HU227275B1 - Particles of hcv envelope proteins: use for vaccination - Google Patents

Description

A találmány tárgya a Hepatitis C vírus elleni terápiás vagy profilaktikus vakcinázásra alkalmas készítmény, amely alapvetően HCV-burokfehérjék által alkotott oligomer részecskéket tartalmaz, továbbá az oligomer részecskék, illetve a fehérjék alkalmazásai és eljárások előállításukra.

A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy a HCV burokfehérjéi előnyös immunválaszt indukálnak olyan csimpánzoknál, amelyek heterológ 1a- vagy 1b-altípusú HCV-törzs krónikus fertőzése alatt állnak. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi az a felismerés, hogy a burokfehérjék erősen immunogének, és a celluláris és a humorális immunválaszt is stimulálják. Ráadásul, a találmány tárgyát képezi az a felismerés, hogy a ciszteinek alkilálással történő blokkolása a fehérjék immunogenicitásának növekedését eredményezi. Továbbá, a találmány szerinti burokfehérjék beépíthetők olyan részecskékbe, amelyek nagymértékű immunogenitást és immunreaktivitást mutatnak. Kimutattuk továbbá, hogy az ilyen részecskékbe más fehérjék is beépíthetőek.

A hepatitis C vírus (HCV) általi fertőzés jelentős egészségügyi probléma a fejlett és a fejlődő országokban egyaránt. Becslések szerint a vírus a Föld lakosságának 1-5%-át érinti. A HCV-fertőzés a transzfúzióval összefüggő hepatitis legjelentősebb előidézője, és gyakran krónikus májkárosodáshoz vezet. Ráadásul bizonyított tény, hogy a HCV szerepet játszik a hepatocellularis carcinoma indukciójában. Következésképpen nagy az igény megbízható diagnosztikai eljárások és terápiás hatóanyagok iránt. Szükség van a HCV-vel szennyezett vérkészítmények szűrését szolgáló érzékeny és specifikus szkrínelési eljárásokra, valamint a HCV tenyésztésére alkalmas javított eljárásokra.

A HCV egy megközelítőleg 9600 bázist tartalmazó, pozitív szálú RNS-t tartalmazó RNS-vírus, amely legalább három strukturális, és hat nem strukturális fehérjét kódol. Szekvenciahomológia alapján a struktúrfehérjéket funkcionálisan egy egyedi magfehérjeként és két burokfehérjeként: E1 -ként és E2-ként azonosították. Az E1-fehérje 192 aminosavból áll, és 5-6 N-glikozilációs helyet tartalmaz, a HCV-genotípustól függően. Az E2-fehérje 363-370 aminosavat tartalmaz, és a HCVgenotípustól függően 9-11 N-glikozilációs helyet tartalmaz [lásd Major és Feinstone (1997); és Maertens és Stuyver (1997) összefoglaló cikkeit]. Az E1-fehérje különböző variábilis doménokat tartalmaz [Maertens és Stuyver (1997)], míg az E52-fehérje három hipervariábilis domént tartalmaz; a legjelentősebb közülük a fehérje N-terminális részén lokalizálódik [Maertens és Stuyver (1997)]. Az utóbb említett burokfehérjéket előállították rekombináns eljárásokkal Escherichia coliban, rovarsejtekben, élesztősejtekben és emlőseredetű sejtekben. Magasabb rendű eukarióta eredetű, és különösen emlőseredetű sejttenyészet expressziós rendszerének alkalmazása olyan burokfehérjéket eredményez, amelyeket a betegekből származó mintákban található antitestek hatékonyan felismernek [Maertens (1997)].

Valószínűsítik, hogy az E1-burokfehérje megfelelő felgombolyodási (folding) állapotának eléréséhez szükség van az E2-burokfehérjére [Deleersnyder és munkatársai (1997)]. Ráadásul azt is valószínűsítik, hogy az E1 és az E2 heterodimereket alkot, amelyek a virális burok alapegységét alkotják [Yi és munkatársai (1997)]. A WO 98/21338 számú nemzetközi közzétételi iratban Ling és munkatársai a feltételezések alapján megalkották a HCV-részecskék modelljét, amely az E1-ből, az E2-ből, valamint a magfehérjéből és a P7-ből áll. Más szavakkal, az E1 és az E2 elkülönítve történő alkalmazását immunizálási és más célokra nem javasolják a technika korábbi állása szerint. Houghton (1997) azonban azt írta le, hogy 3, krónikus HCV-fertőzésben szenvedő csimpánz rekombináns gpE1E2-ve\ történő (4^25 pg) immunizálása nem indukáltjelentős mértékű immunválaszt. Arra a következtetésre jutottunk, hogy burok elleni immunválasz indukálása krónikus hepatitis C vírus fertőzésben szenvedő betegek esetében a beteg számára kívánatos és hasznos lenne, mivel úgy tűnik, hogy az ilyen antitestek magasabb szintje az interferonterápiára adott megfelelő válaszreakcióval összefüggést mutat, és hozzásegítheti a beteget ahhoz, hogy a vírust kiürítse (clear) (Martens és munkatársai PCT/EP95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése). Mivel a krónikus HCV-hordozók E1 elleni antitestszintjei a legalacsonyabbak a HCV-antitestszintek között, arra a további következtetésre jutottunk, hogy hasznos lenne az antitestszintek növelése, és esetleg a celluláris immunválasz növelése, a fertőzésnek a gazdaszervezet általi kontrollja, vagy akár teljes kiürítésének (clearance) indukálása céljából. Úgy tűnik, hogy az E1 elleni celluláris immunitás magasabb szintjei szintén az interferonterápia által kiváltott megfelelő válaszreakcióval van összefüggésben [Leroux-Roels és munkatársai (1996)].

Az interferonterápiával kapcsolatban az E1 elleni immunitás fontosságán kívül más jelek arra mutatnak, hogy a HCV-genom más részei fontosak lehetnek a fertőzés kontrollját lehetővé tevő specifikus immunválasz indukálásában. Az interferonterápiára reagáló betegek esetében a magfehérje C-terminális régiója elleni T-sejt-reaktivitást is gyakrabban figyeltek meg [LerouxRoels és munkatársai (1996)]. A májátültetésen átesett betegek esetében az WS46-fehérje elleni, potenciálisan neutralizáló hatású antitesteket mutattak ki [Villa és munkatársai (1998)]. Az NS3 esetében is azonosítottak epitóp-térképezéssel néhány T-sejt-epitópot, amelyek valószínűleg összefüggést mutatnak a HCV kiürülésével az akut fázisban [lásd Leroux-Roels és munkatársai PCT/EP 94/03555 számú nemzetközi szabadalmi bejelentését; Leroux-Roels és munkatársai (1996); Rehermann és munkatársai (1996 és 1997); Diepolder és munkatársai (1995 és 1997)]. Ráadásul, az NS5A elleni antitestek, mint az E1 elleni antitestek, az alapvonal feletti magasabb szinteket mutat az inerferon-a-terápiát megelőzően a hosszú távú válaszreakciót adók esetében („long term responders”, LTR), a válaszreakciót nem adókhoz viszonyítva.

Jelenleg a terápiás célú HCV-vakcinázás nem sikeres. A profilaktikus célú vakcinázás is csak homológ

HU 227 275 Β1

HCV-törzzsel szemben hatékony [Choo és munkatársai (1994)]. A találmány tárgya azon a váratlan felismerésen alapul, hogy HCV-burokantigén beadása drámai módon javítja heterológ törzzsel vagy izolátummal fertőzött, krónikus, aktív hepatitisben szenvedő személy állapotát, heterológ 1a-altípusú és heterológ 1 b-altípusú fertőzés esetében egyaránt. Valójában, krónikus fertőzésben szenvedő csimpánzok, amelyeknek 50 pg E1s (azaz az E1-fehérje 192-326 aminosavából álló fehérje) hat dózisát adtuk be, meglepően élénk humorális és celluláris immunválaszt mutattak, amely a vakcinázást megelőzően a krónikus fertőzés teljes időtartama alatt nem volt tapasztalható. Ráadásul, a virális antigén a májban 2-5 hónapon át nem volt detektálható, és a vakcinázás után legalább 5 hónapon át detektálhatatlan maradt. A máj enzimszintjei a szérumban a nyilvánvaló normalizálódás tendenciáját mutatták, noha a szérum HCV-RNS-titere nem csökkent. Még fontosabb, hogy a máj hisztológiája mindkét vakcina esetében drámai javulást mutatott. A találmány tárgyának további alapját képezi az a váratlan felismerés, hogy a vakcinázásra alkalmazott E1-fehérje, amelyet hidrofób horgonyrésze nélkül, szabad HCV-fehérjeként expresszáltunk, stabil részecskéket alkot. Meg kell jegyeznünk, hogy a nem releváns epitópok elleni immunválasz indukálása elkerülése céljából a vakcinázási célokat szolgáló E1-fehérjét egyetlen krónikus hordozó egyetlen szérummintájából származó, egyedi kiónok konszenzusszekvenciájaként állítottuk elő. Ráadásul, a szabadalmi bejelentés tárgyának alapját képezi az a felismerés is, hogy a fent ismertetett oligomer részecskék még nagyobb mértékű immunogenicitást mutatnak, ha a HCV-burokfehérjék ciszteinjeit alkiláljuk, például N-(jód-etil)-trifluoro-acetamiddal, etilénimiddel, vagy aktív halogénekkel, mint például jód-acetamiddal. Végül a találmány tárgyát képezi az a felismerés, hogy a HCV-burokfehérje ciszteinjeinek bármely más, természetes aminosavra, előnyösen metioninra, glutaminsavra, glutaminra vagy lizinre történő mutációja a fenti oligomer részecskék esetében az eredeti burokfehérjékhez viszonyítva nagyobb immunogenicitáshoz vezet.

A technika állása szerint nyilvánvaló, hogy a HCV esetében sürgősen szükség van megbízható vakcinákra és terápiás hatóanyagokra. Ezért a találmány szerinti megoldás kidolgozásakor az volt a célunk, hogy olyan antigént állítsunk elő, amely a HCV burokfehérje ellen specifikus humorális és celluláris immunitás indukálására alkalmas, még krónikus HCV-hordozók esetében is (de nem kizárólag ebben az esetben). Ugyanazt az antigént alkalmazhatjuk immunválasz diagnózisában is.

Közelebbről, a találmány célja a fentiek szerinti antigénpreparátum biztosítása, amely a HCV egyedi burokfehérjéinek stabil részecskéiből áll. Világosan kell látnunk, hogy a technika korábbi állása szerint (jelenleg) az ilyen részecskék előállítására alkalmas eljárások nem ismeretesek. Ráadásul, a technikában nincs utalás arra, hogy bármely előállított antigént, többek között az ilyen szabad, tisztított HCV-burokfehérjék által alkotott ilyen stabil részecskéket sikeresen alkalmazták volna (heterológ) HCV elleni vakcinaként profilaktikus vagy terápiás célokra. így a találmány célja olyan, stabil részecskék előállítására szolgáló eljárás biztosítása, amelyek sikeresen alkalmazhatóak a HCV elleni profilaktikus vagy terápiás hatóanyagként, valamint HCV-antigéneket kódoló vakcinák előállítása. Közelebbről, a találmány célja az utóbbi részecskék detergens alkalmazásával történő, részecskeképzésen alapuló (lásd később) előállítására szolgáló eljárás biztosítása. Ráadásul, a találmány célja különböző genotípusú HCV-kből nyert antigénekből álló részecskék előállítására szolgáló eljárás biztosítása.

Továbbá, a találmány célja olyan, egyedi kiónokból származó konszenzusszekvenciákból álló antigén biztosítása, amely lehetővé teszi a fehérje megfelelőbb felgombolyodását. Ennek célja a nem releváns epitópok elleni immunitás stimulálásának megakadályozása.

Ráadásul, a találmány célja olyan, különösen terápiás célokat szolgáló antigénformula biztosítása, amely a krónikus hordozót fertőző HCV genotípusán alapul. Ebből a szempontból, a találmány célja a krónikus hordozó HCV-vírus genotípusától vagy altípusától különböző vagy akár azzal homológ burokfehérje biztosítása.

A találmány egy további célja krónikus betegek kezelésére vagy terápiás vakcinázására szolgáló eljárás biztosítása, amely a fent említett DNS-vakcinákat alkalmazza, lehetséges módon más vegyületekkel kombinálva. A találmány célja emberek HCV elleni, profilaktikus vakcinázására szolgáló eljárás biztosítása.

A találmány egy másik célja kiváló magasabb rendű immunogenicitással rendelkező oligomer részecske biztosítása, ahol az immunogenicitást a HCV-burokfehérje legalább egy ciszteinjének természetesen előforduló aminosavra, előnyösen metioninra, glutaminsavra, glutaminra vagy lizinre történő mutációjának tulajdonítható. Alternatívaként végrehajthatjuk a HCV-burokfehérje legalább egy ciszteinjének alkilációját. Közelebbről, az utóbbi fehérjét alkilálhatjuk etilénimid, N-(jód-etil)-trifluor-acetamid, vagy aktív halogének alkalmazásával. Ebből a szempontból a találmány célja az oligomer részecskék további alkalmazásának biztosítása, nem HCV-jellegű epitópok hatékony bemutatására szolgáló hordozókként.

A találmány egy további célja akut vagy krónikus fertőzésben szenvedő beteg bármely, burok elleni antitesttel, mint az E1 elleni antitesttel, például az E1 V2-régiója elleni antitesttel, önmagában vagy akár más kezelésekkel kombinációban történő kezelésére szolgáló eljárás biztosítása.

A találmány egy másik célja T-sejtet stimuláló antigén, mint a magfehérje, az E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, vagy NS5B a találmány szerinti fehérjékkel együttes biztosítása.

A találmány céljait a találmány alább részletezésre kerülő megvalósítási módjai megvalósítják.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a táblázatokat és az ábrákat.

HU 227 275 Β1

1. táblázat Egyedi, krónikus hordozóból nyert E1-kiónok szekvenciáit mutatja be; vakcina előállítására alkalmazott E1-konstrukció az egyedi kiónok mindegyikére vonatkozó konszenzusszekvenciája. V1-V5: az 1-5 variábilis régiók; C4:4-es konstans dómén; HR: hidrofób régió; HCV-B-con: olyan konszenzusszekvencia, amely a kiónok és a HCV-J között variabilitást mutató pozíciókban van.

2. táblázat Az E1-fehérje és az E1-vakcinafehérje Phil és Tón nevű fertőzött csimpánzokból izolált formáinak szekvenciáit mutatja be. A Phil nevű csimpánzból izolált 1b-altípus 5,92%-ban tért el a vakcinatörzstől. A vakcina és a Tón nevű csimpánzból izolált 1 a-altípus közötti eltérés 20,74%-os volt.

3. táblázat A terápiás vakcinázás által indukált változások vázlatos áttekintését nyújtja két krónikusan fertőzött csimpánz (Phil és Tón) esetében. A vizsgálatot a 8. és 11. ábránál leírtak szerint hajtottuk végre. Kiegészítésként: a hisztológiai (vizsgálatok eredményét) és a gyulladást májbiopsziás vizsgálatok alapján pontoztuk.

4. táblázat A B-sejt-epitópok térképezésére alkalmazott peptidek szekvenciáit adja meg. Megjegyezzük, hogy a HR és a V4V5 egymást átfedi.

5. táblázat Az WS3-nak a vírus kiürítésével összefüggő mindegyik fő epitópot hordozó, rövidebb fehérje létrehozásának céljából történő átrendezését mutatja be.

6. táblázat Az E1s-acetamid és az E1s-maleimid L/A-ban mutatott reaktivitásának összehasonlítása a krónikus HCV-hordozók szérumaival. A fehérjéket a L/A-membránokra kötöttük. Az E1s-acetamidot a LIAcsíkokra porlasztottuk, az E1s-maleimidet (amely biotin-maleimidet is tartalmazott) porlasztás előtt sztreptavidinnel komplexbe vittük. Az antigéneket a LIA -membránokra kötöttük, és a csíkokat alapvetően Zrein és munkatársai (1998) szerint dolgoztuk fel. Az antigének elleni, humán eredetű antitesteket alkalikus foszfatázzal konjugált, humán eredetű IgG elleni antitesttel tettük láthatóvá. NBT-t és BCIP-et alkalmaztunk a csíkoknál színelőhíváshoz. A festődést 0,5—4-ig pontoztuk, Zrein szerint (1998). A mérésben 0,5-ös határértéknél a pozitív minták számát (#pos) és a százalékos arányt (%pos) a táblázat alján tüntettük fel.

1. ábra A Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) szerint expresszált és tisztított E1s és E2s-fehérjék 3% Empigen-BB-\/e\ kiegészített PBS-ben felvett, egymásra helyezett méretkizárási kromatográfiás profiljai.

2. ábra A Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) szerint expresszált, tisztított, és 0,2%-os CHAPS-t tartalmazó PBS-ben ugyanazon a méretkizárási (SEC) oszlopon 250-300 kDa-os becsült, látszólagos molekulatömegű oligomer szerkezetek előállítása céljából újra megfuttatott E1s és E2s-fehérjék egymásra helyezett méretkizárási kromatográfiás profiljai. 3% bétáin alkalmazásával hasonló asszociációs fokú termék állítható elő.

3. ábra A Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) szerint expresszált, tisztított, és 0,2%-os CHAPS-t vagy 3% betaint tartalmazó PBS-ben ugyanazon a méretkizárási (SEC) oszlopon a 2. ábrán bemutatott specifikus oligomer szerkezetek előállítása céljából újra megfuttatott, és 250-300 kDa (E2s) és 600 kDa-nál nagyobb (E2s) becsült, látszólagos molekulatömegű specifikus homooligomer szerkezetek előállítása céljából ugyanazon az oszlopon 0,15% CHAPS-ban harmadszor megfuttatott E1s és E2s-fehérjék egymásra helyezett méretkizárási kromatográfiás profiljai. 0,1-0,5% bétáin alkalmazásával hasonló asszociációs fokú termék állítható elő.

4. ábra Az E1s 0,05%-os CHAPS-ot tartalmazó

PBS-ben végrehajtott dinamikus fényszórási vizsgálata; a részecskék számát százalékában fejeztük ki, a nm-ben kifejezett átmérőhöz viszonyítva.

5. ábra Az E1s 0,1%-os PBS-ben (fent) és

0,5%-os betainban (lent) végrehajtott dinamikus fényszórási vizsgálata; a részecskék számát százalékban fejeztük ki, a nm-ben kifejezett átmérőhöz viszonyítva.

6. ábra EM-festés (A) a 0,05%-os CHAPS-ot tartalmazó PBS-ben E1s-esetén és (B) 3% betaint tartalmazó E1s esetében.

7. ábra Az E1s méreteloszlása 0,05%-os

CHAPS-ot tartalmazó PBS-ben.

8. ábra Hat, egymást követő és három, emlékeztető immunizálással (kis nyilakkal jelölve) indukált, E1 elleni antitestek (mennyiségi) változása 1b-fertőzött csimpánznál (Phil), és az ALT, HCV-RNS, és az E1 elleni antitestek (mennyiségének) változása. A szilárd fázisú E1-hez kötődő E1 elleni antitesteket peroxidázzal konjugált, humán eredetű IgG elleni másodlagos antiszérummal detektáltuk. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként. Az eredményeket végponttiterben adtuk meg. Az ALT-szinteket klinikai analizátorral állapítottuk meg, és U/l egységben adtuk meg. A szérum HCV-RNS-szintjeit HCVMonitor (Roche, Basel, Svájc) alkalmazásával határoztuk meg. A máj vírusterhelését a májbiopsziában a megfestett E2-antigén mennyiségének specifikus, monoklonális antitesttel (98031215 ECACC-kat. számú, az EP 98870060.5 európai szabadalmi bejelentésben leírva) történő, sze4

HU 227 275 Β1 mikvantitatív meghatározásával adtuk meg.

9. ábra Az E1 -gyei történő immunizálással a Phil nevű csimpánzban indukált antitestválasz epitóp-térképezése. Az antitestek különböző peptidekkel szembeni reaktivitását indirekt EL/SA-méréssel határoztuk meg, amelyben biotinilált peptideket (lásd még a 4. táblázatot) adszorbeáltunk mikrotiterlemezekre sztreptavidinen keresztül. A specifikus antitesteket humán IgG-re specifikus, peroxidázzal konjugált másodlagos antiszérummal detektáltuk. TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként a szín előhívásához.

10. ábra A limfocitaproliferációs mérési eljárás eredményei a Phil nevű csimpánz esetében, vakcinázás előtt és után. Fagyasztott PBMC-ket felolvasztottunk, és különböző antigénekkel stimuláltuk, háromszoros mintaszámmal (triplikátumban). Negatív kontrollként tápközeget, pozitív kontrollként concanavalin-A-t alkalmaztunk, 5 pg/ml-es koncentrációban. A PBMC-ket 2-4χ10⁵ sejt/üreg koncentrációban, 150 μΙ-es teljes térfogatban tenyésztettük, 10% hőinaktivált FCS-sel kiegészített RPMI-1640-es tápközegben, 96 üregű mikrotiterlemezeken, a kontrollokkal, vagy 1 pg/ml E1 jelenlétében, 90 órán át, 37 °C-on, 5% CO₂ jelenlétében, párásított légtérben. Az utolsó 18 órában a sejteket lökésszerűen 0,5 μθ (³H)/üreg timidinnel. Ezt követően a tenyészeteket üvegszűrőn szűrve a sejteket összegyűjtöttük, és a jelzett anyag felvételét meghatároztuk. Az eredményeket Stimulációs Indexben (Sl) kifejezve adjuk meg: átlagos cpm antigén/átlagos cpm tápközeg a háromszoros mérés átlagában.

11. ábra Hat, egymást követő és három, emlékeztető immunizálással (kis nyilakkal jelölve) indukált, E1 elleni antitestek (mennyiségi) változása la-fertőzött csimpánznál (Tón). Az ALT, HCV-RNS és az E1 elleni antitestek májban mért (mennyiségi) változását mutatjuk be. Az E1 elleni antitesteket indirekt FL/SA-val határoztuk meg: a szilárd fázisú E1-hez kötődő specifikus antitesteket peroxidázzal konjugált, humán eredetű IgG elleni másodlagos antiszérummal detektáltuk. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként. Az eredményeket végponttiterben adtuk meg. Az ALTszinteket klinikai analizátorral állapítottuk meg, és U/l egységben adtuk meg. A HCV-RNS-szinteket HCV-Monitor (Roche, Basel, Svájc) alkalmazásával határoztuk meg. Az E2-antigént a májbiopsziában specifikus monoklonális antitesttel (98031215 ECACC-kat. számú, az EP 98870060.5 európai szabadalmi bejelentésben leírva) festettük meg. A szemikvantitatív eredményeket a sejtek többségénél tapasztalt nyilvánvalóan pozitív festés esetében fekete körökkel jelöltük, a sejtek kisebbségénél detektált festődésnél szürke körökkel, és a nem detektálható festődést fehér körökkel jelöltük, a HCVRNS-t kis, fekete négyszögekkel jelöltük.

12. ábra Az E1-gyel történő immunizálással indukált válaszreakcióban termelt antitest epitóp-térképezése, a Tón nevű csimpánz esetében. A különböző peptidekre adott antitestreaktivitást indirekt EL/SA-val mértük, amelyben biotinilált peptideket (lásd még a 4. táblázatot) adszorbeáltunk mikrotiterlemezekre sztreptavidinen keresztül. A specifikus antitesteket humán IgG elleni, peroxidázzal konjugált másodlagos antiszérum alkalmazásával detektáltuk. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként.

13. ábra A 1 a-altípusú és 1 b-altípusú E1-fehérjére adott E1-antitestválaszok vizsgálata a Tón nevű csimpánz esetében. A vizsgálat céljából a HCV-H-szekvenciából származó, 1a-genotípusú E1 rekombináns vakcinavírust állítottunk elő, az E1-nek ugyanazt a részét expresszálva, mint a 1b-genotípus esetében (lásd alább). Az E1 vakcina vírussal fertőzött RK-13-as sejtek nyers lizátumaiból származott (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése alapján állítottuk elő). Az antitestreaktivitást indirekt ELISA méréssel határoztuk meg, amelyben az E1-et mikrotiterlemezekre abszorbeáltuk a nagy molekulájú mannózoligomerekhez kötődő Galanthus nivalis (GNA) agglutininen keresztül. A specifikus antitesteket specifikus, humán IgG elleni, peroxidázzal konjugált, másodlagos antiszérummal detektáltuk. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként. Az eredményeket differenciális OD-ben (E1-et adszorbeált üreg OD-je mínusz az E1-et nem adszorbeált üreg OD-je) fejeztük ki.

14. ábra A limfocitaproliferációs mérési eljárás eredményei a Phil nevű csimpánz esetében, vakcinázás előtt és után. Fagyasztott PBMC-ket felolvasztottunk, és különböző antigénekkel stimuláltuk, háromszoros mintaszámmal (triplikátumban). Negatív kontrollként tápközeget, pozitív kontrollként concanavalin-A-t alkalmaztunk, 5 pg/ml-es koncentrációban. A PBMC-ket 2-4x10⁵ sejt/üreg koncentrációban, 150 μΙ-es teljes térfogatban tenyésztettük,

HU 227 275 Β1

10% hőinaktivált FCS-sel kiegészített RPMI-1640-es tápközegben, 96 üregű mikrotiterlemezeken, a kontrollokkal, vagy 1 pg/ml E1 jelenlétében, 90 órán át, 37 °C-on, 5% CO₂ jelenlétében, párásított légtérben. Az utolsó 18 órában a sejteket lökésszerűen 0,5 pCi (³H)/üreg timidinnel. Ezt követően a tenyészeteket üvegszűrőn szűrve a sejteket összegyűjtöttük, és a jelzett anyag felvételét meghatároztuk. Az eredményeket Stimulációs Indexben (Sl) kifejezve adjuk meg: átlagos cpm antigén/átlagos cpm tápközeg a háromszoros mérés átlagában.

15. ábra Az N-terminális, hipervariábilis régiójában deletált E2-fehérje expressziójára alkalmazott konstrukciók térképei. A pvHCV-92 és a pvHCV-99 konstrukciók a pvHCV-100 és a pvHCV-101 deléciós mutánsok megalkotására alkalmazott köztes konstrukciók.

16. ábra A 15. ábrán feltüntetett (lásd fent) konstrukciókhoz tartozó szekvenciák (A: nukleotidok; B: transzlációs termék).

17. ábra A 9. példánál leírt különböző E1-preparátumokkal immunizált egereknél kiváltott antitesttiterek. A titereket ELISA alkalmazásával határoztuk meg: egérszérumot hígítottunk 20-szorosára, majd logaritmikus hígítás szerint (0,5 log₁₀) és (acetamiddal vagy maleimiddel módosított) E1s-sel burkolt mitrotiterlemezeken inkubáltuk. Mosás után a kötődött antitesteket egéreredetű IgG elleni, peroxidázzal konjugált másodlagos antiszérummal detektáltuk. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként. Az eredményeket végponttiterben fejeztük ki, és a standard deviációt (n=6) feltüntettük.

18. ábra Különböző E1s-preparátumokkal történő immunizálással egerekben indukált antitest válaszreakcióban termelt antitest epitóp-térképezése, egerek esetében. A különböző peptidekre adott antitestreaktivitást indirekt EL/SA-val mértük, amelyben biotinilált peptideket (lásd a 4. táblázatot) adszorbeáltunk mikrotiterlemezekre sztreptavidinen keresztül. Egérszérumot 20-szorosára hígítottuk, és a specifikus antitesteket humán IgG elleni, peroxidázzal konjugált másodlagos antiszérum alkalmazásával detektáltuk. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként.

19. ábra Különböző E1s-preparátumokkal immunizált egerek immunglobulin-izotípusprofilja. A specifikus Ig-osztályú és alosztályú antitesteket mikrotiterlemezre adszorbeáltuk. Az 500-szorosára hígított egéreredetű immunszérumból az Ig-ket kikötöttük, majd E1s-t inkubáltunk 1 pg/ml koncentrációban. A kialakult immunkomplexeket tovább inkubáltuk E1 elleni poliklonális, kecskeeredetű, nyúl-IgG elleni, peroxidázzal konjugált antiszérummal. A szín előhívására TMB-t alkalmaztunk szubsztrátként. Az eredményeket lgG₃-re normáltuk (az lgG_rjelet minden állatnál külön-külön 1-nek vettük, és a más izotípusra vonatkozó eredményt az lgG-|-eredményhez viszonyítva fejeztük ki).

20. ábra Az 1000-ik nap körül két, E1s-acetamiddal történő immunizálással indukált antitesttiterek, a Phil nevű csimpánz esetében. Az E1 elleni antitesteket indirekt EL/SA-val határoztuk meg: a szilárd fázisú E1-hez kötődő specifikus antitesteket humán eredetű IgG-re specifikus, peroxidázzal konjugált másodlagos antiszérummal határoztuk meg. A titert egység/ml-ben fejeztük ki, ahol az egység humán eredetű szérumon alapuló cégen belüli (in house) standardra vonatkozik.

21. ábra A 900-ik nap körül két, E1s-acetamiddal történő immunizálással indukált antitesttiterek a Tón nevű csimpánz esetében. Az E1 elleni antitesteket indirekt ELISA-val határoztuk meg: a szilárd fázisú E1-hez kötődő specifikus antitesteket humán eredetű IgG-re specifikus, peroxidázzal konjugált másodlagos antiszérummal határoztuk meg. A titert egység/ml-ben fejeztük ki, ahol az egység humán eredetű szérumon alapuló cégen belüli (in house) standardra vonatkozik.

22. ábra A végső detergensredukciós lépés SECprofilja (0,2-0,05% CHAPS): (A): csak E1 -bői álló részecske; (B) csak E2-ből álló részecske; (C): kevert részecske. Az ábrán bemutatjuk a csak E1 -et (felül), a csak E2-t (középen) detektáló specifikus ELISA és a csak a kevert részecskéket (alul) detektáló ELISA OD-értékeit (ráhelyezve).

23. ábra A végső detergensredukciós lépés SECprofilja (0,2-0,05% CHAPS): (A): csak 1b-genotípusú E1-ből álló részecske (felül), (B) csak 4-genotípusú E1 -bői álló részecske (középen) vagy 1b- és 4-genotípusú E1 ekvimoláris elegye (alul). Az ábrán bemutatjuk a csak kevert részecskéket detektáló ELISA -értékeit (ráhelyezve) (lásd még a 22. ábrát).

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt.

Az itt közölt leírás megírásakor az előzőleg publikált munkákból és a függőben levő szabadalmi bejelentésekből merítettünk. Például a publikált munkák lehetnek tudományos közlemények, szabadalmak és függőben levő szabadalmi bejelentések. A fentiekben és az alábbiakban idézett közlemények és szabadalmi bejelentések mindegyikét úgy idézzük, mintha teljes egé6

HU 227 275 Β1 szében beépítettük volna a szabadalmi leírásba, és azok a kitanítás részét képezik.

A találmány tárgyát képezi HCV-vakcinázás. Súlyos, krónikus akut hepatitis-C-ben szenvedő csimpánzok esetében az első, sikeres immunterápiát értük el HCV-antigén alkalmazásával. A vakcina nemcsak erős immunválaszt indukált, hanem indukálta a vírusantigén májból történő kitisztulását, a májbetegség enyhülését, és a máj hisztológiai aktivitásának jelentős mértékű javulását is. A találmány tárgyát képezik továbbá egyedi HCV-burokfehérjék, közelebbről oligomer részecskék. Az oligomer részecskék alapvetően HCV-burokfehérjékből állnak, és átmérőjük 1-100 nm, dinamikus fényszórással vagy lehetséges módon elektronmikroszkópiával meghatározva. Ebből a szempontból hangsúlyoznunk kell, hogy a részecskék kialakíthatóak csak E1- és/vagy E2-fehérjéből, vagy ezek részeiből (lásd fentebb). így a találmány szerinti oligomer részecskék alapvetően különböznek a WO 98/21338 számú nemzetközi közzétételi iratban leírt, HCV-szerű részecskéktől, amelyek alapvetően az E 1-ből, E2-ből a magfehérjéből, és a P7-ből állnak. Az „alapvetően HCV-burokfehérjékből álló oligomer részecskéket” specifikus természetű és alakú szerkezetekként definiáljuk, amelyek a HCV E1- és/vagy E2-burokfehérjék néhány alapegységét tartalmazzák, amelyekről feltételezzük, hogy önmagukban egy vagy két E1- és/vagy E2-monomerből állnak. Nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti részecskék definíció szerint fertőző HCV-RNS-genomtól mentesek. A találmány szerinti részecskék lehetnek magasabb rendű, gömbtermészetű részecskék, amelyek lehetnek olyan, burokfehérjevázból álló üres részecskék, amelyek lipideket, detergenseket, a HCV-magfehérjét, vagy adjuvánsmolekulákat foglalnak magukban. Az utóbbi részecskék lehetnek ezenkívül kapszulázva liposzómákban vagy apolipoproteinek által, mint például apolipoprotein-B-vel vagy alacsony denzitású lipoproteinekkel, vagy bármely más, a részecskéket specifikus szervhez vagy szövethez célba juttató eszköz által. Ebben az esetben az ilyen üres, gömb alakú részecskéket gyakran „vírusszerű részecskéknek” vagy VLPknek hívjuk. Alternatívaként a magasabb rendű részecskék lehetnek tömör, gömb alakú szerkezetek, amelyeknél a teljes gömb olyan HCV-eredetű E1- vagy E2-burokfehérje-oligomerekből áll, amelyek ráadásul lidipeket, detergenseket, a HCV-magfehérjék, vagy adjuvánsmolekulákat foglalhatnak magukban, vagy amelyek maguk lehetnek kapszulázva liposzómák vagy apolipoproteinek, mint például apolipoprotein-B-vel vagy alacsony denzitású lipoproteinekkel által, vagy bármely más, a részecskéket specifikus szervhez vagy szövethez célba juttató anyaggal például aszialoglikoproteinekkel. A részecskék állhatnak kisebb struktúrákból (a fent jelzett üres vagy tömör, gömb alakú struktúrákhoz viszonyítva), amelyek rendszerint gömbölyűek (lásd a továbbiakat), és amelyek csak egy réteg HCVburokfehérjét tartalmaznak. Az ilyen, kisebb részecskékre tipikus példaként szolgálnak a rozettaszerű szerkezetek, amelyek kisszámú, rendszerint 4-16 HCV-burokfehérjéből állnak. Az utóbbira specifikus példa, többek között, a példaként említett, 0,2%-os CHAPS-ban E1s-sel kapott kisebb struktúrák, amelyek láthatóan 8-10 E1s-monomerből állnak. Az ilyen, rozettaszerű struktúrák rendszerint síkban szerveződnek és kerekded alakúak, például kerékformát kialakítva. Ráadásul itt is beépülhetnek detergensek, a HCV-magfehérje, vagy adjuvánsmolekulák, vagy a kisebb részecskék lehetnek kapszulázva liposzómák vagy apolipoproteinek, mint például apolipoprotein-B-vel vagy alacsony denzitású lipoproteinekkel, vagy bármely más, a részecskéket specifikus szervhez vagy szövethez célba juttató anyaggal. A kisebb részecskék kialakíthatnak gömb alakú vagy globuláris szerkezeteket, amelyek hasonló, kisszámú HCV-E1- vagy E2-burokfehérjéből állnak, és amelyek ráadásul tartalmazhatnak lipideket, detergenseket, a HCV-magfehérjét, vagy adjuvánsmolekulákat, vagy amelyek lehetnek kapszulázva liposzómák vagy apolipoproteinek, mint például apolipoprotein-B-vel vagy alacsony denzitású lipoproteinekkel, vagy bármely más, a részecskéket specifikus szervhez vagy szövethez célba juttató eszközzel, anyaggal. A fent definiált részecskék mérete (azaz az átmérője) a technika állása szerint jól ismert, dinamikus fényszórási technikákkal (lásd a példáknál) meghatározva, rendszerint az 1-100 nm-es tartományba, előnyösen a 2-70 nm-es, előnyösebben a 2-40 nm-es, a 3-20 nm-es, az 5-16 nm-es, a 7-14 nm-es, vagy a 8-12 nm-es tartományba esik.

Ráadásul, a találmány tárgyát képezik a fent definiált oligomer részecskék, ahol a burokfehérjék lehetnek a HCV-E1, a HCV-E1s, a HCV-E2-fehérjék, a 13. azonosító számú (ezentúl a. sz.) vagy a 14. a. sz. szekvenciákkal leírható fehérjék, vagy ezek részei. A HCV-E1 és a HCV-E2-fehérjék jellemzése, és a fehérjék tisztításának részletes leírása megtalálható Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031. számú nemzetközi szabadalmi bejelentésében. A HCV-E1s-t, a 13. a. sz.-t vagy a 14. a. sz.-t vagy ezek részeit megtisztíthatjuk a Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésében megtalálható, a HCV-E1-re vagya HCV-E1s-re vonatkozó leírás szerint. Hangsúlyoznunk kell, hogy az utóbbi irat teljes tartalma, mindegyik definíciók beleértve, a szabadalmi leírásba teljes egészében, a kitanítás részét képezve beleértendő. A HCV-E1s-fehérje alatt az El 192-326. aminosavait értjük, amelyek az E1-fehérjét reprezentálják, a C-terminális hidrofób horgonyrész nélkül. A „vagy annak részei” kifejezés alatt értjük a fehérjék bármely, olyan részét, amelyik immunogén tulajdonságúak, amennyiben ezek a találmány szerinti részecske részét képezik.

A találmány tárgyát képezik az itt leírtak szerint az olyan oligomer részecskék, amelyeknél a HCV-burokfehérje legalább egy ciszteincsoportja alkilálva van, előnyösen alkilálószerekkel, mint például aktív halogénekkel, etiléniminnel, vagy N-(jód-etiI)-trifluoracetamiddal. Ebből a szempontból meg kell értenünk, hogy alkilált ciszteinek alatt olyan ciszteineket értünk, amelyeknél a kénatomon a hidrogént (CH₂)_nR-rel helyettesítjük, ahol n 0, 1, 2, 3 vagy 4, és R=H, COOH,

HU 227 275 Β1

NH₂, CONH₂, fenil, vagy ezek bármely származéka. Az alkilációt végrehajthatjuk a technikában ismert bármely eljárással, mint például X(CH₂)_nR aktív halogénekkel, ahol X halogén, például I, Br, Cl vagy F. Aktív halogénekre példa a metil-jodid, jód-ecetsav, jód-acetamid, vagy az N-(jód-etil)-trifluor-acetamid. Az alkilációra szolgáló más eljárások többek között az etilénimid vagy az N-(jód-etil)-trifluor-acetamid alkalmazásával történő alkilálás, amelyek közül mindkettő a H-atom -CH₂-CH₂-NH₂-vel történő helyettesítését eredményezi (Hermanson, 1996). Az „alkilálószer” kifejezés alatt olyan vegyületeket értünk, amelyek az itt leírt alkiláció végrehajtására alkalmasak. Az ilyen alkilálás végül olyan módosított ciszteint eredményez, amely más aminosavakhoz lesz hasonló. Az etilénimiddel történő alkiláció lizinhez hasonló struktúrát eredményez, így a tripszin számára új hasítóhelyet alakítunk ki (Hermanson, 1996). Hasonló módon, metil-jodid alkalmazása metioninhoz hasonló aminosavat eredményez, míg a jód-acetát és a jód-acetamid alkalmazása glutaminsavhoz és glutaminhoz hasonló aminosavat eredményez. Ennek analógiájaként ezeket az aminosavakat előnyösek alkalmazzák a cisztein direkt mutációja céljából. így a találmány tárgyát képezik az itt leírt oligomer részecskék, ahol a HCV-burokfehérje legalább egy ciszteincsoportja természetes aminosavra van mutáltatva, előnyösen metioninra, glutaminsavra vagy lizinre. A „mutáltatva” kifejezés alatt az említett aminosavakat kódoló nukleinsavak helyspecifikus mutagenezisét értjük, azaz a technikában ismert eljárásokat, mint például a Sambrook és munkatársai (1989) által leírt, PCR-t alkalmazó helyspecifikus mutagenezist, vagy oligonukleotid által közvetített, helyspecifikus mutagenezist.

A „tisztított” kifejezés alatt olyan készítményt értünk, amelyben a kívánt komponensek, mint például a HCV-burokfehérjék vagy oligomer részecskék a készítményben a teljes összetevők legalább 35%-át teszik ki. A kívánt komponens a készítmény összes komponensei közül előnyösen legalább körülbelül azok 40%-át, előnyösen legalább körülbelül azok 50%-át, még előnyösebben legalább körülbelül azok 60%-át, még előnyösebben legalább körülbelül 70%-át, még előnyösebben legalább körülbelül 80%-át, még előnyösebben legalább körülbelül 90%-át, még előnyösebben legalább körülbelül 95%-át, a legelőnyösebben legalább körülbelül 98%-át alkotja. A készítmény tartalmazhat más vegyületeket is, mint például szénhidrátokat, sókat, lipideket, oldószereket és ehhez hasonlókat, amelyek nem befolyásolják a tisztaság %-os értékben itt megadott értékeit. Az „izolált oligomer HCV-részecske alatt olyan, oligomer HCV-részecskekészítményt értünk, amely legalább 35%-os tisztaságú. Ebből a szempontból nyilvánvaló, hogy a „tisztított, egyedi HCV-burokfehérje” alatt alapvetően tiszta HCV-burokfehérjét értünk. Az „alapvetően megtisztított oligomer részecske” és az „egyedi HCV-burokfehérje” kifejezésen olyan oligomer HCV-részecskéket vagy egyedi HCV-burokfehérjéket értünk, amelyek alkalmasak in vitro diagnosztikai eljárásokban és terápiákban történő alkalmazásra. Ezek az oligomer HCV-részecskék alapvetően mentesek sejtfehérjéktől, vektoreredetű fehérjéktől vagy más HCV-víruskomponenstől. Rendszerint ezek a részecskék vagy fehérjék homogenitásig vannak tisztítva (legalább 80%-os tisztaságúak, előnyösen 85%-os tisztaságúak, előnyösebben 90%-os tisztaságúak, előnyösebben 95%-os tisztaságúak, előnyösebben 97%-os tisztaságúak, előnyösebben 98%-os tisztaságúak, előnyösebben 99%-os tisztaságúak, még előnyösebben 99,5%-os tisztaságúak, és a legelőnyösebben a szennyező fehérjék nem detektálhatóak olyan hagyományos eljárásokkal, mint az SDS-PAGE vagy az ezüstfestés.

A találmány tárgyát képezik olyan, a fentiekben definiált oligomer részecskék is, amelyekben a burokfehérje a HCV-E1, a HCV-E1s, a HCV-E2, a 13. azonosító számú szekvenciával és/vagy a 14. azonosító számú szekvenciával leírható fehérje, vagy azok részeinek bármely lehetséges keveréke; például a találmány szerinti részecske alapvetően állhat HCV-E1- és HCV-E2fehérjékből, HCV-E1- és HCV-E1s-fehérjékből, HCVE1s- és HCV-E2-fehérjékből, és HCV-E1-, HCV-E1sés HCV-E2-fehérjékből. Ráadásul a találmány tárgyát képezi olyan, a fentiekben definiált oligomer részecske is, ahol a fehérjék különböző HCV-törzsekből, altípusokból vagy genotípusokból származnak, például a fehérje származhat az 1b. és a 4. genotípusból, vagy lehet olyan HCV-keverék, amely egy törzsből vagy genotípusból, és legalább egy másik törzsből vagy genotípusból származik. A különböző HCV-törzsek vagy genotípusok alapos definícióját és jellemzését megtaláljuk Maertens és munkatársai PCT/EP 95/04155 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésében. Hangsúlyoznunk kell, hogy az utóbbi okmány teljes tartalma, az összes definíciót beleértve, a szabadalmi bejelentés és a kitanítás részét képezi. így a találmány tárgyát képezik a technika állása szerint ismert bármely HCV-törzsből vagy genotípusból származó burokfehérjéket tartalmazó oligomer részecskék, vagy a technika állása szerint ismert bármely HCV-törzsből vagy genotípusból származó burokfehérjék keverékét tartalmazó részecskék. Ebből a szempontból a találmány tárgyát képezik az egyedi kiónokból származó konszenzusszekvenciák, amint azt a példáknál ismertetjük (lásd alább).

A találmány tárgyát képezik továbbá oligomer részecskék, amelyek előállíthatóak egy eljárással, valamint a találmány tárgyát képezi az oligomer részecske előállítására alkalmas eljárás. Az eljárás a következő lépésekből áll:

(I) HCV-burokfehérjék tisztítása, lehetséges módon egy első detergens alkalmazásával. Lényegét tekintve, a tisztítási eljárás (I) lépését Maertens és munkatársai PCT/EP 95/04155 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésében részletesen leírtuk. Nagy jelentőséggel bír, hogy a találmány szerinti megoldásban a - PCT EP95/03031 számú bejelentésben leírt tisztítási művelet során, például NEMbiotinnal végrehajtott - blokkolási lépést alkilezési lépéssel együtt végezzük el, amit a találmány szerinti megoldásban ismertetünk, előnyösen jód-acet8

HU 227 275 Β1 amid alkalmazásával. Továbbá, az I. lépés szerinti tisztítási művelet során lehetőleg diszulfidhidat hasító reagenst alkalmazunk, és lehetséges alkilálószer alkalmazása is. Végül, az (I) lépésben az eljárás tisztított, oldat formájú HCV-burokfehérjét eredményez.

(II) A tisztított HCV-burokfehérje-oldatban az oldószer helyettesítése detergenssel vagy sóval, amely lépés oligomer részecskék kialakulását eredményezi.

(Ili) Az oligomer részecskék kinyerése vagy tisztítása, lehetséges módon az (I) lépésben alkalmazott, a helyettesítés után az oligomer részecskék kialakulását és stabilizálását segítő detergens vagy só koncentrációjának további csökkentésével. Előnyösebben, a találmány tárgyát képezik az itt definiált oligomer részecskék, valamint a részecske előállítására szolgáló eljárás, ahol az adott esetben alkalmazott detergens az Empigen-BB. Előnyösebben, a találmány tárgyát képezi az itt definiált oligomer részecske, valamint a részecske előállítására szolgáló eljárás, ahol a (II) lépésben alkalmazott detergens a CHAPS, az octylglucaside vagy a Tween, előnyösebben a Tween-20 vagy Tween-80, vagy bármely más detergens. Még előnyösebben a találmány tárgyát képezik az itt definiált oligomer részecskék, valamint a részecske előállítására szolgáló eljárás, ahol a só a bétáin. Még előnyösebben a találmány tárgyát képezik a fent definiált oligomer részecskék, valamint a részecske előállítására szolgáló eljárás, ahol az Empigen-BB-t 1-10%-os koncentrációban alkalmazzuk, és ahol a CHAPS-ol vagy a Tweenl 0,01-10%-os koncentrációban alkalmazzuk, vagy a betaint 0,01-10%-os koncentrációban alkalmazzuk. Még előnyösebben a találmány tárgyát képezik az itt definiált oligomer részecskék, valamint a részecske előállítására szolgáló eljárás, ahol az Empigen-BB-t 3%-os koncentrációban alkalmazzuk, és ahol a CHAPS-ot 0,2%-os, vagy a betaint 0,3%-os koncentrációban alkalmazzuk, miután a puffért lecseréltük, és a CHAPS-ot vagy betaint alkalmazzuk 0,05%-os vagy 0,1-05%-os koncentrációban. Nyilvánvaló, hogy a fent ismertetett eljárásban a %-os értékeket tömeg/térfogat egységben adjuk meg. Nyilvánvaló, hogy a fent ismertetett eljárás (lásd még a PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentést és a leírásban a példákat) egy példa arra, hogy hogyan állítsuk elő a találmány szerinti részecskéket. Ebből a szempontból a találmány tárgyát képezi a technika állása szerinti bármely eljárás, amely alkalmas a találmány szerinti oligomer részecskék előállítására, mint például a PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben és a példáknál (alább) leírt redukálószerek alkalmazásának elhagyása, és helyette gazdasejtek alkalmazása, amelyek endoplazmatikus retikulumában a ciszteinhidak redukálásához optimális a redoxállapot. Ráadásul, nyilvánvaló, hogy az alkil-betainok széles skáláját alkalmazhatjuk, például C_n-végződéssel rendelkező alkil-betainokat, ahol n pozitív egész szám, 1-től 20-ig, valamint alkalmazhatunk betainszármazékokat, mint például szulfobetainokat.

Mivel először értünk el sikeres immunterápiát súlyos, aktív, krónikus hepatitis C-ben szenvedő csimpánzok esetében tisztított HCV-antigénnel történő vakcinázással, ezért a találmány tárgyát képezi tisztított szabad HCV-burokfehérje is, közelebbről az E1 vagy az E1s. Ráadásul a találmány tárgyát képezi az egyedi HCV-burokfehérjét tartalmazó készítmény, és annak HCV-vakcinaként, vagy HCV-vakcina előállításában történő alkalmazása.

Irreleváns epitópok elleni immunválasz indukálásának elkerülése céljából a vakcinázásban alkalmazott HCV-burokfehérjét előnyösen egyedi altípusok, törzsek vagy kiónok konszenzusszekvenciájaként szerkesztjük meg. így a találmány tárgyát képezi HCV-antigén (peptid, fehérje vagy akár polinukleotid formájában) alkalmazása is, vakcinázási vagy diagnosztikai célra. Ráadásul, a találmány tárgyát képezi az itt definiált oligomer részecske, és annak alkalmazása, ahol a HCV-burokfehérjét olyan konszenzusszekvenciák kódolják, amelyek izolátumon belüli guas/spec/es-variabilitáson alapulnak (izolátumkonszenzus-szekvenciák), vagy egy altípushoz (altípuskonszenzus-szekvenciák), egy típushoz vagy fajhoz (típuskonszenzus-szekvenciák vagy fajkonszenzus-szekvenciák), tartozó, különböző izolátumok, vagy a teljes HCV-genus (genus-konszenzusszekvenciák) konszenzusszekvenciáin alapulnak. Következésképp e konszenzus-HCV-burokfehérje aminosavszekvenciája izolátum-, altípus-, törzs-, vagy genus-konszenzusszekvenciákból származnak. A „konszenzusszekvencia” kifejezés jelentését Maertens és Stuyver (1997) közleményében, és az itt idézett hivatkozásokban közelebbről meghatározzák.

A találmány szerinti oligomer részecske rendkívül hatékonyan jelenít meg epitópokat (lásd alább). így az oligomer részecske az epitópok számára egy olyan eszköz, amely az epitópokat hatékony immunválasz kiváltására alkalmas módon prezentálja. Ezzel összefüggésben magától értetődik, hogy az itt definiált HCV-burokfehérjék nem szükségszerűn csak HCV-epitópokat tartalmaznak. A HCV-burokfehérjék, amelyek oligomer részecskéket alkotnak, tartalmazhatnak olyan epitópokat, amelyek más, exogén tényezőből, például HBVböl vagy HIV-ből származnak. Más szóval, a HCV-burokfehérjevázból álló oligomer részecske alkalmazható, lehetséges módon, a HCV-epitópok mellett ráadásul a nem HCV-epitóp prezentálását szolgáló hordozóként. így a találmány tárgyát képezi az itt definiált, azonban lehetséges módon HCV-epitópot nem tartalmazó oligomer részecske, valamint annak alkalmazása és előállítása, lehetséges módon úgy, hogy az tartalmaz nem HCV-jellegű epitópot. Az „exogén tényező kifejezés alatt értünk bármely olyan, élő vagy akár nem élő tényezőt, amely immunválasz kiváltására alkalmas, és amely a gazdaszervezet szempontjából nem endogén, és amely nem HCV. Speciálisan az utóbbi kifejezés alatt patogén tényezőket, allergéneket és hapténokat tartalmazó csoportot értünk. Patogén tényezők, többek között a prionok, vírusok, prokarióták és eukarióták. Specifikusabban, vírus többek között különösen a HBV, HÍV, vagy herpeszvírus, de nem a HCV. Aller9

HU 227 275 Β1 gének többek között az olyan anyagok vagy molekulák, amelyek gazdaszervezetben önmagukban képesek immunválasz kiváltására, amikor a gazdaszervezet az allergéneknek van kitéve. A haptének az allergénekhez hasonlóan működnek, azonban az allergénekkel szemben a haptén hordozómolekulát igényel.

A találmány tárgyát képezi a fent definiált oligomer részecskét tartalmazó készítmény. Közelebbről a találmány tárgyát képezi vakcinakészítmény. A „vakcinakészítmény” kifejezés alatt HCV elleni védelem kiváltására alkalmas immunogén készítményt értünk, függetlenül attól, hogy a védelem részleges vagy teljes. Ez ilyen módon magában foglalja a HCV-peptideket, fehérjéket, vagy polinukleotidokat. A HCV-vel szembeni védelem alatt közelebbről emberek védelmét értjük, de a kifejezés vonatkozik a főemlősökre, trímera egerekre [Zauberman és munkatársai (1999)] vagy más emlősre.

A találmány tárgyát képező részecskéket mint olyanokat alkalmazhatjuk biotinilált formában (mint a WO 93/18054 számú nemzetközi közzétételi iratban), és/vagy Neutralite Avidinne\ komplexet képezve (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA). Meg kell jegyeznünk azt is, hogy „vakcinakészítmény” a hatóanyagon kívül tartalmaz alkalmas excipienst, hígítót, hordozót és/vagy adjuvánst, amelyek önmagukban nem indukálják a készítménnyel kezelendő egyén számára ártalmas antitestek termelését, és (önmagukkal szembeni) védelmet sem váltanak ki. Alkalmas hordozók, többek között, tipikusan nagy, lassan metabolizálódó makromolekulák, mint a fehérjék, poliszacharidok, a polilaktonsav, a poliglikolsav, aminosavpolimerek, aminosavkopolimerek és inaktív vírusrészecskék. Az alkalmas hordozók a technikában jártas szakember számára jól ismertek. A készítmény hatásosságának növelésére szolgáló, előnyös adjuvánsok többek között, de nem kizárólag: alumínium-hidroxid, alumínium 3-0-dezacilált monofoszforil lipid-A-val kombinálva, a WO 93/18054 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint, alumínium-foszfát a WO 93/18054 számú nemzetközi közzétételi iratban leírtak szerint, N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin a 4606918 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat szerint, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin, az N-acetilmuramil-L-alanil-D-izoglutamil-L-alanin-2(T,2’dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxi-foszforil-oxi)-etil-amin és a RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA), amely monofoszforil lipid-A-t, detoxikált endotoxint, trehalóz-6,6,-dimikolátot, és sejtfalvázat (MPL+TDM+CWS) tartalmaz 2% szkvalén/7ween-80 emulzióban. A három komponens (MPL, TDM vagy CWS) bármelyike alkalmazható önmagában vagy kettesével kombinálva. Ráadásul alkalmazhatóak olyan adjuvánsok, mint a Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA) vagy SAF-1 (Syntex), valamint az olyanok, mint a QS21 és a 3-dezoxi-acetilált monofoszforil lipid-A közötti kombináció (WO 94/00153 számú nemzetközi közzétételi irat), vagy az MF-59 (Chiron), vagy a poli[di(karboxil-atofenoxi)-foszfazén]-alapú adjuvánsok (Vírus Research Institute), vagy blockopolymer-a\apú adjuvánsok, mint az Optivax (Vaxcel,

Cythx) vagy az inulinalapú adjuvánsok, mint az Algammulin és a Gammalnulin (Anutech), az inkomplett Freund-adjuváns (IFA) vagy Geróu-preparátumok (Gerbu Biotechnik). Magától értetődik, hogy a komplett Freund-adjuváns (CFA) alkalmazható nem emberi célokra történő alkalmazásokban és kutatási célokra egyaránt. „Vakcinakészítmény” ráadásul tartalmaz excipienseket és hígítókat, amelyek inherens módon nem toxikusak és nem terápiásak, mint például a víz, a sóoldat, a glicerin, az etanol, nedvesítő- vagy emulgeálószerek, pH-pufferoló anyagok, tartósítószerek, és ehhez hasonlóak. Tipikusan, vakcinakészítményt injektálható formában állítanak elő, folyadék vagy akár szuszpenzió formájában. Előállíthatóak szilárd formák, amelyek alkalmasak folyadék hordozóban, az injektálás előtt vagy oldatban, vagy szuszpenzióban való elkészítésre. A preparátum lehet liposzómákban emulgeálva vagy kapszulázva az adjuvánshatás növelése céljából. A polipeptidek lehetnek beépítve immunstimuláló komplexekbe szaponinokkal, például Qu/7-A-val együtt (ISCOMS). A vakcinakészítmények a találmány szerinti polipeptid immunológiailag hatásos mennyiségét, valamint bármely, a fent említett összetevőket tartalmazza. Az „immunológiailag hatásos mennyiség” azt jelenti, hogy az ilyen mennyiség beadása az egyénnek akár egyszeri dózisban, akár egy sorozat tagjaként, hatásos a megelőzésben vagy a kezelésben. Ez a mennyiség függ a kezelendő egyén egészségi és fizikai kondíciójától, annak rendszertani besorolásától (azaz humán, nem humán főemlős, főemlős stb.), az egyén immunrendszerének kapacitásától hatásos immunválasz produkálására szempontjából, a kívánt védelem fokától, a vakcina formulázásától, a kezelőorvos által történő elbírálástól, a fertőző HCV-törzs besorolásától és más, lényeges tényezőktől. Várható, hogy a mennyiség viszonylag széles tartományba esik, amelyet rutinkísérletekkel határozhatunk meg. Rendszerint a mennyiség a 0,01-1000 pg/dózis, előnyösebben a 0,1-100 pg/dózis tartományba esik. A vakcinakészítményeket szokásosan parenterálisan, tipikusan injekcióban, például szubkután vagy intramuszkuláris injekcióban adjuk be. A beadás további módjaira alkalmas formulák többek között az orális formulák és kúpok. A dóziselosztás történhet egyszeri dózis vagy többszöri dózisbeosztás szerint. A vakcinát beadhatjuk más immunregulátor hatóanyagokkal együtt. így a találmány tárgyát képezi az itt definiált oligomer részecske alkalmazása HCV elleni immunitás profilaktikus indukálásában. Meg kell jegyeznünk, hogy vakcina alkalmas lehet egyének kezelésében is, a fentiekben ismertetettek szerint, amely esetben ezt „terápiás vakcinának nevezzük.

A találmány tárgyát képezi a fenti definíció szerinti készítmény is, amely tartalmaz HCV-magfehérjét, E1-et, E2-t, P7-et, NS2-t, NS3-at, NS4A-t, NS4B-t, NS5A-t és/vagy NS5B-fehérjét, vagy ezek részeit is. Az E1, E2 és/vagy E1E2-részecske lehet például kombinálva T-sejt-stimuláló antigénekkel, mint például a magfehérjével, a P7-tel, az NS3-mal, az NS4B-vel, NS5A-val és/vagy NS5B-vel. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi a fent definiált készítmény, ahol az NS310

HU 227 275 Β1 fehérje, vagy annak részeinek aminosavszekvenciája az 1. azonosító számú vagy a 2. azonosító számú szekvenciával van megadva (lásd még a példáknál). Az NS3-fehérjék tisztítása előnyösen magában foglalja a ciszteincsoportok reverzibilis módosítását, és előnyösebben a ciszteinek szulfonálását. Az ilyen reverzibilis módosítás, többek között a szulfonálás végrehajtására szolgáló eljárásokat az NS3-fehérjék esetében Martens és munkatársai PCT/EP99/02547 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése írja le. Hangsúlyoznunk kell, hogy az utóbbi okmány teljes tartalmát, többek között minden definíciót úgy idézünk, mintha a szabadalmi leírásba beépítettük volna, és azok a kitanítás részét képezik.

A fentiekből világosan kiderül, hogy a találmány tárgyát képezi a fentiekben definiált oligomer részecske vagy a fentiekben definiált készítmény alkalmazása HCV-vakcinakészítmény előállításában. Közelebbről, a találmány tárgyát képezi az itt definiált oligomer részecske alkalmazása HCV elleni immunitás indukálásában krónikus HCV-hordozók esetében. Még közelebbről a találmány tárgyát képezi az itt definiált oligomer részecske alkalmazása HCV elleni immunitás indukálásában krónikus HCV-hordozók esetében, más terápiák, mint például a jól ismert interferonterápia előtt, azzal egyidejűleg, vagy az után, akár a HCV kezelésére szolgáló kis (molekulájú) hatóanyagok, mint például a ribavirin beadásával kombinálva, akár anélkül. Az ilyen készítmény alkalmazható májátültetés előtt vagy után, vagy feltételezett fertőzés után, mint például tűszúrás okozta sérülés esetében. Ráadásul, a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti oligomer részecskéket vagy egyedi HCV-burokfehérjéket tartalmazó, HCV-antitestek biológiai mintákban történő detektálására szolgáló reagenskészlet. A „biológiai minta” kifejezés alatt egyénből izolált szövetmintát vagy folyadékot értünk, többek között, de nem kizárólag, például szérumot, plazmát, nyiroknedvet, a bőr, a légzőszervek, a béltraktus és a genitourinarius traktus külső metszetét vagy kiválasztási termékét, könnyeket, nyálat, tejet, vérsejteket, tumorokat, szerveket, gyomornedveket, nyálkát, gerinccsatorna-folyadékot, kiválasztási termékeket, mint például székletet, vizeletet, spermát és ehhez hasonlókat. Mivel a találmány szerinti oligomer részecskék és az egyedi HCV-burokfehérjék erősen immunogének, és mind humorális, mind celluláris immunválaszt stimulálnak, a találmány tárgyát képezi HCV-vel összefüggő T-sejt-válasz detektálására szolgáló reagenskészlet is, amely tartalmazza a találmány szerinti oligomer részecskét vagy a tisztított, szabad HCV-burokfehérjét. A HCV-T-sejtválaszt mérhetjük például a példáknál leírtak szerint, vagy a LerouxRoels és munkatársai PCT/EP94/035555 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésében leírtak szerint. Hangsúlyoznunk kell, hogy az utóbbi irat teljes tartalmára, többek között minden definíciójára úgy hivatkozunk, mintha a szabadalmi bejelentésbe beépítettük volna, és azok a kitanítás részét képezik.

Első ízben mutatjuk ki, hogy elegendő szintű HCVantitest, különösen HCV-burok elleni antitest a hepatitis C-betegség enyhülését indukálja. Először mutattuk ki azt is, hogy elegendő szintű antitest képes megkötni a vírust a keringésben, és az antitesttel komplexet képező vírus jelenléte a HCV-antigén májból történő kitisztulásával, és a májbetegség enyhülésével összefüggésben történik. HCV-burokfehérje elleni antitesteket indukálhatunk vakcinázással vagy átvihetünk passzív módon injekcióval, miután az antitesteket HCV-vel fertőzött vérből vagy HCV-vakcinával kezelt (egyének) véréből megtisztítottuk. A találmány szerinti oligomer részecskék epitópjai erősen immunogének. Következésképp az oligomer részecskéken található epitópok erősen immunogének. így a találmány tárgyát képezik oligomer részecskéken elhelyezkedő epitópok is, amelyek legalább 10-szer, előnyösen legalább 20-szor, előnyösebben legalább 50-szer, előnyösebben legalább 100-szor, előnyösebben legalább 500szor, és a legelőnyösebben legalább 1000-szer erősebben immunogének, mint a nem a találmány szerint előállított, azaz nem detergens által segített részecskekialakításban előállított HCV-peptidek epitópjai. A szakember számára nyilvánvaló, hogy az immunogenicitást például detektálhatjuk és összehasonlító vizsgálatokat végezhetünk úgy, hogy emlősöket immunizálunk bármelyik eljárással előállított, összehasonlítható mennyiségű peptidek beadásával. Az „antitest” kifejezésen poliklonális vagy monoklonális antitesteket értünk. A „monoklonális antitest” kifejezés alatt homogén antitestpopulációval jellemezhető antitestkészítményt értünk. Az „antitest” kifejezés értelmezését nem korlátozzuk az antitest eredete szerint, és a készítés módja szerint sem. Ráadásul, az „antitest” kifejezés alatt értünk „humanizált” antitesteket is, ahol az immunglobulin vázrégióinak legalább egy része humán eredetű immunglobulin-szekvenciákból és egyláncú antitestekből származik, mint amilyenek leírását megtaláljuk például a 4946778 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban; a kifejezés alatt értünk antitestfragmenseket, mint az F_ab, az F(_abj₂, az F_v, és más fragmenseket, amelyek megtartják az antigénkötő funkciót és az antitest specificitását, amelyből származik.

Ráadásul, a találmány tárgyát képezi a fentiekben definiált oligomer részecske vagy a fentiekben definiált készítmény HCV-burokfehérjék elleni antitestek detektálásában történő alkalmazása. A „detektálás” kifejezés alatt a technika állása szerinti bármely, a detektálásra alkalmas eljárást értünk. Közelebbről, a kifejezés alatt a WO 96/13590 számú nemzetközi közzétételi iratban leírt immunológiai mérési eljárásokat értjük.

A „peptid, „polipeptid, és „fehérje kifejezéseket a szabadalmi leírásban egymással felcserélhetően (szinonimaként) alkalmazzuk. A „polipeptid” kifejezés alatt aminosavpolimert (aminosavszekvenciát) és nem specifikus hosszúságú molekulát értünk. így az oligopeptidek a polipeptid kifejezés alá értendők. Magától értetődik, hogy a „polipeptid”, „peptid” és „fehérje” kifejezések magukban foglalják a peptidmimetikumokat.

A találmány tárgyát képezi az itt leírt oligomer részecske alkalmazása HCV elleni immunitás indukálá11

HU 227 275 Β1 sában, ahol az oligomer részecskét időbeni sorozat és vegyületsor részeként alkalmazzuk. Ebből a szempontból magától értetődő, hogy a „időbeni sorozat és vegyületsor részeként” azt jelenti, hogy az immunválasz kiváltásában alkalmazott vegyületeket időközönként adjuk be egyéneknek. A vegyület tartalmazhatja az alábbi összetevők bármelyikét: oligomer részecskék, HCV-DNS-vakcinakészítmény, HCV-polipeptidek.

Ebből a szempontból egy sorozat állhat:

(I) HCV-antigén, például oligomer részecske, időközönként történő beadásából, vagy (II) HCV-antigén, például oligomer részecske és a

HCV-DNS-vakcinakészítmény kombinációjának beadásából, ahol az oligomer részecskét és a HCVDNS-vakcinakészítményt beadhatjuk egyidejűleg, vagy különböző időpontokban/időközönként, például váltakozó időközönként történő beadásából, vagy (III) vagy az (I), vagy a (II) szerint történő, esetleg más

HCV-peptidekkel kombinálva, időközönként történő beadás.

Ebből a szempontból világos, hogy HCV-DNS-vakcinakészítmény tartalmaz HCV-burokfehérjét kódoló nukleinsavakat, többek között E1-, E2-, E1/E2-peptideket, a 13. azonosító számú szekvenciával leírt fehérjét, a 14. azonosító számú szekvenciával leírt fehérjét, NS3-peptidet, más HCV-peptideket, vagy a peptidek részeit kódoló nukleinsavakat. Ráadásul, magától értetődik, hogy a HCV-peptidek tartalmaznak HCV-burokpeptideket, többek között E1-, E2-, E1/E2-peptideket, E1 s-peptidet, a 13. azonosító számú szekvenciával leírható, a 14. azonosító számú szekvenciával leírható fehérjét, NS3-peptidet, más HCV-peptideket, vagy ezek részeit. A „más HCV-peptidek” kifejezés alatt értünk bármely HCV-peptidet vagy fragmenst, feltéve, hogy a HCV-peptid nem E1-, E2-, E1/E2-peptid, E1speptid, a 13. azonosító számú szekvenciával leírt fehérje, a 14. azonosító számú szekvenciával leírt fehérje, vagy NS3. A fenti vázlat (II) pontjában a HCV-DNSvakcinakészítmény előnyösen tartalmaz HCV-burokfehérje-peptideket kódoló nukleinsavakat. A fenti vázlat (II) pontjában a HCV-DNS-vakcinakészítmény még előnyösebben HCV-burokfehérje-peptideket kódoló nukleinsavakat kódol, esetlegesen HCV-NS3-DNSvakcinakészítménnyel kombinálva. Ebből a szempontból nyilvánvaló, hogy HCV-DNS-vakcinakészítmény olyan plazmidvektort tartalmaz, amely a fenti HCV-peptidet kódoló, transzkripciós szabályozóelemek szabályozása alatt álló polinukleotidszekvenciát tartalmaz. A „plazmidvektor kifejezés alatt olyan nukleinsavmolekulát értünk, amely más, hozzá kötött nukleinsavmolekula átvitelére alkalmas. Előnyösek azok a vektorok, amelyek képesek autonóm replikációra, és/vagy más, hozzájuk kötött nukleinsavak expressziójára. Általában, de nem kizárólag, a plazmidvektorok cirkuláris, kettős láncú DNS-hurkok, amelyek ebben a formában nem kromoszómához kapcsoltak. A „polinukleotidszekvencia” kifejezés alatt olyan polinukleotidokat értünk, mint a dezoxiribonukleinsav (DNS), és adott helyen a ribonukleinsav (RNS). A kifejezés nyilvánvalóan magában foglal azonos jelentéssel nukleotidanalógokból felépülő RNS-t vagy akár DNS-t, és egyláncú („szenz” vagy „antiszenz”) és kettős láncú polinukleotidokat. A „transzkripciós szabályozóelemek” kifejezés alatt olyan nukleotidszekvenciát értünk, amely alapvető fontosságú szabályozóelemeket tartalmaz, és amely élő, gerinces eredetű sejtbe juttatva képes arra, hogy a sejt „gépezetét” a polinukleotid által kódolt transzlációs termékek előállítására állítsa át. A „szabályozása alatt álló” kifejezés alatt a komponensek olyan egymás mellé helyezését értjük, ahol azok úgy vannak csoportosítva, hogy a szokásos funkciójukat elláthassák. így nukleotidszekvenciához szabályozóhatással kapcsolt szabályozóelemek képesek arra, hogy hatást gyakoroljanak az adott nukleotidszekvencia expressziójára. A szakember számára nyilvánvaló, hogy a különböző transzkripciós promoterek, terminátorok, hordozóvektorok vagy specifikus génszekvenciák sikeresen alkalmazhatóak.

Végül, a találmány tárgyát képezi HCV-antitest detektálására szolgáló immunológiai mérési eljárás, amely a következő lépésekből áll: (1) a fentiekben definiált, egyedi HCV-burokfehérje vagy oligomer részecske, vagy funkcionális ekvivalense előállítása, (2) biológiai minta inkubálása az oligomer részecskével, vagy a HCV-burokfehérjével olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik antitest-antigén komplex kialakulását, (3) az oligomer részecskét vagy a HCV-burokfehérjét tartalmazó antitest-antigén komplex kialakulásának megállapítása.

Az alábbiakban olyan példákkal illusztráljuk a találmányt, amelyek a találmány különösen előnyös megvalósítási módjait mutatják be. Meg kell jegyeznünk azonban, hogy a találmány ilyen megvalósítási módjai csak illusztrációként szolgálnak, de semmilyen módon nem értelmezhetőek a találmány tárgykörének korlátozásaként.

Példák

1. példa

A HCV-burokfehérje expressziója, tisztítása és detergens által elősegített homooligomerizációja A (a 192-326. aminosavból álló) HCV-E1s-fehérjét

RK13-as sejtekben expresszáltuk és tisztítottuk pvHCV-11A rekombináns vakcinavírus alkalmazásával, a Maertens és munkatársai (PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) által leírt előirat szerint. Ráadásul, a 3%-os Empigen-BB-ben tisztított E1-fehérjét, amelynek látszólagos molekulatömege az E1-homodimerrel megegyező (megközelítőleg 60 kDa; 1. ábra), összegyűjtöttük, és az összegyűjtött frakciókat újra méretkizárási kromatográfiás oszlopra vittük (a PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint), és 2,2% CHAPS-ban vagy 3% bétáin jelenlétében megfuttattuk. Meglepő módon mindkét detergens esetében specifikusan asszociálódott, 260-280 kDa látszólagos molekulatömegű E1-homooligomerek homogén populációját kaptuk (2. ábra),

HU 227 275 Β1 noha az E1s-fehérje membránhorgony-régiója hiányzik. Az ilyen homooligomer szerkezetek megközelítőleg 9 E1s-monomert tartalmazhatnak. Nyilvánvaló, hogy ez utóbbi megállapítás durva becslés, mivel az oligomer alakja nagymértékben hatást gyakorol az oligomer méretkizárási kromatográfiával mért látszólagos molekulatömegére. A 0,2% CHAPS-t 0,05%-ra cserélve és az eljárás megismétlésével a látszólagos molekulatömeg tovább tolódott, az oszlop felbontóképességén túl (az oszlop üres térfogata, >600 kDa, 3. ábra), ami részecskék kialakulását valószínűsíti. A 3% bétáin cseréje 0,1% betainra hasonló viselkedésű (az adatokat nem mutatjuk be) E1s-oligomerek populációját eredményezte. Választhatunk másik, olyan detergenst, amely alkalmazásával hasonló, detergens által elősegített oligomerizációt valósíthatunk meg. A részecske kialakulásához vezető oligomerizáció (elősegítése) nem a CHAPS vagy a bétáin egyedi tulajdonsága, mivel hasonló eredményeket értünk el Tween-20 vagy Tween-80 vagy octylglucaside alkalmazásával. Ráadásul a detergens eltávolítását tovább folytathatjuk, és ez még nagyobb részecskék kialakulásához vezethet. A részecskéket kialakíthatjuk SSC alkalmazásával, mindenféle detergens nélkül. Figyelemre méltó, hogy az E1-monomer megközelítőleg 31 kDa, míg az E2-monomer megközelítőleg 70 kDa. Ezek az értékek azonban változhatnak, a fehérje glikozilációs állapotától függően.

2. példa

Magasabb rendű E1s-oligomer szerkezetek analízise dinamikus fényszórás alkalmazásával Azt a váratlan eredményt, hogy részecskéket állítottunk elő, úgy kívántuk megerősíteni, hogy az 1. példa szerint előállított E1s-preparátumokat 0,05% CHAPS-ban és 0,1% betainban, vagy 0,1%-os betainban (0,5%-os betainkészítmény hígításával előállítva) dinamikus fényszórási analízisnek vetettük alá.

A dinamikus fényszórási módszerek Brown-féle mozgást mérnek, és (a mért paraméterek) a részecske méretével vannak összefüggésben. Minél nagyobb a részecske, annál lassabb a Brown-fé\e mozgás. A Brown-mozgás sebességét a diffúziós együttható (rendszerint D-vel jelölt) néven ismert tulajdonsággal definiáljuk. A részecske méretét a diffúziós együtthatóból a Stokes-Einstein-egyen\et alkalmazásával számítjuk ki: d(H)=kT/377H|D, ahol d(H) a hidrodinamikus átmérő, k a Bo/fzmann-állandó, T az abszolút hőmérséklet, η a viszkozitás. Megjegyezzük, hogy a mért átmérő olyan érték, amely arra utal, hogy a részecske hogyan diffundál folyadékban. így ez a hidrodinamikus átmérőt jelenti. A diffúziós együtthatót autokorrelációs függvényből származtatjuk (a fény intenzitásfluktuációjának változása az időben). A készülék számítógép által szabályozott korrelátort alkalmaz az autokorrelációs függvény intenzitásának automatikus számítására.

Az eloszlások számítása céljából a fenti függvényt lineáris grafikonok előállítására korrigáltuk, és a készüléket a méreteloszlás analízisére alkalmas számítógépes programmal láttuk el. A módszer azonban a sokszögű fényszórásban (MALLS) alkalmazottakhoz hasonló, korlátozó jellegű feltételezéseket alkalmaz, és egyik eljárás sem alkalmas abszolút értékek megadására. A DLS-mérésekből származó méreteloszlási eredményeket inkább a polidiszperzitásra utaló szemikvantitatív értékeknek tekintjük, és nem a valós eloszlást reprezentálja.

Az E1s-részecskéket tartalmazó mintákat (80-400 pg E1s/ml PBS-0,05% CHAPS, 0,1% vagy 0,5% bétáin) 10 mW HeNe Laserre\ felszerelt LSP 3.53 DLS-készülék (PolymerLabs) mérőcellájába pipettáztuk. Az analízis eredményét a 4. ábrán (E1s 0,05% CHAPS-ban) és az 5. ábrán (E1s 0,1% vagy 0,5% betainban) mutatjuk be.

Ezek az analízisek valóban megerősítették azt a váratlan eredményt, hogy a kapott E1s-szerkezetek gömb alakú, monodiszperz részecskék. Az E1s-részecskék átlagos méreteloszlása PBS/0,1 % betainban: 21,3±4 nm, PBS/0,5% betainban: 27,9±5 nm, míg az E1s átmérője PBS/0,05% CHAPS-ban 12,5 volt.

3. példa

Méret- és formaanalízis elektronmikroszkóp alkalmazásával

Tíz μΙ E1s-t (226 pg/ml, PBS/0,05% CHAPS-ban; és 143 pg/ml PBS/3% betainban) standard, negatív festéssel, 1%-os uranil-acetátban, szénnel stabilizált formvar rácson tettünk láthatóvá. A mintafelvitel 30 másodpercig tartott, és ezután dH₂O-dal öblítettük, majd 5 másodpercig festettük, és fotóztuk (6. ábra).

A statisztikai analízis a következő eredményeket adta: az E1s-részecske átmérője CHAPS-ban 8,7±0,17 nm volt (a 4,3-29,0 tartományban; Cl: 5,4) és az E1s-részecske betainban kevésbé homogén volt, 9,7±0,55 nm (a 4,3±40,5 tartományban; Cl: 511,0) átlagos átmérővel. Meglepő módon a 3% betainos preparátum, amely molekulatömege kezdetben a SEC-analízis szerint 250-300 kDa volt, nagyobb részecskéket alakított ki, mint a 0,05% CHAPS-preparátum, amely kezdetben 600 kDa-nál nagyobb molekulatömegű volt. Ezért azt feltételeztük, hogy az E1s 3%-os betainban kapott közbenső, homooligomer formái később magasabb rendű részecskéket alakíthatott ki. Ez a meglepő hatás a magasabb rendű részecskék előállításának más lehetőségeire mutat. A részecskék méreteloszlása (7. ábra) azt mutatja, hogy a CHAPS-preparátumok monodiszperzek, azonban az ábrán a nagyobb részecskeméreteknél „tailing” figyelhető meg (hullámszerű v. farokrész az eloszlási görbén) (29 nm-ig 0,05% CHAPS-ban). Mivel a nagyobb szerkezetek a DLSanalízisben túlbecsültek, a nagyobb méretű részecskék jelenléte (noha kisebb számban vannak jelen) magyarázatul szolgálhatnak a DLS-analízisben kapott nagyobb átmérőre (2. példa). Az átmérőben tapasztalható különbség szintén magyarázható azzal a ténnyel, hogy a DLS a részecskét mozgása közben méri, míg az elektronmikroszkópia statikus részecskéket mér. Nyilvánvaló, hogy e preparátumok immunogenicitása, az alábbi példákban bemutatottak szerint, a preparátum egészének tulajdonítható, és lehet az átlagos, a ki13

HU 227 275 Β1 sebb vagy nagyobb részecskék, vagy ezek keverékeinek tulajdonsága.

4. példa

1b-altípusú HCV-vel krónikusan fertőzött csimpánz immunizálása

1b-altípusú HCV-törzzsel már 13 éve (az immunizálás előtt 5015 napja) fertőzött, Phil nevű csimpánzt az 1b-genotípus eltérő törzséből származó, 95,1 %-os aminosavazonosságú (lásd a 2. táblázatot), és az 1-3. példákban leírt módon előállított E1 -vakcinával (192-326. a.) kezeltük. A csimpánznak összesen 6, 50-50 pg EIBI-R-730-ca\ (MPLA+TDM+CWS) kevert E1 -et adtunk be intramuszkuláris immunizálás formájában, PBS/0,05% CHAPS-ban a gyártó előirata szerint (Ribi Inc., Hamilton, MT). A 6 immunizálókezelést egyenként három injekcióból álló két sorozatban, háromhetenként, a két sorozat között hat hét nyugalmi (lag) időszakkal hajtottuk végre. Az immunizálás előtt 150 nappal kezdődően, az immunizálási időszak alatt és 1 évig az immunizálás után (lásd alább) a csimpánzot folyamatos megfigyelés alatt tartottuk, a HCV által indukált betegség aktivitására jellemző, különböző paraméterek szempontjából. Ezek a paraméterek, többek között, a vérkép, az ALT, AST, gamma-GT, a szérum vírusterhelése, a máj vírusterhelése és a máj hisztológiája. Ráadásul, az immunizálásra adott immunválaszt humorális és celluláris szinten megfigyelés alatt tartottuk. Ez időszak alatt az állatot az immunizálás bármely, káros hatása szempontjából, mint például a viselkedés változása, a klinikai tünetek, a testsúly, a hőmérséklet változása és helyi reakciók (pír, duzzadás, szöveti keményedés) szempontjából is megfigyeltük. Nem tapasztaltunk ilyen hatásokat.

Az ALT- (és különösen a gamma-GT, az adatokat nem mutatjuk be) szintek egyértelműen csökkentek, mihelyt az E1 elleni antitestszint elérte maximumát (8. ábra). Az ALT-szint viszonylag gyorsan visszaállt, ahogy az antitestszint kezdett csökkenni, azonban a gammaGT alacsonyabb szinten maradt, amíg az E1 elleni antitest detektálható maradt.

A májban az E2-antigén szinte a detektálási határszintek alá csökkent, mialatt az E1 elleni antitest detektálható volt, és az E2-antigén szintje visszaugrott röviddel az antitestek eltűnése után. Mialatt a „mag” (core) és az E2-antigén a májban detektálhatatlanná vált, a máj gyulladása kifejezetten csökkent (lásd még a 3. táblázatot). Ez jelentős bizonyítéka annak, hogy a vakcina a májkárosodás csökkenését indukálja, valószínűleg úgy, hogy a virális antigénnek a fő célszervből, a májból történő kiürülését okozza.

A virémia Amplicor HCV-monitorral (Roche, Basel, Svájc) mért szintje megközelítőleg változatlan maradt a szérumban a vizsgálat teljes időtartama alatt.

A humorális válaszreakció részletesebb analízise azt mutatta ki, hogy a maximális végponttiter elérte a 14,5*10³ értéket (hat immunizálás után), és ez a titer a detektálási határ alá csökkent 1 évvel az immunizálás után (8. ábra). A 9. ábra bemutatja, hogy a B-sejtek által felismerhető fő epitópok, amelyek peptidekkel utánozhatóak (mímelhetőek), az E2 N-terminális régiójában helyezkednek el (a V1V2- és a V2V3-peptidek; részletesen lásd a 4. táblázatban). Mivel a rekombináns E1 elleni reaktivitás nagyobb mértékű és hosszabb ideig tart, az ábra alapján arra a következtetése juthatunk, hogy a peptideket felismerő antitestek az E1 elleni antitestpopulációnak csak egy részét képviselik. A fennmaradó rész olyan epitópok ellen irányul, amelyeket nem jeleníthetünk meg peptidekkel, azaz ezek szakaszos (konformációs) epitópok. Ilyen epitópok csak a teljes E1-molekulán vagy esetleg csak a részecskeszerű szerkezeteken vannak. Az ilyen, E1 elleni immunválasz egyedülálló, legalábbis a krónikus HCV-hordozó embereknél (Maertens és munkatársai PCT/EP 96/13590 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) és csimpánzoknál [van Doorn és munkatársai (1996)] normális esetben megfigyeltekhez viszonyítva, ahol az E1-antitestek a fertőzés természetes lefolyása során termelődnek. Ezeknél a betegeknél az E1 elleni antitest részben a szakaszos (konformációs) epitópok ellen is termelődnek, de nagyobb részük a C4-epitóp ellen irányul (a betegek szérumának ±50%-a), és egy kisebb része a V1V2-ellen (a genotípustól függően 2-70%), és a V2V3 elleni reaktivitást csak kivételes esetekben észlelnek [Maertens és munkatársai (1997)].

A T-sejt-reaktivitás analízise azt jelezte, hogy a vakcinázás az immunrendszernek ezt a részét is stimulálja specifikus módon, mivel e T-sejtek stimulációs indexe 1-ről 2,5-re emelkedett, és kissé megemelkedett marad az ellenőrzési időszakban (10. ábra). A T-sejtreaktivitás az, amely csak az interferonterápiában a hosszú távú válaszreakciót adók esetében figyelhető meg [lásd Leroux-Roels és munkatársai PCT/EP 94/03555 számú nemzetközi szabadalmi bejelentését; Leroux-Roels és munkatársai (1996)].

5. példa

Krónikus HCV-hordozó immunizálása különböző altípusú HCV-vel

A (Tón nevű) csimpánz, amely már 10 éve (az immunizálás előtt 3809 nappal) 1a genotípusú HCV-vel fertőzött volt, a csak 79,3%-os aminosavazonosságot mutató (lásd a 2. táblázatot), és az előző példákban leírtak szerint előállított 1b-genotípusú E1-vakcinával kezeltük. A csimpánznak összesen 6, 50-50 pg, EIBIR-730-cal kevert E1 -et adtunk be intramuszkuláris immunizálás formájában, PBS/0,05% CHAPS-ban a gyártó előirata szerint (Ribi Inc., Hamilton, MT). A 6 immunizálókezelést egyenként három injekcióból álló két sorozatban, háromhetenként, a két sorozat között hat hét nyugalmi (lag) időszakkal hajtottuk végre. Az immunizálás előtt 250 nappal kezdődően, az immunizálási időszak alatt és 9 hónapig az immunizálás után (lásd alább) a csimpánzot folyamatos megfigyelés alatt tartottuk, a HCV által indukált betegség aktivitására jellemző, különböző paraméterek szempontjából. Ezek a paraméterek, többek között, a vérkép, az ALT, AST gamma-GT, a szérum vírusterhelése, a máj vírusterhelése és a máj hisztológiája. Ráadásul, az im14

HU 227 275 Β1 munizálásra adott immunválaszt humorális és celluláris szinten megfigyelés alatt tartottuk. Ez időszak alatt az állatot az immunizálás bármely, káros hatása szempontjából, mint például a viselkedés változása, a klinikai tünetek, a testsúly, a hőmérséklet változása és helyi reakciók (pír, duzzadás, szöveti keményedés) szempontjából is megfigyeltük. Nem tapasztaltunk ilyen hatásokat.

Az ALT (és különösen a gamma-GT, az adatokat nem mutatjuk be) szintek egyértelműen csökkentek, mihelyt az E1 elleni antitestszint elérte maximumát (11. ábra). Az ALT-szint és a gammaGT-szint visszaállt, ahogy az antitestszint kezdett csökkenni, azonban az ALT-szint és a gammaGT-szint alacsonyabb szinten maradt, a teljes megfigyelési időszak alatt. Az ALTszintek még jelentősebb mértékben csökkentek a vakcinakezelés után (62±6 U/l) a vakcinázás előtti időszakhoz viszonyítva (85±11 U/l). Mivel a szöveti károsodásra jellemző kevesebb jelzőparaméter állt vissza az eredeti szintre a szérumban, ezek a felismerések voltak az első jelzések arra, hogy a vakcinakezelés a májbetegség enyhülését indukálta.

Az E2-antigénszintek detektálhatatlanokká váltak abban az időszakban, amikor az E1 elleni antitesttiter 1,0χ10³ felett maradt, azonban újra detektálhatóvá váltak alacsony E1-antitestszintnél. A HCV-antigén eltűnésével a májgyulladás határozottan lecsökkent a mérsékelt aktív hepatitisről az állandó (ismétlődő) hepatitis minimális formájára (3. táblázat). Ez egy másik, jelentős bizonyíték arra, hogy a vakcina a májkárosodás mérséklődését indukálja, valószínűleg úgy, hogy a vírusnak a fő célszervből, a májból történő, legalábbis részleges kiürülését okozza.

Avirémia Amplicor HCV-monitorral (Roche, Basel, Svájc) mért szintje megközelítőleg változatlan maradt a szérumban a vizsgálat teljes időtartama alatt. A humorális válaszreakció részletesebb analízise azt mutatta ki, hogy a maximális végponttiter elérte a 30x10³ értéket (hat immunizálás után), és ez a titer 0,5x10³-ra csökkent 9 hónappal az immunizálás után (11. ábra). A 12. ábra bemutatja, hogy a B-sejtek által felismerhető fő epitópok, amelyek peptidekkel utánozhatok (mímelhetőek), az N-terminális régióban helyezkednek el (a V1V2- és a V2V3-peptidek; részletesen lásd a 4. táblázatban). Mivel a rekombináns E1 elleni reaktivitás nagyobb mértékű és hosszabb ideig tart, az ábra alapján arra a következtetésre juthatunk, hogy a peptideket felismerő antitestek az E1 elleni antitestpopulációnak csak egy részét képviselik. A fennmaradó rész olyan epitópok ellen irányul, amelyeket nem jeleníthetünk meg peptidekkel, azaz ezek szakaszos (konformációs) epitópok. Ilyen epitópok csak a teljes E1-molekulán vagy esetleg csak a részecskeszerű szerkezeteken vannak. Az ilyen, E1 elleni immunválasz egyedülálló, legalábbis az olyan, krónikus HCV-hordozó embereknél, akiknél van detektálható E1 elleni antitest. Ezeknél a betegeknél az E1 elleni antitest részben a szakaszos (konformációs) epitópok ellen is termelődnek, de nagyobb részük a C4-epitóp ellen irányul (a betegek szérumának ±50%-a), és egy kisebb része a V1V2-ellen (a genotípustól függően 2-70%), és a V2V3 elleni reaktivitást csak kivételes esetekben észlelnek [Maertens és munkatársai (1997)]. Mivel ez a csimpánz 1a-izolátummal volt fertőzve, az antitestválasz az immunválasznak az E1-1a-antigénnel való keresztreaktivitásra is vizsgáltuk. Amint a 13. ábrán látható, valóban keletkeztek ilyen, keresztreaktivitást mutató antitestek, azonban ezek csak egy részét képezik a teljes antitestpopulációnak. Figyelemre méltó a virális antigénnek a májba való visszatérése és a detektálható 1 aE1 elleni antitest szérumból történő eltűnése közötti összefüggés.

A T-sejt-reaktivitás analízise azt jelezte, hogy a vakcinázás az immunrendszernek ezt a részét is stimulálja specifikus módon, mivel e T-sejtek stimulációs indexe 0,5-ről 5-re emelkedett, és kissé megemelkedett maradt az ellenőrzési időszakban (14. ábra).

6. példa

A krónikus HCV-hordozók (immunrendszerének) fellendítése emlékeztető (reboosting) kezeléssel Mivel a 4. és 5. példánál megfigyelt E1 -antitesttiterek nem voltak stabilak és az időben csökkentek, még a detektálhatósági szintek alá is az 1 b-vel fertőzött csimpánz esetében, vizsgáltuk azt, hogy az antitestválasz szintje újra növelhető-e további fellendítő (emlékeztető) kezelésekkel. Mindkét csimpánzt újra immunizáltuk három egymást követő intramuszkuláris immunizálással, háromhetes időközönként (50 pg, R/ö/-adjuvánssal kevert E1). A 8. és a 11. ábra alapján megállapíthatjuk, hogy az E1 elleni válaszreakció valóban újra fellendíthető, ha a virális antigén szintje a májban a detektálhatóság határa alá csökkent. A szérum vírusterhelése azonban a Tón nevű csimpánz esetében állandó maradt (11. ábra). Az ellenőrzési időszakban, első ízben mértünk <10⁵ genomekvivalens/ml virémiaszintet.

Figyelemre méltó az a felismerés, hogy amint az első immunizálási sorozatban is megfigyeltük, az 1 b-altípusú HCV-törzzsel fertőzött csimpánz (a Phil nevű állat) alacsonyabb E1-titerekkel jellemezhető immunválaszt ad, mint az 1a-altípusú HCV-törzzsel fertőzött csimpánz (az első kísérletben a maximális titer 14,5x10³ Phil esetében, illetve 30x10³ volt Tón esetében, és további emlékeztető kezelés után csak 1,2χ10³ volt Phil esetében, ezzel szemben 30χ10³ Tón esetében). Mindkét állat esetében az előnyös hatás hasonlónak tűnik, azonban ebből a kísérletből az a következtetés vonható le, hogy krónikus hordozó más altípusból vagy genotípusból származó E1 -gyei történő immunizálása különösen előnyös magasabb titerek elérésében, valószínűleg azáltal, hogy az immunizálással megkerüljük a gazdaszervezetben korábban létező, a fertőző altípus vagy genotípus által indukált specifikus immunszuppressziót. Alternatív módon, a homológ összeállításban (1b-vakcina+1b-fertőzés) a megfigyelt alacsonyabb titerek az jelezhetik, hogy az antitestek nagyobb tömege (nagyobb része) a vírushoz kötődik, így az indukált antitestek semlegesítő képességgel rendelkezhetnek.

HU 227 275 Β1

7a. példa

A fertőzésre gyakorolt szabályozóhatással összefüggésbe hozott fő epitópokat kombináló NS-fehérje megalkotása

Az E1-ben más epitópok is összefüggésbe hozhatók a HCV-nek az akut fázis vagy az interferonterápia során történő kiürülésével. Az epitópok közül néhány az NS3-ban lokalizálódik [Leroux-Roels és munkatársai (1996); Rehermann és munkatársai (1996 és 1997); Diepolder és munkatársai (1995 és 1997)]. A fő epitópok közül kettő: a Rehermann és munkatársai által térképezett CTL-epitóp (1073-1081. aminosav), és a Diepolder és munkatársai által térképezett T-sejt-epitóp (CD4) (1248-1261. a.). Sajnálatos módon ezek az epitópok az NS3-fehérje egészén szóródva helyezkednek el. Ahhoz, hogy legalább ezeket az epitópokat hozzáférhetővé tegyük, viszonylag nagy fehérjére lenne szükség (1073-1545. a.) Az ilyen nagy fehérje termelése rendszerint alacsony kitermelést eredményez, és a vakcinázáskor olyan válaszreakciót eredményez, amelyben az (antitestek) csak kis része célozza a fontos epitópokat. Ilyen módon kisebb fehérje termelése alkalmasabb lenne a probléma megoldása céljából. Ezért arra van szükség, hogy az epitópok közül néhányat egy kisebb fehérjén újra pozícionáljunk. Alkalmazva azt az ismeretet, hogy létezik egy másik CTL-epitóp, amely nem hozható kapcsolatba a HCV-kiürüléssel [Rehermann és munkatársai (1996 és 1997)], a 1166. aminosavval kezdődő és az 1468. aminosavval végződő NS3-molekulát terveztünk (5. táblázat). Ez a konstrukció már magában foglalja a Weiner és munkatársai, valamint a Diepolder és munkatársai által leírt epitópokat. A 1167-1180 régiónak a 1071-1084 régióra történő mutáltatásával a nem releváns CTL-epitópot arra cseréltük ki, amelyet Rehermann és munkatársai a vírus kiürülésével hozott összefüggésbe. Ezt a konstrukciót tovább módosítottuk úgy, hogy tartalmazzon egy metionint a 1166. pozícióban, hogy lehetővé tegyük a transzláció megkezdődését. Ez a metionin E. coliban kivágódik, mivel alanin követi. Ilyen módon az NS3 természetes formájában jelen nem lévő, új epitópok bevitelének esélye minimálisra korlátozódik. Alternatív módon, ha az ilyen fehérje expressziója túl fáradságos lenne, a CTL-epitópot kapcsolhatjuk a C-terminális 1468-as aminosavhoz, amint azt részletesen feltüntettük az 5. táblázatban.

Izoláltuk és expresszáltuk a HCV NS3-fragmense kódoló szekvenciáját, a Maertens és munkatársai által leírtak szerint (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) (19b. klón; a HCV 1188-1468. szakaszát alkalmazva kiindulási anyagként). A Rehermann által leírt CTL-epitópot, amely nincs jelen a 19b-NS3-fragmensen, fuzionáltattuk ezzel a fragmenssel. Megszerkesztettük az N-terminális és a C-terminális fúziós fehérjék közül mindkettőt, mivel az epitóp helyzete hatást gyakorolhat a fúziós fehérje expressziós szintjére, a proteolitikus degradálódásra és a funkció kifejtésére gyakorolt hatásra.

Az NS3 19b-fragmenst a 3’-irányú (leftward) promoter szabályozásával expresszáló £ coli expressziós plazmid, a p/GR/2WS-3-plazmid PCR-templátként történő alkalmazásával az NS3-19b-t kódoló szekvenciákat a Rehermann-féle CTL-epitóppal N-terminálisan és C-terminálisan fuzionáltattuk (elnevezése: NS3 19Tn és NS3-19Tc, értelemszerűen), és először a pGEM-T (Promega) klónozó vektorban szubklónoztuk, a pGEMTNS-319bTn és a pGEM-TNS-319Tc vektorok létrehozása céljából. A PCR-rel amplifikált szekvenciákat DNS-szekvencia-analízissel igazoltuk.

A T-sejt-epitóp-szekvenciának az NS3 N-terminális régiójához történő fúziója esetében a PCR-reakciót hosszú, a CTL-epitópot hordozó hosszú, szenz láncindító, és az NS-3-19b stopkodon 3’-szekvenciájával homológ, rövid, antiszenz láncindító alkalmazásával hajtottuk végre. A láncindítókat az alábbiakban tüntettük fel.

9038. láncindító (szenz)

5. azonosító számú szekvencia: 5’-GCCATGGCGACCTGCATCAACGGTGT TTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGG-3’

1901. láncindító (antiszenz)

6. azonosító számú szekvencia: 5’-TTTTATCAGACCGCTTCTGCG-3’

A C-terminálisan fuzionált NS3 esetében a PCRreakciót az NS-3-19b startkodon 5’-szekvenciájával homológ, rövid, szenz láncindító, és a CTL-epitópot, utána in frame (azonos fázisú) stopkodonokat hordozó, hosszú, antiszenz láncindító alkalmazásával hajtottuk végre. A láncindítók szekvenciáját az alábbiakban tüntetjük fel.

1052. láncindító (szenz)

7. azonosító számú szekvencia: 5’-AGCAAACCACCAAGTGGA-3’

9039. láncindító (antiszenz)

8. azonosító számú szekvencia: 5’-CTCTAGACTATTAACCGTGGTAAAC GGTCCAGCAAACACCGTTGATGCAGGTCGCCAGGCTGAAGTCGACTGTCTGG-3’

A pGE/W-T-vektorokba klónozott kódolószekvenciáktól kiinduló NS3-19bT-szekvenciákat az E. coli plGI2 expressziós vektorába illesztettük. Az N-terminálisan fuzionált NS3-19bT esetében az NS3-19bT kódolószekvenciát 379 bp hosszúságú Ncol/SnaBI-fragmens formájában izoláltuk és ligáltuk a plGRI2NS-3vektorból származó SnaBI/AllwNI- és az AiwNI/Ncolfragmensekkel, a plGRI2NS-3Tn-vektor előállítása céljából. A C-terminálisan fuzionált NS3-19bT esetében a NS3-19bT kódolószekvenciát 585 bp hosszúságú SnaBi/Spel-fragmens ként izoláltuk, és az SnaBi/Spel-gye\ felnyitott p/GR/2NS-3-vektorba illesztettük, a plGRI2NS-3Tc-vektor létrehozása céljából.

A plGRI2NS-3Tn-\/eklort és a plGRI2NS-3Tc-\/ektort egymást követően az MC1061 (pAd) E. coli expressziós törzsbe transzformáltuk, és a lambda-P_L-pro16

HU 227 275 Β1 moter hőindukciója után az expressziós szinteket SDSPAGE és Western-blot alkalmazásával analizáltuk, poliklonális, nyúleredetű NS-3-szérum alkalmazásával.

Az NS3-19bTn-fehérje animosavszekvenciája

1. azonosító számú szekvencia: MATCINGVCWTVYHGRAAVCTRGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFS (SEQIDNO1)

Az NS3-19bTc-fehérje animosavszekvenciája

2. azonosító számú szekvencia: MGVAKAVDFVPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKVLVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGVDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGAYDIIICDECHSIDSTSILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSSTGEIPFYGKAIPIEVIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGFGINAVAYYRGLDVSVIPTSGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLATCINGVCWTVYHG (SEQ ID NO 2)

Az NS3-19bTn kódolórégiójának nukleotidszekvenciája

ATGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTCGTGCGGCTGTTTGCACCCGTGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCTAA (SEQ ID NO 3)

Az NS3-19bTc kódolórégiójának nukleotidszekvenciája

ATGGGGGTTGCGAAGGCGGTGGACTTTGTACCCGTAGAGTCTATGGAAACCACCATGCGGTCCCCGGTCTTTACGGATAACTCATCTCCTCCGGCCGTACCGCAGACATTCCAAGTGGCCCATCTACACGCCCCCACTGGTAGTGGCAAGAGCACTAAGGTGCCGGCTGCATATGCAGCCCAAGGGTACAAGGTACTTGTCCTGAACCCATCCGTTGCCGCCACCTTAGGATTCGGGGCGTATATGTCTAAAGCACATGGTGTCGACCCTAACATTAGAACTGGGGTAAGGACCATCACCACGGGCGCCCCCATTACGTACTCCACCTACGGCAAGTTTCTTGCCGACGGTGGTTGCTCTGGGGGCGCTTACGACATCATAATATGTGATGAGTGCCACTCGATTGACTCAACCTCCATCTTGGGCATCGGCACCGTCCTGGATCAGGCGGAGACGGCTGGAGCGCGGCTTGTCGTGCTCGCCACTGCTACACCTCCGGGGTCGGTCACCGTGCCACATCCCAACATCGAGGAGGTGGCTCTGTCCAGCACTGGAGAGATCCCCTTTTATGGCAAAGCCATCCCCATCGAGGTCATCAAAGGGGGGAGGCACCTCATTTTCTGCCATTCCAAGAAGAAATGTGACGAGCTCGCCGCAAAGCTATCGGGCTTCGGAATCAACGCTGTAGCGTATTACCGAGGCCTTGATGTGTCCGTCATACCGACTAGCGGAGACGTCGTTGTTGTGGCAACAGACGCTCTAATGACGGGCTTTACCGGCGACTTTGACTCAGTGATCGACTGTAACACATGCGTCACCCAGACAGTCGACTTCAGCCTGGCGACCTGCATCAACGGTGTTTGCTGGACCGTTTACCACGGTTAA (SEQ ID NO 4)

7b. példa

Az NS3-19bTn és az NS3-19bTc fehérjék tisztítása

Az Er/enmeyer-tenyészetekből származó E. colisejtmasszát sejtzúzó (CSI, B-modell) alkalmazásával, 1,4 kBar nyomással, 50 mM Trisz-ben (pH=8) feltártuk. A lizátumot centrifugáltuk (15 000 g, 30 perc, 4 °C). A felülúszót kiöntöttük, mivel az N-terminális és a C-terminális konstrukció is az üledékben volt. Ez az üledék az N-terminális konstrukció számára nagymértékben stabilnak bizonyult, lehetővé téve alapos mosást (az első mosást 2% szarkozillal, 0,5 M guanidin-hidrokloriddal és 10 mM DTT-vel, a második és harmadik mosást 0% Triton-X-100-za\, 0,5 M guanidin-hidrokloriddal és 10 mM EDTA-val hajtottuk végre) az oldás (szolubilizálás) előtt. A C-terminális konstrukció esetében nem ezt tapasztaltuk. A tisztítást az N-terminális konstrukcióval folytattuk. A mosott csapadékot végül 6 M guanidin-hidrokloridot tartalmazó 50 mM Na₂HPO₄-ban (pH=7,2) feloldottuk, és a Maertens és munkatársai által leírt módon (a PCT/EP 99/02547 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben) szulfonáltuk. A szulfonált üledéken először Sephadex G25-ös oszlopon puffercserét hajtottunk végre (6 M karbamid, 50 mM trietanol-amin, pH=7,5), és végül két, egymást követő anioncserélő kromatográfiás lépésben, ugyanolyan összetételű pufferben. Az első anioncserélő kromatográfiát Hyper-DQ (50 pm) oszlopon (BioSpra Inc., Marlborough, MA, USA) hajtottuk végre, és az NS3-at 0.11-0.19 NaCI-tar17

HU 227 275 Β1 tományban kaptuk. Hígítás után ezeket a frakciókat egy másik Hyper-DQ (20 pm) oszlopra vittük (BioSpra Inc., Marlborough, MA, USA), és az NS3-at 0,125 M NaCI-ot tartalmazó frakciókban kaptuk. Ezeket a frakciókat 6 M karbamidot tartalmazó PBS-be (pH=7,5) vittük át. A végső tisztaságbecslés szerint >90%, az ezüsttel festett SDS-PAGE-gélkép alapján. Az EDMAN-degradációval történő N-terminális szekvenálás azt mutatta, hogy az NS3 N-terminális része ép, ahol jelen van a kívánt epitóp, a megfelelő szekvenciával. Megerősítettük azt is, hogy a transzláció kezdete céljából alkalmazott metionin lehasadt, az előrejelzés szerint.

8. példa

Az I. régiójában hiányos E2-fehé/je megalkotása

Immundomináns, homológ válaszreakciót figyeltek meg az E2 HVR-l-régiójával szemben. Ennek a válaszreakciónak kevés haszna van vakcinában történő alkalmazás esetén, mivel a vakcinát általában heterológ összeállításban alkalmazzák (a vakcinatörzs rendszerint különbözik a mezei törzsektől). Ezért szükséges e régió deléciója az olyan E2-fehérjék előállításához, amelyek az E2 konzerváltabb, azonban kevésbé immunogén régiói elleni antitesteket indukálnak. Az E2 /eader-szekvenciáját és az E2 hipervariábilis régiójának alapos vizsgálatával a HVR-l-régiójában hiányos E2-fehérje expressziója célját szolgáló, legideálisabb konstrukciót terveztük meg. Ez a konstrukció lehetővé teszi, hogy az E2-peptid expressziója a 409. pozícióban kezdődjön a 384. pozíció helyett, Leaeter-szekvenciaként az E1 C-terminális 20 aminosavát alkalmaztuk. Mivel a HVR ezen leírása (ábrázolás) nem teljesen egyértelmű, egy másik változatot is elkészítettünk (a 412. aminosavval kezdődőt), amely szintén nagy valószínűséggel a megfelelő pozícióban hasad.

A pvHCV-99-es közbenső konstrukció (lásd még a 15. és a 16. ábrát)

A expressziós kazettában az E2-715 kódolószekvenciáját meg kell előznie az El Met364-nél kezdődő /eader-szignálszekvenciának. Ezért az 1b-típusú, az E1 -szignálpeptid (Met347-tel kezdődő) hosszú változatával rendelkező HCV E2-715 kódolószekvenciáját tartalmazó pvHCV-92 plazmidon (15. ábra) deléciót hajtottunk végre EcoR/-gyel és Wco/-gyel történő kettős emésztéssel, majd az 5’-túlnyúló vég 74-D/VS-polimerázzal történő feltöltési reakcióval. A kapott tompa végek ligálása (a 6621 bp méretű fragmens recirkularizálásával) eredményezte a pvHCV-99 plazmidot, amely ugyanazt a fehérjét (E2-715) kódolja, rövidebb E1 leader-szignálszekvenciával (a Met364-gyel kezdődően). A pvHCV-99-et letétbe helyeztük ICCG 3635 néven. Nyilvánvaló, hogy különböző hosszúságú HCVvagy heterológ szignálszekvenciák alkalmazhatóak.

A pvHCV-100 és a pvHCV-101 plazmidok szükségképpen tartalmaznak deléciót az E2-szekvenciában, azaz deléciót az I. hipervariábilis régióban (HVR-I). A pvHCV-100 plazmidban a 384(His)-408(Ala) aminosavakat, míg a pvHCV-101 plazmidban a 384(His)-41 l(lle) aminosavakat deletáltuk.

A pvHCV-100 megalkotása

A pvHCV-100 megalkotása céljából két oligonukleotidot terveztünk:

HCV-pr 409 [8749]

9. azonosító számú szekvencia:

5’-CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GAA AAT CCA GCT CGT AA-3’

HCV-pr 408 [8750]

10. azonosító számú szekvencia:

5’-TTA CGA GCT GGA TTT TCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG-3’

A pi/HCV-öö-templát Gpt-pr [3757] és HCV-pr 408 [8750] alkalmazásával történő PCR-amplifikációja (denaturáció: 5 perc, 95 °C-on 1 percig, 30 ciklus amplifikáció, amely áll: hibridizálásból 55 °C-on, polimerizációból 72 °C-on, és denaturációból 95 °C-on 1 percig, elongációból 10 percig 72 °C-on) 221 bp méretű fragmenst eredményezett, míg a HCV-pr 409 [8749] és a TKr-pr [3756] alkalmazásával történő amplifikáció 1006 bp méretű fragmenst eredményezett. A két PCRfragmens átfedi egymást egy 19 nukleotid hosszúságú szakaszon. Ezt a két fragmenst összekapcsoltuk, és amplifikáltuk PCR alkalmazásával a Gpt-pr [3757] és a TKr-pr [3756] láncindítók alkalmazásával. Az eredményül kapott 1200 bp hosszúságú fragmenst EcoRIgyel és HinDIII-ma\ emésztettük, és az EcoRI/HinDIIImal emésztett pgsATA18 [ICCG 1998] vektorba (5558 bp) ligáltuk. Ezt a konstrukciót, a pvHCV-100-at restrikciós analízissel és szekvenciaanalízissel analizáltuk, és a törzslistán az ICCG 3636 néven letétbe helyeztük.

A pvHCV-101 megalkotása

A pvHCV-101 megalkotása céljából két oligonukleotidot terveztünk:

HCV-pr 411 [8747]

11. azonosító számú szekvencia:

5’-CTT TGC CGG CGT CGA CGG GCA GCT CGT AAA CAC CAA CG-3’

HCV-pr 410 [8748]

12. azonosító számú szekvencia:

5’-CGT TGG TGT TTA CGA GCT GCC CGT CGA CGC CGG CAA AG-3’

A pvHC\/-99-templát Gpt-pr [3757] és HCV-pr 410 [8748] alkalmazásával történő PCR-amplifikálása 221 bp méretű fragmenst, míg a HCV-pr 411 [8747] és a TKr-pr [3756] alkalmazásával történő amplifikálás 997 bp méretű fragmenst eredményezett. A két PCRfragmens átfedi egymást egy másik 19 nukleotidon át. Ezt a két fragmenst összekapcsoltuk, és amplifikáltuk PCR alkalmazásával a Gpt-pr [3757] és a TKr-pr [3756] láncindítók alkalmazásával. Az eredményül kapott 1200 bp hosszúságú fragmenst EcoRI-gye\ és HinDlll-ma\ emésztettük, és az EcoRI/HinDIII-ma\ emésztett pgsATA18[ICCG 7998]vektorba (5558 bp) ligáltuk. Ezt a konstrukciót, a pvHCV-101-et restrikciós analí18

HU 227 275 Β1 zissel és szekvenciaanalízissel analizáltuk, és a törzslistán az ICCG 3637 néven letétbe helyeztük.

Minden plazmidot szekvenciaanalízissel ellenőriztünk, és letétbe helyeztünk az Innogenetics törzslistán. Minden plazmid esetében két DNS-minipreparátumot (PLASmix) készítettünk steril körülmények között, és raktároztuk. Meghatároztuk a DNS-koncentrációt, és QA-t hajtottunk végre restrikciós analízissel. Tisztított DNS-t alkalmaztunk rekombináns vakcinavírus előállítására, a Maertens és munkatársai [Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése] által leírtak szerint. A vvHCV-100 és vvHCV-101 rekombináns vírusokat azonban a WHO által hitelesített Vero-sejtekben állítottuk elő. Két plakktisztítási lépés után az expressziós terméket Western-blot-analízissel vizsgáltuk, a Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) által leírtak szerint. A fehérjéket specifikus E2 elleni monoklonális antitest (IGH-212, amely kérésre rendelkezésre bocsátunk az Innogenetics N. V.-nél, Zwijnaarde, Belgium) alkalmazásával tettük láthatóvá, a wHCV-100 esetében 69 és 37 kDa, és a vvHCV-101 esetében a 68 és 35 kDa becsült molekulatömegeknél. A molekulatömeg ilyen értékei glikozilált és nem glikoziált E2-fehérjék közül mindkettő jelenlétét jelzik, amely tényt azzal bizonyítottunk, hogy a mintákat a Western-blot-analízis végrehajtása előtt PNG-áz-F-fel kezeltük. Ez a kezelés azt eredményezte, hogy a wHCV-100 esetében egy 37 kDa, és a vvHCV-101 esetében egy 35 kDa molekulatömegű fehérjét detektáltunk.

A pvHCV-100-óó/ származó érett

E2 aminosavszekvenciája

13. azonosító számú szekvencia: QKIQLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRFGVPTYNWGANDSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRFEAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAVVSLVIK (SEQ ID NO 13)

A pvHCV-101-óó7 származó érett

E2 aminosavszekvenciája

14. azonosító számú szekvencia: QLVNTNGSWHINRTALNCNDSLQTGFFAALFYKHKFNSSGCPERLASCRSIDKFAQGWGPLTYTEPNSSDQRPYCWHYAPRPCGIVPASQVCGPVYCFTPSPVVVGTTDRFGVPTYNWGANDSDVLILNNTRPPRGNWFGCTWMNGTGFTKTCGGPPCNIGGAGNNTLTCPTDCFRKHPEATYARCGSGPWLTPRCMVHYPYRLWHYPCTVNFTIFKVRMYVGGVEHRFEAACNWTRGERCDLEDRDRSELSPLLLSTTEWQILPCSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQYLYGVGSAVVSLVK_(SEQ ID NO 14)

9. példa

Továbbjavított immunogenitással rendelkező

E1-részecske

Az 1. példa szerinti elrendezésben az E1s-fehérjét megtisztítottuk a Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) által leírt előirat szerint. Ez az előirat magában foglalja a ciszteinek (a szabad ciszteinek és az intermolekuláris hidakban részt vevő ciszteinek, az utóbbiak a ciszteinhidak DTT-vel történő redukciója után) maleimidszármazékok (N-etil-maleimid és biotin-maleimid, mindkettő a Sigmátó\) alkalmazásával történő kovalens módosítását. A maleimidblokkolás alternatív módszereként aktív halogéneket is alkalmaztunk. Ezek a vegyületek (az aktív halogének) alkilálással blokkolják a szabad ciszteineket. Példaként egy aktív halogént (jód-acetamid, Merck) értékeltünk is. Az E1 tisztításakor a Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) által leírt előiratot alkalmaztuk, azonban maleimidvegyületek helyett jódacetamidot alkalmaztunk. Az eljárással nyert E1s-fehérje a teljes tisztítási eljárás során a maleimiddel blokkolt fehérjékhez hasonló viselkedést mutatott. A detergens koncentrációjának végső, 0,05% CHAPS-ra vagy 0,5%-os betainra való váltásakor, az 1. példánál leírtak szerint, DLS-sel meghatározva hasonló részecskéket kaptunk. Meglepő hatást akkor észleltünk, amikor az acetamiddal módosított E1s-sel egereket immunizáltunk.

Összesen három sorozatban 6 egeret immunizáltunk E1s-sel háromhetes szünettel; minden injekció 5 pg E1s-t 100 pg/ml koncentrációban, PBS-ben, és azonos térfogatú R/6/-adjuvánssal (R-700) keverve. Az első sorozat (egérnek) 0,05% CHAPS-ban formulázott E1-maleimidet, a második sorozatnak 0,05% CHAPS-ban formulázott E1-acetamidot, míg a harmadik sorozatnak 0,12% betainban formulázott E1-acetamidot adtunk be. Végül minden egeret 10 nappal az immunizálás után elvéreztettünk. Végponttitereket (definíció szerint olyan szérumhígítás, amely a háttérértéknél még kétszer magasabb OD-értéket eredményez) határoztunk meg minden állatnál egyedileg az E1-maleimid és az E1-acetamid elleni antitestek esetében. A 17. ábrán bemutatjuk ezeket a végponttitereket, átlagértékben és standard deviációban bemutatva. Az E1-maleimiddel kezelt állatok olyan antitestválaszt produkáltak, amely antitestek csak a maleimidet tartalmazó epitópokat képesek felismerni (egyáltalán nem mutat reaktivitást az E1-acetamiddal szemben), az E1-acetamiddal kezelt egerek egyértelműen olyan antitestválaszt produkáltak, amely antitestek a valódi E1-epitópokat ismerik fel, mivel az antitestek reaktivitást mutatnak az E1-acetamiddal és az E1-maleimiddel szemben is. Ezt nyilvánvalóan bizonyítottuk egy további kísérletben, amelyben az E1 specifikus régiói elleni antitesteket meghatároztuk olyan peptidek alkalmazásával, amelyeket acetamiddal és maleimiddel sem módosítottunk. Az eredmények, amelyeket a 18. ábrán mutatunk be, azt bizonyítják, hogy az

HU 227 275 Β1

E1-acetamiddal immunizált egerek (CHAPS-ban és betainban formulázva) olyan antitestválaszt produkálnak, ahol az antitestek felismerik a V1V2, a V2V3, a V3V4, és a C4V6 peptidet. Mivel a v6 nem része az E1s-nek, azt a következtetést vonhatjuk le, hogy antitestek termelődtek a C4, V3 ellen (a V3V4 pozitív, míg a V4V5 nem), és a V1V2 ellen. Az E1s-maleimiddel immunizált egerek csak nagyon alacsony szintű válaszreakciót adtak a V1V2 és a V2V3 peptidek ellen. Ez arra a tényre világít rá, hogy ezeknél az egereknél meghatározott, mérsékelten magas titerű, maleimidE1s elleni antitestek főleg a maleimidfüggő epitópok ellen irányulnak. Ráadásul bizonyítani tudtuk azt, hogy az E1s-acetamid által indukált válaszreakció részben Th1-típusú, mivel az indukált antitestek tekintélyes mennyisége lgG2(a+b) altípusú. Az lgG2 mennyisége a betainformulázott fehérje esetében még magasabb, a CHAPS-ban formulázott fehérjéhez viszonyítva (19. ábra). Ezekből az eredményekből azt a következtetést vontuk le, hogy a HCV-burokfehérjék, amelyekben legalább egy cisztein (de lehetőség szerint több, mint egy cisztein) alkilálva van, extrém módon immunogén fehérjék.

Következésképp, az acetamiddal módosított, betainban formulázott E1 szintén alkalmaztuk a Phil és a Tori nevű csimpánz emlékeztető kezelésében. Mindkét állatot újra immunizáltuk két, egymást követő intramuszkuláris immunizálással, háromhetes időközönként (50 pg E1 R/6/-adjuvánssal keverve, a 4. és az 5. példánál leírtak szerint). A 20. és a 21. ábra alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy az E elleni antitestválasz valóban újra fellendíthető, és ez magasabb szintet ér el, mint az előző immunizálás két injekcióját követően elért szintek. Újra végrehajtottuk a titrálást standarddal szemben, amely három, magas E1 elleni antitesttitert mutató (krónikus HCV-hordozó) humán eredetű szérum keveréke. A szérumok E1 elleni antitesttiterét egység/ml egységben definiáljuk. A Phil nevű csimpánz esetében (20. ábra) a humán eredetű szérum szintjének kétszerese indukálódott, csupán két immunizálás után. A Tori nevű csimpánz esetében (21. ábra) 140-szer magasabb titer indukálódott. Ez újra kiemeli az E1-részecskék magas immunogenitását.

10. példa

Az alkilált E1 diagnosztikai alkalmazásra kiváló tulajdonságokkal rendelkezik A 9. példánál leírt E1 s-acetamidot, mint antigént további értékelésnek vetettük alá a krónikus HCV-hordozókból származó, humán eredetű szérumminták esetében az E1 elleni antitestek detektálása szempontjából. Példaként ezeket az antitesteket LIA-membránokra kötöttük, és a sávokat alapvetően a Zrein és munkatársai (1998) által leírt módon dolgoztuk fel. Először 72 véradótól származó szérummintát értékeltünk abból a célból, hogy megállapítsuk az E1 -antigén mérési eljárásban alkalmazható optimális koncentrációját, a „fals pozitív eredmények kizárására. Az E1s-maleimid és az E1s-acetamid esetében ez a koncentráció 8 pg/ml volt, míg az E1s-acetamid esetében 50 pg/ml koncentrációig nem kaptunk „fals” pozitív eredményt (nem volt minta, amely 0,5 feletti relatív festődést mutatott volna). Az E1s-maleimid és az E1s-acetamid esetében 8 és 50 pg/ml koncentrációt alkalmazva 24 krónikus HCVhordozó szérumát szűrtük az E1s elleni antitestre. A 6. táblázatban bemutatottak szerint az E1 s-acetamidot alkalmazva egyértelműen több mintát találtunk pozitívnak (67%, az E1s-maleimidet alkalmazva 38%). Nem találtunk olyan mintát, amelyet csak az E1s-maleimid mutatott pozitívnak. Azoknál a mintáknál, amelyet az E1s-maleimid és az E1s-acetamid is pozitívnak mutatott, az utóbbinál a reaktivitás magasabb volt. E példa arra enged következtetni, hogy a HCV alkilált burokfehérjéi a humán eredetű antitestek kimutatásában jobb antigének, mint a maleimiddel módosított burokfehérjék.

11. példa

E1-et és E2-t tartalmazó kevert részecskék előállítása

E1 s-t és E2s-t (vvHCV-44) állítottunk elő Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) által leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a maleimidmódosítás helyett jód-acetamiddal történő alkilálást alkalmaztunk. Az E1s-t és az E2s-t 3%-os empigenben önmagában vagy ekvimoláris keverék formájában Superdex-200 PC 3.2/30 oszlopra injektáltunk, amelyet előzőleg PBS/0,2% CHAPS-szal ekvilibráltunk. Ezt az oszlopot a SMART™ HPLC-készülékkel (Pharmacia LKB, Svédország) történő alkalmazásra tervezték. A frakciókat három, különböző „szendvics” ELISA-va\ szűrtük. Az ELISA mérésekben E1-(IGH 207) és E2-(IGH 223) specifikus monoklonális antitestekkel burkoltunk 2 pg/ml koncentrációban. A gélszűrésből származó frakciókat 1/2500 hígításban inkubáltuk. Két másik, biotinnel konjugált monoklonális antitestet, az E1-(IGH 200) és E2-(IGH 212) alkalmaztuk a kötött antigén detektálására. A sztreptavidin-HRP/TMB-rendszert alkalmaztuk a kötött biotin sárga színének előhívására, amelyet 540 nm-en mértünk.

Ezt az EL/SA-rendszert alkalmaztuk homológ (E1 elleni burkolás és E1 elleni detektálás, vagy E2 elleni burkolás és E2 elleni detektálás) és heterológ (E1 elleni burkolás és E2 elleni detektálás) összeállítású rendszerben. Az utóbbi elméletileg csak azokat a részecskéket detektálja, amelyekben az E1 és az E2 is jelen van. A reaktív frakciókat összegyűjtöttük, 10 kDa (átcsapási tartományú) szűrőn töményítettük, és újra kromatografáltuk Superdex-200-osz\opor\ PBS/0,05% CHAPS-ban. Mindegyik frakciót reaktivitásra teszteltünk különböző összeállítású EL/SA-rendszerekkel. Amint az a 22. ábra alapján megállapítható, az E2 hozzáadása az E1-hez nem eredményezi a retenciós idő eltolódását az E1-hez viszonyítva, azt jelezve, hogy a részecskék valóban jelen vannak. Ezek a részecskék tartalmaznak E1-et és E2-t is, mivel csak ebben az esetben ad pozitív eredményt a heterológ ELISA.

HU 227 275 Β1

12. példa

Két különböző genotípusból származó E1-et tartalmazó kevert részecskék előállítása Az 1b-genotípusból és 4. genotípusból származó

E1s-t (wHCV-72) állítottunk elő és tisztítottunk Maertens és munkatársai (Maertens és munkatársai PCT/EP 95/03031 számú nemzetközi szabadalmi bejelentése) által leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy a maleimiddel történő módosítást az 1b-genotípus esetében jód-acetamiddal történő alkilálással helyettesítettük. Az E1 s-1 b-t és E1s-4-et 3% empigenben önmagában vagy ekvimoláris keverék formájában Superdex-200 PC 3.2/30 oszlopra injektáltunk, amelyet PBS/0,2% CHAPS-szal ekvilibráltunk. Ezt az oszlopot a SMART™ HPLC-készülékkel (Pharmacia LKB, Svédország) történő alkalmazásra tervezték. A fő, fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, 10 kDa (átcsapási tartományú) szűrőn töményítettük, és újra kromatografáltuk Superdex-200-osz\opor\ PBS/0,05% CHAPS-ban. Mindegyik frakciót reaktivitásra teszteltünk olyan összeállítású EL/SA-rendszer alkalmazásával, amely csak a mindkét genotípusú E1-et tartalmazó részecskéket detektálja. Ehhez az ELISA-hoz sztreptavidinnel burkoltunk 2 pg/ml koncentrációban. A gélszűrés frakcióit 1/2500 hígításban inkubáltuk. Olyan E1 elleni monoklonális antitestet (IGH 200) alkalmaztunk a kötött antigén detektálására, amely csak az 1. és a 10. genotípusú E1-et ismeri fel. A kecskeeredetű, egér elleni HRP/TMB-rendszert. alkalmaztuk a mérési eljárásban a sárga szín előhívására, amelyet 450 nm-en mértünk. Amint az a 23. ábra alapján megállapítható, E1—4 hozzáadása az E1-1b-hez nem eredményezte a fehérjék retenciós idejének lényeges eltolódását, ami azt jelzi, hogy a részecskék még mindig jelen vannak. Ezek a részecskék mindkét E1-fehérjét, azaz az 1b és 4 genotípusú E1-et tartalmazzák, mivel csak ebben az esetben ad pozitív eredményt a heterológ ELISA.

Referencialista

Deleersnyder V., Pillez A., Wychowski C., Blight K., Xu J., Hahn Y. S., Rice C. M., Dubuisson J. Formation of native hepatitis C vírus glycoprotein complexes. J. Virol. 1997:71:697-704.

Diepolder Η. M., Zachoval R., Hoffmann R. M., Wierenga E. A., Santantonio T., Jung M. C., Eichenlaub D., Papé G. R. Possible mechanism involving T-lymphocyte response to non-structural protein 3 in viral clearance in acute hepatitis C vírus infection. Láncét 1995: 346: 1006-1007.

Diepolder Η. M., Gerlach J. T., Zachoval R., Hoffmann R. M., Jung M. C., Wierenga E. A., Scholz S., Santantonio T., Houghton M., Southwood S., Sette A., Papé G. R. Immunodominant CD4+ T-cell epitope within nonstructural protein 3 in acute hepatitis C vírus infection. J. Virol., 1997: 71: 6011-6019.

Fancy, D. A., Melcher, K., Johnston, S. T. and Kodadek, T. New chemistry fór the study of multiprotein complexes: the six-histidine tag as a receptor fór a protein crosslinking reagent. Chem. Bioi. (1996) 3: 551-559.

G. T. Hermanson in Bioconjugate Techniques (1996) Part I section 1.43 and section 2.2.1, Academic Press San Diego CA, USA.

Houghton M. Immunity to HCV: The case fór vaccine development. 4^th International meeting on hepatitis C Vírus and related viruses. Sattelite Symposium: New appraoch to prevention and therapy of HCV infection. March 7 1997, Kyoto, Japan.

Leroux-Roels G., Esquivel C. A., DeLeys R., Stuyver L., Elewaut A., Philippe J., Desombere I., Paradijs

J. , Maertens G Lymphoproliferative responses to hepatitis C vírus core, Ε1, E2, and NS3 in patients with chronic hepatitis C infection treated with interferon alfa. Hepatology 1996: 23: 8-16.

Maertens G. and Stuyver L. Genotypes and genetic variation of hepatitis C vírus. In: The molecular medicine of viral hepatitis. Ed: Hamson T. J. and Zuckerman A. J. 1997.

Major Μ. E. and Feinstone S. M. The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 1997: 25: 1527-1538.

Maertens G., Depla E., Ducatteeuw A., Vandeponseele P., Bosman F., Venneman A., de Martynoff G., Stuyver L., Dekeyser F., Vandeperre B., Zrein M. And Buyse M.-A. Hepatology 1997: 26: 186A.

Rehermann B., Chang K. M., McHutchinson J., Kokká R., Houghton M., Rice C. M., Chisari F. V. Differential cytotoxic T-lymphocyte responsiveness to the hepatitis B and C viruses in chronically infected patients. J. Virol. 1996 70:7092-7102.

Rehermann B., Takaki A., Liebetrau A., Luda S., Seifert U., Salha K., Manns M., Wiese M. Characterization of the cytotoxic and helper T cell response in patients 18 years after a single source outbreak of HCV infection. Hepatology, 1997: 26: 406A.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, second edition. Cold Spring Harbor University Press, Cold Spring Harbor, NY USA.

van Doorn L. J., Kleter B., Pike I., Quint W. Analysis of hepatitis C vírus isolates by serotyping and genotyping. J. Clin. Microbiol. 1996; 34:1784-1787.

Villa E., Buttafoco P., Grottola A., Scarcelli A., Giannini F., Manerti F. Neutrtalizing antibodies against HCV: liver transplant as an experimental model. J. Hepatol. 1998: 28.

Weiner A. J., Erickson A. L., Kansopon J., Crawford

K. , Muchmore E., Houghton M., Walker C. M. Association of cytotoxic T lymphocyte (CTL) escape mutations with persistent hepatitis C vírus (HCV) infection. Princess Takamatsu Symp, 1995: 25: 227-235.

Yi M., Nakamoto Y., Kaneko S., Yamashita T., Murakami S. Delineation of regions important fór heteromeric association of Hepatitis C vírus E1 and E2. Virol. 1997a: 231:119-129.

Zauberman, A., Nussbaum, O., lián, E., Erén, R.,

Ben-Moshe, O., Arazi, Y., Bérré, S., Lubin, L, Shouval,

D., Galun, E., Reisner, Y. and Dagan, S. The trimera mouse system: a mouse model fór hepatitis C infection and evaluation of therapeutic agents. June 6-9, 1999;

HU 227 275 Β1

Órai 4.3. In: 6th International Symposium on Hepatitis C & Related Viruses. Bethesda USA.

Zrein, M., Louwagie, J., Boeykens, H., Govers, L., Hendrickx, G., Bosman, F., Sablon, E., Demarquilly,

C., Boniface, M. and Sámán, E. (1998) Assessment of a new immunoassay fór serological confirmation and discrimination of humán T-cell lymphotropic vírus infections. Clin.

1. táblázat

A HCV-B E1s-konszenzusszekvenciája

A-pozíció*	200	233	235	251	253	271	293	298	304	313	314	322
Régió	V1	V3	V3	V4	V4	HR	HR	V5	C4	C4	C4	C4
HCV-J	I	S	F	S	I	L	F	Y	-	V	S	-
HCV-B-kon.	M	N	S	A	V	F	I	H	C	I	T	M
HCCI9A	-	-	-	-	-	L	-	-	-	-	-	-
HCCI9B	-	D	-	-	-	-	-	-	Y	-	-	-
HCCI9C	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	T
HCCI10A	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HCCI10B	-	D	-	-	I	-	-	-	-	-	-	-
HCCI11A	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HCCI11B	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HCCI14	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
HCCI17	-	-	-	-	I	-	-	-	-	-	-	-

* a 192. és a 326. közötti pozíciókat, amelyek teljesen konzerváltak, nem jeleztük.

2. táblázat

A krónikus hordozókban jelen lévő vírus HCV-szekvenciája és az E1s-vakcina szekvenciájának egymáshoz illesztése

192 259

Tón (la) YQVRNSTGLYHVTNDCPNSSIVYEAADAILHTPGCVPCVREGNASRCWVAMTPTVATRDGKLPTTQLR * * * * * * * * * *********

El vaccin

YEVRNVSGMYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCVPCVRENNSSRCWVALTPTLAARNASVPTTTIR

Phil (lb)

YEVRNVSGVYHVTNDCSNASIVYEAADMIMHTPGCVPCVREGNSSRCWVALTPTLAARNVSVPTTTIR

Tón (la)

260 326

RHIDLLVGSATLCSALYVGDLCGSVFLVGQLFTFSPRRHWTTQECNCSMYPGHITGHRMAWDMMMNW * **** * ****

El vaccin

RHVDLLVGAAAFCSAMYVGDLCGSVFLVSQLFTISPRRHETVQDCNCSIYPGHITGHRMAWDMMMNW * * * *

Phil (lb)

RHVDLIVGAAAFCSAMYVGDLCGSVFLVSQLFTFSPRRHETVQDCNCSIYPGHVSGHRMAWDMMMNW

3. táblázat

A terápiás vakcinázás által indukált változások (6x50 pg E1s)

	Tón (1a-altípus)	Phil (1 b-altípus)
előtte	utána	előtte	utána
Szérum
E1 Ab-titer	0	30 000	0	14 500
HCV-RNS-titer (105)	2-3	nincs változás	2-4	nincs változás
ALT(IU)	85±11	62±6	44±4	37±6
Máj
Antigénfestődés	erősen pozitív	negatív	erősen pozitív	negatív

HU 227 275 Β1

3. táblázat (folytatás)

	Tón (1 a-altípus)	P/7//(1 b-altípus)
előtte	utána	előtte	utána
Hisztológia	CAH	CPH	CAH	CPH
Portalis gyulladás	enyhe	nincs	súlyos	mérsékelt
Lobularis hepatitis	mérsékelt	minimális	súlyos	mérsékelt
Interface hepatitis	+	-	+	-
Hisztológiai aktivitás	4	1-2	6-8	2-3

4. táblázat

E1-peptidek	Genotípus	Név	#	a.
YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSI- VYEAADMIMHTPGC	1b	V1V2	888	192-226
IVYEAADMIMHTPGCVPCV- RENNSSRCWV	1b	V2V3	1036	212-244
VRENNSSRCWVALTPTLAAR- NASVPTTTIRRHVD	1b	V3V4	1022	230-263
HVDLLVGAAAFCSA- MYVGDLCGSVFLVSQL	1b	HR	1150	261-290
SQLFTISPRRHETVQDCNCSIYPG- HITGHRMAWDMMMNWS	1b	V5V4	1176	288-327
SIYPGHITGHRMAWDMMMNWSPT- TALWSQLLRI	1b	C4C6	1039	307-340

5. táblázat

MATC/A/GV'CÍVTVYHGRAAVCTRGVAK javasolt szekvencia

GGPLLCPAGHAVGIFRAAVCTRGVAK természetes szekvencia dőlt betűvel jelölve: minimális CTL-epitóp, aláhúzással jelölve: további, környező természetes aminosavak, félkövér betűvel jelölve: 1188. aminosav.

A c-terminálisnál az epitópot és környezetét közvetlenül kapcsolhatjuk. VDFSLATC/A/GVCW7VYHG javasolt szekvencia

VDFSLDPTFTIETITLPQD természetes szekvencia félkövér betűvel jelölve: 1468. aminosav.

6. táblázat

Antigén	E1s-maleimid	E1s-acetamid
pg/ml	8	50
17 758	2	4
17 761	0	0,5
17 763	0	0,5
17 766	0	1
17 767	0	1
17 771	0,5	2
17 773	0	0
17 775	0	0,5
17 776	0	0,5

HU 227 275 Β1

6. táblázat (folytatás)

Antigén	E1s-maleimid	E1s-acetamid
μ9/ΠΐΙ	8	50
17 777	0,5	2
17 779	0	0
17 784	3	4
17 785	0,5	2
17 786	0	2
17 789	2	4
17 790	2	4
17 794	2	4
17 795	0	1
17 796	0	0
17 798	0	0,5
17 820	2	4
17 825	2	3
17 827	2	4
17 842	1	2
#	9	16
% ροζ.	38	67

Claims (56)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Oligomer részecske, amely HCV-burokfehérjékböl áll, és átmérője 5-100 nanométer, ahol a burokfehérje legalább egy ciszteinoldallánca alkilált. 35
2. 2. Tisztított HCV-burokfehérje héjból álló oligomer részecske, ahol a burokfehérje legalább egy cisztein aminosava alkilált vagy oligomer részecske, amelyben a teljes gömb tisztított HCV-burokfehérjékből áll, és ahol a burokfehérje legalább egy ciszteinoldallánca al- 40 kilált, amely részecske átmérője 5-100 nanométer.
3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti oligomer részecske, amely átmérője 5-40 nanométer.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti oligomer 45 részecske, amelyben a HCV-burokfehérje aminosavszekvenciája HCV-izolátum-, HCV-altípus-, HCV-törzsvagy HCV-genus-konszenzusszekvenciákból származó konszenzusszekvencia.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti oligomer 50 részecske, amelyben a burokfehérje legalább egy ciszteincsoportja alkilezőszerrel alkilált.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti oligomer részecske, amelyben a ciszteincsoport alkilezőszerként etiléniminnel, N-(jód-etil)-trifluor-acetamiddal vagy alábbi (I) álta- 55 lános képletű aktív halogénnel alkilált:

   X(CH₂)_nR, (I) ahol a képletben X jelentése halogén, R jelentése H, COOH, NH₂, CONH₂, fenil vagy ezek bármely származéka, n értéke 0,1,2,3 vagy 4. 60
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjék HCV-E1-fehérjék vagy annak részei.
8. 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjék HCV-E1s-fehérjék vagy annak részei.
9. 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjék HCV-E2-fehérjék vagy annak részei.
10. 10. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjék szekvenciája a 13. azonosító számú szekvenciával és/vagy a 14. azonosító számú szekvenciával, vagy ezek részeivel azonos.
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjéket HCV-izolátum-, HCV-altípus-, HCV-faj-, vagy HCV-genus-nukleotid-konszenzusszekvencia, vagy ezek bármely része kódolja.
12. 12. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjéket HCV-E1fehérje és/vagy annak része, HCV-E1s-fehérje és/vagy annak része, HCV-E2-fehérje és/vagy annak része által alkotott keverék képezi.
13. 13. A 12. igénypont szerinti oligomer részecske, amelyben a NCV-E2 fehérjék vagy részei és/vagy a 13. azonosító számú szekvenciával és/vagy ennek részeivel vagy a 14. azonosító számú szekvenciával és/vagy ennek részei által meghatározottak.

    HU 227 275 Β1
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjék, vagy azok részei különböző HCV-törzsekből, HCV-altípusokból vagy HCV-genotípusokból származnak.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amelyben a burokfehérjéket, vagy azok részeit egy adott HCV-törzsből vagy HCV-genotípusból származó HCV-burokfehérjék és legalább egy másik HCV-törzsből vagy HCV-genotípusból származó HCVburokfehérjék keveréke képezi.
16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti, az alábbi lépésekkel jellemzett eljárással előállítható oligomer részecske:

    i) - HCV-burokfehérjék tisztítása oldatban, alkilálószer alkalmazásával, ii) - a tisztított HCV-burokfehérjék oldatában detergenssel vagy sóval való helyettesítés, ezáltal oligomer részecskék előállítása, és iii) - a ii) lépésben előállított oligomer részecskék tisztítása.
17. 17. A 16. igénypont szerinti oligomer részecske, ahol az eljárás i) lépése egy első detergens alkalmazását foglalja magában.
18. 18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti oligomer részecske, ahol az eljárás i) lépése diszulfidhíd-hasító anyag alkalmazását foglalja magában.
19. 19. A 16-18. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, ahol az eljárás iii) lépése a ii) lépésben a detergens vagy só koncentrációjának további csökkentését foglalja magában.
20. 20. A 17-19. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske, amely olyan eljárással állítható elő, amelyben az i) lépésben az első detergens az Empigen-BB, és a ii) vagy iii) lépésben alkalmazott detergens CHAPS, oktil-glükozid, Tween, vagy bármely más detergens, és az alkalmazott só a bétáin.
21. 21. A 20. igénypont szerinti oligomer részecske, amely olyan eljárással állítható elő, amelyben az Empigen-BB-t 1-10%-os koncentrációban alkalmazzák, és a CHAPS-t vagy a Tweent 0,01-10%-os, a betaint 0,01-10%-os koncentrációban alkalmazzák.
22. 22. Eljárás az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecskék előállítására, azzal jellemezve, hogy

    i) - HCV-burokfehérjéket tisztítunk oldatban, alkilálószer alkalmazásával, ii) - a tisztított HCV-burokfehérjék oldatában detergenssel vagy sóval helyettesítést végzünk, ezáltal oligomer részecskéket állítunk elő, iii) - a ii) lépésben előállított oligomer részecskéket megtisztítjuk.
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, ahol az i) lépésben egy első detergenst alkalmazunk.
24. 24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti eljárás, ahol az i) lépésben diszulfidhíd-hasító hatóanyagot alkalmazunk.
25. 25. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol a iii) lépésben a ii) lépésben alkalmazott detergens vagy só koncentrációját tovább csökkentjük.
26. 26. A 23-25. igénypontok szerinti eljárás oligomer részecske előállítására, azzal jellemezve, hogy az i) lépésben alkalmazott első detergensként Empigen-BB-t alkalmazunk, és a ii) vagy iii) lépésben detergensként CHAPS-ot, oktil-glükozidot, Tweent, vagy bármely más detergenst alkalmazunk, és sóként a betaint alkalmazzuk.
27. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Empigen-BB-t 1-10%-os koncentrációban, a CHAPS-ot vagy Tweent 0,01-10%-os, a betaint 0,01-10%-os koncentrációban alkalmazzuk.
28. 28. Készítmény, amely az 1-21. igénypontok bármelyike szerint meghatározott oligomer részecskéket tartalmaz.
29. 29. A 28. igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz HCV-„magot”, P7-et, E1-et, E2-t, NS2-t, NS3-at, NS4A-t, NS4B-t, NS5A-t és/vagy NS5B-fehérjét, vagy ezek részeit tartalmazza.
30. 30. A 29. igénypont szerinti készítmény, amelyben az NS3-fehérje, vagy annak részei aminosavszekvenciája az 1. azonosító számon megadott szekvencia vagy ennek részei vagy a 2. azonosító számon megadott szekvencia vagy ennek részei.
31. 31. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely vakcinakészítmény.
32. 32. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása gyógyszer előállításában.
33. 33. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása HCV-vakcinakészítmény előállításában.
34. 34. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása krónikus HCV-hordozók esetében HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
35. 35. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása krónikus HCV-hordozók esetében, bármely egyéb terápia előtt, azzal egyidejűleg vagy az után HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
36. 36. Oligomer részecske 35. igénypont szerinti alkalmazása, ahol az egyéb terápia interferonterápia.
37. 37. Oligomer részecske 35. igénypont szerinti alkalmazása, ahol az egyéb terápia kisméretű hatóanyaggal kombinált interferonterápia.
38. 38. Oligomer részecske 37. igénypont szerinti alkalmazása, ahol a kisméretű hatóanyag ribavirin.
39. 39. Oligomer részecske 35. igénypont szerinti alkalmazása HCV-vel fertőzött egyének esetében, májátültetés előtt vagy után, vagy feltételezett fertőzés után HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
40. 40. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása profilaktikus módon, HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
41. 41. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy az oligomer részecskét vagy készítményt idő- és vegyületsorozat részeként alkalmazzuk.

    HU 227 275 Β1
42. 42. Az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecske alkalmazása HCV-fertőzés kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.
43. 43. A 42. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a kezelés során

    - a HCV-vírusantigének kitisztulnak a májból, és/vagy

    - a máj enzimszintek normalizálódnak a szérumban, és/vagy

    - a máj hisztológiai jellemzői javulnak, és/vagy

    - a májbetegség mint állapot javul,

    - a májgyulladásos állapot javul.
44. 44. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása gyógyszer előállítására.
45. 45. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása HCV-vakcina előállítására.
46. 46. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása krónikus HCV-hordozók esetében HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
47. 47. Készítmény 46. igénypont szerinti alkalmazása krónikus HCV-hordozók esetében - bármely egyéb terápia előtt, azzal egyidejűleg vagy az után - HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
48. 48. Készítmény 47. igénypont szerinti alkalmazása, ahol az egyéb terápia interferonterápia.
49. 49. Készítmény 47. igénypont szerinti alkalmazása, ahol az egyéb terápia kisméretű hatóanyaggal kombinált interferonterápia.
50. 50. Készítmény 49. igénypont szerinti alkalmazása, ahol a kisméretű hatóanyag ribavirin.
51. 51. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása HCV-vel fertőzött egyének esetében, májátültetés előtt vagy után, vagy feltételezett fertőzés után HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
52. 52. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása HCV elleni immunitás profilaktikus módon történő indukálására szolgáló gyógyszer előállítására.
53. 53. A 28-30. igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása HCV elleni immunitás indukálására szolgáló gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy az oligomer részecskét vagy készítményt idő- és vegyületsorozat részeként alkalmazzuk.
54. 54. Biológiai mintában jelen lévő HCV-antitestek detektálására szolgáló reagenskészlet, amely az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecskét tartalmaz, alkalmas tartóban.
55. 55. HCV-vel összefüggő T-sejt-válaszreakció detektálására szolgáló reagenskészlet, amely az 1-21. igénypontok bármelyike szerinti oligomer részecskét tartalmaz.
56. 56. Biológiai mintában HCV elleni antitest detektálására szolgáló immunológiai vizsgálati eljárás, azzal jellemezve, hogy

    i) az 1-21. igénypontok bármelyike szerint meghatározott oligomer részecskét biztosítunk, ii) a biológiai mintát az i) szerinti oligomer részecskével inkubáljuk olyan körülmények között, amelyek lehetővé teszik HCV elleni antitestek és az oligomer részecske közötti komplex kialakulását, iii) az ii) lépésből meghatározzuk azt, hogy a komplex kialakult-e, és ezáltal a HCV elleni antitestek jelenlétét a biológiai mintában.