FR2789075A1 - 1,2-DIOXETAN COMPOUNDS, THEIR PREPARATION AND THEIR USE FOR THE DETERMINATION OF THIOLS AND ACETYLCHOLINESTERASE - Google Patents
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Classifications
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- C07D321/00—Heterocyclic compounds containing rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D317/00 - C07D319/00
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Abstract
Description
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COMPOSES 1,2-DIOXETANNES, LEUR PREPARATION ET LEUR
UTILISATION POUR LE DOSAGE DE THIOLS ET DE
L'ACETYLCHOLINESTERASE. 1,2-DIOXETAN COMPOUNDS, THEIR PREPARATION AND THEIR
USE FOR THE DETERMINATION OF THIOLS AND
ACETYLCHOLINESTERASE.
DESCRIPTION Domaine technique
La présente invention a pour objet de nouveaux composés 1,2-dioxétannes, utilisables de façon générale pour doser des fonctions thiols, et plus particulièrement pour mesurer l'activité de l'acétylcholinestérase par mesure de luminescence. DESCRIPTION Technical area
The subject of the present invention is novel 1,2-dioxetane compounds which can be used in general for assaying thiol functions, and more particularly for measuring the activity of acetylcholinesterase by measuring luminescence.
Elle s'applique en particulier aux dosages immuno-enzymatiques dans lesquels l'enzyme utilisée est l'acétylcholinestérase. It applies in particular to immunoenzymatic assays in which the enzyme used is acetylcholinesterase.
État de la technique antérieure
A l'heure actuelle, la technique de choix pour mesurer l'activité de l'acétylcholinestérase est la méthode colorimétrique d'Ellman. Celle-ci est fondée sur l'utilisation d'acétylthiocholine et de 5-5'dithiobisnitrobenzoate (DTNB) selon le schéma réactionnel qui suit : State of the prior art
At present, the technique of choice for measuring acetylcholinesterase activity is the Ellman colorimetric method. This is based on the use of acetylthiocholine and 5-5'dithiobisnitrobenzoate (DTNB) according to the following reaction scheme:
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Dans un premier temps, l'acétylthiocholine apportée dans le milieu est hydrolysée par l'acétylcholinestérase en thiocholine. La thiocholine réagit ensuite sur le pont disulfure du DTNB pour donner du DTNB réduit. Cette molécule présente la particularité d'absorber fortement dans le visible (# = 412 nm, # = 13600 cm-1mol-1 et produit une coloration jaune. First, the acetylthiocholine provided in the medium is hydrolyzed by acetylcholinesterase to thiocholine. The thiocholine then reacts on the disulfide bridge of DTNB to give reduced DTNB. This molecule has the particularity of absorbing strongly in the visible range (# = 412 nm, # = 13600 cm-1mol-1 and produces a yellow coloration.
Si la concentration de thiocholine formée excède celle du DTNB (ce qui est en rarement le cas), la thiocholine formée en excès réagit une nouvelle fois avec le disulfure mixte obtenu en produisant une If the concentration of thiocholine formed exceeds that of DTNB (which is rarely the case), the thiocholine formed in excess reacts again with the mixed disulfide obtained, producing a
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nouvelle molécule de DTNB réduit. Par colorimétrie, on peut ainsi détecter jusqu'à 1,5.10-6 mole de thiocholine et jusqu'à 1,85.10-18 mole d'acétylcholinestérase de Gymnote (EP-A-0 139 552 [5]). new reduced DTNB molecule. By colorimetry, it is thus possible to detect up to 1.5 × 10-6 mol of thiocholine and up to 1.85 × 10-18 mol of Gymnot's acetylcholinesterase (EP-A-0 139 552 [5]).
Depuis une dizaine d'années, des procédés de détection de l'activité enzymatique de certaines enzymes par mesure de luminescence, ont été développés. For the past ten years or so, methods for detecting the enzymatic activity of certain enzymes by measuring luminescence have been developed.
Ainsi, les documents EP-A-0 254 051 [1] et WO-A-88/00695 [2] décrivent l'utilisation de dérivés 1,2-dioxétannes stables, non luminescents, qui sous l'action d'une enzyme telle que la phosphatase alcaline, produisent un intermédiaire instable se décomposant en émettant de la lumière. Dans le cas de la phosphatase alcaline, on peut utiliser comme dioxétanne l'ester phosphorique de l'AMPPD qui réagit avec cette enzyme selon le schéma réactionnel donné cidessous :
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L'hydrolyse enzymatique de l'ester phosphorique de l'AMPPD génère de l'AMPD- instable qui se scinde en deux produits dont l'un, l'anion méthyl moxybenzoate émet de la lumière en présence d'un amplificateur de luminescence. Cette lumière est observée pendant plusieurs heures (glow luminescence). The enzymatic hydrolysis of the phosphoric ester of AMPPD generates unstable AMPD- which splits into two products, one of which, the methyl moxybenzoate anion, emits light in the presence of a luminescence enhancer. This light is observed for several hours (glow luminescence).
Par cette technique, on peut détecter jusqu'à 10-20 mole de phosphatase alcaline. By this technique, up to 10-20 moles of alkaline phosphatase can be detected.
A l'heure actuelle, il n'existe pas de technique équivalente pour déterminer l'activité de l'acétylcholinestérase (AchE). En effet, on ne dispose pas de substrat luminescent susceptible d'être pris en charge par le site catalytique de l'AchE qui n'est accessible qu'au travers d'une étroite gorge . At present, there is no equivalent technique for determining the activity of acetylcholinesterase (AchE). Indeed, there is no luminescent substrate capable of being taken over by the catalytic site of the AchE which is accessible only through a narrow groove.
Exposé de l'invention
La présente invention a précisément pour objet de nouveaux composés 1,2-dioxétannes susceptibles de convenir pour mesurer l'activité de l'AchE par luminescence. Disclosure of the invention
A specific subject of the present invention is novel 1,2-dioxetane compounds which may be suitable for measuring the activity of AchE by luminescence.
Selon l'invention, les composés 1,2dioxétanne répondent à la formule : According to the invention, the 1,2-dioxetane compounds correspond to the formula:
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dans laquelle : - R1 est un atome d'hydrogène ou un groupe choisi parmi les groupes alkyle, alcoxy, hydroxyalkyle, aryloxy, dialkylamino, arylamino, trialkylsiloxy, arylsiloxy, aryle, aralkyle, alkaryle, hétéroalkyle, hétéroaryle, cycloalkyle et cyclohétéroalkyle ; - R2 est choisi parmi les groupes aromatiques bivalents éventuellement substitué par un groupe amino, alkylamino, dialkylamino, alcoxy, alkyle, hydroxyalkyle, aryloxy, arylamino, diarylamino, halogène, aryle, hétéroalkyle ou hétéroaryle ; - X représente 0 ou S ; - R3 représente un groupe phényle ou un groupe polyaromatique, substitué en ortho et/ou en para du soufre par au moins un groupe choisi parmi les groupes alkylcarbonyle, arylcarbonyle, carboxyle, azido, nitro, cyano, acyle, alkylsulfonyle, arylsufonyle, acide sulfonique -S03H, alkyl sulfinyle ou aryl sulfinyle ; et - R4 et R5 sont des groupes alkyle ou aryle qui peuvent former ensemble un groupe cycloalkyle, polycycloalkyle, aryle, aryle polycyclique lié au cycle dioxétanne par une jonction spirannique.
in which: - R1 is a hydrogen atom or a group chosen from alkyl, alkoxy, hydroxyalkyl, aryloxy, dialkylamino, arylamino, trialkylsiloxy, arylsiloxy, aryl, aralkyl, alkaryl, heteroalkyl, heteroaryl, cycloalkyl and cycloheteroalkyl groups; - R2 is chosen from bivalent aromatic groups optionally substituted by an amino, alkylamino, dialkylamino, alkoxy, alkyl, hydroxyalkyl, aryloxy, arylamino, diarylamino, halogen, aryl, heteroalkyl or heteroaryl group; - X represents 0 or S; - R3 represents a phenyl group or a polyaromatic group, substituted ortho and / or para sulfur with at least one group chosen from alkylcarbonyl, arylcarbonyl, carboxyl, azido, nitro, cyano, acyl, alkylsulfonyl, arylsufonyl, sulfonic acid groups -SO3H, alkyl sulfinyl or aryl sulfinyl; and - R4 and R5 are alkyl or aryl groups which can together form a cycloalkyl, polycycloalkyl, aryl or polycyclic aryl group linked to the dioxetane ring via a spiran junction.
Ces composés 1,2-dioxétannes sont conçus non pas pour réagir directement avec l'AchE, mais pour These 1,2-dioxetane compounds are designed not to react directly with AchE, but to
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réagir avec le produit obtenu par hydrolyse enzymatique de l'acétylthiocholine par l'AchE, c'est-à-dire la thiocholine. En effet, cette thiocholine peut réagir avec le pont SX du composé 1, 2-dioxétanne pour générer un anion instable du type :
qui comme son homologue oxygéné AMPD est instable et génère de la lumière. react with the product obtained by enzymatic hydrolysis of acetylthiocholine by AchE, that is to say thiocholine. Indeed, this thiocholine can react with the SX bridge of compound 1,2-dioxetane to generate an unstable anion of the type:
which like its oxygenated counterpart AMPD is unstable and generates light.
Selon l'invention, dans la formule (I) cidessus, les groupes alkyle utilisés dans R1, soit seuls, soit en combinaison dans d'autres groupes, peuvent être linéaires ou ramifiés, et comprennent de préférence 1 à 8 atomes de carbone. According to the invention, in formula (I) above, the alkyl groups used in R1, either alone or in combination in other groups, can be linear or branched, and preferably comprise 1 to 8 carbon atoms.
Les groupes cycloalkyle et cyclohétéroalkyle utilisés pour R1 ont de préférence 2 ou 3 à 14 atomes de carbone. The cycloalkyl and cycloheteroalkyl groups used for R1 preferably have 2 or 3 to 14 carbon atoms.
Les groupes aryle utilisés pour R peuvent comporter un ou plusieurs cycles, et de préférence 6 à 14 atomes de carbone. A titre d'exemples de tels groupes, on peut citer les groupes phényle, diphényle, naphtyle. The aryl groups used for R may have one or more rings, and preferably 6 to 14 carbon atoms. As examples of such groups, mention may be made of phenyl, diphenyl and naphthyl groups.
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Les groupes hétéoaryle utilisés pour R1 peuvent être par exemple les groupes pyrrolyle et pyrazolyle. The meteoraryl groups used for R1 can be, for example, pyrrolyl and pyrazolyl groups.
Selon l'invention, R représente un groupe aromatique comportant un ou plusieurs noyaux aromatiques ayant par exemple 6 à 30 atomes de carbone. According to the invention, R represents an aromatic group comprising one or more aromatic rings having for example 6 to 30 carbon atoms.
A titre d'exemple, on peut utiliser les groupes phényle, diphényle, naphtyle. Ce groupe aromatique est substitué par au moins un groupe choisi parmi les groupes mentionnés précédemment. Lorsque les groupes substituants comprennent un groupe aryle ou alkyle, le groupe alkyle comprend généralement de 1 à 10 atomes de carbone. Le groupe aryle peut comporter un hétéroatome tel que 0, S ou N, et à généralement 5 à 10 atomes de carbone. By way of example, it is possible to use the phenyl, diphenyl and naphthyl groups. This aromatic group is substituted by at least one group chosen from the groups mentioned above. When the substituent groups include an aryl or alkyl group, the alkyl group generally has 1 to 10 carbon atoms. The aryl group can contain a heteroatom such as 0, S or N, and generally 5 to 10 carbon atoms.
Dans la formule (I), R2 est un groupe aromatique bivalent qui peut être substitué. A titre d'exemple de groupes aromatiques utilisables, on peut citer les groupes phénylène, diphénylène et naphtylène. In formula (I), R2 is a divalent aromatic group which may be substituted. As examples of aromatic groups that can be used, mention may be made of phenylene, diphenylene and naphthylene groups.
De préférence, selon l'invention, R2 représente un groupe phénylène éventuellement substitué en position para par rapport à X, par l'un des groupes mentionnés ci-dessus. Dans ce cas, le composé 1,2dioxétanne répond à la formule : Preferably, according to the invention, R2 represents a phenylene group optionally substituted in the para position with respect to X, by one of the groups mentioned above. In this case, the compound 1,2dioxetane corresponds to the formula:
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dans laquelle R , R3, R4, R et X sont tels que définis ci-dessus, Y représente un atome d'hydrogène ou un groupe choisi parmi les groupes amino, alkylamino, dialkylamino, alkyloxy, halogène, aryle ou alkyle.
in which R, R3, R4, R and X are as defined above, Y represents a hydrogen atom or a group chosen from amino, alkylamino, dialkylamino, alkyloxy, halogen, aryl or alkyl groups.
Selon l'invention, R4 et R5 forment de préférence ensemble un groupe cycloalkyle ayant par exemple 6 à 12 atomes de carbone dans le cycle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes alkyle en C1 à C7 ou groupes comportant un hétéroatome comme le groupe carbonyle, ou un groupe polycycloalkyle, par exemple de 6 à 30 atomes de carbone ayant deux ou plusieurs cycles fusionnés de 5 à 12 atomes de carbone chacun, lié au cycle dioxétanne par une jonction spirannique. According to the invention, R4 and R5 preferably together form a cycloalkyl group having for example 6 to 12 carbon atoms in the ring, optionally substituted by one or more C1 to C7 alkyl groups or groups comprising a heteroatom such as the carbonyl group, or a polycycloalkyl group, for example of 6 to 30 carbon atoms having two or more fused rings of 5 to 12 carbon atoms each, linked to the dioxetane ring through a spiran junction.
A titre d'exemple, R et R peuvent former ensemble le groupe adamantyle. For example, R and R can together form the adamantyl group.
De préférence, R représente un groupe alcoxy de 1 à 4 atomes de carbone. Preferably, R represents an alkoxy group of 1 to 4 carbon atoms.
Dans les composés de formule (I) et (II) de l'invention, R est choisi en fonction des propriétés que l'on veut obtenir. En effet R joue le rôle d'un noyau modulateur car en modifiant la nature des groupements présents sur ce noyau, on peut jouer à la In the compounds of formula (I) and (II) of the invention, R is chosen as a function of the properties which it is desired to obtain. Indeed R plays the role of a modulating nucleus because by modifying the nature of the groups present on this nucleus, we can play the
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fois sur le potentiel d'oxydoréduction du pont S-X et sur la solubilité du substrat luminescent dans l'eau. both on the redox potential of the S-X bridge and on the solubility of the luminescent substrate in water.
De préférence, R3 représente le groupe dinitrophényle. Preferably, R3 represents the dinitrophenyl group.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, le composé 1,2-dioxétanne est un composé de formule (I) dans laquelle X représente S. A titre d'exemple d'un tel composé, on peut citer celui répondant à la formule :
Selon un second mode de réalisation de l'invention, le dioxétanne répond à la formule (I) dans laquelle X représente 0. According to a second embodiment of the invention, the dioxetane corresponds to formula (I) in which X represents 0.
A titre d'exemple d'un tel composé, on peut citer celui répondant à la formule : By way of example of such a compound, mention may be made of that corresponding to the formula:
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Les dioxétannes répondant à la formule (I) dans laquelle X représente S, peuvent être préparés par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaction d'un composé de formule :
dans laquelle R1 et R2 sont tels que définis ci-dessus et R représente un groupe alkyle, avec une cétone de formule :
dans laquelle R4 et R5 sont tels que définis ci-dessus, pour obtenir le composé de formule :
in which R1 and R2 are as defined above and R represents an alkyl group, with a ketone of formula:
in which R4 and R5 are as defined above, to obtain the compound of formula:
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b) réaction du composé de formule (VII) avec un composé de formule : R3 SCI (VIII) ,
R3SCN ou R3 SBr dans laquelle R est tel que défini ci-dessus, pour obtenir un composé de formule :
c) réaction du composé (IX) avec de l'oxygène singulet pour obtenir le composé 1,2dioxétanne de formule (I) avec X représentant S. b) reaction of the compound of formula (VII) with a compound of formula: R3 SCI (VIII),
R3SCN or R3 SBr in which R is as defined above, to obtain a compound of formula:
c) reaction of the compound (IX) with singlet oxygen to obtain the 1,2-dioxetane compound of formula (I) with X representing S.
L'oxygène singulet utilisé dans l'étape c) peut être obtenu par décomposition à 35 C du composé d'oxydation du thriphényl phosphite avec de l'ozone. The singlet oxygen used in step c) can be obtained by decomposition at 35 ° C. of the thriphenyl phosphite oxidation compound with ozone.
Le composé de formule (V) utilisé comme produit de départ dans ce procédé, peut être préparé par réaction d'un composé de formule :
avec un composé d'étain de formule :
dans laquelle R8 est tel que défini ci-dessus. The compound of formula (V) used as starting material in this process can be prepared by reaction of a compound of formula:
with a tin compound of the formula:
in which R8 is as defined above.
Dans le cas des composés 1,2-dioxétannes de formule (I) dans laquelle X représente 0, on peut In the case of 1,2-dioxetane compounds of formula (I) in which X represents 0, it is possible
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préparer les composés par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) réaction d'un composé de formule :
dans laquelle R et R2 sont tels que définis ci-dessus et R9 est un groupe protecteur d'une fonction hydroxyle, avec une cétone de formule :
dans laquelle R4 et R5 sont tels que définis ci-dessus, pour obtenir le composé de formule :
b) réaction de déprotection du composé de formule (XIII) pour obtenir le composé de formule :
c) réaction du composé de formule (XIV) avec le composé de formule R3SC1 (VIII), R3 SCN ou R3 SBr dans laquelle R est tel que défini ci-dessus, pour obtenir un composé de formule : preparing the compounds by a process comprising the following steps: a) reaction of a compound of formula:
in which R and R2 are as defined above and R9 is a group protecting a hydroxyl function, with a ketone of formula:
in which R4 and R5 are as defined above, to obtain the compound of formula:
b) deprotection reaction of the compound of formula (XIII) to obtain the compound of formula:
c) reaction of the compound of formula (XIV) with the compound of formula R3SC1 (VIII), R3 SCN or R3 SBr in which R is as defined above, to obtain a compound of formula:
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et d) réaction du composé de formule (XV) avec de l'oxygène singulet pour obtenir le composé 1,2- dioxétane de formule (I) dans laquelle X représente 0.
and d) reaction of the compound of formula (XV) with singlet oxygen to obtain the 1,2-dioxetane compound of formula (I) in which X represents 0.
Comme précédemment, l'oxygène singulet utilisé dans la dernière étape peut être obtenu par réaction de triphénylphosphite avec de l'ozone. Par ailleurs, le groupe protecteur R du composé XII peut être un groupe trialkyl silyle. As before, the singlet oxygen used in the last step can be obtained by reacting triphenylphosphite with ozone. Moreover, the protecting group R of compound XII can be a trialkyl silyl group.
La présente invention a encore pour objet un procédé de dosage d'un thiol dans un échantillon liquide, qui consiste à ajouter à l'échantillon une solution d'un composé 1,2-dioxétanne de formule (I) décrit ci-dessus, et à mesurer la lumière émise par l'échantillon due à la décomposition du composé 1,2- dioxétanne par le thiol. A further subject of the present invention is a method for assaying a thiol in a liquid sample, which consists in adding to the sample a solution of a 1,2-dioxetane compound of formula (I) described above, and measuring the light emitted by the sample due to the decomposition of the 1,2-dioxetane compound by the thiol.
De préférence, la solution du composé 1,2- dioxétanne comprend de plus un amplificateur de luminescence. Preferably, the solution of the 1,2-dioxetane compound further comprises a luminescence enhancer.
L'emploi d'un tel amplificateur, a pour but d'amplifier l'émission de lumière et d'éviter une extinction trop rapide par le milieu des phénomènes d'émission de lumière. The purpose of the use of such an amplifier is to amplify the emission of light and to avoid too rapid extinction by the medium of the phenomena of light emission.
Le signal lumineux peut être augmenté de 10 fois à 500 fois suivant l'amplificateur utilisé. L'amplificateur peut être une solution aqueuse micellaire contenant un sel d'ammonium quaternaire à longue chaîne hydrocarbonée et une molécule fluorescente possédant également une longue chaîne. The light signal can be increased from 10 times to 500 times depending on the amplifier used. The enhancer may be an aqueous micellar solution containing a long chain hydrocarbon quaternary ammonium salt and a fluorescent molecule also having a long chain.
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Après ajout de cet amplificateur, le composé 1,2-dioxétanne diffuse à l'intérieur d'une micelle au sein de laquelle il possède un environnement totalement hydrophobe. Lors de la dégradation du dioxétanne, la molécule activée formée peut alors retourner à son état fondamental en transférant son énergie lumineuse aux molécules fluorescentes voisines. On obtient ainsi une amplification du signal lumineux. After adding this enhancer, the 1,2-dioxetane compound diffuses inside a micelle within which it has a completely hydrophobic environment. During the degradation of dioxetane, the activated molecule formed can then return to its ground state by transferring its light energy to neighboring fluorescent molecules. An amplification of the light signal is thus obtained.
Des amplificateurs de luminescence appropriés sont par exemple ceux décrits dans les documents EP-B-352 713 [3] et WO-A-94/21821 [4]. La solution de composé 1,2-dioxétanne utilisée pour ce dosage peut être une solution du composé dans l'éthanol absolu et un tampon appropriée, à laquelle on ajoute une solution de l'amplificateur de luminescence dans un tampon approprié. La concentration en composé 1,2-dioxétanne de la solution peut varier dans une large gamme. Généralement, on utilise des concentrations finale de 10 à 10-4M. Suitable luminescence enhancers are, for example, those described in documents EP-B-352 713 [3] and WO-A-94/21821 [4]. The solution of 1,2-dioxetane compound used for this assay can be a solution of the compound in absolute ethanol and a suitable buffer, to which a solution of the luminescence enhancer in a suitable buffer is added. The concentration of 1,2-dioxetane compound in the solution can vary over a wide range. Usually, final concentrations of 10-10-4M are used.
L'invention a encore pour objet, un procédé de dosage de l'acétylcholinestérase, qui comprend les étapes suivantes :
1) addition d'acéthylthiocholine à un échantillon contenant l'acétylcholinestérase à doser et incubation du mélange pour former de la thiocholine par hydrolyse enzymatique,
2) addition au mélange d'une solution d'un composé 1,2-dioxétanne de formule (I) décrit ci-dessus, et
3) mesure de la lumière émise dans l'échantillon par réaction de la thiocholine avec le composé 1,2dioxétanne. A further subject of the invention is a method for assaying acetylcholinesterase, which comprises the following steps:
1) addition of acetylthiocholine to a sample containing the acetylcholinesterase to be assayed and incubation of the mixture to form thiocholine by enzymatic hydrolysis,
2) addition to the mixture of a solution of a 1,2-dioxetane compound of formula (I) described above, and
3) measurement of the light emitted in the sample by reaction of thiocholine with the compound 1,2dioxetane.
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Dans ce procédé, on peut ajouter le composé 1,2-dioxétanne en même temps que l'acétylthiocholine au contact de l'acétylcholinestérase. In this process, the 1,2-dioxetane compound can be added at the same time as the acetylthiocholine in contact with the acetylcholinesterase.
De préférence, la solution du composé 1,2dioxétanne comprend de plus un amplificateur de luminescence. Preferably, the solution of the 1,2-dioxetane compound further comprises a luminescence enhancer.
Les amplificateurs de luminescence utilisés peuvent être du même type que ceux décrits ci-dessus pour le dosage d'un thiol. La solution du composé 1,2dioxétanne peut être également du même type que celle utilisée pour le dosage d'un thiol. The luminescence enhancers used can be of the same type as those described above for the assay of a thiol. The solution of the 1,2-dioxetane compound can also be of the same type as that used for the assay of a thiol.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront mieux à la lecture de la description qui suit d'exemples de réalisation, donnés bien entendu à titre illustratif et non limitatif, en référence aux dessins annexés. Other characteristics and advantages of the invention will emerge more clearly on reading the following description of exemplary embodiments, of course given by way of illustration and without limitation, with reference to the appended drawings.
Brève description des dessins
La figure 1 représente le schéma réactionnel utilisé pour préparer un composé 1,2dioxétanne conforme au premier mode de réalisation de l'invention. Brief description of the drawings
FIG. 1 represents the reaction scheme used to prepare a 1,2dioxetane compound in accordance with the first embodiment of the invention.
La figure 2 représente le schéma réactionnel utilisé pour préparer un composé 1,2dioxétanne conforme au second mode de réalisation de l'invention. FIG. 2 represents the reaction scheme used to prepare a 1,2dioxetane compound in accordance with the second embodiment of the invention.
La figure 3 est un diagramme illustrant l'évolution de l'absorbance en fonction du rapport thiocholine/composé de l'invention dans le dosage de la thiocholine. FIG. 3 is a diagram illustrating the change in absorbance as a function of the thiocholine / compound of the invention ratio in the thiocholine assay.
La figure 4 est un diagramme représentant l'évolution du rendement lumineux RLu en fonction du FIG. 4 is a diagram representing the evolution of the light output RLu as a function of the
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rapport thiocholine/composé 1,2-dioxétanne utilisé pour le dosage de la thiocholine. thiocholine / 1,2-dioxetane compound ratio used for thiocholine assay.
La figure 5 est un diagramme illustrant l'évolution du rendement lumineux en fonction de la concentration en acétylcholinestérase, pour le dosage de l'AchE. FIG. 5 is a diagram illustrating the evolution of the light output as a function of the acetylcholinesterase concentration, for the determination of AchE.
La figure 6 est un diagramme illustrant l'évolution du rendement lumineux en fonction du temps d'incubation (en minutes) pour le dosage de l'acétylcholinestérase. FIG. 6 is a diagram illustrating the evolution of the light output as a function of the incubation time (in minutes) for the assay of acetylcholinesterase.
Exposé détaillé des modes de réalisation Exemple 1 : Synthèse du dioxétanne 1
Pour cette synthèse, on suit le schéma réactionnel représenté sur la figure 1. a) préparation de l'ester éthylique d'acide 3-iodo benzoique 3 :
1,5 ml (9,37 mmole, 1 éq.) de 3-bromo benzoate d'éthyle 2 est ajouté à une solution contenant 23,3 g (0,14 mole, 15 éq. ) de KI et 8,92 g (0,047 mole, 5 éq. ) de Cul dans 56 ml de hexaméthylphosphoramide (HMPT). On chauffe le tout à 155 C pendant 3 jours. Detailed description of the embodiments Example 1: Synthesis of dioxetane 1
For this synthesis, the reaction scheme shown in FIG. 1 is followed. A) preparation of 3-iodo benzoic acid ethyl ester 3:
1.5 ml (9.37 mmol, 1 eq.) Of ethyl 3-bromo benzoate 2 is added to a solution containing 23.3 g (0.14 mole, 15 eq.) Of KI and 8.92 g (0.047 mol, 5 eq.) Of Cul in 56 ml of hexamethylphosphoramide (HMPT). The whole is heated to 155 ° C. for 3 days.
Après avoir laissé la température du milieu réactionnel descendre à température ambiante, le mélange est versé dans une solution aqueuse de NaCl saturée (200 ml). Les deux phases obtenues sont séparées, puis la phase aqueuse est extraite à l'éther (3x100 ml). Les différentes phases organiques sont ensuite rassemblées, séchées sur MgS04, et concentrées sous pression After allowing the temperature of the reaction medium to drop to room temperature, the mixture is poured into saturated aqueous NaCl solution (200 ml). The two phases obtained are separated, then the aqueous phase is extracted with ether (3x100 ml). The different organic phases are then combined, dried over MgS04, and concentrated under pressure.
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réduite. Le produit brut résultant est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane / acétate d'éthyle 95/ 5). On obtient ainsi le 3-iodo benzoate d'éthyle 3 avec un rendement de 92% sous forme d'une huile incolore.
CgHgIOz = 276 huile incolore rendement : 92% CCM (SiOz) : hexane/ acétate d'éthyle 90/ 10 Rf=0,5 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 8, 22 (m, 1H, Harom) : 7, 85 (m, 1H, Harom); 7,70 (m, 1H, Harom); 7,01 (m, 1H, Harom); 4, 24 (q, J=9,3 Hz, 2H, -OCHz) ; 1,27 (t, J=9,3Hz, 3H, -CH3) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 164,72 (CO); 141,51 ; 138,25 ; 132,28 ; 130,05 ; 128,62 ; 93,87 (CI) ; 61,26 (-OCH2-); 14,35 (-CH3) SM (IC / NH3, m/z) : 294 [M+NH4]+ 311 [M+NH4+NH3]+ + b) Préparation du tert-butylsulfanyltributyl étain 4 :
Sous atmosphère d'argon, 4,1 ml (15,1 mmoles, 1 éq. ) de Bu3SnCl sont ajoutés à une CgHgIOz = 276 colorless oil yield: 92% TLC (SiOz): hexane / ethyl acetate 90/10 Rf = 0.5 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 8.22 (m, 1H, Harom): 7.85 (m, 1H, Harom); 7.70 (m, 1H, Harom); 7.01 (m, 1H, Harom); 4.24 (q, J = 9.3Hz, 2H, -OCHz); 1.27 (t, J = 9.3Hz, 3H, -CH3) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 164.72 (CO); 141.51; 138.25; 132.28; 130.05; 128.62; 93.87 (CI); 61.26 (-OCH2-); 14.35 (-CH3) MS (IC / NH3, m / z): 294 [M + NH4] + 311 [M + NH4 + NH3] + + b) Preparation of tert-butylsulfanyltributyl tin 4:
Under an argon atmosphere, 4.1 ml (15.1 mmoles, 1 eq.) Of Bu3SnCl are added to a
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solution contenant 1,704 ml (15,1 mmoles, 1 éq. ) de tert-butylthiol et 2,53 ml (18,12 mmole, 1,2 éq.) de triéthylamine dans 100 ml de CCl4. Après une nuit d'agitation, le milieu réactionnel est filtré, lavé avec une solution aqueuse d'acide acétique à 5% (100 ml) puis avec de l'eau (100 ml). La phase organique est séchée sur MgS04 puis concentrée sous pression réduite. Le produit brut réactionnel est propre. Il est utilisé tel quel pour la suite.
C16H36SSn = 378,7 solide blanc rendement : 98% CCM (Si.02) : dégradation sur silice RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 1,49-1,37 (m, 6H, -CH2-); 1,28 (s, 9H, -C(CH3)3) ; 1,23- 1,12 (m, 6H, -CH2-); 1,02-0,97 (m, 6H, -CH2-); 0,76 (t, J=9,7Hz, 9H, -CH2CH3) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 43,11 (-C(CH3)3) ; 36,60; 28,64; 26,97; 14,31; 13,51 c) Préparation de l'ester éthylique de l'acide 3-tert-butylsulfanyl-benzoique 5 :
83,66 mg (0,072 mmole, 0,1 éq.) de Pd(PPh3)4 sont ajoutés dans une boite à gant à une solution contenant 0,2 g (0,72 mmole, 1 éq.) de 3-iodo benzoate d'éthyle 3 dans 20 ml de toluène anhydre. Sous C16H36SSn = 378.7 white solid yield: 98% TLC (Si.02): degradation on silica 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 1.49-1.37 (m, 6H, -CH2-); 1.28 (s, 9H, -C (CH3) 3); 1.23-1.12 (m, 6H, -CH2-); 1.02-0.97 (m, 6H, -CH2-); 0.76 (t, J = 9.7Hz, 9H, -CH2CH3) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 43.11 (-C (CH3) 3); 36.60; 28.64; 26.97; 14.31; 13.51 c) Preparation of 3-tert-butylsulfanyl-benzoic acid ethyl ester 5:
83.66 mg (0.072 mmol, 0.1 eq.) Of Pd (PPh3) 4 are added in a glove box to a solution containing 0.2 g (0.72 mmol, 1 eq.) Of 3-iodo benzoate of ethyl 3 in 20 ml of anhydrous toluene. Under
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atmosphère d'argon, 0,302 g (0,79 mmole, 1,1 éq. ) du composé 4 dissous dans 5 ml de toluène anhydre est alors ajouté. Le milieu réactionnel est ensuite porté au reflux pendant 48 heures. Après retour à température ambiante, 50 ml d'éther et 50 ml d'une solution aqueuse de KF à 10% sont ajoutés. Les deux phases obtenues sont séparées, puis la phase aqueuse est extraite à l'éther (3x100 ml). Les différentes phases organiques sont ensuite rassemblées, séchées sur MgS04, et concentrées sous pression réduite. Le brut résultant est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane/ acétate d'éthyle 95/ 5). On obtient le composé 5.
C13H18O2S = 238 huile jaune rendement : 75% CCM (Si02) hexane/ acétate d'éthyle 80/ 20 Rf=0,8 8 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 8,21 (m, 1H, Harom); 8, 04 (m, 1H, Harom) ; 7,72 (m, 1H, Harom) ; 7,42 (m, 1H, Harom) 4,39 (q, J=9,3 Hz, 2H, -OCH2-); 1,40 (t, J=9,3 Hz, 3H, -CH3) ; 1,30 (s, 9H, -C (CH3) 3) C13H18O2S = 238 yellow oil yield: 75% TLC (SiO2) hexane / ethyl acetate 80/20 Rf = 0.88 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 8.21 (m, 1H, Harom); 8.04 (m, 1H, Harom); 7.72 (m, 1H, Harom); 7.42 (m, 1H, Harom) 4.39 (q, J = 9.3Hz, 2H, -OCH2-); 1.40 (t, J = 9.3Hz, 3H, -CH3); 1.30 (s, 9H, -C (CH3) 3)
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RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 166,19 (CO); 141,68; 138,25; 133,43; 131,02; 129,86; 128, 51; 61, 23 (-OCH2-) ; 31, 04 (-C (CH3) 3) ; 14, 41 (-CH2CH3) SM (IC/ NH3, m/z) : 256 [M+NH4]+
273 [M+NH4+NH3]+ d) Préparation du 2-[(3-tert-butylsul- fanyl-phényl)-éthoxy-méthylène]-adamantane 7 :
Dans une boite à gants sous azote, 4,36 g (28,26 mmoles, 10 éq.) de TiCl3 sont déposés dans un ballon de 250 ml préalablement purgé à l'argon. Le ballon est refroidi à 0 C et 35 ml de tétrahydrofuranne THF puis 14,1 ml (14,1 mmoles, 5 éq.) de LiAlH4 en solution 1M dans l'éther sont ajoutés. Après 10 minutes d'agitation à 0 C, 2,37 ml (16,9 mmoles, 6 éq.) de triéthylamine sont ajoutés. Le milieu réactionnel est porté au reflux pendant 1 heure puis 0,532 g (3,53 mmoles, 1,25 éq.) de 2-adamantanone 6 et 0,675 g (2,826 mmole, 1 éq.) de l'ester 5 en solution dans 8 ml de THF sont ajoutés goutte à goutte en 2,5 heures. 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 166.19 (CO); 141.68; 138.25; 133.43; 131.02; 129.86; 128, 51; 61, 23 (-OCH2-); 31.04 (-C (CH3) 3); 14.41 (-CH2CH3) MS (IC / NH3, m / z): 256 [M + NH4] +
273 [M + NH4 + NH3] + d) Preparation of 2 - [(3-tert-butylsulfanyl-phenyl) -ethoxy-methylene] -adamantane 7:
In a glove box under nitrogen, 4.36 g (28.26 mmoles, 10 eq.) Of TiCl3 are placed in a 250 ml flask previously purged with argon. The flask is cooled to 0 ° C. and 35 ml of tetrahydrofuran THF then 14.1 ml (14.1 mmoles, 5 eq.) Of LiAlH4 in 1M solution in ether are added. After 10 minutes of stirring at 0 C, 2.37 ml (16.9 mmol, 6 eq.) Of triethylamine are added. The reaction medium is refluxed for 1 hour then 0.532 g (3.53 mmol, 1.25 eq.) Of 2-adamantanone 6 and 0.675 g (2.826 mmol, 1 eq.) Of ester 5 dissolved in 8 ml of THF are added dropwise over 2.5 hours.
Après une nuit d'agitation au reflux, 200 ml d'éther et 200 ml d'eau sont ajoutés dans le milieu réactionnel. Les deux phases obtenues sont séparées, puis la phase aqueuse est extraite à l'éther (3x200 ml). Les différentes phases organiques sont ensuite rassemblées, séchées sur MgSO, et concentrées sous pression réduite. Le brut ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane/ acétate d'éthyle 98/ 3). On obtient ainsi l'éther d'énol 7(60%) sous forme d'une huile incolore. After stirring overnight at reflux, 200 ml of ether and 200 ml of water are added to the reaction medium. The two phases obtained are separated, then the aqueous phase is extracted with ether (3 × 200 ml). The different organic phases are then combined, dried over MgSO, and concentrated under reduced pressure. The crude thus obtained is purified by chromatography on a silica column (eluent: hexane / ethyl acetate 98/3). This gives the enol ether 7 (60%) in the form of a colorless oil.
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C23H320S = 356 huile incolore rendement : 60% CCM (SiOz) : hexane/ acétate d'éthyle 90/ 10 Rf=0,7 7 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 7, 51 (m, 1H, Harom) ; 7, 44 (m, 1H, Harom); 7,37-7,31 (m, 2H, Harom) ; 3, 47 (q, J=9, 2 Hz, 2H, -OCH2-) ; 3, 29 (m, 1H, Hadam) ; 2, 63 (m, 1H, Hadam); 1,99-1,60 (m, 12H, (Hadam) ; 1, 31 (s, 9H, -C (CH3) 3) ; 1,15 (t, J=9,2 Hz, 3H, -CH2CH3) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 138,53 ; 136,39 ; 135,14 ; 132,31 ; 129,67;129,40; 128,20 ; 128,02 ; 64,74 (-OCH2-) 46,02; 39,32 ; 39,06 ; 37,32 ; 32, 53; 31, 09; 30, 46; 28,48; 15, 19 (-CH2CH3) SM (IC / NH3, m/z) : 357 [M+H]+ e) Préparation du 2-{[3-(2,4-dinitrophé- nylsulfanyl)-phenyl]-ethoxy-methylene}-adamantane 9 :
Après avoir solubilisé 0,949 g (2,66 mmole, 1 éq. ) d'éther d'énol 7 dans 7 ml de THF distillé, 0,625 g (2,66 mmoles, 1 éq. ) de chlorure de 2,4dinitrobenzenesulfényle 8 est ajouté à température C23H320S = 356 colorless oil yield: 60% TLC (SiOz): hexane / ethyl acetate 90/10 Rf = 0.77 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 7.51 (m, 1H, Harom) ; 7.44 (m, 1H, Harom); 7.37-7.31 (m, 2H, Harom); 3.47 (q, J = 9.2Hz, 2H, -OCH2-); 3.29 (m, 1H, Hadam); 2.63 (m, 1H, Hadam); 1.99-1.60 (m, 12H, (Hadam); 1.31 (s, 9H, -C (CH3) 3); 1.15 (t, J = 9.2Hz, 3H, -CH2CH3) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 138.53; 136.39; 135.14; 132.31; 129.67; 129.40; 128.20; 128.02; 64.74 (-OCH2- ) 46.02; 39.32; 39.06; 37.32; 32, 53; 31, 09; 30, 46; 28.48; 15, 19 (-CH2CH3) MS (IC / NH3, m / z) : 357 [M + H] + e) Preparation of 2 - {[3- (2,4-dinitrophenylsulfanyl) -phenyl] -ethoxy-methylene} -adamantane 9:
After having solubilized 0.949 g (2.66 mmol, 1 eq.) Of enol 7 ether in 7 ml of distilled THF, 0.625 g (2.66 mmol, 1 eq.) Of 2,4dinitrobenzenesulfenyl chloride 8 is added at temperature
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ambiante sous atmosphère d'argon. Le milieu réactionnel est alors agité pendant 2 heures puis concentré sous pression réduite. Le brut obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane/ acétate d'éthyle/ triéthylamine 95/ 5/ 0,1). On obtient ainsi le disulfure 9 avec un rendement de 17% sous forme d'une huile jaune.
C25H26N2O5S2 = 498 huile jaune rendement : 17% CCM (SiOz) hexane acétate d'éthyle triéthylamine
95/ 5 / 0,1 Rf=0,25 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 9, 13 (m, 1H, Harom); 8,44 (m, 2H, Harom) ; 7,43 (m, 1H, Harom); 7,39-7,24 (m, 3H, Harom) ; 3,42 (q, J=9, 2 Hz, 2H, -OCH2-); 3, 24 (m, 1H, Hadam); 2,53 (m, 1H, Hadam) ; 1,96-1,70 (m, 12H, Hadam) ; 1,12 (t, J=9, 2 Hz, 3H, Hadam) C25H26N2O5S2 = 498 yellow oil yield: 17% TLC (SiOz) hexane ethyl acetate triethylamine
95/5 / 0.1 Rf = 0.25 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 9.13 (m, 1H, Harom); 8.44 (m, 2H, Harom); 7.43 (m, 1H, Harom); 7.39-7.24 (m, 3H, Harom); 3.42 (q, J = 9.2Hz, 2H, -OCH2-); 3.24 (m, 1H, Hadam); 2.53 (m, 1H, Hadam); 1.96-1.70 (m, 12H, Hadam); 1.12 (t, J = 9.2Hz, 3H, Hadam)
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RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 145,90; 140,84; 137,79; 134,05; 133,47; 129,36; 128,97; 128,69; 127,57; 127,15; 121,65; 65,11; 39,32; 38,99; 37,15 ; 32,50 ; 30,59 ; 28,28 ; 15,20 SM (IC / NH3, m/z) : 499 [M+H]
516 [M+NH4]+ f) Préparation du dioxétanne 1 :
Une solution de 0,0493 ml (0,188 mmole, 1,5 éq. ) de triphénylphosphite dans 1,5 ml de CH2Cl2 est refroidie à -78 C puis de l'ozone est bullé dans le mélange jusqu'à l'obtention d'une coloration bleue. Le milieu réactionnel est ensuite purgé avec de l'argon jusqu'à disparition de la coloration bleue. 0,0625 g (0,126 mmoles, 1 éq. ) du disulfure 9 dans 0,75 ml de CH2Cl2 est alors ajouté à -78 C puis on laisse remonter à température ambiante. Après concentration du milieu réactionnel sous pression réduite, le brut obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane acétate d'éthyle 90 10). On obtient ainsi le dioxétane recherché 1 avec un rendement de 22% sous forme d'une huile jaune. 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 145.90; 140.84; 137.79; 134.05; 133.47; 129.36; 128.97; 128.69; 127.57; 127.15; 121.65; 65.11; 39.32; 38.99; 37.15; 32.50; 30.59; 28.28; 15.20 MS (IC / NH3, m / z): 499 [M + H]
516 [M + NH4] + f) Preparation of dioxetane 1:
A solution of 0.0493 ml (0.188 mmol, 1.5 eq.) Of triphenylphosphite in 1.5 ml of CH2Cl2 is cooled to -78 C then ozone is bubbled through the mixture until obtaining a blue coloration. The reaction medium is then purged with argon until the blue color disappears. 0.0625 g (0.126 mmol, 1 eq.) Of disulfide 9 in 0.75 ml of CH2Cl2 is then added at -78 ° C. and then allowed to return to room temperature. After concentration of the reaction medium under reduced pressure, the crude product obtained is purified by chromatography on a silica column (eluent: hexane ethyl acetate 90 10). The desired dioxetane 1 is thus obtained with a yield of 22% in the form of a yellow oil.
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C25H26N207S2 = 530 huile jaune rendement : 22% CCM (Si02) hexane/ acétate d'éthyle 95 / 5 Rf=0, 2 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 9, 13 (m, 1H, Harem); 8,43 (m, 2H, Harom) ; 8,10-7,4 (m, 2H, Harom); 7,52 (m, 1H, Harom); 7,41 (m, 1H, Harom); 3, 53 (dt, J=9,3 Hz, J=21, 7 Hz, 1H, -OCH2-) ; 3, 15 (dt, J=9,3 Hz, J=21,7 Hz, 1H, -OCH2-); 3,05 (m, 1H, Hadam) 1,92 (m, 1H, Hadam); 1,82-1,50 (m, H, Hadam) ; 1,43-1,38 (m, 1H, Hadam); 1,23 (t, J=9, 3 Hz, 3H, -CH3) ; 1,15-1,11 (m, 1H, Hadam) ; 0, 91-0, 82 (m, 2H, Hadam) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 145,96; 145,27; 137,66; 134,31; 129, 60; 129,32; 128,87; 127,54; 121,89 ; 111,03 ; 95,40 ; 58,51 ; 36,38 ; 34,86 ; 33,33; 33,08; 32,20; 31,91; 31,68; 29,78; 26,06; 25,99; 15,30 C25H26N207S2 = 530 yellow oil yield: 22% TLC (SiO2) hexane / ethyl acetate 95/5 Rf = 0.2 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 9.13 (m, 1H, Harem); 8.43 (m, 2H, Harom); 8.10-7.4 (m, 2H, Harom); 7.52 (m, 1H, Harom); 7.41 (m, 1H, Harom); 3.53 (dt, J = 9.3Hz, J = 21.7Hz, 1H, -OCH2-); 3.15 (dt, J = 9.3Hz, J = 21.7Hz, 1H, -OCH2-); 3.05 (m, 1H, Hadam) 1.92 (m, 1H, Hadam); 1.82-1.50 (m, H, Hadam); 1.43-1.38 (m, 1H, Hadam); 1.23 (t, J = 9.3Hz, 3H, -CH3); 1.15-1.11 (m, 1H, Hadam); 0.91-0.82 (m, 2H, Hadam) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 145.96; 145.27; 137.66; 134.31; 129, 60; 129.32; 128.87; 127.54; 121.89; 111.03; 95.40; 58.51; 36.38; 34.86; 33.33; 33.08; 32.20; 31.91; 31.68; 29.78; 26.06; 25.99; 15.30
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UV : =304 nm (s=9010 éthanol). UV: = 304 nm (s = 9010 ethanol).
Exemple 2 : Synthèse du dioxétanne 10. Example 2: Synthesis of dioxetane 10.
Pour cette synthèse, on suit le schéma réactionnel représenté sur la figure 2. a) Préparation de l'ester méthylique de l'acide 3-(tert-butyl-dimethyl-silanyloxy)-benzoique 12
2,28 g (15 mmoles, 1 éq. ) de (3-hydroxy)benzoate de méthyle 11 et 2,55 g (37,5 mmoles, 2,5 éq.) d'imidazole séché sont dissous succesivement dans 4 ml de DMF anhydre. 2,71 g (18 mmoles, 1,2 éq.) de diméthyl-tert-butyl-chlorosilane TBDMSC1 sont ensuite ajoutés après une dizaine de minutes d'agitation. Après 14 heures d'agitation, 100 ml d'une solution aqueuse de NaHC03 (5%) sont ajoutés dans le milieu. Le tout est extrait au pentane (3x100 ml) puis les phases organiques sont rassemblées, séchées sur MgS04 et concentrées sous pression réduite. Le résidu est chromatographié sur colonne de silice (éluant : pentane/ éther 90 / 10). On obtient ainsi 3,39 g d'une huile incolore.
2.28 g (15 mmoles, 1 eq.) Of methyl (3-hydroxy) benzoate 11 and 2.55 g (37.5 mmoles, 2.5 eq.) Of dried imidazole are dissolved successively in 4 ml of DMF anhydrous. 2.71 g (18 mmol, 1.2 eq.) Of dimethyl-tert-butyl-chlorosilane TBDMSC1 are then added after about ten minutes of stirring. After 14 hours of stirring, 100 ml of an aqueous solution of NaHCO3 (5%) are added to the medium. The whole is extracted with pentane (3x100 ml) then the organic phases are combined, dried over MgSO4 and concentrated under reduced pressure. The residue is chromatographed on a silica column (eluent: pentane / ether 90/10). In this way 3.39 g of a colorless oil is obtained.
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huile incolore rendement : 84% CCM (Si02) pentane/ acétate d'éthyle 99 1 Rf=0,25 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 7, 60 (d, J=8 Hz, 1H, , Harom) ; 7,48 (t, J=2 Hz, 1H, , Harom); 7,25 (t, J=8 Hz, 1H, , Harom) ; 6,99 (dd, J=8 Hz, J=2 Hz, 1H, , Harom) ; 3, 66 (s, 3H, -OCH3) ; 0, 97 (s, 9H, -C (CH3) 3) ; 0, 18 (s, 6H, -SiCH3) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 168,54 ; 155,44 ; 131,28 ; 129,08 ; 124,48; 122,13 ; 120,73 ; 51,73; 25,36; 13,91; -4,6 b) Préparation de [3-(adamantan-2-ylidène- méthoxy-méthyl)-phénoxy]-tert-butyl-diméthyl-silane 14: Dans une boite à gants sous azote, 4,36 g (28,26 mmoles, 10 éq. ) de TiCl3 sont déposés dans un ballon de 250 ml préalablement purgé à l'argon. Le ballon est refroidi à 0 C et 35 ml de THF puis 14,1 ml (14,1 mmoles, 5 éq.) de LiAlH4 en solution 1M dans l'éther sont ajoutés. Après 10 minutes d'agitation à 0 C, 2,37 ml (16,9 mmoles, 6 éq. ) de triéthylamine sont ajoutés. Le milieu réactionnel est porté au refux pendant 1 heure puis 0,532 g (3,53 mmoles, 1,25 éq.) d'adamantanone 13 et 0,752 g (2,826 mmole, 1 éq.) d'ester silylé 12 en solution dans 8 ml de THF sont ajoutés goutte à goutte en 2,5 heures. Après une nuit d'agitation au reflux, 200 ml d'éther et 200 ml d'eau sont ajoutés dans le milieu réactionnel. Les deux phases obtenues sont séparées, puis la phase aqueuse est extraite à l'éther (3x200 ml). Les différentes colorless oil yield: 84% TLC (Si02) pentane / ethyl acetate 99 1 Rf = 0.25 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 7.60 (d, J = 8 Hz, 1H,, Harom) ; 7.48 (t, J = 2Hz, 1H,, Harom); 7.25 (t, J = 8Hz, 1H,, Harom); 6.99 (dd, J = 8Hz, J = 2Hz, 1H,, Harom); 3.66 (s, 3H, -OCH3); 0.97 (s, 9H, -C (CH3) 3); 0.18 (s, 6H, -SiCH3) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 168.54; 155.44; 131.28; 129.08; 124.48; 122.13; 120.73; 51.73; 25.36; 13.91; -4.6 b) Preparation of [3- (adamantan-2-ylidene-methoxy-methyl) -phenoxy] -tert-butyl-dimethyl-silane 14: In a glove box under nitrogen, 4.36 g (28, 26 mmoles, 10 eq.) Of TiCl 3 are placed in a 250 ml flask previously purged with argon. The flask is cooled to 0 ° C. and 35 ml of THF then 14.1 ml (14.1 mmol, 5 eq.) Of LiAlH4 in 1M solution in ether are added. After 10 minutes of stirring at 0 C, 2.37 ml (16.9 mmol, 6 eq.) Of triethylamine are added. The reaction medium is refluxed for 1 hour then 0.532 g (3.53 mmol, 1.25 eq.) Of adamantanone 13 and 0.752 g (2.826 mmol, 1 eq.) Of silyl ester 12 dissolved in 8 ml. of THF are added dropwise over 2.5 hours. After stirring overnight at reflux, 200 ml of ether and 200 ml of water are added to the reaction medium. The two phases obtained are separated, then the aqueous phase is extracted with ether (3 × 200 ml). The different
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phases organiques sont ensuite rassemblées, séchées sur MgS04, et concentrées sous pression réduite. Le brut ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane/ acétate d'éthyle 98/ 3) . On obtient ainsi l'éther d' énol 14 (59%) sous forme d'une huile incolore.
C24H36O2Si = 385 huile incolore rendement : 59% CCM (Si02) hexane/ acétate d'éthyle 95 / 5 Rf=0,4 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 7,09 (m, 1H, , Haro.) ; 6, 81 (m, 1H, , Harom) ; 6,70 (m, 2H, , Harom) ; 3, 20 (s, 3H, -OCH3) ; 3, 14 (m, 1H, Hadam) 2,54 (m, 1H, Hadam); 1,87-1,67 (m, 12H, Hadam) ; 0, 91 (s, 9H, -C(CH3)3); 0,14 (s, 6H, -SiCH3) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 155,45; 143,55; 136,83; 131,17; 129,00; 122,62; 121,16; 119,43 ; 57,60 ; 39,32 ; 39,18 ; 38,99 ; 37,37 ; 32,88 ; 30,49 ; 28,49; 25,80 ; 18,32 ; -4,70 C24H36O2Si = 385 colorless oil yield: 59% TLC (Si02) hexane / ethyl acetate 95/5 Rf = 0.4 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 7.09 (m, 1H,, Haro.) ; 6.81 (m, 1H,, Harom); 6.70 (m, 2H,, Harom); 3.20 (s, 3H, -OCH3); 3.14 (m, 1H, Hadam) 2.54 (m, 1H, Hadam); 1.87-1.67 (m, 12H, Hadam); 0.91 (s, 9H, -C (CH3) 3); 0.14 (s, 6H, -SiCH3) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 155.45; 143.55; 136.83; 131.17; 129.00; 122.62; 121.16; 119.43; 57.60; 39.32; 39.18; 38.99; 37.37; 32.88; 30.49; 28.49; 25.80; 18.32; -4.70
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c) Préparation du 3-(adamantan-2-ylidèneméthoxy-méthyl)-phénol 15 :
Dans un ballon sous agitation magnétique et sous atmosphère d'argon sont placés successivement 150 mg (0,39 mmole, 1 éq. ) de composé 14 dans 2,5 ml de THF anhydre puis goutte à goutte 0,430 ml (0,43 mmole, 1,1 éq. ) de fluorure de tétrabutylammonium 1M dans du THF. Après 15 minutes, le mélange est repris dans un large excès d'éther (100 ml), lavé à l'eau (50 ml), séché sur MgS04, filtré sur Büchner et concentré sous pression réduite. On obtient ainsi l'éther d'énol 15 avec un rendement de 83% sous forme d'une huile incolore.
150 mg (0.39 mmol, 1 eq.) Of compound 14 in 2.5 ml of anhydrous THF are placed successively in a flask with magnetic stirring and under an argon atmosphere, then 0.430 ml (0.43 mmol, drop by drop). 1.1 eq.) Of 1M tetrabutylammonium fluoride in THF. After 15 minutes, the mixture is taken up in a large excess of ether (100 ml), washed with water (50 ml), dried over MgSO4, filtered through Buchner and concentrated under reduced pressure. There is thus obtained the enol ether in 83% yield as a colorless oil.
C18H22O2 = 270 huile incolore rendement : 83% CCM (Si02) : hexane/ acétate d'éthyle/ triéthylamine 90 / 10 / 1 Rf=O,4 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 7, 22 (m, 1H, , Harom); 6, 92 (m, 1H, , Harom); 6,89 (m, 1H, , Harom); 6,83 (m, 1H, , Harom) ; 3, 37 (s, 3H, -OCHJ) 3, 27 (m, 1H, Hadam) 2, 68 (m, 1H, Hadam) ; 1,97-1,79 (m, 12H, Hadam) C18H22O2 = 270 colorless oil yield: 83% TLC (Si02): hexane / ethyl acetate / triethylamine 90/10/1 Rf = 0.4 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 7.22 (m, 1H ,, Harom); 6.92 (m, 1H,, Harom); 6.89 (m, 1H,, Harom); 6.83 (m, 1H,, Harom); 3.37 (s, 3H, -OCHJ) 3.27 (m, 1H, Hadam) 2.68 (m, 1H, Hadam); 1.97-1.79 (m, 12H, Hadam)
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RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 156,09; 142,88; 136,73; 132,75; 129, 29; 121,91; 116,09; 114,90; 57,89;,39,26; 39,13; 37,25; 32,41; 30,46; 28,38 d) Préparation de l'éther d'énol 17 :
Sous atmosphère inerte et à 0 C, 0,316 g (1,34 mmole, 1 éq.) de chlorure de 2,4dinitrobenzènesulfényle 16 est ajouté à une solution contenant 0,365 g (1,34 mmole, 1 éq.) d'éther d'énol 15 et 0,188 ml (1,34 mmole, 1 éq.) de triéthylamine dans 20 ml de CH2Cl2. Le mélange est ensuite agité à 0 C pendant 1 heure. Après ajout de 50 ml d'eau, les deux phases obtenues sont séparées, puis la phase aqueuse est extraite au dichlorométhane (3x75 ml). Les différentes phases organiques sont ensuite rassemblées, séchées sur MgS04, et concentrées sous pression réduite. Le brut ainsi obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane acétate d'éthyle 90 10). Le produit désiré 17 est obtenu avec un rendement de 77% sous forme d'une huile jaune. La cétone correspondant au produit d'hydrolyse de l'éther d'énol est observé comme produit secondaire dans cette réaction. 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 156.09; 142.88; 136.73; 132.75; 129, 29; 121.91; 116.09; 114.90; 57.89;, 39.26; 39.13; 37.25; 32.41; 30.46; 28.38 d) Preparation of the enol 17 ether:
Under an inert atmosphere and at 0 C, 0.316 g (1.34 mmol, 1 eq.) Of 2,4dinitrobenzenesulfenyl chloride 16 is added to a solution containing 0.365 g (1.34 mmol, 1 eq.) Of ether. enol 15 and 0.188 ml (1.34 mmol, 1 eq.) of triethylamine in 20 ml of CH2Cl2. The mixture is then stirred at 0 C for 1 hour. After adding 50 ml of water, the two phases obtained are separated, then the aqueous phase is extracted with dichloromethane (3x75 ml). The different organic phases are then combined, dried over MgSO4, and concentrated under reduced pressure. The crude thus obtained is purified by chromatography on a silica column (eluent: hexane ethyl acetate 90 10). The desired product 17 is obtained with a yield of 77% in the form of a yellow oil. The ketone corresponding to the hydrolysis product of the enol ether is observed as a side product in this reaction.
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C24H24N2O6S = 468 huile jaune rendement : 77% CCM (Si02) hexane acétate d' éthyle 90 10 Rf=0,4 4 RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 9, 15 (d, J=2,9 Hz, 1H, Harom); 8,46 (dd, J=2,9 Hz, J=12,l Hz, 1H, Harom) ; 7,88 (d, J=12,l Hz, 1H, Harom); 7, 35-7, 27 (m , 1H, Harom) ; 7,18-7,09 (m, 3H, Harom) ; 3, 30 (s, 3H, -OCH3) ; 3, 23 (m, 1H, Hadam) ; 2, 60 (m, 1H, Hadam); 1,95-1,73 (m, 12H, Hadam) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 157,52; 153,27; 145,19; 142,65; 139,77; 137,87; 133,21; 129,58 ; 128,25 ; 125,49 ; 124,21 ; 121,01 ; 116,80 ; 115,47 ; 58,05; 39,25; 39,08; 37,16; 32,42; 31,68; 30,41; 28,30 SM (IC / NH3, m/z) : 469 [M+H]+ C24H24N2O6S = 468 yellow oil yield: 77% TLC (Si02) hexane ethyl acetate 90 10 Rf = 0.4 4 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 9.15 (d, J = 2.9 Hz, 1H, Harom); 8.46 (dd, J = 2.9Hz, J = 12.1Hz, 1H, Harom); 7.88 (d, J = 12.1Hz, 1H, Harom); 7.35-7.27 (m, 1H, Harom); 7.18-7.09 (m, 3H, Harom); 3.30 (s, 3H, -OCH3); 3.23 (m, 1H, Hadam); 2.60 (m, 1H, Hadam); 1.95-1.73 (m, 12H, Hadam) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 157.52; 153.27; 145.19; 142.65; 139.77; 137.87; 133.21; 129.58; 128.25; 125.49; 124.21; 121.01; 116.80; 115.47; 58.05; 39.25; 39.08; 37.16; 32.42; 31.68; 30.41; 28.30 MS (IC / NH3, m / z): 469 [M + H] +
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e) Préparation dioxétane 10 :
Une solution de 0,131 ml (0,5 mmole, 1 éq.) de triphénylphosphite dans 8 ml de CHzClz est refroidie à -78 C puis de l'ozone est bullé dans le mélange jusqu'à l'obtention d'une coloration bleue. Le milieu réactionnel est ensuite purgé avec de l'argon jusqu'à disparition de la coloration bleue. 0,234 g ( 0, 5 mmoles, 1 éq. ) de l'éther d' énol 17 dans 4 ml de CH2Cl2 est alors ajouté à -78 C puis on laisse remonter à température ambiante. Après concentration du milieu réactionnel sous pression réduite, le brut obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant : hexane acétate d'éthyle 90 10). On obtient ainsi le dioxétane 10 recherché avec un rendement de 18% sous forme d'une huile jaune.
A solution of 0.131 ml (0.5 mmol, 1 eq.) Of triphenylphosphite in 8 ml of CHzClz is cooled to -78 ° C. then ozone is bubbled through the mixture until a blue color is obtained. The reaction medium is then purged with argon until the blue color disappears. 0.234 g (0.5 mmol, 1 eq.) Of the ether of enol 17 in 4 ml of CH2Cl2 is then added at -78 ° C. and then allowed to return to room temperature. After concentration of the reaction medium under reduced pressure, the crude product obtained is purified by chromatography on a silica column (eluent: hexane ethyl acetate 90 10). The desired dioxetane is thus obtained with a yield of 18% in the form of a yellow oil.
C24H24N2O8S = 500 huile jaune rendement : 18% CCM (Si02) . hexane/ acétate d'éthyle 90/ 10 Rf=0,35 C24H24N2O8S = 500 yellow oil yield: 18% TLC (Si02). hexane / ethyl acetate 90/10 Rf = 0.35
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RMN 1H (CDC13/ TMS, 300 MHz) : 9,15 (d, J=3,l Hz, 1H, Harom); 8, 42 (dd, J=3,l Hz, J=12,l Hz, 1H, Harom); 7,81 (d, J=12,l Hz, 1H, , Harom) ; 7,65-7,20 (m, 2H, Harom) ; 7,43-7,41 (m, 1H, Harom) ; 7,28-7,24 (m, 1H, Harom); 3, 19 (s, 3H, -OCH3) ; 3, 00 (m, 1H, Hadam); 2, 07 (m, 1H, Hadam) : 1,95-1,50 (m, 8H, Hadam); 1,46-1,42 (m, 1H, Hadam) : 1,27-1,22 (m, 1H, Hadam) ; 0,93-0,84 (m, 2H, Hadam) RMN 13C (CDC13/ TMS, 75 MHz) : 157,79; 152,83; 145,27; 139,88; 137,54; 130,03; 128, 27; 123,98 ; 121,08 ; 117,40 ; 111,59 ; 95,52,50,10; 36,54 ; 36,41; 34,83; 33,31; 33,14; 32,37; 31,76; 31,57; 26,04 UV : =320 nm (s=4755 éthanol) SM ( IC / NH3, m/z) : 518 [M+NH4]+ Exemple 3 : dosage d'un thiol. 1H NMR (CDCl3 / TMS, 300 MHz): 9.15 (d, J = 3.1Hz, 1H, Harom); 8.42 (dd, J = 3.1Hz, J = 12.1Hz, 1H, Harom); 7.81 (d, J = 12.1Hz, 1H,, Harom); 7.65-7.20 (m, 2H, Harom); 7.43-7.41 (m, 1H, Harom); 7.28-7.24 (m, 1H, Harom); 3.19 (s, 3H, -OCH3); 3.00 (m, 1H, Hadam); 2.07 (m, 1H, Hadam): 1.95-1.50 (m, 8H, Hadam); 1.46-1.42 (m, 1H, Hadam): 1.27-1.22 (m, 1H, Hadam); 0.93-0.84 (m, 2H, Hadam) 13C NMR (CDCl3 / TMS, 75 MHz): 157.79; 152.83; 145.27; 139.88; 137.54; 130.03; 128, 27; 123.98; 121.08; 117.40; 111.59; 95,52,50,10; 36.54; 36.41; 34.83; 33.31; 33.14; 32.37; 31.76; 31.57; 26.04 UV: = 320 nm (s = 4755 ethanol) MS (IC / NH3, m / z): 518 [M + NH4] + Example 3: assay of a thiol.
Dans cet exemple, on utilise le composé 1 pour doser un thiol constitué par la thiocholine. Pour ce dosage, on utilise la réaction suivante :
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On vérifie tout d'abord que cette réaction a bien lieu en ajoutant 60 l d'une solution éthanolique comprenant 1,2.10 3 mol/1 du dioxétanne 1, à 1,2 ml d'une solution de thiocholine à 5.10 mol/1 dans un tampon phosphate (10-2 M, pH = 7,4). Juste après mélange, on observe très rapidement, en 2 minutes environ, la disparition de la bande à la longueur d' nm correspondant au dioxétanne de départ, et l'apparition simultanée d'une nouvelle bande à une longueur d'onde X = 402 nm. It is first of all checked that this reaction takes place by adding 60 l of an ethanolic solution comprising 1.2.10 3 mol / 1 of dioxetane 1, to 1.2 ml of a solution of thiocholine at 5.10 mol / 1 in a phosphate buffer (10-2 M, pH = 7.4). Immediately after mixing, the disappearance of the band at wavelength = 374 nm corresponding to the starting dioxetane, and the simultaneous appearance of a new band at a wavelength X = 402 nm.
Cela montre bien que le pont disulfure se coupe et que l'on a formation du thiolate dinitré qui absorbe dans le visible. This clearly shows that the disulfide bridge is cut and that there is formation of the dinitrated thiolate which absorbs in the visible.
On a ensuite étudié l'influence du rapport thiocholine/composé 1,2-dioxétanne sur l'absorbance afin de vérifier la réaction. Dans ce cas, on a utilisé 50 l d'une solution de thiocholine ayant une concentration en thiocholine de 4,8.10- à 6.10-5 mol/1 dans un tampon phosphate (10-2 M, pH = 7,4), 25 l de tampon EIA (essai immunoenzymatique) : pH = 7,4 ; K2HP04 0, 08 M ; KH2P04 0, 02 M ; NaCL 0, 15 M ; Sérum albumine bovine 145 pM ; NaN3 1,5 mM, 100 l du produit Sapphire qui est un amplificateur de luminescence commercialisé par Tropix, et 100 l du composé dioxétanne 1 de l'exemple 1 à une concentration de 1,2.10- M dans un mélange d'éthanol et du tampon fourni avec l'amplificateur de luminescence commercialisé par TROPIX (1 : 9 en volume). The influence of the thiocholine / 1,2-dioxetane compound ratio on the absorbance was then studied in order to verify the reaction. In this case, 50 l of a thiocholine solution having a thiocholine concentration of 4.8.10- to 6.10-5 mol / 1 in phosphate buffer (10-2 M, pH = 7.4) were used, 25 l of EIA buffer (enzyme immunoassay): pH = 7.4; 0.08M K2HPO4; 0.02M KH2PO4; 0.15M NaCl; 145 pM bovine serum albumin; 1.5 mM NaN3, 100 l of the Sapphire product which is a luminescence enhancer marketed by Tropix, and 100 l of the dioxetane compound 1 of Example 1 at a concentration of 1.2.10 -M in a mixture of ethanol and buffer supplied with the luminescence amplifier marketed by TROPIX (1: 9 by volume).
Pour chaque concentration de thiocholine, on détermine l'absorbance à 414 nanomètres après une nuit d'agitation à la température ambiante. For each concentration of thiocholine, the absorbance is determined at 414 nanometers after stirring overnight at room temperature.
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La figure 3 illustre les résultats obtenus c'est-à-dire l'absorbance UV du milieu à 414 nm en fonction du rapport thiocholine/composé 1. FIG. 3 illustrates the results obtained, that is to say the UV absorbance of the medium at 414 nm as a function of the thiocholine / compound 1 ratio.
Sur cette figure, on remarque que l'absorbance chute pour devenir quasiment nulle dès que le rapport thiocholine/composé 1 devient inférieur à 1. In this figure, we notice that the absorbance drops to become almost zero as soon as the thiocholine / compound 1 ratio becomes less than 1.
Sur la figure 4, on a représenté les résultats obtenus dans les mêmes conditions, mais en mesurant la lumière émise au lieu de l'absorbance. FIG. 4 shows the results obtained under the same conditions, but by measuring the light emitted instead of the absorbance.
Comme précédemment, immédiatement après l' addition de la thiocholine, on observe une lumière instantanée qui continue à être observée même lorsque le rapport thiocholine/dioxétanne est bien inférieur à 1. As before, immediately after the addition of the thiocholine, instantaneous light is observed which continues to be observed even when the thiocholine / dioxetane ratio is much less than 1.
Ces résultats montrent bien que l'addition du thiol se fait d'abord sur l'atome de soufre directement porté par le noyau moduleur R défini précédemment, le thiolate produit par la rupture du pont disulfure se décompose en produisant de la couleur. La présence de l'amplificateur de luminescence est intéressante car elle permet de minimiser l'extinction directe par le milieu aqueux de cette luminescence. These results clearly show that the addition of the thiol is carried out first of all on the sulfur atom directly carried by the modulator nucleus R defined above, the thiolate produced by the breaking of the disulfide bridge decomposes producing color. The presence of the luminescence amplifier is advantageous because it makes it possible to minimize the direct extinction by the aqueous medium of this luminescence.
Exemple 4 : Dosage de l'acétylcholinestérase au moyen du composé 1. Example 4 Determination of acetylcholinesterase using compound 1.
Dans cet exemple, on réalise le dosage de l'acétylcholinestérase en utilisant le composé 1,2dioxétanne 1 de l'exemple 1, comme substrat luminescent. In this example, the acetylcholinesterase assay is carried out using the 1,2-dioxetane compound 1 of Example 1, as luminescent substrate.
Dans ce but, on ajoute 50 l d'une solution d'acétylthiocholine à une concentration de For this purpose, 50 l of an acetylthiocholine solution is added at a concentration of
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2,5.10 mol/1 dans du tampon phosphate (10 -2 M, pH = 7,4) à 25 l d'acétylcholinestérase dans du tampon EIA. Après 30 minutes de réaction sous agitation à la température ambiante, on ajoute 25 l de tacrine à une concentration de 1,2.10- M dans du tampon phosphate (10-2 M, pH = 7,4), puis 100 l du dioxétanne 1 et 100 l de l'amplificateur de luminescence Sapphire commercialisé par Tropix. La solution de dioxétanne utilisée est formée à partir du mélange de 100 l de solution-mère à 1,2.10' mol/1 de dioxétanne 1 dans l'éthanol absolu avec 900 l de tampon EIA. 2.5.10 mol / 1 in phosphate buffer (10 -2 M, pH = 7.4) to 25 l of acetylcholinesterase in EIA buffer. After 30 minutes of reaction with stirring at room temperature, 25 l of tacrine at a concentration of 1.2.10-M in phosphate buffer (10-2 M, pH = 7.4) are added, then 100 l of dioxetane 1 and 100 l of the Sapphire luminescence enhancer marketed by Tropix. The dioxetane solution used is formed from the mixture of 100 l of stock solution containing 1.2.10 'mol / l of dioxetane 1 in absolute ethanol with 900 l of EIA buffer.
L'addition de tacrine est effectuée pour stopper l'activité de l'acétylcholinestérase avant d'observer la luminescence. The addition of tacrine is carried out to stop the activity of acetylcholinesterase before observing luminescence.
Cette procédure est effectuée pour diverses concentrations en acétylcholinestérase allant de 0,001 à 0,5 unité Ellman/ml. Cette unité Ellman (UE11) est définie comme la quantité d'enzyme produisant un accroissement d'absorbance d'une unité à 414 nm pendant 1 minute, dans un volume de 1 ml de milieu d'Ellman, pour 1 cm de trajet optique à 25 C. This procedure is performed for various acetylcholinesterase concentrations ranging from 0.001 to 0.5 Ellman units / ml. This Ellman unit (UE11) is defined as the amount of enzyme producing a one-unit increase in absorbance at 414 nm for 1 minute, in a volume of 1 ml of Ellman's medium, per 1 cm of optical path at 25 C.
Une UEll/ml correspond à 7,35.10-z unité enzymatique, l'unité enzymatique UE étant défini comme la quantité d'enzyme catalysant l'hydrolyse d'une pmole de substrat pendant 1 minute à 25 C. Une UEll/ml correspond environ à 10-10 mol/1 d'acétylcholinestérase sous forme monomérique. One UE11 / ml corresponds to 7.35.10-z enzymatic unit, the enzymatic unit UE being defined as the quantity of enzyme catalyzing the hydrolysis of a pmole of substrate for 1 minute at 25 C. One UE11 / ml corresponds approximately at 10-10 mol / l of acetylcholinesterase in monomeric form.
Comme dans l'exemple précédent, on observe une flash luminescence pour les différentes concentrations en enzyme. Cette luminescence est quantifiée en regardant la valeur du maximum As in the previous example, a flash luminescence is observed for the different enzyme concentrations. This luminescence is quantified by looking at the value of the maximum
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d'intensité. Les résultats obtenus sont représentés sur la figure 5. intensity. The results obtained are shown in Figure 5.
Sur cette figure, on voit que le dosage présente une très bonne sensibilité, puisque l'on peut détecter par luminescence jusqu'à environ 8.10 UEll/ml d'acétylcholinestérase, soit à peu près la même limite de sensibilité qu'avec le réactif d'Ellman. In this figure, it can be seen that the assay has very good sensitivity, since it is possible to detect by luminescence up to approximately 8.10 UEll / ml of acetylcholinesterase, i.e. roughly the same limit of sensitivity as with the reagent d 'Ellman.
On a observé que l'on peut améliorer la sensibilité du dosage en augmentant la durée de réaction de l'acétylthiocholine avec l'acétylcholinestérase. It has been observed that the sensitivity of the assay can be improved by increasing the reaction time of acetylthiocholine with acetylcholinesterase.
Dans ce but, on a effectué un dosage d'acétylcholinestérase en utilisant 75 l d'une solution à 10 3 mol/1 d'acétylthiocholine dans du tampon phosphate (10-2 M, pH = 7,4), 25 l d'acétylcholinestérase à une concentration correspondant à 8,3.10- UEll/ml dans du tampon EIA, 100 l de la solution de dioxétanne utilisée précédemment et 100 l d'amplificateur de luminescence sapphire. For this purpose, an acetylcholinesterase assay was carried out using 75 l of a 10 3 mol / l solution of acetylthiocholine in phosphate buffer (10-2 M, pH = 7.4), 25 l of acetylcholinesterase at a concentration corresponding to 8.3.10-UEll / ml in EIA buffer, 100 l of the dioxetane solution used previously and 100 l of sapphire luminescence enhancer.
Dans cet essai, on utilise des temps d'incubation différents pour vérifier l'influence du temps de réaction sur le signal luminescent. In this test, different incubation times are used to check the influence of the reaction time on the luminescent signal.
La figure 6 illustre les résultats obtenus. FIG. 6 illustrates the results obtained.
Ainsi, on remarque que la lumière émise après l'ajout du substrat luminescent 1 s'avère proportionnelle au temps d'incubation. Ainsi, en doublant ou triplant le temps de réaction, on double ou triple la quantité de lumière émise. Il est donc possible d'améliorer la sensibilité du dosage en utilisant un temps d'incubation plus long. Thus, it is noted that the light emitted after the addition of the luminescent substrate 1 proves to be proportional to the incubation time. Thus, by doubling or tripling the reaction time, the quantity of light emitted is doubled or tripled. It is therefore possible to improve the sensitivity of the assay by using a longer incubation time.
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