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ES2999367T3 - Systems and methods for characterizing surfactant protein d (sp-d) oligomers - Google Patents

Systems and methods for characterizing surfactant protein d (sp-d) oligomers Download PDF

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ES2999367T3
ES2999367T3 ES19777857T ES19777857T ES2999367T3 ES 2999367 T3 ES2999367 T3 ES 2999367T3 ES 19777857 T ES19777857 T ES 19777857T ES 19777857 T ES19777857 T ES 19777857T ES 2999367 T3 ES2999367 T3 ES 2999367T3
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ES19777857T
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English (en)
Inventor
Jan Susan Rosenbaum
Mark Cornell Manning
Ryan R Manning
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Airway Therapeutics Inc
Original Assignee
Airway Therapeutics Inc
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Publication date
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Abstract

Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen la identificación y/o cuantificación de especies oligoméricas de proteína tensioactiva D (SP-D). Algunas realizaciones incluyen la realización de un fraccionamiento de flujo asimétrico con análisis de dispersión de luz láser multiángulo (AF4-MALLS) en la SP-D. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas y métodos para caracterizar oligómeros de proteína surfactante D (SP-D)
Campo de la invención
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen identificar y/o cuantificar especies oligoméricas de proteína surfactante-D (SP-D). Algunas realizaciones incluyen realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la SP-D.
Antecedentes de la invención
El surfactante pulmonar de mamífero es una mezcla de proteínas (10 %) y lípidos (90 %) que incluye el componente lipídico principal dipalmitoilfosfatidilcolina (Zuo YY, et al., Biochim Biophys Acta (2008) 1778:1947-77). La función principal del surfactante pulmonar es asegurar la tensión superficial mínima dentro del pulmón para evitar el colapso durante la respiración. Además, al interactuar con patógenos inhalados, el surfactante pulmonar también participa en la defensa del hospedador (Clements JA. Am Rev Respir Dis (1977) 115:67-71). Por lo tanto, la deficiencia de surfactante pulmonar está asociada con enfermedades pulmonares tal como asma, bronquiolitis, síndrome de dificultad respiratoria (RDS), fibrosis quística y neumonía (Griese M. Eur Respir J (1999) 13:1455-76). Las formulaciones de surfactantes se indican para el tratamiento de RDS, que afecta a ~ 1,5 millones de bebés prematuros en todo el mundo cada año. El síndrome de dificultad respiratoria es una importante enfermedad de deficiencia de surfactante pulmonar provocada por la inmadurez estructural de los pulmones en bebés prematuros, que dificulta la respiración, inhibe el intercambio de gases y promueve el colapso alveolar (Notter RH. 2000 Lung Surfactants. Basic Science and Clinical Applications. Nuevo York, NY: Marcel Dekker Inc.). Sin embargo, el tratamiento se vuelve más difícil si los pulmones están infectados o si hay complicaciones inflamatorias u oxidativas, debido a que las preparaciones de surfactantes actuales carecen de proteína surfactante D (SP-D). El tratamiento exitoso de enfermedades pulmonares complejas, por lo tanto, requiere la producción de formulaciones de surfactantes cuya composición coincida con el surfactante pulmonar natural lo más cerca posible (Robertson B, et al., Biochim Biophys Acta (1998) 1408:346-61).
SP-D tiene un papel en el sistema inmunitario innato pulmonar al proporcionar actividades antiinflamatorias y antimicrobianas que abordan enfermedades pulmonares crónicas tal como asma, fibrosis quística y enfisema inducido por fumar (Clark H, et al., Immunobiology (2002) 205:619-31). Los datos basados en corderos recién nacidos prematuros sugieren que la administración de ~2-3 mg/kg de SP-D humana recombinante en combinación con 100 mg/kg de Survanta®(un agente tensioactivo natural disponible en EUA) es más efectiva que Survanta® solo para la prevención del choque de endotoxinas y la reducción de la inflamación pulmonar provocada por la ventilación (Ikegami M, et al., Am J Respir Crit Care Med (2006) 173:1342-7; Sato A, et al., Am J Respir Crit Care Med (2010) 181:1098-105).
El artículo HARTSHORN et al., “Role of viral hemagglutinin glycosylation in anti-influenza activities of recombinant surfactant protein D”, Respiratory Research, 2008, Vol. 9, No. 1, p. 65 divulga actividades antivirales de SP-D humana recombinante contra un panel de cepas de IAV que varían en sitios de glucosilación en su hemaglutinina (HA). La solicitud de patente US 2014/302158 A1 divulga métodos para medir el tamaño de partículas tipo virus por fraccionamiento usando AF4-MALLS. La solicitud de patente WO 2019/050856 A1 divulga métodos y composiciones para preparar proteína surfactante-D (SP-D). La solicitud de patente WO 2019/050857 A1 divulga métodos, composiciones y células para preparar proteína surfactante-D (SP-D).
Tradicionalmente, SP-D se ha aislado del sobrenadante de lavado broncoalveolar o líquido amniótico, pero la mayor parte de SP-D se pierde durante la purificación, en parte debido a las propiedades hidrófilas de SP-D (Dodagatta-Marri E, et al., Methods Mol Biol (2014) 100:273-90). El uso de la proteína surfactante D humana recombinante (rhSP-D) para complementar las formulaciones de surfactante pulmonar puede asegurar la eficacia terapéutica debido a que las formulaciones de surfactante pulmonar actuales carecen de la capacidad de modular de manera efectiva la respuesta inmunitaria de hospedador en la ausencia de las proteínas surfactantes hidrófilas. Una característica de la SP-D nativa que se debe mantener en cualquier composición farmacéutica es el estado de oligomerización apropiado debido a que la multimerización de orden superior en la proteína surfactante endógena incrementa el número de sitios de unión de SP-D a ligandos de carbohidratos en la superficie de los patógenos, logrando potentes efectos de aglutinación bacteriana y viral (White M, et al., J Immunol (2008) 181 :7936-43). El estado de oligomerización apropiado también se requiere para el reconocimiento de receptor y la transducción de señales mediada por receptor para modulación de la respuesta inmunitaria del hospedador (Yamoze M et al., J Biol Chem (2008) 283:35878-35888) así como para el mantenimiento de la homeostasis de agentes tensioactivos (Zhang L et al., J Biol Chem (2001) 276: 19214-19219). Los bajos rendimientos de SP-D y los estados de oligomerización variables dificultan el uso de fuentes naturales para la producción de SP-D farmacéutica (Strong P, et al., J Immunol Methods (1998) 220:139-49). Para superar algunas de estas limitaciones, la SP-D recombinante se puede producir en microbios o líneas de células de mamíferos, ofreciendo potencialmente una plataforma a gran escala para la producción de formulaciones de SP-D recombinantes homogéneas. Sin embargo, la SP-D recombinante puede tener estados de oligomerización variables y/o formas agregadas inactivas, reduciendo de este modo la eficacia potencial de estas preparaciones. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos que se puedan usar para discriminar formas oligoméricas activas de las formas agregadas inactivas, y para cuantificar las formas oligoméricas para asegurar la calidad reproducible del proceso de fabricación.
Sumario de la invención
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen métodos para determinar la actividad de una composición farmacéutica que comprende proteína surfactante-D (SP-D). Algunas de estas realizaciones incluyen un método que comprende: medir la proporción relativa de especies oligoméricas de SP-D en la composición farmacéutica; y calcular la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la composición farmacéutica, determinando de este modo la actividad de la composición farmacéutica. Algunas realizaciones también incluyen calcular la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio cuadrático medio (RMS) mayor que 70 nm en la composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la medición comprende realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS). En algunas realizaciones, el cálculo comprende proporcionar un modelo de la especie oligomérica de SP-D que comprende geometrías tipo varilla y geometrías tipo esférico. En algunas realizaciones, el modelo comprende un modelo de Zimm y un modelo de Debye de segundo orden de la especie oligomérica de SP-D. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm y un agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen determinar la proporción relativa de especies oligoméricas de la proteína surfactante-D (SP-D) en una muestra, que comprende: realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la muestra de SP-D; y determinar la proporción relativa de una especie oligomérica de SP-D a partir de los resultados del análisis por AF4-MALLS, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la muestra. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de r Ms mayor que 70 nm en la muestra.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen un método para determinar la proporción relativa de especies oligoméricas activas de proteína surfactante-D (SP-D) en una muestra, que comprende: realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la muestra de SP-D; medir la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la muestra de SP-D; medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm; y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm; y calcular una relación entre cada una de las proporciones relativas medidas. En algunas realizaciones, la al menos una especie oligomérica de SP-D comprende un agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm. Algunas realizaciones también incluyen integrar un fractograma del análisis por AF4-MALLS en picos. Algunas realizaciones también incluyen medir un área de pico relativa (RPA) del fractograma para al menos un pico indicativo de una especie oligomérica de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm. En algunas realizaciones, el oligómero tipo estrella de SP-D tiene una masa molar menor que o igual a aproximadamente 6 MDa. En algunas realizaciones, el agregado de SP-D tiene una masa molar mayor que 6 MDa.
Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de especies oligoméricas tipo estrella de SP-D en la muestra que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm en la muestra. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la muestra.
En algunas realizaciones, se predice que la muestra de SP-D tiene actividad en un ensayo de receptor tipo toll de lipopolisacárido 4 (LPS-TLR4) o en un ensayo de agregación bacteriana. En algunas realizaciones, la muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de dodecámeros de SP-D mayor que o igual a 35 % de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad. En algunas realizaciones, la muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm menor que 5%de la especie oligomérica de SP-D total en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad.
En algunas realizaciones, la AF4-MALLS se realiza en ausencia de un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en EDTA y EGTA.
En algunas realizaciones, la SP-D es una SP-D humana recombinante (rhSP-D). En algunas realizaciones, la rhSP-D se deriva de una línea de células de leucemia mieloide humana que expresa la rhSP-D de un transgén. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende un residuo en una posición polimórfica que corresponde a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Met11, Thr160, Ser 270 y Ala 286.
En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a la masa. En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica de SP-D es con respecto al número de moléculas. En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a un área de pico relativa (RPA) o un RPA ajustada en un análisis por AF4-MALLS. En algunas realizaciones, el dodecámero de SP-D tiene un peso molecular de aproximadamente 520 kDa.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen sistemas electrónicos para determinar la actividad de una composición farmacéutica que comprende proteína surfactante-D (SP-D). Algunas de estas realizaciones pueden incluir un sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos: medir la proporción relativa de especies oligoméricas de SP-D en la composición farmacéutica; calcular la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la composición farmacéutica; y determinar la actividad de la composición farmacéutica con base en la proporción relativa de dodecámeros de SP-D, donde una mayor proporción relativa de dodecámeros de SP-D es indicativa de que la composición tiene un mayor nivel de actividad en comparación con la actividad de una composición que tiene una menor proporción relativa de dodecámeros de SP-D. En algunas realizaciones, la actividad comprende actividad en un ensayo de receptor tipo toll 4 (TLR4) o en un ensayo de agregación bacteriana. Algunas realizaciones también incluyen calcular la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la medición comprende realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS). En algunas realizaciones, el cálculo comprende proporcionar un modelo de la especie oligomérica de SP-D que comprende geometrías tipo varilla y geometrías tipo esférico. En algunas realizaciones, el modelo comprende un modelo de Zimm y un modelo de Debye de segundo orden de la especie oligomérica de SP-D. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm y un agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen sistemas electrónicos para determinar la proporción relativa de especies oligoméricas de proteína surfactante-D (SP-D) en una muestra. Algunas de estas realizaciones pueden incluir un sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos: realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la muestra de SP-D; y determinar la proporción relativa de una especie oligomérica de SP-D a partir de los resultados del análisis por AF4-MALLS, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la muestra. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de r Ms mayor que 70 nm en la muestra.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen sistemas electrónicos para determinar la proporción relativa de especies oligoméricas activas de proteína surfactante-D (SP-D) en una muestra. Algunas de estas realizaciones incluyen un sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos: realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la muestra de SP-D; medir la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la muestra de SP-D; medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm; y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm; y calcular una relación entre cada una de las proporciones relativas medidas. En algunas realizaciones, la al menos una especie oligomérica de SP-D comprende agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm. Algunas realizaciones también incluyen integrar un fractograma del análisis por AF4-MALLS en picos. Algunas realizaciones también incluyen medir un área de pico relativa (RPA) del fractograma para al menos un pico indicativo de una especie oligomérica de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm. En algunas realizaciones, el oligómero tipo estrella de SP-D tiene una masa molar menor que o igual a aproximadamente 6 MDa. En algunas realizaciones, el agregado de SP-D tiene una masa molar mayor que 6 MDa. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de especies oligoméricas tipo estrella de SP-D en la muestra que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm en la muestra. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la muestra.
En algunas realizaciones, se predice que la muestra de SP-D tiene actividad en un ensayo de receptor tipo toll de lipopolisacárido 4 (LPS-TLR4) o en un ensayo de agregación bacteriana.
En algunas realizaciones, la muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de dodecámeros de SP-D mayor que o igual a 35 % de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad.
En algunas realizaciones, la muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm menor que 5 % de la especie oligomérica de SP-D total en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad.
En algunas realizaciones, la AF4-MALLS se realiza en ausencia de un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en EDTA y EGTA.
En algunas realizaciones, la SP-D es una SP-D humana recombinante (rhSP-D). En algunas realizaciones, la rhSP-D se deriva de una línea de células de leucemia mieloide humana que expresa la rhSP-D de un transgén. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende un residuo en una posición polimórfica que corresponde a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Met11, Thr160, Ser 270 y Ala 286.
En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a la masa. En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a un área de pico relativa (RPA) o un RPA ajustada en un análisis por AF4-MALLS. En algunas realizaciones, el dodecámero de SP-D tiene un peso molecular de aproximadamente 520 kDa.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un esquema que representa la formación de un trímero de SP-D y las características estructurales del trímero de SP-D.
Descripción detallada
La proteína surfactante D (SP-D) es una lectina tipo C (dependiente de Ca2+) que comprende cuatro dominios: una región N-terminal enlazada a cisteína requerida para la formación de enlaces de disulfuro intermoleculares, una región de colágeno de triple hélice, un péptido de cuello de trimerización de hélice superenrollada a y un dominio de reconocimiento de carbohidratos (CRD) dependiente de calcio C-terminal (Crouch E. et al. (1994) J Biol Chem, 269:17311-9). Los monómeros forman trímeros a través del plegamiento de la región colagenosa en hélices triples y el montaje de un haz superenrollado de hélices a en espiral en la región de cuello (figura 1). Estos trímeros se estabilizan por dos enlaces de disulfuro en el dominio N-terminal rico en cisteína. El trímero de SP-D tiene un peso molecular total de 129 kDa que comprende tres cadenas de polipéptidos idénticas de 43 kDa. Los trímeros de SP-D pueden formar estados de oligomerización más altos que varían por tamaño y conformación. Los estados de oligomerización más altos pueden ser importantes para la función de SP-D (Hakansson K, et al., Protein Sci (2000) 9:1607-17; Crouch E. Respir Res (2000) 1:93-108; Crouch E. et al. (2006) J Biol Chem, 281:18008-14). La asociación de trímeros de SP-D en estados de oligomerización más altos es sensible a factores y condiciones ambientales durante la purificación y almacenamiento. La vía y tipo de interacciones implicadas en la formación de oligómeros grandes de SP-D no se han dilucidado previamente.
Algunas realizaciones incluyen un sistema y método para resolver especies oligoméricas de SP-D usando una variación de la técnica de fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico (AF4). Algunas de estas realizaciones se desarrollaron para resolver especies de SP-D de orden inferior (hexámeros y más pequeñas) de las especies de SP-D de orden superior (dodecámero y más grandes). Estas realizaciones permiten que la forma de dodecámero de SP-D se delinee claramente dentro de una envoltura de fractograma compleja usando dispersión de luz láser de múltiples ángulos (MALLS). El uso de esta variación de la técnica AF4, incorporando MALLS, permitió determinar consistentemente la masa molar del dodecámero a 521,8 ± 3,6 kD durante el análisis de numerosas (n=102) muestras. Como se usa en la presente, el término “AF4-MALLS” significa un método para realizar un fraccionamiento de flujo de campo-flujo asimétrico seguido por el uso de dispersión de luz láser de múltiples ángulos para identificar las especies oligoméricas en la mezcla que se analiza. Se calculó que la precisión del método AF4-MALLS es ~5 %. Los fractogramas de SP-D también mostraron picos asociados con especies más grandes que un dodecámero, que aparecieron como especies tipo estrellas que surgen del montaje de dodecámero y/o hexámero por microcopia de fuerza atómica (AFM), así como agregados que tenían un radio mayor que 70 nm. Por lo tanto, se encontró que las realizaciones que usan la técnica AF4-MALLS proporcionan un perfil detallado de los diferentes estados de asociación oligomérica de orden superior de SP-D, que se encontró que se determinaron con precisión y exactitud.
Identificación de especies oligoméricas de SP-D
Una muestra de SP-D puede incluir varias especies oligoméricas de las proteínas SP-D, que incluyen: trímeros, hexámeros, dodecámeros y oligómeros de orden superior, tal como especies oligoméricas tipo estrella que tienen un radio cuadrático medio (RMS) promedio de aproximadamente 70 nm, y agregados que pueden tener un radio mayor que 70 nm. Como se describe en la presente, ciertas especies oligoméricas de SP-D se han asociado con ciertas actividades útiles. Por ejemplo, los dodecámeros de SP-D se han asociado con actividad antagonista en un ensayo de receptor tipo Toll 4 (TLR4). Un ensayo de TLR4 puede medir la actividad de rhSP-D para inhibir las respuestas celulares inflamatorias inducidas por lipopolisacárido (LPS) al evitar que LPS se una/active un complejo de TLR4. La actividad de la SP-D en un ensayo, tal como un ensayo de TLR4, puede ser un indicador útil para la eficacia predicha de la SP-D en ciertos métodos de tratamiento. Además, diferentes muestras de SP-D pueden contener diferentes distribuciones relativas de especies oligoméricas de SP-D.
La distribución de formas oligoméricas de SP-D humana recombinante (rhSP-D) en una muestra se puede determinar por una variedad de técnicas. Algunas realizaciones pueden incluir identificar especies oligoméricas de rhSP-D al realizar AFM. Algunas realizaciones pueden incluir identificar especies oligoméricas de rhSP-D al realizar una cromatografía de exclusión por tamaño tal como cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Algunas realizaciones pueden incluir identificar especies oligoméricas de rhSP-D al realizar electroforesis en gel de poliacrilamida. En algunos de estos métodos, una muestra de rhSP-D se puede poner en contacto con un detergente aniónico, tal como de SDS, seguido de poner en contacto la muestra con un reactivo de reticulación, tal como glutardialdehído al 1 %. Las proteínas reticuladas entonces se pueden resolver por tamaño usando técnicas tal como electroforesis en gel de poliacrilamida. Algunos métodos también pueden incluir identificar las diferentes especies oligoméricas de rhSP-D, tal como realizar una transferencia Western.
Algunas realizaciones incluyen realizar un análisis por AF4-MALLS en una muestra de SP-D. AF4 es un tipo de fraccionamiento de flujo de campo asimétrico que es capaz de fraccionamiento rápido y caracterización de alta resolución de diferentes partículas, incluidas biomoléculas.Véase por ejemplo,Giddings, J.C. et al., Science 193:1244-1245 (1976); Giddings, J.C. et al., Anal. Chem. 48:1126-1132 (1976); y Wagner et al., (2014) Anal Chem 86:5201-5210. AF4 puede separar partículas que van desde unos pocos nanómetros hasta unos pocos micrómetros. La separación por fraccionamiento de flujo de campo se presenta en un canal de flujo delgado que es comparable a una columna de separación cromatográfica. Un solvente acuoso u orgánico transporta la muestra a través de este canal. El flujo a través del canal es laminar debido a la baja altura de canal, y es la primera fuerza ejercida sobre la muestra. Se genera una segunda fuerza perpendicular al flujo de canal. En AF4, un lado del canal de flujo es una membrana y la segunda fuerza es el flujo de fluido a través del canal a través de la membrana. La separación de partículas se presenta en este sistema debido a estas dos fuerzas. En primer lugar, el gradiente de velocidad debido al flujo laminar dentro del canal provoca que las partículas en el centro del canal se muevan más rápidamente a lo largo del canal y se separen de las más cercanas a los lados del canal. En segundo lugar, la segunda fuerza, fuerza la muestra hacia la membrana. La separación de tamaño se presenta debido a que las moléculas más pequeñas se difunden hacia el centro del canal más rápidamente que las partículas más grandes y por lo tanto, se separan de las partículas más grandes debido al flujo de disolvente más rápido hacia el centro del canal. En algunas realizaciones, la AF4-MALLS se realiza en ausencia de un agente quelante tal como EDTA y EGTA.
Algunas realizaciones incluyen determinar la proporción relativa de especies oligoméricas activas en la muestra de SP-D, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm, y un agregado de SP-D que tiene un radio promedio o un radio de RMS mayor que 70 nm. En algunas realizaciones, el oligómero tipo estrella de SP-D puede tener una masa molar menor que o igual a aproximadamente 6 MDa. En algunas realizaciones, el agregado de SP-D tiene una masa molar mayor que 6 MDa.
Algunas realizaciones también incluyen integrar un fractograma de un análisis por AF4-MALLS en picos. Un primer pico en un fractograma (pico 1) puede incluir trímeros y hexámeros de SP-D. Un segundo pico en el fractograma (pico 2) puede incluir dodecámeros de SP-D. Un tercer pico en el fractograma (pico 3) puede incluir especies intermedias entre dodecámeros de SP-D y oligómeros tipo estrellas de SP-D. Un cuarto pico en el fractograma (pico 4) puede incluir una masa heterogénea de oligómeros de rhSP-D con radio de RMS constante de aproximadamente 70 nm consistente con lo que se ha observado por mediciones de AFM para la especie oligomérica tipo estrella, y especies de agregados de SP-D más grandes que tienen un radio mayor que 70 nm.
Algunas realizaciones también incluyen determinar, o medir, un área de pico relativa (RPA) para un pico como un porcentaje del área de pico total de los picos medidos, tal como los cuatro picos identificados anteriormente. Algunas de estas realizaciones incluyen medir un área de pico relativa (RPA) del fractograma para al menos un pico indicativo de una especie oligomérica de SP-D, tal como un trímero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm.
En algunas realizaciones, una muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de dodecámeros de SP-D mayor o igual a un cierto porcentaje de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad, el porcentaje puede ser 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y cualquier porcentaje entre cualquiera de dos de los porcentajes anteriores.
En algunas realizaciones, una muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de agregados de SP-D menor que un cierto porcentaje de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad, el porcentaje puede ser 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 3 %, 2 %, 1 % y cualquier porcentaje entre cualquiera de dos de los porcentajes anteriores.
En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica de SP-D puede ser con respecto a la masa, número de moléculas/agregados en una población de especies oligoméricas diferentes de SP-D o área de pico relativa (RPA) en un análisis por AF4-MALLS.
En algunas realizaciones, la SP-D comprende un polipéptido de SP-D humana tipo silvestre. En algunas realizaciones, la SP-D incluye un polimorfismo del polipéptido de SP-D humana. Las secuencias de polipéptidos de SP-D de ejemplo se proporcionan en la tabla 1. Los polimorfismos en el polipéptido de SP-D humana pueden incluir: residuo 11, ATG (Met) -> ACG (Thr); residuo 25, AGT (Ser) -> AGC (Ser); residuo 160, ACA (Thr) -> GCA (Ala); residuo 270, TCT (Ser) -> ACT (Thr); y residuo 286, GCT (Ala) -> GCC (Ala) en el que las posiciones se refieren a una posición en un polipéptido de SP-D maduro, tal como el polipéptido de ejemplo de<s>E<q>ID NO: 02. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende un cierto residuo en una posición polimórfica en la que el residuo seleccionado de Met11/31, Thr160/180, Ser 270/290 y Ala 286/306 en las que las posiciones de residuo se refieren a una posición en el polipéptido de SP-D maduro, tal como el ejemplo SEQ ID NO: 02, y una posición en el polipéptido de SP-D con su polipéptido guía, tal como el ejemplo s Eq ID NO: 01. En algunas realizaciones, la SP-D comprende Met11/31. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende Met11/31, Thr160/180, Ser 270/290 y Ala 286/306. En algunas realizaciones, el polipéptido de SP-D tiene una identidad con un polipéptido de SEQ ID NO: 02 en toda la longitud del polinucleótido de al menos 80 %, 90 %, 95 %, 99 % y 100 %, o cualquier porcentaje en un intervalo entre cualquiera de los porcentajes anteriores.
Tabla 1
En algunas realizaciones, la SP-D es una SP-D humana recombinante (rhSP-D). En algunas realizaciones, la rhSP-D se deriva de una línea de células de leucemia mieloide humana que expresa la rhSP-D de un transgén integrado.
Los ejemplos de vectores de expresión, polipéptidos de rhSP-D, líneas de células y métodos para purificar rhSP-D de estas células se proporcionan en U.S. 2019/0071693; y U.S. 2019/0071694.
Ciertos sistemas
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen sistemas electrónicos para determinar la actividad de una composición farmacéutica que comprende proteína surfactante-D (SP-D). Algunas de estas realizaciones pueden incluir un sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos: medir la proporción relativa de especies oligoméricas de SP-D en la composición farmacéutica; calcular la proporción relativa de dodecámeros de<s>P-D en la composición farmacéutica; y determinar la actividad de la composición farmacéutica con base en la proporción relativa de dodecámeros de SP-D, donde una mayor proporción relativa de dodecámeros de SP-D es indicativa de que la composición tiene un mayor nivel de actividad en comparación con la actividad de una composición que tiene una menor proporción relativa de dodecámeros de SP-D. En algunas realizaciones, la actividad comprende actividad antagonista en un ensayo de receptor tipo toll 4 (TLR4). Algunas realizaciones también incluyen calcular la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la composición farmacéutica. En algunas realizaciones, la medición comprende realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS). En algunas realizaciones, el cálculo comprende proporcionar un modelo de la especie oligomérica de SP-D que comprende geometrías tipo varilla y geometrías tipo esférico. En algunas realizaciones, el modelo comprende un modelo de Zimm y un modelo de Debye de segundo orden de la especie oligomérica de SP-D. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm y un agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen sistemas electrónicos para determinar la proporción relativa de especies oligoméricas de proteína surfactante-D (SP-D) en una muestra. Algunas de estas realizaciones pueden incluir un sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos: realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la muestra de SP-D; y determinar la proporción relativa de una especie oligomérica de SP-D a partir de los resultados del análisis por AF4-MALLS, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la muestra. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de r Ms mayor que 70 nm en la muestra.
Algunas realizaciones de los métodos y composiciones proporcionados en la presente incluyen sistemas electrónicos para determinar la proporción relativa de especies oligoméricas activas de proteína surfactante-D (SP-D) en una muestra. Algunas de estas realizaciones incluyen un sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos: realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS) en la muestra de SP-D; medir la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la muestra de SP-D; medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm; y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm; y calcular una relación entre cada una de las proporciones relativas medidas. En algunas realizaciones, la al menos una especie oligomérica de SP-D comprende agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm. Algunas realizaciones también incluyen integrar un fractograma del análisis por AF4-MALLS en picos. Algunas realizaciones también incluyen medir un área de pico relativa (RPA) del fractograma para al menos un pico indicativo de una especie oligomérica de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un dodecámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm. En algunas realizaciones, el oligómero tipo estrella de SP-D tiene una masa molar menor que o igual a aproximadamente 6 MDa. En algunas realizaciones, el agregado de SP-D tiene una masa molar mayor que 6 MDa. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de especies oligoméricas tipo estrella de SP-D en la muestra que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm en la muestra. Algunas realizaciones también incluyen medir la proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la muestra.
En algunas realizaciones, se predice que la muestra de SP-D tiene actividad antagonista en un ensayo de receptor tipo toll de lipopolisacárido 4 (LPS-TLR4).
En algunas realizaciones, la muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de dodecámeros de SP-D mayor que o igual a 35 % de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad. En algunas realizaciones, una muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de dodecámeros de SP-D mayor o igual a un cierto porcentaje de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad, el porcentaje puede ser 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y cualquier porcentaje entre cualquiera de dos de los porcentajes anteriores.
En algunas realizaciones, la muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm menor que 5 % de la especie oligomérica de SP-D total en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad. En algunas realizaciones, una muestra de SP-D que tiene una proporción relativa de agregados de SP-D menor que un cierto porcentaje de la especie oligomérica de SP-D en la muestra es indicativa de que la muestra de SP-D tiene actividad, el porcentaje puede ser 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 3 %, 2 %, 1 % y cualquier porcentaje entre cualquiera de dos de los porcentajes anteriores.
En algunas realizaciones, la AF4-MALLS se realiza en ausencia de un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en EDTA y EGTA.
En algunas realizaciones, la SP-D es una SP-D humana recombinante (rhSP-D). En algunas realizaciones, la rhSP-D se deriva de una línea de células de leucemia mieloide humana que expresa la rhSP-D de un transgén. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 02. En algunas realizaciones, la rhSP-D comprende un residuo en una posición polimórfica que corresponde a un residuo seleccionado del grupo que consiste en Met11, Thr160, Ser 270 y Ala 286.
En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a la masa. En algunas realizaciones, la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a un área de pico relativa (RPA) o un RPA ajustada en un análisis por AF4-MALLS.
Ejemplos
Ejemplo 1- Análisis por microscopio de fuerza atómica de rhSP-D
Las especies oligoméricas de una SP-D humana recombinante (rhSP-D) se caracterizaron por microscopio de fuerza atómica (AFM).Véase por ejemplo,Arroyo R, et al. (2017) Biophysical Journal 112 (3): 503a. Una solución que comprende 0,85 ng/pl de rhSP-D en amortiguador de dilución (NaCl 200 mM, Tris 20 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM) se colocó en sustrato de mica recién escindido. Las muestras se formaron en imágenes con un microscopio de fuerza atómica de Nanotec (Nanotec Electrónica, Madrid, España) y PointProbePlus tips, tipo PPP-NC<h>(Nanosensors, Neuchátel, Suiza). El tamaño de imagen para los estudios cuantitativos fue 1 pm x 1 pm con 512 píxeles, y se obtuvo a una velocidad de 1 línea/segundo. Las imágenes sin procesar se sometieron a sustracción de plano general, aplanamiento con sustracción de fondo y remoción de líneas de artefacto.
Las especies oligoméricas identificadas en las imágenes obtenidas incluyeron trímeros, hexámeros, dodecámeros y oligómeros tipo estrella. Los trímeros tuvieron un aspecto tipo varilla, y se midió que algunos trímeros tuvieron una longitud promedio de aproximadamente 65 nm (± 8,6 nm). Los dodecámeros tuvieron un aspecto en forma de X, y se midió que algunos dodecámeros tuvieron una longitud de punta a punta opuesta de aproximadamente 136 nm (± 8,1 nm). Las especies tipo estrellas incluyeron miembros que tuvieron una apariencia en forma de estrella compuesta por 6-20 trímeros, cada trímero unido a un miembro particular de esta especie a través de un eje central. Se midió que algunas especies similares a estrellas tienen un diámetro de aproximadamente 140 nm, similar al diámetro de los dodecámeros medidos. La tabla 2 resume la distribución y frecuencia de las especies oligoméricas observadas.
Tabla 2
Ejemplo 2- Análisis por AF4-MALLS de rhSP-D
La distribución de diferentes especies oligoméricas de rhSP-D se determinó por un análisis por AF4-MALLS. Para el análisis por AF4-MALLS, las muestras de rhSP-D se separaron por un sistema AF4 (Eclipse Dual Tec, Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA) seguido de UV (detector de longitud de onda variable Ultimate 3000, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) y análisis MALS (detector Dawn Heleos II, Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA). Se usó un sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) para inyectar las muestras y administrar la fase móvil al sistema AF4. La configuración de AF4 usó un canal corto con un espaciador de 350 |jm de espesor (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA). El análisis de los datos y los cálculos se realizaron usando el software Chromeleon (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) y ASTRA (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA). Los resultados del análisis por AF4-MALLS incluyeron un fractograma con varios picos.
El software ASTRA (versión 6.1.1.17) calculó lo siguiente: momentos de radio de masa molar y media cuadrática (RMS) para cada pico seleccionado. Los momentos se referenciaron a promedios sobre toda la muestra, que pueden incluir muchos picos. La ecuación (1) se refiere a la masa molar promedio en número:
Una medición de ASTRA habitualmente requería una determinación de concentración independiente. Puesto que la relación entre la concentración (mg/ml) y densidad numérica (número/ml) fue nM = c, se pudieron determinar los resultados de la ecuación (2). La ecuación (2) se refiere a la masa molar promedio en peso:
El valor de índice de polidispersidad fue: p = Mw/ Mn. Habitualmente, un valor mayor que 12 se consideró polidisperso, en tanto que los valores menores que 1,1 se designaron como que tienen baja polidispersidad.
A fin de determinar la masa molar, se seleccionaron modelos matemáticos mixtos para calcular el tamaño y MW de la molécula en un análisis de rhSP-D usando datos de dispersión de luz. Como se indica en la presente, las imágenes de AFM demostraron que las especies oligoméricas de rhSP-D incluyeron monómeros, dímeros, trímeros, hexámeros, dodecámeros y estructuras oligoméricas de orden superior. Las imágenes de AFM demostraron estructuras que tuvieron forma de varilla, forma de X y tipo estrella. Las estructuras tipo estrella se midieron por AFM y se calculó que tenían un radio de aproximadamente 70 nm, que se caracterizaron mejor por un modelo de Debye de segundo orden (P Debye, "Molecular-weight determination by light scattering," J. Phys. Coll. Chem., vol. 51, pp. 18-32 (1947)). El modelo de Debye usa el formalismo R0/K*c y proporcionó mejores resultados en un intervalo más amplio de masa molar, incluidas masas muy grandes (mayores que ~106 Daltons o ~100 nm de radio RMS). El modelo de Debye se aplicó al análisis del pico 4 como se describe en la presente. Las estructuras en forma de varilla se midieron por AFM y se calculó que tienen una longitud de aproximadamente 65 nm. Las estructuras en forma de X se midieron por AFM y se calcularon a una longitud de aproximadamente 135 nm. Tanto las estructuras en forma de varilla como las en forma de X se caracterizaron mejor por un modelo de varilla. La ecuación de Zimm se ajustó a Re/K*cvs. sen(0/2). B.H. Zimm, J. Chem. Phys., vol. 16, pp. 1093-1099 (1948). El factor de forma teórico P(0) para el modelo deseado se ha derivado para esferas, esferas recubiertas y varillas y se cubren en el texto de van de Hulst (H.C. van de Hulst, Light Scattering by Small Particles, Wiley, New York (1957)). Los modelos de esfera y esfera recubierta produjeron radios geométricos, en tanto que el modelo de varilla produjo una longitud. El modelo de varilla se aplicó al análisis de los picos 1, 2 y 3 como se describe en la presente. El modelo de varilla resultante se describe por la siguiente ecuación:
dondeu=[(2nno/Áo) L sen(G/2)J,y L es la longitud de varilla,
que se asume que es mucho mayor que su diámetro insignificante
La diversidad de estructuras de SP-D no se pudo alojar con un modelo individual. Por lo general, el modelo de Zimm puede ser suficientemente flexible para acomodar múltiples geometrías, pero en el caso de SP-D, se usó un análisis modal mixto que combinó el uso del modelo de Debye de segundo orden con el modelo de varilla. El modelo de Debye de segundo orden se aplicó a especies oligoméricas de SP-D que incluyen agregados que tienen un radio mayor que 70 nm (pico 4). El modelo de varilla se aplicó a estructuras de SP-D tipo varilla que incluían monómero, dímero, trímero, hexámero y dodecámero (picos 1 y 2). Hubo una transición entre el dodecámero y la formación de estructuras tipo estrella (pico 3) para las cuales se aplicó el modelo de varilla para la mejor caracterización de MW. El modelo mixto se ajustó mejor a los datos de AF4-MALLS y fue consistente con las mediciones geométricas obtenidas por AFM.
Las muestras se integraron en cuatro secciones de picos, picos 1-4, usando una combinación de análisis de la señal UV y un análisis de la masa molar como se determina por dispersión de luz. Todas las áreas relativas se calcularon usando una integración desplegable en los puntos seleccionados. El pico 2 correspondió a un pico de dodecámero de rhSP-D, cuyos límites se determinaron al analizar la masa molar y el índice de polidispersidad. Un punto central, usualmente el punto más alto de la traza UV, y los límites se establecieron equidistantes de ese punto. La polidispersidad de esa sección se mide por Mw/Mn, como se describe en la presente. Habitualmente, un valor mayor que 12 se consideró polidisperso, en tanto que los valores menores que 1,1 se designaron como que tienen baja polidispersidad. Los límites se movieron hasta que el índice de polidispersidad fue aproximadamente 1,05. Los índices variaron entre 1,008 y 1,090. Se observó que ligeros movimientos de los límites de los picos pueden provocar cambios en el índice. Los límites de pico 3 se establecieron desde el límite posterior del pico 2 hasta la caída en la traza UV encontrada a los 36,5 minutos. El límite exterior del pico 4 se estableció en 45 minutos. A los 45 minutos se había apagado el flujo cruzado. Cualquier material restante en el canal comenzó a eluirse en ese momento y efectivamente no hubo separación. El pico 1 incluyó todas las especies más bajas que un dodecámero de rhSP-D. En algunos casos, se resolvieron especies de menor peso molecular y se realizaron integraciones separadas. Fue posible superponer la traza de MW sobre la traza de UV y se encontraron puntos de integración para hexámeros (258 kDa), trímeros (129 kDa), dímeros (86 kDa) y monómeros (42 kDa). Los picos eran bastante estrechos y se pueden determinar de forma fiable.
En una serie inicial de estudios, los parámetros de flujo cruzado se investigaron usando la composición de fase móvil original (amortiguador Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM). Una vez que se estableció el programa de flujo cruzado, una serie de experimentos investigaron los efectos de la composición de fase móvil, dando por resultado la remoción de EDTA de la fase móvil compuesta por Tris 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4. Se realizaron ajustes finales a los pasos de enfoque, dando por resultado un método final que tiene un tiempo de ejecución de 59,2 minutos. La tabla 3 lista los parámetros usados para el AF4.
Tabla 3
Membrana: PES de 10 kD
En otra serie de estudios, se analizaron 102 formulaciones liofilizadas de rhSP-D obtenidas de 17 líneas de células diferentes que expresan la rhSP-D de un transgén integrado. Esto incluye líneas de células: S888, S990, S991, S1010, S2099 y doce líneas de células numeradas de 2428 a 2439. La reproducibilidad del método AF4 se midió usando cuatro métricas diferentes: (i) área total bajo el fractograma, que indica precisión, (ii) área relativa del dodecámero, (iii) masa molar calculada del dodecámero a partir de los datos de MALLS y (iv) la polidispersidad de la masa molar dentro de la envoltura de pico de dodecámero. La desviación estándar relativa (rsd) se calculó para cada métrica en todas las muestras. En promedio, el área total bajo el fractograma, indicativa de precisión, mostró valores de rsd que variaron de 4,3 % a 5,3 %. En otras palabras, el área total para estos fractogramas complejos fue reproducible dentro de aproximadamente 5 % de ejecución a ejecución para una muestra dada. Sin embargo, el área relativa del dodecámero de rhSP-D en estas muestras varió ampliamente, de aproximadamente 25 % a 65 %, y estas cantidades relativas fueron reproducibles, con los valores de rsd que varían de aproximadamente 5 % a 6,5 %. La rsd promedio para la masa molar calculada a partir de los datos de MALLS fue muy baja a 0,86 %. Finalmente, los valores de índice de polidispersidad (PDI) calculados a partir de los datos de MALLS exhibieron valores de rsd promedio de aproximadamente 1,5 %.
Los datos usando AF4-MALLS se analizaron para determinar la masa molar absoluta y el tamaño de rhSP-D en un cierto tiempo durante la elución. La relación de tamaño a masa fue indicativa de la forma de la rhSP-D. A partir de la relación de tamaño a masa, se determinó que en las primeras etapas de una elución (0-34 minutos) la molécula de rhSP-D tenía una forma lineal o de varilla. Para los cálculos de modelo de varilla, el software asumió que el espesor de una partícula en forma de varilla era insignificante (0,0 nm) en comparación con su longitud. Se determinó que las longitudes de varilla eran consistentes con las mediciones de<a>F<m>de 136 ± 8,1 nm (N=50 moléculas individuales). Las etapas posteriores de la elución (34-45 minutos) para rhSP-D indicaron que se estaba observando una estructura más compacta. Se empleó un modelo de Debye de segundo orden para el análisis de estas etapas de la elución. El modelo de Debye de segundo orden proporcionó mejores resultados en un intervalo más amplio de masas molares, incluido el muy grande (mayor que ~106 Daltons o ~50 nm de radio RMS). Para los dodecámeros de rhSP-D, se determinó que el peso molecular es 520,09 /- 4,61 kDa (N=72 determinaciones).
Un primer pico en el fractograma (pico 1) contuvo trímeros y hexámeros de rhSP-D con base en cálculos de masa de acuerdo con el modelo de varilla. Un segundo pico en el fractograma (pico 2) contuvo dodecámeros de SP-D. Un tercer pico en el fractograma (pico 3) contuvo especies intermedias entre dodecámeros de rhSP-D y oligómeros tipo estrellas de rhSP-D con base en el peso molecular intermedio determinado por el modelo de varilla. Un cuarto pico en el fractograma (pico 4) contuvo una masa heterogénea de oligómeros de rhSP-D con radio de RMS constante de aproximadamente 70 nm consistente con lo que se ha observado por mediciones de AFM para la especie oligomérica tipo estrella, y especies más grandes que tienen un radio mayor que 70 nm. Más allá de 36 minutos en el fractograma, el radio de RMS incrementó aún más, indicativo de especies de agregado adicionales. El área de pico relativa (RPA) para cada pico se determinó como un porcentaje del área de pico total de los cuatro picos.
Para determinar la distribución de especies oligoméricas en solución usando un análisis por AF4-MALLS con una mayor resolución, las especies del Pico 4 se analizaron adicionalmente. Se asumió que el peso molecular máximo para el oligómero de rhSP-D tipo estrella es aproximadamente 6 MDa con base en imágenes del análisis de AFM. El peso molecular máximo se usó como un corte nominal para distinguir los oligómeros de rhSP-D tipo estrella de los agregados más grandes. Sin embargo, las especies oligoméricas de rhSP-D asociadas con el pico 3 se incluyeron en la determinación de agregado cuando se usó el 6 MDa como punto de corte en el análisis. Esto fue inconsistente con el inicio claro de la elución de un nuevo pico cerca de 34 minutos. Se usó un corte basado en el tamaño de 70 nm en el análisis. El corte de 70 nm coincidió casi exactamente con el comienzo del pico 4, como se ve ya sea por la traza UV o por la traza LS total. Por lo tanto, usar el corte de 70 nm fue una medida más precisa para distinguir la presencia de agregado oligomérico de rhSP-D.
Se determinó un RPA ajustada para cada uno de los picos 3 y 4. Específicamente, se determinaron aspectos del RPA del pico 4 que correspondían a especies oligoméricas tipo estrella que tenían un radio de RMS constante de aproximadamente 70 nm, y estos aspectos se removieron del RPA del pico 4 y se agregaron al RPA del pico 3 para proporcionar un RPA ajustado para el pico 4 y pico 3. Por lo tanto, el RPA del pico 1, RPA del pico 2, RPA ajustada del pico 3 y RPA ajustada del pico 4 correspondieron a las distribuciones relativas de especies oligoméricas de rhSP-D en el análisis por AF4-MALLS para (1) trímeros y hexámeros; (2) dodecámeros; (3) especies oligoméricas tipo estrella que tienen un radio de RMS de aproximadamente 70 nm; y (4) agregados que tienen un radio de RMS mayor que 70 nm, respectivamente.
Se realizó un análisis por AF4-MALLS en tres muestras de rhSP-D obtenidas de diferentes líneas de células de leucemia mieloide humana que expresan rhSP-D de un transgén integrado. La tabla 4 resume los resultados.
Tabla 4
Como se muestra en la tabla 4, la muestra de rhSP-D 8B11 tenía un RPA para el pico 2 de 44,37 % que es fue ndicativo de que esta muestra tiene la mayor cantidad relativa de dodecámero de las tres muestras probadas. La muestra de rhSP-D 8B11 tuvo un RPA ajustada para el pico 4 de 1,04 %, lo que fue indicativo de que esta muestra tiene la cantidad relativa más baja de agregados que tienen un radio de RMS mayor que 70 nm, de las tres muestras probadas.
Ejemplo 3 -Actividad de rhSP-D en un ensayo de TLR4
Los receptores tipo Toll (TLR) tienen un papel tanto en el sistema inmunitario innato como en el sistema inmunitario adaptativo, y SP-D tiene actividad para modular la señalización a través de TLR, tal como el receptor tipo Toll 2 (Tl R2) y receptor tipo Toll 4 (Tl R4).Véase por ejemplo,Haagsman HP et al., (2008) Neonatology 93 :288-294; Yamazoe M. et al., (2008) J. Biol Chem. 283:35878-35888; y Vieira F. et al., (2017) Ann Anat 211:184-201. La actividad de TLR4 también puede modular la severidad de condiciones, tal como la displasia broncopulmonar (BPD) (Malash AH et al., (2016) Gene 592:23-28). Por lo tanto, la actividad de rhSP-D para modular la actividad de TLR4 se midió como una indicación del efecto de rhSP-D en una respuesta inmunitaria de hospedador. La actividad de las formulaciones reconstituidas que contienen rhSP-D se probó en un ensayo de LPS-TLR4. En un ensayo de LPS-TLR4, rhSP-D reconstituida puede inhibir las respuestas de células inflamatorias inducidas por lipopolisacárido (LPS) al evitar que LPS se una/active el receptor tipo Toll 4 (TLR4).Véase por ejemplo,Yamazoe M. et al., (2008) J. Biol Chem. 283:35878-35888.
La actividad de rhSP-D reconstituida en un ensayo de LPS-TLR4 se probó en un método sustancialmente similar al siguiente método. Las células HEK-Blue™ hTLR4 (InvivoGen, San Diego, CA, EUA) se colocaron en placas a una densidad de ~20000 células/pozo en placas de 384 pozos y se incubaron con diferentes concentraciones de SP-D durante 2 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Se adicionó l Ps (E.coliO26:B6, L5543 Sigma Aldrich) a una concentración de ECs<0>a cada pozo, y las células se incubaron durante otras 22 horas a 37 °C, CO<2>al 5 %. La actividad de TLR4 se midió al separar las células de los pozos, al lavar las células suspendidas, al resuspender las células en PBS y al remover cualquier grumo por pipeteo suave. Las células lavadas se transfirieron a una placa de 384 pozos a una densidad de 20e103 células/pozo que contenía medio de detección de azul HEK (InvivoGen, San Diego, CA, EUA) que se había preparado en agua libre de endotoxinas que contiene CaCh 5 mM y BSA al 1 % (v/v). Las células se incubaron a 37 °C en CO<2>al 5 % durante 24 horas, y la actividad de TLR4 se determinó al medir la actividad de un gen indicador de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) usando un espectrofotómetro a 655 nm. Se determinó un valor de IC<50>para la SP-D usando un análisis de regresión no lineal al ajustar los datos a la ecuación logística de cuatro parámetros. Debido a que solo el logaritmo de los valores de IC<50>se distribuyó normalmente, para los propósitos de promediar los números de una serie de experimentos, se usaron los valores de pIC<50>, definidos como -Logic (IC<50>). Se determinó un intervalo de curva a partir de la diferencia entre la respuesta máxima ajustada (Emáx) y la respuesta mínima ajustada (Emín) y corresponde a la amplitud de la curva de dosis-respuesta, o eficacia de la respuesta. Los resultados de un ensayo de LPS-TLR4 con muestras de rhSP-D se resumen en LA TABLA 5.
Tabla 5
Como se muestra en la tabla 5, la muestra de rhSP-D 8B11 fue la única muestra de clon celular probada que tuvo actividad en el ensayo de TLR4. En particular, la muestra de rhSP-D 8B11 fue la única muestra probada que tenía un RPA para el pico 2 mayor que 35 %.
Ejemplo 4- Actividad de rhSP-D en un ensayo de agregación bacteriana
La actividad de las muestras de rhSP-D se probó en un ensayo de agregación bacteriana. En un ensayo de agregación bacteriana, rhSP-D activa agrega células bacterianas y reduce la absorbancia / incrementa la transmisión a través de la suspensión bacteriana. El ensayo de agregación bacteriana se realizó por un método sustancialmente similar al siguiente método. En resumen, se preparó un cultivo exponencial de E.coli(ATCC: Y1088), se tomó una alícuota resuspendida en 1 ml de amortiguador (HEPES 150 mM, NaCl 20 mM pH 7,4). La absorbancia de la suspensión bacteriana se midió en un espectrómetro a 700 nm, y la suspensión bacteriana se ajustó para obtener una absorbancia en el intervalo de 1,0000 a 1,1000. Se adicionó CaCh 1 M a la suspensión para obtener una concentración final de CaCh 5 mM. Se crearon muestras de rhSP-D en amortiguador de placebo (15 |jl de volumen total para cada dilución) a las siguientes concentraciones: 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1, 0 jg/m l y se adicionaron a cubetas que contenían cada una 20 j l del amortiguador Hepes-NaCl. Entonces se adicionaron 600 j l de suspensión bacteriana a las cubetas, y se midió la absorbancia cada 2,5 minutos para cada cubeta a 700 nm, durante un total de 120 minutos. Las concentraciones probadas de rhSP-D incluyeron 0 jg/ml, 0,1 jg/ml, 0,25jg/ml, 0,5 jg/m l, 1,0 jg/m l y 5,0 jg/ml. Se calculó un porcentaje de agregación promedio a los 60 minutos a partir del valor de absorbancia a los 60 minutos en cada concentración probada, de acuerdo con la siguiente fórmula:
(! - íibs)* I QO-% Agregación
donde 1 = la absorbancia medida de la suspensión deE. colisin rhSP-D.
Abs = El valor de absorbancia de la suspensión deE. coli+ rhSP-D a 60 minutos.
Porcentaje (%) Los valores de agregación se promediaron de 3 réplicas y se importaron, junto con la desviación estándar, en GraphPad Prism v7.0c, (GraphPad, La Jolla, CA 92037). Los valores promediados se ajustaron usando una curva logística de 4 parámetros. Los valores resultantes para la EC50 y Span se determinaron para cada muestra de rhSP-D reconstituida. pEC50 es el -Log10 de la EC50.
Cada una de las muestras de rhSP-D 7H8, 1C4 y 8B11 tuvo actividad en el ensayo de agregación bacteriana.
Ejemplo 5- Análisis multivariante de especies oligoméricas de rhSP-D
Se realizó un análisis estadístico multivariante para determinar cualquier correlación entre los picos observados en los fractogramas en los análisis por AF4-MALLS para diferentes formulaciones de rhSP-D y la actividad de las muestras de rhSP-D en el ensayo de agregación bacteriana o el ensayo de TLR4. Los fractogramas digitalizados obtenidos de más de 40 muestras diferentes se usaron como una matriz de datos, y las correlaciones con los valores de pIC<50>medidos del ensayo TLR4, o los resultados de pEC<50>de los ensayos de actividad de agregación bacteriana se determinaron usando PLS.
Se realizó una validación cruzada completa en todos los modelos de calibración usando técnicas estándar.Véase por ejemplo,Katz, M.H. "Multivariate Analysis: A Practice Guide for Clinicians." Cambridge University Press, Nueva York, pp. 158-162 (1999); Stable, L. et al., (1988) "Multivariate data analysis and experimental design in biomedical research. Prog. Med. Chem. 25: 291-338; Wold S. (2001) "PLS-regression: a basic tool of chemometrics." Chemom. Intell. Lab. Syst. 58: 109-130. En resumen, se removió una muestra a la vez, se recalibró el conjunto de datos y se construyó un nuevo modelo. Este proceso se repitió hasta que todas las muestras de calibración se retiraron una vez y se cuantificaron como un modelo de validación. Por lo tanto, el primer conjunto, que contiene todas las muestras, se refirió como el conjunto de calibración y el posterior a la validación cruzada como el conjunto de validación. El algoritmo jack-knife se usó para determinar la significancia estadística de cualquier factor usado en la construcción de modelos de mínimos cuadrados parciales (PLS) (Martens, H. et al., (2001) "Multivariate Analysis of Quality: An Introduction" Wiley y Sons, Chichester, UK).
Con respecto a una correlación entre los picos particulares observados en el análisis por AF4-MALLS y la actividad en el ensayo de agregación bacteriana para diferentes formulaciones de rhSP-D, se encontró que la mayoría de la actividad residía en los picos 1 y 2, y algunos persistieron a lo largo del pico 3. Se encontró una correlación negativa entre el pico 4 y la actividad en el ensayo de agregación bacteriana. Con respecto a una correlación entre los picos particulares observados en el análisis por AF4-MALLS y la actividad en el ensayo de TLR4 para diferentes formulaciones de rhSP-D, se encontró que la actividad se localiza casi exclusivamente en el pico 2. Por lo tanto, la actividad de rhSP-D en el ensayo de TLR4 se relacionó directamente con las especies de dodecámeros de rhSP-D. Por lo tanto, un AF4-MALLS proporciona un método para determinar la proporción de la muestra que incluye dodecámeros activos en un ensayo de TLR4. En particular, las especies de agregado con radio >70 nm encontradas en el pico 4 corregido no se asociaron con actividad ni en el ensayo de agregación bacteriana ni en el ensayo de TLR4, lo que confirma que estas especies representaban formas inactivas de rhSP-D.
El término “que comprende”, como se usa en la presente, es sinónimo de “que incluye”, “que contiene” o “caracterizado porque”, y es inclusivo o abierto y no excluye elementos o pasos de método adicionales no citados.
La descripción anterior divulga varios métodos y materiales de la presente invención. La presente invención es susceptible de modificaciones en los métodos y materiales, así como alteraciones en los métodos y equipos de fabricación. Estas modificaciones llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de una consideración de esta divulgación o práctica de la invención divulgada en la presente. En consecuencia, no se propone que esta invención se limite a las realizaciones específicas divulgadas en la presente, sino que cubra todas las modificaciones y alternativas que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para determinar la actividad de una composición farmacéutica que comprende proteína surfactante-D (SP-D), el método comprende:
medir la proporción relativa de especies oligoméricas de SP-D en la composición farmacéutica al realizar un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS); y
calcular la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la composición farmacéutica, determinando de este modo la actividad de la composición farmacéutica, donde la actividad comprende actividad en un ensayo de receptor tipo toll 4 (TLR4), o en un ensayo de agregación bacteriana, y donde una composición que tiene una mayor proporción relativa de dodecámeros de SP-D tiene una mayor actividad en comparación con una composición que tiene una menor proporción relativa de dodecámeros de SP-D.
2. El método de la reivindicación 1, donde la actividad comprende actividad en un ensayo de receptor tipo toll 4 (TLR4).
3. El método de la reivindicación 1 o 2, que comprende además calcular la proporción relativa de agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la composición farmacéutica.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde el cálculo comprende proporcionar un modelo de la especie oligomérica de SP-D que comprende geometrías tipo varilla y geometrías tipo esférico.
5. El método de la reivindicación 4, donde el modelo comprende un modelo de Zimm y un modelo de Debye de segundo orden de la especie oligomérica de SP-D.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm y un agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende además integrar un fractograma del análisis por AF4-MALLS en picos; y opcionalmente, medir un área de pico relativa (RPA) del fractograma para al menos un pico indicativo de una especie oligomérica de SP-D seleccionada del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm, y agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm.
8. El método de la reivindicación 6 o 7, donde el oligómero tipo estrella de SP-D tiene una masa molar menor que o igual a aproximadamente 6 MDa.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 6-8, que comprende además medir la proporción relativa de especies oligoméricas tipo estrella de SP-D en la muestra que tiene un radio promedio de 70 nm o radio de RMS de 70 nm en la muestra; y opcionalmente, medir la proporción relativa de agregados de SP-D que tienen un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la muestra.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde la AF4-MALLS se realiza en ausencia de un agente quelante seleccionado del grupo que consiste en EDTA y EGTA.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde la proporción relativa de la especie oligomérica es con respecto a un área de pico relativa (RPA) o un RPA ajustada en un análisis por AF4-MALLS.
12. Un sistema electrónico para determinar la actividad de una composición farmacéutica que comprende proteína surfactante-D (SP-D), el sistema que comprende un procesador que tiene instrucciones configuradas para ejecutar los siguientes pasos:
determinar la proporción relativa de especies oligoméricas de SP-D en la composición farmacéutica a partir de datos obtenidos de un fraccionamiento de flujo de campo de flujo asimétrico con análisis por dispersión de luz láser de múltiples ángulos (AF4-MALLS);
calcular la proporción relativa de dodecámeros de SP-D en la composición farmacéutica; y
determinar la actividad de la composición farmacéutica con base en la proporción relativa de dodecámeros de SP-D, donde una mayor proporción relativa de dodecámeros de SP-D es indicativa de que la composición tiene un mayor nivel de actividad en comparación con la actividad de una composición que tiene una menor proporción relativa de dodecámeros de SP-D.
13. El sistema de la reivindicación 12, que comprende además calcular la proporción relativa de agregado de SPD que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o radio de RMS mayor que 70 nm en la composición farmacéutica.
14. El sistema de la reivindicación 12 o 13, donde el cálculo comprende proporcionar un modelo de la especie oligomérica de SP-D que comprende geometrías tipo varilla y geometrías tipo esférico; y opcionalmente, donde el modelo comprende un modelo de Zimm y un modelo de Debye de segundo orden de la especie oligomérica de SP-D.
15. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, que comprende además medir la proporción relativa de al menos una especie oligomérica de SP-D en la muestra de SP-D, donde la especie oligomérica de SP-D se selecciona del grupo que consiste en un trímero de SP-D, un hexámero de SP-D, un oligómero tipo estrella de SP-D que tiene un radio promedio de 70 nm o un radio de RMS de 70 nm y un agregado de SP-D que tiene un radio promedio mayor que 70 nm o un radio de RMS mayor que 70 nm.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7590631B1 (ja) * 2023-03-23 2024-11-26 積水メディカル株式会社 肺サーファクタントプロテインｄの測定方法、測定キット、モノクローナル抗体及び細胞

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6333041B1 (en) * 1998-03-02 2001-12-25 Children's Hospital Medical Center Nontoxic vernix compositions and method of producing
US6838428B2 (en) 1998-10-20 2005-01-04 Children's Hospital Medical Center Surfactant protein D for the prevention and diagnosis of pulmonary emphysema
US8933032B2 (en) 1998-10-20 2015-01-13 Children's Hospital Medical Center Surfactant protein D for the treatment of disorders associated with lung injury
US7199097B1 (en) 1998-11-19 2007-04-03 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Peptide fragments having cell death inhibitory activity
EP1440083B1 (en) 2001-10-25 2013-01-02 Medical Research Council Molecules
US20050137126A1 (en) * 2003-04-09 2005-06-23 Natlmmune A/S Treatment of SARS in individuals
KR100770362B1 (ko) * 2004-12-30 2007-10-26 (주)두비엘 분무건조 고분자형 콜렉틴족 단백질 및 그의 제조방법
CA2628472C (en) * 2005-11-03 2015-01-27 Children's Hospital Medical Center Surfactant protein-d for prevention and treatment of lung infections and sepsis
CN102947335B (zh) 2010-04-15 2018-11-06 基因泰克公司 抗多聚遍在蛋白抗体及使用方法
PL2661308T3 (pl) 2011-01-05 2019-10-31 Prenatal Int Gmbh Hipotoniczna formulacja wodna ze zmniejszoną zawartością chloru z lub bez fosfolipidów
CN104010655B (zh) * 2011-11-11 2018-06-22 菲利普莫里斯生产公司 普通烟草中产生的包含血凝素的流感病毒样颗粒(vlp)
RS60068B1 (sr) 2012-10-26 2020-05-29 Oncopeptides Ab Liofilisani preparati melfalan flufenamida
ES2572919T3 (es) 2014-05-23 2016-06-03 Ares Trading S.A. Composición farmacéutica líquida
WO2017143024A2 (en) 2016-02-16 2017-08-24 President And Fellows Of Harvard College Pathogen vaccines and methods of producing and using the same
MX2020002551A (es) 2017-09-06 2020-08-20 Airway Therapeutics Inc Metodos, composiciones y celulas para preparar proteina surfactante d (sp-d).
EP3679066A4 (en) 2017-09-06 2021-06-09 Airway Therapeutics, Inc. Methods and compositions for preparing surfactant protein d (sp-d)
RU2020131642A (ru) 2018-03-29 2022-04-29 Эйрвэй Терапьютикс, Инк. Способы и композиции, содержащие сурфактантный белок d (sp-d)

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