HRP20020387A2 - Interferon gamma conjugates - Google Patents

Description

Područje izuma

Predmetni izum odnosi se na konjugate s aktivnosti kao interferon - gama, postupke za njihovu preparaciju, farmaceutske kompozicije koje obuhvaćaju te molekule i njihovu upotrebu za liječenje bolesti.

Pozadina izuma

Interferon - gama (IFNG) je citokin kojeg proizvode T - limfociti i prirodne stanice -ubojice te postoji kao homodimer dvije nekovalentno vezane polipeptidne podjedinice. Zrela forma svakog dimera obuhvaća 143 amino kiseline (prikazano u SEQ ID NO 2), njegov prekursorski oblik uključujući signalnu sekvencu od 166 aminokiselina (prikazano u SEQ ID NO 1).

Svaka podjedinica ima potencijalno mjesto za N-glikoziliranje (Aggarwal et al. Human Cytokines, Blackwell Scientific Publications, 1992) na položajima 25 i 97. Ovisno o stupnju glikoziliranja, molekulska težina IFGN u dimernom obliku je 35 - 50 kDa (Farrar et al., Ann. Rev, Immunol. 1993, 11: 57 - 611).

Primarnu sekvencu divljeg tipa humanog IFNG (huIFNG) objavili su Gray et al. (Nature 298:859 - 863, 1982), Taya et al. (EMBO J. 1: 953 -958, 1982), Devos et al. (Nucleic Acids Res. 10: 2487 - 2501, 1982) i Rinderknecht et al. (J. Biol. Cheiru 259: 6790 - 6797, 1984) te u EP 77670, EP 89676 i EP 110044. 3D struktura huIFNG objavljena je u članku Ealick et al. (Sience 252: 698 - 702, 1991).

Različite forme polipeptida IFNG podjedinice koje se pojavljuju u prirodi ili mutirani oblici su objavljene/'' uključujući jednu koja obuhvaća sekvencu N-terminalnih amino kiselina Cys – Tyr - Cys (položaji (-3)-(-l) relativno prema SEQ ID NO 2), jednu koja obuhvaća N-terminalni metionin (položaj -l relativno prema SEQ ID NO 2) i različiti C - terminalno skraćeni oblici koji obuhvaćaju 127 - 134 aminokiselina. Poznato je da se 1 - 15 aminokiselina može ukloniti sa C-terminusa a da se ne ukine IFNG aktivnost molekule. Dalje, heterogenost huIFN C - terminusa opisana je u Pan et al. (Eur. J. Biochem. 166:145 - 149, 1987).

HuIFNG muteini objavljeni su u Slodowski et al. (Eur. J. Biochem. 202: 1133 - 1140), Luk et al. (J. Biol. Chem. 265: 13314 - 13319), Seelig et al. (Biochemistry 27: 1981 - 1987, 1988), Trousdale et al. (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 26: 1244 - 1251, 1985) i u EP 146354. Prirodna varijanta huIFNG opisana je u Nishi et al. (J. Biochem. 97: 153 - 159, 1985).

US 6,046,034 izlaže termostabilne rekombinantne huIFNG (rhuIFNG) varijante koje imaju inkorporirana do 4 para cisteina da se omogući stvaranje disulfidnog mosta i tako stabiliziranje IFNG varijante u homodimernom obliku.

WO 92/08737 izlaže IFNG varijante koje obuhvaćaju metionin dodan na N-terminalnom kraju cijele (aminokiseline 1-143) ili parcijalne (aminokiseline 1-132) sekvence aminokiselina divljeg tipa humanog IFNG. EP 219 781 izlaže parcijalne huIFNG sekvence koje obuhvaćaju aminokiseline 3-124 (iz SEQ ID NO 2). US 4,832,959 izlaže parcijalne huIFNG sekvence koje obuhvaćaju aminokiseline 1-127, 5-146 i 5-127 sekvence aminokiselina koja u usporedbi sa SEQ ID NO 2 ima 3 dodatne N-terminalne aminokiseline (CYC). US 5,004,689 izlaže DNA sekvencu koja šifrira huIFNG bez 3 N-terminalne aminokiseline (CYC) i njenu ekspresiju u E. coli. EP 446582 izlaže huIFNG proizveden u E. coli bez N-terminalnog metionina. US 6,120,762 izlaže peptidni fragment huIFNG koji obuhvaća njegove aminokiselinske ostatke 95 - 134 (relativno prema SEQ ID NO 2).

Visoka razina ekspresije rhuIFNG objavljena je u Wang et al. (Sci. Sin. B 24: 1076 - 1084, 1994).

Varijaciju glikoziliranja u rhuIFNG objavili su Curling et al. (Biochem. J. 272: 333 - 337, 1990) i Hooker et al. (J. of Interferon and Cytokine Research, 1998, 18: 287 - 295).

Polimernu modifikaciju rhuIFNG prijavili su Kita et al. (Drug Des. Deliv. 6: 157 - 167, 1990), te u EP 236987 i US 5109 120.

WO 92/22310 izlaže asialoglikoproteinske konjugatne derivate interferona, inter alia huIFNG.

Opisani su IFNG fuzijski proteini. Na primjer, EP 237019 izlaže jednostruki polipeptidni lanac koji ima područje s (J aktivnosti interferona i jedno područje s IFNG aktivnosti.

EP 158 198 izlaže jednostruki polipeptidni lanac koji ima područje s IFNG. aktivnosti i područje s IL - 2 aktivnosti. Nekoliko referenci opisalo je jednolančane dimerne IFNG proteine, npr. Landar et al. (J. Mol. Biol., 2000, 299: 169 - 179).

WO 99/02710 izlaže jednostruke polipeptidne lance među kojima je IFNG jedan od mnogih primjera.

WO 99/03887 izlaže PEGilirane varijante polipeptida koje pripadaju nadporodici hormona rasta, gdje je neesencijalna aminokiselina smještena u specificiranom području polipeptida zamijenjena cisteinom. IFNG se spominje kao jedan primjer člana nadporodice hormona rasta, ali njegova modifikacija nije detaljno raspravljena.

IFNG je predložen za liječenje intersticijskih plućnih oboljenja (također poznatih kao intersticijska pulmonarna fibroza IPF) (Ziesche et al. (N. Engl. J. Med. 341: 1264 - 1269, 1999 i Chest 110: Suppl: 25S, 1996) i EP 795331) gdje se IFNG može koristiti u kombinaciji s prednisolonom. Dodatno na IPF, granulomatozna oboljenja (Bolinger et al, Clinical Pharmacy, 1992, 11: 834 - 850), neke mikobakterijske infekcije (N. Engl. J. Med. 330: 1348 - 1355, 1994), karcinom bubrega (J. Urol. 152: 841 - 845, 1994), osteoporoza (N. Engl. J. Med. 332: 1595 -1599, 1995), skleroderma (J. Dermatol. 23: 654 -658, 1996), hepatitis B (Hepatogastroenterolgy 45: 2282 - 2294), hepatitis C (Int. Hepatol. Communic. 6: 264 - 273, 1997), septički šok (Nature Medicine 3: 678 - 681, 1997) i reumatoidni artritis mogu se liječiti s IFNG.

Kao farmaceutski spoj rhuIFNG koristi se, s izvjesnim uspjehom, iznad svega protiv nekih virusnih infekcija i tumora. rhuIFNG se obično može davati pareneralnom, preferirano subkutanom, injekcijom. Maksimalne serumske koncentracije nađene su nakon sedan sati, vrijeme poluraspada u plazmi je 30 minuta nakon iv davanja. Iz ovog razloga efikasno liječenje s rhuIFNG uključuje česte injekcije. Glavni negativni efekti sastoje se od groznice, zimice, znojenja, glavobolje, mijalgije i pospanosti. Ovi efekti su povezani s ubrizgavanjem rhuIFNG i opaženi su unutar prvih sati nakon injekcije. Rijetki stranski efekti su lokalna bol i eritrema, povišenje jetrenih enzima, reverzibilna granulo- i trombopenija i kardiotoksičnost.

Poželjno je da se pronađu nove molekule s IFNG aktivnošću koje imaju poboljšana svojstva u smislu farmakokinetike, homogenosti, imunogenosti i drugih nepovoljnih stranskih efekata u usporedbi s huIFNG i rhuIFNG.

Kratko izlaganje izuma

Ova prijava iznosi poboljšane molekule slične IFNG koje pružaju jednu ili više gore prije spomenutih prednosti. U prvom vidu izum se odnosi na konjugat koji pokazuje IFNG aktivnost i obuhvaća najmanje jednu prvu ne-polipeptidnu jedinku kovalentno vezanu na IFNG polipeptid, taj polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od prvobitnog IFNG polipeptida u najmanje jednom uvedenom i/ili najmanje jednom uklonjenom aminokiselinskom ostatku koji obuhvaća veznu rupu za ne-polipeptdinu jedinku. Konjugati imaju produženo vrijeme poluživota in vivo u usporedbi s huIFNG i rhuIFNG te po izboru uzrokuju smanjeni imuni odovor u usporedbi s rhuIFNG. Po izboru ova klasa molekula ima dalje poboljšana svojstva u smislu produktibilnosti homogenih molekula, poboljšanu otpornost prema proteolizi i/ili povećanu bioraspoloživost.

Prema tome, konjugat izuma pruža mnoge prednosti prema sadašnjim raspoloživim IFNG spojevima, uključujući dulje trajanje između injekcija ili drugih oblika davanja, manje stranskih efekata i/ili povećanu efikasnost uslijed smanjenja antitijela. Štoviše, veće doze aktivnog proteina i tako efikasniji terapeutski odgovor može se dobiti korištenjem konjugata izuma.

U daljnjem aspektu, izum se odnosi na konjugat koji pokazuje IFNG aktivnost koji obuhvaća najmanje jedan N-terminalno PEGiliran polipeptid. IFNG polipeptid može biti huIFNG ili bilo koji od ovdje opisanih IFNG polipeptida.

U još daljem aspektu izum se odnosi na načine i postupke za preparaciju konjugata izuma, uključivši sekvencu nukleotida i ekspresijske vektore kao i postupke za preparaciju polipeptida ili konjugata.

U još daljim aspektima izum se odnosi na terapeutsku kompoziciju koja obuhvaća konjugat izuma, na konjugat ili kompoziciju izuma za korištenje u terapiji, na upotrebu konjugata ili kompozicije u terapiji ili za proizvodnju medikamenta za liječenje bolesti.

Na kraju, izum se odnosi na upotrebu specificiranih IFNG konjugata za proizvodnju medikamenta, farmaceutske kompozicije ili skupine komponenata za liječenje intersticijskog plućnog oboljenja, raka, infekcija i/ili upalnih bolesti i u slučaju intersticijskih bolesti pluća, po izboru, dalje u kombinaciji s glukokortokoidima.

Detaljan opis izuma

Definicije

U okviru predmetne prijave i izuma vrijede sljedeće definicije:

Izraz "konjugat" (ili zamjenjivo "konjugirani polipeptid") je namijenjen da označava heterogenu (u smislu da je složena ili himern) molekulu nastalu kovalentnim povezivanjem jednog ili više polipeptida na jednu ili više ne-polipeptidnih jedinki.

Izraz kovalentno povezivanje znači da su polipeptidna i ne-polipeptidna jedinka ili direktno kovalentno vezane jedna na drugu ili su inače indirektno kovalentno povezane jedna na drugu kroz posredujuću jedinku ili jedinke, kao što je most, razmak ili vezna jedinka ili jedinke. Preferirano je konjugat topljiv u relevantnim koncentracijama i uvjetima, tj. topljiv u fiziološkim otopinama kao što je krv. Primjeri konjugiranih polipeptida izuma uključuju glikozilirane i/ili PEGilirane polipeptide. Izraz "nekonjugirani polipeptid" može se upotrijebiti za polipeptidni dio konjugata.

Izraz "ne-polipeptidna jedinka" je namijenjen da označava molekulu koja je sposobna da se konjugira na povezanu grupu IFNG polipeptida.

Preferirani primjeri takve molekule uključuju polimerne molekule, lipofilne spojeve, jedinke šećera ili organska derivatizirajuća sredstva. Kada se upotrijebe u kontekstu konjugata izuma bit će razumljivo da je ne-polipeptidna jedinka vezana na polipeptidni dio konjugata kroz povezujuću grupu polipeptida.

Izraz "polimerna molekula" definira se kao molekula nastala kovalentnim vezanjem dva ili više monomera gdje nijedan od monomera nije aminokiselinski ostatak, osim kada je polimer humani albumin ili drugi obilan protein plazme. Izraz '"polimer" može izmjenjivo koristiti s izrazom "polimerna molekula". Izraz "šećerna jedinka" namijenjen je da označava ugljikohidratnu molekulu pričvršćenu in vivo ili in vitro glikoziliranjem, kao što je N- ili O-glikoziliranje. Izuzev kada je broj ne-polipeptidnih jedinki, kao što su polimerne molekule, u konjugatu izričito označen, svako navođenje *ne-polipeptidne jedinke" sadržane u konjugatu ili inače upotrijebljeno u predmetnom izumu odnosit će se na jednu ili više ne-polipeptidnih jedinki u konjugatu.

Izraz "povezana grupa" je namijenjen da označava aminokiselinsku grupu sposobnu da se kombinira s relevantnom ne-polipeptidnom jedinkom kao što je polimerna molekula ili šećerna jedinka. Korisne povezane grupe i njihove odgovarajuće ne-polipeptidne jedinke očite su iz tablice dolje.

[image]

[image]

Za in vivo glikoziliranje, izraz "povezana grupa" koristi se na nekonvencionalan način da se označe aminokiseline koje sačinjavaju mjesto za N-glikoziliranje (sa redoslijedom N - X' - S/T/C - X", gdje X' je bilo koja aminokiselina osim prolina, X" je bilo koja aminokiselina koja može ali ne mora biti identična X' i preferirano je različita od prolina, N je asparagin te S/T/C je serin, treonin ili cistein, preferirano serin ili treonin i najviše preferirano treonin). Iako asparagin na mjestu N-glikoziliranja je onaj na koji se jedinka šećera veže za vrijeme glikoziliranja, takvo povezivanje ne može se postići ako nisu prisutne druge aminokiseline mjesta za N-glikozilizranje. Isto tako, kada je ne-peptidna jedinka šećer i konjugiranje se postiže N-glikoziliranjem, izraz aminokiselina koja obuhvaća vezujuću grupu za ne-polipeptidnu jedinku" kao što je upotrijebljen u vezi s promjenama sekvence aminokiselina u polaznom peptidu, treba se shvatiti tako da jedna, dvije ili sve aminokiseline koje sačinjavaju mjesto N-glikoziliranja se mijenjaju na takav način da se ili uvede funkcionalno mjesto za N-glikoziliranje u sekvencu aminokiselina ili se ukloni iz navedene sekvence.

U predmetnoj prijavi, nazivi aminokiselina i nazivi atoma (npr. CA, CB, CD, CG, SG, NZ, N, O, C itd.) upotrebljavaju se kako je definirano u Protein Databank (PDB) (ww.pdb.org) koje se temelji na IUPAC nomenklaturi (IUPAC Nomenclatue and Symbolism for Amino Acids and Peptides (nazivi aminkiselinskih ostataka, nazivi atoma itd), Eur. J. Biocheiru, 138, 9-37 (1984) zajedno s njihovim ispravkom u Eur. J. Biocheiru, 152, l (1985). CA se ponekad označava kao Cα, CB kao Cβ. Izraz "aminokiselinski ostatak" namijenjen je da označava aminokiselinu sadržanu u grupi koja se sastoji od alanina (Ala ili A), cisteina (Cys ili C), aspartanske kiseline (Asp ili D), glutaminske kiseline (Glu ili E), fenilalanina (Phe ili F), glicina (Gly ili G), histidina (His ili H), izoleucina (Ile ili I), lizina (Lys ili K), leucina (Leu ili L), metionina (Met ili M), asparagina (Asn ili N), prolina (Pro ili P), glutamina (Gln ili Q), arginina (Arg ili R), serina (Ser ili S), treonina (Thr ili T), valina (Val ili V), triptofana (Trp ili W) i tirozina (Tyr iliY). Brojanje aminokiselinskih ostataka u ovom dokumentu je od N-terminusa huIFNG bez signalnog peptida (npr. SEQ ID NO 2). Terminologija upotrijebljena za identificiranje položaja/supstitucija aminokiselina ilustrirana je kako slijedi:

N25 (označava da je položaj #25 okupiran asparaginom u redoslijedu aminokiselina pokazanom u SEQ ID NO 2). N25C (označava da je asparagin na položaju 25 zamijenjen cisteinom). Višestruke supstitucije označavaju se s "+", npr. Q1N + P3T/S označava sekvencu aminokiselina koja obuhvaća supstituciju Gln ostatka na položaju 1 asparaginom i supstituciju Pro ostatka na položaju 3 treoninom ili serinom, preferirano Thr.

Izraz "sekvenca nukleotida" je namijenjen da označava odlomak u nizu od dvije ili više nukleotidnih molekula. Sekvenca (redoslijed) nukleotida može biti genomnog, cDNA, RNA, semisintetskog, sintetskog porijekla ili bilo koja njihova kombinacija.

Izraz "lančana reakcija polimeraze" ili "PCR" općenito se odnosi na postupak za umnožavanje željene sekvence nukleotida in vitro, kako je, na primjer, opisano u US4,683,195. Općenito, PCR postupak uključuje ponavljane cikluse ekstenzijske primerne sinteze upotrebom oligonukleotidnih primera sposobnih da se hibridiziraju preferirano na kalup nukleinske kiseline.

"Stanica", "stanica domaćin", "linija stanica" i "kultura stanica" koriste se međuizmjenjivo ovdje i za sve takve izraze treba shvatiti da uključuju potomstvo koje je nastalo iz rasta ili uzgoja stanice. "Transformacija" ili "transfekcija" koriste se međuizmjenjivo i odnose se na postupak za uvođenje DNA u stanicu.

"Operativno vezani" odnosi se na kovalentno vezanje dvije ili više nukeotidnih sekvenci putem enzimatskog vezanja ili drugačije, u konfiguraciji relativno jedna prema drugoj tako da se normalna funkcija sekvenci može odvijati. Na primjer, sekvenca nukleotida koja zapisuje predsekvencu ili sekretorni začetak operativno je vezana na sekvencu nukleotida za polipeptid ako se izražava kao predprotein koji sudjeluje u izlučivanju polipeptida: promotor ili pojačivač je operabilno vezan na sekvencu zapisa ako utječe na transkripciju sekvence; vezno mjesto za ribosom operativno je vezano na sekvencu šifre ako je smješteno tako da olakša translatiranje. Općenito "operativno vezani" znači da su sekvence nukleotida koje bivaju vezane u susjedstvu i, u slučaju sekretornog začetka, u susjedstvu i u fazi za čitanje. Povezivanje se postiže ligacijom na pogodnim restrikcijskim mjestima. Ako takva mjesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili povezivači zajedno sa standardnim metodama rekombinantne DNA.

Izraz "uvesti" primarno je namijenjen da znači supstituciju postojećeg aminokiselinskog ostatka, ali može također značiti umetanje dodatne aminokiseline. Izraz "ukloniti" primarno je namijenjen da znači supstituciju aminokiseline koju se treba ukloniti drugom aminokiselinom, ali može također značiti brisanje (bez supstitucije) aminokiselinskog ostatka koji treba biti uklonjen.

Izraz "aminokiselina koja obuhvaća povezujuću grupu za nepolipeptidnu jedinku" namijenjen je da označava da je aminokiselina ona na koju se ne-polipeptidna jedinka veže (u slučaju uvedene aminokiseline) ili bi se bila vezala (u slučaju uklonjene aminokiseline).

Izraz "jedna razlika" ili "razlikuje se" kako je upotrijebljeno za sekvencu aminokiselina ovdje opisanog IFNG polipeptida namijenjen je da se omoguće dodatne prisutne razlike. Prema tome, dodatno uz specificiranu razliku aminokiselina, mogu se mutirati druge aminokiseline osim onih navedenih.

Izraz "funkcionalno vrijeme poluživota in vivo" koristi se u svom normalnom značenju, tj. vrijeme u kojem 50% konjugiranih molekula cirkulira u plazmi ili krvotoku prije nego se iščisti (također nazvano "serumsko vrijeme poluživota"), ili vrijeme u kojem se zadrži 50% dane funkcionalnosti, Polipeptid ili konjugat se normalno iščisti djelovanjem jednog ili više retikuloendotelijalnog sistema (RES), bubrega, slezene ili jetre, ili specifičnom ili nespecifičnom proteolizom. Normalno čišćenje ovisi o veličini (u odnosu prema presjeku za glomurularno filtriranje), naboju, pričvršćenim ugljikohidratnim lancima i prisutnosti staničnih receptora za protein. Funkcionalnost koja se treba održati normalno se izabere iz antiviralne, antiproliferativne, imunomodulacijske aktivnosti ili aktivnosti vezanja IFNG receptora. Funkcionalno vrijeme poluživota in vivo može se odrediti bilo kojom pogodnom metodom poznatom u struci kako je ovdje dalje raspravljeno u sekciji o metodama.

Izraz "povećano funkcionalno vrijeme poluživota in vivo" koristi se da naznači da je funkcionalno vrijeme vrijeme poluživota konjugata in vivo statistički značajno povećano u odnosu prema onome referentne molekule kao što je huIFNG, po izboru u glikoziliranom obliku, npr. nekonjugirani huIFNG ili rhuIFNG kako je ustanovljeno u usporedivim uvjetima.

Izraz "imunogenost" kako se koristi u vezi s danom tvari namijenjen je da označava sposobnost tvari da inducira odgovor humanog imunog sistema. Imuni odgovor može biti stanični ili odgovor prenesen antitijelima(vidi, npr., Roitt: Essential Immunology (8th Edition, Blackwell) za daljnje definirane imunogenosti).

Izraz "smanjena imunogenost" namijenjen je da označava da konjugat predmetnog izuma dovodi do mjerljivo nižeg imunološkog odgovora nego referentna molekula, kao što je huIFNG ili rhuIFNG, kako je određeno u usporedivim, uvjetima.

Izraz "pokazuje IFNG aktivnost" namijenjen je da označava da polipeptid ima jednu ili više funkcija domaćeg IFNG, naročito huIFNG i rhuIFNG, uključujući sposobnost da se veže na IFNG receptor i uzrokuje transdukciju signala transduciranog što je huIFNG vezao svoj receptor kako je određeno in vitro ili in vivo (tj. in vitro ili in vivo bioaktivnost). Receptor za IFNG opisali su Aguet et al.(Cell 55: 273 - 280, 1988) i Calhedron et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4837 - 4841, 1988). "IFNG polipeptid" je polipeptid koji pokazuje IFNG aktivnost i ovdje se upotrebljava za polipeptid u monomernom ili dimernom obliku, kako je prikladno. Na primjer, kada se indiciraju specifične supstitucije, one se normalno označavaju relativno u odnosu na IFNG polipeptid monomer. Kada se izražava odnos na IFNG dio konjugata izuma, ovo je normalno dimerni oblik (i tako, npr., obuhvaća dva IFNG polipeptid monomera modificirana kako je opisano). Dimerni oblik IFNG polipeptida može se postići normalnom asocijacijom dva monomera ili može biti u obliku jednostrukog lanca dimernog polipeptida.

Ovdje opisan IFNG polipeptid može imati in vitro ili in vivo bioaktivnost iste veličine kao huIFNG ili rhuIFNG ili veću ili manju, npr. in vitro ili in vivo bioaktivnost od 1 - 100 % od one koju ima huIFNG ili rhuIFNG, kako je mjereno u istim uvjetima, npr. 1 - 25 % ili 1 - 50 % ili 25 - 100 % one koju ima huIFNG ili rhuIFNG.

Izraz "polazni IFNG" namijenjen je da označava da molekulu koja će biti modificirana u skladu s predmetnim izumom. Normalno polazni IFNG je kodiran sekvencom nukleotida koja se modificira u skladu s predmetnim izumom tako da kodira polipeptidni dio konjugata izuma. Polazni IFNG normalno je huIFNG ili rhuIFNG ili varijanta ili njihov fragment. "Varijanta" je polipeptid koji se razlikuje u jednom ili više aminokiselinskih ostataka od polaznog polipeptida, normalno u l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka. Fragment je dio potpune huIFNG sekvence koja pokazuje IFNG aktivnost, npr. C-terminalno ili N-terminalno njegova skraćena verzija.

Izraz "funkcionalno mjesto" namijenjen je da označava jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji su esencijalni ili na drugi način uključeni u funkciju ili ponašanje IFNG. Takvi aminokiselinski ostaci "smješteni su" na funkcionalnom mjestu. Funkcionalno mjesto može se odrediti postupcima poznatim u struci i preferirano se određuje analizom strukture polipeptida koji je u kompleksu s relevantnim receptorom kao što je IFNG receptor.

Konjugat izuma

Kao što je gore navedeno, prvi aspekt izuma odnosi se na konjugat koji pokazuje IFNG aktivnost i obuhvaća najmanje jednu prvu ne-polipeptidnu jedinku kovalentno vezanu na IFNG polipeptid, a taj polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence polaznog polipeptida u najmanje jednoj uvedenoj i/ili uklonjenoj aminokiselini koja obuhvaća veznu grupu za ne-polipeptidnu jedinku.

Uklanjanjem ili uvođenjem aminokiseline koja obuhvaća veznu grupu za ne-polipeptidnu jedinku može se specifično prilagoditi polipeptid da molekula bude više podložna konjugiranju na ne-polipeptidnu jedinku po izboru, da se optimizira način konjugiranja (npr. da se osigura optimalna distribucija ne-polipeptidnih jedinki na površini IFNG polipeptida) i tako dobije nova molekula konjugata koja pokazuje IFNG aktivnost i dodatno jedno ili više unaprijeđenih svojstava u usporedbi prema molekulama baziranih na huIFNG ili rhuIFNG koje su danas na raspolaganju. Na primjer, uvođenjem veznih grupa, IFNG polipeptid je pojačan ili promijenjen na drugi način u sadržaju specifičnih aminokiselina na koje se relevantna ne-polipeptidna jedinka veže, čime se postiže efikasnija, specifična i/ili šira konjugacija. Uklanjanjem jedne ili više veznih grupa može se izbjeći konjugacija na ne-polipeptidnu jedinku u dijelovima polipeptida u kojima je takva konjugacija nedostatak, npr. na aminokiselinu smještenu na ili u blizini funcionalnog mjesta polipeptida (s obzirom da bi konjugacija na takvom mjestu mogla dovesti do inaktivacije ili smanjene IFNG aktivnosti nastalog konjugata uslijed oštećenog prepoznavanja receptora). Nadalje, uklanjanje vezne grupe smještene blizu druge vezne grupe može imati prednost za izbjegavanje heterogenog konjugiranja na takve grupe. U preferiranim izvedbama više nego jedna aminokiselina IFNG polipeptida se mijenja, tj. alteracija zahvaća uklanjanje kao i uvođenje aminokiselina koje obuhvaćaju vezna mjesta za ne-polipeptidnu jedinku prema izboru. Ova izvedba se smatra od posebnog interesa jer se može specifično projektirati IFNG polipeptid tako da se dobije optimalno konjugiranje ne-polipeptidne jedinke.

Dodatno uz uklanjanje i/ili uvođenje aminokiseline, polipeptid može obuhvaćati druge supstitucije koje nisu povezane s uvođenjem i/ili ukalanjanjem aminokiselina koje obuhvaćaju veznu rupu za ne-polipeptidnu jedinku. Dok polazni polipeptid koji će se modificirati prema predmetnom izumu može biti bilo koji polipeptid s IFNG aktivnošću i tako se može izvesti iz bilo kojeg ishodišta, npr. ishodište ne-humanog sisavca, preferirano je da je polazni polipeptid huIFNG sa sekvencom aminokiselina prikazanom u SED IQ NO 2 ili njegova varijanta ili segment. Primjeri varijanti hIFNG opisani su gore u pozadini izuma i uključuju, npr., huTFNG s N - terminalnim dodatkom CYC te varijante modificirane cisteinom opisane u US 6,046,034. Specifični primjeri fragmenata su oni izneseni gore u odjeljku Pozadina izuma i uključuju huIFNG C- terminalno skraćen s 1 - 15 aminokiselina, npr. s 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka i/ili N-terminalno skraćen s 1 - 3 aminokiselinskih ostataka.

Razumije se da kada je polazni polipeptid varijanta ili fragment huIFNG, modificirani IFNG polipeptid prepariran iz takvog polaznog obuhvaća mutacije ili skraćivanja polaznog polipeptida.

Također polazni polipeptid može biti hibridna molekula između IFNG polipeptid monomera i drugog homolognog polipeptida koji po izboru može sadržavati jednu ili više supstitucija uvedenih u hibridnu molekulu. Takva hibridna molekula može sadržavati sekvencu aminokiselina koja se razlikuje u više nego 15 tako kao više nego 10 aminokiselina od sekvence aminokiselina prikazane u SED IQ NO 2. Kako bi bila korisna u predmetnom izumu hibridna molekula pokazuje IFNG aktivnost.

Ne-humani polazni IFNG mogu se modificirati analogno onome kako je ovdje opisano, tj. modificiranjem pripadnog položaja na ne-humanom polaznom IFNG (npr. kako je ustanovljeno iz poravnavanja sekvence aminokiselina ili 3D strukture navedenog IFNG s huIFNG) do ovdje opisanog položaja.

Razumjet će se da se aminokiselina koja obuhvaća veznu grupu za ne - polipeptidnu jedinku, bilo da je ona uklonjena ili uvedena, izabere na osnovu prirode dijela izbora po ne-polipeptidnoj jedinki i, u većini slučajeva, na osnovu postupka konjugacije koji će se upotrijebiti. Na primjer, kada je ne-polipeptidna jedinka molekula polimera kao što je molekula izvedena iz polietilen glikola ili polialkilen oksida, aminokiseline sposobne da djeluju kao vezna grupa mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od cisteina, lizina, aspartanske kiseline, glutaminske kiseline i arginina. Kada je ne-polipeptidna jedinka jedinka šećera, vezna grupa je, npr. na in vivo mjestu glikoziliranja, preferirano mjestu N-glikoziliranja.

Kada se vezna grupa za ne-polipeptidnu jedinku uvodi ili uklanja iz IFNG polipeptida u skladu s predmetnim izumom, položaj polipeptida koji se modificira pogodno se izabere kako slijedi:

Položaj je preferirano smješten na površini IFNG polipeptida i, više preferirano, na njemu je aminokiselina koja ima više od 25% svojeg pokrajnjeg lanca izloženo otapalu, preferirano više nego 50% svojeg pokrajnjeg lanca izloženo otapalu, kako je utvrđeno na osnovu 3D strukture ili modela IFNG u njegovom dimernom obliku, struktura ili model dalje opcionalno obuhvaća jednu ili dvije molekule receptora IFNG. Takvi položaji (npr. predstavljanje više od 25% ili više nego 50% izloženosti površine u modelu s ili bez molekula receptora) popisani su ovdje u odjeljku Materijali i metode.

Također je interesantno da se modificira neka od 23 C-terminalne aminokiseline polaznog IFNG (uvođenjem i/ili modificiranjem aminokiselinskih ostataka koji obuhvaćaju veznu grupu za ne-polipeptidnu jedinku) s obzirom da se vjeruje da su takvi ostaci smješteni na površini IFNG polipeptida.

Dalje, na IFNG polipeptidnog dijela konjugata izuma, vezne grupe smještene na mjestu vezanja receptora IFNG preferirano su bile uklonjene, preferirano supstituiranjem aminokiselina koje obuhvaća takva grupa. Aminokiselinski ostaci mjesta vezanja receptora IFNG identificirane su dolje u odjeljku Materijali i metode. U slučaju IFNG polipeptida s jednostrukim lancem može biti dovoljno da se ukloni vezne grupe na mjestu vezanja receptora samo jednog od monomera i tako se dobije jednolančani konjugat IFNG polipeptida s jednim aktivnim i jednim neaktivnim mjestom vezanja receptora.

Kako bi se mogla odrediti optimalna distribucija veznih grupa, udaljenost između aminokiselina smještenih na površini IFNG polipeptida izračuna se na osnovi 3D strukture IFNG dimernog polipeptida. Određenije, odredi se udaljenost između CB aminokiselinskih ostataka koji obuhvaćaju takve vezne grupe ili udaljenost između funkcionalne grupe (NZ za lizin, CG za asparaginsku kiselinu, CD za glutaminsku kiselinu, SG za cistein) jedne i CB neke druge aminokiseline koja obuhvaća veznu grupu. U slučaju glicina koristi se ČA umjesto CB. U IFNG polipeptidnom dijelu konjugata iuma, bilo koja od navedenih udaljenosti je preferirano više od 8 A, određenije više od 10 A, kako bi se izbjegla ili smanjila heterogena konjugacija.

Također, sekvenca aminokiselina IFNG polipeptida može se razlikovati od polaznog polipeptida u tome da je uklonjena jedna ili više aminokiselina koje tvore dio epitopa, preferirano supstitucijom do aminokiseline koja obuhvaća veznu grupu za ne-polipeptidnu jedinku tako da se uništi ili deaktivira epitop. Epitopi od huIFNG ili rhuIFNG mogu se identificirati korištenjem postupaka poznatih u struci, također poznatih kao mapiranje epitopa, vid, npr. Romagnoli et al., Biol. Chem., 1999, 380 (5): 553 - 9; DeLisser HM, Methods Mol. Biol., 1999, 96: 11 - 20; Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 1997, 83 (3): 229 - 35; Saint-Remy JM, Toxicoligy, 1997, 119 (1): 77 - 81; i Lane DP and Stephen CW, Curr. Opin. Immunol., .1993, 5, (2): 268 - 71. Jedan postupak je da se uspostavi pokazna biblioteka faga ekspresije slučajnh oligopeptida od npr. 9 aminokiselina. IgG1 antitijela iz specifičnih antiseruma za huIFNG ili rhuIFNG pročiste se imunoprecipitacijom i reaktivni fagi se odrede imunološkim mrljama. Određivanjem sekvence DNA pročišćenih reaktivnih faga može se odrediti sekvenca oligopeptida nakon čega slijedi lokaliziranje sekvence na 3D strukturi IFNG. Tako identificirano područje na strukturi čini epitop koji se onda može izabrati kao ciljno područje za uvođenje vezne grupe za ne-polipeptidnu jedinku.

Da se izbjegne previše ometanja strukture i funkcije polazne IFNG molekule, ukupni broj aminokiselina koje se mijenjaju u skladu s predmetnim izumom (u usporedbi s sekvencom aminokiselina prikazanom u SEQ ID NO 2) tipično ne prelazi 15. Preferirano IFNG polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje u 1 - 15 aminokiselina od sekvence aminokiselina prikazane u SEQ ID NO 2, kao što je u 1 - 8 ili 2-8 aminokiselinskih ostataka, npr. u 1- 5 ili 2-5 aminokiselina iz sekvence aminokiselina prikazane u SEQ ID NO 2. Tako normalno IFNG polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od zrelog dijela sekvence aminokiselina prikazane u SEQ ID NO 2 u 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka. Preferirano gornji brojevi predstavljaju ili ukupni broj uvedenih aminokiselina ili ukupni broj uklonjenih aminokiselina koje obuhvaćaju veznu grupu za relevantnu ne-polipeptidnu jedinku(e), ili ukupni broj uvedenih ili uklonjenih aminokiselina koje obuhvaćaju takvu skupinu. Točan broj veznih grupa na raspolaganju za konjugaciju i prisutnih u IFNG polipeptidu u dimernom obliku ovisi o efektu koji se želi postići konjugacijom. Efekt koji će se postići ovisi, npr., o prirodi i stupnju konjugacije (npr. vrsti ne-polipeptidne jedinke, broju ne-polipeptidnih jedinki koje se želi ili može konjugirati na polipeptid, gdje bi trebale biti

konjugirane ili gdje bi konjugaciju trebalo izbjegavati itd.).

IFNG polipeptidni dio konjugata izuma može biti u skraćenom obliku (npr. skraćen za 1 - 15 C-terminalnih aminokiselina kako je opisano dalje gore u vezi s polaznim IFNG polipeptidom ili skraćen za 1 - 3 N-terminalne aminokiseline).

Funkcionalno vrijeme poluživota in vivo ovisi, npr., o molekulskoj težini konjugata i broj veznih grupa potrebnih da se omogući povećano vrijeme poluživota tako ovisi o molekulskoj težini ne-polipeptidne jedinke o kojoj se radi. U jednoj izvedbi, konjugat izuma ima molekulsku težinu najmanje 67 kDa, određenije najmanje 70 kDa kako je mjereno pomoću SDS-PAGE prema Laemmli, U.K. Nature, Vol. 227 (1970), p 690 -85. IFNG ima molekulsku težinu u području oko 3 - 50 kDa i tako je potrebno dodatnih 20 - 40 kDa da se postigne željeni efekt. Ovo se može postići npr. s 2 - 4 kDa PEG molekula ili drugačije kako je ovdje opisano.

U konjugatu izuma preferirano je da su najmanje oko 50 % ili sve vezne grupe, kao što je najmanje 80 % i preferirano sve takve grupe okupirane relevantnom ne-polipeptidnom jedinkom. U skladu s tim, u preferiranoj izvedbi konjugat izuma obuhvaća npr. 1-10 ne-polipeptidnih jedinki kao što je 2 - 8 ili 3-6.

Kao što je gore navedeno, u fiziološkim uvjetima IFNG postoji kao dimerni polipeptid. U skladu s izumom, IFNG polipeptidni dio konjugata izuma normalno je u homodimernom obliku (npr. prepariran asocijacijom dvije IFNG polipeptidne molekule priređene kako je ovdje opisano). Međutim, ako se želi može se polipeptidni dio konjugata izuma prirediti u obliku jednostrukog lanca gdje su dva IFNG polipeotidna monomera povezana peptidnom vezom ili peptidnim povezivačem. Priređivanje IFNG polipeptida u obliku jednostrukog lanca ima prednost da dva tvoreća polipeptida mogu biti različita što može imati prednost,-npr. da se omogući asimetrična mutageneza polipeptida. Na primjer, mjesta PEGiliranja mogu se ukloniti s mjesta vezanja receptora na jednom od monomera ali zadržati na drugom. Tako nakon PEGiliranja jedan monomer ima nedirnuto mjesto vezanja receptora dok drugi može biti potpuno PEGiliran (i tako pruža značajno povećanu molekulsku težinu).

Preferirano konjugat izuma ima jedno ili više od sljedećih poboljšanih svojstava:

1) Povećano funkcionalno vrijeme poluživota in vivo u usporedbi s huIFNG ili rhuIFNG, npr. povećanje od najmanje 5 puta, kao što je najmanje 10 puta ili čak više.

2) Smanjenu imunogenost u usporedbi s huIFNG ili rhuIFNG, npr. smanjenje od najmanje 25%, kao što je najmanje 50% i, više preferirano, najmanje 75%.

Konjugat izuma gdje je ne-polipeptidna jedinka šećerna jedinka

U preferiranoj izvedbi konjugata izuma prva ne-polipeptidna jedinka je šećerna jedinka, npr. O - vezan ili N - vezan šećer, i IFNG polipeptid obuhvaća najmanje jedno uklonjeno i/ili jedno uvedeno mjesto in vivo glikoziliranja.

Na primjer, mjesto in vivo glikoziliranja se uvodi na položaj polaznog IFNG polipeptida zauzeto aminokiselinom koja je izložena na površini polipeptida, preferirano s više nego 25% pokrajnjeg lanca izloženog otapalu, određenije više od 50% izloženog otapalu (ovi položaji su ovdje identificirani u odjeljku Metoda). Mjesto N-glikoziliranja se uvodi na takav način da je N - ostatak navedenog mjesta smješten na navedenom položaju. Analogno, mjesto O-glikoziliranja se uvodi tako da je S ili T ostatak koji tvori takvo mjesto smješten na navedenom položaju. Dalje, kako bi se osiguralo efikasno glikoziliranje, preferirano je da je mjesto in vivo glikoziliranja, određenije N-ostatak mjesta N-glikoziliranja ili S ili T ostatak mjesta O-glikoziliranja, smješteno unutar 118 N-terminalnih aminokiselina IFNG polipeptida, više preferirano unutar 93 N -terminalne aminokiseline. Još više preferirano, mjesto in vivo glikoziliranja uvodi se na položaj gdje je potrebna samo jedna mutacija za stvaranje mjesta (tj. gdje su bilo koje druge aminokiseline potrebne za stvaranje funkcionalnog mjesta glikoziliranja već prisutne u molekuli).

Na primjer, supstitucije koje vode do uvođenja dodatnog mjesta za N-glikoziliranje na položaju izloženog na površini IFNG polipeptida i zauzetog aminokiselinama koje imaju više od 25 % pokrajnjeg lanca izloženog na površini (u strukturi s molekulama receptora) uključuju:

Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, GISR, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41Sn, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N-KJ67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, NSSS^, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N-HF92S/T, E93N+L95SH, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T. D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+ A141S/T, R140N i R140N+S142T,

supstitucija je označena relativno prema huIFNG sa sekvencom aminokiselina prikazanom u SEQ ID NO 2. S / T označava supstituciju u serin ili treonin, preferirano treonin.

Supstitucije koje dovode do uvođenja dodatnog mjesta N-glikoziliranja na položajima izloženim na površini IFNG polipeptida koji imaju više od 50% pokrajnjeg lanca izloženog na površini (u strukturi s molekulama receptora) uključuju:

P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15SAT, G18S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40S/T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, D62N-Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N i R140N+S142T,

supstitucija je označena relativno prema huIFNG sa sekvencom aminokiselina prikazanom u SEQ ID NO 2 .

Supstitucije gdje je potrebna mutacija samo jedne aminokiseline za uvođenje mjesta N-glikoziliranja uključuju

K12S/T, G18S.T, G18N, K37S/T, E38N, M45N, I49N, K61S/T, D63N, Q67N, V70N, K80S/T, F82N, N85S/T, K87S/T, K94N, S99N, Q106S/T, E119N, A124N, K130N i R140N, posebno K12S/T, G18N, G18S/T, K37S/T, E38N, K61S/T, D63N, Q67N, K80S/T, N85S/T, K94N, S99N, Q106S/T, A124N, K130N, i R140N

(položaji s više od 25 % pokrajnjeg lanca izloženog na površini (u strukturi bez molekula receptora), ili više preferirano

G18N, E38N, D63N, Q67N, K94N, S99N, A124N, K130N i R140N

(s više od 50 % pokrajnjeg lanca izloženog na površini u strukturi bez molekula receptora).

Iz gornjeg popisa supstitucija, preferirano je izabrati supstituciju smještenu unutar 118 N-terminalnih aminokiselina, određenije unutar 93 N-terminalne aminokiseline.

Kao što je gore naznačeno, dodatno uz jedno ili više uvedenih mjesta glikoziliranja, postojeća mjesta glikoziliranja mogu se ukloniti sa IFNG polipeptida. Na primjer, bilo koja od gore navedenih supstitucija za uvođenje mjesta glikoziliranja može se kombinirati sa supstitucijom za uklanjanje bilo koja od dva prirodna mjesta N-glikoliziranja na huIFNG. Na primjer, IFNG polipeptid može obuhvaćati supstituciju N25 i/ili N97, tj. jednu od supstitucija N25K/C/D/E i/ili N97K/C/D/E, ako konjugat izuma obuhvaća ne-polipeptidni peptid koji ima relevantno od K, C, D, E kao vezne grupe.

IFNG polipeptidni dio konjugata izuma može sadržavati jedan pr monomer mjesta in vivo glikoziliranja. Međutim, da postane dovoljno velik za produživanje in vivo vremena poluživota, često je poželjno da polipeptid obuhvaća više nego jedno mjesto in vivo glikoziliranja, određenije 2-7 mjesta in vivo glikoziliranja, kao što je 2, 3, 4, 5, 6 ili 7 mjesta in vivo glikoziliranja. Tako IFNG polipeptid može obuhvaćati jedan dodatni pr monomer mjesta in vivo glikoziliranja, ili može obuhvaćati dva, tri, četiri, pet, šest, sedam ili više uvedenih mjesta in vivo glikoziliranja, preferirano uvedenih jednom ili više supstitucija opisanih u bilo kojem od gornjih popisa.

Uklanjanje i/ili uvođenje mjesta in vivo glikoziliranja može se postići kao što je opisano u sljedećim potpoglavljima o modificiranju IFNG polipeptida da se uvede i/ili ukloni mjesto vezanja polimera.

Bilo koji od iznesenih glikoziliranih IFNG polipeptida u predmetnom odjeljku, nakon što je uvedeno i/ili uklonjeno najmanje jedno mjesto glikoziliranja, može se dalje konjugirati na drugu ne-polipeptidnu jedinku. Na primjer, druga ne-polipeptidna jedinka je molekula polimera, kao što je PEG, ili bilo koja druga ne-polipeptidna jedinka. Za ovu svrhu konjugiranje se može postići korištenjem veznih grupa koje su već prisutne u IFNG polipeptidu ili veznih grupa koje su uvedene i/ili uklonjene, određenije tako da je ukupno 1-6, određenije 3-4 ili 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 veznih grupa na raspolaganju za konjugiranje. Preferirano, u konjugatu izuma gdje IFNG polipeptid obuhvaća dva mjesta glikoziliranja, broj i molekulska težina ne-polipeptidne jedinke se izabere tako da je ukupna molekulska težina dodana ne-polipeptidnom jedinkom u rasponu 20 - 40 kDa, određenije oko 20kDa ili 30kDa.

Određenije, glikozilirani IFNG polipeptid može se konjugirati na polimer koji ima cistein kao veznu grupu. Za ovu svrhu jedan ili više cisteinskih ostataka umetne se u IFNG polipeptid, npr. kako je opisano u odjeljku naslova "Konjugat izuma gdje je ne-polipeptidna jedinka molekula koja ima cistein kao veznu grupu".

Alternativno ili dodatno, glikozilirani IFNG polipeptid može se konjugirati na polimer koji ima lizin kao veznu grupu. Za ovu svrhu jedan ili više lizinskih ostataka na polaznom polipeptidu moglo se ukloniti, npr., bilo kojom od supstitucija navedenih u odjeljku označenom "Konjugat izuma gdje je ne-polipeptidna jedinka molekula koja ima lizin kao veznu grupu". Alternativno ili dodatno, lizin je mogao biti uveden, npr., bilo kojom od supstitucija spomenutih u navedenom odjeljku.

Kao alternativa konjugaciji polimera putem cisteinske ili lizinske grupe, konjugacija se može postići pomoću kisele skupine kako je opisano u odjeljku naslova "Konjugacija izuma gdje se ne-polipeptidna jedinka veže na kiselinsku grupu" ili putem bilo koje pogodne skupine.

Konjugat izuma gdje je prva ne-polipeptidna jedinka polimer

U alternativnoj izvedbi prva ne-polipeptidna jedinka je polimer, npr. bilo koji od onih opisanih u odjeljku naslova "Konjugacija na molekulu polimera", određenije na linearnu ili razgranatu PEG molekulu, npr. koja ima cistein, lizin, aspartansku kiselinu i glutaminsku kiselinu kao veznu grupu. Uvođenje i/ili uklanjanje vezne grupe za takav polimer prikazano je u sljedećim odjeljcima. IFNG polipeptidni dio konjugata prema ovoj izvedbi može biti glikozilirani polipeptid, npr. korištenjem jednog ili oba prirodna mjesta N-glikoziliranja na huIFNG ili uvedenog mjesta glikoziliranja kako je opisano u neposredno prethodnom odjeljku.

Konjugat izuma gdje je ne-polipeptidna jedinka molekula koja ima cistein kao veznu grupu

U preferiranoj izvedbi prva ne-polipeptidna jedinka je polimer koji ima cistein kao veznu grupu i najmanje jedan cisteinski ostatak uveden je na položaj IFNG polipeptida koji je u divljem tipu humanog IFNG zauzet aminokiselinskim ostatkom izloženim na površini. Preferirano, cistein se uvodi u skladu s općenitim razmatranjem za uvođenje i/ili uklanjanje vezne grupe za ne-polipeptidnu jedinku opisano u odjeljku naslova "Konjugacija izuma". Na primjer, IFNG polipeptid može obuhvaćati najmanje jednu supstituciju izabranu iz grupe koja se sastoji od P3C, K6C, N10C, K13C, N16C, D21C, N25C, G26C, G31C, K34C, K37C, E38C, E39C, K55C, K58C, N59C, D62C, Q64C, S65C, K68C, E71C, E75C, N83C, S84C, K86C, K87C, K94C, N97C, S99C, T101C, D102C, L103C i N104C (uvođenje cisteina na položaj koji zauzima aminokiselina koja ima više od 50 % pokrajnjeg lanca izloženo na površini u strukturi sa receptorom). Supstitucije N25C i N97C su naročito zanimljive, i naročito N25C + N97C kada je IFNG polipeptid izražen u ne-glikozilirajućom stanici domaćinu, kao što je E. coli, s obzirom da N25C i N97C čine dio inherentnog mjesta glikoziliranja na huIFNG.

Također ili alternativno, IFNG polipeptid prema ovoj izvedbi može obuhvaćati najmanje jedan cistein uveden na položaj zauzet bilo kojom od aminokiselina 121 - 143 na huIFNG.

Preferirano, IFNG polipeptid konjugata prema ovom aspektu obuhvaća ukupno 1-8, kao što je 2-6 Cys ostataka, npr. 1-3 Cys ostataka po monomeru.

Konjugacija između polipeptida i polimera može se postići na bilo koji prikladan način, npr. kako je opisano u odjeljku naslova "Konjugiranje na polimernu molekulu", npr. korištenjem postupka s jednim korakom ili na postepen način o kojem se govori u navedenom odjeljku. Kada konjugat obuhvaća dvije ili više ne-polipeptidnih jedinki, normalno svaka od ovih ima molekulsku težinu 5 ili 10 kDa. Prikladan polimer je VS - PEG.

Konjugat izuma gdje je ne-polipeptidna jedinka molekula koja ima lizin kao veznu grupu

U skladu s ovom izvedbom ne-polipeptid je polimer koji ima lizin kao veznu grupu i IFNG polipeptid je modificiran tako da je najmanje jedan lizin uklonjen, a lizin se izabere iz grupe koja se sastoji od K6, K12, K13, K34, K37, K43, K55, K58, K61, K68, K74, K80, K86, K87, K88, K94, K108, K125, K128 i K130 gdje se brojenje vrši relativno prema SEQ ID NO 2. Više preferirano, najmanje jedan lizin izabran iz grupe koja se sastoji od K12, K34, K37, K108, K128 i K130 se ukloni. Prema tome se konjugiranje ovog/ovih ostataka može izbjeći. Lizin se može zamijeniti bilo kojom drugom aminokiselinom, ali se preferirano nadomjesti argininom ili glutaminom.

Nadalje, IFNG polipeptid može se modificirati tako da se uvede jedan ili više lizina, određenije na položaj na huIFNG zauzet aminokiselinom izloženom na površini. Preferirano se lizin uvodi u skladu s općim razmatranjima za uvođenje i/ili uklanjanje veznih grupa za ne-polipeptidnu jedinku opisanim u odjeljku naslova "Konjugat izuma", određenije na položaju na kojem se nalazi aminokiselina koja ima najmanje 25 %, kao što je najmanje 50% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini (takvi položaji označeni su ovdje u odjeljku "Materijali i metode"). Također najmanje jedan lizin može se uvesti supstitucijom bilo koje od aminokiselina 121 - 143 u SEQ ID NO 2. Alternativno, IFNG polipeptid može obuhvaćati lizin na najmanje jednom položaju izabranom iz grupe koja se sastoji od D2, E7, E9, H19, D21, D24, N25, E38, E39, D41, R42, D62, D63, E71, E75, D76, R89, D90, D91, E93, N97, R107, H111, E112, E119, R129, R131, R137, R139 i R140 u SEQ ID NO 2 (položaji na kojima se nalaze aminokiselinski ostaci N, R, D, E ili H u huIFNG).

U skladu s ovom izvedbom, IFNG polipeptid obuhvaća supstituciju na jednom ili više gornjih položaja, određenije na 1-15, kao što je 1-8 ili 2-8, preferirano položajima 1-5 ili 2-5 (uklanjanje i/ili uvođenje lizina) po monomeru. Na primjer, IFNG polipeptid može obuhvaćati supstituciju na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 113, 14 ili 15 gornjih položaja. Supstitucije N25K i N97K su od naročitog interesa, a posebno N25K + N97K, kada dolazi do ekspresije IFNG polipeptida u neglikozilirajućoj stanici domaćinu, kao što je E. coli, s obzirom da N25K i N97K čine dio inherentnog mjesta glikoziliranja na huIFNG.

Na primjer, IFNG polipeptid konjugata prema ovoj izvedbi može obuhvaćati najmanje jednu od gornjih supstitucija za uvođenje lizina u kombinaciji s najmanje jednom supstitucijom uklanjanja lizina kako je gore definirano (preferirano supstitucija u R ili Q). Na primjer, IFNG polipeptid obuhvaća najmanje jednu od sljedećih supstitucija N25K i N97K u kombinaciji s najmanje jednom od supstitucija K128R, K128Q, K130R i R130Q. Još više specifično, IFNG polipeptid obuhvaća supstituciju N25K+K128R, N25K+KI30R. N25K+K128R+K130R, N97K+K128R, N97K+K130R, N97K+K128R+K130R, N25K+N97K+K128R+K130R, N25K+N97K+K12SR i N25K+N97K+K130R.

Dok ne-polipeptidna jedinka konjugata prema ovom aspektu izuma može biti bilo koja molekula koja, kada se koristi dani postupak konjugiranja, ima lizin kao veznu grupu (kao što je jedinka šećera, lipofilna grupa ili organsko sredstvo za deriviranje),preferirano je da je ne-polipeptidna jedinka polimerna molekula. Polimerna molekula može biti bilo koja od molekula navedenih u odjeljku naslova "Konjugacija na molekulu polimera", ali se preferirano izabere iz grupe koja se sastoji od ravnog ili razgranatog polietilen glikola ili polialkilen oksida. Najviše preferirano, polimerna molekula je SS-PEG, NPC-PEG, aldehid-PEG, mPEG-SPA, mPEG-SCM ili mPEG-BTC iz Shearwater Polymers Inc., SC- PEG iz Enzon Inc., tresilirani mPEG kako je opisano u US 5,880,255 ili oksikarboni1-oksi-N-dikarboksiimid-PEG (US 5,122,614). Normalno za konjugiranje na lizin ne-polipeptidna jedinka ima molekulsku težinu oko 5 ili 10 kDa.

Konjugat izuma gdje se ne-polipeptidna jedinka veže na kiselu grupu

U dalje još jednoj izvedbi ne-polipeptidna jedinka konjugata izuma je molekula koja ima kiselu veznu grupu, a IFNG polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od sekvence aminokiselina prikazane u SEQ ID NO 2 u tome da je najmanje jedna aminokiselina izložena na površini supstituirana aspartanskom kiselinom ili glutaminskom kiselinom, preferirano u skladu s općenitim razmatranjima iznesenim u odjeljku naslova "Konjugat izuma". Alternativno, Asp ili Glu može se uvesti na položaj gdje se na polaznom IFNG polipeptidu nalazi K, R, Q ili N. Na primjer, N25, N97, K125, K128, R129, K130 i/ili R131, više preferirano N25 i/ili N97, najviše preferirano N25 + N97, može biti supstituirano Asp ili Glu ostatkom.

Analogno onome što je opisano u prethodnim dijelovima, jedan ili više Asp ili Glu može se ukloniti, npr. s mjesta vezanja receptora, u slučaju da je ne-polipeptidna jedinka ona koja se veže na te aminokiseline.

Dok ne-polipeptidna jedinka konjugata prema ovom aspektu izuma koja ima kiselu grupu kao veznu grupu može biti ne-polipeptidna jedinka s takvim svojstvom, predmetno se preferira da je ne-polipeptidna jedinka molekula polimera ili organsko sredstvo za derivatiziranje, određenije polimerna molekula, te se konjugat preparira , npr. kao što je opisano u Sakane i Pardridge, Pharmaceutical Research, Vol. 14, No. 8, 1997, pp 1085 - 1091.

Ne-polipeptidna jedinka konjugata izuma

Kao što je gore naznačeno ne-polipeptidna jedinka konjugata izuma se preferirano izabere iz grupe koja se sastoji od polimerne molekule, lipofilnog spoja, šećerne jedinke (npr. na način in vivo glikoziliranja) i organskog sredstva za derivatiziranje. Svako od ovih sredstava može prenijeti poželjna svojstva polipeptidnom dijelu konjugata, naročito povećano vrijeme poluživota in vivo i/ili smanjenu imunogenost. Polipeptidni dio konjugata normalno se konjugira samo na jednu vrstu ne-polipeptidne jedinke, ali može također biti konjugiran na dvije ili više vrsta ne-polipeptidne jedinke, npr. na polimernu molekulu i šećernu jedinku, na lipofilnu skupinu i šećernu jedinku, na organsko sredstvo za derivatiziranje i šećernu jedinku, na lipofilnu skupinu i polimernu molekulu itd. Konjugiranje dviju ili više ne-polipeptidnih jedinki može se učinit simultano ili jedno za drugim.

Postupci za preparaciju konjugata izuma

U sljedećim odjeljcima "Konjugacija na lipofilni spoj", "Konjugacija na polimernu molekulu", "Konjugacija na šećernu jedinku" i "Konjugacija na organsko sredstvo za derivatiziranje" opisano je konjugiranje na specifične tipove ne-polipeptidne jedinke.

Konjugacija na lipofilni spoj

Polipeptid i lipofilni spoj mogu se konjugirati jedan na drugi, direktno ili putem povezivača. Lipofilni spoj može biti prirodni spoj kao što je zasićena ili nezasićena masna kiselina, diketon masne kiseline, terpen, prostaglandin, vitamin, karotenoid ili steroid, ili na sintetički spoj kao što je ukljikova kiselina, alkohol, amin i sulfonska kiselina s jednim ili više alkila, arila, alkenila ili drugih višestrukih nezasićenih spojeva. Konjugiranje između polipeptida i lipofilnog spoja, po izboru preko povezivača, može se provesti postupcima poznatim u struci, npr. kako je opisao Bodanszky u Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976 i u WO 96/12505.

Konjugacija na polimernu molekulu

Polimerna molekula koja se veže s polipeptidom može biti bilo koja prikladna polimerna molekula kao što je prirodni ili sintetički homo-polimer ili heteropolimer, tipično molekulske težine u rasponu 300 - 100000 Da, kao što je 300 - 20000 Da, više preferirano u rasponu 500 - 10000 Da, još više preferirano u rasponu 500 - 5000 Da.

Primjeri homopolimera uključuju poliol (tj. poli-OH), poliamin (tj. poli-NH2) i polikarboksilnu kiselinu (tj. poli-COOH). Heteropolimer je polimer koji obuhvaća jednu ili više grupa, kao što je, npr., hidroksilan skupina i aminska skupina.

Primjeri prikladne polimerne molekule uključuju polimerne molekule izabrane iz grupe koja se sastoji od polialkilen oksida (PAO), uključujući polialkilen glikol (PAG), kao što je polietilen glikol (PEG) i polipropilenglikol (PPG), razgranatih PEG, polivinilnog alkohola (PVA), polikarboksilata, polo-(vinilpirolidona), anhidrida polietilen-ko-maleinske kiseline, anhidrida polistiren-ko-maleinske kiseline, dekstrana uključujući karboksimetil-dekstran ili bilo kojeg biopolimera koji je pogodan za smanjivanje imunogenost i/ili povećanje funkcionalnog in vivo vremena poluraspada i/ili serumskog vremena poluraspada. Drugi primjer polimerne molekule je humani albumin ili drugi protein plazme kojeg ima u velikim količinama. Općenito, polimeri izvedeni iz polielkilen glikola su bikompatibilni, netoksični, neantigeni, neimumogeni, imaju raznolika svojstva- topljivosti u vodi lako se izlučuju iz živog organizma.

PEG je preferirana polimerna molekula koja se upotrebljava s obzirom da ima samo nekoliko reaktivnih skupina koje se mogu unakrsno povezati, u usporedbi s npr., polisaharidima kao što je dekstran, i slično. Određenije, monofunkcijski PEG, npr. monoetoksipolietilen glikol (mPEG) zanimljiv je jer je kemija njegovog povezanog ponašanja relativno jednostavna (samo jedna reaktivna grupa raspoloživa je za knjugiranje s veznim grupama na polipeptidu). Stoga je rizik unakrsnog povezivanja uklonjen, nastali konjugati polipeptida su više homogeni i rekcija polimernih molekula s polipeptidom se lakše kontrolira.

Da se postigne kovalentno vezanje polimerne(ih) molkule(a) na polipeptid, hidroksilne grupe na kraju polimera moraju biti u aktivnom obliku, tj. s reaktivni mfunkcionalnim skupinama (njihovi primjeri uključuju primarne amino skupine, hidrazid (HZ), tiol, sukcinat (SUC), sukcinimidil sukcinat (SS), sukcinimidil sukcinamid (SSA), sukcinimidil propionat (SPA), sukcinimidil karboksimetilat (SCM), benzotriazolkarbonat (BTC), N-hidroksi sukcinimid (NHS), aldehid, nitrofenilkarbonat (NPC) i trezilat (TRES)). Prikladno aktivirane molekule polimera komercijalno su na raspolaganju, npr. od Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Al, USA. Alternativno, polimerne molekule mogu se aktivirati uobičajenim postupcima poznatim u struci, npr. kako je izneseno u WO 90/13540. Specifični primjeri aktiviranih ravnolančanih ili razgranatih polimernih molekula za upotrebu u predmetnom izumu opisani su u katalozima Shearwater Polymers, Inc. za 1997 i 2000 Catalogs (Functionalized Biocompatible Polymers for Research and phannaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives, ovdje uključeni putem reference). Specifični primjeri aktiviranih PEG polimera uključuju sljedeće linearne PEG:

NHS-PEG (e.g. SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, i SCM-PEG), i NOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, AIJD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG i MAL-PEG te razgranate PEG kao što je PEG2-NHS i one iznesene u US 5,932,462 i US 5,643,575, koje su obadvije reference ovdje uključene kao reference. Nadalje,sljedeće publikacije, uključene ovdje putem referenci, kemiju PEGiliranja:

US 5,824,778, US 5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, US 4,902,502, US 5,281,698, US 5,122,614, US 5,219,564, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, US 5,736,625, WO 98/05363, EP 809 996, US 5,629,384, WO 96/41813, WO 96/07670, US 5,473,034, US 5,516,673, EP 605 963, US 5,382,657, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 and EP 154 316.

Konjugiranje polipeptida i aktivirane polimerne molekule provodi se putem bilo kojeg konvencionalnog postupka, npr. kako je opisano u sljedećim referencama ( koje također opisuju pogodne postupke za aktiviranje polimernih molekula) Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington; RJ7. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamcntal and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), MChcmistiy of Protein Conjugation and Cresslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et aL. (1993), Timnobilized Affinity Ugand TechniquesH, Academic Press, N.Y.). Stručnjak će biti svjestan da postupak aktiviranja i/ili kemija aktiviranja koja će se upotrijebiti ovisi o veznoj grupi na IFNG polipeptidu kao i o funkcionalnim skupinama polimera (npr. ako je amino skupina, hidroksilna skupina, karboksilna skupina, aldehidna skupina ili sulfidrilna skupina).PEGiliranje se može usmjeriti prema konjugaciji na sve raspoložive vezne skupine na polipeptidu (tj. takve vezne grupe koje su izložene na površini polipeptida) ili mogu biti usmjerene na specifične vezne skupine, npr. N-terminalnu amino skupinu (US 5,985,265). Nadalje, konjugacija se može postići u jednom koraku ili postepeno (npr. kako je opisano u WO 99/55377).

Razumije se da je PEGiliranje planirano da proizvede optimalnu molekulu s obzirom na broj vezanih PEG molekula, veličinu i oblik (npr. da li su ravnolančane ili razgranate) takvih molekula te gdje se takve molekule vežu na polipeptid. Na primjer, molekulska težina polimera koji se koristi može se izabrati na osnovu efekta koji se želi postići. Na primjer, ako je primarna namjena kojnugacije da se postigne konjugat velike molekulske težine (npr. da se postigne klirens bubrega), obično je poželjno da se konjugira koliko je moguće malo polimernih molekula velike molekulske težine da se postigne željena molekulska težina. Kada je poželjan visok stupanj epitopnog zasjenjivanja, to se može postići korištenjem dovoljno velikog broja polimera male molekulske težine (npr. molekulske težine oko 5000 Da) da se efikasno zasjene svi ili većina epitopa polipeptida. Na primjer, može se upotrijebiti 2-8, kao što je 3-6, takvih polimera.

U vezi s konjugiranjem na samo jednu veznu grupu na proteinu (kao što je opisano u US 5,985,265), može imati prednost da polimerna molekula, koja može biti ravnolančana ili razgranata, ima veliku molekulsku težinu , npr. oko 20 kDa.

Normalno se konjugiranje polimera odvija u uvjetima koji su ciljani da reagiraju sve rasoložive vezne grupe polimera s polimerskim molekulama. Tipično je molarni odnosm aktiviranih polimernih molekula prema polipeptidu 1000 - 1, određenije 200 - 1, preferirano 100 - 1, kao što je 10 - 1 ili 5 - 1, da se postigne optimalna reakcija. Međutim, mogu se koristiti i ekvimolarni odnosi.

Također se prema izumu razmatra povezivanje polimernih molekula s polipeptidom putem povezivača. Prikladni povezivači dobro su poznati stručnjaku. Preferirani primjer je cinaurični klorid (Abuchowskietal., (1977), J. Biol. Chem.,252,3578-3581;US 4,179337; Shafer et al., (1986), J. Polyra. Sci. Polym. Chem. Ed, 24,375-378.

Nakon konjugiranja, preostale aktivirane polimerne molekule blokiraju se prema postupcima poznatim u struci, npr. dodavanjem primanog amina u reakcijsku smjesu, te se nastale deaktivirane polimernemolekule uklone pogodnim postupkom.

Vezanje na šećernu jedinku

Vezanje na šećernu jedinku može se provesti in vivo ili in vitro. Kako bi se postiglo in vivo glikoziliranje polipeptida s IFNG aktivnosti, koji je modificiran tako da su uvedena jedno ili više mjesta za in vivo glikoziliranje (vidi odjeljak "Konjugat izuma gdje je ne-polipeptidna jedinka šećerna jedinka"), sekvenca nukleotida koja kodira polipeptidni dio konjugata mora se umetnuti uglikozilirajućeh eukariotskog domaćina za ekspresiju. Stanica domaćina za ekspresiju može se izabrati od fungalnih (filamentne gljive ili kvasac), insektnih ili životinjskih stanica, ili od transgenih biljnih stanica. Nadalje, glikoziliranje se može postići u ljudskom tijelu kada se koristi sekvenca nukleotida koji kodiraju polipeptidni dio konjugata izuma ili polipeptid izuma u genskoj terapiji. U jednoj izvedbi stanica-domaćin je stanica sisavca, kao što je CHO stanica, BHK ili HEK stanica, npr. HEK293, ili stanica insekta, kao što je SF9 stanica, ili stanica kvasca, npr. Saccharomices cerevisiae, Pichia pastoris ili bilo koji domaćin pogodan za likoziliranje, npr. kako je dolje opisano. Po izboru, šećerne jedinke vezane na IFNGpolipeptid in vivo glikoziliranjem dalje se modificiraju upotrebom glikozil trans feraza, npr. korištenjem tehnologije GlycoAdvance™ na tržištu putem Neose, Horsham, PA, USA. Prema tome, može se, npr. povisiti sijaliranje glikoziliranog IFNG polipeptida nakon ekspresije i in vivo glikoziliranja putem CHO stanica.

Kovalentno in vitro povezivanje glikozida na aminokiseline u IFNG može se upotrijebiti da se modificira ili poveća broj ili profil ugljikohidratnih supstituenata. Ovisno o postupku povezivanja, šećer (i) se može vezati na a) arginin i histidin, b) slobodne hidroksilne skupine, c) slobodne sulfhidrilne skupine kao što su one na cisteinu, d) slobodne hidroksilne skupine koa što su one na serinu, treoninu, tirozinu ili hidroksiprolinu, e) aromatske aminokiseline kao što je fenilalanin ili triptofan ili f) amidnu skupinu lutamina. Ove aminokiseline čine primjere veznih grupa za šećernu jedinku koja se može uvesti i/ili ukloniti u IFNG polipeptidu konjugata izuma. Pogodni postupci za in vitro vezanje opisani su, na primjer, u WO 87/05330 i u Aplin et al., CRC Crit Rev. Biochem, pp . 259 - 306, 1981. In vitro vezanje šećernih jedinki ili PEG na Gln aminokiseline vezane na protein i peptid takođr se može provesti pomoću transglutaminaza (Tgaza), npr. kako je opisao Sato et al. , 1996 Biochemistry 35, 13072 - 13080 ili u EP 725145.

Vezanje na organsko sredstvo za derivatiziranje

Kovalentno modificiranje IFNG polipeptida može se postići reakcijom vezne(ih) grupe(a) polipeptida s organskim sredstvom za derivatiziranje. Pogodna organska sredstva za derivatiziranje i postupci dobro su poznati u struci. Na primjer, cisteinske aminokiseline najčešće reagiraju s α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što je kloroctena kiselina ili kloracetamid, tako da se dobiju karboksimetilni ili karboksiamidometilni derivati. Cisteinilske aminokiseline također se derivatiziraju reakcijom s bromtrifluoracetonom, α-brom-beta-(4-imidozol) propionskom kiselinom, kloracetil fosatom, N-alkiImaleimidima, 3-nitro-2-piridildisulfidom, metil 2-piridildisulfidom, p-klormerkuribenzoatom, 2-klormerkuri-4-nitrofenolom ili klor-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom. Histidilne aminokiseline derivatiziraju se reakcijom s dietiIpirokarbonatom pri pH 5.5 - 7.0 jer je ovo sredstvo relativno specifično zahistidilski pokrajnji lanac. Para-bromfenacil bromid također je koristan; reakcija se preferirano provodi u 0,1 M natrijevom kakodilatu na pH 6. Lizinilne i aminoterminalne aminokiseline reagiraju sa sukcinskim ili drugim karboksilnim anhidridima. Derivatiziranje s ovim sredstvima ima efekt da se promijeni naboj lizinilne aminokiseline. Druga prikladna sredstva za derivatiziranje aminokiselina uključuju imidoestere kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; klorborhidrid; trinitrobenznsulfonska kiselina; O-metil izourea; 2,4-pentadion; i reakciju s glioksilatom kataliziranu transaminazom. Arginilne aminokiseline modificiraju se reakcijom s jednim ili nekoliko konvencionalnih agenasa, među njima je fenilgloksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatiziranje argininskih aminokiselina zahtijeva da se reakcija provodi u alkalnim uvjetima zbog vsokog pH gvanidinske funkcionalne grupe. Nadalje, ova sredstva mogu reagirati s grupama lizina kao i s guanido skupinom arginina. Karboksilne pokrajnje skupine (aspartil ili glutamil) selektivno se modificiraju reakcijom s karbodiimidima (R-N=C=N-R') gdje su R i R' različite alkilne skupine, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilentil) karbodiimid. Nadalje, aspartilne i glutamilne aminokiseline mogu se prevesti u asparaginil ili glutaminil reakcijom s amonijevim ionima.

Blokiranje funkcionalnog mjesta

Objavljeno je da pretjerana konjugacija polimera može dovesti do gubitka aktivnosti polipeptida na koji je polimer konjugiran. Ovaj problem se može eliminirati, npr. uklanjanjem veznih grupa smještenim na funkcionalnom mjestu ili blokiranjem funkcionalnog mjesta prije konjugiranja. Ovakvi postupci tvore daljnje izvedbe izuma (prvi način postupanja prikazan je dalje gore, npr. uklanjanjem lizina koji mogu biti smješteni blizu funkcionalnog mjesta). Više specifično, prema drugom načinu postupanja, konjugiranje između polipeptida i ne-polipeptidne jedinke provodi se u uvjetima gdje je funkcionalno mjesto polipeptida blokirano pomoćnom molekulom koja je sposobna da se veže na funkcionalno mjesto polipeptida. Preferirano, pomoćna molekula je ona koja specifično prepoznaje funkcionalno mjesto polipeptida, kao što je receptor. Alternativno, pomoćna molekula može biti antitijelo, određenije, monoklonalno antitijelo koje prepoznaje polipeptid koji pokazuje IFNG aktivnost. Određenije, pomoćna molekula može biti neutraližirajuće monoklonalno antitijelo.

Polipeptid se pusti da reagira s pomoćnom molekulom prije nego što se provede konjugacija. Ovo osigurava da funkcionalno mjesto polipeptida bude zasjenjeno ili zaštićeno te time neraspoloživo za derivatiziranje ne-polipeptidnom jedinkom kao što je polimer. Nakon eluiranja s pomoćne molekule, konjugat između ne-polipeptidne jedinke i polipeptida može se opet dobiti s najmanje djelomično očuvanom funkcionalnim mjestom.

Daljnje konjugiranje polipeptida koji ima blokirano funkcionalno mjesto na polimer, lipofilni spoj, šećernu jedinku, organsko sredstvo za derivatiziranje ili bilo koji drugi spoj provodi se na normalni način, npr. kako je opisano u gornjim odjeljcima pod naslovom "Konjugiranje na...".

U daljnjoj izvedbi pomoćna molekula se prvo kovalentno veže na čvrstu fazu kao što je kolona, na primjer Sephadex ili kuglice agaroze, ili površinu, npr. reakcijska posuda. Nakon toga polipeptid se nanese na materijal kolone koji nosi pomoćnu molekulu i konjugacija se provede prema postupcima poznatim u struci, npr. kako je opisano u gornjim odjeljcima pod naslovom "Konjugiranje na...". Ovaj postupak omogućava da se konjugat polipeptida odvoji od pomoćne molekule eluiranjem. Konjugat polipeptida eluira se uobičajenim postupcima u fizikalno -kemijskim uvjetima koji ne dovode do bitne degradacije polipeptidnog konjugata. Fluidna faza koja sadrži konjugat polipeptida odvoji se od čvrste faze na koju pomoćna molekula ostaje kovalentno vezana. Odvajanje se može postići i na druge načine: Na primjer, pomoćna molekula se može derivatizirati drugom molekulom (npr. biotin) koju može prepoznati specifični vezni spoj (npr. streptavidin). Specifični vezni spoj može biti povezan sa čvrstom fazom tako da omogućava odvajanje polipeptidnog konjugata od kompleksa pomoćna molekula - druga molekula prolaskom preko kolone s drugom pomoćnom čvrstom fazom koja će zadržati, nakon eluiranja što slijedi, kompleks pomoćna molekula - druga molekula, ali ne i polipeptidni konjugat. Konjugat polipeptida može se osloboditi s pomoćne molekule na prikladan način. Skidanje zaštite može se postići omogućavanjem uvjeta u kojima pomoćna molekula disocira s funkcionalnog mjesta na IFNG na koje je vezana. Na primjer, kompleks između antitijela na koje je polimer konjugiran i antiidiotipičnog antitijela može se disocirati podešavanjem pH na kiseli ili alkalni pH.

Konjugiranje na označeni polipeptid

U alternativnoj izvedbi dolazi do ekspresije IFNG polipeptida kao fuzijskog proteina s oznakom, tj. sekvenca aminokiselina ili dio peptida sastavljen od tipično 1 - 30, kao što je 1 - 20, aminokiselina. Osim što omogućava brzo i lagano pročišćavanje, oznaka je pogodna alatka za postizanje konjugacije između označenog IFNG polipeptida i ne-polipeptidne jedinke. Određenije, oznaka se može koristiti za postizanje konjugacije na mikrotitarskim pločama ili drugim nosačima, kao što su paramagnetične kuglice, na kojima se označeni polipeptid može imobilizirati putem oznake. Konjugiranje na označeni IFNG polipeptid u, npr., mikrotitarskim pločama ima prednost da se označeni polipeptid može imobilizirati na mikrotitarskim pločama direktno iz smjese za uzgoj kulture (u principu bez ikakvog pročišćavanja) i podvrgnuti konjuiranju. Prema tome, ukupni broj koraka u postupku (od ekspresije do konjugiranja) može se smanjiti. Nadalje, oznaka može djelovati kao molekula za razmak čime se osigurava poboljšana pristupačnost do imobiliziranog polipeptida koji će biti konjugiran. Konjugiranje pomoću označenog polipeptida može biti na bilo koju od ne-polipeptidnih jedinki ovdje prikazanih, eg. na polimernu molekulu kao što je PEG.

Identitet specifične oznake koja se uzima nije presudan sve dok oznaka ima sposobnost ekspresije s polipeptidom i ima sposobnost da se imobilizira na prikladnoj površini ili materujalu nosača. Komercijalno je raspoloživo niz prikladnih ozna.ka, npr. iz Unizyme Laboratories, Danska. Na primjer, oznaka može biti bilo koja od sljedećih sekvenci:

Ks-Ks-His-His-His-His

Met-Lys-His-His-His-His-His-His

Met-Lys-His-His-Ala-His-His-GIn-His-His

Met-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln

(sve se mogu dobiti od Unizyme Laboratories, Danska) ili bilo koja od sljedećih:

EQKLISEEDL (C-terminalna oznaka opisana u Mol.

Cell Bio. 5: 3610 - 16, 1985)

DYKDDDDK (C-terminalna oznaka)

YPYDVPDYA

Antitijela protiv gornjih oznaka su komercijalno raspoloživa, npr. kod ADI Aves Lab and Research Diagnostics.

Pogodni postupak za korištenje označenog polipeptida za PEGiliranje dan je dolje u odjeljku Materijali i metode).

Odsijecanje oznake s polipeptida što slijedi nakon toga može se postići korištenjem komercijalno raspoloživih enzima.

Polipeptidi izuma

U daljnjem aspektu izum se odnosi na općenito nove IFNG polipeptide kao što je ovdje prikazano. Novi polipeptidi se važni intermedijerni spojevi za preparaciju konjugata izuma. Dodatno, i sami polipeptidi mogu imati zanimljiva svojstva.

Na primjer, novi IFNG polipep'id obuhvaća najmanje jednu supstituciju na K, R, D, E, C, S, T ili N amniokiseline izložene na površini kao što je puno detaljnije opisano u prethodnom dijelu prijave.

Postupci za preparaciju IFNG polieptida

IFNG polipeptid, po izboru u glikozoliranom obliku, može se proizvesti bilo kojim prikladnim postupkom poznatim u struci. Takvi postupci mogu uključiti tvorbu sekvence nukleotida koji šifriraju (kodiraju) polipeptid i ekspresiju sekvence u pogodnom transformiranom ili trans ficiranom domaćinu, međutim, polipeptidi izua mogu se proizvesti, iako manje efikasno, kemijskom sintezom ili kombinacijom kemijske sinteze i tehnologije rekombinantne DNA.

Sekvenca nukleotida izuma koja šifrira IFNG polipeptid (u obliku monomera ili jednostrukog lanca) može se izgraditi izoliranjem ili sintezom sekvence nukleotida koja šifrira polazni IFNG, kao što je huIFNG s sekvencom aminokiselina SEQ ID NO 2 i onda mijenjanjem sekvence nukleotida tako da se potakne uvođenje (tj. umetanje ili supstitucija) ili poništavanje (tj. uklanjanje ili supstitucija) relevantnih aminokiselina.

Sekvenca nuklotida se pogodno modificira usmjereno mutagenezom u skladu s dobro poznatim postupcima, vidi npr. Mark et al., "Site-specific Mutaenesis of the Human Fibroblast Interferin Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662 - 66 (1984); i US 4,588,585.

Alternativno, sekvenca nukleotida preparira se kemijskom sintezom, npr. korištenjem sintetizera oligonukleotida, gdje su oligonukleotidi projektirani na osnovi sekvence aminokiselina željenog polipeptida, i preferirano se izaberu oni kodoni koji imaju prednost u stanici domaćinu u koji će rekombinantni polipeptid biti proizveden. Na primjer, nekoliko malih oligonukleotida koji šifriraju dijelove željenog polipeptida mogu se sintetizirati i složiti putem PCR, Igacijom ili ligacijskom lančanom reakcijom (LCR). Pojedini oligonukleotidi tipično sadrže 5' ili 3' nastavke za komplementarno slaganje.

Kada je jednom sastavljena (putem sinteze, usmjerenom mutagenezom ili drugim postupkom), sekvenca nukleotida koja šifrira polipeptid umetne se u rekombinantni vektor i operativno veže s kontrolnim sekvencama potrebnim za ekspresiju IFNG u željenoj transformiranoj stanici domaćinu.

Naravno treba razumjeti da svi vektori i sekvence kontrole ekspresije ne djeluju jednako dobro za ekspresiju sekvence nukleotida koji šifrira IFNG polipeptid ovdje opisan. Niti će svi domaćini djelovati jednako dobro s istim sistemom za ekspresiju. Međutim, stručnjak može izabrati između tih vektora, sekvenca kontrole ekspresije i domaćina bez pretjeranog eksperimentiranja. Na primjer, kada se bira vektor domaćin se mora uzeti u obzir zbog toga što se vektor mora u njemu eplicirati ili biti u mogućnosti da se integrira u kromosom. Vektorov broj umnožavanja, sposobnost kontrole tog broja umnožavanja i ekspresija bilo kojih drugih proteina šifriranih vektorom, kao što su antibiotski markeri, trebaju se također uzeti u obzir. Kod odabira sekvence kontrole ekspresije treba također uzeti u obzir niz faktora. Ovi uključuju, na primjer, relativnu snagu sekvence, mogućnost njene kontrole i njenu kompatibilnost sa sekvencom nukleotida koji šifrira polipeptid, naročito u odnosu na potencijalne sekundarne strukture. Domaćine se treba birati uzimanjem u obzir njihove kompatibilnosti s izabranim vektorom, toksičnosti produkta šifriranog sekvencom nukleotida, njihove karakteristike sekrecije, njihove sposobnosti da ispravno slože protein, njihove potrebe za fermentiranjem ili kulturom i lakoću pročišćavanja produkata šifriranih sekvencom nukleotida.

Rekombinantni vektor može biti autonomno replicirajući vektor, tj. vektor koji postoji kao ekstrakromosomski entitet čija replikacija ne ovisi o kromosomskoj replikaciji, npr. plazmid. Alternativno, vektor je onaj koji se, kada se uvede u stanicu domaćina, integrira u genom stanice domaćina i replicira zajedno s kromosomom ili krosomima u koje je bio integriran.

Vektor je preferirano ekspresijski vektor u kojem se sekvenca nukleotida koji šifriraju IFNG polipeptid operabilno veže nadodatne segmente potrebne za transkripciju sekvence nukleotida. Vektor se tipično derivira iz plazmida ili viralne DNA. Niz prikladnih ekspresijskih vektora za ekspresiju u stanici domaćina koji su ovdje spomenuti raspoloživi su komarcijalno ili opisani u literaturi. Korisni ekspresijski vektori za eukariotske domaćine uključuju, na primjer, vektore koji obuhvaćaju sekvence kontrole ekspresije iz SV40, papiloma virusa goveda, adenovirus i citomegalovirus. Specifični vektori su. npr., pCDNA3.1(+)Hyg (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and pCI-neo (Stratagene, La Jola, CA, (USA). Korisni ekspresijski vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pBR322, pETSa and pET12a (oba Novagen Inc., WI, USA), plazmidi šireg raspona domaćina, kao što je RP4, DNA faga, npr. brojni derivati faga lambda, npr. NM989, i drugi DNA fagi, kao što je M13 i fag filamentne jednostruke DNA. Korisni ekspresijski vektori za stanice kvasca uključuju 2μ plazmid i njegove derivate, POT1 vektor (US 4,931,373), pJS037 vektor opisan u (Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996)i pPICZ A, B ili C (Invitrogen). Korisni vektori za stanice insekata uključuju VL941, pBG311 (Cateet ah, "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Aniraal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986), pBluebac 4.5 and pMelbac (oba na raspolaganju kod Invitrogen).

Drugi vektori za upotrebu u ovom izumu uključuju one koji dopuštaju da se sekvenca nukleotida koja šifrira IFNG polipeptid pojača u broju kopija. Takvi vektori koji se mogu pojačavati dobro su poznati u struci. Oni uključuju, na primjer, vektore koji se mogu pojačati DHFR pojačavanjem (vidi Kaufman, U.S. Pat. No. 4,470,461, Kaufman and Sharp, "Constmction Of A Modular Dihydrafolate Reductasc cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. BioL, 2, pp. 1304-19 (1982)); i pojačavanje glutamin sintetaze ("GS") (vidi, npr. US 5,122,464 i EP 338,841).

Rekombinantni vektor može dalje obuhvaćati sekvencu DNA koja omogućava vektoru da se replicira u danoj stanici domaćina. Primjer takve sekvence (kada je stanica domaćin stanica sisavca) je SV40 ishodište repliciranja. Kada je stanica domaćin stanica kvasca, prikladne sekvence koje omogućavaju vektor da se replicira su replikacijski geni 2μ plazmida kvasca REP 1-3 i ishodište repliciranja.

Vektor može također obuhvaćati marker s mogućnošću izbora, npr. gen čiji produkt je komplementaran defektu u stanici domaćina kao što je gen koji šifrira dihidrogolat reduktazu (DHFR) ili Schizosaccharomyces pombe TPI gene (P.R, Russell, Gene40, 1985, pp. 125-130), ili onaj koji daje rezistentnost na lijek, npr. ampicilin, kanamcin, tetraciklin, kloramfenikol, neomicin, higromicin ili metotreksat. Za nitaste gljive, markeri koji se mogu izabrati uključuju amdS, pyrG, arcB, niaD, sC.

Izraz "kontrolne sekvence" ovdje je definiran da uključi sve komponente koje su neophodne ili imaju prednost za ekspresiju IFNG polipeptida. Svaka kontrolna sekvenca može biti domaća ili strana za sekvencu nukleotida koja šifrira polipeptid. Takve sekvence uključuju, ali nisu na njih ograničene, vodeću, promotorsku, pojačanu ili uzvodnu aktivirajuću sekvencu, sekvencu signalnog peptida i terminator transkripcije, Minimalno, kontrolne sekvence uključuju promotor.

U predmetnom izumu može se upotrijebiti širok izbor sekvenci kontrole ekspresije. Takve korisne sekvence kontrole ekspresije uključuju sekvence kontrole ekspresije povezane sa strukturalnim genima tekućih ekspresijskih vektora kao i bilo koju sekvencu koja je poznata da kontrolira ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih stanica ili njihovih virusa te njihove različite kombinacije.

Primjeri prikladnih kontrolnih sekvenci za upravljanje transkripcijom u stanicama sisavaca uključuju rane i kasne promotore SV40 i adenovirusa, npr. adenovirus 2 glavni kasni promotor, MT-1 (metalotionein gen) promotor, humani citomegalovirus trenutačni - rani promotor (CMV), promotor za humani elongacijski faktor 1α (EF – 1α) , promotor za protein 70 minimalnog toplinskog šoka kod Drosophile, Rous Sarkoma virus (RSV) promotor, promotor za humani Izraz "kontrolne sekvence" ovdje je definiran da uključi sve komponente koje su neophodne ili imaju prednost za ekspresiju IFNG polipeptida. Svaka kontrolna sekvenca može biti domaća ili strana za sekvencu nukleotida koja šifrira polipeptid. Takve sekvence uključuju, ali nisu na njih ograničene, vodeću, promotorsku, pojačanu ili uzvodnu aktivirajuću sekvencu, sekvencu signalnog peptida i terminator transkripcije, Minimalno, kontrolne sekvence uključuju promotor.

U predmetnom izumu može se upotrijebiti širok izbor sekvenci kontrole ekspresije. Takve korisne sekvence kontrole ekspresije uključuju sekvence kontrole ekspresije povezane sa strukturalnim genima tekućih ekspresijskih vektora kao i bilo koju sekvencu koja je poznata da kontrolira ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih stanica ili njihovih virusa te njihove različite kombinacije.

Primjeri prikladnih kontrolnih sekvenci za upravljanje transkripcijom u stanicama sisavaca uključuju rane i kasne promotore SV40 i adenovirusa, npr. adenovirus 2 glavni kasni promotor, MT-1 (metalotionein gen) promotor, humani citomegalovirus trenutačni - rani promotor (CMV), promotor za humani elongacijski faktor 1α (EF – 1α), promotor za protein 70 minimalnog toplinskog šoka kod Drosophile, Rous Sarkoma virus (RSV) promotor, promotor za humani ubikvitin (UbC), terminator humanog hormona rasta, poliadenilacijski signali SV40 ili adenovirus Elb područja i Kozak koncenzus sekvenca (Kozak, M. J. Biol. 1987 Aug 20; 196 (4) : 947 - 50) .

Kako bi se poboljšala ekspresija u stanicama sisavaca, može se umetnuti sintetički intron u 5' neprevedeno područje sekvence nukleotida koja šifrira IFNG polipeptid. Primjer sintetičkog introna je sintetički intron iz plazmida pCI -Neo (raspoloživ kod Promega Corporation, Wi, USA).

Primjeri prikladnih kontrolnih sekvenci za upravljanje transkripcijom u stanicama insekata uključuju polihedrin promotor , PIO promotor, promotor za bazični protein Autorapha californica polihedroznog virusa, promotor za bakulovirus trenutačni rani gen 1 i promotor za bakulovirus 39K odložen - rani gen te SV-40 poliadenilacijska sekvenca.

Primjeri prikladnih kontrolnih sekvenci za upotrebu u stanicama domaćinima kvasca uključuju promotore kvaščevog sistema α-parenja, promotor za trioza fosfat izomerazu (TPI) kvasca, promotore iz glikolitičnih gena kvasca ili gena alkoholne dehidrogenaze, ADH2 - 4c promotor i inducibilni GAL promotor.

Primjeri prikladnih kontrolnih sekvenci za upotrebu u stanicama domaćinima filamentoznih gljiva uključuju ADH3 promotor i terminator, promotor deriviran iz gena koji šifriraju amilaza trioza fosfat izomerazu iz Aspergillus oryzae TAKA ili alkalnu proteazu kao što je A. niger α-amilaza, A. niger ili A. nidulans glukoamilaza, A. nidulans acetamidaza, Rhizomucor miehei aspartanska proteinaza ili lipaza, TP11 terminator i ADH3 terminator.

Primjeri prikladnih kontrolnih sekvenci za upotrebu u bakterijskim stanicama domaćinima uključuju promotore 1ac sistema, TAC ili TRG sistem i glavne promotorske regije faga lambda.

Nukleotidna sekvenca izuma, bilo da je pripremljena usmjerenom mutagenezom, sintezom ili drugim postupcima, može ili ne mora također uključivati sekvencu nukleotida koja šifrira signalni peptid. Signalni peptig je prisutan kada polipeptid treba izdvojiti iz stanica u kojima dolazi do njegove ekspresije. Takav peptid, ako je prisutan, trebao bi biti onaj koji prepoznaje stanica izabrana za ekspresiju. Signalni peptid može biti homologan (tj. onaj koji se normalno asocira s huIFNG) ili heterologan (tj. potječe iz drugog izvora nego što je huIFNG) s polipeptidom ili može biti homologan ili heterologan sa stanicom domaćina, tj. signalni peptid koji normalno ima ekspresiju iz stanice domaćina ili koji normalno nema ekspresiju iz stanice domaćina. Prema tome signalni peptid može biti prokariotski, tj. deriviran iz bakterije kao što je E. coli, ili eukariotski, tj. deriviran iz stanice sisavca, insekta ili kvasca.

Prisutnost ili odsutnost signalnog peptida ovisit će, npr., o ekspresijskoj stanici domaćinu upotrijebljenoj za proizvodnju polipeptida, o proteinu za ekspresiju (da li je intracelularni ili intracelularni protein) i da li je poželjno da se postigne sekrecija. Za upotrebu u filamentoznim gljivama signalni peptid se može pogodno izvesti iz gena koji kodira Aspergillus sp. amilazu ili glukoamilazu, gena koji kodira Rhizomucor miehei lipazu ili proteazu ili Humicola lanugiosa lipaze. Signalni peptid se pogodno izvodi iz gena koji kodira A. oryzae TAKA amilazu, A. niger neutral ct-amilazu, A. niger stabilnu u kiselom amilazu ili A. niger glukoamilazu. Za upotrebu u stanicama insekata signalni peptid se može pogodno izvesti iz gena insekta (cf. WO 90/05738) kao što je prekursor adipokinetičkog hormona kod lepidopteričkog Manduca sexta, (cf. US 5,023,328), melitin iz pčele (Invitrogen), ecdysteroid UDPglukoziltransferaza (egt) (Murphy et al., Protein and Purification 4, 349 - 357 (1993)) ili humana pankreatska lipaza (hpl) (Methods in Enzymology 284, pp. 262 - 272, 1997).

Preferirani signalni peptid za upotrebu u stanicama sisavaca je onaj iz huIFNG ili signalni peptid za murin Ig kapa laganog lanca (Golima, M. (1991) J. Imm. Methods 152: 89 -104). Za upotrebu u stanicama kvasca nađeno je da su prikladni signalni peptidi signalni peptid za -faktor iz S. cerviciae, (cf. US 4,870,008), signalni peptid za mišju amilazu iz sline (cf . O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643 - 646), signalni peptid za modificiranu karboksipeptidazu (cf. L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887 - 897), signalni peptid za BAR l iz kvasca (cf. WO 87/02670) i signalni peptid za aspartansku proteazu 3 iz kvasca (YAP3) (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127 -137).

Bilo koji pogodni domaćin može se upotrijebiti da se proizvede IFNG polipeptid, uključivši bakterije, gljive, biljke, insekte, sisavce ili druge prikladne životinjske stanice ili stanične linije, kao i transgenske životinje ili biljke. Primjeri bakterijskih stanica domaćina uključuju grampozitivne bakterije kao što su sojevi Bacillus, npr. B. brvis ili B. subtilis, Pseudomonas ili Streptomyces, ili gramnegativne bakterije kao što su sojevi E. coli. Uvođenje vektora u bakterijsku stanicu domaćina može se postići, na primjer, transformacijom protoplasta (vidi, npr., Chang and Cohen, 1979, Moelcular General Genetics 168: 111 - 15), upotrebom kompetentnih stanica (vidi Voung and Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56. 209-221) elektroporacijom (e.g. Shigekawa and Dower, 1988, Biotechnigues 6: 742-751), ili konjugacijom (Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5270).

Primjeri pogodnih stanica domaćina filamentnih gljiva uključuju sojeve Aspergillus, A. oryzae, A. niger, f li A. nidulans, Fusarium ili Trichoderma.

Gljivične stanice mogu se transformirati postupkom koji uključuje stvaranje protoplasta, transformaciju protoplasta i regeneraciju staničnog zida na način poznat sam za sebe. Pogodni postupci za transformaciju Aspergillus stanica domaćina opisani su u EP 238 023 i US 5,679,543. Pogodni postupci za transformiranje vrste Fusarium opisani su u Malardier et al., 1989, Gene 78: 147 - 156 i W0 96/00787. Kvasac se može transformirati korištenjem postupaka opisanih u Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Melhods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; and Hinnen et al, 1978, Proceedings ofthe National Academy of Sciences USA 75: 1920.

Primjeri pogodnih stanica domaćina kvasca uključuju sojeve Saccharomyces npr. S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, kao P. pastoris ili P. methanolica, Hansenula, kao H. Polymorpha ili Yarrowia.

Postupci za transformiranje stanica kvasca heterolognom DNA i proizvodnju heterolognih polipeptida iz njih opisani su kod Clontech Laboratories, Ine, Palo Alto, CA, USA (u protokolu za produkte Veastmaker™ Ycast Tmnfonnation Systcm Kit), i kod Reeves et al., EEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198, Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415 i Ganeva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.

Primjeri pogodnih stanica domaćina insekata uključuju Lepidoptora staničnu liniju, kao što su stanice Spodoplera frugiperda (Sf9 or Sf21) a Trichoplusioa ni (High Five) (US 5,077,214).

Transformacija stanica insekata i proizvodnja heterolognih polipeptida u njima može se provesti kao što je opisao Invitrogen.

Primjeri pogodnih stanica domaćina sisavaca uključuju stanične linije jajnika kineskog hrčka (CHO) (npr. CHO-K1; ATCC CCL - 61), stanične linije zelenog majmuna (COS) (npr. COS 1 (ATCC CRL - 1650), COS 7 (ATCC CRL - 1651)), mišje stanice (npr. NS / O), stanične linije bubrega mladunaca hrčka (BHK) (npr. ATCC CRL - 1632 ili ATCC CCL - 10) i ljudske stanice (npr. HEK 293 (ATCC CRL - 1573)) kao i biljne stanice u kulturi tkiva. Dodatne pogodne stanične linije nove su u struci i raspoložive iz javnih spremišta kao što je American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Također, stanica sisavaca, kao CHO stanica, može se modificirati za ekspresiju sialiltransferaze, npr. 1,6 -sialiltransferaze, npr. kao što je opisano u US 5,047,335, kako bi se postiglo poboljšano glikoziliranje IFNG polipeptida.

Postupci za uvođenje egzogene DNA u stanice domaćina sisavca uključuju transfekciju posredovanu kalcij em, elektroporaciju, transfekciju posredovanu DEAE - dekstranom, transfekciju posredovanu liposomom, viralne vektore i transfekcijsku metodu opisanu pri Life Technologies Ltd, Paisley, UK pomoću Lipofectamina 2000. Ovi postupci dobro su poznati u struci i npr. opisani u Ausbel ct al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wilcy & Sons, Ncw York, USA. Uzgajanje stanica sisavaca provodi se prema poznatim postupcima, npr. kako je opisano u (Animal Ccll Biotechnology, Methods and Protocois, Edited by Nige, Jenkins, 1999, Human Press Ine, Totowa New Jersey, USA and Hamson MA and Rae IF, General Technigues of Cell Culture, Cambridge UniversityPressl997).

Za proizvodnju glikoziliranog polipeptida preferirano se upotrebljava eukariotska stanica domaćin, npr. gore spomenutog tipa.

U postupcima proizvodnje u predmetnom izumu stanice se uzgajaju u hranjivom mediju pogodnom za proizvodnju polipeptida primjenom metoda poznatih u struci. Na primjer, stanica se može uzgajati u tikvici za potresanje, fermentacijom na veliko ili na malo (uključivši kontinuirano, u porcijama, ubacivanim porcijama ili fermentiranje u čvrstom stanju) u laboratorijskim ili industrijskim fermentatorima provođeno u pogodnom mediju i u uvjetima koji omogućavaju ekspresiju i/ili izolaciju polipeptida. Uzgajanje se odvija u pogodnom hranjivom mediju koji obuhvaća izvore ugljika i dušika i anorganske soli, putem postupaka poznatih u struci. Pogodni mediji su raspoloživi kod komercijalnih dobavljača ili se mogu prirediti prema objavljenim kompozicijama (npr., u katalozima American Type Culture Collection). Ako se polipeptid izlučuje u hranjivi medij, polipeptid se može izolirati direktno iz medija. Ako se polipeptid ne izlučuje može se izolirati iz staničnih lizata.

Nastali polipeptid može se izolirati postupcima poznatim u struci. Na primjer, polipeptid se može izolirati iz hranjivog medija konvencionalnim postupcima koji uključuju, ali nisu na njih ograničeni, centrifugiranje, filtriranje, ekstrakciju, sušenje u spreju, uparavanje ili taloženje.

Polipeptidi se mogu pročistiti nizom postupaka poznatih u struci uključivši, ali nisu na njih ograničeni, kromatografiju (npr. ionske izmjene, afinitetnu, hidrofobnu, kromatofokusirajuću i ekskluziju veličinom), elektroforetske postupke (npr., preparativno izoelektrično fokusiranje), diferencijalnu topljivost (npr., taloženje amonijevim sulfatom), SDS-PAGE ili ekstrakciju (vidi npr., Protein Puri fication, J. - C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989). Specifične metode za pročišćavanje polipeptida koji imaju IFNG aktivnost opisane su u EP 110044 i neproučenoj japanskoj patentnoj prijavi No. 186995/84.

Biološka aktivnost IFNG polipeptida može se ispitati bilo kojim pogodnim postpkom poznatim u struci. Takve probe uključuju neutralizaciju antiviralne aktivnosti antitijelima, indukciju protein kinaze, aktivnost oligoadenilat 2,5 - A sintetaze ili fosfodiesteraze, kako je opisano u EP 41313 BI. Takve probe također uključuju imunomodulatorne probe (vidi, npr., US 4,753,795), probe inhibiranja rasta i mjerenje . vezanja na stanice koje provode ekspresiju interferonskih receptora. Specifične probe opisane su ovdje u odjeljku Materijali i metode.

Nadalje, izum se odnosi na poboljšane postupke liječenja, određenije, intersticijskih plućnih oboljenja, ali također i granulomatozne bolesti, rak, infekcije, poremećaje kosti (npr. poremećaj metabolizma kosti kao maligna osteoporoza) i autoimunih bolesti kao što je reumatoidni artritis, pri čemu su glavne prednosti manje učestalo i/ili manje invazivno davanje efikasnije terapije i moguće niži rizik imune reakcije s terapijski aktivnim spojevima.

Konjugat izuma preferirano se daje u kompoziciji koja uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent. "'Farmaceutski prihvatljiv" znači nosač ili ekscipijent koji ne uzrokuje nepoželjne efekte kod pacijenata kojima se daje. Takvi farmaceutski prihvatljivi nosači ili ekscipijenti dobro su poznati u struci (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; and Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, EA, Phannaceutical Press [2000]).

Konjugat izuma može se upotrijebiti kakav je i/ili u obliku njegove soli. Pogodne soli uključuju, ali nisu na njih ograničene, soli s alkalnim ili zemnoalkalnim metalima, kao što je natrij, kalij, kalcij ili magnezij kao i, npr. cinkove soli. Ove soli ili kompleksi mogu biti prisutni u kristalnoj i/ili amorfnoj strukturi.

Konjugat izuma daje se u dozi koja otprilike odgovara onoj koja se upotrebljava u terapiji s poznatim komercijalnim preparatima IFNG kao što je Actimmune ili kao što je specificirano EP 795332. Točna doza koja se daje ovisi o uvjetima. Normalno doza mora biti u stanju da spriječi ili smanji jačinu ili širenje stanja ili indikacije koja se liječi. Stručnjacima će biti jasno da efektivna količina konjugata izuma ovisi, između ostalog, o bolesti, dozi, rasporedu davanja, da li se polipeptid ili konjugat izuma daje sam ili u spoju s drugim terapeutskim sredstvima, vremenu poluživota kompozicije u serumu i općenitom zdravlju pacijenta.

Izum se također odnosi na upotrebu a) konjugata koji obuhvaća najmanje jednu ne-polipeptidnu jedinku vezanu na IFNG polipeptid pri čemu se polipeptid izabere iz grupe koja se sastoji od huIFNG, rhuIFNG ili IFNG polipeptida kao što je ovdje opisano (tj. konjugat je konjugat izuma) ili b) farmaceutske kompozicije izuma za proizvodnju medikamenta, farmaceutske kompozicije ili sastojaka za pripremu za liječenje intersticijskih plućnih oboljenja, raka, infekcije, poremećaja kosti (npr. poremećaj metabolizma kosti kao maligna osteoporoza) i/ili upalnih oboljenja, određenije intersticijskih plućnih oboljenja, najviše određeno idiopatske pulmonarne fibroze. Glukokortikoid kao što je prednisilin može se također uključiti. Preferirano doziranje je 1 -4, više preferirano 2-3, mikrograma/kg težine pacijenta polipeptidne komponente po dozi. Preferirano doziranje je 10 - 350, više preferirano 100 - 150 mikrograma glukokortikoida/ kg težine pacijenta po dozi.

Također je prikazan poboljšan način za unošenje molekula ili preparacija, koje izborno dodatno sadrže glukokortikoide.

Izum se također odnosi na pripremljene sastavne dijelove pogodne za liječenje intersticijskih plućnih oboljenja koji obuhvaćaju prvu farmaceutsku kompoziciju koja obuhvaća gore spomenute aktivne komponente a) ili b) i drugu farmaceutsku kompoziciju koja obuhvaća najmanje jedan glukokortikoid, svaki po izboru s farmaceutski prihvatljivim nosačem i/ili ekscipijentom.

Konjugat izuma može se formulirati u farmaceutske kompozicije dobro poznatim postupcima. Pogodbe formulacije opisao je E. W. Martin u Remington's Pharmaceutical Sciences te u US 5,183,46.

Farmaceutska kompozicija može se formulirati u niz oblika, uključujući tekućinu, gel, lifilizat, prašak, prešanu krutinu ili bilo koji drugi pogodni oblik. Preferirana forma ovisit će o određenoj indikaciji koja se liječi i bit će očita stručnjaku.

Farmaceutska kompozicija može se davati oralno, subkutano, intravenozno, intracerebralno, intranazalno, transdermalno, intraperitonealno , intramuskularno, intrampulmoralno, vaginalno, rektalno, intraokularno ili na bilo koji drugi prihvatljiv način, npr. upotrebom tehnologije PowderJect ili ProLease. Formulacije se mogu davati kontinuirano infuzijom, iako su injekcije u bolusu prihvatljive, primjenom tehnika poznatih u struci, kao što su pumpice ili implantacija. U nekim slučajevima formulacije se mogu davati direktno kao otopina ili sprej. Preferirani način davanja ovisit će o određenoj indikaciji koja se liječi i bit će očit stručnjaku.

Farmaceutska kompozicija izuma može se davati u spoju s drugim terapijskim sredstvima. Ova sredstva može se inkorporirati kao dio iste farmaceutske kompozicije ili se može davati odvojeno od polipeptida ili konjugata izuma istovremeno ili u skladu s bilo kojim drugim rasporedom liječenja. Dodatno, polipeptid, konjugat ili farmaceutska kompozicija izuma može se upotrijebiti kao dodatak drugim terapijama. Određenije, razmatraju se kombinacije s glukokortikoidima kao što je opisano u EP 795332.

Parenteralne preparacije

Primjer farmaceutske kompozicije je otopina namijenjena za parenteralno davanje. Iako u mnogim slučajevima farmaceutske formulacije u otopini su pripremljene u tekućem obliku, prikladne za neposrednu upotrebu, parenteralne preparacije mogu također biti pripremljene u smrznutom ili liofiliziranom obliku. U prvom slučaju, kompozicija se mora rastopiti prije upotrebe. Drugi oblik se često koristi da se poveća stabilnost aktivne komponente sadržane u kompoziciji u širokom rasponu uvjeta skladištenja, kako je stručnjacima u području poznato da su liofilizirane otopine općenito stabilnije nego njihovi tekući oblici. Takve liofilizirane preparacije se rekonstituiraju prije primjene dodavanje jednog ili više farmaceutski prihvatljivih razrjeđivača kao što je sterilna voda za injekcije ili sterilna fiziološka slana otopina.

U slučaju parenteralnih preparacija, one se pripremaju za skladištenje kao liofilizirane formulacije ili vodene otopine miješanjem, kako je prikladno, polipeptida koji ima željeni stupanj čistoće s jednim ili više farmaceutski prihvatljivim nosačem, ekscipijentora ili stabilizatorom koji se tipično koristi u struci (koji se svi nazivaju "ekscipijenti"), na primjer, puferskim sredstvima, sredstvima za stabilizaciju, konzervansima, izotonifikatorima, neionskim detergentima, antioksidantima i/ili drugim različitim aditivima.

Puferska sredstva pomažu da se pH održava u području koje je slično fiziološkim uvjetima. Oni su tipično prisutni u koncentraciji u rasponu od oko 2 mM do oko 50 mM. Pogodna puferska sredstva za upotrebu u predmetnom izumu uključuju organske i anorganske kiseline i njihove soli kao što su citratni puferi (npr. smjesa mononatrij citrat - dinatrij citrat, smjesa limunska kiselina - trinatrij citrat, smjesa limunska kiselina - mononatrij citrat itd.), sukcinatni puferi (npr. smjesa sukcinska kiselina - mononatrij sukcinat, smjesa sukcinska kiselina - natrijev hidroksid, smjesa sukcinska kiselina - dinatrij sukcinat itd), tartaratni puferi (npr., smjesa tartarna kiselina - natrij tartarat, smjesa tartarna kiselina - kalij tartarat, smjesa tartarna kiselina - natrij hidroksid itd.), fumaratni puferi (npr., smjesa fumarna kiselina - mononatrij fumarat, smjesa fumarna kiselina - dinatrij fumarat, smjesa mononatrij fumarat - dinatrij fumarat itd), glukonatni puferi (npr., smjesa glukonska kiselina - natrij glukonat, smjesa glukonska kiselina - natrij hidroksid, smjesa glukonska kiselina - kalij glukonat), oksalatni puferi (npr., smjesa oksalna kiselina - natrij oksalat, smjesa oksalna kiselina - natrij hidroksid, smjesa oksalna kiselina - kalij oksalat itd.), laktatni puferi (npr., smjesa mliječna kiselina - natrij laktat, smjesa mliječna kiselina -natrij hidroksid, smjesa mliječna kiselina -kalij laktat itd.) i acetatni puferi (npr., smjesa octena kiselina - natrij acetat, smjesa octena kiselina - natrij hidroksid itd.). Dodatne mogućnosti su fosfatni puferi, histidinski puferi i soli trimetilamina kao što je Tris.

Konzervansi se dodaju da se uspori rast mikriba i tipično se dodaju u količinama od oko 02% - 1% (m/v). Pogodni konzervansi za upotrebu u predmetnom izumu uključuju fenol, benzil alkohol, meta-krezol, metil paraben, propil paraben, oktadeciIdimetiIbenzil amonij klorid, benzalkonijevi halidi (npr. benzalkonijum klorid, bromid ili jodid), heksametonijum klorid, alkil paraben, katehol, rezorcinol, cikloheksanol i 3-pentanol.

Izotonifikatori se dodaju da se osigura izotičnost tekućih kompozicija i uključuju polihidrične šećerne alkohole, preferirano trhidrične ili više šećerne alkohole, kao što je glicerin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol i manitol. Polihidrični alkoholi mogu biti prisutni u količini između 0,1% i 25% težinski, tipično 1% do 5%, uzimajući u obzir relativne količine drugih sastojaka.

Stabilizatori se odnose na široku kategoriju ekscipijenata koji mogu biti u rasponu funkcije kao sredstvo za stvaranje mase do dodatka koji otapa terapeutsko sredstvo ili pomaže da se spriječi denaturiranje i lijepljenje za stijenku posude. Tipični stabilizatorimogu biti polihidrični šećerni alkoholi (nabrojeni gore); aminokiseline kao što je arginin, lizin, glicin, glutamin, asparagin, histidin, alanin, omitin, L-leucin, 2-fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin itd; organski šećeri ili šećerni alkoholi kao što je laktoza, trehaloza, stahioza, manitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, mioinisitol, galaktitol, glicerol i slično uključivši ciklitole kao što je inozitol; polietilen glikol; aminokiselinski polimeri; reducensi sa sumporomkao što je urea, glutation, tioktična kiselina, natrij tioglikolat, tioglicerol, α-mono tioglicerol i natrij tiosulfat; polipeptidi niske molekulske mase (tj. <10 aminokiselina); proteini kao što je albumin iz humanog seruma, albumin iz goveđeg seruma, želatina ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao polivinilpirolidon; monosaharidi kao ksiloza, manoza, fruktoza i glukoza; disaharidi kao laktoza, maltoza i sukroza; trisaharidi kao rafinoza i polisaharidi kao dekstran. Stabilizatori su tipično prisutni u rasponu od 0,1 do 10000 težinskih dijelova bazirano na težini aktivnog proteina.

Neionski surfaktanti ili detergenti (također poznati kao sredstva za vlaženje) mogu biti prisutni da pomognu otapanje terapeutskog sredstva kao i da zaštite terapeutski polpeptid protiv agitacije - inducirane agregacije što također omogućava da formulacija bude izložena površinskom naprezanju bez uzrokovanja denaturacije polipeptida. Pogodni neionski surfaktanti uključuju polisorbate (20, 80 itd.), polioksamere (184, 188 itd.), Pluronic® poliole, polioksietilen sorbitan monoetere (Tween®-20, Tween®-80 itd.).

Dodatni raznoliki ekscipijenti uključuju sredstva za stvaranje mas ili punila (npr. škrob), helatna sredstva (npr. edta), antioksidante (npr. askorbinska kiselina, metionin, vitamin E) i kootapala. Aktivni sastojak može također biti uhvaćen u mikrokapsulama koje se prepariraju, npr., konzervacijskim postupcima ili interpovrinskom polimerizacijom, na primjer hidroksimetilceluloza, želatina ili poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, u koloidnim sistemima za unošenje lijekova (na primjer liposomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike iznesene su u Remington's Pharmaceutical Sciences, supra.

Parenteralne formulacije koje se koriste za in vivo davanje moraju biti sterilne. Ovo se jednostavno postiže, na primjer, foltriranjem kroz sterilne membrane za filtriranje.

Preparacije za zadržano otpuštanje

Pogodni primjeri za preparacije zadržanog otpuštanja uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže konjugat, gdje matrice imaju pogodni oblik kao što je film ili mikrokapsule. Primjer matrica zadržanog otpuštanja uključuju poliestere, hidrogelove (na primjer poli (2-hidroksietil-metakriat) ili oli (vinilalkohol)), polilaktide, kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-1-glutamata, nedegradabilni etilen-vinil acetat, degradabilne mliječna kiselina – glikolna kiselina kopolimere kao što je ProLease® tehnologija ili Lupron Depot® (mikrospore za injekciju sastavljene od mliječna kiselina -glikolna kiselina kopolimera i leuprolid acetata) i poli-D-(-)-3-hidroksimaslačnu kiselinu. Dok polimeri kao etilen-vinil acetat i mliječna kiselina - glikolna kiselina omogućavaju otpuštanje molekula kroz duge periode kao do preko 100 dana, izvjesni hidrogelovi otpuštaju proteine kroz kraće vremenske periode. Kada kapsulirani proteini ostaju u tijelu dugo vrijeme, može doći do denaturacije ili agregacije kao rezultat izlaganja vlazi na 37°C što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih promjena u imunogenosti. Racionalne strategije mogu se razviti za stabiliziranje ovisno o kojem se mehanizmu radi. Na primjer, ako se ustanovi da je mehanizam agregiranja stvaranje intermolekulske S-S veze kroz tio-disulfid izmjenu, stabilizacija se može postići modificiranjem sulfhidril aminokiselina, liofiliziranjem iz kiselih otopina, kontroliranjem sadržaja vlage, upotrebom prikladnih-aditiva i razvojem kompozicija specifične polimerne matrice.

Oralno davanje

Za oralno davanje farmaceutska kompozicija može biti u čvrstom ili tekućem obliku, npr. u obliku kapsule, tablete, suspenzije, emulzije ili otopine. Farmaceutska kompozicija se preferirano izrađuje u obliku jedinice doziranja koja sadrži danu količinu aktivnog sastojka. Pogodna dnevna doza za čovjeka ili drugog sisavca može široko varirati ovisno o stanju pacijenta i drugim faktorima ali je mogu odrediti stručnjaci u području primjenom rutinskih metoda.

Oblici čvrstog doziranja za oralno davanje može uključivati kapsule, tablete, supozitorije, prašak i granule. U takvim čvrstim formama doziranja aktivni spoj može se miješati s najmanje jednim inertnim razrjeđivačem kao što je sukroza, laktoza ili škrob. Takvi oblici doziranja mogu također obuhvaćati, kao što .je normalna praksa, dodatne tvari, npr. sredstva za podmazivanje kao što je magnezij stearat. U slučaju kapsula, tableta i pilula oblici doziranja mogu također sadržavati puferska sredstva. Tablete i pilule mogu se dodatno prirediti s enteričkom presvlakom.

Konjugati se mogu miješati s pomoćnim sredstvima kao što je laktoza, sukroza, škrob u prahu, celulozni esteri alkanskih kiselina, stearinska kiselina, magnezijev oksid, talk, magnezij stearat, magnezij oksid, natrijeve i kalcijeve soli fosforne i sumporne kiseline, akacija, želatina, natrijev alginat, polivinil-pirolidin i/ili polivinil alkohol te se tabletiraju ili kapsuliraju za konvencionalno davanje.

Alternativno se mogu otopiti u slanoj vodi/ vodi, polietilen glikolu, propilen glikolu, etanolu, uljima (kao što je kukuruzno ulje, ulje kikirikija, ulje sjemenki pamuka ili sezamovo ulje), tragakant gumi i/ili različitim puferima. Druga pomoćna sredstva i načini davanja dobro su poznati u farmaceutskoj struci. Nosač ili razrjeđivač mogu uključivati materijale za produžavanje vremena kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat sam ili s voskom, ili druge materijale dobro poznate u struci.

Farmaceutska kompozicija može se podvrgnuti konvencionalnim farmaceutskim postupcima kao što je sterilizacija i/ili može sadržavati konvencionalna pomoćna sredstva kao što su konzervansi, stabilizatori, sredstva za vlaženje, emulgatore, punila itd., npr. kako je ovdje drugdje prikazano.

Tekući oblici doziranja za oralno davanje mogu uključiti farmaceutski prihvatljive emulzije, otopine, suspenzije, sirupe i eliksire koji sadrže inertne razrjeđivače koji se uobičajeno upotrebljavaju u struci, kao što je voda. Takve kompozicije mogu također obuhvaćati pomoćna sredstva kao što su sredstva za vlaženje, sladila, sredstva za aromu i mirisna sredstva.

Topičko davanje

Formulacije pogodne za topičko davanje uključuju tekuće il polutekuće preparacije pogodne za prodiranje kroz kožu (npr. linimenti, losioni, mazila, kreme ili paste) i kapljice pogodne za davanje u oko, uho ili nos.

Unošenje kroz pluća

Formulacije pogodne za upotrebu s raspršivačem, mlaznim ili ultrasoničnim, tipično će obuhvaćati polipeptid ili konjugat otopljen u vodi pri koncentraciji od, npr. oko 0,01 do 25 mg konjugata po mL otopine, preferirano oko 0,1 do 10 mg/mL. Formulacija može također uključivati pufer i jednostavni šećer (npr. za stabilizaciju proteina i reguliranje osmotskog tlaka) i/ili albumin iz ljudskog seruma u rasponu koncentracija od 0,1 do 10 mg/mL. Primjeri pufera koji se mogu upotrijebiti su natrij acetat, citrat i glicin. Preferirano pufer će imati sastavi molarnost pogodnu da podesi pH otopine u području 3 do 9. Općenito molarnosti pufera od InM do 50 nM su pogodne za ovu namjenu. Primjeri šećera koji se mogu koristiti su alktoza, maltoza, manitol, sorbitol, trehaloza i ksiloza, obično u količinama u rasponu od 1% do 10% formulacije težinski.

Formulacija za raspršivanje može također sadržavati površinski aktivnu tvar da se smanji ili spriječi površinski potaknuto agregiranje proteina uzrokovano atomiziranjem otopine prilikom nastajanja aerosola. Raznolike površinski aktivne tvari mogu se upotrijebiti, kao što su polioksietilenski esteri masnih kiselina i alkoholi te polioksietilen sorbitan esteri masnih kiselina. Količine će općenito biti u području između 0,001% i 4% formulacije težinski. Naročito preferirana površinski aktivna tvar za svrhu ovog izuma je polioksietilen sorbitan monooleat.

Specifične formulacije i postupci za generiranje pogodnih disperzija tekućih čestica izuma opisane su u WO94/20069, US 5,915,378, US5,960,792, US5,957,124, US 5,934,272, US 5,915,378, US 5,855,564, US 5,826,570 i US 5,522,385 što je ovdje uključeno putem reference.

Formulacije za upotrebu s inhalatorom mjerene doze općenito će obuhvaćati fino usitnjen prašak. Ovaj prašak može se proizvesti liofiliziranjem i onda mljevenjem tekuće formulacije konjugata i može također sadržavati stabilizator kao što je albumin iz ljudskog seruma (HSA). Tipično doda se više nego 0,5% (tež.) HSA. Dodatno se može dodati u preparaciju jedan ili više šećera ili šećernih alkohola ako je neophodno. Primjeri uključuju laktozu, maltozu, manitol, sorbitol, sorbitozu, trehalozu, ksilitol i ksilozu. Količina koja se dodaje u formulaciju može biti u rasponu od oko 0,01 do 200 % (tež.), preferirano od oko l do 50 % prisutnog konjugata. Takve formulacije se onda liofiliziraju i melju do željene veličine čestica.

Čestice odgovarajuće veličine se onda suspendiraju u pogonskom sredstvu pomoću sredstva za smanjivanje napetosti površine. Pogonsko sredstvo može biti bilo koja konvencionalna tvar koja se upotrebljava za ovu namjenu, kao što je klorfluorugljik, klorfluorugljikovodik, fluorugljikovodik ili ugljikovodik, uključujući triklofluormetan, diklordifluormetan, diklortetrafluoretanol i 1,1,1,2,-tetrafluoretan ili njihove kombinacije. Pogodna sredstva za smanjivanje napetosti površine uključuju sorbitan trioleat i lecitin iz soje. Oleinska kiselina može također biti korisna kao sredstvo za smanjivanje napetosti površine. Smjesa se onda napuni u sredstvo za nanošenje. Primjer komercijalno raspoloživog inhalatora s mjernom dozom za primjenu u predmetnom izumu je Ventolin inhalator s mjernom dozom, proizveden u GlaxoInc.,Research Triangle Park, N.C.

Formulacije za inhalatore praha obuhvaćat će fino usitnjen suhi prašak koji sadrži konjugat i može također sadržavati sredstvo za stvaranje mase kao što je laktoza, sorbitol, sukroza ili manitol u količinama koje olakšavaju raspršivanje praška iz uređaja, npr. 50% do 90% formulacije težinski. Čestice praška imaju aerodinamička svojstva u plućima koja odgovaraju česticama gustoće od oko l g/cm2 koje imaju središnji promjer manji nego 10 mikrometara, preferirano između 0,5 i 5 mikrometara, najviše preferirano između 1,5 i 3,5 mikrometara. Primjer inhalatora praha prikladan za upotrebu u skladu s ovim podučavanjima je Spinhaler inhalator za prah, proizveden kod Fisons Corp., Bedford, Mass.

Prašak za ove uređaje može se generirati i/ili isporučiti postupcima opisanim u US 5,997,848, US 5,993,783, US 5,985,248, US 5,976574, US 5,922354, US 1 5,785,049 i US 5,654,007.

Mehanički uređaji projektirani za unošenje terapeutskih proizvoda u pluća uključuju, ali nisu na njih ograničeni, raspršivače, inhalatore s mjernom dozom i inhalatore praha koji su svi poznati stručnjacima u području. Specifični primjeri komercijalno raspoloživih uređaja za primjenu ovog izuma su Ultravent raspršivač, proizveden kod Mallinckrodt, Inc., StLouis, Missouri; AcornIInebulizer proizveden kod Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; Ventolin metered dose inhaler, proizveden u Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; Spinhaler powder inhaler, proizveden u Fisons Corp., Bedford, Massachusetts; "standing cloud" uređaj iz Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, CaIifoniia; AIR inhaler proizveden uAlkermes, Cambridge, Massachusetts; i the AERx pulmonaly drug deli very system proizveden kod Aragigm Corporation, Hayward, California.

Izum pruža kompozicije i postupke za liječenje bakterijskih i virusnih infekcija, rak ili tumora, interstićijskih pulmonarnih bolesti kao što je idiopatska pulmonarna fibroza, granulomatoznih bolesti, poremećaja u kostima (npr. poremećaj metabolizma kosti kao maligna osteopporoza) i autoimunih bolesti kao reumatoidni artritis.

U daljnjem aspektu izum se odnosi na postupak za liječenje sisavca koji ima cirkulirajuća antitijela protiv huIFNG ili rhuIFNG, a taj postupak obuhvaća davanje spoja koji ima bioaktivnost IFNG i koji ne reagira s navedenim antitijelima. Spoj je preferirano konjugat kako je ovdje opisano a sisavac je preferirano ljudsko biće. Sisavci koje treba liječiti mogu bolovati od bilo koje od bolesti gore navedene za koja je IFNG koristan za liječenje. Nadalje, izum se odnosi na postupak za pripremanje farmaceutskog proizvoda za upotrebu u liječenju sisavca koji ima cirkulirajuća antitijela protiv huIFNG ili rhuIFNG gdje je spoj koji ima bioaktivnost IFNG i koji ne reagira s navedenim antitijelima formuliran u formulaciju za injekcije ili inače pogodnu formulaciju. Izraz "cirkulirajuća antitijela" ima namjenu da naznači antitijela koja nastaju u sisavcu kao odgovor na liječenje s komercijalno raspoloživim IFNG preparacijama.

Također je promišljena primjena sekvence nukleotida koja kodira IFNG polpeptid izuma u primjenama genske terapije. Određenije, može biti interesantno da se upotrijebi sekvenca nukleotida koja kodira IFNG polipeptid opisan gore u odjeljku gore naslova "Glikozilirani polipeptidi izuma modificirani da uključuju dodatna mjesta glikoziliranja". Glikoziliranje polipeptida se tako postiže za vrijeme genske terapije, tj. nakon ekspresije sekvence nkleotida u ljudskom tijelu.

Promišljene primjene genske terapije uključuju liječenje onih bolesti u kojima se očekuje da će polipeptid pružiti efikasnu terapiju.

Lokalno unošenje IFNG pomoću genske terapije može pružiti terapeutsko sredstvo za ciljano područje dok se istovremeno izbjegava problem potencijalne toksičnosti povezan sa nespecifičnim davanjem.

Zamišljene su i in vitro i in vivo metodologije genske terapije.

Poznato je nekoliko metoda za prenošenje potencijalno terapeutskih gena u definirane stanične populacije. Za dalje reference vidi, npr . Mulligan, "The Basic Science Of Gene Therapy", Science, 260, pp. 926-31 (1993). Ovi postupci uključuju:

Direktni transfer gena, npr. kako je opisano u Wolff et al., "Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In vivo", Science 247, pp. 1465-68 (1990);

Transfer DNA posredovan liposomom, npr. kako je opisano u Caplen et al., "Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis" Nature Med., 3, pp. 39-46 (1995); Crystal, The Gene As A Drug, Nature Med., 1, pp.- 15-17 (1995); Gao and Huang, "A Novel Cationic liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells", Biochem Biophys Res. Comm, 179, pp. 280-85 (1991);

Transfer DNA posredovan retrovirusom, npr. kako je opisano u Kay et al., "In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor DC-Deficient Dogs", Science, 262, pp. 117-19 (1993); Anderson, "Human Gene Therapy", Science, 256, pp.808-13(1992);

Transfer DNA posredovan DNA virusom. Takvi DNA virusi uključuju adenoviruse (preferirano vektori bazirani na Ad-2 ili Ad-5), herpes viruse (preferirano vektori bazirani na herpes simplex virusima) i parvoviruse (preferirano "defektni" ili vektori bazirani na neautonomnom parovirusu, više preferirano vektori bazirani na adeno-asociranom virusu, najviše preferirano vektori bazirani na AAV-2). Vidi, npr., Ali et al., "The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy", Gene Therapy, 1, pp. 367-84 (1994); US 4,797368, and US 5,139,941.

Izum je dalje opisan u sljedećim primjerima. Primjeri ne bi ni na koji način trebali biti shvaćeni kao ograničavanje općenitosti predmetne prijave i zahtjeva.

MATERIJALI I METODE

Probe

Opis probe za interferon

Prethodno je objavljeno da IFNG reagira s i aktivira IFNG receptore na HeLa stanicama. Stoga se trankripcija aktivira na promotorima koji imaju element odgovora stimuliranog interferonom (ISRE). Tak je moguće da se pretražuje za antagoniste interferonskih receptora primjenom reporter gena luciferaze povezanog s ISRE (ISRE-luc) smještenim u HeLa.

Primarna proba

HeLa stanice se ko-transficiraju s ISRE-luc i pCDNA 3.1/hygro i foci (stanični klonovi) nastaju selekcijom u DMEM mediju koji sadrži higromicin B. Stanični klonovi se pretraže za aktivnost luciferaze u prisutnosti ili odsutnosti IFNG. Oni klonovi koji pokazuju najveći odnos stimulirane prema nestimuliranoj luciferaznoj aktivnosti koriste se dalje u probama.

Za pregledavanje muteina nasađeno je 15000 stanica/udubini u pločama za kulturu s 96 udubina i inkubirano preko noći u DMEM mediju. Sljedeći dan se muteini kao i poznati standard dodaju u stanice u različitim koncentracijama. Ploče se inkubiraju 6 sati na 37°C u 5% C02 zračnoj atmosferi. LucLite supstrat (Packard Bioscience, Groningen, Nizozemska) se potom doda u svaku udubinu. Ploče se zapečate i mjeri luminiscenca na TopCount luminometru (Packard) u SPC načinu (brojanje pojedinačnog fotona). Svaka pojedina ploča sadrži udubine inkubirane s IFNG kao stimuliranu kontrolu i nestimulirana aktivnost luciferaze služi kao unutrašnji standard za aktivnost muteina i varijacije iz eksperimenta u eksperiment.

Funkcionalno in vivo vrijeme poluživota IFNG konjugata

Mjerenje biološkog vremena poluživota može se provesti na niz načina opisanih u literaturi. Jedan postupak opisan je u p. 337-341) gdje je korištena intravenozna i intramuskularna inekcija IFNG u 8 mjeseci stare C57B1/6 miševe. Biološko vrijeme poluživota mjereno je biološkom probom koja određuje titar IFNG u serumu murina, primjenom Hep-2 stanica i virusa vezikularnog stomatitisa (VVS). Kao alternativu također su upotrijebili ELISA da ustanove razinu IFNG u serumu.

Kao alternativa može se upotrijebiti radioaktivno označen IFNG za proučavanje supkutane apsorpcije i distribucije IFNG. 609( proveli su ispitivanja 125IFNG u anesteziranim ženkama Spraque-Dawley štakora. Nakon davana subkutanog davanja uzorci krvi i tkiva skupljeni su i IFNG je određen gama brojačem.

PEGiliranje IFNG

PEGilirani rhuIFNG može se prirediti kako je opisano u primjeru 2 US 5,109,120. Analogno, modoficirani IFNG polipeptidi ovdje opisani, npr. koji nose mutaciju N25K mogu se PEGilirati. Nastali PEG-IFNG- N25K konjugat ima vezanu dodatnu PEG molekulu u usporedbi s konjugatom rhuIFNG.

Prepariranje farmaceutske kompozicije

Farmaceutska kompozicija, npr. za liječenje intersticijskih pulmonarnih bolesti, može se prirediti formuliranjem relevantnog pročišćenog konjugata izuma u kompoziciji za injekcije postupcima dobro poznatim stručnjaku tako da svaka fiola obuhvaća konjugat u količini koja obuhvaća 50, 100, 200, 300, 400 ili 500 mikrograma, npr., rhuIFNG ili IFNG- N25K,

Identificiranje aminokiselina izloženih na površini

Strukture

Eksperimentalne 3D strukture huIFNG određene rendgenskom kristalografijom opisali su objavio je strukturu IFNG homodimera u kompleksu s dvije molekule topljivog oblika IFNG receptora. Koordinate ove strukture nisu javno objavljene. Thiel et al objavio je strukturu IFNG homodimera u kompleksu s dvije molekule topljivog oblika IFNG receptora i trećom molekulom receptora u strukturi koja nema interakcija s IFNG homodimerom.

Metode

Dostupno područje površine (ASA)

Kompjuterski program upotrijebljen je da se izračuna dostupna područja površine (ASA) individualnih atoma u strukturi. Ovaj postupak tipično koristi probnu veličinu 1,4Å i definira dostupno područje površine (ASA) kako područje koje čini središte probe. Prije ovog računana sve molekule vode, atomi vodika i drugi atomi koji nisu direktno povezani s proteinom se uklone iz seta koordinata.

Frakcionalni ASA pokrajnjeg lanca

Frakcionalni ASA pokrajnjeg lanca računa se dijeljenjem sume ASA svih atoma u pokrajnjem lancu s vrijednosti koja predstavlja ASA atoma u pokrajnjem lancu ovog tipa aminokiseline u produženom Ala-x-Ala tripeptidu.

Za ovaj primjer se CA atom smatra kao dio pokrajnjeg lanca glicina ali ne i ostalih aminokiselina. Sljedeća tablica se koristi kao standard za 100% ASA pokrajnjeg lanca:

Ala 69.23 Å2

Arg 200.35 Å2

Asn 106.25 Å2

Asp 102.06 Å2

Cys 96.69 Å2

Gln 140.58 Å2

Glu 134.61 Å2

Gly 32.28 Å2

His 147.00 Å2

De 137.91 Å2

Leu 140.76 Å2

Lys 162.50 Å2

Met 156.08 Å2

Phe 163.90 Å2

Pro 119.65 Å2

Ser 78.16 Å2

Thr 101.67 Å2

Trp 210.89 Å2

Tyr 176.61 Å2

Val 114.14 Å2

Aminokiseline koje nisu nađene u strukturi definirane su kao da imaju 100% izloženost zbog toga što se za njih smatra da se nalaze u fleksibilnim područjima.

Određivanje udaljenosti između atoma:

Udaljenost između atoma određena je primjenom programa molekulske grafike npr.

Određivanje mjesta vezanja receptora:

Mjesto vezanja receptora definira se da obuhvaća sve aminokiseline kojima se pristupačno područje površine mijenja nakon vezanja receptora. Ovo se određuje s najmanje dva ASA računa: jedan na izoliranom ligandu (ima) u kompleksu ligand(i)/receptor(i) i jedan za kompletan kompleks ligand(i) / receptor(i).

Rezultati

Upotrijebljena je rendgenska struktura IFNG homo dimera u kompleksu s dvije molekule topljivog . oblika IFNG receptora i trećom molekulom IFNG receptora u strukturi koja nema interakcija s IFNG homodimerom kako je objavio Thiel et al. Structure 8: 927 - 936 (2000). Struktura se sastoji od IFNG-homodimera gdje su dvije molekule označene A i B. Za svrhu izgradnje nalazi se i dodatna molekula metionina ispred IFNG sekvence označena MO i ta je sekvenca C-terminalno skraćena za deset aminokiselina (Q133 je zadnja aminokiselina u konstruiranoj molekuli). MO se ukloni iz strukture u svim računima ovog primjera. Struktura dvaju IFNG monomera ima vrlo slabu elektronsku gustoću nakon aminokiseline 120 i aminokiseline su modelirane samo do aminokiseline T126. Prema tome. aminokiseline S121 - T126 su uklonjene iz strukture prije računanja u ovom primjeru. Dva fragmenta receptora označeni C i D čine direktne interakcije s IFNG homodimerom i nisu uključeni u ove proračune.

Izloženost površine

Provođenje frakcijskih ASA računa na homodimeru A i B bez MO i S121 - T126 u obje molekule dovelo je do sljedećih aminokiselina koje imaju više nego 25% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini u barem jednom monomeru: Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K12, K13, Y14, N16, G18, H19, S20, D21, A23, D24, N25, G26, T27, G31, i K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59, K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97, S99, T101, D102,L103, N104,H111, Q115, A118. V E119.

Sljedeće aminokiseline imale su više od 50% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini u barem jednom monomeru: Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K13, N16, G18, H19, S2Q, D21, A23, D24, N25, G26, T27, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104, Q115, A118, E119.

Provođenje frakcijskih ASA računa na homodimeru A i B bez MO i S121 - T126 u obje molekule i uključivši receptorske molekule C i D dovelo je do sljedećih aminokiselina koje imaju više nego 25% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini u barem jednom monomeru: Q1, D2, P3, K6, E9, N10, K13, Y14, N16, G18, H19, D21, N25, G26, G31, K34, N35, K37, E38, E39, S40, K55, K58, N59, K61, D62, D63, Q64, S65, Q67, K68, E71, T72, K74, E75, N78, V79, K80, N83, S84, N85, K86, K87, D90, E93, K94, N97, S99, T101, D102, L103, N104, E119.

Sljedeće aminokiseline imale su više od 50% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini u barem jednom monomeru: P3, K6, N10, K13, N16, D21, N25, G26, G31, K34, K37, E38, E39, K55, K58, N59, D62, Q64, S65, K68, E71, E75, N83, S84, K86, K87, K94, N97, S99, T101, D102, L103 i N104.

Svi gornji položaji su ciljevi za modificiranje u skladu s predmetnim izumom.

Uspoređujući dvije liste rezultata u K12, S20, A23, D24, T27, H111, Q115 i A118 koji se uklanjaju iz više nego 25% pokrajnjeg lanca liste ASA nakon vezanja receptora i Q1, D2, E9, G18, H19, S20, A23, D24, T27, Q115, A118 i E119 koji se uklanjaju iz više nego 50% pokrajnjeg lanca liste ASA nakon vezanja receptora.

Aminokiseline koje nisu određene u strukturi razmatraju se kao da su potpuno izloženi na površini, tj. aminokiseline S121, P122, A123, A124, K125. T126, G127, K128, R129, K130, R131, S132, Q133, M134, L135, F136, R137, G138, R139, R140, A141, S142, Q143.

Ove aminokiseline također sačinjavaju odvojene ciljeve za uvođenje vetnih grupa u skladu s predmetnim izumom (ili se može smatrati kao da pripada u grupu aminokiselina izloženih na površine, tj. koje imaju više nego 25% i 50% pokrajnjeg lanca izloženo).

Mjesto vezanja receptora

Provođenje ASA računa kao što je gore opisano dovelo je do sljedećih aminokiselina IFNG molekule koje imaju reducirani ASA u najmanje jednom od monomera kompleksa u usporedbi s računanjem na izoliranom dimeru:

Q1, D2, Y4, V5, E9, K12, G18, H19, S20, D21, V22, A23, D24, N2S, G26, T27, L30, K34, K37, K108, H111, E112, I114, Q115, A118, E119.

PRIMJERI

Primjer 1

Projektiranje ekspresijske kasete za ekspresiju IFNG u stanicama kvasca i CHO

DNA sekvenca, pristupni broj K13274 za GenBank, što obuhvaća punu duljinu cDNA koja kodira zreli huIFNG bez prirodnog signalnog peptida, modificirana je kako bi se olakšala visoka ekspresija u stanicama kvasca. Prvo, MAT signalni peptid je uveden umjesto IFNG signalnog peptida kako bi se olakšala sekrecija u medij kvasca. Drugo, kodoni sekvence huIFNG nukleotida modificirani su tako da je napravljena prednost u primjeni kodona za kodone koji se često upotrebljavaju u kvascu. Nakon toga izvjesni nukleotidi u sekvenci su supstituirani drugima da se uvedu mjesta prepoznavanja za DNA restrikcijske endonukleaze. Primeri su projektirani tako da se gen može sintetizirati. Primeri su sklopljeni u sintetski gen u jednom koraku primjenom opreme Platinum Pfx-polimeraza (Life Technologies) i standardnim PCR ciklirajućim parametrima u tri koraka.

Sklopljeni gen je pojačan pomoću PCR korištenjem istih uvjeta i ima sekvencu pokazanu u SEQ ID NO 3.

Sintetiziran gen je kloniran u pJSO37-lip Okkels, J.S. (1996) Rec. DNA Biotech. III.,vol 782, 202-207) između HindIII mjesta na 5’ kraju i Xbal na 3’ kraju tvoreći pIGY-1.

Kako bi se napravio jednolančani konstrukt koji sadrži kovalentno vez'ane raonomerne IFNG polipeptide učinjeni su sljedeći konstrukti:

I) Konstrukt koji sadrži dva zrela huIFNG polipeptida pune duljine povezane preko 19mernog veznog peptida modeliran prema područjima u humanom IgA1 za pričvršćivanje (Lunn CA et al., J. Biol. Chem., 267,17920-17924,1992).

To je učinjeno pomoću PCR primjenom sljedećih primera

ADJ002 5'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-S' (SEQ ID NO 4)

ADJ003 5'-GCGGCCCTCTAGATTACT-S1 (SEQ ID NO 5)

ADJ004 5'-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3' (SEQ ID NO 6);

ADJ007 5'ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGGAGTAGAAGGAACCGCTGTTTTAGCAGCTGGAGAGATT-3' (SEQ ID NO 7)

Fragmenti PCR klonirani su u pIGY - 1 između ClaI na 5’ kraju i XbaI na 3’ kraju sklapanjem dva monomera u SphI (uveden u područje povezivača). Konstrukt je nazvan pIGY - 2.

II) Konstrukt koji sadrži dva zrela huIFNG polipeptida pune duljine bez povezivača. Za ovu svrhu sljedeći primeri su upotrijebljeni za PCR.

ADJ002 5'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3' (SEQ ID NO 8)

ADJ003 5’-GCGGCCCTCTAGATrACT-3’ (SEQID NO 9)

ADJ006 5'-TTTAGAGGTAGAAGAGCTTCTCAGCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3' (SEQ DD NO 10)

ADJ009 5'-AGCTTCTTTCACATATGGATCTTGCTGAGAAGCTCTTCTACGTCTAAA-3'(SEQ iD NO 11)

Fragment PCR je-sklopljen u dva koraka PCR i kloniran između Clai na 5’ kraju i Xbai na 3’ u pIGY-1 te nazvan pIGY-3.

III) Konstrukt koji sadrži dva C-terminalno skraćena (zadnjih 11 aminokiselina) monomerna IFNG polipeptida kovalentno vezana kroz 19merni peptidni povezivao spomenut gore. Upotrijebljeni su sljedeći primeri:

ADJ001 5’-TGCTCTAGACATCTGAGATCGT]TrCTCTTTCC-3’ (SEQ ID NO 12)

ADJ002 5'-GGTTTGATATCGATGGCCAA-3' (SEQ ID NO 13)

ADJ004 5'-CATCTCCGTCCACTCCGACTCCATAGCATGCAAGATCCATATGTGAAAGAA-3' (SEQ ID NO 14)

ADJ005 5'ATCTTGCATGCTATGGAGTCGGAGTGGACGGAGATGGAGTTGGCGGAGTAGAAGGAACCGGCATCTGAGATCTTTTTCTCC-3' (SEQID NO 15)

Fragmenti PCR klonirani su u pIGY-l između ClaI na 5’ kraju i XbaI na 3’ kraju sklapanjem dva monomera u SphI (uveden u područje povezivača). Konstrukt je nazvan pIGY-4.

Konstrukti za ekspresiju u CHO stanicama

Za ekspresiju IFNG u CHO stanicama sintetiziran je sljedeći oligonukleotid da omogući kloniranje IFNG uključujući njegov signalni peptid u pcDNA3.1/hygro (Ivitrogen).

ADJ012 5'-cgcggatccatgaaatatacaagttatatcTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAAGATCCATATGTGAAAGAAGCT-3’ (SEQ ID NO 16)

Za kloniranje ovog ekspresijskog vektora pojačavanje PCR pomoću ADJ012 i ADJ003 i pIGY kao templata proizvodi 450 bp fragment koji se može klonirati između BamHI na 5’ kraju i XbaI na 3’ kraju pcDNA3.1/hygro čime se dobiva pIGY-5 .

Za uvođenje mjesta glikoziliranja u IFNG su projektirani na takav način da PCR generirane promjene se mogu uvesti u ekspresijski plazmid (pIGY - 5)klasičnim PCR u dva koraka nakon čega slijedi kloniranje PCR fragmenta između BamHI na 5’ kraju i XbaI na 3’ kraju.

Prema tome dva vektorska primera su projektirana za primjenu sa specifičnim mutacijskim primerima:

ADJ013 5'-OATGGCTGGCAACTAGAAG-3' (SEQ E) NO 17) (antisense downstream vektor primer)

ADJ014 5'-TGTACGGTGGGAGGTCTAT-3' (SEQ K) NO 18) (sense upstrcam vektor primer)

Za različite muteine projektirani su sljedeći primeri:

K12T.

ADJ015 5'-AGCATTAAAATACITCGTCAAGTTTTCAGC-3’ (SEQ ID NO 19)

ADJ016 5'-GCTGAAAACTTGACGAAGTATITTAATGCT-3’ (SEQ ID NO 20)

G18T

ADJ017 5'-CACATCAGAATGAGTAGCATTAAAATA-3' (SEQ ID NO 21)

ADJ018 5'-TATTTTAATGCTACTCATTCTGATGTG-3' (SEQ ID NO 22)

E38N

ADJ019 5'-CATAATTTTTCGATCGGATTCGTTTTTCCAATTCTT-3' (SEQ ID NO 23)

ADJ020 5'-AAGAATTGGAAAAACGAATCCGATCGAAAAATTATG-3' (SEQ ID NO 24)

K61T

ADJ021 5'-AATAGACTGATCGTCTGTAAAGTTTTTAAA-3' (SEQ ID NO 25)

ADJ022 5'-TTTAAAAACTTTACAGACGATCAGTCTATT-3' (SEQ ID NO 26)

N85T

ADJ023 5'-TCTTTTCTTTTTAGTACTATTGAAAAACTT-3' (SEQ ID NO 27)

ADJ024 5'-AAGTTTTTCAATAGTACTAAAAAGAAAAGA-3' (SEQ ID NO 28)

K94N

ADJ025 5'-ATAATTAGTCAAATTTTCGAAGTCATG-3' (SEQ ID NO 29)

ADJ026 5'-GATGACTTCGAAAATTTGACTAATTAT-3' (SEQ ID NO 30)

S99N

ADJ027 5’-AATCAAGTCAGTAACGTTATAATTAGTCAA-3' (SEQ ID NO 31)

ADJ028 5'-TTGACTAATTATAACGTTACTGACTTGAAT-3' (SEQ ID NO 32)

Q106T

ADJ029 5'-ATGAATAGCTTTACTAGTCACATTCAAGTC-3' (SEQ ID NO 33)

ADJ030 5'-GACTTGAATGTGACTAGTAAAGCTATTCAT-3' (SEQ ID NO 34)

Nakon PCR u dva koraka i digestiju BamHI i XbaI svaki od ovih parova primera se očekuje da proizvede 447 bp fragment koji se može klonirati u pIGY-5.

Ekspresija interferona γ u CHO stanicama

Gore spomenuti konstrukt se transficira u CHO K1 staničnu liniju (ATCC#CCL-61) pomoću Lipofectamine 2000 (Life Technologies, USA) kao transfekcijskog sredstva. 24 sata kasnije medij za kulturu se sakupi i proba na aktivnost interferona γ i koncentraciju.

Claims (29)

1. Konjugat naznačen time da pokazuje IFNG aktivnost i obuhvaća najmanje jednu N-vezanu šećernu jedinku kovalentno vezanu na uvedeno mjesto N-glikoziliranja IFNG poiipeptida, a taj polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od one polaznog IFNG polipeptida u najmanje jednom uvedenom mjestu N-glikoziliranja.

2. Konjugat prema zahtjevu 1 naznačen time da je polazni polipeptid divlji tip humanog IFNG (huIFNG) ili njegova varijanta ili fragment.

3. Konjugat prema zahtjevu 1 ili 2 naznačen time da je uvedeno mjesto N-glikoziliranja uvedeno na položaj koji u huIFNG zauzima aminokiselina koji je najmanje 25% pokrajnjeg lanca izloženo na površini.

4. Konjugat prema zahtjevu 3 naznačen time da je uvedeno mjesto N-glikoziliranja uvedeno na položaj koji u huIFNG zauzima aminokiselina koji je najmanje 50% pokrajnjeg lanca izloženo na površini.

5. Konjugat prema zahtjevu 3 naznačen time da je uvedeno mjesto N-glikoziliranja uvedeno supstitucijom izabranom iz grupe koja se sastoji od Q1N+P3S/T, P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, E9N+L11S/T, K12S/T, K13N+F15S/T, Y14N+N16S/T, G18S/T, GISR, G18N+S20T, H19N+D21S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40T, E39N+D41Sn, S40N+R42S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, K61N+D63S/T, D62N+Q64S/T, D63N, D63N+S65T, Q64N+I66S/T, S65N-KJ67S/T, Q67N, Q67N+S69T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, T72N+K74S/T, K74N+D76S/T, E75N+M77S/T, K80S/T, V79N+F81S/T, K80N+F82S/T, NSSS^, S84N+K86S/T, K87S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, D90N-HF92S/T, E93N+L95SH, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T. D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, E119N, E119N+S121T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+ A141S/T, R140N i R140N+S142T, supstitucija je označena relativno prema huIFNG sa sekvencom aminokiselina prikazanom u SEQ ID NO 2.

6. Konjugat prema zahtjevu 4 naznačen time da je uvedeno mjesto N-glikoziliranja uvedeno supstitucijom izabranom iz grupe koja se sastoji od P3N+V5S/T, K6N+A8S/T, K12S/T, K13N+F15SAT, G18S/T, D21N+A23S/T, G26N+L28S/T, G31N+L33S/T, K34N+W36S/T, K37N+E39S/T, E38N, E38N+S40S/T, E39N+D41S/T, K55N+F57S/T, K58N+F60S/T, K61S/T, D62N-Q64S/T, Q64N+I66S/T, S65N+Q67S/T, K68N+V70S/T, E71N+I73S/T, E75N+M77S/T, N85S/T, S84N+K86S/T, K86N+K88S/T, K87N+R89S/T, K94N, K94N+T96S, S99N, S99N+T101S, T101N+L103S/T, D102N+N104S/T, L103N+V105S/T, Q106S/T, P122N+A124S/T, A123N+K125S/T, A124N, A124N+T126S, K125N+G127S/T, T126N+K128S/T, G127N+R129S/T, K128N+K130S/T, R129N+R131S/T, K130N, K130N+S132T, R131N+Q133S/T, S132N+M134S/T, Q133N+L135S/T, M134N+F136S/T, L135N+R137S/T, F136N+G138S/T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T, R140N i R140N+S142T, R137N+R139S/T, G138N+R140S/T, R139N+A141S/T,R140N i R140N+S142T, supstitucija je označena relativno prema huIFNG sa sekvencom aminokiselina prikazanom u SEQ ID NO 2.

7. Konjugat prema bilo kojem od zahtjeva 3 -6 naznačen time da je uvedeno mjesto N-glikoziliranja uvedeno supstitucijom izabranom iz grupe koja se sastoji od K12S/T, G18S/T, E38N, E38N+S40T, K61S/T, N85S/T, K94N, i Q106S/T.

8. Konjugat prema zahtjevu 1 naznačen time da obuhvaća najmanje još jednu ne-polipeptidnu jedinku.

9. Konjugat prema zahtjevu 8 naznačen time da je daljnja ne-polimerna jedinka polimerna molekula.

10. Konjugat naznačen time da pokazuje IFNG aktivnost i obuhvaća najmanje jednu ne-polipeptidnu jedinku kovalentno vezanu na IFNG polipeptid , a polipeptid obuhvaća sekvencu aminokiselina koja se razlikuje od polaznog IFNG polipeptida u najmanje jednoj uvedenoj aminokiselini cisteinu.

11. Konjugat prema zahtjevu 10 naznačen time da je polazni polipeptid divlji tip humanog IFNG (huIFNG) ili njegova varijanta ili fragment.

12. Konjugat prema zahtjevu 11 naznačen time da je cistein uveden na položaj koji je u huIFNG zauzet aminokiselinom koja ima najmanje 25% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini.

13. Konjugat prema zahtjevu 12 naznačen time da je cistein uveden na položaj koji je u huIFNG zauzet aminokiselinom koja ima najmanje 50% svog pokrajnjeg lanca izloženo na površini.

14. Konjugat prema zahtjevu 13 naznačen time da je uvedeni cistein uveden supstitucijom izabranom iz grupe koja se sastoji od N10C, N16C, E38C, N59C, N83C, K94C i N104C.

15. Konjugat prema zahtjevu 13 naznačen time da je uvedeni cistein uveden na položaj zauzet aminokiselinama 121-143 u huIFNG.

16. Konjugat prema bilo kojem od zahtjeva 10-15 naznačen time da je polipeptidna jedinka polimerna molekula.

17. Konjugat prema zahtjevu 9 ili 16 naznačen time da je polimerna molekula linearni ili razgranati poletilen glikol.

18. Konjugat prema bilo kojem od zahtjeva 1-17 naznačen time da je IFNG polipeptid skraćen na C-terminalnom kraju.

19. Sekvenca nukleotida naznačena time da kodira polipeptidni dio konjugata prema bilo kojem od zahtjeva 1-18.

20. Ekspresijski vektor naznačen time da ima sekvencu nukleotida prema zahtjevu 19.

21. Stanica domaćina naznačena time da obuhvaća sekvencu nukleotida prema zahtjevu 19 ili -ekspresijski vektor prema zahtjevu 20.

22. Farmaceutska kompozicija naznačena time da obuhvaća konjugat prema bilo kojem od zahtjeva 1-18 i farmaceutski prihvatljiv razrjeđivač, nosač ili pomoćno sredstvo.

23. Konjugat prema bilo kojem od zahtjeva 1-18 ili farmaceutska kompozicija prema zahtjevu 22 naznačen time da je za upotrebu kao lijek.

24. Upotreba konjugata prema bilo kojem od zahtjeva 1-18 ili farmaceutske kompozicije prema zahtjevu 22 naznačena time da je za proizvodnju lijeka za liječenje intersticijskih pulmonarnih oboljenja .

25. Upotreba prema zahtjevu 24 naznačena time da je intersticijsko pulmonarno oboljenje idiopatska pulmonarna fibroza.

26. Upotreba prema bilo kojem od zahtjeva 24 ili 25 naznačena time da se lijek daje subkutano.

27. Postupak za liječenje intersticijskih pulmonarnih oboljenja naznačen time da postupak obuhvaća davanje konjugata prema bilo kojem od zahtjeva 1-18 ili farmaceutske kompozicije prema zahtjevu 22 pacijentu kojem to treba.

28. Postupak prema zahtjevu 27 naznačen time da je intersticijsko pulmonarno oboljenje idiopatska pulmonarna fibroza.

29. Postupak prema zahtjevu 27 ili 28 naznačen time da se konjugat daje subkutano.