FI102076B - Menetelmä mini-proinsuliinin ja insuliinin valmistamiseksi - Google Patents

Description

102076

Menetelmä mini-proinsuliinin ja insuliinin valmistamiksek-si

Keksintö koskee menetelmää uuden "mini-proinsulii-5 nin" valmistamiseksi, jossa mini-proinsuliinissa lyhentämätön B-ketju on sitoutunut A-ketjuun vain arginiiniryhmän välityksellä. Tästä mini-proinsuliinista on mahdollista saada ihmisen insuliinia ilman kalliita kemiallisia muutoksia.

10 Mini-proinsuliinit, joilla on lyhennetty C-ketju, ovat tunnettuja. Näin ovat R. Wetzel et ai.. Gene 16 (1981), 63 - 71, kuvanneet proinsuliinin, jossa on kuuteen aminohappoon lyhennetty C-ketju. EP-patenttihakemuksesta EP-A 0 055 945 ovat vastaavat proinsuliinit tunnettuja, 15 joiden C-ketju on lyhennetty kahteen aminohappoon.

EP-A 0 163 529:n perusteella tunnetaan insuliini-esiyhdisteitä, joissa on lyhennetty B-ketju ja joiden C-ketju joko kokonaan puuttuu tai on jopa yhteen aminohappoon lyhennetty. Nämä esituotteet muutetaan trypsiinin 20 katalysoiman transpeptisoinnin kautta of-treoniiniesterillä kypsäksi ihmisen insuliiniksi.

Keksintö koskee sitä vastoin menetelmää ihmisen-des- (32-65) -proinsuliinin tai mini-proinduliinin valmistamiseksi, jolla on kaava I

V 25 B(l-30)-Arg-A(l-21) (I) jossa B(1-30) ja A(1-21) tarkoittavat ihmisen insuliinin B- ja A-ketjua, vastaavasti. Tämä yhdiste ei ole vain vä-30 lituote ihmisen insuliini-Arg^'-OHtn valmistamiseksi, seu- .. raavassa "mono-Arg-insuliiniksi" sanottu, joka on tunnettu EP-patenttijulkaisuista EP-B 0 132 769 ja EP-B 0 132 770, samoin kuin ihmisen insuliinin valmistamiseksi, vaan se osoittaa myös itse tiettyä insuliiniaktiivisuutta.

35 Kaavan I mukainen yhdiste on siten käyttökelpoinen myös lääkeaineena, erityisesti sokeritaudin käsittelyssä.

102076 2

Keksintö koskee lisäksi menetelmää kaavan II mukaisen mono-Arg-insuliinin valmistamiseksi,

S - S

I I

5 A(1 - 21)

I I

S S (II),

I I

s s

10 | I

B(1 — 30) - Arg jossa A(l-21):llä ja B(l-30):llä on edellä mainitut merkitykset ja -S-S-sillat ovat järjestäytyneet kuten insu- 15 liinissa.

Keksintö koskee edelleen menetelmiä ihmisen insuliinin valmistamiseksi. Erityisen edullista on kaavan I mukaisen yhdisteen välitön muuttaminen insuliiniksi "tölk-kireaktiossa".

20 Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi on tunnusomaista, että tätä yhdistettä koodittava geenirakenne ilmennetään bakteerissa, kuten E. colissa, tai hiivassa, erityisesti Saccharomyces cerevisiaessa, ja siinä tapauksessa, että geenirakenne 25 koodaa fuusioproteiinia, vapautetaan kaavan I mukainen yhdiste tästä fuusioproteiinista.

Keksinnön eräässä sovellusmuodossa edellä saatava fuusioproteiini pilkotaan entsymaattisesti ja kaavan I mukainen proteiini eristetään.

30 Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan II mukai sen yhdisteen valmistamiseksi on tunnusomaista, että edellä kuvatuilla menetelmillä saatava proteiini pilkotaan entsymaattisesti lievästi happamissa olosuhteissa (pH = 6,8), edullisesti trypsiinillä.

35 Keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen insulii nin valmistamiseksi on tunnusomaista, että edellä kuvatulla menetelmillä saatava proteiini pilkotaan trypsiinillä 102076 3 ja karboksipeptidaasi B:llä yksitölkkireaktiossa, lievästi happamissa olosuhteissa (pH = 6,8).

Toiselle keksinnön mukaiselle menetelmälle ihmisen insuliinin valmistamiseksi on tunnusomaista, että valmis-5 tetaan edellä kuvatulla menetelmällä fuusioproteiini, tämä tämä pilkotaan, kaavan I mukainen proteiini eristetään ja siitä valmistetaan entsymaattisesti kaavan II mukainen yhdiste ja tästä, joko välillä eristämällä tai edullisesti suoraan, pilkotaan C-terminaalinen arginiini lievästi hap-10 pamissa olosuhteissa (pH = 6,8).

Keksinnön mukaisissa menetelmissä kaavan I mukaisen yhdisteen valmistamiseksi on edullisesti fuusioproteii-neissa kaavan I mukainen proteiini sitoutunut painolasti-osaan siltajäsenen välityksellä, jonka kaava on 15 -Met-Ile-Glu-Gly-Arg-.

Keksinnön muita edullisia suoritusmuotoja selitetään seuraavassa lähemmin.

20 Kuviot esitetään esimerkkien havainnollistamiseksi, jolloin kuvio 1 (ja sen jatko kuviossa la ja Ib) osoittaa E. coli -ilmentymisvektoreiden pIKlO ja pSW3 rakenteet ja kuvio 2 (ja sen jatko kuviossa 2a ja 2b) hiiva-ekspressio-vektoreiden po;fB102 ja vastaavasti pafB104 rakenteet. Nämä 25 vektorit koodaavat mini-proinsuliinia.

Havaittiin, että mini-proinsulilla on oikea laskostuminen siten, että trypsiinipilkkomisen jälkeen saadaan melkein kvantitatiivisesti mono-Arg-insuliinia. Yllättäen aikaansaatiin siis yksinkertainen menetelmä mono-Arg-insu-30 liinin valmistamiseksi. Tästä voidaan valmistaa sinänsä tunnetulla tavalla ihmisen insuliinia. Lisäksi mono-Arg-insuliini toimii vaikutusaineena lääkeaineissa (EP-B 0 132 769).

EP-A 0 229 998:ssa kuvattiin ilmentymisvektori 35 pK50. Miniproinsuliinia voidaan valmistaa fuusioproteiinin 102076 4 muodossa, joka vastaa tätä rakennetta, bakteerissa, kuten E. coli.

Vaikealiukoista fuusioproteiinia voidaan rikastaa pesemällä neutraalilla puskuriliuoksella. Halogeenisyaani-5 pilkkomisella (E. Gross ja B Wittkop, J. Am. Chem. Soc. 82 (1961) 1510 - 1517) vapautetaan mini-proinsuliini. Tämä ei ole vielä biologisesti aktiivisessa muodossa, vaan koostuu epäyhtenäisestä seoksesta, jossa on erilaisia inter- ja intramolekulaarisia disulfidisiltoja, mahdollisesti myös 10 muita proteiinifragmentteja. Kemiallisesti yhtenäiseksi suhteellisen stabiilisiksi johdannaiseksi valmistetaan molekyylin S-sulfonaattimuoto (P. G. Katsoyannis et ai., Biochemistry 6 (1967) 2635 - 2641) . Tämä johdannainen voidaan puhdistaa erittäin hyvin ioninvaihtokromatografiällä 15 ja se on luotettava lähtömateriaali laskostumiselle luontaiseen avaruusrakenteeseen oikeiden disulfidisiltojen muodostamiseksi (Y. C. Du et ai., Sei. Sin. 15 (1965) 229 - 236; H. P. Gattner et ai., Hoppe-Seylers Z. physiol. Chem. 362 (1981) 1943 - 1049); B. H. Frank et ai. teokses-20 sa: "Peptides·. Synthesis-Structure-Function", D. H. Rich ja E. Gross, vai., (1981) 1043 - 1049). Tämän laskostumisen onnistuminen varmistetaan HPLC-analyysin avulla fragmentilla, joka saadaan pilkkomalla S. aureus -proteaasi V8:11a (U. Grau, Diabetes 34 (1985) 1174 - 1180).

\ 25 Mono-Arg-insuliinin tai insuliinin vapauttaminen trypsiinillä tai karboksipeptidaasi B:llä tai samalla lailla vaikuttavalla entsyymillä (W. Kemmler et ai., J. Biol. Chem. 246 (1971) 2780 - 2795) tapahtuu ilmeisen yksinkertaisesti, sillä tässä osoittautuu erittäin edulli-30 seksi, että mahdollisten pilkkomiskohtien lukumäärä ver-.. rattuna normaaliin proinsuliiniin on vähentynyt. Siten pilkkominen on huomattavasti yksinkertaisempaa (mitä tulee sivutuotteiden muodostumiseen kuten valmistettaessa de-B30-insuliinia tai de-okta-B23-B30-insuliinia) ohjata.

35 Sekä mono-Arg-insuliini että myös insuliini on mahdollista 102076 5 eristää tunnetulla tavalla ioninvaihtokromatografiällä hyvin puhtaassa muodossa. Insuliinin ja mono-Arg-johdannaisen muodostuminen, puhdistamisen kulku ja lopputuotteen laatu tarkistetaan normaalilla RP-HPLC-menetelmällä (G.

5 Seipke et ai., Angew. Chem. 98 (1986) 530 - 548).

Pilkottaessa mini-proinsuliinia muodostuu yllättäen, päinvastoin kuin luonnollista proinsuliinia pilkottaessa, tuskin lainkaan insuliini-de-B30:tä. Koska jälkimmäinen voidaan vain hyvin vaikeasti erottaa insuliinista, 10 pidetään insuliinin valmistuksessa luonnollisesta proin-suliinista "kaksiastiareaktiota" parempana, mikä tarkoittaa, että trypsiinipilkkomisen päätuotteet, insuliini-Arg832 ja mono-Arg-insuliini, erotetaan ensin ioninvaihtajalla tunnetulla tavalla insuliini-de-B30:stä ja sen jälkeen 15 pilkotaan karboksipeptidaasi B:n avulla ihmisen insuliiniksi (EP-B 0 195 691). Mini-proinsuliini voidaan sitä vastoin muuttaa ihanteellisella tavalla "yksiastiareak-tiossa" samanaikaisesti trypsiinillä ja karboksipeptidaasi B:llä ihmisen insuliiniksi.

20 Kaavan I mukaisen yhdisteen ilmentyminen hiivassa ja siihen liittyvä erittyminen on erityisen edullista, sillä oikein laskostettu proinsuliinijohdannainen voidaan eristää suoraan. Isäntäsysteemiksi valitaan hiivat, kuten esimerkiksi EP-A 0 248 227:ssä on esitetty, siis esim.

25 Pichia pastoria, Hansenula polymorphis, Schizosaccharomy-ces pombe tai edullisesti Saccharomyces cerevisiae.

Hiivan ilmentämisvektoreita tunnetaan suuri joukko. Keksinnön mukainen insuliinijohdannaisen valmistus kuvataan seuraavassa hiiva-ar-tekijäsysteemin avulla, mikä kui-30 tenkin on ymmärrettävä vain esimerkkinä, sillä sinänsä ;· tunnetulla tavalla voidaan myös muita ilmentymissysteemejä käyttää.

Hiiva-feromonigeenin MFa rakenne on tunnettu artikkelista Kurjan ja Herskovitz, Cell 30 (1982) 933 - 943, 35 missä keskustellaan myös muiden geenien ekspression ja 102076 6 geenituotteiden erittämisen mahdollisuudesta. Tähän liittyen voidaan viitata myös artikkeliin Brake et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984), 4642 - 4646.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää hiiva-"tappaja-5 toksiini"-systeemiä tai hyödyntää hapon fosfataasi- tai invertaasisysteemiä erittymisen aikaansaamiseksi.

Hiivavektoreina käytetään edullisesti niin sanottuja "shuttle"-vektoreita, joissa on bakteeri- ja hiiva-plasmidin replikaation aloituskohta samoin kuin geeni tai 10 geenejä selektiota varten molemmissa isäntäsysteemeissä. Lisäksi sellaisissa vektoreissa on vieraiden geenien eks-pressioon välttämättömät promoottorisekvenssit ja mahdollisesti saannon parantamiseksi lopetussekvenssi, siten että heterologinen geeni - tarvittaessa erittävään signaa-15 liin fuusioituneena - on järjestäytynyt promoottorin ja lopetussekvenssin väliin. Sellaisia vektoreita on kuvattu esimerkiksi US-A 4 766 073:ssa.

Geneettinen koodi on tunnetusti "huonontunut", mikä tarkoittaa, että vain kahta aminohappoa koodaa yksi ainoa 20 nukleotidisekvenssi, kun taas muille 18 koodattavalle aminohapolle on 2 - 6 triplettiä. Mini-proinsuliinin geenin synteesiä varten on siten suuri määrä kodoni-kombinaatioita valittavana. Nyt on havaittu, että mini-proinsuliinia koodaava DNA-sekvenssi I, joka on toistettu liitteessä 25 molempien geeni fragment ti en IK I (taulukko 1) ja IK II (taulukko 2) muodossa, on erityisen edullinen, sillä se on optimoitu kodonin käyttöön sekä hiivassa että myös E. co-lissa.

DNA-sekvenssi I:n koodaavan juosteen 5'-päässä on 30 "yliroikkuva" DNA-sekvenssi, vastaten restriktioendonuk- ;· leaasi Kpnl:tä. Koodaavan juosteen 3'-päässä sitä vastoin « yksijuosteinen sekvenssi roikkuu yli vastaten restriktio-entsyymi HindIII:a. Nämä molemmat erilaiset tunnistussek-venssit takaavat DNA-sekvenssi I:n insertion plasmideihin 35 toivotussa suunnassa. Koodaavia sekvenssejä seuraa trip- 102076 7 letin nro 65, asparagiinin, jälkeen kaksi translaation lopetuskodonia (stop-kodonit). Restriktioentsyymi Pstlm sisäinen yksittäinen pilkkomiskohta (kodoni 41/42) mahdollistaa kahden geenifragmentin alakloonaamisen, joita voi-5 daan viedä hyvin tutkittuihin plasmideihin, kuten pUC18 tai tämän johdannaisiin.

Lisäksi rakennegeeniin rakennettiin sarja muita yksittäisiä restriktioentsyymien tunnistuskohtia, jotka toisaalta luovat pääsyn proinsuliinin osasekvenssien luok-10 se ja toisaalta mahdollistavat mutaatioiden suorittamisen:

Restriktioentsyymi Pilkkominen numeroidun nukleotidin jälkeen (koo- __daava juoste)_

Accl 201

Drain 46 15 FnuDII 107

Hgal 105

Hindlll 213

Hinfl 17

Hpal 22 20 Hphl 76

Mael 155

Maelll 191 ; MboII 89

MluI 106 25 Ncol 207

Nlalll 208

PvuII 175

Sali 201

Spel 154 30 StyI 207

Taql__202_ 102076 8 DNA-sekvenssi I muutettiin olennaisilta kohdin luonnollisesta sekvenssistä. Sen takia lukuisten yksittäisten restriktioentsyymien pilkkomiskohtien lisääminen oli mahdollista.

5 DNA-sekvenssi I on mahdollista rakentaa yhteensä 6 oiigonukleotidistä, joiden ketjun pituus on 47 - 96 nuk-leotidiyksikköä. Tällöin menetellään kuten seuraavassa kuvataan.

Geenifragmentti IK I (taulukko 1) on mahdollista 10 rakentaa 4 oligonukleotidistä, joiden ketjun pituus on 47 - 74 yksikköä, jolloin ensin syntetisoidaan kemiallisesti ja sitten liitetään entsymaattisesti 3 nukleotidin tarttuvien päiden ("sticky ends") avulla. Tarttuvat päät vastaavat restriktioentsyymi DraIII:n vastaavia, mikä on 15 etu myöhemmälle modifikaatiolle.

Geenifragmentti IK II (taulukko 2) saadaan kahdesta kemiallisesti syntetisoidusta oligonukleotidista, joiden pituus on 88 - 96 nukleotidiyksikköä.

Esimerkki 1 20 a) Yksisäikeisen oligonukleotidin kemiallinen syn teesi Käyttäen esimerkkinä oligonukleotidia 4 (taulukko 1) selitetään DNA-rakenneosien synteesiä. Kiinteäfaasisyn-teesiä varten 3'-päässä oleva nukleosidi, tässä tapaukses-25 sa siis adeniini (nukleotidi nro 125), sidotaan kovalent-tisesti 3'-hydroksiryhmän kautta kantajaan. Kantajamate-riaali on pitkäketjuisilla aminoalkyyliryhmällä funktio-nalisoitu CPG ("Controlled Pore Glass").

Seuraavissa synteesivaiheissa käytetään emäskompo-30 nenttina 5' -O-dimetoksitrityylinukleosidi-3' - fosfori happo-β-syaanietyyliesteridialkyyliamidia, jolloin adeniini on N^-bentsoyyliyhdisteenä, sytosiini ^-bentsoyyliyhdisteenä, guaniini N2-isobutyryyliyhdisteenä ja tyrniini ilman suoja-ryhmää .

102076 9 25 mg:aa polymeerikantajaa, jossa on 0,2 μπιοί 5'-0-dimetoksitrityyli-N4-bentsoyyli-2' -deoksiadenosiinia sitoutuneena, käsitellään perättäin seuraavilla aineilla: A) asetonitriili 5 B) 3 % trikloorietikkahappo dikloorimetaanissa C) asetonitriili D) 5 μπιοί vastaavaa nukleosidi-3'-O-fosfiittia ja 25 μπιοί tetratsolia 0,15 ml:ssa vedetöntä asetonitriiliä E) asetonitriili 10 F) 20 % asetanhydridiä tetrahydrofuraanissa, jossa on 40 % lutidiinia ja 10 % dimetyyliaminopyridiiniä G) asetonitriili H) 3 % jodi lutidiini/vesi/tetrahydrofuraanissa tilavuussuhteessa 5:4:1.

15 "Fosfiitti" tarkoittaa tässä 2'-deoksiriboosi-3'- monofosforihappo-mono-6-syaanietyyliesteriä, jolloin kolmas valenssi on kyllästetty di-isopropyyliaminoryhmällä. Yksittäisten synteesivaiheiden saannot voidaan kulloinkin määrittää detritylointireaktion B) jälkeen spektrofotomet-20 risesti mittaamalla dimetoksitrityylikationin absorption aallonpituudella 496 nm.

Synteesin jälkeen seuraa dimetoksitrityyliryhmän pilkkominen kuten on kuvattu kohdissa A) - C). Käsittelemällä ammoniakilla halkaistaan oligonukleotidi kantajasta 25 ja samalla eliminoidaan β-syaanietyyliryhmät. 16-tuntinen oligomeerin käsittely konsentroidulla ammoniakilla 50 °C:ssa hajottaa emäksen aminosuojaryhmän kvantitatiivisesti. Siten saatu raakatuote puhdistetaan polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla.

30 Vastaavalla tavalla valmistetaan oligonukleotidit 1-3 (taulukko 1) , 5 ja 6 (taulukko 2) .

b) Yksisäikeisen oligonukleotidin entsyxnaattinen yhdi s täminen

Oligonukleotidin fosforyloimiseksi entsymaattisesti 35 5'-päätteesstä 1 μπιοί kumpaakin oligonukleotidiä 1 ja 4 102076 10 käsitellään 5 μτηοΐιΐΐβ adenosiinitrifosfaattia, jossa on neljä yksikköä T4-polynukleotidikinaasia 20 μΐ-.ssa 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,6), 10 mM magnesiumkloridia ja 10 mM ditiotreitolia (DTT) 30 minuuttia 37 °C:ssa. Entsyy-5 mi inaktivoidaan kuumentamalla viisi minuuttia 95 °C:ssa. Oligonukleotidejä 2 ja 3, jotka muodostavat "yliroikkuvat" yksisäikeiset sekvenssit, ei fosforyloida. Tämä estää seu-raavassa ligaatiossa suurempien geenifragmenttien muodostumisen.

10 Oligonukleotidit 1-4 ligatoidaan seuraavasti: 1 μτηοΐ oligonukleotidiä 1 ja 2 tai 3 ja 4 hybridisoidaan parittain, samalla kun nämä liuotetaan aina 20 μl:aan 50 mM Tris-HCl-puskuria (pH 7,6), 10 mM magnesiumkloridia ja 10 mM DTT:tä, tätä liuosta kuumennetaan 5 minuuttia 15 95 °C:ssa ja jäähdytetään huoneenlämpötilaan 2 tunnissa.

Tällöin käytetään oligonukleotidejä 1 ja 4 niiden 5'-fos-faattimuodossaan. Muodostuneiden bihelikaalisten DNA-frag-menttien yhdistämiseksi edelleen, samat liuokset yhdistetään, lämmitetään 15 minuuttia 60 °C:ssa ja jäähdytetään 20 huoneenlämpötilaan. Sitten lisätään 2 μΐ 0,1 M DTT:tä, 16 μΐ 2,5 mM adenosiinitrifosfaattia (pH 7) samoin kuin 1 μΐ T4 DNA-ligaasia (400 yksikköä) ja inkuboidaan 16 tuntia 22 °C:ssa.

Siten saadun geenifragmentin puhdistaminen (taulu-.! 25 kot 1 ja 2) tapahtuu geelielektroforeesilla 10-%:isessa polyakryyliamidigeelissä (ilman virtsa-ainelisäystä, 40 x 20 x 0,1 cm), jolloin merkkiaineena toimii 0X174 DNA (Fa. BRL), joka on leikattu Hinfl:llä, tai pBR322, joka on leikattu HaeIII:lla.

30 Esimerkki 2 a) Syntetisoidun DNA-fragmentin kloonaus Kaupallinen plasmidi pUC19 aukaistaan restriktio-entsyymeillä Kpnl ja PstI ja suuri fragmentti (1) erotetaan 0,8-%:isessa "Seaplaque"-geelissä. Tämä fragmentti 35 käsitellään taulukon 1 mukaisella synteettisellä DNA:11a 102076 11 (2) T4-ligaasin avulla ja ligaatioseosta inkuboidaan kompetenttien E. coli 79/02 -solujen kanssa. Transformaatio-seos maljataan IPTG/Xgal-maljoille, joissa on 20 mg/ml ampisilliinia. Valkoisista pesäkkeistä eristetään plasmi-5 di-DNA ja se karakterisoidaan restriktio- ja DNA-sekvens-sianalyysillä. Toivotuille plasmideille annetaan merkintä pIKl.

Vastaavasti ligatoidaan taulukon 2 mukainen DNA (5) pUC19:ään, joka on aukaistu Pstlrllä ja HindIII:lla (4).

10 Saadaan plasmidi pIK2 (6).

b) Mini-proinsuliinigeenin rakentaminen Plasmideista piki (3) ja pIK2 (6) eristetään uudelleen taulukkojen 1 ja 2 mukaiset DNA-sekvenssit (2) ja (5) ja ne ligatoidaan pUC19:n kanssa, joka on avattu Kpnl.-llä 15 ja HindIII:lla (7). Näin saadaan plasmidi pIK3 (8), joka koodaa modifioitua ihmisen insuliinisekvenssiä.

Plasmidi pIK3 aukaistaan Mlulillä ja Spel:llä ja iso fragmentti (9) eristetään. Tämä ligatoidaan DNA-sek-venssin (10) kanssa 20 B30 AI A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 (Thr)(Arg) Gly Ile Vai Glu Gin Cys Cys (Thr)(Ser) (10) 5' CG CGT GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT A 3' 3' A CCA TAG CAA CTT GTT ACA ACA TGA TC 5' • 25 (MluI) (Spel) joka täydentää B-ketjun (B30) viimeisen kodonin arginiini-kodonilla ja korvaa A-ketjun 7 ensimmäistä aminohappoa koodittavat poisleikatut kodonit ja täydentää A-ketjun aminohappoja 8 ja 9 koodittavat kodonit.

30 Näin saadaan plasmidi pIK4 (11), joka koodaa uutta :V ihmisen mini-proinsuliinia.

102076 12 c) Mini-proinsuliinin ekspressiovektorit ρίκ I : EP-A 0 229 998:sta tunnettu plasmidi pK50 (12) (siinä esimerkki 3, kuvio 3 (33)) pilkotaan EcoRI:lla ja 5 HindIII:lla. Molemmat fragmentit (13) ja (14) eristetään. Pieni fragmentti (14), jossa on IL-2-osasekvenssi, pilkotaan vielä MluI:llä ja IL-2-osasekvenssi (15) eristetään.

Plasmidi pIK4 pilkotaan EcoRI:lla ja Hpal:llä ja suuri fragmentti (16) eristetään. Tämä ligatoidaan nyt IL-10 2-osasekvenssin (15) ja synteettisen DNA:n (17) kanssa B1 B2

Met Ile Glu Gly Arg Phe Vai 5' CG CGT ATG ATT G AG GGC CGT TTC GTT 3' (17) 3' A TAC TAA CTC CCG GCA A AG CAA 5' (MluI) (Hpal) jolloin saadaan plasmidi pIK8 (18) . Tämä koodaa fuusio-proteiinia, jossa IL-2:n 38:aa ensimmäistä aminohappoa seuraa Met-Ile-Glu-Gly-Arg-silta ja tämän jälkeen mini-20 proinsuliinin aminohapposekvenssi.

Plasmidista pIK8 (18) pilkotaan pois EcoRI-Hindlll-fragmentti (19), joka koodaa mainittua fuusioproteiinia. Tämä fragmentti ligatoidaan suuren fragmentin (13) kanssa, joka on saatu pilkkomalla pK50. Näin saadaan ekspressio-.· 25 vektori pIKlO (20), joka koodaa edellä karakterisoitua fuusioproteiinia. pSW3 :

Jos vektori pIK10:ltä (20) poistetaan Ndel-BstEII-segmentti, joka ympäröi "bom site'n", niin saadaan vekto-30 ri, joka esiintyy soluissa suuremmissa kopioluvuissa ja

• I

puuttuvan "bom site'n" takia ei enää ole mobilisoitavissa konjugatiivisen plasmidin avulla.

Tämän lisäksi pilkotaan vektori pIKlO (20) BstEIIrllä ja Ndel:llä, DNA saostetaan etanolilla, siir-35 retään DNA-polymeraasipuskuriin ja tehdään Klenow-polyme- l3 1020 76 raasireaktio. Niin saadut tasapäiset DNA-fragmentit erotetaan geelielektroforeettisesti ja suurempi fragmentti (21) eristetään. Ligaation kautta saadaan vektori pSW3 (22) . Kompetenttien E. coli-Mcl061 -solujen transformoin-5 nin ja amplifioinnin jälkeen plasmidi pSW3 (22) eristetään ja karakterisoidaan.

Esimerkki 3

Ekspressoituminen kaimassa E. coli W3110 Yön yli kasvanut E. coli -solujen viljelmä, jotka 10 solut sisältävät plasmidin pIKlO (20) tai pSW3 (22) , laimennetaan LB-alustalla (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972), jossa on 50 ^g/ml ampisilliinia, suhteessa noin 1:100 ja kasvua seurataan OD-(optinen tiheys)-mittauksella. Kun 15 OD = 0,5, säädetään kasvusto arvoon 1 mM IPTG ja bakteerit sentrifugoidaan 150 - 180 minuutin kuluttua. Bakteereita keitetään 5 minuuttia puskuriseoksessa (7 M virtsa-aine, 0,1 % SDS, 0,1 M natriumfosfaatti, pH 7,0) ja näytteet siirretään SDS-geelielektroforeesilevyille. Geelielektro-20 foreettisen analyysin jälkeen havaitaan noin 10 Kd:n alueella ylimääräinen vyöhyke, joka vastaa odotettua fuusio-proteiinia. Tämä vyöhyke reagoi "Western Blot" -kokeessa insuliinia vastaan osoitettujen vasta-aineiden kanssa. Jos solut rikotaan paineen avulla ja sen jälkeen sentrifugoi-25 daan, fuusioproteiini löytyy sedimentistä muiden liukenemattomien solunosien kanssa.

Annetut induktio-olosuhteet koskevat ravisteluvil-jelmiä; suuremmissa fermentaatioissa on toisten kasvualustojen ja olosuhteiden valinta, esim. muutetun OD-arvon 30 saavuttamiseksi, tarkoituksenmukaista.

: Esimerkki 4 a) Mono-Arg-insuliinin valmistaminen 40 g sentrifugoimalla ja fosfaattipuskurilla (pH 7) tai vedellä pesemällä rikastettua fuusioproteiinia (kuiva-35 ainepitoisuus n. 25 %) liuotetaan 75 ml:aan 98 - 100 %:sta 102076 14 fosforihappoa ja sekoitetaan 5 g BrCN:ää. 6 tunnin reaktion jälkeen huoneenlämpötilassa seokseen sekoitetaan 2 1 vettä ja se kylmäkuivataan.

Fragmenttiseos (10 g) liuotetaan 1 l:aan puskuri-5 liuosta (8 M virtsa-aine, 0,2 M Tris-HCl (pH 8,5)), lämmitetään 30 °C:seen ja sekoitetaan 10 g natriumsulfiittia ja 2,5 g natriumtetrationaattia. 90 minuutin jälkeen 30 °C:ssa lisätään 3 1 kylmää vettä ja pH-arvo säädetään 7,0:ksi. Muodostuneet hiutaleet sentrifugoidaan. Mini-pro- 10 insuliinin heksa-S-sulfonaatti saostetaan supernatantista säätämällä pH 3,5:ksi. 15 tunnin inkuboinnin jälkeen +4 °C:ssa sentrifugoidaan. Saostuma pestään 200 ml :11a vettä ja kylmäkuivataan. Saadaan 4,8 g aineseosta, josta määritetään RP-HPLC:ssä 900 mg:n mini-proinsuliiniosa.

15 S-sulfonaatin rikastaminen tapahtuu 2 vaiheessa: 1. Anioninvaihtokromatografia 5 x 60 cm:n pylväässä RFractogel TSK DEAE-650 M:llä 3 M virtsa-aineessa; 0,05 M Tris-HCl (pH 8,3). Eluutio suoritetaan 0,05 - 0,5 M NaCl-gradientilla (kutakin 6 1) . Eluaatti analysoidaan iso- 20 elektrisellä fokusoinnilla, minkä jälkeen tuote saostetaan yhdistetyistä fraktioista laimentamalla pitoisuuteen 1 M virtsa-ainetta ja säätämällä pH 3,5:ksi.

2. Suuri- ja pienimolekulaaristen epäpuhtauksien poistaminen geelisuodatuksena RSephacryl S200:ssa 3 M

25 virtsa-aineessa; 0,05 M Tris-HCl; 0,05 M NaCl (pH 8,3).

Fraktioiden analysointi ja tuotteen eristäminen suoritetaan kuten edellisessä vaiheessa. Saostuma pestään 20 ml :11a vettä ja kylmäkuivataan. Saadaan 1,10 g 69 %:n puhtauteen rikastettua tuotetta.

30 Laskostumista ja disulfidisiltojen muodostumista

« L

4- varten S-sulfonaatti liuotetaan 50 ml:aan 8 M virtsa-ai netta; 0,02 M Tris-HCl pH:ssa 8,6. Lisätään muutamia tippoja oktanolia, minkä jälkeen seokseen johdetaan 15 minuutin ajan jälkipuhdistettua typpeä. Kun lisätään 1,1 ml (16 35 mMol) 2-merkaptoetanolia, seuraa täydellinen pelkistyminen 102076 15 1 tunnin sisällä huoneenlämpötilassa. Liuos laitetaan RSephadex G25-pylvääseen (5 x 60 cm) ja eluoidaan 0,05 M:11a glysiini/NaOH (pH 10,6). Proteiinifraktiota 300 ml:ssa glysiinipuskuria säilytetään pH-arvon kontrolloin-5 nin ja mahdollisen korjaamisen jälkeen 2 päivää 4 °C:ssa.

Sen jälkeen säädetään pH-arvo 6,8:ksi ja liuosta inkuboi-daan 1 mg:n (3,5 U) kanssa trypsiiniä (Merck, L-l-p-tosyy-liamino-2-fenyylietyylikloorimetyyliketonilla (TPCK) käsitelty) huoneenlämpötilassa 4 tuntia. Sen jälkeen seoksen 10 pH-arvo säädetään 3,5:ksi, siihen sekoitetaan 1 mg soija-pavun trypsiini-inhibiittoria (Sigma) ja 3 ml 10 % ZnCl2 ja pH säädetään takaisin 6,8:ksi. Syntynyt saostuma erotetaan sentrifugoimalla. Siinä on vallitsevasti mono-Arg-insuliinia, joka puhdistetaan ioninvaihtokromatografiällä S-15 SepharoseR:ssa (2,5 x 40 cm) puskurissa, joka koostuu 50 mM maitohaposta, 30 % isopropanolista (pH 3,5). Eluutio tapahtuu 0,05 - 0,50 M NaCl-gradientin avulla (kutakin 1 1). Eluaatti analysoidaan HPLC:llä; fraktiosta, joka sisältää tuotetta, saostetaan mono-Arg-insuliini laimentamalla 1:1 20 H20:lla ja lisäämällä 10 ml 10 % ZnCl2:a 1 l:aa kohti ja säätämällä pH 6,8:ksi. Sentrifugaatiolla erotettu saostuma kiteytetään puskurista, jossa on 1 g/1 fenolia, 10,5 g/1 sitruunahappoa ja 200 mg/1 ZnCl2 pH 6:ssa. Pienellä määrällä vettä pestyt kiteet kylmäkuivataan, jolloin saadaan 390 25 mg mono-Arg-insuliinia yli 90 %:n puhtaudella.

Esimerkki 5

Insuliinin valmistaminen

Liuotetaan 200 mg mono-Arg-insuliinia (ks. esimerkki 4) 100 ml:aan 0,05 M Tris-HCl:ää (pH 8,5). Sitten lisä-30 tään 1 U (n. 4 μg) karboksipeptidaasi B:tä ja liuosta se-

• I

koitetaan heikosti huoneenlämpötilassa. 3 tunnin kuluttua ihmisen insuliini kiteytetään säätämällä pH 3,5:ksi ja lisäämällä 1 ml 10 % ZnCl2:ta pH 5,5:ssä. Saadaan 200 mg kiteistä insuliinia, jonka puhtaus on enemmän kuin 85 %.

35 Tälle materiaalille tehdään puhdistus ioninvaihtokromato- 102076 16 grafiällä pylväässä, jossa on Fractogel TSK-DEAE-650 M:ää (2,5 x 40 cm) 0,1 % RLutensol ON 100:ssa (BASF AG; lineaarisen, tyydytetyn, pääasiassa 12 C-atomisen rasva-alkoholin oksietylaatti); 0,05 M Tris-HCl (pH 8,3), jolloin 5 eluaatio seuraa 0 - 0,4 M NaCl-gradientissa (kutakin 1 1). HPLC:n avulla identifioiduista tuotepitoisista fraktioista kiteytetään insuliini lisäämällä 10 ml 10 %:sta ZnCl2 ja 1 ml 10 % sitruunahappoa pH 5,5:ssä. Seosta sekoitetaan hitaasti yön yli, minkä jälkeen se sentrifugoidaan ja saa-10 tu sedimentti kiteytetään uudestaan 20 ml:sta puskuria, jossa on 5 g/1 sitruunahappoa, 125 ml/1 asetonia ja 200 mg/1 ZnCl2 pH 5,5:ssä. Saadaan 160 mg insuliinia, jonka puhtaus on enemmän kuin 95 %.

Esimerkki 6 15 Insuliinin valmistaminen mono-Arg-insuliinista käyttämällä trypsiiniä ja karboksipeptidaasi B:tä 5 mg mono-Arg-insuliinia liuotetaan 20 ml:aan 0,1 M Tris-HCl:ää (pH 8,0) ja lämmitetään 30 °C:seen. Seokseen lisätään samanaikaisesti 2,5 μΐ trypsiiniliuosta (1 U/ml) 20 ja 150 μΐ karboksipeptidaasi B -liuosta (1 U/ml). 3 tunnin kuluttua liuoksen pH säädetään 3,5:ksi ja lisätään 2,5 μΐ trpysiini-inhibiittoriliuosta (1 U/ml) sekä 200 μΐ 10 %.-sta ZnCl2-liuosta. Ihmisen insuliini saostetaan säätämällä pH 6,8:ksi, sentrifugoidaan ja kiteytetään kuten 25 esimerkissä 5. Kiteytetyn insuliinin puhtaus on > 95 %.

Esimerkki 7

Hi iva-ekspressiovektorin rakentaminen

Ensin syntetisoidaan DNA-sekvenssi (23) (taulukko 3) fosfiittimenetelmän mukaan. Tämä DNA-sekvenssi (23) 30 koodaa MFa-esiasteproteiinin aminohappoja 49-80 ja vastaa olennaisesti luonnollista DNA-sekvenssiä.

Tätä DNA-sekvenssiä (23) käytetään sitten koettimena λ-tekijän geenin eristyksessä ja tätä varten se leimataan 32P:llä. Tämän koettimen avulla eristetään genomi 35 Xgtll-hiivageenipankista (jotka ovat kaupallisesti ylei- 102076 17 sesti saatavissa, esim. Clontech Laboratories Inc., 4055 Fabian Way, Palo Alto, CA94303) . Sitä varten identifioidaan Xgtll-faageja, joissa on λ-tekijä, plakkihybridisoin-tikokeessa. Positiivisiksi tunnistetuista plakeista eris-5 tetään faageja, ne monistetaan ja DNA eristetään. DNA pilkotaan EcoRI:lla ja analysoidaan 0,8-%:isessa agaroosigee-lissä. "Southern transfer" -analyysin jälkeen membraani hybridi soidaan 32P-leimatun DNA-sekvenssin (23) kanssa. Faagi-DNA, jossa on n. 1,75 kb:n fragmentti (24), joka 10 hybridisoituu DNA-sekvenssin (23) kanssa, pilkotaan uudestaan entsyymillä ja vastaava fragmentti eristetään. Vektori pUC19 aukaistaan EcoRI:lla (25) ja saatetaan reagoimaan 1,75 kb:n fragmentin (24) kanssa T4-ligaasin avulla. Saadaan kloonausvektori (26).

15 Ligaatioseoksella transformoidaan E. coli 79/02 -kanta. Eristetään valkoiset pesäkkeet, näistä eristetään plasmidi-DNA ja plasmidit (26), joissa on 1,75 kb:n EcoRI-fragmentti, tunnistetaan.

MFa:n esiasteproteiinin luonnollisella DNA-sekvens-20 sillä on aminohappojen 8-10 alueella Pstl-pilkkomiskohta ja aminohappojen 48/49 alueella TaqI-pilkkomiskohta. Eristetystä plasmidi-DNA:sta (26) eristetään nyt Pstl:llä ja Taql:llä reaktion jälkeen fragmentti (27), joka koodaa MFa-esiastesekvenssin aminohappoja 9-48. Vektori pUC18 au- '* 25 kaistaan Pstl:llä ja Kpnlrllä (28) ja saatetaan reagoimaan

Pstl-Taql-fragmentin (27) kanssa samoin kuin synteettisen DNA-sekvenssin (23) kanssa T4-ligaasin avulla. Ligaatioseoksella transformoidaan E. coli 79/02. Transformaatio-seos maljataan IPTG-Xgal-Ap-maljoille. Eristetään valkoi-30 set pesäkkeet ja näiden kloonien plasmidi-DNA karakteri- • · .«* soidaan restriktioanalyysillä. Näin saadaan kloonausvekto ri (29), joka koodaa MFa-esiastesekvenssin aminohappoja 8-80.

Kloonausvektorista (29) leikataan Pstl:llä ja 35 Kpnl:llä mainittu koodaava sekvenssi (30) ja sitä käyte- 102076 18 tään seuraavassa kuvattuun ligaatioon. Tätä varten kloo-nausvektori (26) saatetaan reagoimaan EcoRI:n ja osittain Pstl:n kanssa ja fragmentti (31) eristetään, joka käsittää MFof-esiastesekvenssin 8 ensimmäistä aminohappoa koodaavan 5 sekvenssin. pUC19-vektori pilkotaan edelleen EcoRI:lla ja

Kpnlrllä (32) ja ligatoidaan molempien kuvattujen fragmenttien (30) ja (31) kanssa, jolloin syntyy kloonausvek-tori (33) . Tämä koodaa MFor:n koko esiastesekvenssiä aminohappoon 80 asti.

10 Kloonausvektori (33) aukaistaan Kpnl:llä ja

HindIII:lla ja suuri fragmentti (34) eristetään. Tämä ligatoidaan plasmidin (11) Kpnl-HindiII-fragmentin (35) kanssa, joka koodaa mini-proinsuliinia. Näin saadaan plas-midi pIK20 (36), jonka rakenne vahvistetaan restriktioana-15 lyysillä.

Plasmidi Yepl3 (Broach et ai.. Gene 8 (1979) 121) aukaistaan BamHI:llä ja ylijäävät päät täytetään Klenow-polymeraasilla (38) . DNA saostetaan etanolilla ja käsitellään alkaalisella naudan fosfataasilla.

20 Kloonausvektorista (36) leikataan HindIII:lla ja

EcoRIrlla insuliinijohdannaista ja MFa:n esiastesekvenssiä koodaava fragmentti ja ylijäävät päät täytetään kuten kuvattu (37) .

Molemmat tasapäiset DNA-sekvenssit (37) ja (38) I 25 ligatoidaan keskenään, jolloin muodostuu plasmidit pafbl02 (39) ja pafB104 (40). Nämä molemmat plasmidit eroavat vain insertoidun fragmentin suunnan suhteen.

Kuten EP-A 0 171 024:ssä on kuvattu, voidaan insertoidun sekvenssin jälkeen laittaa lopetuskohta (kuviot 4 -30 6 EP-A 0 171 024:ssä). Tähän sopivat Ncol- ja/tai BamHI- *: pilkkomiskohdat.

«

Plasmidi-DNA amplifioidaan E. coli MM294:ssä, minkä jälkeen plasmidi pafB102 (39) transformoidaan leusiinia tarvitseviin hiivakantoihin Y79 (a, trpl-1, leu2-l) 35 (Cantrell et ai., Proc. Acad. Natl. Sei. USA 82 (1985) 102076 19 6250 ja DM6-6 (a/ot leu2-3, 112::ura3+/leu2::lys2+, trp'/trpl‘, his3-ll, 15/his3-ll, 15, ura3‘/ura3', Iys2'/lys2', arg4-17/arg4 + , adel'/adel + ) (Maya Hanna, Dept. Mol. Biol. Massachusetts General Hospital, Boston, USA) Ito, H. et 5 al:iin. litium-menetelmän mukaan, J. Bacteriol., 153 (1983) 163. Pesäkkeet, jotka voivat kasvaa selektiivisellä alustalla ilman leusiinilisäystä, eristetään ja yksilöidään. yksittäiset pesäkkeet ympätään hiiva-minimaalialus-talle ja inkuboidaan 24 tuntia 28 °C:ssa. Solut sentrifu-10 goidaan ja supernatantin insuliiniaktiivisuus testataan RIA-testissä. Hiivaklooneista, joiden supernatantti osoittaa insuliiniaktiivisuutta, eristetään plasmidi-DNA uudelleen ja karakterisoidaan restriktioanalyysillä. Transformoituja hiivakantoja käytetään seuraavaan ekspressoitumi-15 seen.

Esimerkki 8

Espressoituminen hiivassa 10 ml hiivatäysalustaa ympätään soluilla, jotka on otettu tuoreesta yön yli kasvaneesta viljelmästä, jossa on 20 erästä esimerkin 7 mukaan saatua kantaa selektiiviseltä alustalta, niin että saavutetaan optinen tiheys OD^» = 0,1. Viljelmää ravistellaan 8 tuntia 28 °C:ssa, minkä jälkeen lisätään 90 ml tuoretta alustaa. Sen jälkeen ravistellaan viljelmää vielä 20 tuntia. Solut sentrifugoidaan ja super-:· 25 natantin insuliinikonsentraatio määritetään. Olosuhteet muuttuvat suuremmalle fermentaatiolle, esim. tuoretta alustaa voidaan lisätä jatkuvasti.

Esimerkki 9

Mono-Arg-insuliinin puhdistaminen hiivasupematan- 30 tista V Fermentaatiosupernatanttia laitetaan adsorptiopyl- vääseen, jossa on huokoista adsorptiohartsia styroli- ja divinyylibentsoli-kopolymeeristä (RDiaion HP20). Pylväs tasapainotetaan ensin 20 - 50 mM asetaattipuskurilla (pH 35 5). Pestään Tris-puskurilla (pH 8), minkä jälkeen tehdään 102076 20 isopropanoligradientti (0 - 50 %) 10-kertaisella pylvästi-lavuudella. Insuliinipitoisten fraktioiden pH säädetään 6:ksi, saatetaan reagoimaan *MATREX CELLUFINE AM:n kanssa (Fa. Amicon), sekoitetaan ja suodatetaan ja pestään uudel-5 leen 50 mM:lla asetaattipuskurilla (pH 6). Pesufraktio ja pääfraktio yhdistetään, pH säädetään 3,5:ksi maitohapolla ja seos laitetaan S-SEPHAROSE-pylvääseen, joka on tasapainotettu 50 mMrlla maitohapolla (pH 5)/30 % isopropanolilia.

10 Eluutio tapahtuu 0 - 0,6 M NaCl-gradientin avulla.

Miniproinsuliini eluoituu alueella 0,25 - 0,3 M.

Proinsuliinipitoisten fraktioiden tilavuus haihdutetaan l/4:ään ja laitetaan pylvääseen, jossa on Biogel-P10 (Bio-Rad) ja joka on tasapainoitettu 6 %:ssa etikka-15 happoa (pH 2) . Insuliinipitoinen eluaatti lyofilisoidaan ja puhdistetaan preparatiivisen käänteisfaasi-HPLC:llä (RP18-materiaali, 0,1 % TFA, asetonitriiligradientti 20 -40 %) . Kylmäkuivataan, liuotetaan Tris-puskuriiin (pH 6,8) ja inkuboidaan 4 yksikön kanssa trypsiiniä grammaa mono-20 Arg-proinsuliinia kohti huoneenlämpötilassa 3-5 tuntia. Reaktion kulkua seurataan käänteisfaasianalytiikalla. Osoittautuu, että syntyy lähes kvantitatiivisesti mono-Arg-insuliinia. Reaktion lopussa pH-arvo säädetään 3,5:ksi ja reaktio lopetetaan lisäämällä vastaava määrä trypsiini-: 25 inhibiittoria. Sen jälkeen säädetään seoksen sinkkiklori- dikonsentraatio 0,21 g/1 ja pH-arvo 6,8. Saadaan hiutalei-nen saostuma, joka liukenee maitohappopuskuriin. Komponentit erotetaan toisistaan S-SEPHAROSE-kromatografiällä. Fraktiot, joissa on mono-Arg-insuliinia, puhdistetaan ja 30 sekoitetaan vedellä suhteessa 1:1. Sen jälkeen liuos saa-tetaan reagoimaan 10 ml:n kanssa 10-%:ista ZnCl2 yhtä litraa kohti. pH 6,8:ssa saostuu mono-Arg-insuliini, joka sitten (insuliinille) tunnetulla tavalla kiteytetään uudelleen.

102076 21

Esimerkki 10

Ihmisen insuliinin valmistaminen

Esimerkissä 9 kuvattu mono-Arg-insuliini toimii lähtömateriaalina karboksipeptidaasi B -pilkkomiselle.

5 Sitä varten insuliinijohdannainen liuotetaan Tris-pusku-riin (pH 8,5) ja sekoitetaan 5 yksikön kanssa karboksipeptidaasi B:tä grammaa kohti mono-Arg-insuliinia. Reaktio suoritetaan huoneenlämpötilassa heikosti sekoittaen 3 tuntia. Sitten saostetaan ZnCl2:lla kuten esimerkissä 9 on 10 kuvattu. Ihmisen insuliini puhdistetaan sitten tunnetulla tavalla (DE-B 2 629 568).

5 22 102076

Taulukko 1

Geenifragmentti IK I (2) B1

Phe 10 20 30 40 10 <..............................2...........................

CT TTG GAC AAG AGA TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCT CAC

CAT GGA AAC CTG TTC TCT AAG CAA TTG GTT GTG AAC ACA CCA AGA GTG

<.............................1...............................> (Kpnl) Hpal 15 50 60 70 80 90 --> <-----------------------------------------.....4--.....-

TTG GTG GAA GCG TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAG CGT GGT TTC TTC

20 ' AAC CAC CTT CGC AAC ATG AAC CAA ACA CCA CTC GCA CCA AAG AAG

<.....-......................................--3......-.....

b30

Thr Arg Lys Gly Ser Leu 100 110 120 25 ;· _________________________________________>

TAC ACT CCA AAG ACG CGT AAG GGT TCT CTG CA

ATG TGA GGT TTC TGC GCA TTC CCA AGA G

__________________________________>

MluI (PstI) » 102076 23

Taulukko 2

Geenifragmentti IK II (5) 5 A*

Gin Lys Arg Gly 130 140 150 160 10 <.......................................................6

G AAG CGT GGT ATC GTT GAA CAA TGT TGT ACT AGT ATC TGT TCT

AC GTC TTC GCA CCA TAG CAA CTT GTT ACA ACA TGA TCA TAG ACA AGA

<.............................................................5 iPstl) Spel 15

Asn 170 180 190 200 210 ---------------------------------------------------------->

TTG TAC CAG CTG GAA AAC TAC TGT AAC TGA TAG TCG ACC CAT GGA

20

AAC ATG GTC GAC CTT TTG ATG ACA TTG ACT ATC AGC TGG GTA CCT TCG A

----------------------------------------------------------------> {Hindlll) 102076 24

Taulukko 3 DNA-sekvenssi (23) 5 50 55

5' C GAT GTT GCT GTT TTÖ CCA TTC TCC 3’ TA CAA CGA CAA AAC GGT AAG AGG

(Taql) 10 60 65

AAC AGT ACT AAT AAC GGT TTA TTG TTC TTG TCA TGA TTA TTG CCA AAT AAC AAG

70

15 ATT AAT ACT ACT ATT GCT AGC ATT GCT

TAA TTA TGA TGA TAA CGA TCG TAA CGA

75 80 GCT AAA GAA GAA GGG GTA C 3’ 20 CGA TTT CTT CTT CCC 5’ (ΚρηI)

Claims (6)

102076

1. Menetelmä sellaisen yhdisteen valmistamiseksi, jolla on kaava I 5 B (1-30)-Arg-A(l-21) (I), jossa B(l-30) ja A(1-21) merkitsevät ihmisen insuliinin B-ja A-ketjua, vastaavasti, tunnettu siitä, että 10 tätä yhdistettä koodittava geenirakenne ilmennetään bakteerissa tai hiivassa, ja siinä tapauksessa, että geenirakenne koodittaa fuusioproteiinia, vapautetaan fuusiopro-teiinista kaavan I mukainen yhdiste.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä kaavan 15. mukaisen proteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 mukaisesti saatava fuu-sioproteiini pilkotaan entsymaattisesti ja kaavan I mukainen proteiini eristetään.

3. Menetelmä sellaisen yhdisteen valmistamiseksi, 20 jolla on kaava II S - S I I A (1 - 21) I I

25 SS (II), I I S S I I B(1 - 30) - Arg 30 jossa A(1-21):llä ja B(l-30):llä on patenttivaatimuksessa 1 mainitut merkitykset ja -S-S-sillat ovat järjestäytyneet , kuten insuliinissa, tunnettu siitä, että patent- tivaatimuksen 1 tai 2 mukaisesti saatava proteiini pilko-35 taan entsymaattisesti lievästi happamissa olosuhteissa (pH = 6,8), edullisesti trypsiinillä.

4. Menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 1 tai 2 102076 mukaisesti saatava proteiini pilkotaan trypsiinillä ja karboksipeptidaasi B:llä yksitölkkireaktiossa lievästi happamissa olosuhteissa (pH = 6,8).

5. Menetelmä ihmisen insuliinin valmistamiseksi, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan patenttivaatimuksen 1 mukaisesti fuusioproteiini, tämä pilkotaan, kaavan I mukainen proteiini eristetään ja siitä valmistetaan entsymaattisesti kaavan II mukainen yhdiste ja tästä, joko välillä eristämällä tai edullisesti suoraan, pilkotaan

10 C-terminaalinen arginiini lievästi happamissa olosuhteissa (pH = 6,8).

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioproteiinissa kaavan I mukainen proteiini on sitoutunut painolastiosaan siltajä- 15 senen välityksellä, jonka kaava on -Met-Ile-Glu-Gly-Arg-. 102076