ES2919825T3 - Arabinanasa y usos de la misma - Google Patents
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Abstract
La invención se relaciona con el uso de una enzima arabinanasa aislada que comprende las actividades de (1-5)-Α -arabinofuranosídica endohidrólisis en (1-5)-Α -l-arabinans (EC3.2.1.99), y Hidrólisis de (1-5)- Α -arabinofuranosídico enlaces en el extremo no reductor de α -l-arabinans o α -l-arabinosa-oligómeros (EC3.2.1.55), particularmente un arabinano degradante La enzima aislada de Arxula adeninivorans como aditiva para el alimento en la cría de ganado. Además, la invención se relaciona con la aplicación de la Arabinanasa en la producción de jugos de frutas o biocombustibles. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Arabinanasa y usos de la misma
La presente invención se refiere a enzimas hidrolíticas con actividad arabinanasa y su uso como aditivo para piensos en la cría de ganado.
Antecedentes de la invención
El arabinano es un polisacárido neutro que se presenta principalmente como cadena lateral de pectina. Un a-L-arabinano lineal consiste de una estructura principal de monómeros de arabinosa enlazados por enlaces a-1,5-glicosídicos (arabinofuranosídicos). En un a-L-arabinano ramificado, los monómeros de arabinosa o los oligómeros de arabinosa se unen a la estructura principal mediante enlaces a-1,2- o a-1,3-glicosídicos (arabinofuranosídicos).
Las arabinanasas son enzimas hidrolíticas capaces de escindir el arabinano. Las endo-arabinanasas (EC 3.2.1.99) hidrolizan los enlaces a-1,5-glicosídicos dentro de la estructura principal lineal de los a-L-arabinanos. Las a-L-arabino-furanosidasas (EC 3.2.1.55) hidrolizan los enlaces glicosídicos a-1,5- y/o a-1,3- y/o a-1,2- en el extremo no reductor de los a-L -arabinanos u oligómeros de a-L-arabinosa, liberando de este modo monómeros de arabinosa.
La harina de colza (RSM) y la harina de soja (SBM) son subproductos del bioetanol y la producción de alimentos. Son económicos, están disponibles a gran escala y tienen un alto contenido de proteínas. Por estas razones, a menudo se usan como ingredientes de piensos para aves y cerdos. Contienen muchos polisacáridos no amiláceos (NSP), principalmente pectina, que los animales solo pueden digerir parcialmente.
Si un ingrediente del pienso se digiere solo parcialmente, no se utiliza toda la energía contenida en el ingrediente del pienso. Además, los NSP no digeridos tienen un efecto sobre la viscosidad del pienso dentro del tracto digestivo.
Para mejorar la digestión de los NSP, los ingredientes del pienso o el pienso compuesto pueden ser pretratados mecánica, térmica o enzimáticamente.
La WO 1992017592 A1 ("Cloning and expression of DNA molecules encoding arabinan-degrading enzymes of fungal origin) describe la clonación de una arabinanasa fúngica y su uso en la producción de zumos de frutas y verduras.
La WO 1994020611 A1 ("An enzyme with arabinanase activity") describe una preparación enzimática enriquecida en una arabinanasa de Aspergillus aculeatus.
La WO 1995029598 A1 ("Enzymatic treatment of soy”) describe una mezcla de enzimas que comprende varias actividades enzimáticas (incluyendo una endo-arabinanasa de origen fúngico) para el tratamiento de una suspensión acuosa de harina de soja.
La US 2011/0287135 ("Novel arabinohydrolases") describe una composición multienzimática que comprende varias enzimas con actividad de arabinanasa para hidrolizar arabinanos presentes en la biomasa vegetal.
UNIPROT-ID:AOA060TAE2 es una entrada de la base de datos Uniprot (www.uniprot.org) que divulga una secuencia idéntica a la SEQ ID NO 02.
EMBL-ID:CDP37734 es una entrada de la base de datos EMBL (www.ebi.ac.uk) referente a secuencias idénticas a las SEQ ID NO 01/02.
El problema que subyace a la presente invención es mejorar la digestibilidad de los ingredientes de piensos ricos en pectina o piensos mixtos. El problema se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes.
Descripción de la invención
Un primer aspecto de la invención se refiere al uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa en la preparación de un aditivo para piensos, dicha enzima caracterizándose por una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO 02.
En ciertas realizaciones, la enzima comprende las actividades de
a. endohidrólisis de enlaces (1-5)-a-arabinofuranosídicos en (1-5)-a-L-arabinanos (EC 3.2.1.99), y b. hidrólisis de enlaces (1-5)-a-arabinofuranosídicos en el extremo no reductor de a-L-arabinanos u oligómeros de a-L-arabinosa (EC 3.2.1.55).
En ciertas realizaciones, la enzima cataliza adicionalmente la hidrólisis de enlaces (1-3)-a- y/o (1,2)-aarabinofuranosídicos en el extremo no reductor de a-L-arabinanos o a-L-arabinosa-oligómeros.
En ciertas realizaciones, la enzima muestra una actividad óptima a una temperatura entre 40° C y 55° C, y/o a un pH entre 3,5 y 5,5.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa de acuerdo con el primer aspecto en la alimentación de ganado.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa para la fabricación de una preparación enzimática de un solo componente para la preparación de un aditivo para piensos, en donde dicha enzima se caracteriza por una identidad de por lo menos un 98% con la SEQ ID NO 02. En ciertas realizaciones, la preparación enzimática de un solo componente se usa en la alimentación del ganado.
Otro aspecto de la invención se refiere a un pienso compuesto que comprende, o consiste esencialmente de
a. una biomasa rica en pectina seleccionada de remolacha azucarera, semillas oleaginosas, altramuces y leguminosas, y
b. una preparación enzimática de un solo componente como se especifica en el aspecto anterior.
En ciertas realizaciones, el pienso compuesto comprende además una biomasa que comprende almidón, particularmente grano o maíz.
En ciertas realizaciones, la concentración de dicha preparación enzimática es de 1-500 mg/kg.
En ciertas realizaciones, el pienso compuesto comprende además una enzima aislada adicional seleccionada de fitasa, proteasa y una enzima degradante de NSP, dicha enzima aislada adicional estando presente a una concentración de 1-500 mg/kg, incluso más particularmente 10-400 mg/kg, incluso más particularmente 100 300 mg/kg.
En ciertas realizaciones, el ganado se selecciona de animales monogástricos.
Dentro del contexto de la presente memoria descriptiva, el término "arabinano" significa un polisacárido que comprende una estructura principal de monómeros de arabinosa enlazados por enlaces glicosídicos a-1,5. En un arabinano ramificado, los monómeros de arabinosa o los oligómeros de arabinosa están enlazados a la estructura principal a través de enlaces glicosídicos a-1,2 y a-1,3 (Fig. 1).
Dentro del contexto de la presente memoria descriptiva, el término "enzima" significa una única proteína que consiste de una única cadena de aminoácidos.
Dentro del contexto de la presente memoria descriptiva, el término "enzima aislada" significa que dicha enzima se produjo/aisló intencionalmente y no es un componente o subproducto aleatorio, menor o insignificante.
La enzima de acuerdo con la presente invención se amplificó a partir de ADN genómico de A. adeninivorans.
La presencia tanto de actividad de endoarabinanasa como de actividad de arabinofuranosidasa tiene la ventaja de que el arabinano ramificado puede degradarse de manera más eficiente. La actividad de arabinofuranosidasa degrada los oligómeros de arabinosa enlazados a la estructura principal de arabinano y elimina los monómeros de arabinosa enlazados a la estructura principal de arabinano (desramificación). Paralelamente, la estructura principal lineal es degradada por la actividad de endoarabinanasa (despolimerización). Se sabe que la actividad de endoarabinanasa se inhibe en presencia de oligómeros de arabinano. Debido a la actividad de arabinofuranosidasa, se degradan los oligómeros producidos durante la despolimerización.
Sin formulación adicional, la enzima de acuerdo con la presente invención es termoestable hasta una temperatura de aprox. 65° C. Durante la incubación a 60° C durante 2 horas, la actividad enzimática no disminuye. Esto significa una estabilidad térmica mejorada en comparación con la arabinanasa aislada de Aspergillus aculeatus (WO 1994020611 A1), que se inhibe parcialmente a 50° C. La enzima de acuerdo con la presente invención también es estable entre pH 3 y pH 9 ya una concentración de sal de 50-100 mmol/l.
Estas propiedades permiten la generación de piensos que comprenden la enzima de acuerdo con la presente invención. La actividad de la arabinanasa puede protegerse adicionalmente, por ejemplo, mediante un recubrimiento protector contra el calor que evita la pérdida de actividad enzimática durante la granulación.
La enzima de acuerdo con la presente invención es activa en las condiciones ambientales dentro del tracto digestivo.
También se divulga el uso de la enzima aislada de acuerdo con cualquier realización del primer aspecto de la invención para la degradación de la biomasa vegetal o para la preparación de un aditivo de materia prima. También se divulga que la biomasa vegetal es una biomasa vegetal rica en pectina.
También se divulga una secuencia de ácidos nucleicos aislada. Esta secuencia de ácidos nucleicos a partir de la cual puede expresarse la enzima para llevar a cabo la presente invención
a. codifica la enzima de acuerdo con el primer aspecto de la invención; y/o
b. comprende o consiste esencialmente de la secuencia de ácidos nucleicos especificada por la SEQ ID NO 01. que el procedimiento de alimentación por lotes comprende una fase por lotes y una fase de alimentación, en donde la fase de alimentación se realiza a pH 6 y 40% de pO2.
En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término "pienso compuesto" se refiere a un pienso para animales que comprende múltiples componentes. Los ejemplos no limitativos de tales componentes son componentes que contienen carbohidratos, componentes que contienen proteínas y aditivos para piensos como vitaminas o preparaciones enzimáticas.
En el contexto de la presente invención, el término "biomasa rica en pectina" se refiere a una biomasa en la que las paredes celulares contienen más del 12% de pectina en peso seco. Ejemplos no limitativos de biomasa rica en pectina son soja y harina de soja (SBM), altramuces, colza, harina de colza (RSM), otras semillas oleaginosas y legumbres y remolacha azucarera.
También se divulga que el pienso compuesto comprende un 5%-50% (p/p), particularmente un 15%-25% (p/p) de una biomasa rica en pectina.
En otras palabras, la invención proporciona un pienso compuesto que tiene un porcentaje significativo de biomasa rica en pectina y una única preparación enzimática añadida para facilitar la utilización del componente de pectina. Los componentes de pectina y arabinanasa pueden granularse individualmente o junto con componentes de piensos compuestos convencionales que son ricos en almidón (trigo, maíz) y típicamente constituyen entre el 50% y el 95% del pienso compuesto que se alimenta a un animal de granja.
El uso de la enzima de acuerdo con la presente invención como aditivo para piensos mejora la digestibilidad de alimentos ricos en pectina como soja y harina de soja (SBM), altramuces, colza, harina de colza (RSM), otras semillas oleaginosas y legumbres y remolacha azucarera.
Sorprendentemente, los inventores descubrieron que la adición de la arabinanasa bifuncional altamente activa de acuerdo con la presente invención es capaz de mejorar la degradación de los ingredientes de piensos ricos en pectina como la harina de soja o la harina de colza en un grado inesperado. La arabinanasa actúa exclusivamente sobre el arabinano. Libera polímeros, oligómeros y monómeros de arabinosa, que pueden aprovecharse aún más. Además, se mejora la fluidez del pienso. El efecto observado es sorprendente, ya que la enzima no actúa sobre la estructura principal de pectina que consiste principalmente de poligalacturonano. Las preparaciones de pectinasa como Ronozyme VP (DSM) actúan principalmente sobre la estructura principal de la pectina.
Inesperadamente, la arabinanasa de acuerdo con la presente invención es más rápida y eficaz que las preparaciones de pectinasa comparables en la liberación de oligómeros y/o monómeros de arabinosa a partir de polímeros de origen natural. Es ventajoso un efecto rápido de los aditivos de piensos, ya que el tiempo de retención en el tracto intestinal es de solo 4 a 8 horas para las aves de corral y otros animales monogástricos (Enzyms in farm animal Nutrition, 2a edición, Bedford und Partridge, 2010).
También se divulga que la biomasa rica en pectina se selecciona de remolacha azucarera, semillas oleaginosas y leguminosas, más particularmente colza, harina de colza, altramuces, soja y harina de soja.
También se divulga que el pienso compuesto comprende dos enzimas aisladas, seleccionadas de:
a. la enzima de acuerdo con el primer aspecto de la invención y una fitasa;
b. la enzima de acuerdo con el primer aspecto de la invención y una enzima degradante de NSP, particularmente una pectinasa; y
c. la enzima de acuerdo con el primer aspecto de la invención y una proteasa, particularmente una serina proteasa estable frente a ácidos.
Se han demostrado los efectos sinérgicos de la arabinanasa y la fitasa en las dietas de aves de corral. Sin pretender estar limitados por la teoría, los inventores creen que la degradación parcial de la pectina por la arabinanasa reduce el efecto antinutritivo de esta fracción particular de NSP y aumenta la energía metabolizable aparente. La hidrólisis de las cadenas laterales de arabinano también puede facilitar la degradación del fitato, que se vuelve más accesible, por la fitasa suplementada, lo que da como resultado una mayor liberación de fósforo y oligoelementos complejados.
La suplementación de enzimas degradadoras de arabinanasa y NSP, en particular una pectinasa, muestra efectos sinérgicos en las dietas de aves de corral. Las ventajas de ambas enzimas, es decir, la rápida despolimerización de las cadenas laterales por la arabinanasa y la eficiente degradación de la estructura principal de la pectina por una pectinasa, llevan a una reducción de los efectos antinutritivos en las dietas ricas en NSP y a un aumento de la energía metabolizable aparente (Fig. 3 y 4).
Se han demostrado los efectos sinérgicos de la proteasa y la arabinanasa en las dietas de aves de corral. La degradación parcial de la pectina por la arabinanasa reduce el efecto antinutritivo de esta fracción de NSP particular. La degradación de las cadenas laterales de arabinanos facilita el acceso a las proteínas, que están parcialmente enjauladas por pectinas y fibra. La degradación de proteínas antes inaccesibles es catalizada por la proteasa lleva a una mayor liberación de péptidos y aminoácidos. Parece como si la energía metabolizable aparente aumentara fuertemente por el enfoque combinado.
Breve descripción de las figuras.
La Figura 1 muestra un dibujo esquemático del arabinano.
La Figura 2 muestra el procedimiento de alimentación por lotes.
La Figura 3 muestra la degradación de harina de soja por la arabinanasa de acuerdo con la presente invención y por aditivos de piensos establecidos.
La Figura 4 muestra la degradación de harina de colza por la arabinanasa de acuerdo con la presente invención y por aditivos de piensos establecidos.
La Figura 5 muestra la degradación de harina de soja por la arabinanasa de acuerdo con la presente invención y por la arabinanasa de A. niger.
La Figura 6 muestra la degradación de harina de colza por la arabinanasa de acuerdo con la presente invención y por la arabinanasa de A. niger.
Ejemplos
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren la invención y ciertas realizaciones de la misma, sin limitar el alcance de la invención.
Clonación y transformación de levadura
El gen de la arabinanasa (AABN) se amplificó a partir del ADN genómico de A. adeninivorans con los oligos 5'-CAGGAATTCG GCAGAGGCAC AATGAAGA-3' (SEQ ID NO 03) y 5'-CAGCTGCAGT GGATAGTAGA TGGATGGTAG TA-3' (SEQ ID NO 04) que contenían sitios de restricción para EcoRI y Pst l, respectivamente, para la subclonación en el vector pBS-TEF1-PHO5 (Wartmann, Fems Yeast Research, 2003. 3(2): págs. 223-232). Se eligieron los siguientes parámetros de PCR: 95° C durante 2 min, 95° C durante 15 s, 58° C durante 15 s, 72° C durante 3 min (25 ciclos) usando Long PCR Enzyme Mix (Thermo Scientific). Células XI1-Blue de E. coli (recAI endAI gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAI lac [F' proAB laclqZAM15Tn10(Tetr)j) para la transformación térmica estándar (Green, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cuarta edición). 2012: Cold Spring Harbor Laboratory Press) y se cultivaron en medio LB, suplementado con ampicilina (50 |jg ml-1; AppliChem, Alemania) cuando se requirió para la selección. Este plásmido sirvió como plantilla para amplificar el gen AABN equipado con el promotor de TEF1 constitutivo con los oligos 5'-CTGCCGCGGC TCGACTTCAA TCT-3' (SEQ ID NO 05) y 5'-CCGCCGCGGC CCCAGCTTGC ATG-3' (SEQ ID NO 06), ambos conteniendo sitios de restricción Sacll para la integración del constructo en el vector de expresión/transformación Xplor® 2 (Boer, Appl Microbiol Biotechnol, 2009. 84(3): págs.
583-594) aplicando las mismas condiciones de PCR que antes. Después de la restricción del plásmido resultante con Ascl, el casete de expresión de AABN que consistía solo de secuencias de levadura que incluían el marcador de
selección ATRP1 se transformó en el mutante auxotrófico A. adeninivorans G1212 [aleu2 atrp1:ALEU2] (Steinborn, J Biotechnol, 2007. 127(3)): págs. 392-401) de acuerdo con el procedimiento de transformación de Hollenberg (Dohmen, Yeast, 1991. 7(7): págs. 691-692).
En base a la secuencia de aminoácidos de la arabinanasa, el peso molecular estimado del monómero es de 42326,16 Dalton. Después de la eliminación de la señal de secreción de 23 aminoácidos putativa, el monómero maduro tiene un peso molecular de 40094,45 Dalton.
Determinación de la actividad enzimática
La enzima muestra actividad de endo-arabinanasa y actividad arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.99, EC 3.2.1.55).
La actividad de endo-arabinanasa se determina en un ensayo fotométrico. Se usa como sustrato arabinano lineal (por ejemplo, arabinano desramificado Megazyme P-DBAR). La enzima se incuba con el sustrato en un tampón que tiene un pH determinado (pH 4, 5, 6, 7 u 8) durante un tiempo determinado (10, 20 o 30 min) a una temperatura determinada (40, 45, 50, 55 o 60° C). Al final del tiempo de incubación, los extremos reductores de los monosacáridos y oligosacáridos liberados del sustrato por la enzima se detectan en una reacción redox. En esta reacción, los grupos hemiacetal terminales de los carbohidratos se oxidan a grupos carboxilo, mientras que el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico añadido (ácido 3,5-dinitrosalicílico, DNSA) se reduce, lo que da como resultado un aumento detectable fotométricamente en longitud de onda de absorción (cambio batocrómico).
Los resultados se comparan con una curva de calibración, que representa una relación lineal entre varias concentraciones conocidas de arabinosa y la longitud de onda de absorción.
La actividad de endo-arabinanasa dentro de la preparación enzimática se determinó usando el sustrato arabinano desramificado (Megazyme) en tampón de actetato que tenía un pH de 5,0 a 55° C. La actividad fue de 3000-5000 U g_1 de preparación dependiendo del lote. Los productos secos y las soluciones enzimáticas en glicerol (10%) son estables durante varios meses.
La actividad de la arabinofuranosidasa se determina usando el sustrato sintético p-nitrofenil-a-L-arabinofuranoside. La enzima se incuba con el sustrato en un tampón que tiene un pH determinado (pH 4, 5, 6, 7 u 8) durante un tiempo determinado (10, 20, 30 o 40 min) a una temperatura determinada (40° C). La enzima libera pnitrofenol de la arabinosa, lo que da como resultado un cambio fotométricamente detectable en la absorción a 415 nm. La evaluación se produce usando una curva de calibración de p-nitrofenol.
La actividad de arabinofuranosidasa dentro de la preparación enzimática se determinó usando el sustrato pnitrofenil-a-L-arabinofuranoside (1 mM) en tampón de citrato que tenía un pH de 5,0 a 40° C. La actividad medida fue de 200-400 U g_1 de preparación dependiendo del lote.
La actividad enzimática se determina de acuerdo con la siguiente fórmula:
Volumen de preparación enzimática
vidad
*
dilución * A OD
Acti
=
(p --- r-e --- p -- a -- r -- a -- c --- ió ;-- n ---- e -- n -- z -- i-m ---- á ;- t-i -- c -- a --- - ---------- - ----------------------------------- ;— ----- - ----- e -- m --- p --- o --- d - -e ---- i-n --- c -- u -- b ;-- a -- c -- i-ó - —
* pendiente en curva estándar * ti n) Estabilidad de pH y temperatura
Sin formulación adicional, la arabinanasa es termoestable hasta una temperatura de aprox. 65° C. La actividad enzimática no disminuye durante la incubación a 60° C durante 2 horas ni durante la incubación a un pH entre 3 y 9 durante 48 horas. La enzima muestra una actividad óptima a una temperatura entre 40° C y 55° C y a un pH entre 3,5 y 5,5. La temperatura óptima se determinó en tampón de citrato que tenía un pH de 5,5. El pH óptimo se determinó usando tampón de acetato (pH 3-6,5), tampón de citrato (pH 3,5-7), tampón de fosfato (pH 5,5-7,5) y Tris HCl (pH 7-9). La presencia de sales de manganeso (MnSO4, MnCh) tuvo efectos positivos sobre la actividad enzimática.
Producción de la arabinanasa
Para producir la arabinanasa, se fermenta A. adeninivorans que comprende el casete de expresión de arabinanasa (AABN) en un procedimiento alimentado por lotes.
Durante la fase por lotes, se usa el siguiente medio completo:
Durante la fase de alimentación, se usan los siguientes dos sustratos:
Después de una fase por lotes de 15 horas, se inicia un ciclo de alimentación (Figura 2). La fermentación se produce al 40% de pO2 y pH 6 durante 5 días; El pH se ajusta usando NaOH (25%) y H3PO4 (10%). Al final del proceso de fermentación, la actividad enzimática dentro del sobrenadante es de 80-90 U g-1. Las células de levadura se eliminan en un paso de centrifugación y la enzima se purifica del sobrenadante.
Determinación de la degradación de la biomasa vegetal por enzimas hidrolíticas (experimento abiótico)
El grado de degradación de la biomasa vegetal se determina con respecto al tiempo, la temperatura, el pH y la concentración de enzimas.
Se proporcionan 50 mg de biomasa vegetal triturada anhidra (sólidos volátiles, SV) en tubos de reacción (V = 2 ml) en 1,4 ml de tampón Mcllvaine (pH 6). El tampón contiene azida de sodio (0,02%) y antibióticos (penicilina: 100 I.U ml-1, estreptomicina: 0,1 mg ml-1), evitando de este modo el crecimiento de microorganismos y la ingestión de los azúcares liberados por las enzimas de prueba.
En cada punto temporal experimental (TP), las muestras y los controles (control de sustrato y control de enzima) se toman por duplicado (tabla 1). Además, se preparan muestras estándar de glucosa de 0-500 mmol I-1 en tampón Mcllvaine (pH 6).
Se añaden 140 pl de agua a los controles de sustrato, mientras que a las muestras se añaden 140 pl de preparación enzimática. La incubación se produce a 40° C con agitación. Los puntos temporales analizados son 2 horas (TP 1), 4 horas (TP 2) y 6 horas (TP 3. En cada punto temporal, la reacción enzimática se detiene añadiendo 140 pl de NaOH (2 M) y 140 pl de glucosa (30 mM). Luego se centrifugan las muestras durante 5 min a 10.000 g.
Se transfieren 40 pl del sobrenadante a nuevos tubos de reacción. Se añaden 180 pl de agua destilada y 100 pl de reactivo de ácido dinitrosalicílico (DNSA). Las muestras se calientan en un baño de agua (10 min, 100° C) y posteriormente se enfrían en hielo. Se añade 1 ml de agua destilada. Se transfieren 250 pl de cada muestra a una placa de microtitulación y se analizan a 530 nm usando un fotómetro.
La cantidad de equivalentes de glucosa (en mg) liberada por la reacción enzimática se determina comparando las muestras con la curva estándar de glucosa. La actividad de degradación de la enzima se determina mediante la proporción de azúcares reductores liberados y el sustrato desplegado (50 mg de biomasa vegetal, VS).
Tabla 1
Degradación de la harina de soja (SBM)
La degradación de la harina de soja por la enzima de acuerdo con la presente invención se analizó como se describe en el apartado anterior. Para relacionar los resultados con el estado de la técnica actual, se determinó en paralelo la actividad de degradación de dos preparaciones enzimáticas establecidas como aditivos para piensos (Ronozyme Multigrain y Ronozyme VP).
Las tres preparaciones enzimáticas se usaron a 25.000 ppm, una dosis que es aprox. 100 veces más alta que la dosis recomendada para aplicaciones prácticas. La dosis alta es necesaria para obtener un resultado rápido y fiable en el procedimiento de prueba abiótico.
Después de 6 horas, la degradación de SBM por Ronozyme Multigrain (que contiene principalmente xilanasa y glucanasa) fue de aprox. un 1%. La degradación de SBM por Ronozyme VP (que contiene hemicelulasas y pectinasas) fue de aprox. un 8% después de 6 horas. La degradación de SBM por la arabinanasa de acuerdo con la presente invención fue de aprox. un 11% después de 6 horas (Fig. 3).
Sorprendentemente, la degradación de SBM por la arabinanasa se produjo mucho más rápido que la degradación de SBM por Ronozyme VP. Esta observación es esencial, ya que el paso por el tracto digestivo lleva solo unas pocas horas. Por tanto, el uso de arabinanasa como aditivo para piensos para aves de corral, cerdos u otros animales monogástricos es una mejora significativa en comparación con el uso de los aditivos para piensos actualmente establecidos.
Los inventores muestran que mediante la adición combinada de la arabinanasa de acuerdo con la presente invención y un producto de pectinasa, puede lograrse un efecto sinérgico.
Degradación de la harina de colza (RSM)
La degradación de la harina de colza por la enzima de acuerdo con la presente invención se analizó como se describe en la sección anterior. Para relacionar los resultados con el estado de la técnica actual, se determinó en paralelo la actividad de degradación de dos preparaciones enzimáticas establecidas como aditivos para piensos (Ronozyme Multigrain y Ronozyme VP).
Las tres preparaciones enzimáticas se usaron a 25.000 ppm, una dosis que es aprox. 100 veces superior a la dosis recomendada para aplicaciones prácticas. La dosis alta es necesaria para obtener un resultado rápido y fiable en el procedimiento de prueba abiótico.
La degradación de RSM por Ronozyme Multigrain (que contiene principalmente xilanasa y glucanasa) fue de aprox. un 1%. La degradación de RSM por Ronozyme VP (que contiene hemicelulasas y pectinasas) fue de aprox. un 7% después de 6 horas. La degradación de rSm por la arabinanasa de acuerdo con la presente invención fue de aprox. un 10% después de 6 horas (Fig. 4).
Sorprendentemente, la degradación de RSM por la arabinanasa se produjo mucho más rápido que la degradación de RSM por Ronozyme VP. Esta observación es esencial, ya que el paso por el tracto digestivo lleva solo unas pocas horas. Por tanto, el uso de arabinanasa sola como aditivo para piensos para aves de corral, cerdos u otros animales monogástricos es una mejora significativa en comparación con el uso de los aditivos para piensos actualmente establecidos.
Los inventores muestran que mediante la adición combinada de la arabinanasa de acuerdo con la presente invención y un producto de pectinasa, puede lograrse un efecto sinérgico.
Experimento de alimentación (aves de corral)
Para evaluar la eficacia de la arabinanasa de acuerdo con la presente invención, se alimentaron pollos de engorde con una dieta de pienso compuesto suplementada con la arabinanasa de la invención. A los 10 días de edad, se dividieron 96 pollos de engorde en 4 grupos. Todos los pollos de engorde recibieron una dieta básica que comprendía harina de colza (35%) y maíz (60%). El grupo A recibió la dieta basal no suplementada, el grupo B recibió la dieta basal suplementada con un producto enzimático alimentario establecido (Ronozyme VP) y los grupos C y D recibieron la dieta basal suplementada con la enzima de acuerdo con la presente invención (Tabla 2). La duración del experimento de alimentación fue de 15 días. Durante la fase de adaptación (día 11-14) todos los grupos recibieron la dieta basal sin ningún suplemento enzimático. Durante la fase experimental (día 15-25) todos los grupos recibieron las dietas suplementadas respectivas. El consumo de alimento se determinó diariamente a lo largo del experimento. El peso corporal se determinó a la llegada, los días 14, 21 y 25. Las excretas se recogieron tres veces al día desde el día 21 hasta el día 25 para evaluar la energía aparentemente metabolizable.
Tabla 2
El análisis de la dieta experimental suplementada con enzimas al inicio y durante el experimento mostró que la actividad de la arabinanasa fue detectable y estable durante todo el experimento.
Se analizaron los siguientes parámetros:
Se observó que el grupo que recibió una dieta sin enzimas (Grupo A) ganó menos peso que el grupo de control positivo (B) y los dos grupos de prueba (C y D). Además, el grupo A ingirió menos pienso que los otros grupos (B-D). La tasa de conversión alimenticia fue mejor para el grupo D (1,61) y B (1,62), lo que significa que los grupos que recibieron Ronozyme VP o la arabinanasa experimental pudieron usar la energía presente en la dieta de manera más eficiente.
Esto muestra que la suplementación de una dieta rica en pectina con arabinanasa llevó a una mejor degradación del sustrato rico en pectina, una disminución del efecto antinutritivo de la harina de colza y a efectos fuertemente positivos en términos de metabolización energética.
Comparación de actividades de arabinanasa
Se determinó la endoactividad de la arabinanasa de la invención (Arxula adeninivorans) y de una arabinanasa comercial de Aspergillus niger (Megazyme E-EARAB) en un ensayo fotométrico. Se usó como sustrato arabinano desramificado (Megazyme P-DBAR). Las enzimas se incubaron con el sustrato en un tampón con un pH de 5 durante 20 min a 55° C. Al final del tiempo de incubación, los extremos reductores de los monosacáridos y oligosacáridos liberados del sustrato por la enzima se detectaron en una reacción redox. En esta reacción, los grupos hemiacetal terminales de los carbohidratos se oxidan a grupos carboxilo, mientras que el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzoico añadido (ácido 3,5-dinitrosalicílico, DNSA) se reduce, lo que da como resultado un aumento detectable fotométricamente en la longitud de onda de absorción (cambio batocrómico).
En las condiciones descritas, la actividad de la arabinanasa de la invención fue de 5500 U/g y la actividad de la arabinanasa de Aspergillus niger comercialmente disponible fue de 645 U/g.
La degradación de la biomasa vegetal inducida por las dos enzimas se determinó en un ensayo abiótico como se ha explicado con detalle con anterioridad. Se usaron harina de colza y harina de soja como sustratos insolubles, debido a que estos sustratos contienen altas cantidades de pectina, que es rica en cadenas laterales de arabina.
Para el experimento se añadieron a los sustratos 12.500 ppm de la arabinanasa de Arxula adeninivorans y 107.000 ppm de Aspergillus niger, lo que significa que se añadió al sustrato una actividad enzimática equivalente (68 Unidades por gramo de sustrato oDM).
Todas las muestras se incubaron durante 24 horas a 40° C. Después de 4, 6 y 24 horas se determinó la cantidad de azúcares reductores en el sobrenadante. El 9% de la harina de soja se degradó durante las primeras 24 horas usando arabinanasa de Arxula, mientras que la arabinanasa de Aspergillus liberó solo el 2% de los carbohidratos (Fig. 5). Además, la degradación de la harina de colza fue mayor si se usaba Arxula arabinanase que si se usaba Aspergillus arabinanase (Fig. 6).
Fue sorprendente que la arabinanasa de la invención funcionara mucho más eficazmente en la degradación del material vegetal no disuelto que la arabinanasa de Aspergillus niger, aunque se aplicaron niveles equivalentes de actividad de endoarabinanasa.
Secuencias
SEQ ID NO 01
atgaagagcc aattgatcgc tacaattgca accgttgccc tgggctctat gagctctgtg 60 gtggcagcaa agtctaagac cgatgattcc aatacctatg atcgattcag gggactggtt 120 gattccaaca cctatgactt gatgaacaat tcactgggtg gaacatatgt ccacactccc 180 aacttgacgg tcattgatac tcccgattgg cctttgccta atccggttat tggagacatt 240 gtgccctggg gaggtgttca ccttcatgac ccttctatta tcaagcacaa tgggtattac 300 tactctttca ccacccacaa cttgattgga atttccaagg ctccatccat gtttggtccc 360 tggcaaaaga ttggaagtgt gttggaggag tccagtatca ttaacagtac tggaagcaca 420 gatccttggg cccctgatgt gcaaaaggtt ggagacacat tctactgcta ctacgccgtc 480 tcctcctttg gaagccccaa gtcgtcaatt ggactagcta cgtccaagac gcttgagccc 540 ggttcttgga ccgaccacgg agaggttatc agttctggtc ccaatgctcc ttaccctctc 600 aatgactcca atgccattga cgctaacctg cttgttgtgg agaatggcaa ttccgttcag 660 gaggcttatc tgctgtgggg gtctttctgg tctaacattt ggcagatcaa gctcaacaat 720 gatctgaccg tgccagacaa tgccattgcc aatgctgtcc agctcgccta cgacggcaca 780 attgacactc atccagttga aggtgcttat ctccacaagg ccagcaatgg atactactac 840 ttgtttgtgt ccaatggagt gtgctgtgga tacgacgctg ctctgcctga tgctggccga 900 gagtataaga tcttggtcgg tcgttcaaag tctccatctg gtcctttcct tgacaagaac 960 ggggtcgaca tggccaaggg cggtggatct cgaatctatg gttctcatgg aattgtctat 1020 ggacctggag gacagggagt gtttactgat gatgacggac aggatatcat ttactaccac 1080 tatgttgatc tgagagtcag tcttgccgat gatgacaagc gtctgggatg gaactatctc 1140 aagtacgaag acggttggcc aaaactcgtt tag 1173 SEQ ID NO 02 MKSQLIATIATVALGSMSSVVAAKSKTDDSNTYDRFRGLVDSNTYDLMNNSLGGTYVHTPN LTVIDTPDWPLPNPVIGDIVPWGGVHLHDPSIIKHNGYYYSFTTHNLIGISKAPSMFGPWQKI GSVLEESSIINSTGSTDPWAPDVQKVGDTFYCYYAVSSFGSPKSSIGLATSKTLEPGSWTDH GEVISSGPNAPYPLNDSNAIDANLLVVENGNSVQEAYLLWGSFWSNIWQIKLNNDLTVPDNA IANAVQLAYDGTIDTHPVEGAYLHKASNGYYYLFVSNGVCCGYDAALPDAGREYKILVGRSK SPSGPFLDKNGVDMAKGGGSRIYGSHGIVYGPGGQGVFTDDDGQDIIYYHYVDLRVSLADD DKRLGWNYLKYEDGWPKLV
Claims (12)
1. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa en la preparación de un aditivo para piensos, dicha enzima estando caracterizada por una secuencia de aminoácidos que muestra por lo menos un 98% de identidad con la SEQ ID NO 02.
2. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enzima comprende las actividades de
a. endohidrólisis de enlaces (1-5)-a-arabinofuranosídicos en (1-5)-a-L-arabinanos (EC 3.2.1.99), y
b. hidrólisis de enlaces (1-5)-a-arabinofuranosídicos en el extremo no reductor de a-L-arabinanos u oligómeros de a-L-arabinosa (EC 3.2.1.55).
3. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha enzima cataliza adicionalmente la hidrólisis de enlaces (1-3)-a- y/o (1,2)-a-arabinofuranosídicos en el extremo no reductor de a-L-arabinanos u oligómeros de a-L-arabinosa.
4. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha enzima muestra una actividad óptima a una temperatura entre 40° C y 55° C, y/o a un pH entre 3,5 y 5,5.
5. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la alimentación del ganado.
6. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa para la fabricación de una preparación enzimática de un solo componente para la preparación de un aditivo para piensos, en donde dicha enzima se caracteriza por una identidad de por lo menos un 98% con la SEQ ID NO 02.
7. El uso de una enzima aislada que tiene actividad de arabinanasa para la fabricación de una preparación enzimática de un solo componente de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha preparación enzimática de un solo componente se usa en la alimentación del ganado.
8. Un pienso compuesto que comprende o consiste esencialmente de
a. una biomasa rica en pectina seleccionada de remolacha azucarera, semillas oleaginosas, altramuces y leguminosas, y
b. una preparación enzimática de un solo componente como se especifica en la reivindicación 7.
9. El pienso compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, que comprende además una biomasa que comprende almidón, particularmente cereales o maíz.
10. El pienso compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en donde la concentración de dicha preparación enzimática es de 1-500 mg/kg.
11. El pienso compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende además una enzima aislada adicional seleccionada de fitasa, proteasa y una enzima degradante de NSP, dicha enzima aislada adicional estando presente a una concentración de 1-500 mg/kg, incluso más particularmente 10-400 mg/kg, incluso más particularmente 100-300 mg/kg.
12. Uso del pienso compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en la alimentación del ganado, en donde dicho ganado se selecciona de animales monogástricos.
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