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HK1048484B - 中性脂质聚合物以及含中性脂质聚合物的脂质体组合物 - Google Patents

中性脂质聚合物以及含中性脂质聚合物的脂质体组合物 Download PDF

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HK1048484B
HK1048484B HK03100630.3A HK03100630A HK1048484B HK 1048484 B HK1048484 B HK 1048484B HK 03100630 A HK03100630 A HK 03100630A HK 1048484 B HK1048484 B HK 1048484B
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alkyl
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S‧扎里普斯基
S‧扎裡普斯基
Original Assignee
阿尔萨公司
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Description

中性脂质聚合物以及含 中性脂质聚合物的脂质体组合物
                       发明领域
本发明涉及PEG取代的中性脂质聚合物及其在延长脂质体在血液中的循环时间方面的应用。含这些脂质聚合物的脂质体与加有常规带负电的PEG取代的磷脂的脂质体相比较，它们具有相似的在血液的循环的循环时间。
                   相互参照的相关申请
美国临时专利申请60/143810(1999年7月14日向美国专利和商标局提出申请)题为“中性脂质聚合物与含中性脂质聚合物的脂质体组合物”中公开的全部内容已列入本文。这些申请是共同拥有的。
                       发明背景
脂质体可用于各种治疗目的，具体地说，通过治疗剂中的脂质体制剂系统地给药将治疗剂携带至目标细胞。有利的是，脂质体--药物制剂为改进包括例如药物受控释放在内的药物释放性能提供了可能性。为了使脂质体达到目标区域、目标细胞或目标位置，常常需要延长循环时间。特别是对于那些不是靠近注射位置的目标区域、目标细胞或目标位置来说，需要有长的循环时间。例如当脂质体按系统地给药时，理想的是用亲水性物质包覆脂质体，例如用亲水性聚合链(如聚乙二醇(PEG))包覆脂质体以延长脂质体在血液循环中的循环时间。这类表面改性的脂质体通常称为“长循环时间的”或“空间稳定的”脂质体。
对脂质体最常见的表面改性是连接PEG链，将分子量通常为约1000道尔顿(Da)-约5000Da的PEG链连接到由约5(摩尔)％脂质构成的脂质体上(见例如Stealth Liposomes CRC Press，Lasic D.andMart in，F.eds.，Boca Raton，FL(1995))，并参看此文所引文献)。这些脂质体所显示的药物动力学特征在于：剂量与肝和脾单核吞噬细胞体系(MPS)对脂质体吸收的下降无关，与表面未改性的脂质体相比，显著地延长了脂质体在血液循环中的循环时间，而表面未改性的脂质体往往会很快地从血液中排出而在肝、脾中积累起来。
最常用的和可商购的PEG取代的磷脂是以在极性端基团上带负电荷的磷脂酰乙醇胺(PE)，通常是DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)，为主要成分的。脂质体上的表面负电荷在某些情况下是不利的，例如在与细胞的相互作用方面(例如参看Miller等的 Biochemistiy，34：12875-12883(1998))，及对可能会发生药物泄漏的阳离子药物的释放方面，(例如参看Webb等， Biochim，Biophys.Acta.1372：272-282，(1998))。
因此，提供一种不带电荷的、能有效地纳入脂质双层结构中并能延长脂质体在血液循环中的循环时间的PEG衍生的脂质会是有利的。理想的是，这类脂质是低毒性、且易于制造的。
                       发明概述
在本发明的一方面，本发明包括含约1(摩尔)％-约10(摩尔)％中性脂质聚合物的脂质体组合物，其中中性脂质聚合物以下式表示：
式中：
R1和R2各自为含约8与约20个碳原子之间的烷基或链烯基链；
n为约10与约300之间的数值；
Z选自羟基、烷氧基、苄氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及
L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自选自氧、NH和直链。优选的是该组合物包含约3(摩尔)％-约6(摩尔)％中性脂质聚合物。
在本发明另一方面，L是可水解的链，如氨基甲酸酯链、酯链或碳酸酯链。在本发明的再一方面，Z是羟基或甲氧基。优选的R1和R2是无支链的。在一方面中，R1和R2都是硬脂基基团(C17H35)。在另一方面中，n优选是数值为约20与约115之间，以使PEG基团的分子量为约1000Da与约5000Da之间。
本发明还提供一种通过在脂质体中加入约1(摩尔)％-约10(摩尔)％如上式所示的中性脂质聚合物而使含成胞脂质的脂质体延长在血液循环中的循环时间的方法。本发明还提供以此式表示的脂质聚合物。
                       附图的简要说明
图1图示的是制备氨基甲酸酯连接的不带电荷的脂质聚合物(本文称为PEG-c-DS)的合成路线；
图2A-2D图示的是制备醚、酯、酰胺和酮连接的、不带电荷的脂质聚合物的合成路线；
图3A-3C是分别含有3(摩尔)％PEG-c-DS(A)，5(摩尔)％PEG-DSPE(B)，或5(摩尔)％PEG-c-DS(C)的HSPC/Chol脂质体在血液、肝和脾中的生物分布图；
图4分别表示不含PEG的2∶1 HSPC脂质体(以+表示)，即，无PEG，5(摩尔)％PEG-GSPE(以△表示)和5(摩尔)％PEG-c-DS(以○表示)在血液中的保留率曲线图；以及
图5分别表示含5(摩尔)％PEG-c-DS(以○表示)和含5(摩尔)％PEG-DSPE(以□表示)的PHEPC脂质体在血液中的保留率曲线图。
                  本发明的详细说明
I规定
本发明所采用的术语“中性”脂质聚合物是指不带电荷的即无离子特性的脂质聚合物。
“成胞脂质”是指具有憎水和极性端基团两部分的两亲脂质。这类成胞脂质例如磷脂能在水中自发地形成双层胞状结构，或者能稳定地纳入脂质双层结构中，其中憎水部分是与内部即双层膜的一个憎水区域相接触的，极性端基团部分是向外部即膜的极性表面取向的。这类成胞脂质通常包含一个或两个憎水性酰基烃链或甾族基团，在极性端基团上可存在化学反应性基团(如胺、酸、酯、醛或醇)。磷脂(例如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)以及鞘磷脂(SM))就包括在这类脂质中，其中两个烃链的长度通常在约14-约22个碳原子之间，并具有不同程度的不饱和度。其它成胞脂质包括糖脂(例如脑苷脂和神经节苷脂)和甾醇(如胆甾醇)。对于本文所述组合物来说，磷脂(如PC和PE)、胆甾醇及本文所述的中性脂质聚合物都是优选的组分。
“烷基”是指含有碳和氢的完全饱和的一价基，该烷基可以是支链的或直链的。烷基基团的实例是甲基、乙基、正丁基、叔丁基、正庚基和异丙基。“低级烷基”是指含约1个-约6个碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、正戊基及异戊基。
“链烯基”是指含碳和氢的并含至少一个双键的一价基，该一价基可以是支链的或直链的。
缩写：PEG：聚乙二醇，mPEG：甲氧基封端的聚乙二醇，Chol：胆甾醇，PC：磷脂酰胆碱，PHPC：部分氢化的磷脂酰胆碱，PHEPC：部分氢化的卵磷脂酰胆碱，HSPC：氢化的大豆磷脂酰胆碱，DSPE：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，DSP或PEG-c-DS：二硬脂酰(氨基甲酸酯连接的)PEG，APD：1-氨基-2，3-丙二醇，DTPA：二亚乙基四胺五乙酸，Bn：苄基。
II、中性脂质聚合物
本发明PEG取代的中性脂质聚合物具有下列结构式：
式中：
R1和R2各自为含约8与约20个碳原子之间的烷基或链烯基链；
n为约10与约300之间的数值；
Z选自羟基、烷氧基、苄氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及
L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-。(ii)-X(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自选自氧、NH和直链。
该类脂质聚合物包括用来取代PEG-磷脂(例如PEG-DSPE)中的带电荷的磷酸酯链的中性链(L)，该PEG-磷脂常用于空间稳定的脂质体中。中性链通常选自氨基甲酸酯、酯、酰胺、碳酸酯、脲、胺以及醚。可水解的或其它可断裂的链例如氨基甲酸酯、碳酸酯和酯是优选用于在体内经一定循环时间后需要除PEG链的场合中的。这一特征可用于在脂质体到达其目标后释放药物或可使药物易为细胞吸收(Martin等人的美国专利5891468，Zalipsky等人的PCT公开No.WO98/18813(1998))。
连接在连接基团上的PEG基团的分子量优选为约1000Da-约15000Da；这就是说n在约20与约340之间。更优选分子量为约1000Da-约12000Da(n＝约20-约275)，而最优选分子量为约1000Da-约5000Da(n＝约20-约115)。R1和R2通常包含约8个碳原子-约24个碳原子，优选为约16-约20个碳原子。最优选的是R1＝R2＝C17H35，因此COOR是硬脂酰基基团。
如上所述，将不带电荷的脂质加入脂质体中会呈现显著的优点，例如降低包胶的阳离子药物的泄漏。此外，另一优点是能更加灵活地调节脂质体表面与目标细胞间及RES间的相互作用(Miller等人Biochemistry，37：12875-12883(1998))。PEG取代的合成N-脂酰基鞘氨醇已经用作空间稳定的脂质体中的不带电荷成分(Webb等人，Biochim，Biophys.Acta.1372：272-282，(1998))，然而这些分子是复杂的，制备成本高，而且它们通常不仅不会挤入二酰基甘油磷脂双层结构，而且也不会挤入磷脂双层结构。
可采用标准合成方法制备脂质聚合物。例如，氨基甲酸酯连接的化合物(L＝-O-(C＝O)-NH-CH2-)是按图1所示步骤制备的：使mPEG(甲氧基PEG)中的端羟基与氯甲酸对硝基苯酯反应制得碳酸对硝基苯酯，然后使该产物与1-氨基-2，3-丙二醇反应制成氨基甲酸酯中间产物，接着使二元醇的羟基基团酰化而得到最后产物。一种以甘油代替1-氨基-2，3-丙二醇的类似合成反应可用来制备碳酸酯连接的产物(L＝-O-(C＝O)-O-CH2-)。氨基甲酸酯连接的二硬脂酰脂质聚合物和二二十酰脂质聚合物的制备在实施例1中也有说明。
如图2A所示，醚连接的脂质聚合物(L＝-O-CH2-)是按下述步骤制备的：使mPEG-OH的端羟基与氯化缩水甘油反应，使得到的环氧化物水解，以及使得到的二元醇酰化。酯连接的脂质聚合物(L＝-O-(C＝O)-或L＝-O-(C＝O)-CH2-)可按如图2B步骤制备：使mPEG-OH与甘油酸丙酮化合物(2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-羧酸)的活化衍生物或四碳同系物2，2-二甲基-1，3-二氧戊烷-4-乙酸的活化衍生物反应，然后使二元醇脱保护和进行酰化。
采用mPEG-NH2(根据Zalipsky等人的PCT公开No.WO98/18813(1998)中所述方法制备的)代替mPEG-OH的相应反应可用来制备含有酰胺链、脲、或胺键(即L＝-NH-(C＝O)-NH-、-NH-(C＝O)-CH2-、-NH-(C＝O)-NH-CH2-或-NH-CH2-)的脂质聚合物。
L为-X-(C＝O)-的化合物，(其中X是O或NH)可通过活化的端羧基PEG(由端羟基PEG经氧化，然后通过例如将羧基转变成硝基苯基酯或使羧基与DCC反应，以使羧基活化而制得)分别与1，2，3-丙三醇或1-氨基-2，3-丙二醇反应来制备(图2C)。酮基连接的化合物(即X是直链)可通过端醛基PEG(由端羟基PEG经温和氧化制得)与例如1-溴-2，3-丙二醇丙酮化物的格氏试剂的缩合(图2D)，接着在非酸性条件下氧化成酮，再使丙酮化物水解成二元醇，然后，在每种情况下，使二元醇按常规进行酰化而制成。
不是与甘油部分相连接的PEG低聚物端位置(α端，上述Z基团)通常是羟基或甲氧基，但可按照技术上已知方法经官能化，以使各种分子易于与中性脂质聚合物相连接，和/或使脂质体以特定的细胞或组织为靶的用途或使药物易于释放。可连接的分子包括：例如蛋白质、肽、糖、抗体或维生素。实施例2和3说明了按照类似于上述合成路线，以商购PEG低聚物来制备α-官能化的脂质聚合物的步骤，其中PEG低聚物中的α端是经诸如叔丁基醚或苄基醚的基团取代的，这种基团在分子的脂质部分合成后易于转变成羟基。就这种情况来说，通过使端基转变为碳酸对硝基苯基酯而使端基活化。
III、脂质体药物动力学。
在包含成胞脂质的脂质体中加入约1-约10(摩尔)％更优选约3-约6(摩尔)％中性脂质聚合物就可形成循环时间长的脂质体。为了说明起见，加有约3-约5(摩尔)％的mPEG2000-DSPE(二硬脂酰磷脂酰乙醇胺)或氨基甲酸酯连接的脂质聚合物(mPEG2000-c-DS)的脂质体是按实施例4所述制备的，而其余的脂质是由摩尔比为1.5∶1的HSPC和胆甾醇所组成。该脂质体是加载有125I-tyraminylinulin标志物的。将各次制备的试样注入老鼠尾巴的静脉中，然后如实施例4中所述在不同的时间点测定试样在组织中的分布。测得的血液、肝和脾中的脂质体浓度列于表1-3中，并图示于图3A-3C中。数据显示，含PEG-c-DS的脂质体的药物动力学与含PEG-DSPE的脂质体的药物动力学是极相似的。
                表1  血液中脂质体分布
时间点     注射剂量的％
    A     B   C
    30min     --   94.8±3.99   89.7±6.94
    2h     85.1±1.99   79.8±3.42   73.0±17.4
    6h     67.1±6.25   54.5±3.05   55.3±2.51
    12h     54.9±6.04   39.7±2.52   44.4±2.52
    24h     14.8±2.81   12.4±2.34   16.6±2.38
                    表2  肝中脂质体分布
时间点     注射剂量的％
    A   B   C
    30min     --   2.27±0.13   3.14±0.95
    2h     8.76±2.01   9.42±1.24   11.7±1.74
    6h     21.7±2.55   19.3±1.37   20.8±0.86
    12h     26.6±0.51   26.4±1.99   30.4±1.28
    24h     43.9±2.7   36.6±2.25   42.6±0.48
                           表3   脾中脂质体分布
时间点   注射剂量的％
  A   B   C
  30min   --   0.09±0.06   0.23±0.08
  2h   0.96±0.16   0.99±0.09   1.08±0.09
  6h   1.94±0.07   1.96±0.29   2.12±0.13
  12h   3.15±0.31   3.13±0.12   3.35±0.22
  24h   4.69±0.37   3.91±0.31   4.56±0.29
对两种PEG脂质与不含PEG脂质的对照配方的特性进行了类似的比较研究。图4显示的是不含PEG脂质(以+表示)，含5(摩尔)％PEG2000-DSPE(以△表示)或含5(摩尔)％PEG2000-c-DS(以○表示)的2∶1 HSPC脂质体在血液中的保留率。
还对含mPEG2000-c-DS∶PHPC∶Chol之摩尔比为5∶55∶40的脂质体进行了研究。脂质体是通过加入铟-DTPA配合物进行标记的。测定血液中和各种组织中24小时内保留的注入剂量的百分比。结果列于表4-6中。这些脂质体通常显示出循环时间长的药物动力学特性，四小时后注入剂量的平均保留率高于70％，24小时后高于30％。
             表4   血液中铟的注射剂量的百分比
  动物# 0.0hrs  0.5hrs   1.0hrs  2.0hrs  4.0hrs  24hrs
  小鼠1 103.7  91.2   82.5  73.8  72.0  33.1
  小鼠2 97.7  87.7   79.4  78.7  74.4  30.7
  小鼠3 95.1  83.1   77.8  68.6  64.4  29.8
  小鼠4 91.9  85.4   78.5  75.6  72.6  33.2
  平均 97.1  86.8   79.6  74.2  70.9  31.7
  标准偏差 5.0  3.4   2.1  4.2  4.4  1.7
                 表5   24小时时组织中注射剂量的百分比
    组织     小鼠#1     小鼠#2     小鼠#3     小鼠#4     平均 标准偏差
    肝     7.5     6.9     6.7     7.2     7.1 0.3
    脾     4.9     5.4     5.6     4.8     5.2 0.4
    心     0.4     0.5     0.5     0.6     0.5 0.1
    肾     1.2     1.2     1.0     1.2     1.1 0.1
    肺     0.7     0.7     0.7     0.8     0.7 0.1
    皮肤     0.1     0.3     0.2     0.2     0.2 0.1
    骨     0.3     0.2     0.2     0.2     0.2 0.2
    肌肉     0.1     0.1     0.1     0.2     0.1 0.4
    尿     11.2     13.4     5.7     12.3     10.7 3.4
                 表6   24小时时组织中每克注射剂量的百分比
    组织     小鼠#1    小鼠#2     小鼠#3     小鼠#4     平均 标准偏差
    肝     0.7     0.7     0.7     0.7     0.7 0.3
    脾     7.3     6.9     8.2     5.9     7.1 0.9
    心     0.5     0.5     0.5     0.5     0.5 0.4
    肾     0.6     0.6     0.5     0.6     0.6 0.6
    肺     0.6     0.5     0.5     0.6     0.5 0.6
    皮肤     0.1     0.1     0.1     0.1     0.1 0.1
    骨     0.4     0.4     0.4     0.4     0.4 0.3
    肌肉     0.1     0.1     0.1     0.1     0.1 0.2
    尿*     0.6     0.6     0.3     0.8     0.6 0.2
*每毫升注射剂量的百分比
最后，比较含5(摩尔)％mPEG2000-c-DS或mPEG2000-DSPE和其余为PHEPC的脂质体在给药最多24小时后在血液中的保留百分比。如图4所示，它们的药物动力学实际是相同的，在24小时后保留率约为40％。
所有公开、专利和专利文件都列入本文供参考。已参照各个具体而优选的实施方案和技术对本发明进行了说明。然而，应当指出，在本发明的精神和范围内是可作许多变化和变更的。
下列实施例是对本发明的说明，而不是对本发明的限制。
实施例1A mPEG 2000 -c-DS(mPEG-氨基丙二醇二硬脂酰；α-甲氧基- ω-2，3-二(硬脂酰氧基)丙基氨基甲酸酯聚(环氧乙烷))的合成
将mPEC2000(20克，10摩尔)溶液在甲苯(50毫升，120℃)中共沸干燥。上述溶液的温度达到25℃后，用氯甲酸硝基苯酯(3.015克，15摩尔)处理，随后用TEA(2.01毫升，15摩尔)处理。使混合物反应1.5小时，过滤产生的TEA盐，脱除溶剂后得到mPEG2000-氯甲酸硝基苯酯粗制品。向mPEG2000-氯甲酸硝基苯酯添加氨基丙二醇(3克，30摩尔)的乙腈(50毫升)溶液，在室温下搅拌该混合物过夜。以过滤方法除去不溶物后，再以蒸发方法脱除溶剂。产物在异丙醇中重结晶两次。产率：13.7克，65％.1HNMR(300兆赫，DMSO-D6)δ：3.23(s，OCH3，3H)、3.65(s，PEG，180H)、4.05(t，氨基甲酸酯CH2，2H)、4.42(t，1°OH，1H)、4.57(d，2°OH，1H)。
将产物mPEG2000氨基丙二醇(2.3克，1.08摩尔，2.17毫当量OH)溶于甲苯(30毫升)中并进行共沸干燥，除去约10毫升溶液。将溶液冷却至室温，用移液管加入吡啶(4毫升，20％)，接着添加硬脂酰氯(1克，4.3摩尔)，立即形成白色沉淀。将反应混合物在120℃下回流过夜后再冷却，当反应烧瓶的温度达到约40℃时，以过滤去除吡啶盐，蒸发滤液。得到的产物(PEG2000-c-DS)用异丙醇(2×30毫升)重结晶两次进行提纯并在P2O5上真空干燥。
产率：2.26克，80％，TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)；mPEG氨基丙二醇Rf＝0.266，PEG-c-DS，Rf＝0.533，1HNMR(300兆赫，DMSO-D6)，δ：0.89(t，CH3，6H)，1.26(s，CH2，56H)，1.50(2t，2CH2，4H)，2.24(t，CH2CH2C＝0，4H)，3.23(s，OCH3，3H)3.50(s，PEG，180H)、4.00(dd，APD的CH2，1H)、4.02(t，CH2OC＝0-N，2H)、4.20(dd，APD的CH2，1H)、4.98(m、CHOC(O)，1H)、7.34(m，NH，1H)。
以相同的步骤，用分子量为750、5000和12000的mPEG聚合物制备mPEG-c-DS。通过1H-NMR和质谱法鉴定产物的结构。用MALDI(MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization)测定的分子量如下：
       对应物                 MALDI法测定的分子量
       mPEG(750)-c-DS         1426
       mPEG(2000)-c-DS        2892
       mPEG(5000)-c-DS        5816
       mPEG(12000)-c-DS       12729
实施例1B  PEG-c-DE(mPEG氨基丙二醇二二十烷酰基；α-甲氧基 -ω-2，3-二(二十烷酰氧基)丙基氨基甲酸酯聚(环氧乙烷))的合成
在100毫升圆底烧瓶中，置入溶于甲苯(20毫升)中的二十烷酸(500毫克，1.6毫摩尔)，再用移液管添加草酰氯(147微升，1.68毫摩尔)。然后向该搅拌着的混合物添加1％DMF，一旦加入DMF，就有气体放出。 必 须避免任何物体与该气体接触。10分钟后，蒸发甲苯，然后再加入20毫升甲苯，并蒸发除去任何过量的草酰氯。蒸余物再溶解于10毫升甲苯中，然后向该甲苯溶液加入上面制备的mPEG-氨基丙二醇(1.19克，0.56毫摩尔)，在烧瓶上装上回流冷凝器并回流该混合物过夜。经TLC分析(甲醇和氯仿，9∶1)显示，反应已完全。待反应混合物冷却后，过滤出不溶物，取出滤液并干燥。产物用异丙醇经三次重结晶纯化并在P2O5上经真空干燥。产率：1.0毫克，70％。1HNMR(360兆赫，DMSO-D6)δ：0.89(t，CH3，6H)，1.26(s，CH2，脂质的66H)，1.50(t，2CH2，4H)，2.24(t，CH2CH2C＝0，4H)，3.23(s，OCH3，3H)，3.50(s，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.05(t，CH2CH2C+O，4H)，3.23(S，OCH3，3H)，3.50(S，PEG，180H)，4.00(dd，APD的CH2，1H)，4.05(t，CH2OC＝O-N，2H)，4.20(dd，APD的CH2，1H)，4.98(m，CHOC(O)，1H)，7.34(m，NH，1H)ppm.
实施例2   经叔丁基-O-PEG-O-琥珀酰亚胺制备叔丁基-O-PEG-氨基 丙二醇
A、 叔丁基-O-PEG-O-琥珀酰亚胺
将购自Polymer Labs的叔丁基-O-PEG-2000(10克，5毫摩尔)溶于120毫升甲苯中并进行共沸干燥，脱除约20毫升溶剂，水分收集在DeanStark分水器中。
将溶液冷却至室温，并添加光气(15毫升)。使混合物在室温下反应过夜。反应完全后，用旋转蒸发器蒸除溶剂，然后再添加约50毫升甲苯，再用旋转蒸发器蒸去溶剂。将蒸余物溶于干燥甲苯(30毫升)和二氯甲烷(10毫升)中，然后向该溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(1.7克，14.8毫摩尔)和三乙胺(2.1毫升，14.9毫摩尔)，使混合物在室温下反应过夜，此后经TLC分析表明，反应已经完全。
    化合物
    t-Bu-O-PEG-OH   0.44
    t-Bu-O-PEG-OSc   0.51
从反应混合物过滤出盐，经蒸发除去溶剂，固体用异丙醇经两次重结晶在P2O5上干燥。产率：9.2，85％。1HNMR(COCl3，360兆赫)，δ：1.25(s，t-Bu，9H)，2.82(s，CH2CH2，4H)，3.60(s，PEG，180H)，4.45(t，CH2OCONH，2H)ppm。
B、 叔丁基-O-PEG-氨基丙二醇
向氨基丙二醇(300毫克，3.2毫摩尔)的DMF(10毫升)溶液添加叔丁基-PEG-OSc(5克，2.29毫摩尔)，然后使反应过夜。全部NHS酯消耗后，得到的混合物在TLC上出现一个斑点.
    化合物
    叔丁基-O-PEG-OSc   0.51
    叔丁基-O-PEG-APD   0.35
将预先洗过的酸性离子交换树脂(1克)加到反应混合物中，30分钟后经过滤滤去。除去溶剂后得到的残留物用200毫升异丙醇重结晶。收集固体并在P2O5上干燥。产率：4.2克，85％。1HNMR(D6-DMSO，360兆赫)δ：1.25(s，t-Bu，9H)，3.68(s，PEG，180H)，403(t，CH2OCONH，2H)，4.43(t，1°OH，1H)，4.55(d，2°OH，1H)，6.98(t，NH，1H)ppm。
实施例3   碳酸对硝基苯酯-PEG-c-DS的制备
A、 Bn-O-PEG-碳酸硝基苯酯(NPC)
将购自Shearwater Polymers(Huntsville，LA，5克2.41毫摩尔)的Bn-O-PEG-2000溶于120毫升甲苯中并进行共沸干燥，脱除约20毫升溶剂，水分收集在Dean Stark分水器中。将溶液冷却至室温，并在减压下蒸去溶液中剩余的溶剂。
将蒸去溶剂后的蒸余物溶解于30毫升二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)中，添加氯甲酸对硝基苯酯(729毫克，3.6毫摩尔)和三乙胺(1毫升，7.2毫摩尔)。使反应在4℃下进行8-16小时。该方法虽可消除碳酸双PEG酯的形成，但会降低反应效率。在GF硅胶板上出现紫外可见斑点说明反应已完成。
反应混合物用预先洗过的酸性和碱性离子交换树脂处理30分钟，然后过滤和干燥。产物用异丙醇重结晶后在P2O5上干燥。产率：4.4克，80％。
B、 Bn-O-PEG-氨基丙二醇
向氨基丙二醇(260毫克，1.9毫摩尔)的DMF(10毫升)溶液添加如上制备的Bn-O-PEG-NPC(4.3克，2.9毫摩尔)，使反应进行5小时。全部Bn-O-PEG-NPC消耗后，反应混合物在TLC硅胶板(氯仿∶甲醇∶水为90∶18∶2)上出现一个斑点。
反应混合物用预先洗过的酸性离子交换树脂5克处理30分钟，然后过滤和干燥。产物用异丙醇重结晶后在P2O5上干燥。产率：3.8克，91％。
C、 Bn-O-PEG-c-二硬脂酰
将Bn-O-PEG-氨基丙二醇(3克，1.36毫摩尔)、硬脂酸(1.94克，6.79毫摩尔)与作为催化剂的DPTS(4-(二甲氨基)吡啶鎓4-甲苯磺酸盐)(408毫克，1.36毫摩尔)在室温下搅拌20分钟。用移液管添加二异丙基碳二亚胺(1.28毫升，8.16毫摩尔)，然后使混合物反应过夜。TLC(氯仿∶甲醇，90∶10)显示二元醇已完全参与反应。
将碱性离子交换树脂(5克)添加到反应混合中，摇动30分钟后，过滤出树脂，使滤液干燥。干燥的产物经异丙醇(100毫升)重结晶，在P2O5上干燥。产率：4克，80％。
D、HO-PEG-c-二硬脂酰
采用两种不同方法脱去Bn-O-PEG-c-DS的苄基基团保护
方法1：氢解：通过载持在碳上的钯脱保护。向Bn-O-PEG-c-DS(218毫克，0.08毫摩尔)的5毫升甲醇溶液添加10％Pd/C(110毫克)和甲酸铵(107毫克，0.8毫摩尔)，使混合物在室温下反应过夜。在Celite上过滤滤去Pd/C，使滤液干燥。将干燥的残留物溶于氯仿中，用饱和NaCl溶液洗涤氯仿溶液三次。收集氯仿相并用MgSO4干燥，然后滤除MgSO4并浓缩。固体产物经叔丁醇冷冻干燥，得到的粉状产物在P2O5上干燥。产率：80％，175毫克。
方法2：通过四氯化钛脱保护。将Bn-O-PEG-c-DS(1.18克，0.43毫摩尔)的二氯甲烷(10毫升)溶液在冰浴中冷却5分钟。用经烘箱干燥过的注射器将四氯化钛(3毫升，21.5摩尔，过量的)转移到密封的反应烧瓶中。5分钟后，移去冰浴，在室温下过夜进行脱保护反应。在GF硅胶TLC板上出现移动距离较短的斑点(相对于原材料)表示脱保护反应已完全。
将约40毫升氯仿加到反应混合物中，然后将混合物转移到含40毫升饱和NaHCO3的分液漏斗中。轻轻地摇动混合物(避免形成乳状液)，收集氯仿层。如此重复萃取三次，收集氯仿相，并再用饱和NaHCO3萃取一次以确保完全除TiCl4。收集的氯仿相用MgSO4干燥，然后过滤和浓缩。
将上述得到的浓缩物溶于1毫升氯仿中并加到已准备好的硅胶(200-400目，60埃)柱中。移动相(氯仿)的极性是通过递增2％的甲醇而增加，直到产物以10％甲醇/90％氯仿洗提。收集流出的产物并以旋转蒸发器脱除溶剂。固体经叔丁醇冷冻干燥后在P2O5上干燥。产率：70％，800毫克。
E、 碳酸时硝基苯酯-PEG-c-DS
反应烧瓶、搅拌棒、注射器和原材料(HO-PEG-c-DS，按上述制备的)在反应开始前都是经仔细干燥的。
向HO PEG-c-DS(1.2克，0.45毫摩尔)的10毫升二氯甲烷/乙酸乙酯(60∶40)溶液添加碳酸对硝基苯酯(136毫克，0.65毫摩尔)和三乙胺(188微升，1.35毫摩尔)。在4℃(以消除碳酸双PEG酯的形成)下使反应进行8-16小时，以后，通过GF硅胶的TLC表明，反应已完全。
    化合物
    HO-PEG-c-DS   0.40
    NPC-PEG-c-DS   0.54
反应混合物用预先洗过的酸性和碱性离子交换树脂处理30分钟后过滤。使滤液干燥，所得固体用异丙醇重结晶。再使固体在P2O5上干燥。产率：70％。1HNMR(D6-DMSO，360兆赫)，δ：0.86(t，CH3，6H)，1.22(s，DS，56H)，1.48(m，CH2CH2(CO)，4H)，2.26(2xt，CH2OCONH，2H)，4.03和4.22(2xd，脂质的CH2CH，2H)，4.97(M，脂质的CHCH2)，6.98(t，NH，1H)，7.55％8.32(2xd，芳香，4H)ppm。
实施例4   含PEG-DSPE和PEG-c-DS的脂质体的制备和生物分布研究
使按下列比例的HSPC∶Chol∶PEG脂质混合物经溶解和脱除溶剂而形成脂质膜：
A：58∶39∶3；PEG脂质＝PEG-c-DS
B：57∶38∶5；PEG脂质＝PEG-DSPE
C：57∶38∶5；PEG脂质＝PEG-c-DS
使膜在含140毫摩尔NaCl的25毫摩尔HEPES的新制备的125I-Tyraminylinulin中(PH7.4)水合，并挤压形成直径为100-105纳米的脂质体。使该脂质体通过0.22微米Millipore(MilliporeCorporation，Bedford，MA)低蛋白结合的注射管端微孔过滤器过滤灭菌。进行等分部分计数以确定125I的注入数。脂质浓度是通过检验脂质体制品的磷酸酯含量来确定，脂质体制品以灭菌缓冲液稀释至最后浓度为2.5微摩尔/毫升。将0.2毫升稀释过的脂质体经老鼠尾巴静脉注入老鼠体内以使每只老鼠接受0.5微摩尔磷脂。在不同的时间点，通过氟烷麻醉、颈部错位使老鼠死亡，取心脏血流和血液的血样以及各种器官供125I计数试验。

Claims (24)

1.一种包含1摩尔％-10摩尔％的中性脂质聚合物和其余为成胞脂质的脂质体组合物，其中脂质聚合物具有下列化学式：
式中：
R1和R2各自为含8与24个碳原子之间的烷基或链烯基链；
n＝10-300之间的数值；
Z选自羟基、烷氧基、苄氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及
L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自选自氧、NH和直链，条件是当L为-X-(C＝O)-时，X不是NH。
2.权利要求1的组合物，其中X是氧，Y是氮。
3.权利要求1的组合物，其中L是氨基甲酸酯链，酯链或碳酸酯链。
4.权利要求3的组合物，其中L是-O-(C＝O)-NH-CH2-。
5.权利要求1的组合物，其中Z是羟基或甲氧基。
6.权利要求1的组合物，还包含3摩尔％-6摩尔％的中性脂质聚合物。
7.权利要求1的组合物，其中R1和R2各自为含8-24个碳原子之间的非支链烷基或链烯基链。
8.权利要求6的组合物，其中R1和R2各自是C17H35。
9.权利要求1的组合物，其中n是20与115之间的数值。
10.一种延长含有成胞脂质的脂质体循环时间的方法，该方法包括：
向含有成胞脂质的脂质体中加入1摩尔％-10摩尔％的具有下列化学式的中性脂质聚合物：
式中：
R1和R2各自为含8与24个碳原子之间的烷基或链烯基链；
n＝10-300之间的数值；
Z选自羟基、烷氧基、苄氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及
L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X-(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自选自氧、NH和直链，条件是当L为-X-(C＝O)-时，X不是NH。
11.权利要求10的方法，其中X是氧，Y是氮。
12.权利要求10的方法，其中L是氨基甲酸酯链、酯链或碳酸酯链。
13.权利要求12的方法，其中L是-O-(C＝O)-NH-CH2-。
14.权利要求10的方法，其中Z是羟基或甲氧基。
15.权利要求10的方法，其中加入有3摩尔％-6摩尔％中性脂质聚合物。
16.权利要求10的方法，其中n是20与115之间的数值。
17.一种具有下列结构的中性脂质聚合物：
式中：
R1和R2各自为含8与24个碳原子之间的烷基或链烯基链；
n＝10-300之间的数值；
Z选自羟基、烷氧基、苄氧基、羧酸酯、磺酸酯、碳酸烷基或芳基酯、氨基和烷基氨基；以及
L选自(i)-X-(C＝O)-Y-CH2-，(ii)-X-(C＝O)-和(iii)-X-CH2-，其中X和Y各自选自氧、NH和直链，条件是当L为-X-(C＝O)-时，X不是NH。
18.权利要求17的脂质聚合物，其中X是氧、Y是氮。
19.权利要求17的脂质聚合物，其中L是氨基甲酸酯链、酯链或碳酸酯链。
20.权利要求19的脂质聚合物，其中L是-O-(C＝O)-NH-CH2-。
21.权利要求17的脂质聚合物，其中R1和R2各自为含8与24个碳原子之间的非支链烷基或链烯基链；
22.权利要求21的脂质聚合物，其中R1和R2各自是C17H35。
23.权利要求17的脂质聚合物，其中Z是羟基或甲氧基。
24.权利要求17的脂质聚合物，其中n是20与115之间的数值。
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