ES2315011T3 - Polipeptidos de semaforina. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido de semaforina truncado que está compuesto por la secuencia de los aminoácidos 52 a 543 de la SEQ ID NO:2.

Description

Polipéptidos de semaforina.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos de semaforina, ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos de semaforina, procedimientos para producir polipéptidos recombinantes de semaforina, composiciones farmacéuticas que contienen estos polipéptidos y procedimientos para tratar trastornos asociados con la actividad semaforina.

Antecedentes de la invención

La familia de genes de semaforina incluye un gran número de moléculas que codifican glucoproteínas transmembrana y secretadas relacionadas, conocidas por ser reguladores neurológicos. Generalmente, las semaforinas tienen sus dominios extracelulares bien conservados que, típicamente, tienen una longitud de aproximadamente 500 aminoácidos. Se han observado proteínas de la familia de semaforinas en tejido neuronal y no neuronal, y se ha estudiado ampliamente su función de guía del cono de crecimiento neuronal. Por ejemplo, las semaforinas secretadas conocidas como colapsina-1 y la semaforina II de Drosophila están selectivamente implicadas en el efecto repulsivo a la guía del cono de crecimiento axonal durante el desarrollo. Las moscas que presentan mutaciones en los genes de semaforina II que reduce su función, muestran rasgos de comportamiento anómalo.

Se ha identificado otra semaforina en varias cepas de poxvirus. Esta semaforina se encuentra en el virus Vaccinia (cepa de Copenhague) y en el virus Ectromelia, y se codifica en un marco de lectura abierta (ORF) conocido como A39R. La proteína codificada por A39R no tiene dominio transmembrana ni posibilidad de unión a la membrana, y se sabe que es una proteína secretada. La ORF del virus de la viruela también contiene secuencias que comparten homología con la ORF A39R del virus Vaccinia en nucleótidos y en aminoácidos. Se ha encontrado otra semaforina vírica, AHV Sema, en el herpesvirus Alcephaline (AHV, Ensser y Fleckenstein, J. Gen. Virol. 76:1063, 1995).

Se han identificado genes que codifican semaforinas de mamíferos (humano, rata y ratón), en función de su similitud con las semaforinas de insectos. Las semaforinas de tipo L se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0892047. Se ha demostrado que la semaforina denominada H-SemaL tiene un dominio estructural inesperado y actividad inmunomoduladora. Los estudios funcionales de estas semaforinas sugieren que las neuronas embrionarias y adultas requieren una semaforina para establecer conexiones funcionales. Significativamente, el rápido tiempo de respuesta de los cultivos del cono de crecimiento a semaforinas apropiadas, sugiere que la señalización de la semaforina implica un mecanismo de transducción de señal mediado por receptor. Los ligandos semaforina que se secretan al medio extracelular inducen una señal a través del receptor expresado en las células de forma localizada y sistémica. Para estudiar más en detalle la naturaleza de los procesos celulares regulados mediante esta señalización local y sistémica, podría ser beneficioso identificar receptores y ligandos adicionales de semaforina. Además, debido a que las semaforinas codificadas por virus se producen en células infectadas y se presentan en virus líticos (poxvirus) y en virus que no son conocidos como neurotróficos (AHV), es poco probable que su función principal sea modificar las respuestas neurológicas. Es más probable que las semaforinas codificadas por virus trabajen modificando la respuesta inmunológica del hospedador infectado y es probable que las semaforinas de mamíferos codificadas por virus modifiquen la respuesta inmunológica. A la vista de la sugerencia de que las semaforinas víricas pueden actuar sobre el sistema inmune como inmunoreguladores naturales, podría ser beneficioso identificar semaforinas que puedan ser agentes terapéuticos mejorando o disminuyendo la respuesta inmune.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos de semaforina, ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos de semaforinas y procedimientos para tratar los trastornos asociados con la actividad semaforina como se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

El polipéptido de semaforina nativo descrito en este documento se descubrió usando una búsqueda en una base de datos y técnicas comparativas que dieron lugar a la identificación de al menos una EST (etiqueta de secuencia expresada, por sus siglas en inglés) que tenía cierta homología con las semaforinas víricas. Como se describe en el Ejemplo 1, se usaron técnicas de PCR para identificar y clonar el homólogo de semaforina vírico completo. La semaforina humana se encuentra en placenta, testículos, ovario, bazo, células dendríticas y células B. Los polipéptidos de semaforina se unen al receptor de semaforina, denominado VESPR (descrito en la solicitud pendiente de tramitación junto con esta S/N 08/958598. La evidencia sugiere que la interacción entre las semaforinas y sus receptores se asocia con la supresión inmune de las células dendríticas maduras. Por esta razón, las semaforinas se denominan DCSema.

El Ejemplo 1 describe la identificación de una DCSema nativa. La secuencia de aminoácidos de la DCSema nativa identificada se describe en la SEQ ID NO: 2 y el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos se describe en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos presentada en la SEQ ID NO: 2 es un polipéptido soluble secretado, pero puede encontrarse adicionalmente como proteína unida a membrana.

La expresión "biológicamente activa" se refiere a polipéptidos de semaforina, lo que significa que el polipéptido de semaforina es capaz de unirse a al menos un receptor de semaforina. Los ensayos adecuados para determinar la unión de DCSema se describen a continuación y pueden incluir análisis por citometría de flujo y pruebas de unión convencionales en porta.

"Aislado" significa que un polipéptido DCSema está libre de asociación con otras proteínas o polipéptidos, por ejemplo, como un producto de purificación de un cultivo de células hospedadoras recombinantes o como un extracto purificado.

El ejemplo 3 describe la construcción de una nueva proteína de fusión semaforina vírica/Fc (DCSema/Fc) que puede utilizarse para estudiar las características biológicas de DCSema y la distribución de su receptor. Pueden sustituirse otras regiones Fc del anticuerpo por la región Fc de la IgG1 humana descrita en el Ejemplo 3. Las regiones Fc adecuadas son aquellas que pueden unirse con una alta afinidad a proteína A o a proteína G, e incluyen la región Fc de la IgG1 humana o fragmentos de la región Fc de la IgG1 humana o murina, por ejemplo, fragmentos que comprenden al menos la región bisagra de modo que se formarán enlaces disulfuro intercatenarios. La proteína de fusión vírica DCSema/Fc ofrece la ventaja de que se purifica fácilmente. Además, se forman enlaces disulfuro entre las regiones Fc de dos cadenas proteicas de fusión independientes, dando lugar a dímeros.

Los polipéptidos DCSema solubles de la presente invención pueden aislarse e identificarse separando células intactas que expresan la proteína deseada a partir del medio de cultivo en el que las células crecen y, a continuación, comprobar la presencia de la proteína deseada en el medio (sobrenadante). La separación puede realizarse usando técnicas de separación convencionales que incluyen la centrifugación. La presencia de polipéptido DCSema en el medio indica que las células secretan la proteína en su forma soluble prevista. Debido a que los polipéptidos DCSema de la presente invención se secretan como polipéptidos solubles poseen muchas ventajas sobre las proteínas de unión a la membrana. La purificación de las proteínas a partir de las células hospedadoras recombinantes es factible, puesto que las proteínas solubles se secretan a partir de las células. Además, generalmente las proteínas solubles son más adecuadas para la administración intravenosa.

Las proteínas DCSema truncadas están constituidas por la secuencia de los aminoácidos 52 a 543 de la SEQ ID NO: 2 que incluye el "dominio semaforina" que es parte de un sitio de unión activo. Cuando inicialmente se expresaban en una célula hospedadora, los polipéptidos DCSema pueden comprender adicionalmente uno de los péptidos señal heterólogos descritos a continuación que sea funcional dentro de las células hospedadoras empleadas. Alternativamente, la proteína puede comprender el péptido señal nativo.

Los polipéptidos DCSema truncados pueden prepararse mediante cualquiera de las diversas técnicas convencionales. Puede sintetizarse químicamente una secuencia de ADN deseada usando técnicas conocidas per se. Los fragmentos de ADN también pueden obtenerse mediante digestión con endonucleasas de restricción de una secuencia de ADN de longitud completa clonada y aislarse mediante electroforesis en geles de agarosa. Pueden emplearse enlazadores que contengan sitios de escisión para endonucleasas de restricción para insertar el fragmento de ADN deseado en un vector de expresión, o el fragmento puede digerirse en sitios de escisión presentes de forma natural en el mismo. El bien conocido procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa también puede emplearse para amplificar una secuencia de ADN que codifica un fragmento proteico deseado. Puede emplearse una alternativa adicional, conocida como técnicas de mutagénesis, para insertar un codon de terminación en un punto deseado, por ejemplo, inmediatamente después del extremo 3' del codon del último aminoácido del dominio de unión.

Los polipéptidos DCSema nativos pueden modificarse para crear derivados de DCSema formando conjugados covalentes o por agregación con otros restos químicos, tales como grupos glucosilo, lípidos, fosfato, grupos acetilo y similares. Los derivados covalentes de los polipéptidos pueden prepararse uniendo los restos químicos a grupos funcionales de las cadenas laterales de los aminoácidos de DCSema o en los extremos N-terminal o C-terminal de un polipéptido DCSema.

La invención además incluye polipéptidos DCSema con o sin patrón de glucosilación nativo asociado. El polipéptido DCSema expresado en sistemas de expresión de levaduras o de mamíferos (por ejemplo, células COS-7) puede ser similar o significativamente diferente a un polipéptido DCSema nativo en peso molecular y en patrón de glucosilación, dependiendo de la elección del sistema de expresión. La expresión de polipéptidos DCSema en los sistemas de expresión bacterianos, como E. Coli, proporciona moléculas no glucosiladas.

La actividad biológica de los polipéptidos DCSema de la presente invención puede determinarse, por ejemplo, mediante competición de unión al dominio de unión de los receptores de semaforina, por ejemplo, ensayos competitivos de unión o de unión al dominio de unión del receptor de semaforina.

Un tipo de ensayo competitivo de unión para un polipéptido DCSema de la presente invención utiliza un DCSema marcado radiactivamente y células intactas que expresan el receptor de semaforina. En lugar de células intactas, se podrían sustituir por proteínas de fusión del receptor de semaforina:Fc solubles unidas a una fase sólida a través de la interacción con proteína A, proteína G o un anticuerpo frente al receptor de semaforina o a porciones Fc de la molécula, con la región Fc de la proteína de fusión. Pueden realizarse ensayos competitivos de unión siguiendo la metodología convencional. En una realización, puede hacerse que un receptor de semaforina soluble compita con un receptor inmovilizado por la unión a un ligando de semaforina soluble. Por ejemplo, puede oponerse un ligando de semaforina soluble marcado radiactivamente al VESPR soluble en un ensayo de la actividad de unión frente a un receptor de semaforina unido a la superficie. Pueden obtenerse resultados cualitativos mediante ensayos competitivos de unión en placas autorradiográficas o pueden utilizarse las gráficas de Scatchard para obtener resultados cuantitativos.

Alternativamente, las proteínas que se unen a semaforina, como VESPR o los anticuerpos anti-semaforina, pueden unirse a una fase sólida como una matriz para cromatografía en columna o un sustrato adecuado similar para identificar, separar o purificar células que expresen semaforinas en su superficie. La unión de una proteína que se une a semaforina a una fase sólida poniéndola en contacto con la superficie puede conseguirse por cualquier procedimiento, por ejemplo, mediante la construcción de una proteína de fusión VESPR:Fc y la unión de ésta a la fase sólida a través de la interacción de proteína A o de proteína G. En la técnica son bien conocidos varios sistemas distintos de fijación de proteínas a una fase sólida y son adecuados para uso en la presente invención. Por ejemplo, pueden recubrirse microesferas magnéticas con VESPR y mantenerse en el recipiente de incubación mediante un campo magnético. Las suspensiones de mezclas de células que contienen células que expresan semaforinas se ponen en contacto con la fase sólida que tiene polipéptidos VESPR en ella. Las células que expresan semaforina en su superficie se unen a VESPR fijada y, a continuación, se eliminan las células no unidas. Este procedimiento de unión por afinidad es útil para purificar, analizar o separar estas células que expresan semaforina de la solución. Los procedimientos de liberación de las células seleccionadas positivamente a partir de la fase sólida son bien conocidos en la técnica y comprenden, por ejemplo, el uso de enzimas. Preferiblemente, estas enzimas no son tóxicas ni perjudiciales para las células y, preferiblemente, se dirigen a escindir el patrón de unión de la superficie celular. En el caso de interacciones semaforina-VESPR, la enzima podría preferiblemente escindir la semaforina liberando por tanto, la suspensión celular resultante del material "extraño" receptor de semaforina. A continuación, puede usarse la población de células purificadas para repoblar tejidos maduros (adultos).

Alternativamente, las mezclas de células en las que se sospecha hay células que contienen semaforinas, pueden incubarse en primer lugar con un receptor de semaforina biotinilado adecuado, por ejemplo, VESPR. Los periodos de incubación típicamente son al menos de una hora de duración para asegurar que se produce una unión suficiente de la semaforina. La mezcla resultante se pasa después a través de una columna empaquetada con perlas recubiertas de avidina, en la que la alta afinidad de la biotina por avidina proporciona la unión de las células a las perlas. El uso de perlas recubiertas de avidina es conocido en la técnica. Véase Berenson y col., J. Cell. Biochem. 10D:239 (1986). El lavado del material no unido y la liberación de las células unidas se realiza usando procedimientos convencionales.

Como se describe anteriormente, las células que expresan polipéptidos DCSema pueden separarse usando un receptor de semaforina, por ejemplo, VESPR. En un procedimiento alternativo, VESPR, otros receptores de semaforinas adecuados o un dominio extracelular o fragmento del mismo puede conjugarse con un resto detectable como ^{125}I, para detectar células que expresan semaforina. El marcaje radiactivo con ^{125}I puede realizarse mediante cualquiera de las metodologías convencionales que producen una molécula funcional marcada con ^{125}I de actividad específica elevada o un anticuerpo yodado o biotinilado frente al receptor de la semaforina. Puede usarse otro resto detectable, como una enzima que puede catalizar una reacción colorimétrica o fluorométrica, biotina o avidina. Las células en las que se ensaya la expresión de polipéptidos DCSema pueden ponerse en contacto con un receptor marcado adecuado, por ejemplo VESPR. Tras la incubación, se elimina el receptor marcado no unido y se mide la unión usando el resto detectable.

Las características de unión de los polipéptidos DCSema también pueden determinarse usando un receptor de semaforina conjugado (por ejemplo, receptor de ^{125}I-semaforina:Fc) en ensayos de competición similares a los descritos anteriormente. En este caso, sin embargo, las células intactas que expresan el polipéptido DCSema de la presente invención, unidas a un sustrato sólido, se usan para medir el grado al cual una muestra que contiene una posible variante del receptor compite por la unión con un DCSema conjugado.

Otros medios de ensayo de los polipéptidos DCSema de la presente invención incluyen el uso de anticuerpos anti-DCSema, líneas celulares que proliferan en respuesta al polipéptido DCSema o líneas celulares recombinantes que expresan DCSema y proliferan en presencia de un receptor de semaforina adecuado.

Las proteínas DCSema también pueden emplearse para medir la actividad biológica de cualquier receptor de semaforina en términos de su afinidad de unión por su ligando semaforina.

Los polipéptidos DCSema descritos en este documento encuentran su aplicación como reactivos en estudios de "garantía de calidad", por ejemplo, para controlar la fecha de caducidad y la estabilidad de un receptor al cual se une DCSema en condiciones diferentes. Como ilustración, los polipéptidos DCSema de la presente invención pueden emplearse en un estudio de afinidad de unión para medir la actividad biológica de un receptor de semaforina de prueba que se ha conservado a temperaturas diferentes o se ha producido en tipos de células diferentes. La afinidad de unión de la proteína DCSema por el receptor de prueba se compara con la de un receptor convencional o control para detectar cualquier impacto adverso sobre la actividad biológica del receptor de prueba de la semaforina.

Los polipéptidos DCSema descritos en este documento también pueden utilizarse como vehículos para la administración de agentes unidos de este modo a las células que expresan receptores de semaforina a los que se une la semaforina. Como se ha descrito en la solicitud pendiente de tramitación junto con esta S/N 958.598, VESPR, al cual se une una DCSema de la presente invención, se expresa en las células epiteliales pulmonares, estroma, células epiteliales del intestino y células de linfoma. Los polipéptidos DCSema de la presente invención pueden, por tanto, usarse para administrar agentes diagnósticos o terapéuticos a estas células (o a otros tipos de células en las que se encuentra que expresan un receptor de semaforina adecuado en la superficie celular) en procedimientos in vitro o in vivo.

Entre los agentes diagnósticos y terapéuticos que pueden unirse a un polipéptido DCSema de la presente invención se incluyen, pero sin limitaciones, fármacos, toxinas, radionucleidos, cromóforos, enzimas que catalizan una reacción colorimétrica o fluorométrica, y similares, eligiéndose el agente en particular según la aplicación pretendida. Entre los ejemplos de fármacos se incluyen los utilizados para tratar diversas formas de cáncer, por ejemplo, mostazas nitrogenadas, como mostaza nitrogenada de L-fenilanalina o ciclofosfamida, agentes intercalantes como cis-diaminodicloroplatino, antimetabolitos como 5-fluorouracilo, alcaloides de la vinca como vincristina y antibióticos como bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina y derivados de los mismos. Entre las toxinas se encuentran ricina, abrina, toxina diftérica, exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadotas de ribosomas, micotoxinas como tricotecenas y derivados y fragmentos (por ejemplo, cadenas sencillas) de las mismas. Los radionucleidos adecuados para su uso diagnóstico incluyen, pero sin limitación, ^{123}I, ^{131}I, ^{99m}Tc, ^{111}In y ^{76}Br. Entre los radionucleidos adecuados para su uso terapéutico se incluyen, pero sin limitaciones, ^{131}I, ^{211}At, ^{77}Br, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{212}Pb, ^{212}Bi, ^{109}Pd, ^{64}Cu y ^{67}Cu.

Estos agentes pueden unirse a la DCSema de la presente invención mediante cualquier procedimiento convencional adecuado. Los homólogos de semaforina de la presente invención, siendo proteínas, incluyen grupos funcionales en las cadenas laterales de los aminoácidos que pueden reaccionar con grupos funcionales de un agente deseado para formar enlaces covalentes, por ejemplo. Alternativamente, la proteína o agente puede derivatizarse para generar o unirse a un grupo funcional reactivo deseado. La derivatización puede implicar la unión de uno de los reactivos de conjugación bifuncionales disponibles para unir varias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Se conocen varias técnicas para el marcaje radiactivo de proteínas. Los radionucleidos metálicos pueden unirse al receptor usando, por ejemplo, un agente quelante bifuncional adecuado. Por tanto, se preparan conjugados que comprenden moléculas de la presente invención y un agente de diagnóstico o terapéutico adecuado (preferiblemente unido de forma covalente). Los conjugados se administran o, por otro lado, se emplean en una cantidad apropiada para la aplicación en particular.

Otro uso de los polipéptidos DCSema de la presente invención es como herramienta de investigación para estudiar la función que DCSema, junto con los receptores de semaforina a los que se une, puede tener en la regulación del sistema inmune y en la infección viral. Los polipéptidos de la presente invención también pueden emplearse en ensayos in vitro para la detección de receptores a los que se une, por ejemplo VESPR, o las interacciones de los mismos. De forma similar, los polipéptidos DCSema de la presente invención pueden usarse como herramienta de investigación para estudiar la función que el ligando, junto con sus receptores, tiene sobre la regulación inmune.

Además, es sabido que la administración de IL-12 a animales portadores de tumores da lugar a la regresión del tumor y el establecimiento de una respuesta inmune específica del tumor. Por tanto, usando un ligando DCSema que se une a VESPR para potenciar o promover IL-12, puede inducir una respuesta inmune curativa frente a tumores micromestastatizantes agresivos.

VESPR, un receptor de semaforina se une con una pareja de unión para regular por disminución la expresión de moléculas MHC de clase II y CD86, una molécula coestimuladora, en las células dendríticas, cultivadas con GM-CSF e IL-4 (véase la solicitud pendiente de tramitación junto con esta S/N 60/085.497). Por analogía, esto sugiere que la interacción entre DCSema de la presente invención y sus receptores se asocia con la supresión inmune de las células dendríticas maduras. Por tanto, se espera que el uso de ligando DCSema, incluyendo la DCSema de la presente invención en el tratamiento de los trastornos autoinmunes disminuya los síntomas no deseados asociados con el trastorno autoinmune mediante la regulación por disminución de las capacidades de presentación del antígeno de las células dendríticas maduras.

Los polipéptidos DCSema de la invención pueden formularse según procedimientos conocidos usados para preparar composiciones farmacéuticas útiles. Las moléculas de la invención pueden combinarse en mezclas, como el único principio activo o con otros principios activos conocidos, con diluyentes farmacéuticamente adecuados (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (por ejemplo, Timerosal, alcohol de bencilo, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adyuvantes y/o vehículos. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edición 1980, Mack Publishing Co. se describen vehículos adecuados y sus formulaciones. Además, estas composiciones pueden contener el polipéptido DCSema formando complejos con polietilenglicol (PEG), iones metálicos o incorporados en compuestos poliméricos, como ácido poliacético, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc. o incorporado en lisosomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilamelares o multilamelares, fantasmas de eritrocitos o esferoblastos. Estas composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y tasa de aclaramiento in vivo de DCSema. Los polipéptidos DCSema descritos en este documento pueden conjugarse con anticuerpos frente a receptores ligandos o antígenos específicas de tejido, o unirse a ligandos de los receptores específicos de
tejido.

Los polipéptidos DCSema de la presente invención pueden administrarse por vía tópica, parenteral o por inhalación. El termino "parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramuscular, inyección intracisternal o técnicas de perfusión. Típicamente estas composiciones contendrán una cantidad eficaz del polipéptido, sólo o en combinación con una cantidad eficaz de cualquier otro principio activo. Estas dosis y las concentraciones de fármaco deseadas contenidas en las composiciones pueden variar dependiente de muchos factores, incluyendo el uso pretendido, el peso corporal del paciente y la edad, y la vía de administración. La dosis preliminar puede determinarse mediante ensayos con animales y el aumento escalonado de las dosis para su administración a humanos puede realizarse según prácticas aceptadas en la técnica.

Los polipéptidos de la presente invención pueden encontrarse como oligómeros, tales como dímeros o trímeros unidos covalentemente o no. Los oligómeros pueden estar unidos mediante puentes disulfuro formados entre restos de cisteína en moléculas de DCSema diferentes. En una realización de la invención, se crea un dímero mediante la fusión de un DCSema con la región Fc de un anticuerpo (por ejemplo, IgG1) de modo que no interfiera con la unión de la DCSema a un dominio de unión al receptor de semaforina. El polipéptido Fc preferiblemente se fusiona con el extremo C-terminal de una DCSema. La preparación general de proteínas de fusión que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fc) ha sido descrita, por ejemplo, por Ashkenazi y col. (PNAS USA 88:10535, 1991) y Byrn y col. (Nature 344:677, 1990). Se inserta una fusión génica que codifica la proteína de fusión DCSema/Fc en un vector de expresión apropiado. Se permite que las proteínas de fusión DCSema/Fc se ensamblen más como moléculas de anticuerpo, con lo cual los puentes disulfuro intercatenarios formados entre los polipéptidos Fc, producen enlaces divalentes. Si se obtienen proteínas de fusión tanto con la cadena ligera como con la cadena pesada de un anticuerpo, es posible formar un oligómero DCSema con hasta cuatro regiones de semaforina. Alternativamente, pueden unirse dos DCSema con un enlazador peptídico.

Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de los polipéptidos DCSema de esta invención incluyen procariotas, levaduras o células de eucariotas superiores. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su uso en hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y de mamíferos se describen, por ejemplo, en Pouwels y col. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nueva York, (1985). Los sistemas de traducción libres de células también pueden emplearse para producir los polipéptidos de la presente invención usando ARN derivados de las construcciones de ADN descritas en este documento.

Entre los procariotas se incluyen organismos Gram negativos o Gram positivos, por ejemplo, E. coli o Bacilli. Entre las células hospedadoras procariotas adecuadas para la transformación se incluyen, por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y otras especies diversas de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus. En una célula hospedadora procariota, como E. coli, un polipéptido receptor de semaforina puede incluir un resto de metionina en el extremo N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariota. La Met N-terminal puede escindirse del polipéptido DCSema recombinante expresado.

Los polipéptidos DCSema puede expresarse en células hospedadoras de levaduras, preferiblemente del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae). También pueden emplearse otros géneros de levaduras, como Pichia, K. lactis o Kluyveromyces. A menudo, los vectores de levaduras contendrán un origen de secuencia de replicación del plásmido de levaduras 2\mu, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias para poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador seleccionable. Las secuencias promotoras adecuadas en vectores de levaduras incluyen, entre otros, los promotores para la metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess y col., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; y Holland y col., Biochem. 17:4900, 1978), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfata, deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilada, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados para su uso en la expresión en levaduras se describen además en Hitzeman, documento EPA-73.657 o en Fleer y col., Gene, 107:285-195 (1991) y van den Berg y col., Bio/Technology, 8:135-139 (1990). Otra alternativa es el promotor ADH2 represible por glucosa descrito por Russell y col. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) y Beier y col. (Nature 300:724, 1982). Los vectores lanzadera replicables tanto en levaduras como en E. coli pueden construirse mediante la inserción de secuencias de ADN de pBR322 para la selección y replicación en E. coli (gen Amp^{r} y origen de replicación) en los vectores de levadura descritos anteriormente.

La secuencia líder del factor \alpha de levaduras puede emplearse para dirigir la secreción del VESPR o del polipéptido DCSema. La secuencia líder del factor \alpha se inserta a menudo entre la secuencia promotora y la secuencia del gen estructural. Véase, por ejemplo, Kurjan y col., Cell 30:933 (1982); Bitter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; patente US. Nº 4546082 y el documento EP 324.274. Otras secuencias líder adecuadas para facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes de hospedadores de levaduras son conocidas por los expertos en la técnica. Puede modificarse una secuencia líder cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia líder con el gen estructural.

Los expertos en la técnica conocen protocolos de transformación de levaduras. Hinnen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978, describen uno de estos protocolos. El protocolo de Hinnen y col. selecciona transformantes Trp^{+} en un medio selectivo, en el que el medio selectivo está compuesto de una base de nitrógeno de levadura al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, adenina 10 \mug/ml y uracilo 20 \mug/ml.

Las células de levaduras hospedadoras transformadas con los vectores que contienen la secuencia promotora de ADH2 pueden cultivarse para inducir la expresión en un medio "rico". Un ejemplo de medio rico es aquel compuesto por extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y glucosa al 1% suplementado con adenina 80 \mug/ml y uracilo 80 \mug/ml. Las desrepresión del promotor de ADH2 tiene lugar cuando se agota la glucosa del medio.

También podrían emplearse sistemas de cultivo de células hospedadoras de mamíferos o de insectos para expresar los polipéptidos recombinantes de la presente invención. Los sistemas de bacilovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insecto se revisan en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). También pueden emplearse líneas celulares establecidas originales de mamíferos. Entre los ejemplos de líneas celulares hospedadoras de mamíferos adecuados se incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651), (Gluzman y col., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), líneas de células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y células BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV-1/EBNA-1 derivada de la línea celular de riñón de mono verde africano CV1 (ATCC CCL 70) como se describe en McMahan y col. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

Las secuencias de control de la transcripción y de la traducción para vectores de expresión de células hospedadoras de mamíferos pueden escindirse de los genomas virales. Normalmente, las secuencias promotoras y las secuencias potenciadoras usadas derivan de poliomavirus, adenovirus 2, virus del simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma vírico de SV40, por ejemplo, el origen, los promotores temprano y tardío, potenciador, ayuste y sitios de poliadenilación de SV40 pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia génica estructural en una célula hospedadora de mamíferos. Los promotores virales tempranos y tardíos son especialmente útiles ya que ambos son fáciles de obtener a partir de un genoma vírico como un fragmento, que puede contener un origen vírico de replicación (Fiers y col., Nature 273:113, 1978). También pueden usarse fragmentos más pequeños o mayores de SV40, siempre que incluyan la secuencia de aproximadamente 250 pb, que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BglI localizado en el origen de replicación vírico de SV40.

Pueden construirse ejemplos de vectores de expresión para su uso en células hospedadoras de mamíferos como describen Okayama y Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983). Puede construirse un sistema útil para la expresión estable a niveles elevados de ADNc de mamíferos en células epiteliales mamarias murinas C127 sustancialmente como describen Cosman y col. (Mol. Immunol. 23:935, 1986). Un vector de alta expresión útil, PMLSV N1/N4, descrito por Cosman y col., Nature 312:768, 1984 se ha depositado como ATCC 39890. En el documento EP-A-0367566 y en la solicitud de patente US Nº 07/701.415, presentada el 16 de mayo de 1991, se describen otros vectores de expresión en mamíferos útiles. Los vectores pueden derivar de retrovirus. En lugar de la secuencia señal nativa y además de una metionina de inicio, puede añadirse una secuencia señal heteróloga, como la secuencia señal para IL-7 descrito en la patente US. Nº 4965195; la secuencia señal para el receptor de IL-2 descrita en Cosman y col., Nature 312:768 (1984); el péptido señal de IL-4 descrito en el documento EP 367.566; el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo I descrito en la patente US 4968607 y el péptido señal del receptor de IL-1 de tipo II descrito en el documento EP 460.846.

Los polipéptidos DCSema de la presente invención, pueden producirse como proteínas aisladas, purificadas u homogéneas mediante sistemas de expresión recombinante como se describe anteriormente o purificarse a partir de células naturales. Los polipéptidos pueden purificarse hasta una homogeneidad sustancial, como indica una única banda de proteína en el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (PAGE-SDS).

Un procedimiento para la producción de los polipéptidos de la presente invención comprende el cultivo de una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica el polipéptido DCSema deseado en condiciones suficientes para promover la expresión del polipéptido DCSema. A continuación, el polipéptido DCSema se recupera del medio de cultivo o de los extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión empleado. Como es conocido por los expertos en la técnica, los procedimientos para purificar una proteína recombinante variarán según factores como el tipo de células hospedadoras empleadas y si la proteína recombinante se secreta o no al medio de cultivo.

Por ejemplo, cuando se emplean sistemas de expresión que secretan la proteína recombinante, el medio de cultivo puede concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Tras la etapa de concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación, como un medio de filtración en gel. Alternativamente, puede emplearse una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos colgantes de dietilaminoetilo (DEAE). Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa y otros tipos empleados frecuentemente en la purificación de proteínas. Alternativamente, puede emplearse una etapa de intercambio catiónico. Entre los intercambiadores catiónicos adecuados se incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. Se prefieren los grupos sulfopropilo. Finalmente, pueden emplearse para una purificación adicional de los polipéptidos una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (HPLC-RP), empleando medios de HPLC-RP hidrófobos (por ejemplo, sílica gel que tenga grupos metilo y otros grupos alifáticos colgantes). Son bien conocidas algunas o todas las etapas de purificación mencionadas anteriormente, en diversas combinaciones, y pueden emplearse para proporcionar una proteína recombinante sustancialmente homogénea.

Es posible utilizar una columna de afinidad que comprende el dominio de unión al receptor de la DCSema del receptor de semaforina purificado por afinidad de la presente invención al cual se une la DCSema. Este receptor puede eluirse de una columna de afinidad usando técnicas convencionales, por ejemplo, con un tampón de elución con alta concentración de sales y, a continuación, dializarse en un tampón de baja concentración de sales, o cambiando el pH u otros componentes de los que depende la afinidad de la matriz utilizada.

La proteína recombinante producida en el cultivo bacteriano puede aislarse mediante la disrupción inicial de las células hospedadoras, centrifugación, extracción a partir de sedimentos celulares si es un polipéptido insoluble o a partir del fluido sobrenadante si es un polipéptido soluble, seguido de una o más etapas de concentración, reducción de sales, intercambio iónica, purificación por afinidad o cromatografía de exclusión molecular. Finalmente, puede emplearse HPLC-RP para las etapas finales de purificación. Las células microbianas pueden disgregarse cualquier procedimiento conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disgregación mecánica o uso de agentes de lisis celular.

Preferiblemente se emplean células hospedadoras de levaduras transformadas para la expresión de las DCSema de la presente invención como polipéptidos secretados para simplificar su purificación. El polipéptido recombinante secretado durante la fermentación de una célula hospedadora de levadura puede purificarse mediante procedimientos análogos a los descritos por Urdal y col. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal y col. describen dos etapas secuenciales de HPLC en fase inversa para la purificación de IL-2 humana recombinante en una columna de HPLC prepara-
toria.

Además de lo indicado anteriormente, se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar las realizaciones especiales.

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Ejemplo 1 Aislamiento de un homólogo humano de semaforina denominado DCSema

Usando técnicas de alineamiento de secuencias y análisis comparativo de secuencias de EST, se ha identificado un homólogo humano de la semaforina AHV Sema del siguiente modo. Se ha usado la secuencia de nucleótidos de A39R viral en una búsqueda comparativa de secuencias Unigene. Esta búsqueda permitió la identificación de la EST Nº 151129 (Nº de acceso [H02902]), depositada el 20 de junio de 1995. EST 151129 es una secuencia parcial que no tiene ATG de inicio ni codon de terminación. EST 151129 tiene homología de secuencia con A39R y con AHV Sema.

EST 151129 se utilizó para aislar e identificar la DCSema humana nativa como sigue:

Se identificó un tejido fuente de EST 151129 usando procedimientos de análisis de una biblioteca de fagos y cebadores de PCR en función de esta secuencia EST. Se sintetizados los cebadores oligonucleotídicos de PCR que tenían las secuencias de nucleótidos siguientes:

5'-TGCTGGAACCTGGTGAATGG-3'	(SEQ ID NO: 3)
5'-AGTGGAACAATGGCGTCTTC-3'	(SEQ ID NO: 4)

Las metodologías de aislamiento y amplificación por PCR se realizaron usando un panel de bibliotecas de fagos de ADNc de tejido humano como moldes para la reacciones de PCR.

Se eligieron para un análisis adicional dos de las bibliotecas de fagos, de fibroblastos de prepucio humano y de fibroblastos dérmicos. Las bibliotecas se dispusieron en placas según los procedimientos establecidos. Se generó una sonda marcada radiactivamente mediante la incorporación de ^{32}P-dCTP en la ampliación de un producto de PCR usando la EST 151129 como molde. La mezcla de reacción de PCR incluía 10 ng de ADN del plásmido EST151129, 50 pmoles de cada cebador oligonucleotídico de PCR identificado a continuación y específico para el extremo 5' de la EST 151129, tampón Amplitaq 1X (Perkin-Elmer Cetus), 1,25 mM de dATP, dGTP, dTTP, 0,001 nM de dCTP (Pharmacia), ^{32}P-dCTP 150 \muCi, 0,5 \mul de Amplitaq polimerasa taq (Perkin-Elmer Cetus) en un volumen final de reacción de 100 \mul. Los ciclos de reacción de PCR incluían un ciclo a 94ºC durante 5 min: veinticinco ciclos a 94ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min y un ciclo a 72ºC durante 5 min usando un Robocycler Gradient 40 (Stratagene, La Jolla, CA).

Los cebadores para PCR son los siguientes:

5'-TCCGCCCAGGGCCACCTAAGGAGCGGA-3'	(SEQ ID NO: 7)
5'-TGTGCGGCTCAGTCTGGCCAAAGTCCA-3'	(SEQ ID NO: 8)

Se usaron aproximadamente 5x10^{5} cpm/ml de sonda purificada para hibridar con la biblioteca de fibroblastos dérmicos humanos sobre filtros de membrana de náilon de la misma forma que se describe en el Ejemplo 5 para la incubación con la sonda de las bibliotecas de fibroblastos de prepucio humano y de fibroblastos dérmicos huma-
nos.

Se aisló un ADNc que solapaba con el extremo 5' de EST 151129. Usando los alineamientos de secuencia se determinó que la secuencia EST 151129 incluía los nucleótidos 115 a 1.536, que codifican los aminoácidos 39 a 512 del péptido de longitud completa. El ADNc aislado proporcionada los nucleótidos 1 a 114 y los nucleótidos no codificantes adicionales antes del extremo 5'. Estos nucleótidos añadidos codifican los aminoácidos 1 a 38 de la semaforina humana de longitud completa, siento el aminoácido 1 la metionina de inicio.

Para aislar el ADNc que solapa con el extremo 3' de EST 151129, se generó otra sonda de PCR marcada radiactivamente como se describió anteriormente, pero usando cebadores oligonucleotídicos de PCR específicos para el extremo 3' de EST 151129:

5'-AGCCAGGTGCCCCTGGACCT-3'	(SEQ ID NO: 9)
5'-CTCGAGGCCAAGAATTCGGC-3'	(SEQ ID NO: 10)

Se usaron aproximadamente 5 x 10^{5} cpm/ml de sonda purificada para hibridar con la biblioteca de fibroblastos de prepucio humano sobre filtros de membrana de náilon seguido del protocolo de hibridación y lavado descrito anteriormente. Se aislaron tres clones de ADNc independientes que solapaban con el extremo 3' de EST 151129 y abarcaban el extremo 3' de EST 151129 desde los nucleótidos 1.537 a 2.001. Los clones aislados contenían nucleótidos adicionales no codificantes después del extremo 3'. Los nucleótidos 1.537 a 2.001 se traducen en los aminoácidos 513 a 666 del péptido de longitud completa más un codon de terminación. La secuencia completa de ADNc del homólogo DCSema humano se proporciona en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos codificada se muestra en la SEQ ID NO: 2.

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Ejemplo 2 Análisis por transferencia de ARN de los tejidos que expresan el homólogo humano

Las sondas marcadas radiactivamente derivadas de la SEC. ID. Nº 1 se usaron en análisis de transferencia de ARN de diferentes tejidos humanos para identificar la distribución tisular del homólogo humano de AHV Sema, denominado DCSema.

Las transferencias de ARN poli A+ de tejido múltiple humano se obtuvieron de Clontech Laboratories, Palo Alto, CA (Nº de catálogo 7760-1, 7759-1, 7756-1 y 757-1). Los filtros de transferencia de ARN se prehibridaron, incubaron con la sonda y lavaron según las instrucciones del fabricante. La sonda era una ribosonda complementaria específica de EST 151129, una EST descrita usando la secuencia AHV Sema vírica en los análisis de alineamiento de secuencia y en procedimientos de análisis comparativo. El molde de ribosonda se generó usando técnicas de PDR y cebadores oligonucleotídicos que se diseñaron para abarcar los nucleótidos 613 a 978 de EST 151129 (HO2902/H). Las secuencias de los cebadores eran las siguientes:

Cebador 5':

TCTACTACTT CTTCC

(SEQ ID NO: 5)

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Cebador 3'

GGAATCCTAA TACGACTCAC TATAGGGAGG CGGGTTGGGA AGGC

(SEQ ID NO: 6)

La porción subrayada del cebador 3' es un sitio T7.

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La ribosonda se generó usando un kit MAXIscript SP6/T7 de Ambion combinando 3 \mul de agua libre de ARNasa, 2 \mul de tampón de transcripción 10x, 1 \mul de cada nucleótido dATP/dCTP/dGTP 10 mM, 5 \mul de productos 5'/3' de PCR de EST 151129, 5 \mul de Amersham [\alpha^{32}P]UTP 10 mCi/ml y 2 \mul de ARN polimerasa T7 a temperatura ambiente. La combinación se microcentrifugó brevemente y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. A continuación, se añadió 1 \mul de ADNasa a la mezcla y se permitió que reaccionara durante 15 minutos a 37ºC. El producto de reacción se hizo pasar a través de dos volúmenes de columna de G-25 (Boehringer). Se contó un microlitro (1 \mul) de la ribosonda en un contador de centelleo durante 1 minuto para determinar las cpm/\mul.

Tras la incubación de las transferencias de ARN con la sonda, se lavaron una vez durante 30 minutos con SSCx2, SDS al 0,05% a 63ºC y tres veces durante 30 minutos con 0,1xSSC, SDS al 0,1% y, a continuación, se expuso a una radiografía. La radiografía revelada indicaba que el homólogo de DCSema humano se encuentra en placenta, cerebro, médula espinal, testículos y bazo. Se observaron señales débiles de hibridación en músculo esquelético, ganglio linfático, ovario y médula ósea.

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Ejemplo 3 Preparación de una proteína de fusión DCSema/Fc

Este ejemplo describe la preparación de una construcción de ADN DCSema/Fc y la posterior expresión de una proteína de fusión DCSema/Fc de inmunoglobulina denominada DCSema/Fc. El ADN que codifica DCSema/Fc incluía una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido líder de la IL-7 murina, un octapéptido FLAG^{TM} (descrito en la patente US. Nº 5011912), una región Fc de una inmunoglobulina mutada para minimizar la unión al receptor de Fc (descrito por Baum y col. Cir. Sh. 44:30, 1994), una secuencia enlazadora flexible y un ADN que codifica los aminoácidos 45 a 666 de la SEQ ID NO: 2. Se preparó un vector de expresión que contiene la secuencia líder, FLAG, el Fc de la IgG hu mutada y el enlazador flexible usando técnicas convencionales de corte y ligamiento con enzimas. A continuación el vector resultante se cortó con las enzimas de restricción SpeI y NotI. El DCSema se insertó en dirección 5' a 3' después del enlazador flexible en un ligamiento bidireccional descrito a continuación.

Para preparar el ADN de DCSema, se diseñaron tres pares de cebadores y se usaron para amplificar tres fragmentos de ADN. Se amplificaron dos de los fragmentos a partir de la biblioteca de clones de fagos de fibroblastos de prepucio humano que contenían la porción 3' del ADNc de DCSema y un fragmento era el ADN de la EST (Research Genetics Imageclone Nº ID 151129). Los tres fragmentos de ADN amplificados se combinaron en una reacción de PCR SOEing para generar un fragmento de ADN que codifica el péptido completo de DCSema (Horton y col., Biotechniques 8:528, 1990). En el fragmento final, el cebador oligonucleotídico 5' introducía un sitio SpeI antes del extremo 5' del aminoácido 45 del péptido DCSema. El cebador oligonucleotídico 3' introducía un sitio NotI justo después del extremo 3' del codon de terminación después del aminoácido 666.

A continuación, el fragmento PCR se ligó en un vector de expresión (pDC409) que contenía la secuencia líder, la secuencia Flag®, el Fc de la IgG humana mutada y una región enlazadora flexible en un ligamiento bidireccional. La construcción de ADN resultante se transfectó en las líneas de células de riñón de mono CV-1/EBNA. Después de 7 días de cultivo en medio que contenía suero bovino con bajo contenido en inmunoglobulinas al 0,5%, se añadió una solución de azida al 0,2% al sobrenadante y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum. Después, aproximadamente 1 l de sobrenadante de cultivo se hizo pasar a través de un sistema de purificación de proteínas por HPLC con BioCad proteína A usando una columna de proteína A de 4,6 x 100 mm (POROS 20A de PerSeptive Biosystems) a 10 ml/min. La columna de Proteína A se une a la porción Fc de la proteína de fusión del sobrenadante, inmovilizando la proteína de fusión y permitiendo que otros componentes del sobrenadante pase a través de la columna. La columna se lavó con 30 ml de solución de PBS y la proteína de fusión unida se eluyó de la columna de HPLC con ácido cítrico ajustado a pH 3,0. La proteína de fusión purificada por elución se neutralizó según eluía usando una solución de HEPES 1M a pH 7,4.

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Ejemplo 4 Preparación de proteínas de fusión DCSema/poliHIS

Este ejemplo describe la preparación de una construcción de ADN DCSema/poliHIS y la posterior expresión de una proteína de fusión DCSema con una etiqueta de polihistidina denominada proteína de fusión DCSema/poliHIS. El ADN que codifica DCSema/poliHIS comprende secuencias que codifican el gen DCSema desde el aminoácido 1 al aminoácido 666 (sin codon de terminación), seguido de un sitio de escisión del factor Xa, un octapéptido FLAG®, una cadena de seis residuos de histidina y un codon de terminación. Se preparó un vector de expresión que contenía el sitio de escisión del factor Xa, la etiqueta y la secuencia poliHIS usando técnicas enzimáticAS de corte y ligamiento de los fragmentos. A continuación el vector resultante se cortó con las enzimas de restricción SalI y SnaBI. La secuencia DCSema se insertó en dirección 5' a 3' antes del sitio de escisión del factor Xa en un ligamiento bidireccional descrito anteriormente.

Para preparar el ADN de DCSema, se diseñaron tres pares de cebadores y se usaron para amplificar tres fragmentos de ADN. Dos de los fragmentos eran ADN del fago y un fragmento era el ADN de la EST (Research Genetics Imageclone, Nº de ID 151129). Los tres fragmentos de ADN amplificados se combinaron en una reacción de PCR SOEing para generar un fragmento de ADN que codifica el péptido completo de DCSema. Este ADN final incluía un sitio SalI antes del extremo 5' del aminoácido 1 del péptido DCSema y un sitio SnaBI después del extremo 3' del aminoácido 666.

A continuación el producto de PCR se ligó en un vector de expresión pDC409 que contenía el sitio de escisión del factor Xa, la etiqueta y la secuencia poliHIS en un ligamiento bidireccional. La construcción de ADN resultante (DCSema/poliHIS) se transfectó de forma transitoria en la línea celular de mono COS-1 (ATCC CRL-1650). Después de 7 días de cultivo en medio que contenía suero bovino con bajo contenido en inmunoglobulinas al 0,5%, se recogieron los sobrenadantes celulares y se añadió a los sobrenadantes azida sódica al 0,2%. Los sobrenadantes se filtraron a través de filtros de 0,22 \mum, se concentró 10 veces con un concentrador de escala preparatoria (Millipore; Bedford, MA) y se purificaron en un sistema de purificación de proteínas de HPLC BioCad equipado con una columna de resina autoempaquetada de níquel NTA superflujo (Qiagen, Santa Clarita, CA). Después de que el sobrenadante pasara a través de la columna, esta se lavó con tampón A (NaPO_{4} 20 mM, pH 7,4; NaCl 300 mM, imidazol 50 mM). A continuación, la proteína unida se eluyó de la columna usando técnicas de elución de gradiente. Se recogieron las fracciones que contenían la proteína y se analizaron en un gel PAGE-SDS del 4 al 20% en condiciones reductoras. Los picos que contenían la proteína de fusión se recogieron, se concentraron 2 veces y, a continuación, se dializaron en PBS. A continuación, la proteína de fusión DCSema/poliHIS se filtró a través de un filtro estéril de 0,22 \mum y se recuperó.

Ejemplo 5 Análisis de líneas celulares para la unión de DCSema

La proteína de fusión DCSema/Fc preparada como se describe en el Ejemplo 3 se uso para analizar su unión a líneas celulares usando estudios de unión cuantitativos según metodologías de citometría de flujo convencionales. Para cada línea celular analizada, el procedimiento implicaba incubar aproximadamente 100.000 células bloqueadas con STF (suero de ternera fetal) al 2%, suero de cabra normal al 5% y suero de conejo al 5% en PBS durante 1 hora. A continuación, las células bloqueadas se incubaron con 5 \mug/ml de la proteína de fusión DCSema/Fc en SFT al 2%, suero de cabra al 5% y suero de conejo al 5% en PBS. Tras la incubación, la muestra se lavó 2 veces con tampón FACS (SFT al 2% en PBS) y después se trató con anticuerpo de ratón anti Fc humano/biotina (obtenido de Jackson Research) y SAPE (estreptavidina-ficoeritrina obtenida de Molecular Probes). Este tratamiento hace que el complejo anti FC humano/biotina se una a cualquier DCSema/Fc unido y el SAPE se una al anti FC humano/biotina dando lugar a un marcador identificable por fluorescencia sobre la DCSema/FC que está unida a las células. Se analizó la presencia de cualquier proteína unida a las células usando la detección de la fluorescencia por citometría de flujo. En la Tabla I se detallan los resultados de los estudios de citometría de flujo. (+) indica que se detectaba unión entre la superficie celular y DCSema. (-) indica que no se detectaba unión entre la superficie celular y A39R.

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TABLA I

1

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Ejemplo 6 Anticuerpos monoclonales frente a DCSema

Este ejemplo muestra un procedimiento para preparar anticuerpos frente a DCSema. Se prepara DCSema/Fc purificada como se describe en el Ejemplo 3 anterior. La proteína purificada se usa para generar anticuerpos frente a DCSema como se describe en la patente US Nº 4411993. Brevemente, los ratones se inmunizan las semanas 0, 2 y 6 semanas con 10 \mug de DCSema/Fc. La inmunización primaria se prepara con adyuvante TITERMAX de Vaxcell, Inc., y las inmunizaciones posteriores se prepararon con adyuvante incompleto de Freund (AIF). A las 11 semanas, los ratones se reinmunizan por vía i.v. con 3 a 4 \mug de DCSema/Fc en PBS. Tres días después de la reinmunización i.v., se recogen los esplenocitos y se fusionan con la pareja de fusión, el mielona Ag8.653, usando una solución acuosa de PEG 1500 al 50%. La presencia de anticuerpos frente a DCSema en los sobrenadantes de los hibridomas se analiza mediante un ensayo de transferencia en puntos frente a DCSema/FC y una proteína Fc irrelevante.

Ejemplo 7 Inducción de citoquinas en monocitos humanos recién aislados

Los monocitos humanos recién aislados se purificaron mediante una primera dilución 1:1 de sangre periférica de donantes sanos en PBS con bajo contenido en endotoxinas a pH 7,4 y a temperatura ambiente. A continuación, se depositaron 35 ml de la sangre diluida sobre 15 ml de Isolymph (Gallar y Schlesinger Industries, Inc.; Carle Place, NY) y se centrifugó a 2.200 rpm durante 25 minutos a temperatura ambiente. Las capas de plasma se reservaron. Se recogió la capa de PBMC y se lavó tres veces para eliminar el Isolymph. Los PBMC lavados se resuspendieron en medio sin suero X-Vivo 15 (BioWhittaker, Walkersville, MD) y se añadieron a frascas de cultivo T175. Las frascas se habían recubierto previamente con gelatina al 2% (Sigma, St. Louis, MO) y se pretrataron durante 30 minutos con la capa de plasma reservada. Se permitió que los PBMC se adhiriesen durante 90 minutos a 37ºC, CO_{2} al 5% y, a continuación, se lavaron cuidadosamente tres veces con lavados 10 ml de PBS con bajo contenido en endotoxinas. Los monocitos adheridos se recubrieron incubando las células en tampón de disociación sin enzimas (Gibco, BRL) y las células se lavaron múltiples veces en PBS. Los monocitos se centrifugaron a 2.500 rpm durante 5 minutos, se contaron y se dispusieron en placas de 24 pocillos a razón de 5 x 10^{5} células/pocillo en 1 ml. Los cultivos presentaban una pureza del 95%.

Los monocitos purificados se cultivaron de 7 a 9 días en presencia de GM-CSF a 20 ng/ml e IL-4 a 100 ng/ml para permitir que las células se diferencien a un fenotipo más similar a células dendríticas. Los días 7 a 9, los cultivos se trataron con proteína de fusión DCSema/Fc a 1 \mug/ml (véase el Ejemplo 3) o una proteína Fc control y, al día siguiente, se recogieron las células y los sobrenadantes para su análisis.

La presencia de citoquinas proinflamatorias se examinó en los sobrenadantes de los monocitos. Para todos los donantes probados, la proteína DCSema inducía IL-6 e IL-8. Ni la DCSema inactivada por calor ni las proteínas control inducían IL-6 o IL-8. Adicionalmente, la producción de citoquina se bloqueaba con la inclusión de un Acm dirigido frente a DCSema.

Los resultados de este experimento demuestran que DCSema o los homólogos de esta proteína pueden inducir la producción de citoquinas por monocitos recién aislados mediante la interacción con su receptor.

Ejemplo 8 Estudios de agregación de monocitos

Para examinar la respuesta de los monocitos humanos a la interacción de DCSema con su receptor en los monocitos, se purificaron estas células como se describe en el Ejemplo 7 y se preparó una proteína de fusión DCSema/FC como se describe en el Ejemplo 3. Tras la incubación de la proteína de fusión DCSema/Fc y los monocitos purificados y cultivados durante 20 horas, se observó la agregación de los monocitos.

Este trabajo confirma que el receptor de la DCSema se expresa en los monocitos y que la interacción entre DCSema y su receptor da lugar a la agregación de monocitos. Al igual que las células B, la agregación de monocitos es indicativa de su activación.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Immunex Corporation y Spriggs, Melanie K.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS POLIPÉPTIDOS DE SEMAFORINA

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Janis C. Henry

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(B)

CALLE: 51 University St.

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: WA

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 98101

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(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO INTERNO DE SOLICITUD: - -por asignar - -

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 5 de mayo de 1999

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/085.497

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14 de mayo de 1998

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Henry, Janis C

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 34.347

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 2634-WO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: (206)470-4189

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (206)233-0644

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2.001 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2.001

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 666 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cebador

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

15

Claims (17)

1. Un polipéptido de semaforina truncado que está compuesto por la secuencia de los aminoácidos 52 a 543 de la SEQ ID NO:2.

2. El polipéptido de semaforina de la reivindicación 1 conjugado covalentemente con un resto químico, en el que el resto no es un aminoácido.

3. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 3 que es ADN.

5. Un procedimiento de selección para la unión de un polipéptido de semaforina

que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, el polipéptido de semaforina capaz de unirse a su receptor, o

un fragmento de un polipéptido de semaforina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento es capaz de unirse a un receptor de semaforina,

a su receptor, comprendiendo el procedimiento ensayar la unión de dicho polipéptido a una proteína VESPR (receptor de la proteína semaforina codificada por virus).

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la proteína VESPR es soluble.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la proteína VESPR soluble se conjuga con un resto detectable.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que dicho polipéptido de semaforina es soluble.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicho polipéptido de semaforina soluble se conjuga con un resto detectable.

10. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la proteína VESPR se expresa en la superficie celular.

11. Uso de un polipéptido de semaforina

que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, el polipéptido de semaforina capaz de unirse a su receptor, o

un fragmento de un polipéptido de semaforina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento es capaz de unirse a un receptor de semaforina,

en la fabricación de un medicamento para tratar tumores micrometastatizantes.

12. Un procedimiento in vitro que comprende tratar un cultivo de monocitos con un polipéptido de semaforina,

que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, el polipéptido de semaforina capaz de unirse a su receptor, o

un fragmento de un polipéptido de semaforina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento es capaz de unirse a un receptor de semaforina,

y analizar la producción de citoquina por el cultivo de monocitos o la activación del cultivo de monocitos.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la citoquina es IL-6 y/o IL-8.

14. El procedimiento de una de las reivindicaciones 12 ó 13, en el que el polipéptido es el polipéptido de la reivindicación 1.

15. Uso de un polipéptido de semaforina

que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 80% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, el polipéptido de semaforina capaz de unirse a su receptor, o

un fragmento de un polipéptido de semaforina que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, en el que el fragmento es capaz de unirse a un receptor de semaforina,

en la fabricación de un medicamento para administrar un agente diagnóstico y terapéutico a las células que expresan la proteína VESPR.

16. El uso de la reivindicación 15, en el que las células que expresan la proteína VESPR se seleccionan a partir del grupo compuesto por células epiteliales de pulmón, estroma, células de epitelio intestinal y células de linfoma.

17. El uso de la reivindicación 15 ó 16, en el que el polipéptido es el polipéptido de la reivindicación 1.