de agua transformado, según se describe en el Ejemplo 1.
Figura 2
La Figura 2 muestra los niveles de interferón (según se determinan mediante
un inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida) en el medio y el tejido de un
cultivo de lenteja de agua transformado, según se describe en el Ejemplo 2. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En la presente invención, se divulgan métodos para mejorar la expresión y la recuperación de polipéptidos biológicamente activos de plantas de lenteja de agua y cultivos de nódulos de lenteja de agua genéticamente manipulados. Estos métodos comprenden las etapas indicadas anteriormente.
Como otro aspecto, la presente invención abarca plantas de lenteja de agua o cultivos de nódulos de lenteja de agua transformados que producen polipéptidos biológicamente activos de acuerdo con los métodos anteriores.
Como otro aspecto, la presente invención divulga métodos y secuencias de ácido nucleico para producir interferón α-2b humano biológicamente activo en lenteja de agua. Definiciones:
“Polipéptido” se refiere a cualquier proteína o péptido monómero o multímero.
“Polipéptido biológicamente activo” se refiere a un polipéptido que tiene la capacidad de realizar una o más funciones biológicas o un grupo de actividades normalmente atribuidas al polipéptido en un contexto biológico. Los expertos en la técnica apreciarán que el término “biológicamente activo” incluye polipéptidos en los que su actividad biológica está alterada en comparación con la proteína natural (p. ej., suprimida o aumentada), con tal de que la proteína tenga suficiente actividad para ser de interés para el uso en procedimientos industriales o químicos o como un reactivo terapéutico, vacunal o diagnóstico. La actividad biológica puede determinarse mediante cualquier método disponible en la técnica. Por ejemplo, la actividad biológica de miembros de la familia de proteínas del interferón puede determinarse mediante cualquiera de un número de métodos, incluyendo su interacción con anticuerpos específicos para el interferón, su capacidad para incrementar la resistencia a una infección viral o su capacidad para modular la transcripción de dianas génicas reguladas por interferón.
“Secuencia de nucleótidos de interés”, según se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido destinado a la expresión en lenteja de agua. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos terapéuticos (p. ej., para usos veterinario o médico) o inmunogénicos (p. ej., para vacunación) pueden expresarse usando lenteja de agua transformada de acuerdo con la presente invención.
Los términos “expresión” o “producción” se refieren a la biosíntesis de un producto génico, incluyendo la transcripción, la traducción y el montaje de dicho producto génico.
El término “lenteja de agua” se refiere a miembros de la familia Lemnaceae. Esta familia se divide actualmente en cuatro géneros y 34 especies de lenteja de agua, como sigue: género Lemna (L. aequinoctialis, L. disperma, L. ecuadoriensis, L. gibba, L. japonica, L. minor, L. miniscula, L. obscura, L. perpusilla, L. tenera, L. trisulca, L. turionifera, L. valdiviana); género Spirodela (S. intermedia, S. polyrrhiza, S. punctata); género Wolffia (Wa. angusta, Wa. arrhiza, Wa. australina, Wa. borealis, Wa. brasiliensis, Wa. columbiana, Wa. elongata, Wa. globosa, Wa. microscopica, Wa. neglecta) y género Wolfiella (Wl. caudata, Wl. denticulata, Wl. gladiata, Wl. hyalina, Wl. lingulata, Wl. repunda, Wl. rotunda y Wl. neotropica). Cualesquiera otros géneros o especies de Lemnaceae, si existen, también son aspectos de la presente invención. Las especies de Lemna pueden clasificarse usando el esquema taxonómico descrito por Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The family of Lemnaceae-A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich.
El término “cultivo de nódulos de lenteja de agua”, según se usa en la presente memoria, se refiere a un cultivo que comprende células de lenteja de agua en el que al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las células son células diferenciadas. Una “células diferenciada”, según se usa en la presente memoria, es una célula con un fenotipo característico (p. ej., una morfología celular distintiva o la expresión de un ácido nucleico o proteína marcador) que la distingue de células no diferenciadas o de células encontradas en otros tipos de tejidos. Las células diferenciadas del cultivo de nódulos de lenteja de agua descrito en la presente memoria forman una superficie lisa enlosada de células interconectadas fusionadas en sus paredes celulares adyacentes, con nódulos que han empezado a organizarse en primordio de fronda dispersado por todo el tejido. La superficie del tejido del cultivo de nódulos tiene células epidérmicas conectadas entre sí a través de plasmadesmata.
“Codones preferidos para lenteja de agua”, según se usa en la presente memoria, se refiere a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en la lenteja de agua de más de 17%.
“Codones preferidos para Lemna”, según se usa en la presente memoria, se refiere a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en el género Lemna de más de 17%.
“Codones preferidos para Lemna gibba”, según se usa en la presente memoria, se refiere a codones que tienen una frecuencia de utilización de codones en Lemna gibba de más de 17%, donde la frecuencia de utilización de codones en Lemna gibba se obtuvo de la Codon Usage Database (GenBank Release 113,0; en http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species=Lemna+gibba+[gbpln]).
“Codón de inicio de la traducción” se refiere al codón que inicia la traducción del mRNA transcrito a partir de la secuencia de nucleótidos de interés.
“Secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción”, según se usa en la presente memoria, se refiere a la identidad de los tres nucleótidos directamente 5’ del codón de inicio de la traducción.
“Secreción”, según se usa en la presente memoria, se refiere a la traslocación de un polipéptido a través tanto de la membrana plasmática como de la pared celular de una célula vegetal huésped.
“Conectada operativamente”, según se usa en la presente memoria en referencia a secuencias de nucleótidos, se refiere a múltiples secuencias de nucleótidos que están situadas en una relación funcional entre sí. Generalmente, las secuencias de DNA conectadas operativamente son contiguas y, cuando es necesario enlazar dos regiones que codifican proteínas, están en el marco de lectura.
A. Casetes de Expresión
De acuerdo con la presente invención, lenteja de agua transformada establemente se obtiene mediante la transformación con una secuencia de nucleótidos de interés contenida dentro de un casete de expresión. El casete de expresión comprende una región de inicio de la transcripción conectada al ácido nucleico o gen de interés. Tal casete de expresión está provisto de una pluralidad de sitios de restricción para que la inserción del gen o los genes de interés (p. ej., un gen de interés, dos genes de interés, etc.) esté bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede codificar un solo gen de interés. En realizaciones particulares de la invención, el ácido nucleico que ha de transferirse contiene dos o más casetes de expresión, cada uno de los cuales codifica al menos un gen de interés.
La región de inicio de la transcripción, (p. ej., un promotor) puede ser natural u homóloga o extraña o heteróloga para el huésped, o podría ser la secuencia natural
o una secuencia sintética. Por extraña, se entiende que la región de inicio de la transcripción no se encuentra en el huésped silvestre en el que se introduce la región de inicio de la transcripción. Según se usa en la presente memoria, un gen quimérico comprende una secuencia codificadora conectada operativamente a una región de inicio de la transcripción que es heteróloga para la secuencia codificadora.
Cualquier promotor adecuado conocido en la técnica puede emplearse de acuerdo con la presente invención (incluyendo promotores bacterianos, de levadura, fúngicos, de insecto, de mamífero y de planta). Por ejemplo, pueden usarse promotores de planta, incluyendo promotores de lenteja de agua. Promotores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, los promotores de opina sintetasa (p. ej., nos, mas, ocs, etc.), el promotor de ubiquitina, el promotor de actina, el promotor de la subunidad pequeña de bisfosfato de ribulosa (RubP) carboxilasa y el promotor de alcohol deshidrogenasa. El promotor de la sub-unidad pequeña de RubP carboxilasa de lenteja de agua es conocido en la técnica (Silverthorne et ál. (1990) Plant Mol. Biol. 15:49). Otros promotores de virus que infectan plantas, preferiblemente lenteja de agua, también son adecuados, incluyendo, pero no limitados a, promotores aislados del virus del mosaico de colocasia, virus de Chlorella (p. ej., el promotor de adenina metiltransferasa del virus de Chlorella; Mitra et ál. (1994) Plant Mol. Biol. 26:85), virus de la peste negra del tomate, virus del cascabeleo del tabaco, virus de la necrosis del tabaco, virus de la mancha anular del tabaco, virus de la mancha anular del tomate, virus del mosaico del pepino, virus del tocón del cacahuete, virus del mosaico de la alfalfa, badnavirus baciliforme de la caña de azúcar y similares.
Finalmente, pueden elegirse promotores para dar un nivel de regulación deseado. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser ventajoso usar un promotor que confiera expresión constitutiva (p. ej., el promotor de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens). Alternativamente, en otras situaciones, puede ser ventajoso usar promotores que se activen en respuesta a estímulos ambientales específicos (p. ej., promotores de genes de choque térmico, promotores de genes inducibles por sequía, promotores de genes inducibles por patógenos, promotores de genes inducibles por heridas y promotores de genes inducibles por luz/oscuridad) o reguladores del crecimiento de las plantas (p. ej., promotores procedentes de genes inducidos por ácido abscísico, auxinas, citoquininas y ácido giberélico). Como una alternativa adicional, pueden elegirse promotores que den expresión específica de un tejido (p. ej., promotores específicos de raíces, hojas y flores).
La resistencia global de un promotor dado puede verse influenciada por la combinación y la organización espacial de secuencias de nucleótidos de acción cis tales como secuencias activadoras aguas arriba. Por ejemplo, secuencias de nucleótidos activadoras derivadas de gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens pueden aumentar la transcripción a partir del promotor de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (véase la Patente de EE. UU. 5.955.646 de Gelvin et ál.). En la presente invención, el casete de expresión puede contener secuencias de nucleótidos activadoras insertadas aguas arriba de la secuencia promotora para aumentar la expresión de la secuencia de nucleótidos de interés. En una realización, el casete de expresión incluye tres secuencias activadoras aguas arriba derivadas del gen de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens conectadas operativamente a un promotor derivado de un gen de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens (véase la Patente de EE. UU. 5.955.646).
El casete transcripcional incluye en la dirección de transcripción 5’-3’ una región de inicio de la transcripción y la traducción, una secuencia de nucleótidos de interés y una región de terminación de la transcripción y la traducción funcional en plantas. Cualquier secuencia de terminación adecuada conocida en la técnica puede usarse de acuerdo con la presente invención. La región de terminación puede ser natural con la región de inicio de la transcripción, puede ser natural con la secuencia de nucleótidos de interés o puede derivarse de otra fuente. Regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintetasa. Véase además Guerineau et ál. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141; Proudfoot (1991) Cell 64:671; Sanfacon et ál. (1991) Genes Dev. 5:141; Mogen et ál. (1990) Plant Cell 2:1261; Munroe et ál. (1990) Gene 91:151; Ballas et ál. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891; y Joshi et ál. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627. Secuencias de terminación ejemplares adicionales son la secuencia de terminación de la subunidad pequeña de RubP carboxilasa de guisante y la secuencia de terminación de 35S del virus del mosaico de la coliflor. Otras secuencias de terminación adecuadas serán evidentes para los expertos en la técnica.
Alternativamente, el gen o los genes de interés pueden proporcionarse en cualquier otro casete de expresión adecuado conocido en la técnica.
Los casetes de expresión pueden contener más de un gen o una secuencia de ácido nucleico que ha de transferirse y expresarse en la planta transformada. Así, cada secuencia de ácido nucleico estará conectada operativamente a secuencias reguladoras 5’ y 3’. Alternativamente, pueden proporcionarse múltiples casetes de expresión.
Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células o tejidos transformados. Genes marcadores seleccionables incluyen genes que codifican resistencia a antibióticos, tales como los que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas. Los genes de resistencia a herbicidas generalmente codifican para una proteína diana modificada insensible al herbicida o para una enzima que degrada o destoxifica el herbicida en la planta antes de que pueda actuar. Véanse DeBlock et ál. (1987) EMBO J. 6:2513; DeBlock et ál. (1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et ál. (1990) BioTechnology 8:833; Gordon-Kamm et ál. (1990) Plant Cell 2:603. Por ejemplo, se ha obtenido resistencia a herbicidas de glifosato o sulfonilurea usando genes que codifican para las enzimas diana mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) y acetolactato sintasa (ALS). Se ha obtenido resistencia a glufosinato amónico, bromoxinil y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) usando genes bacterianos que codifican fosfinotricina acetiltransferasa, una nitrilasa o una 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenasa, que destoxifican los respectivos herbicidas.
Para los propósitos de la presente invención, genes marcadores seleccionables incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican neomicina fosfotransferasa II (Fraley et ál. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); cianamida hidratasa (Maier-Greiner et ál. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4250); aspartato quinasa; dihidrodipicolinato sintasa (Perl et ál. (1993) BioTechnology 11:715); gen bar (Toki et ál. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et ál. (1996) Crop Sci. 36:1367); triptófano descarboxilasa (Goddijn et ál. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); neomicina fosfotransferasa (NEO; Southern et ál. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); higromicina fosfotransferasa (HPT o HYG; Shimizu et ál. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); dihidrofolato reductasa (DHFR; Kwok et ál. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552); fosfinotricina acetiltransferasa (DeBlock et ál. (1987) EMBO J. 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiónico deshalogenasa (Buchanan-Wollatron et ál. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); acetohidroxiácido sintasa (Pat. EE. UU. Nº 4.761.373 de Anderson et ál. ; Haughn et ál. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-enolpiruvilshikimato-fosfato sintasa (aroA; Comai et ál. (1985) Nature 317:741); haloarilnitrilasa (WO 87/04181 de Stalker et ál.); acetil-coenzima A carboxilasa (Parker et ál. (1990) Plant Physiol. 92:1220); dihidropteroato sintasa (sulI; Guerineau et ál. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); y polipéptido del fotosistema II de 32 kDa (psbA; Hirschberg et ál. (1983) Science 222:1346 (1983).
También se incluyen genes que codifican resistencia a: gentamicina (p. ej., aacCl, Wohlleben et ál. (1989) Mol. Gen. Genet. 217:202-208); cloranfenicol (Herrera-Estrella et ál. (1983) EMBO J. 2:987); metotrexato (Herrera-Estrella et ál. (1983) Nature 303:209; Meijer et ál. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); higromicina (Waldron et ál. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103; Zhijian et ál. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et ál. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807); estreptomicina (Jones et ál. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:86); espectinomicina (Bretagne-Sagnard et ál. (1996) Transgenic Res. 5:131); bleomicina (Hille et ál. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); sulfonamida (Guerineau et ál. (1990) Plant Mol. Bio. 15:127); bromoxinil (Stalker et ál. (1988) Science 242:419); 2,4-D (Streber et ál. (1989) BioTechnology 7:811); fosfinotricina (DeBlock et ál. (1987) EMBO J. 6:2513); espectinomicina (Bretagne-Sagnard y Chupeau, Transgenic Research 5:131).
El gen bar confiere resistencia a herbicidas para herbicidas de tipo glufosinato, tales como fosfinotricina (PPT) o bialafos, y similares. Según se apunta anteriormente, otros marcadores seleccionables que podrían usarse en los constructos vectoriales incluyen, pero no se limitan a, el gen pat, también para resistencia a bialafos y fosfinotricina, el gen ALS para resistencia a imidazolinona, el gen HPH o HYG para resistencia a higromicina, el gen de EPSP sintasa para resistencia a glifosato, el gen Hml para resistencia a la toxina Hc, y otros agentes selectivos usados habitualmente y conocidos para un experto normal en la técnica. Véanse Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et ál. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 6314; Yao et ál. (1992) Cell 71:63; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et ál. (1980) The Operon 177-220; Hu et ál. (1987) Cell 48:555; Brown et ál. (1987) Cell 49:603; Figge et ál. (1988) Cell 52:713; Deuschle et ál. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:5400; Fuerst et ál. (1989) Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:2549; Deuschle et ál. (1990) Science 248:480; Labow et ál. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et ál. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 3952; Baim et ál. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:5072; Wyborski et ál. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Biol. 10:143; Degenkolb et ál. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591; Kleinschnidt et ál. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz et ál. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et ál. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. USA 89:5547; Oliva et ál. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913; Hlavka et ál. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; y Gill et ál. (1988) Nature 334:721.
La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable puede usarse en la presente invención.
B. Modificación de Secuencias de Nucleótidos para una Expresión Aumentada en Lenteja de Agua
La presente invención proporciona la modificación de la secuencia de nucleótidos expresada para aumentar su expresión en lenteja de agua. Una de tales modificaciones es la síntesis de la secuencia de nucleótidos de interés usando codones preferidos para lenteja de agua. Están disponibles en la técnica métodos para sintetizar secuencias de nucleótidos con codones preferidos para plantas. Véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. Nº 5.380.831 y 5.436.391; Perlak et ál. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 15:3324; Iannacome et ál. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; y Murray et ál., (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477. Los codones preferidos pueden determinarse a partir de los codones de mayor frecuencia en las proteínas expresadas en lenteja de agua. Por ejemplo, la frecuencia de utilización de codones para Lemna gibba se encuentra en la página electrónica: http://www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species= Lemna+gibba+[gbpln], y la frecuencia de utilización de codones para Lemna minor se encuentra en la página electrónica http: //www.kazusa.or.jp/codon/cgibin/showcodon.cgi?species= Lemna+minor+[gbpln]. Se sabe que genes que se han optimizado para la expresión en lenteja de agua y otras monocotiledóneas pueden usarse en los métodos de la invención. Véanse, p. ej., EP 0 359 472, EP 0 385 962, WO 91/16432; Perlak et ál. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:3324; Iannacome et ál. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; y Murray et ál. (1989) Nuc. Acids Res. 17:477, y similares, incorporados en la presente memoria mediante referencia. Se sabe además que la totalidad o cualquier parte de la secuencia génica puede optimizarse o ser sintética. En otras palabras, también pueden usarse secuencias totalmente optimizadas o parcialmente optimizadas. Por ejemplo, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de los codones puede ser codones preferidos para lenteja de agua. En una realización, entre 90 y 96% de los codones son codones preferidos para lenteja de agua. La secuencia codificadora de la secuencia de nucleótidos de interés puede comprender codones usados con una frecuencia de al menos 17% en Lemna gibba. En una realización, la secuencia de nucleótidos modificada es la secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b humano mostrada en el Nº ID SEC:2, que contiene 93% de codones preferidos para lenteja de agua.
También pueden realizarse otras modificaciones en la secuencia de nucleótidos de interés para aumentar su expresión en lenteja de agua. Estas modificaciones incluyen, pero no se limitan a, eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitios de reparación de exones-intrones, repeticiones similares a transposones y otras secuencias bien caracterizadas tales que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia puede ajustarse hasta niveles promedio para un huésped celular dado, según se calcula mediante referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Cuando es posible, la secuencia puede modificarse para evitar estructuras de mRNA secundarias de tipo horquilla predichas.
Existen diferencias conocidas entre las secuencias de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción óptimas para codones de inicio de la traducción en animales y plantas y la composición de estas secuencias de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción pueden influir en la eficacia de inicio de la traducción. Véanse, por ejemplo, Lukaszewicz et ál. (2000) Plant Science 154:89-98; y Joshi et ál. (1997); Plant Mol. Biol. 35:993-1001. En la presente invención, la secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción para el codón de inicio de la traducción de la secuencia de nucleótidos de interés puede modificarse para aumentar la expresión en lenteja de agua. En una realización, la secuencia de nucleótidos se modifica de modo que los tres nucleótidos directamente aguas arriba del codón de inicio de la traducción de la secuencia de nucleótidos de interés sean “ACC.” En una segunda realización, estos nucleótidos son “ACA”.
La expresión de un transgén en lenteja de agua también puede aumentarse mediante el uso de secuencias líder 5’. Tales secuencias líder pueden actuar para aumentar la traducción. Los líderes de traducción se conocen en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, líderes de picornavirus, p. ej., líder de EMCV (región no codificadora 5’ de encefalomiocarditis; Elroy-Stein et ál. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:6126); líderes de potivirus, p. ej., líder de TEV (virus del grabado del tabaco; Allison et ál. (1986) Virology 154:9); proteína que se une a cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP; Macajak y Sarnow (1991) Nature 353:90); líder no traducido procedente del mRNA de proteína de envuelta de virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4; Jobling y Gehrke (1987) Nature 325:622); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV; Gallie (1989) Molecular Biology of RNA, 23:56); líder del virus del grabado de la patata (Tomashevskaya et ál. (1993) J. Gen. Viral. 74:2717-2724); región no traducida 5’ de Fed-1 (Dickey (1992) EMBO J. 11: 23112317); región no traducida 5’ de RbcS (Silverthorne et ál. (1990) J. Plant. Mol. Biol. 15:49-58); y líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV; Lommel et ál. (1991) Virology 81:382). Véanse además Della-Cioppa et ál. (1987) Plant Physiology 84:965. También se ha mostrado que una secuencia líder que comprende una secuencia intrónica de planta, incluyendo secuencia intrónica del gen de deshidrogenasa 1 de maíz, el gen de catalasa de haba de ricino o el gen de la ruta del triptófano de Arabidopsis PAT1, incrementa la eficacia traduccional en plantas (Callis et ál. (1987) Genes Dev. 1:1183-1200; Mascarenhas et ál. (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). En una realización de la presente invención, una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1222-1775 del gen de alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (Número de Registro de GenBank X04049), indicada en el Nº ID SEC: 1, se inserta aguas arriba de la secuencia de nucleótidos de interés para aumentar la eficacia de su traducción.
Se sabe que cualquiera de las modificaciones de la secuencia de nucleótidos que aumentan la expresión en lenteja de agua descritas anteriormente puede usarse en la presente invención, incluyendo cualquier modificación simple o cualquier posible combinación de modificaciones. La expresión “modificada para una expresión aumentada en lenteja de agua”, según se usa en la presente memoria, se refiere a una secuencia de nucleótidos que contiene una cualquiera o cualquier combinación de estas modificaciones.
C. Péptidos de Señal
Las proteínas secretadas se traducen habitualmente a partir de polipéptidos precursores que incluyen un “péptido de señal” que interactúa con una proteína receptora sobra la membrana del retículo endoplásmico (ER) para dirigir la traslocación de la cadena polipeptídica en crecimiento a través de la membrana y hacia el interior del retículo endoplásmico para la secreción desde la célula. Este péptido de señal a menudo se escinde del polipéptido precursor para producir un polipéptido “maduro” que carece del péptido de señal. En una realización de la presente invención, un polipéptido biológicamente activo se expresa en lenteja de agua a partir de una secuencia de nucleótidos que está conectada operativamente con una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido en el medio de cultivo. Péptidos de señal vegetales que orientan las traslocación de proteínas hacia el retículo endoplásmico (para la secreción al exterior de la célula) son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente de EE. UU. Nº 6.020.169 de Lee et ál. En la presente invención, cualquier péptido de señal vegetal puede usarse para orientar la expresión del polipéptido hacia el ER. En algunas realizaciones, el péptido de señal es el péptido de señal de endoquitinasa básica de Arabidopsis thaliana (Nº ID SEC:8; aminoácidos 14-34 del Nº de Registro de Proteínas del NCBI BAA82823), el péptido de señal de extensina (Stiefel et ál. (1990) Plant Cell 2:785793), el péptido de señal de α-amilasa de arroz (Nº ID SEC:6; aminoácidos 1-31 del Nº de Registro de Proteínas del NCBI AAA33885) o una secuencia de señal de αamilasa de arroz modificada (Nº ID SEC:7). En otra realización, el péptido de señal corresponde al péptido de señal de una proteína de lenteja de agua secretada.
Alternativamente, un péptido de señal de mamífero puede usarse para orientar polipéptidos recombinantes expresados en lenteja de agua manipulada genéticamente para la secreción. Se ha demostrado que las células vegetales reconocen péptidos de señal de mamífero que orientan hacia el retículo endoplásmico, y que estos péptidos de señal pueden dirigir la secreción de polipéptidos no solo a través de la membrana plasmática sino también a través de la pared celular de la planta. Véanse las Patentes de EE. UU. Nº 5.202.422 y 5,639,947 de Hiatt et ál. En una realización de la presente invención, el péptido de señal de mamífero que orienta la secreción de polipéptido es el péptido de señal de interferón α-2b humano (aminoácidos 1-23 del Nº de Registro de Proteínas del NCBI AAB59402 y Nº ID SEC: 4).
En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal se modifica para una expresión aumentada en lenteja de agua, utilizando cualquier modificación o combinación de modificaciones divulgada en la sección B anteriormente para la secuencia de nucleótidos de interés. En otra realización, el péptido de señal es el péptido de señal de α-amilasa de arroz codificado por la secuencia de nucleótidos modificada indicada en el Nº ID SEC: 3, que contiene aproximadamente 93% de codones preferidos para lenteja de agua.
El polipéptido biológicamente activo secretado puede recogerse del medio de cultivo mediante cualquier medio convencional conocido en la técnica y purificarse mediante cromatografía, electroforesis, diálisis, extracción disolvente-disolvente y similares.
D. Plantas de Lenteja de Agua y Cultivos de Lenteja de Agua Transformados
La lenteja de agua transformada establemente utilizada en esta invención puede obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica. En una realización, la lenteja de agua transformada establemente se obtiene mediante uno de los métodos de transferencia génica divulgados en la Patente de EE. UU. Nº 6.040.498 de Stomp et ál. Estos métodos incluyen transferencia génica mediante bombardeo balístico con microproyectiles revestidos con un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de interés, transferencia génica mediante electroporación y transferencia génica mediada por Agrobacterium que comprende un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de interés. En una realización, la lenteja de agua transformada establemente se obtiene a través de uno cualquiera de los métodos mediados por Agrobacterium divulgados en la Patente de EE. UU. Nº 6.040.498 de Stomp et ál. La Agrobacterium usada es Agrobacterium tumefaciems o Agrobacterium rhizogenes.
Se prefiere que las plantas de lenteja de agua transformadas establemente utilizadas en estos métodos exhiban una morfología normal y sean fértiles por reproducción sexual. Preferiblemente, las plantas transformadas de la presente invención contienen una sola copia del ácido nucleico transferido, y el ácido nucleico transferido no tiene transposiciones notables en la misma. También se prefieren plantas de lenteja de agua en las que el ácido nucleico transferido esté presente en bajos números de copias (es decir, no más de cinco copias, alternativamente, no más de tres copias, como una alternativa adicional, menos de tres copias del ácido nucleico por célula transformada).
La lenteja de agua transformada establemente expresa una hormona proteínica, un factor de crecimiento o una citoquina biológicamente activos, o una hormona del crecimiento (en particular, hormona del crecimiento humana). Alternativamente, la lenteja de agua expresa β-glucuronidasa biológicamente activa. La lenteja de agua puede expresar interferón α-2b biológicamente activo, por ejemplo precursor de interferón α-2b humano (Nº de Registro de Proteínas del NCBI AAB59402; indicado en el Nº ID SEC: 4) o interferón α-2b humano maduro (aminoácidos 24-188 de Nº de Registro de Proteínas del NCBI AAB9402; indicado en el Nº ID SEC: 5) o variantes biológicamente activas de los mismos.
Por “variante biológicamente activa” de interferón α-2b humano se entiende un polipéptido derivado del polipéptido natural mediante deleción (llamado truncamiento) o adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína natural; deleción o adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína natural; o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína natural. Los polipéptidos de interferón α-2b variantes biológica-mente activos abarcados por la presente invención son biológicamente activos, esto es, continúan poseyendo la actividad biológica deseada del interferón α-2b natural, incluyendo la capacidad para incrementar la resistencia a una infección viral, o la capacidad para modular la transcripción de dianas génicas reguladas por interferón α2b. Tales variantes biológicamente activas pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína de interferón α-2b natural de la invención tendrán al menos aproximadamente 50%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 5. Así, una variante biológicamente activa de un interferón α-2b de la invención puede diferir de esa proteína en tan poco como 1-15 residuos de aminoácido, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o incluso 1 residuo de aminoácido. Ejemplos de variantes biológicamente activas de interferón α humano son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la patente europea EP211148B1 y las Patentes de EE. UU. Nº 4.748.233, 4.801.685, 4.816.566, 4.973.479, 4.975.276, 5.089.400, 5.098.703, 5.231.176 y 5.869.293.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud entre dos secuencias pueden llevarse a cabo usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453, que se incorpora en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en www.accelrys.com), usando bien una matriz BLOSSUM62 o bien una matriz PAM250, y un peso de huecos de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso longitudinal de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización preferida más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG, usando una matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff et ál. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) y un peso de huecos de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso longitudinal de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Un grupo de parámetros particularmente preferido (y el que debe usarse si el operario no está seguro de qué parámetros deben aplicarse para determinar si una molécula está dentro de una limitación de identidad de secuencia de la invención) está usando una matriz de puntuación BLOSUM62 con un peso de huecos de 60 y un peso longitudinal de 3.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos también puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989) CABIOS 4:11-17 que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud de huecos de 12 y una penalización por huecos de 4.
En una realización, las plantas de lenteja de agua o los cultivos de nódulos de lenteja de agua transformados establemente expresan polipéptidos biológicamente activos que no pueden ser producidos comercialmente de forma eficaz por sistemas de expresión génica existentes, debido a restricciones económica o logísticas, o ambas. Por ejemplo, algunas proteínas no pueden expresarse en sistemas mamíferos debido a que la proteína interfiere con la viabilidad celular, la proliferación celular, la diferenciación celular o el montaje de proteínas en células de mamífero. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteína de retinoblastoma, p53, angiostatina y leptina. La presente invención puede emplearse ventajosamente para producir proteínas reguladoras de mamífero; es improbable, dada la gran distancia evolutiva entre las plantas superiores y los mamíferos, que estas proteínas interfieran con procesos reguladores en la lenteja de agua. También puede usarse lenteja de agua transgénica para producir grandes cantidades de proteínas tales como albúmina de suero (en particular, albúmina de suero humana), hemoglobina y colágeno, que estimulan las capacidades de producción de sistemas de expresión existentes.
Finalmente, sistemas de plantas superiores pueden manipularse para producir proteínas multímeras biológicamente activas (p. ej., anticuerpos monoclonales, hemoglobina, P450 oxidasa y colágeno, y similares) mucho más fácilmente que los sistemas mamíferos. Un procedimiento ejemplar para producir proteínas multímeras biológicamente activas en lenteja de agua usa un vector de expresión que contiene los genes que codifican todas las subunidades polipeptídicas. Véanse, p. ej., During et ál. (1990) Plant Mol. Biol. 15:281 y van Engelen et ál. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1701. Este vector se introduce a continuación en células de lenteja de agua usando cualquier método de transformación conocido, tal como una transformación por bombardeo balístico o mediada por Agrobacterium. Este método da como resultado líneas celulares clonales que expresan todos los polipéptidos necesarios para montar la proteína multímera. Una variación de este procedimiento es elaborar constructos génicos simples, mezclar entre sí DNA procedente de estos constructos y a continuación aportar esta mezcla de DNA a células vegetales usando transformación por bombardeo balístico o mediada por Agrobacterium. Como una variación adicional, algunos o todos los vectores pueden codificar más de una subunidad de la proteína multímera (es decir, de modo que haya menos clones de lenteja de agua para cruzarse que el número de subunidades de la proteína multímera). En una realización alternativa, cada clon de lenteja de agua expresa al menos una de las subunidades de la proteína multímera, y clones de lenteja de agua que secretan cada subunidad se cultivan juntos y la proteína multímera se monta en el medio a partir de las diversas subunidades secretadas. En algunos casos, puede ser deseable producir menos de la totalidad de las subunidades de una proteína multímera, o incluso una sola subunidad proteínica, en una planta de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua transformados, p. ej., para procedimientos industriales o químicos o con propósitos diagnósticos, terapéuticos o de vacunación. PARTE EXPERIMENTAL
Los siguientes ejemplos se ofrecen con propósitos de ilustración, no a modo de limitación.
Vectores de Expresión
El vector de expresión pBMSP-1 usado en algunos de los ejemplos se describe en la Patente de EE. UU. Nº 5.955.646. El casete de transcripción pBMSP-1 contiene tres copias de una secuencia de nucleótidos activadora de la transcripción deri
5 vada de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y una secuencia de nucleótidos activadora de la transcripción adicional derivada del gen de manopina sin-tasa de Agrobacterium tumefaciens, una región promotora derivada del gen de manopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, un sitio policonector para la inserción de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés y una secuencia
10 de terminación derivada del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens. El vector de expresión pBMSP-1 también contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para neomicina fosfotransferasa II como un marcador seleccionable. La transcripción del marcador seleccionable es conducida por un promotor derivado del gen de nopalina sintasa de Agrobacterium tumefaciens.
15 El vector de expresión pBMSP-3, también usado en algunos de los siguientes ejemplos, contiene los componentes del vector de expresión pBMSP-1 descrito anteriormente y adicionalmente contiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a los nucleótidos 1222-1775 del gel de alcohol deshidrogenasa de maíz (Número de Registro del GenBank X04049) insertada entre el promotor y el policonector.
20 Constructos de Expresión para la Producción de Interferón α-2b Humano en Lenteja de Agua Los siguientes constructos de expresión se construyeron usando métodos bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis,
T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 25 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Tabla 1
- Nombre del Constructo
- Vector de Expresión Péptido de Señal Secuencia Codificadora de Interferón
- IFN01
- pBMSP-1 Ninguno Interferón no optimizado (nucleótidos 580-1077 de Nº Registro del Gen-Bank J00207)
- IFN02
- pBMSP-3 Interferón no optimizado (nucleótidos 511-579 de Nº Registro del GenBank J00207) Interferón no optimizado (nucleótidos 580-1077 de Nº Registro del Gen-Bank J00207)
- IFN03
- pBMSP-3 Endoquitinasa de Arabidopsis thaliana (nucleótidos 338-399 de Nº Registro del GenBank AB023460 con una “A” adicional añadida al extremo 3’ de la secuencia) Interferón no optimizado (nucleótidos 580-1077 de Nº Registro del Gen-Bank J00207)
- IFN05
- pBMSP-3 α-Amilasa de arroz modificada * (que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el Nº ID SEC:7) Interferón no optimizado (nucleótidos 580-1077 de Nº Registro del Gen-Bank J00207)
- IFN07
- pBMSP-3 α-Amilasa de arroz silvestre (nucleótidos 34-126 de Nº Registro del GenBank M24286, que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en el Nº ID SEC:6) Interferón no optimizado (nucleótidos 580-1077 de Nº Registro del Gen-Bank J00207)
- IFN08
- pBMSP-3 α-Amilasa de arroz silvestre optimizada (Nº ID SEC:3) Interferón no optimizado (nucleótidos 580-1077 de Nº Registro del Gen-Bank J00207)
- IFN09
- pBMSP-3 α-Amilasa de arroz silvestre optimizada (Nº ID SEC:3) Interferón optimizado (Nº ID SEC:2)
- IFN10
- pBMSP-3 Ninguno Interferón optimizado (Nº ID SEC:2)
- IFN11
- pBMSP-1 α-Amilasa de arroz silvestre optimizada (Nº ID SEC:3) Interferón optimizado (Nº ID SEC:2)
- IFN12
- pBMSP-1 Ninguno Interferón optimizado (Nº ID SEC:2)
- *La secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal de α-amilasa de arroz modificado corresponde a los nucleótidos 34-126 de Nº de Registro del GenBank M24286, excepto que los nucleótidos 97-102 se han cambiado de “CTTGGC” a “ATCGTC.”
Transformación de Lenteja de Agua
Frondas de lenteja de agua o cultivos de nódulos de lenteja de agua (derivados de cepa 8627 de Lemna minor en estos ejemplos) se transforman con los constructos de expresión descritos anteriormente usando métodos de transformación mediados por agrobacterias. Cepa C58Z707 de Agrobacterium tumefaciens, una cepa C58 de amplio espectro de huéspedes desarmada (Hepburn et ál. (1985) J. Gen. Microbiol. 131:2961-2969), se usa para la transformación en estos ejemplos. Los constructos de expresión descritos anteriormente se movilizan hacia el interior de A. tumefaciens mediante electroporación, o mediante un procedimiento de apareamiento triparental usando E. coli MM294 que aloja el plásmido de movilización pRK2013 (Hoekema et ál. (1983) Nature 303: 179-180; Ditta et ál. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7350). Cepas C58Z707 que comprenden los constructos de expresión descritos anteriormente se dispusieron en estrías sobre medio mínimo AB (Chilton et ál., (1974) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71: 3672 -3676) o en medio YEB (1 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de extracto de ternera, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarosa, 0,5 g/l de MgSO4) que contiene estreptomicina en 500 mg/l, espectinomicina en 50 mg/l y sulfato de kanamicina en 50 mg/l y se dejaron crecer durante la noche a 28° C.
En estos ejemplos, cepa 8627 de Lemna minor se usa para la transformación, aunque puede usarse cualquier cepa de Lemna. Las frondas se desarrollan sobre medio de Schenk y Hildebrandt líquido (Schenk y Hildebrandt (1972) Can. J. Bot. 50: 199) que contiene 1% de sacarosa y ácido indolacético 10 µM a 23°C bajo un fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad con una intensidad luminosa de aproximadamente 40 µM/m2·s. Para la inoculación, frondas individuales se separan de los agregados y se hacen flotar en medio de inoculación durante aproximadamente 2 a 20 minutos. El medio de inoculación es medio de Schenk y Hildebrandt (pH 5,6) suplementado con manitol 0,6 M manitol y acetosiringona 100 µM, con la cepa de Agrobacterium tumefaciens apropiada que comprende el constructo de expresión presente a una concentración de aproximadamente 1 X 109 células/ml. Estas frondas se transfieren a continuación a medio de Schenk y Hildebrandt (pH 5,6) que contiene 1% de sacarosa, 0,9% de agar y 20 mg/l de acetosiringona y se cocultivan durante 3 ó 4 días en la oscuridad a 23°C.
Después del cocultivo, las frondas se transfieren para recuperación a medio de Schenk y Hildebrandt o medio de Murashige y Skoog (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473) suplementado con 200 µg/ml de sulfato de kanamicina. Las frondas se descontaminan de agrobacterias infecciosas transfiriendo el tejido infectado a medio reciente con antibiótico cada 2-4 días. Las frondas se incuban sobre este medio durante aproximadamente cuatro semanas bajo condiciones de baja luminosidad (1-5 µM/m2·s).
Cultivos de nódulos de lenteja de agua para transformación se producen como sigue. Se separan frondas de lenteja de agua, las raíces se cortan con un escalpelo estéril y las frondas se colocan, con la cara ventral hacia abajo, sobre medio de Murashige y Skoog (número de catálogo M-5519; Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO), pH 5,6, suplementado con ácido 2,4-diclorofenoxiacético 5 µM, 1-fenil3-(1,2,3-tiadiazol-5-il)urea (tidiazuron) (Sigma P6186) 0,5 µM, sacarosa al 3%, Difco Bacto-agar (Fisher Scientific) al 0,4% y Gelrite (Sigma) al 0,15%. Las frondas se desarrollan durante 5-6 semanas. En este momento, aparecen los nódulos (pequeñas masas amarillentas de células), generalmente desde la parte central de la cara ventral. Este tejido nodular se separa de la fronda madre y se cultiva en medio de Murashige y Skoog suplementado con sacarosa al 3%, Difco Bacto-agar al 0,4%, Gelrite al 0,15%, ácido 2,4-diclorofenoxiacético 1 µM y benciladenina 2 µM.
Los cultivos de nódulos de lenteja de agua se transforman como sigue. La cepa de Agrobacterium tumefaciens apropiada se desarrolla sobre agar de dextrosa de patata o agar YEB con 50 mg/l de kanamicina y acetosiringona 100 µM, y se resuspenden en medio de Murashige y Skoog suplementado con manitol 0,6 M y acetosiringona 100 µM. El tejido del cultivo de nódulos se inocula sumergiendo en la solución de bacterias resuspendidas durante 1-2 minutos, se aplica papel secante para retirar el fluido en exceso y se dispone en forma de placa sobre medio de cocultivo que consisten en medio de Murashige y Skoog suplementado con auxina y citoquinina optimizada para promover el crecimiento de nódulos y acetosiringona 100 µM.
Para la selección, el tejido del cultivo de nódulos se transfiere a medio de regeneración, medio de Murashige y Skoog con sacarosa al 3%, 2,4diclorofenoxiacetato 1 µM, benciladenina 2 µM, Difco Bacto-Agar al 0,4%, Gelrite al 0,15%, 500 mg/l de cefotaxime y 200 mg/l de sulfato de kanamicina y se cultiva durante aproximadamente cuatro semanas bajo luz continua (20-40 µM/m2·s). El tejido nodular se transfiere cada 7 días a medio de cultivo reciente. La selección se completa cuando el tejido nodular muestra crecimiento vigoroso sobre el agente de selección. En algunos ejemplos, los cultivos de nódulos de lenteja de agua transformados se transfieren directamente a medio de regeneración para selección, en lugar de someterse a selección en medio de cocultivo.
Para la regeneración de lenteja de agua transformada, el cultivo de nódulos seleccionado se transfiere a medio de regeneración (0,5 X medio de Schenk y Hildebrandt suplementado con sacarosa al 1% y 200 mg/l de kanamicina) para organizar y producir plantas. El cultivo de nódulos se incuba sobre medio de regeneración bajo iluminación completa durante aproximadamente 3 semanas, hasta que aparecen las frondas. Las frondas totalmente organizadas se transfieren a medio de Schenk y Hildebrandt líquido con sacarosa al 1-3% y se incuban bajo iluminación completa para una proliferación clonal adicional. Detección de Interferón Biológicamente Activo Producido a partir de Frondas de Lenteja de Agua o Cultivos de Nódulos de Lenteja de Agua
El interferón biológicamente activo se detecta mediante diversos ensayos, incluyendo un inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida como el descrito en Staehlin et ál. (1981) Methods Enzymol. 79:589-594 y Kelder et ál. (1986) Methods Enzymol. 119: 582-587, incorporados en la presente memoria mediante referencia, y un ensayo de inhibición del efecto citopático (descrito en Tovey et ál. (1978) Nature 276:270-272). El interferón secretado se recoge del medio de cultivo de lenteja de agua, mientras que el interferón no secretado se recoge de plantas de lenteja de agua
o tejido nodular de lenteja de agua triturados o sometidos a lisis.
El inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida para interferón se realiza usando un estuche de PBL Laboratories (New Brunswick, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, el interferón es capturado por un anticuerpo unido a los pocillos de la placa de microvaloración. Un segundo anticuerpo se usa a continuación para revelar el anticuerpo unido. Un anti-anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) se usa a continuación para marcar el interferón. La tetrametilbencidina (TMB) inicia un cambio de color catalizado por peroxidasa, de modo que el nivel de interferón pueda observarse y compararse con un patrón. Un anticuerpo monoclonal específico para interferón α-2b (Nº Cat. 11105, PBL Laboratories) se usa para este ensayo en los presentes ejemplos.
El ensayo de inhibición del efecto citopático se realiza de acuerdo con los métodos de Tovey et ál. (1978) Nature 276: 270-272. Brevemente, diluciones dobles en serie de la preparación que ha de ensayarse se diluyen en una placa de microvaloración de 96 pocillos (Falcon Inc) en un volumen de 100 µl de medio esencial mínimo de Eagle (Life Technologies Inc) suplementado con suero de ternero fetal al 2% (Life Technologies Inc) en paralelo con diluciones dobles en serie de la preparación de referencia internacional de IFN alfa humano de los US National Institutes of Health (G-002-901-527). Veinte mil células amnióticas humanas (línea WISH) se añaden a continuación a cada pocillo de la placa de microvaloración en un volumen de 100 µl de medio con suero de ternero fetal al 2%. Las células se incuban durante la noche en una atmósfera de CO2 al 5% en aire a 37°C, el medio se retira y se reemplaza por 200 µl de medio con suero de ternero fetal al 2% que contiene virus de estomatitis vesicular con una multiplicidad de infección de 0,1. Las células se incuban adicionalmente durante la noche en una atmósfera de CO2 al 5% en aire a 37°C y el efecto citopático debido a la replicación del virus se evalúa a continuación bajo un microscopio óptico. Las valoraciones de interferón se expresan como la inversa de la dilución de IFN que daba 50% de protección contra los efectos citopáticos del virus. Las valoraciones de interferón se expresan como unidades de referencia internacionales mediante referencia a la valoración de la preparación de referencia.
Los siguientes ejemplos demuestran la expresión de interferón biológicamente activo en lenteja de agua. Ejemplo 1
Se realizó un estudio para determinar niveles de IFN en cultivo en medio y tejido en diversos puntos temporales en un cultivo discontinuo. Un grupo de 20-30 botellas de cultivo de 5,2 l (175 onzas) se inoculó el Día 0 con 20 frondas de una línea que se identificaba previamente que expresaba niveles detectables de interferón α-2b humano (IFN). Los cultivos se hicieron crecer bajo condiciones tamponadas autotróficas con alta iluminación continua proporcionada por bombillas fluorescentes de crecimiento para plantas/acuarios. En cada punto temporal -días 5, 7, 13, 15 y 18 -se midieron el peso fresco y el volumen medio para cuatro cultivos. De cada cultivo se obtuvieron muestras de medio y tejido y se añadió un cóctel inhibidor de proteasa vegetal. Las muestras de tejido se trituraron y se centrifugaron en frío. El sobrenadante se recogió. Los extractos de medios y tejidos se almacenaron a -70ºC hasta que se recogían todas las muestras. Los niveles de IFN en extractos de medios y tejidos se determinaron el mismo día usando el inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida descrito anteriormente. El IFN del cultivo total en medio y tejido se calculó multiplicando las concentraciones de IFN medidas y el volumen de medio y el peso fresco para el cultivo, respectivamente. La Figura 1 muestra los niveles de IFN relativos los días 7, 13, 15 y 18 en comparación con el día 5. El último punto temporal representa el valor promedio para tres cultivos en lugar de cuatro debido a la pérdida de un cultivo.
Ejemplo 2
Se realizó un estudio para determinar niveles de IFN de cultivo en medio y tejido en diversos puntos temporales en un cultivo discontinuo. Un grupo de 24-30 botellas de 5,2 l (175 onzas) se inoculó el Día 0 con 20 frondas de la misma línea que en el Ejemplo 1. Los cultivos se hicieron crecer bajo condiciones no tamponadas autotróficas con alta iluminación continua proporcionada por bombillas fluorescentes de crecimiento para plantas/acuarios. En cada punto temporal -días 7, 10, 12, 14, 17 y 19 -se midieron el peso fresco y el volumen medio para cuatro cultivos. De cada cultivo se obtuvieron muestras de medio y tejido y se añadió un cóctel inhibidor de proteasa vegetal. Las muestras de tejido se trituraron y se centrifugaron en frío. El sobrenadante se recogió. Los extractos de medios y tejidos se almacenaron a -70ºC hasta que se recogían todas las muestras. Los niveles de IFN en extractos de medios y tejidos se determinaron el mismo día usando el inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida descrito anteriormente. El IFN del cultivo total en medio y tejido se calculó multiplicando las concentraciones de IFN medidas y el volumen de medio y el peso fresco para el cultivo, respectivamente. La Figura 2 muestra los niveles de IFN relativos los días 14, 17 y 19 en comparación con el día 12. Los niveles medios de IFN el día 7 y el día 10 estaban por debajo del intervalo del protocolo de intervalo extendido para el inmunoensayo. Ejemplo 3
Se produjeron líneas de lenteja de agua transformadas con los constructos de expresión listados en la Tabla 1 usando los métodos descritos anteriormente. Estas líneas de lenteja de agua transformadas se hicieron crecer durante 14 días bajo condiciones autotróficas. Albúmina de suero bovino en una concentración de 0,2 mg/ml se incluyó en el medio de crecimiento. El día 14, se prepararon extractos de medio y tejido como se describe en el Ejemplo 1, y los niveles de interferón en estos extractos se determinaron usando el inmunoensayo tipo sándwich en fase sólida que se describe anteriormente. La Tabla 2 da el número de líneas clonales de lenteja de agua ensayadas y la concentración de interferón media en el medio para cada constructo de
5 expresión. La Tabla 3 muestra los niveles de interferón dentro del tejido de lenteja de agua para las líneas de lenteja de agua transformadas con los constructos de expresión de interferón que no contenían un péptido de señal (IFN01, IFN10 e IFN12). Se muestran tanto el nivel de interferón medio para todas las líneas clonales ensayadas como el nivel de interferón para la línea de expresión máxima.
10
Tabla 2
- Constructo de expresión
- Nº de Líneas Clonales Probadas Concentración de Interferón media (ng/ml)
- IFN01
- 41 0
- IFN02
- 75 2,3
- IFN03
- 41 0,18
- IFN05
- 44 2,5
- IFN07
- 41 1,5
- IFN08
- 41 1,4
- IFN09
- 41 30,3
- IFN10
- 41 0
- IFN11
- 39 9,9
- IFN12
- 41 0
Tabla 3
- Valor Medio
- Expresador Máximo
- Constructo de IFN
- % de proteína soluble total % de proteína soluble total
- IFN01
- 0,00003 0,0001
- IFN10
- 0,00064 0,0074
- IFN12
- 0,00014 0,001
La actividad biológica del interferón producido por estas líneas de lenteja de agua transformadas se ensayó mediante el ensayo de inhibición del efecto citopático descrito anteriormente. La Tabla 4 da los resultados para la línea de expresión máxima para cada constructo. La actividad de interferón se muestra para el medio para aquellos constructos que contienen un péptido de señal y el tejido para aquellos constructos que carecen de un péptido de señal.
Tabla 4
- Expresador Máximo
- Constructo de IFN
- Material originario UI/ml (Medio) UI/mg de proteína total (tejido)
- IFN01
- Tejido 40
- IFN02
- Medio 16.000
- IFN03
- Medio 320
- IFN05
- Medio 6.400
- IFN07
- Medio 6.000
- IFN08
- Medio 3.200
- IFN09
- Medio 200.000
- IFN10
- Tejido 19.300
- IFN11
- Medio 30.000
- IFN12
- Tejido 150
5
Las siguientes características pueden apuntarse para los datos de este ejemplo: (1) La secreción de interferón se detectó solo para aquellas líneas de lenteja de agua transformadas con constructos de expresión que contienen un péptido de señal. Compárese, por ejemplo, la concentración de interferón en medio para IFN02,
10 IFN03, IFN05, IFN07, IFN08, IFN09 e IFN011 con la de IFN01, IFN10 e IFN12. (2) La secreción de interferón se detectó para todos los constructos de expresión que contenían un péptido de señal, produciendo la secuencia de señal de interferón humano natural el nivel más alto de interferón secretado. Compárense, por ejemplo, los niveles de interferón producidos por IFN02 con aquellos producidos por IFN03 e
15 IFN05. (3) El uso de codones preferidos para lenteja de agua conduce a una expresión de interferón aumentada. Compárense, por ejemplo, los niveles de interferón producidos por IFN09 con los de IFN05. (4) Se alcanzaron niveles de expresión superiores mediante la optimización de codones de más de solamente el péptido de señal. Compárese, por ejemplo, IFN08 con IFN09. (5) Incluir la secuencia intrónica
20 de alcohol deshidrogenasa de maíz en el constructo de expresión daba como resultado niveles superiores de expresión de interferón. Compárense, por ejemplo, IFN09 con IFN11 e IFN10 con IFN12. (6) No se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de interferón expresados a partir del constructo que contiene el péptido de señal de α-amilasa modificado (IFN05) en comparación con el que contiene el péptido de señal de alfa-amilasa silvestre (IFN07). LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Biolex, Inc. Stomp, Anne-Marie Dickey, Lynn Gasdaska, John
<120> Expresión de Polipéptidos Biológicamente Activos en Lenteja de Agua
<130> 40989/237187
<150> US 60/293,330
<151> 2001-05-23
<150> US 60/221,705
<151> 2000-07-31
<160> 8
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 554
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 1
<210> 2
<211> 498
<212> DNA
5 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Secuencia de nucleótidos optimizada de codones de lenteja de agua que codi
fica interferón alfa-2b humano 10
<221> CDS
<222> (1) ... (498)
<400> 2
<210> 3
<211> 96
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 4
<210> 5
<211> 165
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 6
<210> 7
<211> 31
5 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Péptido de señal de alfa-amilasa de arroz modificado 10
<400> 7
<210> 8
<211> 21 15 <212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 8
Claims (17)
- REIVINDICACIONES1. Un método para producir polipéptido recombinante biológicamente activo en un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, que comprende las etapas de:
- (a)
- cultivar dentro de un medio de cultivo para lentejas de agua un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o dicho cultivo de nódulos de lenteja de agua se transforma establemente para expresar dicho polipéptido recombinante biológicamente activo, y en donde dicho polipéptido recombinante biológicamente activo se expresa a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codificadora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; y
- (b)
- recoger dicho polipéptido recombinante del medio de cultivo para lentejas
de agua; en el que dicha secuencia de péptido de señal se selecciona de:- (a)
- el péptido de señal de interferón α-2b humano;
- (b)
- el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana;
- (c)
- el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y
- (d)
- el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.
-
- 2.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido recombinante es interferón α-2b, hormona del crecimiento o un anticuerpo monoclonal.
-
- 3.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos un atributo seleccionado de:
- (a)
- codones preferidos para lenteja de agua en la secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante;
- (b)
- codones preferidos para lenteja de agua en la secuencia codificadora para dicho péptido de señal;
- (c)
- un codón de inicio de la traducción que está flanqueado por una secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción preferida para plantas;
- (d)
- una secuencia de nucleótidos conectada operativamente que comprende un intrón vegetal que está insertado aguas arriba de la secuencia codificadora; y
- (e)
- una secuencia líder 5’ conectada operativamente.
-
- 4.
- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dichos codones preferidos para lenteja de agua son codones preferidos para Lemna gibba o codones preferidos para Lemna minor.
-
- 5.
- El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que al menos una secuencia codificadora seleccionada de la secuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y la secuencia codificadora para dicho péptido de señal comprende 70-100% de codones preferidos para Lemna gibba o codones preferidos para Lemna minor.
-
- 6.
- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho intrón vegetal tiene la secuencia indicada en el Nº ID SEC: 1.
-
- 7.
- El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicha secuencia de nucleótidos de contexto de inicio de la traducción preferida para plantas consiste en la secuencia de nucleótidos “ACC” o “ACA”, en el que dicho contexto está situado inmediatamente adyacente al extremo 5’ del codón de inicio de la traducción.
-
- 8.
- El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho interferón α2b tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC: 5.
-
- 9.
- El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho interferón α2b es interferón α-2b humano.
-
- 10.
- El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho interferón α-2b tiene la secuencia de aminoácidos indicada en el Nº ID SEC: 4 o el Nº ID SEC:
- 5.
-
- 11.
- El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el péptido de señal es el péptido de señal de α-amilasa de arroz que tiene la secuencia indicada en el Nº ID SEC: 3.
-
- 12.
- Un cultivo de plantas de lenteja de agua o un cultivo de nódulos de lenteja de agua, transformado establemente para expresar un polipéptido recombinante biológicamente activo a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende una se
cuencia codificadora para dicho polipéptido recombinante y una secuencia codifica-dora conectada operativamente para un péptido de señal que dirige la secreción del polipéptido recombinante; en el que dicha secuencia del péptido de señal se selecciona de:- (a)
- el péptido de señal de interferón α-2b humano;
- (b)
- el péptido de señal de quitinasa de Arabidopsis thaliana;
- (c)
- el péptido de señal de α-amilasa de arroz; y
- (d)
- el péptido de α-amilasa de arroz modificado indicado en el Nº ID SEC: 7.
-
- 13.
- El cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o cultivo de nódulos de lenteja de agua se selecciona del grupo que consiste en el género Spirodela, el género Wolffia, el género Wolfiella y el género Lemna.
-
- 14.
- El cultivo de plantas de lenteja de agua o el cultivo de nódulos de lenteja de agua transformado establemente de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho cultivo de plantas de lenteja de agua o cultivo de nódulos de lenteja de agua se selecciona de Lemna minor, Lemna miniscula, Lemna aequinoctialis y Lemna gibba.
-
- 15.
- Una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b indicada en el Nº ID SEC: 2 conectada operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal dada en el Nº ID SEC: 3.
-
- 16.
- La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende adicionalmente la secuencia de nucleótidos que comprende el intrón dada en el Nº ID SEC: 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos que comprende el intrón, dicha secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal y dicha secuencia de nucleótidos que codifica interferón α-2b están conectadas operativamente.
Siguen 2 hojas de dibujos.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22170500P | 2000-07-31 | 2000-07-31 | |
| US221705P | 2000-07-31 | ||
| US293330P | 2001-05-23 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2351314T3 true ES2351314T3 (es) | 2011-02-03 |
Family
ID=37029862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01967946T Expired - Lifetime ES2351314T3 (es) | 2000-07-31 | 2001-07-26 | Expresión de polipéptidos biológicamente activos en lenteja de agua. |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1840667A (es) |
| ES (1) | ES2351314T3 (es) |
-
2001
- 2001-07-26 ES ES01967946T patent/ES2351314T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-26 CN CN 200610059681 patent/CN1840667A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1840667A (zh) | 2006-10-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2417415C (en) | Expression of biologically active polypeptides in duckweed | |
| AU2001288226A1 (en) | Expression of biologically active polypeptides in duckweed | |
| EP1037523B1 (en) | Genetically engineered duckweed | |
| AU2004280228B2 (en) | Expression of biologically active polypeptides in duckweed | |
| KR102444024B1 (ko) | 아프리카 돼지열병의 진단을 위한 항원 생산용 재조합 벡터 및 이의 용도 | |
| US8022270B2 (en) | Expression of biologically active polypeptides in duckweed | |
| ES2398142T3 (es) | Elementos de control de la expresión de la familia de Lemnaceae | |
| CN1938427A (zh) | 纤溶酶原和微纤溶酶原在浮萍中的表达 | |
| ES2351314T3 (es) | Expresión de polipéptidos biológicamente activos en lenteja de agua. | |
| US7959910B2 (en) | C-terminally truncated interferon alpha variants | |
| HK1055317B (en) | Expression of biologically active polypeptides in duckweed | |
| AU2007231691A1 (en) | Expression of biologically active polypeptides in duckweed | |
| HK1031297B (en) | Genetically engineered duckweed |