ES2893002T3 - Consorcio microbiano que comprende clostridia para la producción de 1,3-propanodiol a partir de glicerol - Google Patents

Abstract

Consorcio microbiano que comprende por lo menos una cepa de Clostridium acetobutylicum, por lo menos una cepa de Clostridium sporogenes y por lo menos una cepa de Clostridium sphenoides.

Description

DESCRIPCIÓN

Consorcio microbiano que comprende clostridia para la producción de 1,3-propanodiol a partir de glicerol

La presente invención se refiere a un consorcio microbiano, adaptado especialmente para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial. Más en particular, este consorcio microbiano comprende por lo menos una cepa de Clostridium acetobutylicum, por lo menos una cepa de Clostridium sporogenes y por lo menos una cepa de Clostridium sphenoides. La invención también se refiere a un procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol mediante el cultivo de este consorcio microbiano dando como resultado un cocultivo de estos microorganismos particulares diferentes.

Antecedentes de la invención

El 1,3-propanodiol (PDO), también denominado trimetilenglicol o propilenglicol, es uno de los productos de fermentación más antiguos que se conocen. Lo identificó originalmente ya en 1881 por August Freund en un cultivo fermentado de glicerina que contenía Clostridium pasteurianum. El PDO es un producto típico de la fermentación de glicerina y se ha encontrado en conversiones anaerobias de otros sustratos orgánicos. Solo pueden formarlo muy pocos organismos, todos ellos bacterias. Incluyen enterobacterias de los géneros Klebsiella (K. pneumoniae), Enterobacter (E. agglomerans) y Citrobacter (C. freunddi), Lactobacilli (L. brevis y L. buchneri) y Clostridia de los grupos C. butyricum y C. pasteurianum.

El PDO, como compuesto orgánico bifuncional, puede utilizarse potencialmente para muchas reacciones de síntesis, en particular como monómero para policondensaciones para producir poliésteres, poliéteres, poliuretanos, y en particular, poli(tereftalato de trimetileno) (PTT). Estas características de estructura y reactividad conducen a varias aplicaciones en cosmética, productos textiles (fibras de prendas de vestir o pavimentos) o plásticos (industria del automóvil y embalaje o recubrimiento).

El PDO puede producirse mediante diferentes rutas químicas, pero generan corrientes de residuos que contienen sustancias extremadamente contaminantes y el coste de producción es alto. Por tanto, el PDO producido químicamente no puede competir con los dioles disponibles petroquímicamente como 1,2-etanodiol, 1,2-propanodiol y 1,4-butanodiol. Para aumentar esta competitividad, en 1995, DuPont comenzó un programa de investigación para la conversión biológica de la glucosa en PDO. Aunque este procedimiento es respetuoso con el medio ambiente, presenta la desventaja de i) utilizar vitamina B12, un cofactor muy caro, y ii) ser un procedimiento discontinuo debido a la inestabilidad de la cepa productora.

Debido a la disponibilidad de grandes cantidades de glicerol producidas por la industria del biodiésel, por el contrario sería ventajoso un procedimiento continuo, libre de vitamina B12, con un rendimiento de carbono superior.

Se conoce en la técnica que el PDO puede producirse a partir de glicerina, un subproducto no deseado en particular de la producción de biodiesel que contiene aproximadamente el 80-85% de glicerol mezclado con sales y agua.

Se describió previamente que C. butyricum podía crecer y producir PDO a partir de glicerol contenido en glicerina industrial en fermentación continua en dos fases y discontinua (Papanikolaou et al., 2000). Sin embargo, a la concentración más alta de glicerol, el título máximo de PDO obtenido fue de 48.1 g.l-1 a la tasa de dilución de 0.02 h-1, lo que significa una productividad de 0.96 g.M.h'1. Los cultivos se realizaron con una concentración máxima de glicerol que se origina a partir de glicerina en el medio alimentado de 90 g.l-1 y en presencia de extracto de levadura, un compuesto costoso que contiene nitrógeno orgánico que conoce el experto en la materia para ayudar a aumentar la producción de biomasa bacteriana.

La solicitud WO 2006/128381 divulga la utilización de este glicerol para la producción de PDO con cultivos discontinuos y semicontinuos utilizando organismos productores de PDO naturales tales como Klebsiella pneumoniae, C. butyricum o C. pasteurianum. Además, el medio utilizado en el documento WO 2006/128381 también contiene extracto de levadura. Tal como se describe en esta solicitud de patente, la productividad máxima alcanzada estaba comprendida entre 0.8 y 1.1 g.M.h'1.

La capacidad de una cepa de C. acetobutylicum modificada para contener la glicerina-deshidratasa independiente de vitamina B12 y la PDO-deshidrogenasa de C. butyricum, denominada cepa de “C. acetobutylicum DG1 pSPD5” se ha descrito en González-Pajuelo et al., 2005. Esta cepa originalmente crece y produce PDO en un medio alimentado que contiene hasta 120 g.l-1 de glicerol puro. Además, los análisis en un medio alimentado que contiene un máximo de 60 g.l-1 de glicerol puro o glicerol contenido en glicerina industrial no señalaron ninguna diferencia. Estos resultados se han obtenido en presencia de extracto de levadura. Además, no se realizó ninguna prueba con concentraciones de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial superiores a 60 g.l-1. Cuando se comparó C. butyricum de tipo natural con el microorganismo modificado “C. acetobutylicum DG1 pSPD5”, se observó un comportamiento globalmente similar.

En la solicitud de patente WO 2010/128070, los inventores describieron un procedimiento para adaptar la cepa de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 tal como se describe en González-Pajuelo et al. (2005) a crecer en un medio con una alta concentración de glicerol contenido en glicerina industrial y sin extracto de levadura. La población resultante de cepas adaptadas de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 podía producir PDO en un medio que contenía hasta 120 g.l-1 de glicerol contenido en glicerina industrial con un título de hasta 53.5 g.l-1 de PDO, un rendimiento de hasta 0.53 g.g-1 y una productividad de hasta 2.86 g.l-1.h-1. En la solicitud de patente WO 2012/062832, los inventores describieron el aislamiento de un clon de otra población de cepas adaptadas de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 obtenidas mediante el mismo procedimiento que el descrito en la solicitud de patente WO 2010/128070. Esta segunda población podía producir PDO en medio que contenía alrededor de 105 g.l-1 de glicerol contenido en glicerina industrial con un título de hasta 50.45 g/l-1 de PDO, un rendimiento de hasta 0.53 g.g-1 y una productividad de hasta 3.18 g.l-1.h-1, mientras que el clon aislado podía producir PDO en medio que contenía alrededor de 105 g.l-1 de glicerol contenido en glicerina industrial con un título de hasta 51.30 g/l-1 de PDO, un rendimiento de hasta 0.50 g.g-1 y una productividad de hasta 3.05 g.l-1.h-1.

Se ha descrito previamente un procedimiento de producción de un diol diferente, (D)-1,2-propanodiol a partir de cultivos puros de C. sphenoides en condiciones limitantes de fosfato con glucosa como fuente de carbono (Tran-Din y Gottschalk, 1985). Se ha descrito previamente la producción de un biocombustible de alta energía que comprende butanol y etanol a través de la fermentación de cultivos puros de C. sporogenes en unos medios de cultivo que comprenden jugo de caña o almidón hidrolizado procedente de harina de maíz y 20.l-1 de glicerol (documento WO 2010/046928). Se ha descrito previamente la fermentación utilizando cultivos mixtos que comprenden una combinación de especies clostridiales que incluyen por ejemplo C. acetobutylicum y C. sporogenes en el contexto de la producción de hidrógeno (Quéméneur et al., 2011).

En la presente solicitud de patente, los inventores han observado que un cocultivo de la población de cepas adaptadas de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 con diferentes microorganismos, un denominado consorcio microbiano, proporciona una producción mejorada de PDO con un título superior de PDO, un mejor rendimiento y menos glicerol residual en comparación con las capacidades de la población de cepas adaptadas de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 sin consorcio microbiano. En particular, este consorcio microbiano puede producir PDO a este nivel mejorado en presencia de una alta concentración de glicerol contenido en glicerina industrial (hasta 105 g.l-1 de glicerol procedente de glicerina industrial). Por tanto, la utilización del cocultivo de la invención permite una mejor producción de PDO, pero también un procedimiento de purificación más fácil, dado que el glicerol residual disminuye con el cocultivo en comparación con las cepas adaptadas de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 solas, sin consorcio microbiano.

Sumario de la invención

La presente invención se describe en las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos expuestos en la presente memoria son solo para información.

Breve descripción

La presente invención se refiere a un consorcio microbiano que comprende por lo menos una cepa de Clostridium acetobutylicum, por lo menos una cepa de Clostridium sporogenes, y por lo menos una cepa de Clostridium sphenoides.

En particular, el consorcio microbiano según la presente invención comprende por lo menos el 85% de C. acetobutylicum, menos del 0.2% de C. sporogenes y preferentemente entre el 0.001% y el 0.2% de C. sporogenes, y menos del 15% de C. sphenoides y preferentemente entre el 0.1% y el 15% de C. sphenoides.

En una forma de realización particular de la invención, en el consorcio microbiano según la presente invención, la cepa de C. acetobutylicum se adapta para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial.

El consorcio microbiano de la invención que comprende por lo menos una cepa de C. acetobutylicum, por lo menos una cepa de C. sporogenes y por lo menos una cepa de C. sphenoides, puede denominarse un cocultivo, y en estos casos el cocultivo comprende preferentemente una cepa de C. acetobutylicum que se adapta previamente para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol contenido en glicerina industrial.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol, que comprende cultivar el consorcio microbiano según la invención en un medio de cultivo que comprende glicerol como única fuente de carbono, y recuperar el 1,3-propanodiol producido a partir del medio de cultivo.

Además, la presente invención se refiere a la utilización de por lo menos una cepa de C. sporogenes y por lo menos una cepa de C. sphenoides para mejorar la producción de 1,3-propanodiol, más particularmente para mejorar el rendimiento y el título de PDO, a partir de un procedimiento fermentativo mediante el cocultivo con por lo menos una cepa de C. acetobutylicum en un medio de cultivo que contiene una alta concentración de glicerol como única fuente de carbono.

En particular, la por lo menos una cepa de C. sporogenes y por lo menos una cepa de C. sphenoides se utilizan como cocultivo en un procedimiento fermentativo para la producción de PDO con por lo menos una cepa de C. acetobutylicum que ya está adaptada para el crecimiento y la producción de PDO en un medio de cultivo que contiene una alta concentración de glicerol como única fuente de carbono.

Descripción detallada

Los términos “consorcio microbiano” o “cocultivo” se utilizan indistintamente para indicar la utilización de dos o más especies microbianas en el procedimiento de fermentación.

En un primer aspecto, la presente exposición se refiere a un consorcio microbiano que comprende por lo menos una cepa de C. acetobutylicum y por lo menos una cepa elegida de entre cepas de C. sporogenes y/o cepas de C. sphenoides.

El consorcio microbiano proporcionado en la presente memoria es una combinación de varias cepas de Clostridia, la mayoría de las cuales pertenecen a la especie Clostridium acetobutylicum.

Ventajosamente, el consorcio microbiano de la invención comprende por lo menos una cepa de C. acetobutylicum, por lo menos una cepa de C. sporogenes y por lo menos una cepa de C. sphenoides.

En particular, el consorcio microbiano según la presente invención comprende por lo menos el 85% de C. acetobutylicum, entre el 0.001% y el 0.2% de C. sporogenes, y entre el 0.1% y el 15% de C. sphenoides considerando que la totalidad de las células contenidas en el cultivo corresponde al 100%.

En una forma de realización preferida, el consorcio microbiano comprende entre el 85% y el 99.8% de C. acetobutylicum, entre el 0.001% y el 0.15% de C. sporogenes y entre el 0.2% y el 15% de C. sphenoides.

En una forma de realización más preferida, el consorcio microbiano comprende entre el 90% y el 99.8% de C. acetobutylicum, entre el 0.002% y el 0.13% de C. sporogenes y entre el 0.2% y el 10% de C. sphenoides.

En un aspecto, el consorcio microbiano divulgado en la presente memoria consiste en por lo menos una cepa de C. acetobutylicum y por lo menos una cepa de C. sphenoides. El consorcio microbiano de la invención consiste en por lo menos una cepa de C. acetobutylicum, por lo menos una cepa de C. sphenoides y por lo menos una cepa de C. sporogenes. Según estas formas de realización específicas, los porcentajes respectivos de cada uno de los Clostridia mencionados anteriormente también se aplican cambiando lo que corresponda.

En una forma de realización ventajosa, el consorcio microbiano según la presente invención es útil para y permite la producción de 1,3-propanodiol cuando se cultiva en un medio de cultivo apropiado con alto contenido de glicerol. Por tanto, en una forma de realización específica, en el consorcio microbiano de la presente invención, la cepa de C. acetobutylicum se adapta para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol contenido en glicerina industrial.

Un “C. acetobutylicum adaptado”, “C. acetobutylicum previamente adaptado” o “C. acetobutylicum que está adaptándose” significa un C. acetobutylicum que se modifica para poder crecer en una alta concentración de glicerina industrial.

Se conocen en la técnica procedimientos para dirigir el metabolismo de glicerol hacia la producción de 1,3-propanodiol (véase por ejemplo el documento WO 2006/128381, González-Pajuelo et al. 2006).

Por ejemplo, la cepa de C. acetobutylicum puede adaptarse para crecer en un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial mediante un procedimiento de cultivo de presión de selección tal como se divulga en la solicitud de patente WO 2010/128070.

Además, como ejemplo, se conocen en la técnica y se divulgan cepas de C. acetobutylicum modificadas genéticamente para la producción de 1,3-propanodiol a partir de glicerol como única fuente de carbono, particularmente en las solicitudes WO 2001/04324 y WO 2010/128070.

La expresión “modificada genéticamente” significa que la cepa se ha transformado con el objetivo de cambiar sus características genéticas. Los genes endógenos pueden atenuarse, delecionarse o sobreexpresarse, o preferentemente los genes exógenos pueden introducirse, transportarse por un plásmido o integrarse en el genoma de la cepa para expresarse en la célula.

El término “plásmido” o “vector”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un elemento cromosómico adicional que a menudo porta genes que no forman parte del metabolismo central de la célula, y habitualmente está en forma de moléculas circulares de ADN bicatenario.

Puede utilizarse cualquier técnica convencional de mutagénesis y/o sustitución génica en Clostridium, tal como se divulga en la solicitud WO 2008/040387, para adaptar la cepa de C. acetobutylicum para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial.

La adaptación de la cepa de C. acetobutylicum se lleva a cabo preferentemente mediante un procedimiento continuo anaerobio que es una técnica bien conocida por el experto en la materia. Entre los detalles de este procedimiento conocido por los expertos en la materia puede mencionarse, por ejemplo, que el medio alimentado se añade al fermentador de manera continua y se retira simultáneamente del sistema una cantidad equivalente de disolución nutritiva convertida con microorganismos. La tasa de intercambio de nutrientes se expresa como la tasa de dilución. Por tanto, la tasa de dilución se aplica al medio de cultivo, tiene en cuenta la tasa de crecimiento máxima del microorganismo e influye en la tasa de ingesta y retirada del medio.

El procedimiento continuo para la adaptación de la cepa de C. acetobutylicum se lleva a cabo preferentemente en condiciones aerobias.

El experto en la materia sabe cómo gestionar cada una de estas condiciones experimentales y definir las condiciones de cultivo para las cepas de Clostridia utilizadas según la invención. En particular, las cepas de Clostridia se fermentan a una temperatura de entre 20°C y 60°C, preferentemente de entre 25°C y 40°C para C. acetobutylicum.

En una forma de realización preferida, en el consorcio microbiano de la invención, la cepa de C. acetobutylicum se adapta previamente, de manera preferible mediante un procedimiento continuo anaerobio, para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol que presenta un flujo aumentado de producción de 1,3-propanodiol mediante la introducción de copias adicionales del operón 1,3-propanodiol procedente de C. butyricum que codifica para enzimas implicadas en la ruta del 1,3-propanodiol independiente de la vitamina B12. En particular, el operón 1,3-propanodiol procedente de C. butyricum o bien se sobreexpresa mediante un plásmido o bien se integra en el cromosoma de la cepa de C. acetobutylicum que va a adaptarse. Por ejemplo, puede utilizarse el plásmido pSPD5 para la sobreexpresión del operón 1,3-propanodiol (González-Pajuelo et al., 2006).

En una forma de realización ventajosa, en el consorcio microbiano de la invención, la cepa de C. acetobutylicum se adapta previamente para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol durante un procedimiento de cultivo continuo en el que el medio alimentado contiene una concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial comprendida entre 90 y 120 g/l, y de manera preferible de aproximadamente 105 g/l.

Dicha “adaptación” del microorganismo productor se obtiene cultivando el microorganismo en un medio de cultivo que comprende un alto contenido de glicerina industrial a una tasa de dilución baja, y seleccionando el microorganismo adaptado que puede crecer en el medio de cultivo que presenta una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial.

Para este fin, la cepa de C. acetobutylicum se cultiva ventajosamente a una tasa de dilución baja a lo largo de un periodo que oscila entre 24 horas y 10 días, preferentemente más de 2 días, de manera más preferible aproximadamente 8 días.

La tasa de dilución está comprendida generalmente entre 0.005 y 0.1 h-1, preferentemente entre 0.005 y 0.02 h-1. La tasa de dilución puede cambiarse durante el procedimiento de adaptación, eventualmente con una primera etapa comprendida entre 0.005 y 0.02 Ir1 y una segunda etapa en la que la tasa de dilución se aumenta hasta 0.1 h-1, más preferentemente 0.07 h-1. Cuando la tasa de dilución se modifica durante el procedimiento de adaptación, las tasas de dilución de entre 0.005 y 0.02 h'1 se denominan “tasas de dilución bajas” mientras que las tasas de dilución de entre 0.02 y 0.1 h’1 son tasas de dilución comunes.

En una forma de realización específica de la invención, la cepa de C. acetobutylicum que va a adaptarse se cultiva en cultivo continuo utilizando un medio alimentado que contiene entre 90 y 120 g/l de glicerol y de manera preferible aproximadamente 105 g.l-1 de glicerol sin procesar, a una tasa de dilución baja comprendida entre 0.005 y 0.02 h-1, preferentemente 0.02 h-1. A lo largo de un periodo máximo de 10 días, preferentemente de entre 5 y 8 días, la cepa de C. acetobutylicum se adapta a la alta concentración de glicerina presente en el medio alimentado, y la tasa de dilución puede aumentarse hasta 0.1 h-1, preferentemente hasta 0.07 h-1.

Preferentemente, la cepa de C. acetobutylicum se adapta previamente mediante el procedimiento descrito en los documentos WO 2010/128070 y WO 2012/062832.

El consorcio microbiano descrito en la presente memoria comprende por lo menos una cepa de C. acetobutylicum y por lo menos una cepa de C. sporogenes, o comprende por lo menos una cepa de C. acetobutylicum y por lo menos una cepa de C. sphenoides, pudiendo denominarse el consorcio microbiano como cocultivo, y en estos casos el cocultivo comprende preferentemente una cepa de C. acetobutylicum que se adapta previamente para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol contenido en glicerina industrial. Todas las formas de realización preferidas relativas a la cepa de C. acetobutylicum adaptada para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerina y específicamente con una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial mencionada anteriormente también se aplican cambiado lo que corresponda a este aspecto específico.

En la presente memoria también se describe un cocultivo que comprende o que consiste en por lo menos una cepa de C. acetobutylicum y por lo menos una cepa de C. sporogenes o un cocultivo que comprende o que consiste en por lo menos una cepa de C. acetobutylicum y por lo menos una cepa de C. sphenoides, incluyendo todos los aspectos preferidos descritos anteriormente.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol en un procedimiento de fermentación continua de glicerol, que comprende cultivar un consorcio microbiano según la invención en un medio alimentado que comprende glicerol como única fuente de carbono, y recuperar el 1,3-propanodiol producido a partir del medio de cultivo.

Un “medio de cultivo apropiado” o un “medio de cultivo” se refiere a un medio de cultivo optimizado para el crecimiento y la producción de diol de las cepas de Clostridium. El procedimiento de fermentación generalmente se realiza en reactores con un medio de cultivo sintético, en particular inorgánico, de composición definida conocida adaptada a la especie de Clostridium utilizada y que contiene glicerina.

El término “glicerina” se refiere a la disolución que contiene la molécula de glicerol.

En particular, se añade glicerol al medio de cultivo en forma de una composición de glicerina que comprende por lo menos el 50% de glicerol, preferentemente por lo menos el 85% de glicerol.

Ventajosamente, la glicerina utilizada en el medio de cultivo de la invención es glicerina industrial. “Glicerina industrial” significa un producto de glicerina obtenido a partir de un procedimiento industrial sin purificación sustancial. La glicerina industrial también puede designarse “glicerina sin procesar”. La glicerina industrial comprende más del 70% glicerol, preferentemente más del 80%, agua e impurezas tales como metanol, sales minerales o ácidos grasos. El contenido máximo de glicerol en la glicerina industrial es generalmente del 90%, más generalmente de alrededor del 85%.

Los procedimientos industriales a partir de los cuales se obtiene la glicerina industrial son, entre otros, procedimientos de fabricación en los que se procesan grasas y aceites, particularmente grasas y aceites de origen vegetal o grasas y aceites de origen animal o aceites de cocina utilizados, para dar productos industriales tales como detergentes o lubricantes. En tales procedimientos de fabricación, la glicerina industrial se considera un subproducto.

En una forma de realización, el glicerol utilizado en el procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol se proporciona por la glicerina industrial.

En una forma de realización particular, la glicerina industrial es un subproducto de la producción de biodiesel y comprende impurezas conocidas de glicerina obtenida de la producción de biodiesel, que comprenden aproximadamente entre el 80 y el 85% de glicerol con sales, metanol, agua y algunos otros compuestos orgánicos tales como ácidos grasos. La glicerina industrial obtenida a partir de la producción de biodiesel puede someterse adicionalmente a una etapa de acidificación para eliminar los ácidos grasos. El experto en la materia conoce la tecnología de acidificación y puede definir las mejores condiciones de acidificación según la glicerina utilizada.

Los términos “alto contenido de glicerol” o “alta concentración de glicerol” significan más de 90 g.l-1 de glicerol en el medio alimentado. En formas de realización preferidas, la concentración está compuesta por entre 90 y 200 g.l-1 de glicerol, más particularmente entre 90 y 140 g/l de glicerol, de manera preferible aproximadamente 120 g.l-1 de glicerol y de manera más preferible aproximadamente 105 g.l-1 de glicerol contenido en la disolución de glicerina.

En una forma de realización preferida, en el procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol de la presente invención, la concentración de glicerol en el medio alimentado está compuesta por entre 90 y 120 g/l de glicerol, y de manera preferible es de aproximadamente 105 g/l de glicerol contenido en la disolución de glicerina.

En el procedimiento de la presente invención, la producción de 1,3-propanodiol se lleva a cabo preferentemente mediante un procedimiento anaerobio de fermentación continua cultivando el consorcio microbiano o cocultivo de la invención descrito anteriormente en un medio de cultivo que comprende glicerol como única fuente de carbono, siendo dicho medio de cultivo un medio mínimo sin adición de nitrógeno orgánico.

El término “medio mínimo” significa un medio de cultivo estrictamente mineral que comprende una composición definida químicamente en la que los organismos se hacen crecer aparte de la disolución de glicerina.

Tales medios de cultivo se divulgan en la técnica, particularmente en el documento WO 2010/128070 presentado el 05/05/2010 y el documento WO 2011/042434 presentado el 05/10/2010.

En una forma de realización preferida, el 1,3-propanodiol así obtenido a partir del procedimiento según la invención se purifica adicionalmente.

El experto conoce procedimientos para recuperar y purificar finalmente 1,3-propanodiol a partir de un medio de fermentación. El 1,3-propanodiol puede aislarse por destilación. En la mayoría de las formas de realización, el 1,3-propanodiol se destila del medio de fermentación con un subproducto, tal como acetato, y luego se purifica adicionalmente mediante procedimientos conocidos.

Un procedimiento de purificación preferido particular se divulga en las solicitudes WO 2009/068110 y WO 2010/037843.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe la utilización de por lo menos una cepa de C. sporogenes y/o por lo menos una cepa de C. sphenoides para mejorar la producción de 1,3-propanodiol, en particular el rendimiento y el título de PDO, a partir del procedimiento fermentativo mediante el cocultivo con por lo menos una cepa de C. acetobutylicum en un medio de cultivo que contiene una alta concentración de glicerol como única fuente de carbono.

Preferentemente, se utiliza por lo menos una cepa de C. sporogenes y/o por lo menos una cepa de C. sphenoides para por lo menos una cepa de C. acetobutylicum, y más preferentemente para por lo menos una cepa de C. acetobutylicum adaptada para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol y específicamente con una alta concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial. En cuanto a la cepa de C. acetobutylicum adaptada para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerina, se aplican todos los aspectos preferidos anteriores cambiando lo que corresponda para este aspecto en relación con la utilización de mejorar la producción de 1,3-propanodiol y en particular el rendimiento y el título de 1,3-propanodiol, a partir de un procedimiento fermentativo.

El procedimiento y la utilización según la presente invención, en sus diferentes formas de realización, conduce a la producción de 1,3-propanodiol con un título de hasta 52.9 g.l-1, un rendimiento de hasta 0.5 g.g'1 y una productividad de hasta 3.65 g.M.lr1 para una tasa de dilución de 0.069 h1.

Ejemplos:

Los procedimientos y sistemas divulgados en la presente memoria se ilustran adicionalmente en los siguientes ejemplos, que se facilitan a modo de ilustración.

Un experto en la materia apreciará la aplicabilidad y las modificaciones necesarias para adaptar las características descritas en la presente sección. Alternativamente, los procedimientos podrían realizarse con otros procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

Protocolos

Medios y condiciones de cultivo

Los medios y condiciones utilizados para los cultivos ya se describieron en la solicitud de patente WO 2010/128070:

- cultivos en frasco: medios sintéticos y ricos (CGM: medio de crecimiento clostridial)

- cultivo continuo anaerobio

Aislamiento de ADN

Se extrajo ADN genómico de 1 ml de cultivo, se homogeneizó y se transfirió a un tubo de 2 ml con un kit de tubo con perlas de vidrio, de 0.1 mm, utilizando un dispositivo de lisis/homogeneizador Precellys®24 (Bertin Technologies, Saint Quentin Yvelines, Francia). Los ajustes de Precellys®24 fueron: 6500 rpm, duración del ciclo de 20 s, tiempo de retardo de 5 s entre ciclos, para 2 ciclos totales. Después de la extracción con Precellys, se centrifugó el lisado a 10,000 g durante 10 min y se utilizó el sobrenadante para la extracción genómica total utilizando NucleoSpin® Gel y PCR Cleanup de Macherey (Macherey Nagel, Hoerdt, Francia).

Cuantificación de una secuencia específica de ácido desoxirribonucleico de un microorganismo específico mediante PCR cuantitativa

Los últimos avances en técnicas moleculares tales como la tecnología de PCR permiten la detección e identificación rápida, específica y sensible de microorganismos potenciales en diferentes tipos de entornos como por ejemplo en el caldo de cultivo de una producción fermentativa de esta solicitud de patente.

La cuantificación absoluta en las muestras se determinó mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-rad Mitry Mory, Francia). La qPCR se realizó en un termociclador C1000™ de Bio-Rad equipado con un sistema de detección en tiempo real CFX96™ (Bio-Rad Mitry Mory, Francia).

Las mezclas de reacción consistieron en 1* Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Mitry Mory, Francia), 6 |jl de cada cebador directo (F) e inverso (R) (1 |jM), 2 |jl de muestra diluida (2 ng/jl de medida en Nanodrop) y agua libre de nucleasas para alcanzar un volumen final de 20 jL . La amplificación se logró según el siguiente programa de ciclado térmico: fusión inicial a 98°C durante 2 min (1 ciclo) seguido por 40 ciclos de fusión a 98°C durante 10 s, hibridación de cebadores y elongación a 60°C durante 30 s (curva de fusión de 65 a 95°C, incremento de 0.5°C cada 5 s).

Se determinó una curva patrón para cada microorganismo utilizando valores de Cq de diluciones en serie de ADN genómico a concentraciones conocidas. El valor de Cq para cada pocillo (curva patrón y muestras) se determinó mediante el software CFX Manager™ 3.1. Las muestras se representaron frente a la curva patrón para determinar la abundancia de ácido nucleico. Las cuantificaciones absolutas se basaron en una copia del gen gapC por célula para C. acetobutylicum, una copia del gen cpn60 por célula para C. sphenoides y una copia del gen tpi por célula para C. sporogenes. Para los fines de cálculo, se supuso que las extracciones de ácido nucleico eran perfectas, dado que no se dispone de una medición de la eficacia de la extracción.

La población microbiana de C. acetobutylicum que sobreexpresa el operón 1,3-propanodiol procedente de C. butyricum y adaptada para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con una alta concentración de glicerina industrial tal como se describe en solicitud de patente WO2012062832A1 se denominó “población tipo 174P” y se utilizó en la presente memoria como referencia.

En esta solicitud de patente, se utilizó el consorcio microbiano que comprende la “población tipo 174P” y otros microorganismos C. sphenoides y C. sporogenes, para mejorar la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerina. Este consorcio microbiano se denominó “consorcio microbiano tipo 192P”.

Ejemplo 1: prestaciones de la “población tipo 174P” y el “consorcio microbiano tipo 192P” en un quimiostato mediante cultivo continuo con altas concentraciones de glicerina sin procesar

Cepas bacterianas:

- Población tipo 174P: población de la cepa de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 PD0001VE05 desarrollada en altas concentraciones de glicerina sin procesar

- consorcio microbiano tipo 192P: consorcio de la población tipo 174P y otros microorganismos C. sphenoides y C. sporogenes.

Medios de cultivo:

Los medios sintéticos utilizados para los cultivos discontinuos de Clostridia contenían, por litro de agua corriente: glicerol, 30 g; KH2PO4, 0.5 g; K2HPO4, 0.5 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCh 6H2O, 0.01 g; H2SO4, 0.1 ml; NH4C 1.5 g; biotina, 0.16 mg; ácido p-aminobenzoico, 32 mg y FeSO4, 7H2O, 0.028 g. El pH del medio se ajustó a 6.3 con NH4OH 3 N. Se utilizó glicerol comercial adquirido de SDS Carlo_Erba (pureza del 99%) para el cultivo discontinuo. El medio de alimentación para los cultivos continuos contenía, por litro de agua corriente: glicerol procedente de glicerina sin procesar, 105 g; KH2PO4, 0.45 g; K2HPO4, 0.45 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCh 6H2O, 0.013 g; biotina, 0.08 mg; ácido p-aminobenzoico, 16 mg; FeSO4, 7H2O, 0.04 g; antiespumante, 0.05 ml; ZnSO4, 7H2O, 8 mg; CuCh, 2H2O, 4 mg; MnSO4, H2O, 20 mg. El pH del medio se ajustó a entre 3.5 y 4 con H2SO4 al 96%. La glicerina sin procesar, procedente del procedimiento de transesterificación del biodiesel, se proporcionó por diferentes proveedores (Novance, ADM, Diester Industries, Greenergy, Carotech Berhad) y presentaba una pureza comprendida entre el 80 y el 86% (p/p). Estas glicerinas se mezclaron y se pretrataron mediante acidificación.

Configuración experimental:

Se realizaron cultivos continuos en un biorreactor Tryton de 5 l (Pierre Guerin, Francia) con un volumen de trabajo de 2000 ml. El volumen de cultivo se mantuvo constante a 2000 ml mediante la regulación automática del nivel de cultivo. Los cultivos se agitaron a 200 r.p.m., la temperatura se fijó a 35°C y el pH se mantuvo constante a 6.5 mediante la adición automática de NH4OH 5.5 N. Para crear condiciones anaerobias, se purgó el medio esterilizado en el recipiente con nitrógeno estéril libre de O2 durante una hora a 60°C y se purgó de nuevo hasta que se alcanzaron 35°C (purga durante 2 horas). La salida de gas del biorreactor se protegió del oxígeno mediante una disposición de pirogalol (Vasconcelos et al, 1994). Después de la esterilización, el medio de alimentación también se purgó con nitrógeno estéril libre de O2 hasta que se alcanzó la temperatura ambiente y se mantuvo bajo nitrógeno para evitar la entrada de O2.

Procedimiento de cultivos continuos y discontinuos:

El procedimiento utilizado para evaluar se ha descrito en la solicitud de patente WO 2010/128070 (ejemplo 2).

Se utilizó como inóculo (5% v/v) un cultivo que crecía en un frasco de 100 ml con penicilina en medio sintético (el mismo que se describió anteriormente para el cultivo discontinuo pero con la adición de ácido acético, 2.2 g.l-1 y MOPS, 23.03 g.l-1) tomado al final de la fase de crecimiento exponencial.

Los cultivos se hicieron crecer primero de manera discontinua. En la fase temprana de crecimiento exponencial se realizó un pulso de glicerol a partir de glicerina sin procesar: para el pulso, se añadió medio sintético (el mismo que se describió para el cultivo de alimentación) con 105 g.l-1 de glicerol procedente de glicerina sin procesar a un caudal estático durante 3 horas (es decir una adición de 18 g.l-1 de glicerol). Entonces, el crecimiento continuó de manera discontinua y, antes del final de la fase de crecimiento exponencial, se inició la alimentación continua a una tasa de dilución de 0.035 h-1: el medio de alimentación contiene 105 g.l-1 de glicerol procedente de glicerina sin procesar. 6-8 días después de la inoculación del biorreactor y después de 4 tiempos de residencia (RT), se aumentó la tasa de dilución desde 0.035 h-1 hasta 0.070 h-1 en cinco días. Después de esto, la estabilización del cultivo fue seguida por la producción de 1,3-propanodiol y el consumo de glicerol utilizando el protocolo de HPLC descrito a continuación. En particular, se esperó hasta que la concentración de glicerina residual fue lo más baja posible.

Las prestaciones globales del consorcio microbiano tipo 192P se presentan en la tabla 1 y se comparan con las prestaciones de la población tipo 174P que contiene exclusivamente la cepa de C. acetobutylicum DG1 pSPD5 PD0001VE05 desarrollada en altas concentraciones de glicerina sin procesar en las mismas condiciones.

Procedimientos analíticos:

Se midió la concentración celular de manera turbidimétrica a 620 nm y se correlacionó con el peso seco celular determinado directamente. Se determinaron las concentraciones de glicerol, 1,3-propanodiol, etanol, lactato y ácidos acético y butírico mediante análisis de HPLC. Se realizó la separación en una columna Aminex HPX-87H de Biorad y se logró la detección mediante el índice de refracción. Las condiciones de funcionamiento fueron las siguientes: fase móvil, ácido sulfúrico 0.5 mM; caudal 0.5 ml/min, temperatura, 25°C.

Tabla 1: prestaciones de la población tipo 174P de C. acetobutylicum y del consorcio microbiano tipo 192P crecidos en cultivo continuo (datos medios de 20 y 19 quimiostatos, respectivamente). El medio de alimentación contenía 105 g.l-1 de glicerol procedente de glicerina sin procesar, la tasa de dilución fue de 0.035 h-1 y 0.070h-1. Los valores corresponden al promedio de muestras analizadas después de por lo menos 9 tiempos de residencia a la tasa de dilución de 0.070h-1.

Estos resultados muestran que el consorcio microbiano tipo 192P presenta mejores resultados para la producción de PDO que la población tipo 174P (título y rendimiento superiores de PDO y menos glicerina residual).

Ejemplo 2: cuantificación de consorcio microbiano

Se determinó la abundancia de cada microorganismo en las muestras mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-rad Mitry Mory, Francia) en un termociclador C1000™ de Bio-Rad equipado con un sistema de detección en tiempo real CFX96™ (descrito en Protocolos). Los cebadores basados en el gen gapC utilizados para seleccionar como diana C. acetobutylicum fueron gapC_F, 5'-TGCTGCTGTAAGTATCATC-3' (SEC ID NO: 1) y gapC_R, 5'-GTTGGAACTGGAACTCTT-3' (SEC ID NO: 2). Los cebadores basados en el gen cpn60 utilizados para seleccionar como diana C. sphenoides fueron cpn60_F, 5'-TTATATGTGCACCGATATG-3' (SEC ID NO: 3) y cpn60_R, 5'-GAGAAGTCTTGCGCCGGAC-3' (SEC ID NO: 4). Los cebadores basados en el gen tpi utilizados para seleccionar como diana C. sporogenes fueron tpi_F, 5'-CCAGCGGTATTAGAAGAA-3' (SEC ID NO: 5) y tpi_R, 5'-GTCCTATAATTACATAATGAACTC-3' (SEC ID NO: 6).

En las dos tablas a continuación se facilitan porcentajes de representación de las diferentes especies presentes en los cultivos de la población tipo 174P y del consorcio microbiano tipo 192P considerando que la totalidad de las células contenidas en cada cultivo corresponde al 100%.

Tabla 2: composición de la “población tipo 174P” en diferentes etapas del cultivo

La fermentación de la “población tipo 174P” para la producción de 1,3-propandiol no contiene ninguna bacteria C. sphenoides ni C. sporogenes. Esta población no es un consorcio.

Tabla 3: composición del “consorcio microbiano tipo 192P” en diferentes etapas del cultivo. Se realizaron diferentes ensayos y se indican las proporciones mínimas y máximas obtenidas.

Por el contrario, la tabla 3 anterior muestra que las bacterias C. sphenoides y C. sporogenes están presentes en el “consorcio microbiano tipo 192P” en todas las etapas del cultivo y durante la fermentación de producción. La proporción de cada microorganismo varió entre las fases de cultivo continuo.

Según ensayos experimentales adicionales llevados a cabo en las mismas condiciones que se definieron anteriormente, las diferentes especies presentes en el cultivo en estado permanente establecido del “consorcio microbiano tipo 192P” fueron las siguientes:

Ejemplo 3: ensayos de cultivos discontinuos de C. sphenoides y C. sporogenes

Como control de la invención, C. sphenoides y C. sporogenes se cultivaron juntos o se cultivaron de manera independientemente en medio rico (CGM: medio de crecimiento clostridial tal como se describe en Protocolos) que contenía glicerol comercial o glicerol que se origina a partir de glicerina (30 g/l). Pese al crecimiento de los microorganismos, no se consumió glicerol/glicerina y no se produjo 1,3-propanodiol.

Por lo demás, se realizaron varios ensayos para hacer crecer C. sphenoides o C. sporogenes o C. sphenoides y C. sporogenes en cultivos en frasco que contenían medios mínimos sintéticos (descritos en Protocolos) con glicerol/glicerina (30 g/l) pero no se observó crecimiento.

Todos estos datos sugieren que ni C. sphenoides ni C. sporogenes pueden producir 1,3-propanodiol a partir de glicerol/glicerina como única fuente de carbono y que su crecimiento y persistencia en la producción continua de 1,3-propanodiol del “consorcio microbiano tipo 192P” se debe de alguna manera a la presencia de C. acetobutylicum. Además, los resultados de los ejemplos 1, 2 y 3 mostraron que C. sphenoides y/o C. sporogenes desempeñan un papel fundamental en el consorcio con C. acetobutylicum para mejorar las capacidades de producción de PDO en alta concentración de glicerina industrial sin procesar.

Bibliografía

- González-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Andrade JC, Vasconcelos I y Soucaille P.2005. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol. Metabolic Engineering 7: 329-336.

- González-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Soucaille P. y Vasconcelos I. 2006. Microbial conversion of a natural producer, Clostridium butyricum VPI 3266, and an engineered strain, Clostridium acetobutylicum DG (pSPD5). Applied and Environmental Microbiology, 72: 96-101.

- Papanikolaou S, Ruiz-Sanchez P, Pariset B, Blanchard F y Fick M.2000. High production of 1,3-propanediol from industrial glycerol by a newly isolated Clostridium butyricum strain. Journal of Biotechnology. 77: 191­ 208.

- Quéméneur M, Hamelin J, Benomar S, Giudici-Orticoni M, Latrille E, Steyer J-P, Trably E. 2011. Changes in hydrogenase genetic diversity and proteomic patterns in mixed-culture dark fermentation of mono-, diand tri-saccharides. International Journal of Hydrogen Energy. 36. 11654-11665.

- Tran-Din, K. y Gottschalk, G. 1985. Formation of D(-)-1,2-propanediol and D(-)-lactate from glucose by Clostridium sphenoides under phosphate limitation. Arch. Microbiol. 142, 87-92.

- Vasconcelos I, Girbal L, Soucaille P. 1994. Regulation of carbon and electron flow in Clostridium acetobutylicum grown in chemostat culture at neutral pH on mixtures of glucose and glycerol. Journal of bacteriology. 176(5): 1443-1450.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Consorcio microbiano que comprende por lo menos una cepa de Clostridium acetobutylicum, por lo menos una cepa de Clostridium sporogenes y por lo menos una cepa de Clostridium sphenoides.

2. Consorcio microbiano según la reivindicación 1, que comprende por lo menos el 85% de C. acetobutylicum, entre el 0.001% y el 0.2% de C. sporogenes y entre el 0.1% y el 15% de C. sphenoides.

3. Consorcio microbiano según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende entre el 85% y el 99.8% de C. acetobutylicum, entre el 0.001% y el 0.15% de C. sporogenes y entre el 0.2% y el 15% de C. sphenoides.

4. Consorcio microbiano según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende entre el 90% y el 99.8% de C. acetobutylicum, entre el 0.002% y el 0.13% de C. sporogenes y entre el 0.2% y el 10% de C. sphenoides.

5. Consorcio microbiano según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que consiste en por lo menos una cepa de C. acetobutylicum, por lo menos una cepa de C. sporogenes y por lo menos una cepa de C. sphenoides.

6. Consorcio microbiano según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa de C. acetobutylicum se adapta previamente para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo con alto contenido de glicerol que presenta un flujo aumentado de producción de 1,3-propanodiol mediante la introducción de copias adicionales del operón 1,3-propanodiol procedente de C. butyricum que codifica para enzimas implicadas en la ruta del 1,3-propanodiol independiente de la vitamina B12, y donde dicho alto contenido de glicerol significa una concentración de glicerol comprendida entre 90 y 200 g/l de glicerol.

7. Consorcio microbiano según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa de C. acetobutylicum se adapta para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol a partir de un medio de cultivo en el que dicho glicerol se origina a partir de glicerina industrial.

8. Consorcio microbiano según la reivindicación 6, en el que dicho C. acetobutylicum se adapta previamente para el crecimiento y la producción de 1,3-propanodiol durante un procedimiento de cultivo continuo en el que el medio alimentado contiene dicha concentración de glicerol que se origina a partir de glicerina industrial.

9. Procedimiento para la producción de 1,3-propanodiol en un procedimiento de fermentación continua de glicerina, que comprende cultivar un consorcio microbiano según una de las reivindicaciones 1 a 8 en un medio alimentado que comprende glicerol como única fuente de carbono, y recuperar el 1,3-propanodiol producido a partir del medio de cultivo.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la concentración de glicerina en el medio alimentado está comprendida entre 90 y 120 g/l de glicerol, y preferentemente es de aproximadamente 105 g/l de glicerol contenido en la disolución de glicerina.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en el que el medio de cultivo es un medio mínimo, sin adición de nitrógeno orgánico.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en el que el 1,3-propanodiol se purifica adicionalmente.

13. Utilización de por lo menos una cepa de C. sporogenes y por lo menos una cepa de C. sphenoides para mejorar la producción de 1,3-propanodiol a partir del procedimiento fermentativo mediante el cocultivo con por lo menos una cepa de C. acetobutylicum en un medio de cultivo que contiene una concentración de glicerol comprendida entre 90 y 200 g.l-1 de glicerol contenido en la disolución de glicerina como única fuente de carbono.