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ES2710332T3 - Método para el diagnostico y/o pronóstico de daño renal agudo - Google Patents

Método para el diagnostico y/o pronóstico de daño renal agudo Download PDF

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ES2710332T3
ES2710332T3 ES16150622T ES16150622T ES2710332T3 ES 2710332 T3 ES2710332 T3 ES 2710332T3 ES 16150622 T ES16150622 T ES 16150622T ES 16150622 T ES16150622 T ES 16150622T ES 2710332 T3 ES2710332 T3 ES 2710332T3
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mir
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acute renal
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Bermejo María Laura Garcia
Fraile Elia Aguado
Garcia Fernando Liano
Morales David Saenz
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Fundacion para la Investigacion Biomedica del Hospital Universitario Ramon Y Cajal
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Fundacion para la Investigacion Biomedica del Hospital Universitario Ramon Y Cajal
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Abstract

Método para el diagnóstico y/o pronóstico de daño renal agudo que comprende analizar una muestra obtenida de un paciente seleccionada de sangre o suero, para determinar el nivel de expresión de al menos miR-127, y comparar dicho nivel de expresión con un valor control, en el que la disminución en el nivel de expresión de miR-127 en suero con respecto al valor control es indicativo de daño renal agudo.

Description

DESCRIPCION
Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo.
Campo de la invencion
La presente invencion se encuadra en general dentro del campo de la biomedicina y en particular se refiere a un metodo para el diagnostico y/o pronostico del dano renal agudo.
Antecedentes de la invencion
En el trasplante renal, la necrosis tubular aguda (NTA) es la causa principal del retraso en la funcion postrasplante del injerto. Ademas, la NTA contribuye a una mayor incidencia del rechazo agudo, al desarrollo de rechazo cronico y a la disminucion de la supervivencia del injerto (Pannu et al, 2008). El aumento en la demanda de organos en los ultimos anos conlleva el uso de organos procedentes de donantes suboptimos, incluyendo donantes en asistolia y donantes envejecidos, lo cual aumenta significativamente el porcentaje de desarrollo de NTA postrasplante, la morbilidad del injerto y el retraso en su recuperacion funcional. Todo ello dispara el coste economico total de un trasplante renal para la sanidad publica. Observese que las ultimas estadfsticas de la Organizacion Nacional de Trasplantes (ONT) indican que se realizaron en Espana unos 2.200 trasplantes renales/ano y hay mas de 4.000 pacientes aun en lista de espera (Dominguez-Gil y Pascual. 2008). Ademas, la NTA es la manifestacion morfologica mas frecuente de la insuficiencia renal aguda (IRA), incluyendo IRA de origen isquemico (Kellum et al, 2008). La IRA representa uno de los problemas mas graves entre las enfermedades renales en el mundo desarrollado debido a su alta mortalidad, de alrededor del 50%. Alrededor del 30% de todos los episodios de IRA se producen en pacientes ingresados en las UCl, como resultado de insuficiencia multiorganica. En este ultimo contexto, la mortalidad se eleva hasta el 80% (Chertow et al., 2005). El desarrollo de IRA es ademas una de las complicaciones mas habituales tras una intervencion cardiaca, de las que se realizan alrededor de 30.000/ano en Espana y mas de un 1% de ellas en el presente hospital. Practicamente todos los pacientes intervenidos desarrollan un cierto grado de IRA (Yates y Stafford-Schmit, 2006). De la gravedad de esta IRA posoperatoria depende la evolucion a largo plazo de los pacientes, dando como resultado una mortalidad cercana al 60% en aquellos casos que requieran dialisis tras la intervencion cardiaca (Takar et al, 2005; Candela-Taha et al, 2008). Tanto la cirugfa cardiaca como el trasplante renal son dos situaciones “cuasi” experimentales de estudio para NTA en humanos, ya que se conoce el momento y la duracion del estfmulo isquemico y ademas pueden monitorizarse. Todas estas estadfsticas de morbimortalidad no han cambiado significativamente en las ultimas decadas y, hasta el momento, no existe una terapeutica eficaz para la prevencion y/o reduccion de NTA en todas estas situaciones. A ello ha contribuido en gran medida la falta de marcadores de dano renal que sean mas precisos que la determinacion de creatinina y urea en suero, que se han usado hasta ahora. Estos marcadores clasicos no reflejan directamente el dano celular ni muestran el compartimento del tejido renal (tubulo o endotelio) en el que esta teniendo lugar tal dano. Son solo parametros indicativos de una funcion renal alterada como resultado del dano (Vaidya et al., 2008). De hecho, es posible que pacientes con un dano renal subclrnico no se identifiquen como tales porque no ha tenido lugar una alteracion significativa en los niveles de creatinina y urea en suero. Asf, en los ultimos anos, se han desarrollado numerosos estudios que han intentado identificar y validar nuevos marcadores del IRA, tales como NGAL, IL18, KIM, cistatina C, VEGF o CXCL10, que parecen funcionar como buenos marcadores en poblaciones infantiles sin patologfas anadidas significativas pero no en una poblacion adulta (Vaidya et al., 2008).
La isquemia renal, la hipovolemia y los agentes toxicos son las causas mas frecuentes de desarrollo de NTA. La reduccion en el flujo de sangre y como resultado la hipoxia tisular, dan como resultado dano a nivel del epitelio proximal tubular, provocan una rapida disminucion de la filtracion glomerular, alteran la permeabilidad vascular y desencadenan una respuesta inflamatoria que amplifica el dano tisular (Thurman et al., 2007). El grado y la extension del dano isquemico son dependientes de la gravedad y la duracion de la isquemia. En isquemias subletales, se observa el desprendimiento de celulas epiteliales proximales, muchas de las cuales son viables, a la luz tubular. En isquemias mas prolongadas, la persistente hipoxia tisular y la respuesta inflamatoria, entre otros, aumentan el dano epitelial y vascular, con muerte celular en la zona corticomedular del rinon. Ademas, el compartimento vascular tambien se dana tras la isquemia. De hecho, el dano endotelial contribuye significativamente al dano renal agudo y tambien al mantenimiento del mismo a lo largo del tiempo. Alteraciones tempranas en el flujo peritubular durante la isquemia y la reperfusion temprana se asocian a la perdida de la morfologfa y funcion endoteliales contribuyendo a la perdida de la funcion de barrera, la inflamacion y la actividad procoagulante. A medio y largo plazo, se ha descrito perdida de densidad microvascular, lo que favorece la progresion del dano renal cronico como resultado directo de la isquemia inicial (Basile 2007). Para resolver la NTA, se ponen en marcha mecanismos que facilitan la reparacion tisular, es decir, division y diferenciacion celulares a partir de las celulas epiteliales tubulares no danadas. En los ultimos anos, varios estudios han demostrado que a la reparacion del dano tubular tras la isquemia pueden contribuir no solo las propias celulas epiteliales no danadas que se desdiferencian y proliferan, sino tambien celulas pluripotentes renales e incluso celulas pluripotentes extrarrenales tales como las procedentes de la medula osea (Lin 2008). Sin embargo, la contribucion de celulas madre a la reparacion del dano isquemico se cuestiona, aunque sf se acepta que a tal reparacion contribuinan fundamentalmente celulas tubulares proximales no danadas y la revascularizacion del parenquima. En este ultimo proceso, se ha propuesto que tambien participanan celulas progenitoras endoteliales movilizadas tras la isquemia (Becherucci et al, 2009).
Los miARN son ARN de pequeno tamano (22-25 nucleotidos) codificados endogenamente capaces de reconocer ARN mensajeros y as ^ regular negativamente la expresion de protemas, dentro de complejos de silenciamiento inducido por ARN (RISC) por complementaridad total o parcial con su ARNm diana (Chang y Mendell, 2007). En humanos se han clonado ya mas de 700 y predicciones bioinformaticas indican que todos ellos pueden controlar la expresion de mas del 30% de las protemas totales (Filipowicz et al, 2008). La mayona se transcriben mediante la a Rn Pol II a partir de genes individuales o a partir de transcritos policistronicos para varios de ellos a la vez. Se generan como pre-miR mas largos que se procesan en el nucleo por una ribonucleasa III (Drosha), salen al citoplasma por medio de mecanismos dependientes de exportina-5 y Ran-GTP y allf se procesan finalmente mediante otra ribonucleasa III (Dicer) a su forma madura (Rana 2007). Su funcion es esencial en una amplia variedad de procesos, incluyendo desarrollo embrionario, respuesta a estres o regulacion estricta de procesos fisiologicos y, por tanto, mantenimiento de la homeostasis de los organismos. Es importante destacar que el perfil de expresion de miARN es espedfico del tipo celular y puede cambiar dependiendo del estfmulo, de manera que el contexto celular particular de un mismo miARN determinara su funcion en un tipo celular espedfico (Bartel 2009). Por este motivo, la desregulacion de ciertos miARN se ha senalado entre los mecanismos responsables del desarrollo de patologfas tales como cancer (Bartels y Tsongalis, 2009), autoinmunidad (Sonkoly y Pivarcsi 2008), diabetes (Zhou et al, 2008) o patologfas vasculares (Urbich et al., 2008) y se estan constituyendo como biomarcadores precisos de la evolucion de muchas de ellas. Muy recientemente se ha demostrando que los miARN son ademas reguladores clave en la respuesta celular rapida y precisa ante cualquier tipo de estfmulo, incluyendo la falta de nutrientes o la hipoxia (Ivan et al., 2008). Ademas, se ha demostrado que estos miARN junto con ARNm pueden secretarse o intercambiarse por las celulas en forma de micropartmulas (microvesmulas derivadas de plaquetas; exosomas de celulas tumorales; ectosomas de neutrofilos (Valadi et al., 2007). Asf podnan detectarse en ifquidos corporales tales como sangre, orina o lfquido pleural. De hecho, se estima que la sangre periferica de individuos sanos puede contener una concentracion de entre 5-50 mg/ml de micropartmulas, que aumentana en el caso de pacientes con diversas patologfas (Hunter et al., 2008). Esto permitina hacer una monitorizacion muy fiable de la evolucion de estas patologfas utilizando muestras obtenidas mediante metodos mmimamente invasivos (extraccion de sangre y recogida de orina (Gilad 2008). En orina, los miARN detectados, entre los que se incluye miR-127, han demostrado una gran estabilidad, incluso en condiciones muy agresivas (Melkonyan et al., 2008). Dado que la desregulacion de miARN puede provocar diversas patologfas, estan comenzando a considerarse como nuevas dianas de accion terapeutica. De hecho, se han desarrollado herramientas para modular su expresion: premiR para su sobreexpresion y antagomiR (anti-miR) para su inhibicion, con resultados muy esperanzadores en diversos modelos experimentales in vitro e in vivo (Krutzfeld et al., 2006; Care et al., 2007; Van Rooij et al., 2008), aunque esta todavfa por determinar su validez como estrategia terapeutica en humanos.
En cuanto al papel de los miARN en respuesta a la isquemia, se ha determinado su expresion en isquemia cerebral focal en ratas, estableciendose asociacion entre la expresion de miR-145 y el dano cerebral (Dharap et al., 2009). En isquemia cardiaca en humanos, miR-100 y miR-133 parecen participar en el mecanismo de dano cardiaco (Sucharov C, et al., 2008). En isquemia hepatica tambien en humanos, se ha establecido miR-223 como mediador de dano (Yu et al., 2008). Por el contrario, miR-126 y miR-210 se han descrito como promotores fundamentales de angiogenesis, neovascularizacion y reparacion tisular en respuesta a diversos estfmulos, incluyendo hipoxia (Suarez ySessa, 2009; Fasanaro et al., 2008; van Solingen et al., 2008). Hasta el momento, no se han descrito en la bibliograffa miARN modulados en I/R renal, pero los expertos han comenzado a especular sobre su potencial como biomarcadores en patologfas renales, incluidas aquellas que implican alteraciones en la regulacion de la tension arterial (Liang M et al, 2009). En otro contexto, se han identificado algunos miARN relacionados con el rechazo inmunitario en trasplante renal (Sui et al, 2008).
Todo lo anterior justifica la necesidad de identificar y validar nuevos biomarcadores de evolucion del dano renal que sean mas precisos e indicativos de que compartimento tisular esta danandose y/o recuperandose y en que grado tiene lugar esto, cuya determinacion ademas sea rapida, sencilla y no requiera una biopsia del paciente.
Descripcion de la invencion
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo que comprende analizar una muestra obtenida de un paciente para determinar el nivel de expresion de al menos miR-127, y comparar dicho nivel de expresion con un valor control, donde la alteracion de dicho nivel es indicativo de dano renal.
En un aspecto mas en particular de la presente invencion, la muestra del paciente que va a analizarse es sangre. En otro aspecto en particular de la presente invencion, la muestra es suero. En otro aspecto de la presente divulgacion, la muestra es orina.
En un aspecto mas particular de la presente invencion, el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo se lleva a cabo determinando el nivel de expresion del miR-127 solo o en combinacion con al menos un microARN seleccionado de miR-126, miR-210 y miR-101.
En un aspecto mas particular de la presente invencion, la disminucion del nivel de expresion de miR-127 en suero con respecto al valor control es indicativa de dano renal agudo.
En un aspecto mas particular de la presente invencion, el aumento del nivel de expresion de miR-127 en orina con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo se lleva a cabo determinando el nivel de expresion de miR-126 solo o en combinacion con al menos un microARN seleccionado de miR-127, miR-210 y miR-101.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, la disminucion del nivel de expresion de miR-126 en suero con respecto al valor control es indicativa de dano renal agudo.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo se lleva a cabo determinando el nivel de expresion del miR-210 solo o en combinacion con al menos un microARN seleccionado de miR-127, miR-126 y miR-101.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, el aumento del nivel de expresion de miR-210 en suero con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, la disminucion del nivel de expresion de miR-210 en orina con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo se lleva a cabo determinando el nivel de expresion del miR-101 solo o en combinacion con al menos un microARN seleccionado de miR-127, miR-126 y miR-210.
En un aspecto mas particular de la presente divulgacion, el aumento del nivel de expresion de miR-101 en suero con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
En la presente invencion, “dano renal agudo” se refiere al dano renal con una etiologfa isquemica que es o bien primaria o bien secundaria, como es el caso del dano renal debido a agentes toxicos o medios de radiocontraste, y en cualquier caso, excluyendo dano renal cronico.
En un aspecto mas particular de la presente invencion, la expresion de microARN se determina mediante PCR. En un aspecto mas particular, la expresion de microARN se determina mediante PCR cuantitativa. En un aspecto mas particular, la expresion de microARN se determina mediante PCR multiplex.
En otro aspecto mas particular de la presente invencion, la expresion de microARN se determina mediante micromatrices de ARN total.
En un segundo aspecto, la presente divulgacion se refiere a un kit para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo que comprende las sondas y los cebadores necesarios para llevar a cabo el metodo de la presente divulgacion.
En un aspecto particular de la presente divulgacion, el kit comprende las sondas y los cebadores necesarios para determinar el nivel de expresion de al menos un microARN seleccionado de miR-127, miR-126, miR-210 y miR-101. En otro aspecto mas particular de la presente divulgacion, el kit comprende una micromatriz de ARN.
Descripcion de las figuras
La figura 1 muestra la expresion de miR-126 en celulas proximales tubulares humanas HK-2 sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion: NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno durante 6 h (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-3, R-6, R-24 h: celulas que tras 6 h de hipoxia vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 2 muestra la expresion de miR-210 en celulas proximales tubulares humanas HK-2 sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-3, R-6, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 3 muestra la expresion de miR-101 en celulas proximales tubulares humanas HK-2 sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de ox^geno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-3, R-6, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 4 muestra la expresion de miR-127 en celulas proximales tubulares humanas HK-2 sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-3, R-6, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 5 muestra la expresion de miR-101 en celulas proximales tubulares de rata NRK-52E sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-15 min, R-30 min, R-1 h, R-3 h, R-6 h, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 6 muestra la expresion de miR-127 en celulas proximales tubulares de rata NRK-52E sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-15 min, R-30 min, R-1 h, R-3 h, R-6 h, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 7 muestra la expresion de miR-101 en celulas endoteliales humanas HMEC sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-15 min, R-30 min, R-1 h, R-3 h, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 8 muestra la expresion de miR-127 en celulas endoteliales humanas HMEC sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-15 min, R-30 min, R-1 h, R-3 h, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 9 muestra la expresion de miR-210 en celulas endoteliales humanas HMEC sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-15 min, R-30 min, R-1 h, R-3 h, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 10 muestra la expresion de miR-126 en celulas endoteliales humanas HMEC sometidas al protocolo de hipoxia/reoxigenacion. NX: celulas en condiciones normales en cuanto a disponibilidad de oxfgeno (normoxia, 21%) y a disponibilidad de nutrientes (medio completo con FBS al 10%) CC: celulas control que han padecido restriccion de nutrientes (estan en medio sin nutrientes). Hyp: celulas que han padecido restriccion de nutrientes y oxfgeno (1% de oxfgeno en medio sin nutrientes); R-15 min, R-30 min, R-1 h, R-3 h, R-24 h: celulas que vuelven a estar en condiciones normales de disponibilidad de oxfgeno y nutrientes.
La figura 11 muestra la expresion de miR-127 en suero de pacientes diagnosticados de insuficiencia renal aguda (IRA) de etiologfa isquemica. Control: expresion de miARN en control sano igualado a 1. Los datos de expresion en el paciente estan relativizados a estos datos. 0 h y 3 dfas: tiempos en los que se ha tomado una muestra del paciente, al ingresar por IRA (0 h) y mas tarde durante su evolucion (3 dfas).
La figura 12 muestra la expresion de miR-127 en orina de pacientes diagnosticados de insuficiencia renal aguda (IRA) de etiologfa isquemica. Control: expresion de miARN en control sano igualado a 1. Los datos de expresion en el paciente estan relativizados a estos datos. 0 h y 3 dfas: tiempos en los que se ha tomado una muestra del paciente, al ingresar por IRA (0 h) y mas tarde durante su evolucion (3 dfas).
La figura 13 muestra la expresion de miR-126 en suero de pacientes diagnosticados de insuficiencia renal aguda (IRA) de etiologfa isquemica. Control: expresion de miARN en control sano igualado a 1. Los datos de expresion en el paciente estan relativizados a estos datos. 0 h y 3 dfas: tiempos en los que se ha tornado una muestra del paciente, al ingresar por IRA (0 h) y mas tarde durante su evolucion (3 dfas).
La figura 14 muestra la expresion de miR-210 en suero de pacientes diagnosticados de insuficiencia renal aguda (IRA) de etiologfa isquemica. Control: expresion de miARN en control sano igualado a 1. Los datos de expresion en el paciente estan relativizados a estos datos. Dfa 0, dfa 1, dfa 2, dfa 3, dfa 7: tiempos en los que se ha tornado una muestra del paciente, al ingresar por IRA (dfa 0) y mas tarde durante su evolucion.
La figura 15 muestra la expresion de miR-210 en orina de pacientes diagnosticados de insuficiencia renal aguda (IRA) de etiologfa isquemica. Control: expresion de miARN en control sano igualado a 1. Los datos de expresion en el paciente estan relativizados a estos datos. Dfa 0, dfa 1, dfa 2, dfa 3, dfa 7: tiempos en los que se ha tomado una muestra del paciente, al ingresar por IRA (dfa 0) y mas tarde durante su evolucion.
La figura 16 muestra la expresion de miR-101 en suero de pacientes diagnosticados de insuficiencia renal aguda (IRA) de etiologfa isquemica. Control: expresion de miARN en control sano igualado a 1. Los datos de expresion en el paciente estan relativizados a estos datos. 0 dfas, 1 dfa, 2 dfas, 3 dfas, 7 dfas: tiempos en los que se ha tomado una muestra del paciente, al ingresar por IRA (0 d) y mas tarde durante su evolucion.
La figura 17 muestra la expresion de miR-101 en muestras de suero a: en pacientes pertenecientes al grupo lA, b: en pacientes pertenecientes al grupo lB y c: en pacientes pertenecientes al grupo Il.
La figura 18 muestra la expresion de mi R-127 en muestras de suero a: en pacientes pertenecientes al grupo lA, b: en pacientes pertenecientes al grupo lB y c: en pacientes pertenecientes al grupo II.
La figura 19 muestra la expresion de miR-126 en muestras de suero a: en pacientes pertenecientes al grupo lA, b: en pacientes pertenecientes al grupo lB y c: en pacientes pertenecientes al grupo II.
La figura 20 muestra la expresion de miR-210 en muestras de suero a: en pacientes pertenecientes al grupo lA, b: en pacientes pertenecientes al grupo lB y c: en pacientes pertenecientes al grupo Il.
Descripcion detallada de la invencion
Se identifico mediante el uso de matrices que los microARN: miR-127, miR-126, miR-210 y miR-101 en un modelo de H/R que imita I/R se expresaban de forma diferencial de manera que cada uno de estos microARN, solos o en combinacon, sirven como biomarcadores del dano renal.
EJEMPLO 1: Expresion de miARN en lineas celulares sometidas a hipoxia/reoxigenacion.
Se procedio al cultivo de las siguientes celulas (HK2: celulas proximales tubulares humanas, NRK-52E: celulas proximales tubulares de rata y HMEC: celulas endoteliales microvasculares humanas) en medios apropiados que conteman suero, antibioticos y factores de crecimiento espedficos. Se mantuvieron a 37°C, bajo una atmosfera humeda y con un 5% de CO2.
Las lineas celulares descritas anteriormente se sometieron a un protocolo de hipoxia/reoxigenacion. Es decir, las lineas celulares se someten a cambios en las tensiones de oxfgeno y en la disponibilidad de nutrientes. Para ello, se utilizaron dos incubadores diferentes: hipoxia en un incubador sellado a 37°C, perfundido con una mezcla del 5% de CO2, el 1% de O2, el 94% de N2; reoxigenacion, en un incubador convencional a 37°C, con el 5% de CO2. Las celulas se hicieron crecer hasta la confluencia y se privaron de suero 24 horas antes de la hipoxia. Durante la hipoxia, se mantuvieron en medio mmimo (HBSS) sin suero, con una baja concentracion de glucosa o derivados. Durante la reoxigenacion, se utilizo un medio completo (Saenz-Morales et al., 2006). El tiempo de hipoxia para todas las muestras fue de 6 h, y los tiempos de reoxigenacion fueron variables (15 min-72 h). Todos los experimentos in vitro se repitieron al menos 3 veces.
Luego se determino la expresion de diferentes microARN en las lineas celulares mediante PCR, para ello y tras la extraccion del ARN total de las muestras de fluidos (suero u orina) y para la titulacion, se utilizaron 50 nanogramos de cada una de ellos para la reaccion de transcripcion inversa (RT) en 15 microlitros. Para esta etapa se utilizaron cebadores comerciales especiales (cebadores de tallo-bucle). Estos cebadores eran espedficos para cada miARN. Tras la RT, se procedio a la reaccion de amplificacion cuantitativa (qPCR). En esta reaccion, llevada a cabo en un volumen total de 10 microlitros, se utilizo 1 microlitro de la reaccion de RT total y cebadores espedficos para cada miARN, asf como una sonda Taqman con agentes que atrapan la fluorescencia. Todos los reactivos, tanto cebadores como mezclas de reaccion con enzimas y nucleotidos para RT y PCR que se utilizaron eran de Applied Biosystems. Los resultados fueron los siguientes:
Tal como se muestra en la figura 1 los niveles de expresion de miR-126 fueron muy dependientes de la disponibilidad de nutrientes y oxfgeno, ya que la restriccion de ambos disminuyo muy significativamente su expresion con respecto a la condicion de normalidad. La expresion de miARN se recupero en el tiempo de reoxigenacion, en el que las celulas volvieron a disponer de ox^geno y nutrientes. Por tanto, la disminucion en la expresion de miR-126 indico falta de nutrientes y oxigeno en celulas proximales tubulares, lo que es indicativo de isquemia renal. Ademas, y dado que a las 3 h de la reoxigenacion se registro un dano significativo del epitelio in vitro, la baja expresion de este miARN indico dano del epitelio proximal tubular tras la isquemia.
Tal como se muestra en la figura 2, los niveles de expresion de miR-210, como miR-126, fueron muy dependientes de la disponibilidad de nutrientes y oxfgeno, ya que la restriccion de ambos disminuyo muy significativamente su expresion con respecto a la condicion de normalidad. La expresion de miARN se recupero en el tiempo de reoxigenacion, en el que las celulas volvieron a disponer de oxfgeno y nutrientes. La disminucion de miR-210 indico falta de nutrientes y oxfgeno en celulas proximales tubulares, lo que es indicativo, como en el caso de miR-126, de isquemia renal. Ademas, y dado que a las 3 h de reoxigenacion se registro dano del epitelio in vitro, la baja expresion del miR-210 indico dano del epitelio proximal tubular tras la isquemia.
Tal como muestra en la figura 3, la expresion de miR-101 aumento en la condicion de hipoxia en comparacion con la condicion de normoxia. La expresion de este miARN se normalizo gradualmente de nuevo en reoxigenacion, en la que volvio a normalizarse la disponibilidad de oxfgeno y nutrientes. El aumento de expresion de este miARN en celulas proximales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal.
Tal como muestra en la figura 4, la expresion de miR-127 aumento en la condicion de hipoxia en comparacion con la condicion de normoxia. La expresion de este miARN disminuyo significativamente en reoxigenacion, aumentando de nuevo a las 24 h de reoxigenacion cuando la monocapa epitelial esta recuperandose. Por tanto, el aumento de expresion de miR-127 en celulas proximales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal. La disminucion de su expresion tempranamente en reoxigenacion indico dano isquemico y su aumento posterior indico recuperacion endotelial.
Tal como muestra en la figura 5, la expresion de miR-101 se normalizo rapidamente en reoxigenacion, en la que volvio a normalizarse la disponibilidad de oxfgeno y nutrientes, si bien permanecio con niveles de expresion mas elevados que en la condicion de normoxia en estas celulas de rata. El aumento de expresion de este miARN en celulas proximales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal. Su nuevo aumento a las 24 h de reoxigenacion indico recuperacion de la monocapa epitelial.
Tal como se muestra en la figura 6 y tal como se produjo en celulas Hk-2 (tubulares humanas), la expresion de miR-127 aumento en la condicion de hipoxia, en la que esta restringida la disponibilidad de nutrientes y de oxfgeno, en comparacion con la condicion de normoxia. La expresion de este miARN se normalizo rapidamente en reoxigenacion, en la que volvieron a estar disponibles el oxfgeno y los nutrientes. El aumento de expresion de este miARN en celulas proximales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal.
Tal como se muestra en la figura 7 y tal como se produjo en celulas proximales tubulares, la expresion de miR-101 aumento en la condicion de hipoxia en comparacion con la condicion de normoxia. La expresion de este miARN permanecio elevada en reoxigenacion, en la que volvieron a normalizarse la disponibilidad de oxfgeno y nutrientes, y comenzo a normalizarse a las 24 h de reoxigenacion. El aumento de expresion de este miARN en celulas endoteliales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal. Su elevada expresion en reoxigenacion se asocio a un estado de activacion endotelial (proinflamatorio), que comenzo a normalizarse a las 24 h.
Tal como se muestra en la figura 8 y tal como se produjo en celulas proximales tubulares, la expresion de miR-127 aumento en la condicion de hipoxia, en la que estaba restringida la disponibilidad de nutrientes y de oxfgeno, en comparacion con la condicion de normoxia. La expresion de este miARN permanecio elevada en reoxigenacion, en la que se dispuso de oxfgeno y nutrientes, y comenzo a normalizarse a las 24 h de reoxigenacion. El aumento de expresion de este miARN en celulas endoteliales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal. Su elevada expresion en reoxigenacion se asocio a un estado de activacion endotelial (proinflamatorio), que comenzo a normalizarse a las 24 h.
Como se muestra en la figura 9 y a diferencia de lo que se produjo con este miARN en celulas proximales tubulares, la expresion de miR-210 aumento discretamente en la condicion de hipoxia en comparacion con la condicion de normoxia. La expresion de este miARN permanecio elevada en reoxigenacion y la expresion disminuyo bruscamente a las 24 h de reoxigenacion. El aumento de expresion de este miARN en celulas endoteliales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal. Como miR-127 y miR-1 01, su expresion en reoxigenacion se asocio a un estado de activacion endotelial (proinflamatorio), que comenzo a normalizarse a las 24 h.
Tal como se muestra en la figura 10, la expresion de miR-126 aumento discretamente en la condicion de hipoxia, en la que esta restringida la disponibilidad de nutrientes y de oxfgeno, en comparacion con la condicion de normoxia. Aumento muy significativamente a 1 h de reoxigenacion, en la que se dispuso de oxfgeno y nutrientes. Tras ello, la expresion de este miARN se normalizo. El aumento de expresion de este miARN en celulas endoteliales durante la condicion de hipoxia fue indicativo de isquemia renal. Un aumento significativo de este tipo a 1 h de reoxigenacion se asocio de manera inequvoca a un estado maximo de activacion endotelial (proinflamatorio).
EJEMPLO 2: Expresion de miARN en pacientes a los que se les ha diagnosticado insuficiencia renal aguda.
El estudio con muestras de pacientes se llevo a cabo de manera prospectiva. Tras la autorizacion por parte de los pacientes o sus representantes legales mediante el pertinente consentimiento informado y previa aprobacion del estudio por el Comite Etico de Investigacion Clmica del Hospital, se extrajeron muestras de sangre y orina y biopsias renales en caso de trasplante de los grupos de pacientes descritos a continuacion.
Muestras de pacientes de trasplante renal
Se analizaron muestras procedentes de 50 pacientes de trasplante (pacientes con trasplante renal de novo y con diferentes regfmenes de inmunosupresion), estando dichos pacientes organizados en dos grupos:
I. 25 pacientes con funcion inmediata del injerto
II. 25 pacientes con funcion retrasada del injerto
Se tomaron muestras de sangre y orina los dfas 1, 7, 15, 30 tras el trasplante renal, y se determino en las mismas la expresion de los miARN que iban a estudiarse mediante qRT-PCR.
En caso de no funcion del injerto, se realizo una biopsia el septimo dfa, que se repitio cada 7-10 dfas hasta que se resolvio la fase de NTA. En caso de sospecha de rechazo y tras su confirmacion por biopsia, estos pacientes se excluyeron.
En el caso de pacientes trasplantados, se recogio la siguiente informacion y se puso a disposicion:
- Caractensticas del receptor: edad, sexo y tiempo en dialisis.
- Caractensticas del donante: tipo de donante (muerte encefalica, asistolia), edad, sexo, necesidad de farmacos vasoactivos y ultima creatinina.
- Caractensticas del injerto: tiempos de isquemia caliente, fna y de anastomosis. Compatibilidad de HLA e inmunosupresion.
- Funcion del injerto a las 2, 4 y 12 semanas.
Se recogieron muestras de sangre en tubos VACUETTE (z serum sep clot activator) de 8 ml, que se centrifugaron a 2.500 rpm 10 minutos.
Se recogio el suero separado por centrifugacion y se alicuoto y almaceno conforme a los criterios del Biobanco del Hospital Ramon y Cajal (en tubos anonimos, con un unico codigo y a -80°C).
Se recogieron muestras de orina en viales de orina convencionales o extrajeron de la bolsa del cateter, se centrifugaron a 2.800 rpm durante 10 min para eliminar sedimentos y otros restos, y se alfcuotaron y almacenaron conforme a los criterios del Biobanco del Hospital Ramon y Cajal (en tubos anonimos, con un unico codigo y a -80°C).
De todas ellas se solicito su cesion por parte del Biobanco mediante acuerdos de cesion. Se solicitaron un maximo de 500 microlitros, ya que la tecnica se optimizo para amplificar miARN en muestras de 100-200 microlitros de ambos fluidos, mediante PCR cuantitativa, para cuyo fin y tras la extraccion del ARN total de las muestras de fluidos (suero u orina) y para la titulacion, se utilizaron 50 nanogramos de cada una de ellas para la reaccion de transcripcion inversa (RT) en 15 microlitros. Para esta etapa se utilizaron cebadores comerciales especiales (cebadores de tallo-bucle). Estos cebadores eran espedficos para cada miARN. Tras la RT, se procedio a la reaccion de amplificacion cuantitativa (qPCR). En esta reaccion que se llevo a cabo en un volumen total de 10 microlitros, se utilizo 1 microlitro de la reaccion de RT total y cebadores espedficos para cada miARN, asf como una sonda Taqman con agentes que atrapan de fluorescencia. Todos los reactivos, tanto cebadores como mezclas de reaccion con enzimas y nucleotidos para RT y PCR que se utilizaron eran de Applied Biosystems.
El procesamiento de las muestras de suero y orina de los pacientes anterior a la extraccion de ARN total fue el siguiente: se digirio una alfcuota de 100-200 microlitros de suero u orina con Proteinasa K (0,65 miligramos/mililitro) incubando a 56°C, 1 h. Tras ello se realizo una primera extraccion con fenol/cloroformo (5:1) y la fase acuosa se proceso utilizando el kit de aislamiento de miARN High Pure (Roche), siguiendo las indicaciones del fabricante. Muestras de pacientes tras cirugfa cardiaca:
Se analizaron muestras procedentes de 50 pacientes, estando organizados dichos en los siguientes grupos: - lA: 10 pacientes adultos operados tal como se programo con circulacion extracorporea (CEC) y con bajo riesgo para el desarrollo de IRA, es decir, pacientes con una puntuacion de 0 a 2 en el sistema de Thakar5 o de 0 a 1 en el SRI6 simplificado.
- lB: 10 pacientes pediatricos con cardiopatfas congenitas operados por primera vez con CEC.
-II: 15 pacientes adultos operados tal como se programo con CEC, con funcion renal basal alterada y puntuaciones >5 en el sistema de Thakar5 o > 3 en el SRI6.
-III: 15 pacientes adultos operados tal como se programo con CEC, con funcion renal basal normal y con las mismas puntuaciones que en el apartado anterior.
Para cada paciente, se determinaron los miARN mencionados en los siguientes momentos:
- Basal preoperatorio
-A las 2 h del ingreso en la UCI
- A las 24 h, 48 h y 72 h de la cirugfa
- El dfa 7 (opcional para los grupos lA y lB)
Tal como se muestra en la figura 11, la expresion de miR-127 disminuyo significativamente con respecto al control sano. La disminucion en la expresion de este miARN en el suero de pacientes era un indicador de dano renal isquemico o IRA. Estos datos se correlacionan con los datos mostrados en la figura 18.
Tal como se muestra en la figura 12, y en correlacion con la disminucion en suero, la expresion de miR-127 aumento significativamente con respecto al control sano. La disminucion en la expresion de este miARN en el suero de pacientes y su correspondiente aumento en orina era un indicador de diagnostico temprano de dano renal isquemico o IRA.
Tal como se muestra en la figura 13, los niveles de expresion de miR-126 en suero disminuyeron significativamente en el momento del inicio del dano renal isquemico y la expresion del mismo aumento enormemente a las 24 h, para normalizarse posteriormente. Esto indico que la disminucion en la expresion de este miARN en el suero de pacientes era un indicador de diagnostico muy temprano de dano renal isquemico o IRA. Su aumento a las 24 h indico una activacion endotelial tras la isquemia asociada a una reaccion inflamatoria posterior, tal como se comento en el modelo in vitro. Estos datos se correlacionan con los datos mostrados en la figura 19.
Tal como se muestra en la figura 14, la expresion de miR-210 en suero aumento significativamente en el momento del inicio del dano renal isquemico, se mantuvo en las primeras 24 h, para normalizarse posteriormente. Estos datos indicaron que el aumento en la expresion de este miARN en el suero de pacientes era un marcador diagnostico muy temprano de dano renal isquemico o IRA.
Tal como se observa en la figura 15, la expresion de miR-210 en orina aumento significativamente a las 48 h, para normalizarse posteriormente. Teniendo en cuenta que la expresion de este miARN aumento en celulas HK-2 a tiempos en los que empezo a observarse recuperacion epitelial en el modelo experimental, esto indico que el aumento en la expresion de este miARN a las 48 h en orina de pacientes era indicativo del inicio de la recuperacion tras el dano renal isquemico. Estos datos se correlacionan con los datos mostrados en la figura 20.
Tal como se muestra en la figura 16, la expresion de miR-101 aumento muy significativamente y muy tempranamente con respecto al control sano, en el momento del ingreso, y no se detecto expresion significativa con respecto al sujeto sano en el momento de la evolucion. Esto indico que un aumento en la expresion de este miARN en el suero de pacientes era un marcador de diagnostico muy temprano de dano renal isquemico. Estos datos se correlacionan con los datos mostrados en la figura 17.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo que comprende analizar una muestra obtenida de un paciente seleccionada de sangre o suero, para determinar el nivel de expresion de al menos miR-127, y comparar dicho nivel de expresion con un valor control, en el que la disminucion en el nivel de expresion de miR-127 en suero con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
2. Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo segun la reivindicacion 1, en el que comprende ademas determinar el nivel de expresion de miR-126, en el que la disminucion en el nivel de expresion de miR-126 con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
3. Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que comprende ademas determinar el nivel de expresion de al menos un microARN seleccionado de miR-210 y miR-101, en el que el aumento en el nivel de expresion de miR-210 y/o miR-101 con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
4. Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo segun la reivindicacion 1, en el que comprende ademas determinar el nivel de expresion de miR-126, miR-210 y miR-101, en el que el aumento en el nivel de expresion de miR-210 y miR-101 con respecto al valor control y la disminucion en el nivel de expresion de miR-126 con respecto al valor control es indicativo de dano renal agudo.
5. Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la expresion de microARN se determina mediante PCR.
6. Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la expresion de microARN se determina mediante PCR cuantitativa.
7. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el nivel de expresion de microARN se determina mediante micromatrices de ARN.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2484779A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-08 Medizinische Hochschule Hannover Device and method for analysis of kidney failure
ES2432853B1 (es) * 2011-12-15 2015-03-09 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario Ramón Y Cajal Metodo para el diagnostico y/o pronostico de dano renal agudo
RU2587012C1 (ru) * 2014-10-31 2016-06-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный университет" Способ прогнозирования острого повреждения почек у больных острым коронарным синдромом
RU2583950C1 (ru) * 2015-05-13 2016-05-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ прогнозирования развития острого повреждения почки в условиях тепловой ишемии в эксперименте в зависимости от возраста и пола животных
RU2639465C2 (ru) * 2016-02-24 2017-12-21 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" Способ прогнозирования острого повреждения почек у больных острым коронарным синдромом
WO2018033454A1 (en) * 2016-08-19 2018-02-22 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario Ramón Y Cajal Mir-127 agents for use in the treatment of renal fibrosis
EP3523433B1 (en) 2016-10-04 2024-05-08 Vib Vzw Means and methods to treat inflammatory diseases
RU2666911C2 (ru) * 2016-11-24 2018-09-13 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") Способ для прогнозирования метастазирования рака яичников на основе группы генов микроРНК
TWI646199B (zh) * 2017-10-23 2019-01-01 長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院 用於預測一帶有急性心肌梗塞的人類個體發展出急性腎損傷之風險的方法
RU2702023C1 (ru) * 2018-08-17 2019-10-04 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики острого повреждения почек после органосохраняющего хирургического лечения локализованного рака почки
EP3862438A4 (en) * 2018-10-04 2022-08-03 Jichi Medical University FOR ACUTE KIDNEY FAILURE SPECIFIC BIOMARKER, METHODS FOR DIAGNOSIS OF ACUTE KIDNEY FAILURE, TEST KIT FOR ACUTE KIDNEY FAILURE, ANIMAL TREATMENT PROCEDURES AND MEDICATION FOR ACUTE KIDNEY FAILURE
RU2703399C1 (ru) * 2018-11-02 2019-10-16 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" (ФГБНУ "НИИОПП") Способ для диагностики рака яичников на основе группы генов микроРНК
RU2724017C1 (ru) * 2019-05-17 2020-06-18 федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ульяновский государственный университет" Способ прогнозирования острого повреждения почек у больных острым коронарным синдромом с использованием шкалы риска
EP3929308A1 (en) 2020-06-23 2021-12-29 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Diagnostic methods on renal recovery in individuals suffering from acute kidney injury and suitable biomarkers therefor

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7575863B2 (en) * 2004-05-28 2009-08-18 Applied Biosystems, Llc Methods, compositions, and kits comprising linker probes for quantifying polynucleotides
RU2270605C1 (ru) * 2004-06-18 2006-02-27 Государственное учреждение научный центр здоровья детей РАМН (ГУ НЦЗД РАМН) Способ оценки жизнеспособности почечной паренхимы
US7833732B2 (en) * 2005-07-21 2010-11-16 The John Hopkins University Acute renal injury
US20110059537A1 (en) * 2007-09-20 2011-03-10 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for estimating risk of acute kidney injury

Also Published As

Publication number Publication date
AU2010291137A1 (en) 2012-03-15
IN2012DN01910A (es) 2015-07-24
MX2012002333A (es) 2012-06-12
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EP3029156A3 (en) 2016-09-14
WO2011027019A3 (es) 2011-04-28
ES2363661B2 (es) 2012-05-30
WO2011027019A2 (es) 2011-03-10
RU2012106742A (ru) 2013-10-10
US20120172248A1 (en) 2012-07-05
JP2013503617A (ja) 2013-02-04
CA2773054A1 (en) 2011-03-10
RU2629591C2 (ru) 2017-08-30
EP3029156A2 (en) 2016-06-08
CN102575294A (zh) 2012-07-11
EP3029156B1 (en) 2018-11-07
EP2474622A4 (en) 2013-03-06
EP2474622A1 (en) 2012-07-11
JP5801809B2 (ja) 2015-10-28
ES2363661A1 (es) 2011-08-11

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