HU217108B - Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban - Google Patents
Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban Download PDFInfo
- Publication number
- HU217108B HU217108B HU9402511A HU9402511A HU217108B HU 217108 B HU217108 B HU 217108B HU 9402511 A HU9402511 A HU 9402511A HU 9402511 A HU9402511 A HU 9402511A HU 217108 B HU217108 B HU 217108B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- cells
- mdr
- transport
- calcein
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 230000036457 multidrug resistance Effects 0.000 title claims abstract description 29
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 21
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title description 10
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 title description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims abstract description 42
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 53
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 33
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 29
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 28
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical group C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 229960001722 verapamil Drugs 0.000 claims description 16
- 108010047230 Member 1 Subfamily B ATP Binding Cassette Transporter Proteins 0.000 claims description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 claims description 4
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 2
- 102100030306 TBC1 domain family member 9 Human genes 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 abstract description 31
- -1 calcein compound Chemical class 0.000 abstract description 4
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 98
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 18
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 14
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 10
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 10
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 9
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 8
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 8
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 102100033350 ATP-dependent translocase ABCB1 Human genes 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 5
- 101001017818 Homo sapiens ATP-dependent translocase ABCB1 Proteins 0.000 description 5
- 230000009056 active transport Effects 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 description 4
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 102000053576 human ABCB1 Human genes 0.000 description 4
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 3
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 3
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000002825 functional assay Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N Vinblastine Natural products O=C(O[C@H]1[C@](O)(C(=O)OC)[C@@H]2N(C)c3c(cc(c(OC)c3)[C@]3(C(=O)OC)c4[nH]c5c(c4CCN4C[C@](O)(CC)C[C@H](C3)C4)cccc5)[C@@]32[C@H]2[C@@]1(CC)C=CCN2CC3)C JXLYSJRDGCGARV-WWYNWVTFSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 229940045799 anthracyclines and related substance Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229960003048 vinblastine Drugs 0.000 description 2
- JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N vincaleukoblastine Chemical compound C([C@@H](C[C@]1(C(=O)OC)C=2C(=CC3=C([C@]45[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]6(CC)C=CCN([C@H]56)CC4)(O)C(=O)OC)N3C)C=2)OC)C[C@@](C2)(O)CC)N2CCC2=C1NC1=CC=CC=C21 JXLYSJRDGCGARV-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 2
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N (1s,4r,5z,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,18r,19r,20s,21e,26r,27s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@H]1CC[C@H](\C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)C(C)C(=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]2C)C1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N (4Z,18Z,20Z)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)\C=C/C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)C\C=C/C=C\C(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 1
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 1
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 1
- OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N Fluo-3 Chemical compound CC1=CC=C(N(CC(O)=O)CC(O)=O)C(OCCOC=2C(=CC=C(C=2)C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)N(CC(O)=O)CC(O)=O)=C1 OZLGRUXZXMRXGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000014842 Multidrug resistance proteins Human genes 0.000 description 1
- 108050005144 Multidrug resistance proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087367 P-glycoprotein 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100039032 Phosphatidylcholine translocator ABCB4 Human genes 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- PTPUOMXKXCCSEN-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[2-[2-[5-[3-(acetyloxymethoxy)-2,7-dichloro-6-oxoxanthen-9-yl]-2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]-n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(OCOC(C)=O)=C(Cl)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O PTPUOMXKXCCSEN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMJRSUWJSRKGNO-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 2-[n-[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]-2-[2-[2-[bis[2-(acetyloxymethoxy)-2-oxoethyl]amino]-5-(2,7-dichloro-3-hydroxy-6-oxoxanthen-9-yl)phenoxy]ethoxy]-4-methylanilino]acetate Chemical compound CC(=O)OCOC(=O)CN(CC(=O)OCOC(C)=O)C1=CC=C(C)C=C1OCCOC1=CC(C2=C3C=C(Cl)C(=O)C=C3OC3=CC(O)=C(Cl)C=C32)=CC=C1N(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O AMJRSUWJSRKGNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930191479 oligomycin Natural products 0.000 description 1
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=CC(N)=C2)C2=[O+]C2=C1C=CC(N)=C2 TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004621 scanning probe microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000032895 transmembrane transport Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
- Y10S436/808—Automated or kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physiology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány tárgya kvantitatív in vitrő analitikai diagnősztikaieljárás daganatők széles körű (műltidrőg-) rezisztenciáját őkőzótranszpőrtfehérje (MDR- fehérje) aktivitásának és a vizsgált mintabiőlógiailag aktív fehérjekőncentrációjának meghatárőzására. Atalálmány tárgyát képezik az eljárás végrehajtására szőlgáló reagens-készletek is. A találmány szerinti eljárásban a vizsgált biőlógiaimintát vagy annak egy részét valamely jól detektálható vegyület őlyanszármazékával érintkeztetik, amely a transzpőrtfehérje szűbsztrátja,képes a sejtekbe bejűtni, és a sejtek belsejében valamely enzim(ek)hatására őlyan jól detektálható vegyületté alakűlni, amely atranszpőrtfehérjének nem szűbsztrátja, és a sejtekben felhalmőzódik.Valamilyen méréssel (példáűl flűőreszcencia vagy fényabszőrpció)kvantitatívan jellemzik a sejtekben az átalakűlt vegyületfelhalmőzódásának sebességét, majd a vizsgált biőlógiai mintát vagyannak másik részét transzpőrtblőkkőló jelenlétében érintkeztetik a jóldetektálható vegyület származékával, és azőnős módőn, kvantitatívanjellemzik a sejtekben az átalakűlt vegyület felhalmőzódásánaksebességét, majd a mért értékekből empirikűs összefüggések alapján akívánt diagnősztikai egységben megadják a mintában találhatóbiőlógiailag aktív MDR-fehérje aktivitását és/vagy kőncentrációját. Atalálmány szerinti eljárás és reagenskészletek előnyösen alkalmazhatókelsősőrban hűmán klinikai labőratóriűmi diagnősztikában, tűmőrősdaganatők műltidrőgrezisztencia-mértékének MDR-aktivitás alapjántörténő győrs és egyszerű becslésére, ami nagy segítséget nyújthat akívánt kemőterápiás beavatkőzás pőntős megtervezésében. ŕ
Description
A találmány tárgya kvantitatív in vitro analitikai diagnosztikai eljárás daganatok széles körű (multidrog-) rezisztenciáját okozó transzportfehérje (MDR-fehéije) aktivitásának és a vizsgált minta biológiailag aktív fehérjekoncentrációjának meghatározására. A találmány tárgyát képezik az eljárás végrehajtására szolgáló reagenskészletek is.
A találmány szerinti eljárásban a vizsgált biológiai mintát vagy annak egy részét valamely jól detektálható vegyület olyan származékával érintkeztetjük, amely a transzportfehétje szubsztrátja, képes a sejtekbe bejutni, és a sejtek belsejében valamely enzim(ek) hatására olyan jól detektálható vegyületté alakulni, amely a transzportfehérjének nem szubsztrátja, és a sejtekben felhalmozódik. Valamilyen méréssel (például fluoreszcencia vagy fényabszorpció) kvantitatívan jellemezzük a sejtekben az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét, majd a vizsgált biológiai mintát vagy annak egy előzetesen elkülönített részletét transzportblokkoló jelenlétében érintkeztetjük a jól detektálható vegyület származékával, és azonos módon, kvantitatívan jellemezzük a sejtekben az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét, majd a mért értékekből empirikus összefüggések alapján a kívánt diagnosztikai egységben megadjuk a mintában található biológiailag aktív MDR-fehérje aktivitását és/vagy koncentrációját.
A találmány szerinti eljárás és reagenskészletek előnyösen alkalmazhatók elsősorban humán klinikai laboratóriumi diagnosztikában, tumoros daganatok multidrogrezisztencia-mértékének MDR-aktivitás alapján történő gyors és egyszerű becslésére, ami nagy segítséget nyújthat a kívánt kemoterápiás beavatkozás pontos megtervezésében.
Jelen leírás vonatkozásában az alábbi fogalmakat a megadott értelemben fogjuk használni. Az alább közölt fogalmaknak a leírás értelmezésekor abban az esetben is az itt megadott értelmét kell figyelembe venni, ha az esetlegesen eltér a szakirodalomban szokásos értelmezéstől.
Transzportfehérje - olyan membránfehérje, amely valamely anyag sejthártyán keresztüli transzportját az ATP energiájának felhasználásával a koncentrációgradienssel szemben is képes végrehajtani.
Transzportblokkoló - olyan hatóanyag, amely egy vizsgált anyag (például a calcein-AM) sejthártyán keresztüli aktív transzportját bármilyen hatásmechanizmus útján gátolja. Transzportblokkoló lehet például a transzportfehérje inhibitora vagy feleslegben alkalmazott szubsztrátja.
MDR1, P-glikoprotein - 170 kD molekulatömegű membránfehérje, melynek funkcionális expressziója multidrogrezisztenciát idéz elő az adott sejtben.
MDR-fehérje - a jelen leírás vonatkozásában MDRfehérjének nevezzük a humán MDR1 gén termékét és annak valamennyi funkcionális analógját, tekintet nélkül azok eredetére és közhasználatban lévő elnevezéseire (a leírásban MDR-fehétjének nevezzük például a szakirodalomban MRP-nek nevezett MDR-homológ fehéijét is). Másképpen: MDR-fehérje=multidrogrezisztenciát okozó fehéije.
MDR-fehérje szubsztrátja - olyan anyag (például citotoxikumok, citosztatikumok, egyéb sejtidegen anyagok), amely a sejtből MDR-fuggő aktív transzport útján eltávolítódik.
Multidrogrezisztencia - a tumoros szövetekben funkcionális MDR-fehéije-expresszió folytán kialakuló széles spektrumú gyógyszer-rezisztencia, melynek kialakulása folytán az adott szövet egy sor egymástól lényegesen különböző szerkezetű citotoxikumia és citosztatikumia egyidejűleg rezisztenssé válik.
Funkcionális analóg - valamely fehéije funkcionális analógja minden olyan fehérje, amelynek működése azonos vagy hasonlójellegű. A funkcionális analógok a legtöbb esetben strukturális homológiát is mutatnak. Az MDR1 fehéije funkcionális analógja például minden olyan membrán-transzportfehéije, amely képes sejtműködést károsító anyagokat aktív transzport útján a sejtből eltávolítani.
Strukturálisan homológ fehérjék - a strukturális homológok olyan fehéijék, melyeknek van legalább egy fontos, egymáshoz hasonló térszerkezetű alegységük vagy egyéb részletük.
MDR-aktivitás - multidrogrezisztenciát okozó transzportfehéije-aktivitás, az MDR1 fehérje és funkcionális analógjainak aktivitása.
Jól detektálható vegyület - olyan vegyület, amelynek jelenléte és/vagy koncentrációja adott körülmények között valamely jellemző sajátsága alapján műszeresen vagy érzékszervileg jól reprodukálhatóan, pontosan meghatározható. Ilyenek lehetnek például színes vegyületek, fluoreszcens vegyületek, lumineszcens vegyületek, valamint katalizátor- vagy enzimaktivitással rendelkező vagy ilyen aktivitáshoz szükséges vegyületek (például koenzimek).
MDR-fiiggő ATP-áz - az MDR-fehéije azon tulajdonsága, hogy képes ATP-t hidrolizálni, és ily módon az aktív transzporthoz energiát szolgáltatni.
Sejtpermeábilis vegyület - olyan, általában hidrofób karakterű vegyület, amely a sejthártyán keresztül koncentrációgradiensével arányosan, gyakorlatilag akadálytalanul képes áthatolni a sejt belsejébe.
A rákos daganatok kemoterápiájának hatékonyságát jelentősen csökkenti vagy megakadályozza az úgynevezett multidrogrezisztencia kialakulása, amelynek oka emberi daganatok esetén egy 170000 D molekulatömegű membránfehéije, az MDR1 fehérje, más néven Pglikoprotein vagy valamely funkcionális analógjának felszaporodása. Az MDR-fehéijék az ATP energiáját felhasználó aktív transzporttal eltávolítják a sejtekből az alkalmazott citosztatikus anyagokat, például a vinka-alkaloidokat, antraciklinszármazékokat és egyéb, a klinikumban széles körben használt hatékony tumorellenes szereket, megakadályozva így azok hatását [Gottesman, Μ. M. és munkatársa: Annu. Rév. Biochem 62, 385 (1993); Arceci, R. J., Blood 81, 2215 (1993)].
Az MDR-fehéije in vitro klinikai vizsgálatára, daganatsejtekben történő kimutatására számos módszert alkalmaznak, ezek megbízhatósága azonban jelenleg nem kielégítő. Különösen nehéz megvalósítani olyan in vitro funkcionális vizsgálatot, ami valóban jellemzi az MDR2
HU 217 108 Β fehéije aktivitása által kiváltott gyógyszer-rezisztencia várható spektrumát. Jelenleg elsősorban citotoxicitási tesztek [Bruggermann, Ε. P. és munkatársai: J. Bioi. Chem., 267, 21020 (1992)] és a drogokat szimuláló festékek kiáramlásának vizsgálata szolgálnak erre a célra [Goldstein, L. J. és munkatársai: Oncology/Haematology, 12, 243 (1992)]. Kimutatták, hogy az MDR-fehérjét expresszáló sejtekben bizonyos fluoreszcens antraciklinek [Herweijer, H. és munkatársai : Cytometry, 10, 463 (1989)], és fluoreszcens festékek, mint például a Rhodamine 123 [Neyfakh, A. A., Exp. Cell Rés. 174, 168 (1988)] vagy a fluo-3 [Wall, D. M. és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst. 83, 206 (1991); Wall, D. M. és munkatársai: Eur. J. Cancer 29, 1024 (1993)] felhalmozódása kisebb mértékű, és ezeket a festékeket már alkalmazzák az MDR-fehéije kimutatására. Ugyanakkor számos elvi és technikai probléma (például a festékek sejten belüli kötődése, sejtorganellumokban történő felhalmozódása, metabolizálódása, fluoreszcenciaváltozása, a plazmamembránon keresztül történő kiáramlása) erősen csökkenti e vizsgálatok értékelhetőségét [Gottesman és munkatársai (1993); Weaver, J. L. és munkatársai Exp. Cell. Rés. 196, 323 (1991)]. Ismeretes, hogy a fluo-3AM (fluo-3-acetoxi-metil-észter) alkalmazása esetén a szabad festék kalciumfüggő fluoreszcenciája zavaija a vizsgálat értékelését [Haughland, R. P. és munkatársa (szerk.): „Handbook of Fiuorescent Probes and Research Chemicals” 115-116. old., Molecular Probes Inc., Eugene, OR (1992-94)].
A jelen találmány közvetlen előzményét azon korábbi felismerésünk képezi [Homolya, L. és munkatársai: J. Bioi. Chem. 268, 21493 (1993)], miszerint bizonyos fluoreszcens vegyületek hidrofób, sejtpermeábilis észterszármazékait az MDR-fehérje aktívan eltávolítja a sejtekből, míg a sejteken belül, az észterázok hatására keletkező szabad festékekre az MDR-fehérje már nem hat. Kimutattuk, hogy a kereskedelmi forgalomban beszerezhető, sejtek életképességének vizsgálatára használt calcein-AM (calcein-acetoxi-metil-észter) az MDR-függő ATP-áz kitűnő aktivátora (Ka<l pmol/l), a szabad calcein azonban nem, valamint azt, hogy a calcein-AM felhalmozódását követő sejten belüli calceinakkumulációt az MDR jelenléte csökkenti.
A calcein-AM gyakorlatilag nem fluoreszkál, erősen zsíroldékony (hidrofób), ezért a sejtmembránon gyorsan áthatol. A sejtek belsejében lévő észterázok a vegyületben található észtercsoportokat lehasítják, és így vízoldékony (hidrofil) fluoreszcens termék(ek) keletkeznek. Ha calcein-AM-et élő sejtekkel érintkeztetünk, a sejt belseje felé mutató, fennmaradó gradiens miatt a calcein-AM beáramlása folyamatos, és így a hasítási termékek a sejtben felhalmozódnak. Ezen az elven alapul a calcein-AM szakirodalomból közismert sejt-életképességi tesztekben való alkalmazása is, ugyanis a sérült vagy elpusztult sejtekben a bejutott calcein-AM-ből nem keletkezik fluoreszcens termék [Haughland, R. P. és munkatársa (szerk.): „Handbook of Fiuorescent Probes and Research Chemicals” 172-173. oldal, Molecular Probes Inc., Eugene, OR (1992)]. A szakirodalomból ismert még a calcein alkalmazása liposzómák fúziójának és lízisének tanulmányozására is [Kendall, D. A. és munkatársa: Anal. Biochem. 134, 26 (1983); Allén, T.
M., Liposome Technoi. 3, 177 (1984)].
A tárgyban megjelent legújabb tudományos közleményünkben [Holló, Zs. és munkatársai: Biochim. Biophys. Acta, 1191,384 (1994)] igazoltuk, hogy a calcein-AM alkalmas az MDR1 fehérje jelenlétének kvalitatív funkcionális kimutatására. Amennyiben az MDRfehétje jelen van a sejtmembránban, a sejtbe beáramló calcein-AM-et a sejtekből aktív transzport útján eltávolítja, így a hasítás és a fluoreszcens calcein (vagy calceinszármazékok) felhalmozódása a sejtekben csak jelentősen csökkent mértékben történik meg.
A calcein a fluoreszcein molekula származéka, így igen magas a moláris fluoreszcenciás emissziós koefficiense, gerjesztési és emissziós paraméterei kiválóan alkalmassá teszik áramlási citometriás (flow cytometry), konvencionális fluoreszcens, vagy akár lézerpásztázó mikroszkópiás alkalmazásra is. A sejtben felszabaduló szabad calcein a sejtekből nem áramlik ki, nem mutat sejtkárosító hatást, fluoreszcenciája kevéssé érzékeny a különböző behatásokra, így gyakorlatilag nem érzékeny a pH-, vagy a Ca2+-, illetve az Mg2+koncentráció változásaira, és nem lép kölcsönhatásba a sejt különböző komponenseivel.
Mint azt már említettük, calcein-AM alkalmazása esetén a fluoreszcens calcein(származékok) felhalmozódása aktív MDR-fehéijét tartalmazó sejtekben MDRmentes (vagy elhanyagolható MDR-aktivitású) kontrolisejtekhez viszonyítva igen lassú. Az MDR-transzportfehérje jó szubsztrátjai (feleslegben adva őket) és inhibitorai, mint például a verapamil, a vinblasztin, a ciklosporin A és az oligomycin [Gottesman és munkatársa: (1993); Arceci és munkatársai: (1993)] az MDR calcein-AM-transzportáló működését blokkolják, így hozzáadásukkor a fluoreszcencia növekedésének üteme MDR-fehéijét tartalmazó sejtekben jelentősen felgyorsul [Holló, Zs. és munkatársai: (1994)]. A verapamilnak vagy a vinblasztinnak MDR-fehéijét nem tartalmazó sejtekben nincs hatása a fluoreszcens festék felhalmozódásának sebességére. így párhuzamos mérésekkel ugyanazon a sejttípuson összehasonlítható a fluoreszcencia növekedési sebessége MDR-fíiggő transzportgátló szer alkalmazásával és a nélkül. MDR-fehéijét nem tartalmazó sejtekben ez a két érték azonos, míg MDR-fehéijét expresszáló sejtekbenjelentősen különbözik (1. példa, 1. és 2. ábra).
Az eddig elmondottakból világosan kitűnik, hogy igen nagy gazdasági és gyógyászati jelentősége lenne egy olyan kvantitatív in vitro diagnosztikai analitikai módszer kidolgozásának, amely egy viszonylag egyszerű és olcsó mérési eljárás útján lehetővé tenné a különböző tumoros daganattípusok multidrogrezisztenciamértékének megbízható előzetes becslését.
A kitűzött feladat megoldásához nem elégséges a gyógyszer-rezisztenciát okozó MDR-fehérje jelenlétét és aktivitását a vizsgált tumorszövetben pusztán kvalitatívan kimutatni, mivel a kialakult multidrogrezisztencia mértékének ismerete kulcsfontosságú az alkalmazandó terápia megtervezésében. Egy rákos beteg kemoterápiás
HU 217 108 Β kezelése jelenleg több százezer forintos költséggel jár, tehát a daganatban expresszált MDR-fehérje megbízható kvantitatív diagnosztizálása jelentős gazdasági előnyt jelentene, mivel egy ilyen eljárás segítségével pontosan meg lehetne becsülni az alkalmazandó kemoterápiás szerek hatékony mennyiségét, illetve eldönthető lenne, hogy az adott daganatféleség egyáltalán fog-e reagálni az alkalmazni tervezett citotoxikumokra. Nem mellékes a találmány szerinti in vitro diagnosztikai eljárás alkalmazásának azon várható terápiás előnye sem, miszerint segítségével kalkulálható az alkalmazni kívánt citotoxikumok minimális hatékony mennyisége, ami a fellépő káros mellékhatásokat jelentősen csökkentheti.
Olyan diagnosztikai érték meghatározására van tehát szükség, ami megbízhatóan jelzi egy adott daganatféleség MDR-aktivitásának mértékét. Jelenleg ilyen kvantitatív MDR-diagnosztikai eljárás nem áll az orvosok rendelkezésére, az alkalmazott kvalitatív MDR-kimutatási módszerek pedig a fent ismertetett hiányosságok és nehézségek miatt előreláthatóan nem fejleszthetőek egyszerűen kivitelezhető kvantitatív diagnosztikai eljárássá.
Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy amennyiben tumorsejteket calcein-AM-mel érintkeztetünk és a keletkező fluoreszcens calcein(származékok) sejteken belüli felhalmozódásának sebességét megfelelő körülmények között mérjük, a mért értékből belső standard alkalmazásával, egyszerű empirikus összefüggés alapján olyan dimenzió nélküli f aktivitásfaktor számítható, amely a vizsgált sejtek típusától, méretétől és eredetétől függetlenül, kvantitatívan jellemzi a sejtekben található biológiailag aktív MDR-transzportfehéije koncentrációját, más szóval a minta maximális MDRaktivitását. Belső standardként a vizsgált minta calceinakkumulációjának transzportblokkoló jelenlétében mért értékét alkalmazzuk. A találmány szerinti eljárás alapján számított f faktor értékéből kalkulálható MDR-koncentráció a klinikailag fontos koncentrációtartományban (0-0,2 pg MDR-fehérje/mg összfehérje) rendkívül jó egyezést mutat a különböző multidrogrezisztens tumoros sejtvonalakban található funkcionális MDR-fehérje immunológiai módszerrel mért koncentrációjával (1. példa, 3. ábra).
A találmány szerinti megoldásnak a klinikai diagnosztika területén való alkalmazhatósága szempontjából rendkívül fontos kiemelni azt a tényt, hogy a találmány szerinti eljárás alapján számított f faktor értéke minden vizsgált esetben jól korrelált az adott sejtvonal túléléssel mérhető, azaz ténylegesen kialakult gyógyszer-rezisztenciájával (1. példa, 1. ábra).
Azt is kimutattuk, hogy immunológiailag detektálható, de biológiailag inaktív, azaz rezisztenciát nem okozó MDR-mutánst expresszáló ráksejtek f értéke nullának adódik, ami szintén alátámasztja azt a feltételezést, hogy a találmány szerinti kvantitatív analitikai eljárás klinikailag releváns módon jellemzi a tumoros szövetek MDR-aktivitását, azaz drogeltávolító képességét (2. példa).
Mivel a találmány szerinti mérési eljárás a calceinAM-nek kizárólag azon tulajdonságain alapul, miszerint sejtpermeábilis, az MDR-transzportfehéije szubsztrátja és a sejtben általánosan jelen levő enzimek (észterázok) hatására olyan vegyületté alakul, amely jól mérhető, az MDR-transzportfehéqének nem szubsztrátja, és a sejten belül felhalmozódik (a sejtből való kijutása erősen gátolt), szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti eljárásban más hasonló vegyületek is alkalmazhatóak, melyekre a felsorolt tulajdonságok kivétel nélkül kielégítő mértékben fennállnak.
Az elmondottak alapján a találmány tárgyát képezi egy, a daganatok multidrogrezisztenciáját okozó transzportfehéije (MDR-fehétje) aktivitásának és/vagy koncentrációjának biológiai mintákban történő in vitro mennyiségi meghatározására szolgáló eljárás, amely szerint a vizsgált biológiai mintát vagy annak egy részét valamely jól detektálható vegyület olyan származékával érintkeztetjük, amely a transzportfehérje szubsztrátja, képes a sejtekbe bejutni, és a sejtek belsejében valamely enzim(ek) hatására olyan jól detektálható vegyületté alakulni, amely a transzportfehéijének nem szubsztrátja és a sejtekben felhalmozódik. A találmány szerinti eljárás alapján valamely méréssel kvantitatívan jellemezzük a sejtekben az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét (F), majd ezt követően a vizsgált biológiai mintát vagy annak másik részét transzportblokkoló jelenlétében érintkeztetjük a jól detektálható vegyület származékával, és azonos módon, kvantitatívan jellemezzük a sejtekben az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét (F*). Az f=(F*-F)/F* empirikus összefüggés alapján meghatározzuk a vizsgált mintában jelen lévő MDR-fehéije aktivitásának mértékére jellemző dimenzió nélküli f aktivitásfaktor értékét, és adott esetben empirikusan készített táblázat és/vagy grafikon és/vagy egyéb empirikus matematikai összefüggés segítségével f értékéből meghatározzuk és kívánt diagnosztikai egységekben kifejezve megadjuk a mintában található biológiai aktivitással rendelkező MDR-fehérje koncentrációját és/vagy a minta MDR-aktivitását.
A találmány szerinti eljárás előnyös megvalósítási módját jelenti a funkcionális MDR1 protein aktivitásának és/vagy koncentrációjának meghatározása.
A találmány szerinti eljárást előnyösen emlősből származó biológiai mintán, még előnyösebben humán klinikai szövetmintán hajtjuk végre.
A találmány szerinti eljárásban jól detektálható vegyületszármazékként előnyösen calceinszármazékot, még előnyösebben calcein-acetoxi-metil-észtert alkalmazunk.
A találmány szerinti eljárásban transzportblokkolóként előnyösen transzportfehéqe inhibitort vagy szubsztrátfelesleget, még előnyösebben verapamilfelesleget alkalmazunk.
A találmány szerinti eljárásban az átalakult vegyület felhalmozódását előnyösen fluoreszcenciaméréssel jellemezzük. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös megvalósítási módja szerint a mérést áramlási citométerben végezzük.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárások végrehajtására szolgáló, kitanítást is tartalmazó reagenskészletek.
HU 217 108 Β
A találmány szerinti reagenskészletek előnyösen tartalmaznak calceinszármazékot és/vagy transzportfehérje inhibitort vagy szubsztrátot, még előnyösebben calcein-acetoxi-metil-észtert és/vagy verapamilt.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány jobb megértését szolgáló ábrákat.
A 1. ábrán különböző mértékű multidrogrezisztenciát mutató P388 egérleukémia-sejtvonalak találmány szerinti eljárással történő MDR-aktivitás-vizsgálatának grafikus ábrázolását láthatjuk. Az ábrán bemutatott kísérletekben 2,5 χ 105/ml koncentrációjú sejtszuszpenziókat 0,25 pmol/l calcein-AM-mel inkubáltunk 37 °C-on, és a fluoreszcencia növekedését fluoreszcens-spektrofotométer segítségével követtük. Az abszcissza az időt ábrázolja, míg az ordináta a fluoreszcencia intenzitását mutatja önkényes fluoreszcenciaegységekben kifejezve. Az ábrán láthatjuk, hogy a görbék kezdeti szakaszának meredeksége a multidrogrezisztencia mértékének fokozódásával (P388-C<P388-MDRa<P388-MDRb) csökken, míg transzportblokkoló (verapamil) hozzáadása után a görbék meredeksége közel azonossá válik. Az ábra alapján számítható f faktor értékek (0,06<0,37<0,87) a citotoxicitási vizsgálattal meghatározott multidrogrezisztencía mértékével arányosnak bizonyultak (1. példa).
A 2. ábrán az MDR-fehéije aktivitásának áramlási citométerben történő mennyiségi meghatározását mutatjuk be calceinakkumuláció mérésével. Ezekben a kísérletekben drogszenzitív (kontroll: KB3) és növekvő multidrogrezisztenciájú (KB-Vla c) humán epidermoid karcinóma-sejtvonalakat vizsgáltunk. A 2,5xl05/ml koncentrációjú sejtszuszpenziókat 10 percig 37 °C-on 0,25 pmol/l calcein-AM-mel inkubáltuk, majd a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométerben mértük. Ezzel párhuzamosan meghatároztuk ugyanezen sejtek egy másik részletének calceinakkumulációját is, amelyet előzőleg 5 percig (25 °C-on) 100 pmol/l verapamillal előkezeltünk.
Az ábra jól demonstrálja, hogy a festékakkumuláció mértéke a multidrogrezisztencia növekedésével csökken (sötét hisztogramok). Ha az MDR-t előzőleg verapamillal blokkoljuk, a festékfelhalmozódás mértéke azonossá válik a kontrolisejtekben tapasztalható szinttel (körvonallal jelölt hisztogramok). A kontrollsejtek (KB3) calceinakkumulációjára a festéktranszportot blokkoló verapamil nem gyakorol hatást. Az abszcisszán a zöld fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve logaritmikus léptékben, míg az ordináta a sejtszámot mutatja. Az ábrán látható hisztogramok alapján a festékfelhalmozódás sebessége és f faktor értéke számítható (lásd
1. példa).
A 3. ábrán szemléltetjük az f aktivitásfaktor függését az MDR-fehéije koncentrációjának a közismert Westemblot-technikával, MDR-specifikus 4077 jelű ellenanyag alkalmazásával meghatározott értékétől. Kontrollsejtvonalak: P388-C, egérleukémia (□); K562C, humán eritroid leukémia (V); KB3, humán epidermoid karcinóma (A); 3T3C, egérfibroblaszt (O). Különböző mértékben multidrogrezisztens sejtvonalak: P388-MDRa_b, egérleukémia (); K562-MDR, b, humán eritroid leukémia (V); KB-Vla_c, humán epidermoid karcinóma (Δ); F4-6, egéreritroid leukémia (♦); 3T3-MDR, az emberi MDR1gyel stabilan transzfektált egérfibroblaszt (·).
Az ábrából kitűnik, hogy az f aktivitásfaktor értéke az expresszált fehérje koncentrációjával egy irányban nő. Az aktivitásfaktor a klinikailag fontos (0-0,2 pg MDR/mg összfehérje) tartományban arányos a fehérje koncentrációjával (lásd a grafikon kiemelt, nagyított részletét). Az is látható, hogy az expresszált fehérje mennyiségének csökkenésével a módszer (f aktivitásfaktor) érzékenysége nő (1. példa).
A 4. ábrán háromféle humán eritroid leukémia sejtvonal vizsgálatát mutatjuk be: K562C (kontroll) - nem rezisztens, K562-MDR - MDR-fehérjét expresszáló és K562-mMDR — inaktív mutáns MDR-t expresszáló sejtvonalak. Az expresszált MDR koncentrációját immunfluoreszcenciával határoztuk meg UIC2 jelű, a humán MDR1 fehérjére specifikus ellenanyag segítségével. Kontrollként egér-IgGl-ízotípus-ellenanyagot használtunk az immunspecifikus ellenanyag helyett. A jelölődést FITC-konjugált anti-egér-IgG második ellenanyagot használva tettük láthatóvá, majd a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométerben határoztuk meg. Az abszcisszán a zöld fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve logaritmikus léptékben, míg az ordináta a sejtszámot mutatja. Az ábra A panelén bemutatott kísérletből kitűnik, hogy a K562C sejtek igen csekély mennyiségben tartalmaznak MDR1 fehéijét, míg a másik két sejtvonal jelentős mértékű MDR1-expressziót mutat.
A 4. ábra B panelén ugyanezen sejtekben az MDRfehérje aktivitásának meghatározása látható calceinakkumuláció mérésével, a 2. ábrán bemutatott, áramlási citometriás módszerrel. A 2,5xl05/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót 10 percig 37 °C-on 0,25 pmol/l calcein-AM-mel inkubáltuk, majd a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométeren mértük (körvonallal jelölt hisztogramok). Ezzel párhuzamosan meghatároztuk ugyanezen sejtek egy másik részletének calceinakkumulációját is, amelyet előzőleg 5 percig (25 °C-on) 100 pmol/l verapamillal előkezeltünk (sötét hisztogramok). A 4. ábra B paneléből kitűnik, hogy a MDR-t kismértékben expresszáló sejtek (K562C) esetében a meghatározott MDRaktivitás is csekély (f=0,11). A funkcionális MDR-fehérjét nagy mennyiségben expresszáló sejtekben (K562MDR) az aktivitásfaktor értéke nagy (f=0,81), míg az inaktív mutáns MDR-t tartalmazó sejtvonal (K562mMDR) esetében f=0,006 (2. példa).
Az 5. ábrán bemutatott citotoxicitási vizsgálatban a 4. ábrán szereplő sejtvonalak drogrezisztenciáját határoztuk meg. A sejteket standard körülmények között 3 napig tenyésztettük 0,1-100 ng/ml adriamycin jelenlétében. Az abszolút sejtszámokat a droggal nem kezelt sejtek %-ában fejeztük ki.
Az ábrán jól látható, hogy a multidrogrezisztenciát a calceinakkumuláción alapuló funkcionális vizsgálat megbízhatóbban tükrözi, mint a fehérje jelenlétének hagyományos immunológiai detektálása. Az inaktív mutáns MDR-t expresszáló sejtek hiába tartalmazzák a fehérjét nagy mennyiségben, a multidrogrezisztencia közvetlenül az MDR-fehérje aktivitásával áll összefüggés5
HU217 108 Β ben, amelyet a calceinakkumuláció mérésével meghatározott f aktivitásfaktorral jellemezhetünk.
1. példa
MDR-fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatása calceinakkumuláció mérésével (fluoreszcens fotometriával és áramlási citométerben) tumoros sejtvonalakban. Az egpresszált fehérje mennyisége és az aktivitása közötti összefüggés bemutatása
A 1. ábrán bemutatott kísérletekben olyan P388 egérleukémia-sejtvonalakat alkalmaztunk, amelyek különböző mértékű multidrogrezisztenciát mutattak. Citotoxicitási vizsgálatban a P388-C- (kontroll) sejtvonalak adriamycinnel szembeni rezisztenciája az IC50-értékkel jellemezve 0,5 ng/ml-nek bizonyult, a P388-MDRa sejtek esetében ez az érték 4,0 ng/ml, míg a P388-MDRb sejtvonalnál pedig 9,0 ng/ml adódott. Az 1. ábrán bemutatott kísérletekben 2,5xl05/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót 0,25 pmol/l calcein-AM-mel inkubáltunk 37 °C-on, és a fluoreszcencia növekedését fluoreszcens spektrofotométer segítségével követtük. Az abszcissza az időt ábrázolja, míg az ordináta a fluoreszcencia intenzitását mutatja önkényes fluoreszcenciaegységekben kifejezve.
A multidrogrezisztenciát nem mutató kontrolisejtekben (P388-C) gyors festékfelhalmozódást kapunk, amit nem befolyásol a blokkolószer (jelen esetben 100 pmol/l verapamil) alkalmazása. Ezzel szemben a multidrog-rezisztens sejtekben alacsonyabb a blokkolószer nélküli festékfelhalmozódási alapsebesség (P388-MDRa és P388-MDRb). Ez az alapsebesség jelentős mértékben megemelkedik a blokkolószer hozzáadásának hatására ez utóbbi sejtekben (és kizárólag azokban). A módszer hasonlóan alkalmazható a 105-2χ 106 sejt/ml és 0,05-1 pmol/l calcein-AM koncentrációtartományokban. A kvantitatív meghatározás érdekében blokkolószerrel maximális MDR-gátlást kell elérni, ezért a kompetitív inhibitort a festékszármazékhoz viszonyítva nagy feleslegben kell alkalmazni. A görbék állandósult szakaszából meghatároztuk az alap (blokkolószer nélküli) (F) és a blokkolószer jelenlétében mérhető (F*) festékfelhalmozódási sebességeket. Az f=(F*-F)/F* empirikus összefüggés alapján számított aktivitásfaktor-értékek a következőknek adódnak:
P388-C 0,059
P388-MDRa 0,365
P388-MDRb 0,867
Ezek a számok jó összhangban állnak a citotoxicitási vizsgálatban meghatározott drogrezisztencia-értékekkel.
A 2. ábrán az MDR-fehéqe aktivitásának áramlási citométerben történő mennyiségi meghatározását mutatjuk be calceinakkumuláció mérésével. Ezekben a kísérletekben drogszenzitív (kontroll: KB3), illetve növekvő multidrogrezisztenciájú (KB-Vla_c) humán epidermoid karcinóma-sejtvonalakat vizsgáltunk. 2,5xl05/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót 10 percig 37 °C-on 0,25 pmol/l calcein-AM-mel inkubáltunk, majd a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométeren mértük. Ezzel párhuzamosan meghatároztuk ugyanezen sejtek egy másik részletének calceinakkumulációját is, amelyet előzőleg 5 percig (25 °C-on) 100 pmol/l verapamillal előkezeltünk.
Az ábra jól demonstrálja, hogy a festékakkumuláció mértéke a multidrogrezisztencia növekedésével csökken (sötét hisztogramok). Ha az MDR-t előzőleg verapamillal blokkoljuk, a festékfelhalmozódás mértéke azonossá válik a kontrollsejtekben tapasztalható szinttel (körvonallal jelölt hisztogramok). A kontrollsejtek (KB3) calceinakkumulációjára a calcein-AM transzportját blokkoló verapamil nem gyakorol hatást. Az abszcisszán a zöld fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve logaritmikus léptékben, míg az ordináta a sejtszámot mutatja. Mivel a sejteket minden esetben azonos időtartamig (10 percig) inkubáltuk a festékkel, az akkumulált festék mennyiségét tekinthetjük egyfajta festékfelhalmozódási sebességnek. így a blokkolószer nélküli (F) és annak jelenlétében mérhető (F*) akkumulált abszolút fluoreszcenciaértékekből, az f=(F*-F)/F* empirikus összefüggés alapján számított aktivitásfaktor-értékek a követke-
| zőknek adódnak: | |
| KB3 | 0,02 |
| KB-Vla | 0,43 |
| KB-Vlb | 0,74 |
| KB-V1C | 0,92 |
| Amennyiben az | abszolút fluoreszcenciák helyett lo- |
garitmikus csatomaszámokkal kívánjuk meghatározni f aktivitásfaktor értékét, az empirikus összefüggés a következőképpen módosul:
f=l_ek(G-G*) ahol G a blokkolószer nélküli, G* a blokkolószer jelenlétében mérhető átlagos csatomaszám, k pedig az abszolút fluoreszcencia átszámítására használt állandó, amely az adott áramlási citométerre jellemző.
A 3. ábrán szemléltetjük az f aktivitásfaktor függését az MDR-fehéqe koncentrációjától. Az 1. ábrán bemutatott fluoreszcens fotometriás módszer segítségével, a calceinfelhalmozódási görbék alapján meghatároztuk az MDR-aktivitásfaktor értékét több, különböző multidrogrezisztenciát mutató sejtvonalban.
Ezzel párhuzamosan hagyományos immunológiai módszerrel, a közismert Westem-blot-technikával meghatároztuk az expresszált fehérje koncentrációját az MDR-re specifikus 4077 jelű ellenanyagot használva. A részletes kísérleti módszereket a következő közleményekben találhatjuk: Homolya és munkatársai: (1993) és Holló és munkatársai: (1994). Az expresszált fehérje koncentrációját a lumineszcenciaértékekből egy ismert MDR-tartalmú minta alapján határoztuk meg. Kontrollsejtvonalak: P388-C, egérleukémia (□); K562C, humán eritroid leukémia (V); KB3, humán epidermoid karcinóma (Δ); 3T3C, egérfibroblaszt (O). Különböző mértékben multidrogrezisztrens sejtvonalak: P388, MDRa b egérleukémia (B); K562-MDRa_b, humán eritroid leukémia (\7); KB-Vla c, humán epidermoid karcinóma (Δ); F4-6, egér-eritroidleukémia (♦); 3T3-MDR, az emberi MDRl-gyel stabilan transzfektált egérfibroblaszt (·).
Az ábrából kitűnik, hogy az f aktivitásfaktor értéke az expresszált fehérje koncentrációjával egy irányban
HU 217 108 Β nő. Az aktivitásfaktor a klinikailag fontos (0-0,2 pg MDR/mg összfehérje) tartományban, arányos a biológiailag aktív fehérje sejten belüli koncentrációjával (lásd a grafikon kiemelt, nagyított részletét). Ezenfelül az is látható, hogy az expresszált fehéije koncentrációjának csökkenésével a módszer (az f aktivitásfaktor) érzékenysége nő.
2. példa:
Inaktív mutáns MDR-fehérje in vitro mennyiségi kimutatása immunológiai módszerrel és aktivitásának mennyiségi meghatározása calceinakkumulációméréssel
A 4. ábrán háromféle humán eritroid leukémiasejtvonal vizsgálatát mutatjuk be: K562C (kontroll) - nem rezisztens, K562-MDR - MDR-fehérjét expresszáló és K562-mMDR - inaktív mutáns MDR-t expresszáló sejtvonalak. Az expresszált MDR koncentrációját immunfluoreszcenciával határoztuk meg UIC2 jelű, a humán MDR1 fehérjére specifikus ellenanyag segítségével. Kontrollként egér-IgGl-izotípus-ellenanyagot használtunk az immunspecifikus ellenanyag helyett. A jelölődést FITC-konjugált anti-egér-IgG második ellenanyagot használva tettük láthatóvá, majd a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométerben határoztuk meg. Az abszcisszán a zöld fluoreszcencia intenzitása van feltüntetve logaritmikus léptékben, míg az ordináta a sejtszámot mutatja. Az ábra A panelén bemutatott kísérletből kitűnik, hogy a K562C sejtek igen csekély mennyiségben tartalmaznak MDR1 fehérjét, míg a másik két sejtvonal jelentős mértékű MDR 1-expressziót mutat.
A 4. ábra B panelén ugyanezen sejtekben az MDR-fehéije aktivitásának meghatározása látható calceinakkumuláció mérésével, az 1. példában bemutatott, áramlási citometriás módszerrel (2. ábra). A 2,5 χ 105/ml koncentrációjú sejtszuszpenziót 10 percig 37 °C-on 0,25 pmol/l calcein-AM-mel inkubáltuk, majd a sejtek fluoreszcenciáját áramlási citométeren mértük (körvonallal jelölt hisztogramok). Ezzel párhuzamosan meghatároztuk ugyanezen sejtek egy másik részletének calceinakkumulációját is, amelyet előzőleg 5 percig (25 °C-on) 100 pmol/l verapamillal előkezeltük (sötét hisztogramok). A 4. ábra B paneléből kitűnik, hogy a MDR-t kismértékben expresszáló sejtek (K562C) esetében a meghatározott MDR-aktivitás is csekély (f= 0,11). A funkcionális MDR-fehéijét nagy mennyiségben expresszáló sejtekben (K562-MDR) az aktivitásfaktor értéke f=0,81, míg az inaktív mutáns MDR-t tartalmazó sejtvonal (K562-mMDR) esetében f=0,006.
Az 5. ábrán bemutatott citotoxicitási vizsgálatban a 4. ábrán szereplő sejtvonalak multidrogrezisztenciáját határoztuk meg. A sejteket standard körülmények között 3 napig tenyésztettük 0,1-100 ng/ml adriamycin jelenlétében. Az abszolút sejtszámokat a droggal nem kezelt sejtek %-ában fejeztük ki. A három vizsgálat eredményét táblázatban foglaltuk össze:
| MDR-koncentráció (kontrolihoz viszonyított UIC2-jelölődcs) | Aktivitásfaktor (0 | Adriamycinrezisztencia (1C5O, ng/ml) | |
| K562-C | l,09x | 0,11 | 0,7 |
| K562-MDR | 3,98 χ | 0,81 | 3,1 |
| K562-mMDR | 4,18x | 0,006 | 0,35 |
A táblázatból világosan kitűnik, hogy a multidrogrezisztenciát a calceinakkumuláción alapuló funkcionális vizsgálat megbízhatóbban tükrözi, mint a fehéije jelenlétének hagyományos immunológiai detektálása. Az inaktív mutáns MDR-t expresszáló sejtek hiába tartalmazzák a fehérjét nagy mennyiségben, a multidrogrezisztencia közvetlenül az MDR-fehéije aktivitásával áll összefüggésben, amelyet a calceinakkumuláció mérésével meghatározott f aktivitásfaktorral jellemezhetünk.
Az elmondottakból szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány tárgyát képező eljárások és reagenskészletek lehetővé teszik a daganatos betegségekben jelentkező multidrogrezisztenciát okozó membrán-transzportfehérje, például az MDR1 vagy P-glikoprotein funkcionális in vitro klinikai diagnosztikai kimutatását és aktivitásának kvantitatív meghatározását. Éppen ezért a találmány szerinti megoldás a daganatos sejtekben kifejeződő MDR-fehéije in vitro meghatározásával jobban tervezhetővé és eredményesebben kivitelezhetővé teszi gyógyszerrezisztens daganatok kialakulása esetén a kemoterápiás beavatkozásokat, egyaránt csökkentve ezáltal a káros mellékhatásokat és az anyagi ráfordításokat.
Claims (17)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó transzportfehéije aktivitásának és/vagy koncentrációjának biológiai mintákban történő in vitro mennyiségi meghatározására, azzal jellemezve, hogyi) a vizsgált biológiai mintát vagy annak egy részét önmagában ismert módon egy jól detektálható vegyület olyan származékával érintkeztetjük, amely a transzportfehérje szubsztrátja, képes a sejtekbe bejutni, és a sejtek belsejében valamely enzim(ek) hatására olyan jól detektálható vegyületté alakulni, amely a transzportfehérjének nem szubsztrátja, és a sejtekben felhalmozódik;ii) egy méréssel önmagában ismert módon kvantitatívan jellemezzük a sejtekben az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét (F);iii) ezt követően a vizsgált biológiai mintát vagy annak másik részét önmagában ismert módon transzportblokkoló jelenlétében érintkeztetjük a jól detektálható vegyület származékával, és azonos módon, kvantitatívan jellemezzük a sejtekben az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét (F*); majdHU 217 108 Β iv) az f=(F*-F)/F* empirikus összefüggés alapján meghatározzuk a vizsgált mintában jelen lévő transzportfehéije aktivitásának mértékére jellemző dimenzió nélküli f aktivitásfaktor értékét; ésv) adott esetben empirikusan készített táblázat és/vagy grafikon, és/vagy egyéb empirikus matematikai összefüggés segítségével f értékéből meghatározzuk és kívánt diagnosztikai egységekben kifejezve megadjuk a mintában található biológiai aktivitással rendelkező transzportfehérje koncentrációját és/vagy a minta MDRakti vitását.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzportfehéijeként az MDR1 fehéije aktivitását és/vagy koncentrációját határozzuk meg.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzportfehéije aktivitását és/vagy koncentrációját emlősből származó biológiai mintában határozzuk meg.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzportfehérje aktivitását és/vagy koncentrációját humán klinikai mintában határozzuk meg.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jól detektálható vegyület származékaként calceinszármazékot alkalmazunk.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy calceinszármazékként calceinacetoxi-metil-észtert alkalmazunk.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzportblokkolóként transzportfehéije-inhibitort alkalmazunk.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzportblokkolóként transzportfehéije-szubsztrát feleslegét alkalmazzuk.
- 9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy transzportfehérje-szubsztrátként verapamilt alkalmazunk.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az átalakult vegyület felhalmozódásának sebességét fluoreszcenciaméréssel jellemezzük.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fluoreszcenciamérést áramlási citométerben hajtjuk végre.
- 12. Reagenskészlet, amely tartalmazza egy jól detektálható vegyület olyan származékát, amely a vizsgált transzportfehéije szubsztrátja, és amely származék az élő sejtek belsejében a sejtekben felhalmozódó, jól detektálható vegyületté alakul át, valamint tartalmazza a vizsgált transzportfehéije egy inhibitorát (transzportblokkolót), azzal jellemezve, hogy az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás végrehajtására alkalmazzuk.
- 13. A 12. igénypont szerinti reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy jól detektálható vegyületszármazékként calceinszármazékot tartalmaz.
- 14. A 13. igénypont szerinti reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy jól detektálható vegyületszármazékként calcein-acetoxi-metil-észtert tartalmaz.
- 15. A 12. igénypont szerinti reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy transzportblokkolóként transzportfehérje-inhibitort tartalmaz.
- 16. A 12. igénypont szerinti reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy transzportblokkolóként transzportfehérje-szubsztrátot tartalmaz.
- 17. A 16. igénypont szerinti reagenskészlet, azzal jellemezve, hogy transzportblokkolóként verapamilt tartalmaz.
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9402511A HU217108B (hu) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban |
| EP95930671A EP0784699B1 (en) | 1994-08-31 | 1995-08-31 | Assay and reagent kit for the quantitative in vitro determination in biological specimens of the activity of proteins causing multi-drug resistance in tumors |
| DE69510809T DE69510809T2 (de) | 1994-08-31 | 1995-08-31 | Test- und reagenziensatz für die quantitative in vitro bestimmung der aktivität von proteinen, die mehrfachresistenz gegen chemotherapeutika in tumoren verursachen, in biologischen proben |
| CA2198731A CA2198731C (en) | 1994-08-31 | 1995-08-31 | Assay and reagent kit for the quantitative in vitro determination in biological specimens of the activity of proteins causing multi-drug resistance in tumors |
| ES95930671T ES2137538T3 (es) | 1994-08-31 | 1995-08-31 | Metodo de analisis y kit de reactivos para la determinacion cuantitativa in vitro, en muestras biologicas, de la actividad de proteinas que causan resistencia a multiples farmacos en tumores. |
| AT95930671T ATE182179T1 (de) | 1994-08-31 | 1995-08-31 | Test- und reagenziensatz für die quantitative in vitro bestimmung der aktivität von proteinen, die mehrfachresistenz gegen chemotherapeutika in tumoren verursachen, in biologischen proben |
| PCT/HU1995/000042 WO1996006945A1 (en) | 1994-08-31 | 1995-08-31 | Assay and reagent kit for the quantitative in vitro determination in biological specimens of the activity of proteins causing multi-drug resistance in tumors |
| US08/928,528 US5872014A (en) | 1994-08-31 | 1997-09-12 | Assay for multi-drug resistance |
| US09/840,791 US6391656B2 (en) | 1994-08-31 | 2001-04-23 | Assay and reagent kit for evaluation of multi-drug resistance in cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9402511A HU217108B (hu) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9402511D0 HU9402511D0 (en) | 1994-10-28 |
| HUT72700A HUT72700A (en) | 1996-05-28 |
| HU217108B true HU217108B (hu) | 1999-11-29 |
Family
ID=10985550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9402511A HU217108B (hu) | 1994-08-31 | 1994-08-31 | Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5872014A (hu) |
| EP (1) | EP0784699B1 (hu) |
| AT (1) | ATE182179T1 (hu) |
| DE (1) | DE69510809T2 (hu) |
| ES (1) | ES2137538T3 (hu) |
| HU (1) | HU217108B (hu) |
| WO (1) | WO1996006945A1 (hu) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020042079A1 (en) * | 1994-02-01 | 2002-04-11 | Sanford M. Simon | Methods and agents for measuring and controlling multidrug resistance |
| US6277655B1 (en) | 1994-10-13 | 2001-08-21 | Solvo Biotechnology | Assay and reagent kit for evaluation of multi-drug resistance in cells |
| US6162616A (en) * | 1997-04-16 | 2000-12-19 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Multidrug resistance-associated polypeptide |
| HUP0002557A3 (en) * | 2000-07-03 | 2004-08-30 | Solvo Biotechnologiai Kft | Simple quantitative fluorescent assay method for determining the activity of transport proteins of interest |
| WO2002023186A2 (en) * | 2000-09-15 | 2002-03-21 | Virco Bvba | System and method for optimizing drug therapy for the treatment of diseases |
| US20030036049A1 (en) * | 2001-01-03 | 2003-02-20 | Medis El Ltd. | Optical method for testing sensitivity of cells |
| WO2003027264A2 (en) * | 2001-09-27 | 2003-04-03 | University Of Delaware | Coisogenic eukaryotic cell collections |
| WO2005116648A2 (en) * | 2004-05-25 | 2005-12-08 | Solvo Biotechnology, Inc. | Method and reagent kit for evaluation of multidrug-resistance activity |
| DK2084529T3 (da) | 2006-11-10 | 2011-02-07 | Absorption Systems Group Llc | Stabile cellelinier samt fremgangsmåder til bedømmelse af optagelsen af kemikalier i mavetarmkanalen |
| US7838256B2 (en) | 2007-02-23 | 2010-11-23 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Assay and kit for drug efflux transporter activity |
| US8445271B2 (en) | 2010-05-03 | 2013-05-21 | Enzo Life Sciences, Inc. | Processes and kits for determining multi-drug resistance of cells |
| HU231387B1 (hu) | 2017-10-25 | 2023-06-28 | Cellpharma Kft. | Fluoreszcens festékfelhalmozódási vizsgálat |
| HUP2100005A1 (hu) | 2018-05-15 | 2021-03-29 | Navolab Diagnosztika Kft | Rheumatoid arthrits páciensek biológiai terápiára adott válasz készségének becslése |
| EP3570028A1 (en) | 2018-05-15 | 2019-11-20 | MDQuest Kft. | Assessing responsiveness of rheumatoid arthritis patients to biological treatment |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4281061A (en) * | 1979-07-27 | 1981-07-28 | Syva Company | Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay |
| US5407653A (en) * | 1991-06-26 | 1995-04-18 | Brigham And Women's Hospital | Evaluation of the multidrug resistance phenotype |
| US5314805A (en) * | 1991-10-28 | 1994-05-24 | Molecular Probes, Inc. | Dual-fluorescence cell viability assay using ethidium homodimer and calcein AM |
-
1994
- 1994-08-31 HU HU9402511A patent/HU217108B/hu active IP Right Revival
-
1995
- 1995-08-31 AT AT95930671T patent/ATE182179T1/de active
- 1995-08-31 WO PCT/HU1995/000042 patent/WO1996006945A1/en active IP Right Grant
- 1995-08-31 DE DE69510809T patent/DE69510809T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-31 EP EP95930671A patent/EP0784699B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-31 ES ES95930671T patent/ES2137538T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-09-12 US US08/928,528 patent/US5872014A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9402511D0 (en) | 1994-10-28 |
| ES2137538T3 (es) | 1999-12-16 |
| US5872014A (en) | 1999-02-16 |
| ATE182179T1 (de) | 1999-07-15 |
| DE69510809D1 (de) | 1999-08-19 |
| EP0784699A1 (en) | 1997-07-23 |
| EP0784699B1 (en) | 1999-07-14 |
| HUT72700A (en) | 1996-05-28 |
| DE69510809T2 (de) | 2000-03-16 |
| WO1996006945A1 (en) | 1996-03-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HU217108B (hu) | Eljárás daganatok multidrogrezisztenciáját okozó fehérje aktivitásának in vitro mennyiségi kimutatására biológiai mintákban | |
| US5726009A (en) | Native-state method and system for determining viability and proliferative capacity of tissues in vitro | |
| US9389223B2 (en) | Pharmacodynamic assays | |
| Dive et al. | Polar fluorescein derivatives as improved substrate probes for flow cytoenzymological assay of cellular esterases | |
| Witherspoon et al. | Flow cytometric assay of modulation of P-glycoprotein function in whole blood by the multidrug resistance inhibitor GG918. | |
| WO2010094694A1 (en) | Assays to predict cardiotoxicity | |
| US6391656B2 (en) | Assay and reagent kit for evaluation of multi-drug resistance in cells | |
| Degli Esposti | Assessing functional integrity of mitochondria in vitro and in vivo | |
| Lyublinskaya et al. | Flow cytometric HyPer-based assay for hydrogen peroxide | |
| Tian et al. | A highly sensitive and selective two-photon fluorescent probe for glutathione S-transferase detection and imaging in living cells and tissues | |
| Van Orden et al. | Differentiation of norepinephrine storage compartments in peripheral adrenergic nerves | |
| Li et al. | Application of biotin, digoxigenin or fluorescein conjugated deoxynucleotides to label DNA strand breaks for analysis of cell proliferation and apoptosis using flow cytometry | |
| Huang et al. | Use of the comet assay for assessment of drug resistance and its modulation in vivo | |
| DE60217665T2 (de) | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Thymidinkinase-1 und dessen Verwendung | |
| WO1994006014A1 (en) | Diagnostic aid for early detection of cancer and diabetes | |
| Van Graft et al. | Flow cytometric measurement of [Ca2+] i and pHi in conjugated natural killer cells and K562 target cells during the cytotoxic process | |
| Lanuti et al. | A flow cytometry procedure for simultaneous characterization of cell DNA content and expression of intracellular protein kinase C-ζ | |
| AU721183B2 (en) | Method for localization and quantitation of a substance in a biological sample | |
| Avendaño et al. | Oxidative burst assessment and neutrophil–platelet complexes in unlysed whole blood | |
| AU2018357091B2 (en) | Fluorescent dye accumulation assay | |
| JPH07146296A (ja) | 多重抗癌剤耐性を検定する方法 | |
| Zurgil et al. | Determination of cellular thiol levels in individual viable lymphocytes by means of fluorescence intensity and polarization | |
| Celotti et al. | Detection by fluorescence analysis of DNA unwinding and unscheduled DNA synthesis, of DNA damage and repair induced in vitro by direct-acting mutagens on human lymphocytes | |
| Benz et al. | Flow cytometric analysis of fluorescein‐conjugated estradiol (E‐BSA‐FITC) binding in breast cancer suspensions | |
| CA2198731C (en) | Assay and reagent kit for the quantitative in vitro determination in biological specimens of the activity of proteins causing multi-drug resistance in tumors |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee | ||
| DNF4 | Restoration of lapsed final protection | ||
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SOLVO BIOTECHNOLOGIAI KFT., HU |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: SOLVO BIOTECHNOLOGIAI ZRT., HU Free format text: FORMER OWNER(S): DR. SARKADI BALAZS, HU; DR. HOLLO ZSOLT, HU; HOMOLYA LASZLO, HU; SOLVO BIOTECHNOLOGIAI KFT., HU |
|
| HC9A | Change of name, address |
Owner name: SOLVO BIOTECHNOLOGIAI ZRT., HU Free format text: FORMER OWNER(S): DR. SARKADI BALAZS, HU; DR. HOLLO ZSOLT, HU; HOMOLYA LASZLO, HU; SOLVO BIOTECHNOLOGIAI KFT., HU; SOLVO BIOTECHNOLOGIAI ZRT., HU |
|
| QB4A | Exploitation contract |
Name of requester: MDQUEST KFT., HU |