FR2809402A1 - Bibliotheques peptidiques combinatoires convergentes et leur application a la vaccination contre le virus de l'hepatite c - Google Patents
Bibliotheques peptidiques combinatoires convergentes et leur application a la vaccination contre le virus de l'hepatite c Download PDFInfo
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Abstract
L'invention concerne la conception et la synthèse de peptides immunogènes correspondant à des régions restreintes de protéines de virus impliquant une réponse immunitaire à cellules T et à des bibliothèques de peptides combinatoires convergentes dérivées desdites régions.L'invention s'applique notamment au virus de l'hépatite C et à l'élaboration de préparations vaccinales contre celui-ci.
Description
<Desc/Clms Page number 1>
L'invention concerne la conception et la synthèse de mélanges de peptides immunogènes correspondant à des régions restreintes de protéines de virus et notamment du virus de l'Hépatite C (VHC) et leur utilisation pour l'élaboration de préparations vaccinales contre lesdits virus.
Le virus de l'hépatite C a été identifié en 1989 (CHOO Q. L. et al. , Science, 1989,244, 359 - 361) . Il est l'agent étiologique principal des hépatites chroniques non-A, non-B, à transmission parentérale.
L'infection par le VHC évolue vers une pathologie chronique dans 60 à 80 pour cent des cas. La prévalence de ces infections est élevée dans la population générale, de l'ordre de 1 à 2 pour cent dans les pays industrialisés, en particulier en Europe de l'ouest (ALTER H. J. et al., Blood, 1995,85, 1681-1695).
A l'heure actuelle, les traitements antiviraux (interféron, Ribavirine) ne permettent la guérison que de 20 % des patients et surtout aucun vaccin contre le VHC ne protège réellement contre la maladie.
Le VHC fait partie des virus de la famille des Flaviviridae ayant un génome à ARN codant une polyprotéine unique qui est clivée en plusieurs sous-fragments : une protéine de capside, deux glycoprotéines El et E2 et 6 protéines dites non-structurales NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B. Ces protéines virales représentent des cibles antigéniques pour la réponse immunitaire : les protéines d'enveloppe El et E2 constituent des cibles pour les anticorps neutralisants et les protéines non-structurales sont capables d'induire une réponse effectrice cytotoxique.
Toutefois, des mutations surviennent au sein du génome du VHC avec une fréquence élevée et génèrent de nombreuses quasi-espèces facilitant l'échappement du virus face aux défenses antivirales de l'hôte (WEINER A.J., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 1992,92,2755).
Les mécanismes immunitaires responsables de l'élimination du VHC ne sont pas encore clairement établis.
L'observation des groupes de patients, environ 20 %,
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capables d'éliminer le virus spontanément après une phase d'infection aiguë a permis de mettre en évidence une forte corrélation entre une évolution vers la guérison et une forte prolifération des lymphocytes CD4 spécifiques d'antigènes viraux, notamment de la protéine de capside et des protéines NS3 et NS4 (DIEPOLDER H.M,. Lancet, 1995, 346:1006). Une réponse de type TH1 semble être le support de cette immunité, probablement en contrôlant la réponse cytotoxique médiée par les cellules CD8 ou en sécrétant directement différents facteurs antiviraux. Cette réponse doit néanmoins se maintenir pour permettre un contrôle à plus long terme du virus (GERLACH J. T. et al., Gastroenterology, 1999,117:933).
Des peptides synthétiques issus des protéines de capside et des protéines NS3 et NS4 ont montré leur capacité à induire une réponse de type T helper (DIEPOLDER, J.
Virol., 1997, 71:6011). L'induction et le maintien de la réponse CD4 par l'utilisation d'épitopes peptidiques issus de ces protéines d'intérêt représentent une stratégie prometteuse pour l'induction d'une immunité protectrice contre le VHC. Toutefois, les peptides sont généralement faiblement immunogènes et surtout sont rarement capables d'induire une réponse immunitaire de manière indépendante de la restriction liée aux molécules polymorphes du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH).
C'est pourquoi les Demanderesses se sont fixé pour but de sélectionner des peptides d'intérêt, présentant des propriétés d'épitopes T, semblables à ceux qui ont déjà été décrits, et d'en augmenter le pouvoir immunogène par modification de leur séquence native, à des positions définies, dans le double but d'augmenter leur ancrage aux molécules du CMH et d'élargir leur reconnaissance par les récepteurs des cellules T.
Ainsi, pour chaque peptide d'intérêt, on crée une bibliothèque combinatoire de peptides dans laquelle coexistent, à chacune des positions choisies (qui seront définies plus loin), l'acide aminé natif et l'acide aminé de
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remplacement choisi pour créer une dégénérescence artificielle du peptide sélectionné.
Les mélanges de peptides ainsi créés possèdent la même spécificité antigénique que le peptide natif. Ces mélanges de peptides sont donc considérés comme "convergents" et seront appelés, ci-après, "convertopes".
La présente invention concerne donc le procédé de préparation desdits mélanges de peptides immunogènes.
La première étape du procédé concerne la stratégie de sélection des séquences potentiellement capables d'induire l'activation de cellules CD4. La sélection porte sur des régions de la protéine de capside et des protéines NS3 et NS4 du VHC ; ces régions sont choisies pour leur densité importante en motifs d'ancrage pour les molécules du CMH de classe II humaines.
Les molécules du CMH de classe II ont pour rôle de présenter les antigènes dégradés sous forme de peptides aux cellules T CD4. La présentation de ces antigènes dégradés ou épitopes T aux lymphocytes T par les molécules du CMH de classe II est une condition nécessaire à l'induction d'une réponse immune.
Les molécules du CMH sont des protéines polymorphiques, codées par de nombreux allèles dont chacun possède des caractéristiques spécifiques d'interaction avec les épitopes T. Les études cristallographiques de plusieurs molécules du CMH de classe II humaines ont notamment permis la mise en évidence des modalités d'interaction spécifique avec les épitopes T.
Plusieurs critères sont importants : d'une part, la longueur des peptides doit être supérieure à 11 résidus pour permettre une interaction efficace ; d'autre part, certains résidus du peptide antigénique jouent un rôle spécifique dans l'interaction en interagissant avec des microenvironnements ou poches d'ancrage de la molécule du CMH.
Il existe quatre poches d'ancrage qui jouent un rôle dominant dans la reconnaissance, appelées P1, P4, P6, P9, et ce quel que soit l'allèle de CMH. Ces poches d'ancrage sont
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indépendantes les unes des autres et possèdent des caractéristiques physico-chimiques particulières qui permettent l'ancrage spécifique de chaînes latérales du peptide.
Les résidus polymorphiques des molécules du CMH sont principalement regroupés au niveau des poches d'ancrage et influencent donc les caractéristiques particulières d'interaction des antigènes peptidiques.
Les caractéristiques des poches d'ancrage de ces allèles majeurs ont été identifiées par STURNIOLO (STURNIOLO T., Nature Biotech., 1999,17:555).
Les Demanderesses en ont déduit des critères communs à la majorité des allèles de CMH de classe II qui sont applicables à la recherche prédictive des poches d'ancrage, au sein de séquences protéiques natives.
Ainsi, dans un motif de 9 acides aminés adjacents, l'acide aminé occupant la position P1 est nécessairement hydrophobe et est un acide aminé aliphatique ou aromatique, soit V, I, L, F, M, W ou Y ; acides aminés occupant les positions P4, P6 et P9 sont, de préférence, respectivement I, V, L, M, F ou A ; A, P, G, S ou T ; etA, I, V, Y, L, F ou M.
Ces critères ont été appliqués, de manière prédictive non expérimentale, à l'identification des séquences d'intérêt au sein des protéines de capside et NS3 et NS4 dont les séquences sont disponibles dans la banque de données SWISS PROT (dont la référence est annexée au listage des séquences).
Plusieurs motifs d'ancrage potentiels ont été identifiés, qui ne diffèrent que par 1 ou 2 acides aminés des critères définis plus haut.
Les portions de séquences protéiques qui présentent une densité importante de ces motifs d'ancrage ont été identifiées et sélectionnées. Les séquences peptidiques retenues ont une longueur comprise entre 19 et 36 résidus.
Elles comprennent au moins 1 à 2 résidus en amont du premier motif d'ancrage et en aval du dernier motif d'ancrage. Ces
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extrémités peuvent être étendues de 1 à 6 acides aminés naturels additionnels afin d'inclure dans la séquence des acides aminés chargés, pouvant faciliter la solubilité de séquences trop riches en résidus hydrophobes.
Au total, un ensemble de 26 séquences ont été ainsi choisies. Elles sont présentées en annexe dans la rubrique "listage des séquences". Les séquences ID n 1 à 8 sont des régions de la protéine de capside, les séquences ID n 9 à 21 sont des régions de la protéine NS3 et les séquences ID n 22 à 26 sont des régions de la protéine NS4.
Les séquences d'intérêt étant identifiées, la deuxième étape du procédé selon l'invention consiste à concevoir, à partir de ces séquences, des bibliothèques peptidiques combinatoires convergentes (dénommées convertopes).
Le choix des substitutions d'acides aminés destinées à créer la bibliothèque combinatoire est basé sur les caractéristiques moléculaires de reconnaissance des antigènes par les récepteurs immunitaires, en particulier par les molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH) et par les récepteurs des lymphocytes T, et, plus particulièrement, sur la notion de dégénérescence de ces mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire (voir notamment Hemmer et al. Immunol. Today 1998,19, 163- 168 "Probing degeneracy in T-cell récognition using peptide combinatorial libraries").
La dégénérescence recherchée, selon la présente invention, est une dégénérescence non naturelle qui se distingue de la dégénérescence dite naturelle qui est élaborée sur la base des mutations existantes, présentes dans les séquences d'antigènes de différents variants naturels des virus (GRAS-MASSE H., Pept. Res., 1992,5:211- 216). Ce concept de dégénérescence non naturelle pour le développement de mélanges de peptides convergents a été initialement proposé par GRAS-MASSE H. (GRAS-MASSE H., Curr.
Opin. in Immunol., 1999,11:223-228).
L'utilisation desdits mélanges a notamment pour but de
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stimuler une réponse immunitaire plus large, qui permettra une reconnaissance ultérieure de peptides apparentés mais différents du peptide natif et qui pourraient se rencontrer dans des variants naturels du virus.
Dans le procédé selon l'invention, un premier type de dégénérescence est créé dans le but d'augmenter la capacité d'ancrage des épitopes aux molécules du CMH.
Dans les motifs d'ancrage identifiés,on vérifie que les résidus P4, P6 et P9 de la séquence native répondent aux critères communs définis plus haut d'après l'étude de Sturniolo. Si l'acide aminé ne répond pas à ces critères, on envisage sa substitution par un acide aminé plus conforme, et notamment par une alanine.
Un second type de dégénérescence peut être créé dans le but d'augmenter la reconnaissance des épitopes par les récepteurs des cellules T ; ne concerne que les positions qui n'interviennent pas dans l'ancrage aux molécules du CMH, c'est-à-dire les résidus autres que 1,4, 6 et 9. Les substitutions envisagées ici sont basées sur une matrice de remplaçabilité élaborée par Geysen (J. Mol. Recog. 1988, 1,32) qui tient compte de la dégénérescence importante de la reconnaissance des antigènes par les récepteurs T. Toutes les positions peuvent donner lieu à une substitution, à l'exclusion de résidus communs à 2 ou plusieurs motifs d'ancrage voisins et dont la substitution serait incompatible avec le motif voisin ou avec une substitution déjà réalisée dans celui-ci.
Dans les 26 séquences sélectionnées comme épitopes T potentiels, les substitutions retenues conformément aux critères décrits plus haut aboutissent aux 26 convertopes présentés dans le tableau I ci-après et les séquences ID n 27 à 52 et dont la conception sera explicitée dans l'exemple 1 et les figures 1 à 26. Il convient de préciser que chaque convertope comprend le peptide de séquence native et tous les peptides dont la séquence est totalement ou partiellement substituée, aux positions indiquées.
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TABLEAU I CONVERTOPE
Q D V K F P G G G Q I VGGVYLLPRRGPRLGVRA 20-48 R A S A S A A A A A A A A A
27-53 G Q 1 V S G A G V Y L L A P A R A R G A P A 8 L A G V A R A S T K R R K A T S A AAA AA AIAS KRA 35-60 Y L L P R R G P R L G V R A T R K T S E R S Q P R G A A A K A A S A K A A A A
68-86 A R R P E G R T W A S N Q A P S G A Y A P W A P L Y S N A S A A A P L Y G N E G C G W A G W L L S P R G S R 84-104 S A A A S S A A A A S A A
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TABLEAU I (suite)
CONVERTOPE MRSPVFTDNSSPPVVPQSFQVAHLH H
1205-1229 S A A A A A A A A A A A Y A A Q G Y K V L V L N P S V A A T L G F G A Y M S K
1242-1268 S S A S R A A A A # A
R T 1 T T G S P 1 T Y S T Y G K F L A D G G
1282-1304 S S A A S A S A S A #
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T G L T H i DA H F L S Q T K Q S G E N F P Y L V A YQAT V A 1563-1595 S E A A A A A A A A A 1 F S S Q H L P Y EQGMMLAEQFKQKALGLLTA 1712-1739 A D A A A A A A A A S
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La synthèse des peptides est effectuée en deux temps : d'une part la synthèse du peptide de séquence native, d'autre part la synthèse du convertope. Ces synthèses sont effectuées en synthétiseur automatique conventionnel.
L'ensemble des peptides constituant un convertope est obtenu en une seule synthèse au cours de laquelle, pour chaque cycle correspondant à une position pouvant être substituée, on utilise un mélange de l'acide aminé natif et de l'acide aminé de substitution, dont les concentrations sont ajustées pour réaliser un rapport équimolaire dans le peptide synthétisé.
Le procédé selon l'invention a été développé pour le virus de l'Hépatite C et plus particulièrement pour la protéine de capside et les protéines NS3 et NS4 de ce virus.
Il est bien évident que le même procédé de préparation de peptides immunogènes comprenant des régions restreintes de protéines virales choisies et des bibliothèques de peptides combinatoires convergentes est applicable à tout virus impliquant une réponse immunitaire à cellules T.
Ainsi, de manière synthétique, ce procédé comprend : -a) l'identification de séquences d'acides aminés constituant des épitopes T potentiels, par recherche prédictive non expérimentale - de motifs d'ancrage pour les molécules de CMH de classe II, à partir des séquences natives des protéines du virus - et de zones, qui présentent une densité importante desdits motifs d'ancrage ; -b) la conception de bibliothèques de peptides combinatoires convergentes (dénommées convertopes), dérivées des séquences d'épitopes identifiées en a), par substitution dirigée d'acides aminés à des positions choisies, pour induire une dégénérescence non naturelle de chacun des épitopes, - d'une part, afin d'augmenter la capacité d'ancrage de l'épitope aux molécules de CMH de classe II
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- et d'autre part, afin d'élargir le répertoire de reconnaissance de l'épitope par le récepteur des cellules T ; -c) la synthèse, - d'une part, de peptides de séquence native choisis parmi les peptides tels qu'identifiés en a) - et d'autre part, des convertopes correspondants tels que définis en b).
La recherche des motifs d'ancrage est effectuée par application des critères suivants qui sont communs à la majorité des allèles de CMH de classe II : - dans un motif de 9 acides aminés adjacents, l'acide aminé occupant la position P1 est nécessairement hydrophobe et est un acide aminé aliphatique ou aromatique, soit V, I, L, F, M, W ou Y ; - les acides aminés occupant les positions P4, P6 et P9, sont de préférence, respectivement, I, V, L, M, F ou A ; A, P, G, S ou T ; etA, I, V, Y, L, F ou M.
La conception des convertopes comprend la substitution, dans chaque motif d'ancrage identifié, d'un ou plusieurs des résidus P4, P6 ou P9 s'ils ne répondent pas aux critères communs tels que définis plus haut, par un acide aminé plus conforme, et, de préférence par une alanine.
La conception des convertopes peut, en outre, comprendre la substitution d'un ou plusieurs résidus autres que 1,4, 6 ou 9, selon une matrice de remplaçabilité favorisant la reconnaissance de l'épitope par le récepteur des cellules T, à l'exclusion de résidus communs à 2 ou plusieurs motifs d'ancrage voisins et dont la substitution serait incompatible avec le motif voisin ou avec une substitution déjà réalisée dans celui-ci.
Les mélanges de peptides immunogènes obtenus par le procédé selon l'invention sont principalement destinés à la vaccination contre les virus dont ces peptides dérivent.
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Plus particulièrement, la présente invention concerne une composition destinée à la vaccination contre le virus de l'Hépatite C. Cette composition comprend des couples de séquences natives et de séquences dégénérées obtenus par le procédé de l'invention et choisis parmi les convertopes présentés dans le tableau I.
La composition vaccinale peut trouver des applications non seulement prophylactiques mais également thérapeutiques pour stimuler les réactions immunitaires de patients déjà infectés.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemple 1 :
Conception des convertopes.
Conception des convertopes.
Les données bibliographiques ont conduit à retenir, comme protéines potentiellement intéressantes pour préparer des peptides immunogènes constituant des épitopes T potentiels, la protéine de capside et les protéines NS3 et NS4 du virus de l'hépatite C.
Les séquences de ces protéines sont disposibles sur la banque de données SWISS-PROT.
Le procédé d'identification des épitopes T potentiels et de conception, à partir de ceux-ci, de bibliothèques peptidiques convergentes ou "convertopes" comprend les étapes suivantes : - Première étape.
Des motifs d'ancrage potentiels sont identifiés sur la base des règles communes à la majorité des allèles des molécules de CMH de la classe II humaines HLA-DR, c'est-àdire un acide aminé aliphatique ou aromatique (V,I,L,F,M,W,Y) en première position d'une portion de 9 résidus, capable d'interagir avec la poche P1. Concernant les allèles HLA-DR, cette poche P1 est peu polymorphe
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(présence d'un simple dimorphisme val/gly en position 86 de la chaîne ss) et représente une règle de reconnaissance partagée par tous les allèles. De plus, la présence d'un résidu hydrophobe, aliphatique ou aromatique en position P1 semble une condition essentielle à l'interaction avec la poche d'ancrage correspondante, cet ancrage jouant un rôle dominant dans l'interaction du peptide antigénique avec la molécule de CMH en permettant notamment la formation d'un complexe stable.
L'identification des résidus acides aminés impliqués potentiellement dans l'ancrage au niveau des poches d'ancrage P4, P6, P9 découle mathématiquement de la première position. Pour chaque position d'ancrage, un consensus a été défini, à partir de l'analyse des résultats de STURNIOLO T.
(Nature Biotech., 1999, 17:555), par recherche des acides aminés majeurs pouvant interagir avec le plus grand nombre d'allèles différents. Le tableau suivant représente les spécificités des quatre poches P1, P4, P6 et P9 des molécules du CMH de classe II HLA-DR.
TABLEAU II
Motif d'ancrage consensus pour les molécules de CMH de classe II PI P4 P6 P9 YFMIVLWM IVLMFA APGST AIVYLFM
Les portions de séquences des protéines de capside ) et NS3 et NS4 qui présentent une densité importante de ces motifs d'ancrage ont été identifiées et sélectionnées. Elles comprennent 1 ou 2 acides aminés en amont du premier motif d'ancrage et en aval du dernier. Ces extrémités peuvent être étendues de 1 à 6 acides aminés naturels additionnels afin ; d'inclure, dans la séquence, des acides aminés chargés pouvant faciliter la solubilité de séquences trop riches en résidus hydrophobes.
Motif d'ancrage consensus pour les molécules de CMH de classe II PI P4 P6 P9 YFMIVLWM IVLMFA APGST AIVYLFM
Les portions de séquences des protéines de capside ) et NS3 et NS4 qui présentent une densité importante de ces motifs d'ancrage ont été identifiées et sélectionnées. Elles comprennent 1 ou 2 acides aminés en amont du premier motif d'ancrage et en aval du dernier. Ces extrémités peuvent être étendues de 1 à 6 acides aminés naturels additionnels afin ; d'inclure, dans la séquence, des acides aminés chargés pouvant faciliter la solubilité de séquences trop riches en résidus hydrophobes.
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Au total, 26 séquences ont été ainsi choisies : dans la protéine de capside, les séquences ID n 1 à 8 ; dans la protéine NS3 , les séquences ID n 9 à 21 ; dans la protéinne NS4, les séquences ID n 22 à 26.
- Deuxième étape.
Les motifs d'ancrage potentiels obtenus ont été comparés au motif d'ancrage consensus pour le CMH de classe II défini plus haut.
Si l'acide aminé natif ne répond pas aux conditions énoncées dans le tableau II, une alanine est introduite systématiquement aux positions P4, P6, P9. En effet, une alanine est capable de remplacer les acides aminés intervenant dans l'ancrage aux molécules de CMH de classe II (Fleckenstein B. et al, Eur. J. Bioch. 1996.240:71, Sturniolo et al., Nature Biotech 1999,17:555), en permettant de lever l'influence négative d'une chaîne latérale et d'améliorer ainsi l'association aux molécules de CMH sans altérer la reconnaissance par les cellules T (Ahlers et al, Proc Natl Acad Sci USA. 1997. 94:10856).
Toutefois, si l'acide aminé natif est impliqué dans une position d'ancrage P1 d'un motif d'ancrage voisin chevauchant, la substitution n'est pas envisagée.
- Troisième étape -
Pour les acides aminés n'intervenant pas dans l'ancrage potentiel aux molécules du CMH de classe II et susceptibles d'être impliqués dans l'interaction avec le récepteur spécifique des cellules T, c'est-à-dire les positions P2, P3, P5, P7 et P8, une substitution de ces positions peut être effectuée, dédiée à la reconnaissance spécifique par les cellules T. Ces substitutions ont pour but de générer des variants apparentés aux peptides natifs capables de générer un élargissement du nombre de cellules T spécifiques de l'antigène natif. Cet élargissement est
Pour les acides aminés n'intervenant pas dans l'ancrage potentiel aux molécules du CMH de classe II et susceptibles d'être impliqués dans l'interaction avec le récepteur spécifique des cellules T, c'est-à-dire les positions P2, P3, P5, P7 et P8, une substitution de ces positions peut être effectuée, dédiée à la reconnaissance spécifique par les cellules T. Ces substitutions ont pour but de générer des variants apparentés aux peptides natifs capables de générer un élargissement du nombre de cellules T spécifiques de l'antigène natif. Cet élargissement est
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envisagé compte-tenu de la dégénérescence importante de la reconnaissance T (Hemmer, B. , Immunol . Today 1998 19:163).
En effet, une cellule T clonale a la capacité de reconnaître un très grand nombre d'antigènes peptidiques apparentés mais également non apparentés à la séquence native avec, dans certains cas, une meilleure affinité.
Les substitutions réalisées sont basées sur une matrice de remplaçabilité de type Geysen (Geysen M.et al, J. Mol. Recog 1998.1, 32-41). Cette matrice de remplaçabilité a été élaborée sur la base de la reconnaissance peptide/anticorps, qui est apparentée au mode de reconnaissance du récepteur des cellules T. Les acides aminés en position P2, P3, P5, P7 et P8 peuvent être substitués sauf s'ils sont impliqués dans une position d'ancrage au niveau d'un motif voisin. Compte-tenu des diverses possibilités de remplacement suggérées par la matrice de Geysen, les substitutions privilégieront l'acide aminé ayant l'un des meilleurs index de remplaçabilité.
La conception des convertopes est schématisée dans les figures 1 à 26.
Légende des figures 1 à 26
La séquence native d'intérêt est présentée sur la partie supérieure de la figure.
La séquence native d'intérêt est présentée sur la partie supérieure de la figure.
Les acides aminés impliqués dans l'interaction potentielle avec une poche d'ancrage sont représentés par un #.
Les points d'ancrage CMH P1, P4, P6 et P9 sont associés au sein d'un motif d'ancrage selon un mode de représentation en diagonale.
Les substitutions d'acides aminés naturels, selon la méthode rationnelle développée dans la description, sont indiquées en indice.
Les acides aminés substitués pour améliorer la
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reconnaissance par le récepteur des cellules T (TCR) sont également présentés.
L'addition des deux approches de substitutions (CMH et TCR) est récapitulée sur la partie inférieure encadrée de la figure.
Exemple 2 A) Préparation des peptides.
Les peptides sont synthétisés en utilisant la stratégie en phase solide conventionnelle du type Boc-benzyle (ou Fmoc), dans un synthétiseur automatisé de peptides (modèle 430A, APPLIED BIOSYSTEM, INC.). Les groupes de protection des chaînes latérales sont les suivants : Asn(Trt), Gln (Trt), Asp(Ochx), Glu(Ochx), Ser (Bzl), Thr(Bzl), Cys(4-MeBzl), et His(Dnp) (SHEPPARD R.C. et al., Peptide Synthesis Comp. Org. Chem., 1979,5:321). Les acides aminés sont introduits en utilisant le protocole d'activation HBTU/HOBt avec un double couplage systématique sur une résine Boc-X-Pam (X représentant l'acide aminé en position C-terminale). Après thiolyse du groupe dinitrophényl Dnp, suivie par une déprotection finale et un clivage à l'acide fluorhydrique, le peptide clivé et déprotégé est précipité avec du diéthyléther froid, puis dissous dans de l'acide acétique 5 % et lyophilisé. Le peptide est purifié à plus de 90 % sur une colonne de 5 mm x 250 mm, 100a Nucleosyl C18 RP-HPLC préparative (MACHERY NAGEL, Düren, Allemagne). L'homogénéité est confirmée par HPLC analytique sur une colonne Vydac éluée avec un système de solvants (acide trifluoroacétique-acétonitrile-eau).
L'identité du peptide est confirmée par la détermination de la composition en acides aminés et par spectrométrie de masse enregistrée sur un spectromètre de masse Bio Ion 20 plasma (BIO ION AB, Uppsala, Suède).
B) Préparation des convertopes.
La synthèse s'effectue selon la méthode décrite précédemment à la différence des positions dégénérées où des
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quantités équimolaires d'acides aminés protégés sont utilisées dans les réactions de couplage à la place d'un seul acide aminé pour une synthèse classique. Pour compenser les différences cinétiques dans les réactivités des différents acides aminés, un premier couplage est réalisé avec 1 mmol (quantité totale) de Boc-amino-acide (ou d'un mélange). Un deuxième couplage utilisant 2 mmol (quantité totale) est alors systématiquement réalisé. Après clivage, le peptide brut est dissous dans de l'acide trifluoroacétique et précipité dans une solution de diéthyléther froid. Après centrifugation, le précipité est dissous dans l'eau puis purifié par gel filtration sur une colonne TSK HW40S (MERK, Darmstadt, Allemagne). Un aliquot est soumis à une hydrolyse acide pour la détermination de la composition en acides aminés.
Exemple 3 Évaluation de l'immunogénicité des mélanges
Les séquences des peptides natifs et des convertopes qui en dérivent ont été présentées dans le listage des séquences et dans le Tableau II. Ces produits et diverses combinaisons de ceux-ci seront utilisés en tant qu'antigènes pour les immunisations.
Les séquences des peptides natifs et des convertopes qui en dérivent ont été présentées dans le listage des séquences et dans le Tableau II. Ces produits et diverses combinaisons de ceux-ci seront utilisés en tant qu'antigènes pour les immunisations.
L'évaluation de l'immunogénicité des peptides et convertopes est réalisée selon deux approches complémentaires : d'une part, par immunisation in vivo de souris humanisées ; d'autre part, par immunisation in vitro de cellules humaines de donneurs HLA typés.
A) Des souris déficientes pour les molécules du CMH de classe II murines (APO) et transgéniques pour différentes molécules du CMH de classe II humaines (DR1, DR2, DR3, DQ6, DQ8) sont immunisées avec les mélanges de peptides choisis à raison de trois souris par condition. Les souris sont immunisées avec 100 microgrammes de peptides dans un volume de 100 microlitres d'un mélange eau/adjuvant complet de Freund par voie sous-cutanée. Les souris sont restimulées
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une ou deux fois à 15 jours d'intervalle avec 50 microgrammes de peptides dans 100 microlitres de mélange eau/adjuvant incomplet de Freund. Un échantillon de sera des souris immunisées est récupéré avant chaque injection afin d'évaluer la production d'anticorps spécifiques ainsi que la production de cytokines in vivo. Une semaine après la dernière injection, les ganglions ainsi que les rates des différents groupes d'animaux sont recueillis, mélangés par groupe, puis mis en culture pour étudier la capacité à induire la prolifération cellulaire in vitro et la capacité à induire la production de cytokines de type TH1 ou TH2 in vitro, afin d'identifier les peptides et les convertopes ayant la meilleure immunogénicité.
B) Les immunisations in vitro sont réalisées de la manière suivante : des monocytes sanguins CD14+ isolés par sélection positive sont différenciés en cellules dendritiques après mise en présence d'IL4 et de GM-CSF pendant 5 jours. Les cellules CD4+ isolées à partir du même donneur sont ensuite immunisées in vitro par les différents mélanges de peptides et convertopes. Une restimulation ultérieure est réalisée dans les mêmes conditions puis les lymphocytes B du même donneur sont utilisés en tant que cellules présentatrices d'antigènes. La production de différentes cytokines est recherchée dans les surnageants de culture, 24 et 48 heures après immunisation in vitro.
Claims (7)
1.- Procédé de préparation de peptides immunogènes correspondant à des régions restreintes de protéines de virus impliquant une réponse immunitaire à cellules T et à des bibliothèques de peptides combinatoires convergentes dérivées desdites régions, caractérisé en ce qu'il comprend : -a) l'identification de séquences d'acides aminés constituant des épitopes T potentiels, par recherche prédictive non expérimentale - de motifs d'ancrage pour les molécules de CMH de classe II, à partir des séquences natives des protéines du virus - et de zones, qui présentent une densité importante desdits motifs d'ancrage ; -b) la conception de bibliothèques de peptides combinatoires convergentes (dénommées convertopes), dérivées des séquences d'épitopes identifiées en a), par substitution dirigée d'acides aminés à des positions choisies, pour induire une dégénérescence non naturelle de chacun des épitopes, - d'une part, afin d'augmenter la capacité d'ancrage de l'épitope aux molécules de CMH de classe II - et d'autre part, afin d'élargir le répertoire de reconnaissance de l'épitope par le récepteur des cellules T ; -c) la synthèse, - d'une part, de peptides de séquence native choisis parmi les peptides tels qu'identifiés en a) - et d'autre part, des convertopes correspondants tels que définis en b).
2. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la recherche des motifs d'ancrage est effectuée par application des critères suivants qui sont communs à la majorité des allèles de CMH de classe II : - dans un motif de 9 acides aminés adjacents, l'acide aminé occupant la position P1 est nécessairement hydrophobe et est un acide aminé aliphatique ou aromatique, soit V, I, L, F,
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M, W ou Y ; - les acides aminés occupant les positions P4, ?6 et Pg, sont de préférence, respectivement, I, V, L, M, F ou A ; A, P, G, S ou T ; etA, I, V, Y, L, F ou M.
3. - Procédé selon la revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la conception des convertopes comprend la substitution, dans chaque motif d'ancrage identifié, d'un ou plusieurs des résidus P4, P6 ou Pg s'ils ne répondent pas aux critères communs tels que définis dans la revendication 2, par un acide aminé plus conforme, et, de préférence par une alanine.
4.- Procédé selon la revendication 1 ou 3, caractérisé en ce qu'il comprend, en outre, la substitution d'un ou plusieurs résidus autres que 1,4, 6 ou 9, selon une matrice de remplaçabilité favorisant la reconnaissance de l'épitope par le récepteur des cellules T, à l'exclusion de résidus communs à 2 ou plusieurs motifs d'ancrage voisins et dont la substitution serait incompatible avec le motif voisin ou avec une substitution déjà réalisée dans celui-ci.
5. - Procédé selon l'une quelconque des revendication 1 à 4, caractérisé en ce que chaque convertope est obtenu en une seule synthèse, au cours de laquelle pour chaque cycle correspondant à une position pouvant être substituée, on utilise un mélange de l'acide aminé natif et de l'acide aminé de substitution, ajusté pour réaliser un rapport équimolaire dans le peptide synthétisé.
6. - Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les protéines du virus sont la protéine de capside et les protéines NS3 et NS4 du virus de l'Hépatite C (VHC).
7. - Ensemble de séquences d'épitopes potentiels identifiés par le procédé selon la revendication la) comprenant les séquences ID n 1 à 8 de la protéine de capside, les séquences ID n 9 à 21 de la protéine NS3 et les séquence ID n 22 à 26 de la protéine NS4 du VHC.
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