HU220860B1 - Process for enzymatic hydrolysis of alpha-substituted 4-methyl-thiobutyronitriles - Google Patents
Process for enzymatic hydrolysis of alpha-substituted 4-methyl-thiobutyronitriles Download PDFInfo
- Publication number
- HU220860B1 HU220860B1 HU9702057A HU9702057A HU220860B1 HU 220860 B1 HU220860 B1 HU 220860B1 HU 9702057 A HU9702057 A HU 9702057A HU 9702057 A HU9702057 A HU 9702057A HU 220860 B1 HU220860 B1 HU 220860B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- methylthio
- substituted
- nitrilase
- hydrolysis
- ferm
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 title 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 title 1
- 108010033272 Nitrilase Proteins 0.000 claims description 29
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 25
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 25
- VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CSCCC(O)C#N VWWOJJANXYSACS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 241000203747 Gordonia terrae Species 0.000 claims description 11
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 claims description 10
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 claims description 9
- -1 α-substituted 4- (methylthio) butyric acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 241000187562 Rhodococcus sp. Species 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- 150000008363 butyronitriles Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000002816 methylsulfanyl group Chemical group [H]C([H])([H])S[*] 0.000 claims description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 32
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 27
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 18
- NNICRUQPODTGRU-UHFFFAOYSA-N mandelonitrile Chemical compound N#CC(O)C1=CC=CC=C1 NNICRUQPODTGRU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N (2R)-2-hydroxy-2-phenylacetic acid Chemical compound O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1.O[C@@H](C(O)=O)c1ccccc1 QBYIENPQHBMVBV-HFEGYEGKSA-N 0.000 description 5
- ONFOSYPQQXJWGS-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-4-(methylthio)butanoic acid Chemical compound CSCCC(O)C(O)=O ONFOSYPQQXJWGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 description 5
- IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N mandelic acid Chemical compound OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 IWYDHOAUDWTVEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229960002510 mandelic acid Drugs 0.000 description 4
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- OJNFYMFDNUAUDV-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-2-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CCC(O)(SC)C#N OJNFYMFDNUAUDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- UWBAEAALSITMBX-UHFFFAOYSA-N azanium;2-hydroxy-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound [NH4+].CSCCC(O)C([O-])=O UWBAEAALSITMBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 2
- ZJAKITOEQQTZLI-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfanylbutanenitrile Chemical compound CCC(SC)C#N ZJAKITOEQQTZLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 8-[3-(1-cyclopropylpyrazol-4-yl)-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-5-yl]-3-methyl-3,8-diazabicyclo[3.2.1]octan-2-one Chemical class C1(CC1)N1N=CC(=C1)C1=NNC2=C1N=C(N=C2)N1C2C(N(CC1CC2)C)=O HBAQYPYDRFILMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000131747 Exiguobacterium acetylicum Species 0.000 description 1
- 241000203751 Gordonia <actinomycete> Species 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N Pentanenitrile Chemical compound CCCCC#N RFFFKMOABOFIDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N butyronitrile Chemical compound CCCC#N KVNRLNFWIYMESJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LMPDLIQFRXLCMO-UHFFFAOYSA-L dipotassium;hydrogen phosphate;phosphoric acid Chemical compound [K+].[K+].OP(O)(O)=O.OP([O-])([O-])=O LMPDLIQFRXLCMO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012933 kinetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003367 kinetic assay Methods 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002560 nitrile group Chemical group 0.000 description 1
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N tetrachlorvinphos Chemical compound COP(=O)(OC)O\C(=C/Cl)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl UBCKGWBNUIFUST-YHYXMXQVSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P11/00—Preparation of sulfur-containing organic compounds
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
A találmány nitrilcsoport karboxicsoporttá való hidrolízisét katalizáló nitriláz felhasználására vonatkozik racém, α-szubsztituált 4-(metil-tio)-vajsavak előállításában. Pontosabban egy olyan nitriláz felhasználására, amelyet az Alcaligenes, Rhodococcus vagy Gordona nemzetségbeli mikroorganizmusok nitrilázai közül választottunk ki, még pontosabban, az Alcaligenes faecalis (letétbe helyezve 1994.09. 22-én ATCC 8750 letéti szám alatt), a Rhodococcus sp. HT 29-7 törzs (letétbe helyezve 1995. 03. 07-én FERM BP-3857 letéti szám alatt) vagy a Gordona terrae MA-1 törzs (letétbe helyezve 1995. 09. 19-én FERM BP-4535 letéti szám alatt) nitrilázai közül.
Az Alcaligenes faecalis eredetű nitrilázt például az EP 348 901 számon közzétett európai, illetve a JP 03 224 496 számon közzétett japán szabadalmi leírás - mindkettő az ASAHI cég tulajdona - írja le. Ezekben a szabadalmi leírásokban, és különösen az európai szabadalmi leírásban a nitrilázt arra használták, hogy racém nitrilekből kiindulva optikailag aktív savakat termeljenek. A leírások szerint előnyös kiindulási nitrilek aszubsztituáltak, és előnyösen 1-3 szénatomos alkilláncot vagy aromás gyököt tartalmaznak. A fent említett európai szabadalmi leírás 11. példájában leírják a racém mandulasavnitril Alcaligenes faecalis használatával végzett hidrolízisét, amikor is 91% túlsúlyban R-(—)enantiomer mandulasav képződik. A 486 289 számú európai szabadalmi leírás és a N1TTO CHEMICAL cég ennek megfelelő US 5 326 702 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírása az Alcaligenes BC35-2 törzs (FERM No. 11265 vagy FERM BP—3318) felhasználását írja le mandelonitril hidrolízisére szulfit jelenlétében, amikor is mandulasavat kapnak, ebben az esetben körülbelül 98% enantiomer feleslegben.
Az ASAHI cég JP 04 341 185 számú szabadalmi leírása ezen kívül az Alcaligenes faecalis ATCC 8750 törzs nitrilázának előállítását és felhasználását is tartalmazza, mégpedig, hogy hogyan oldották meg racém nitriljükből kiindulva az optikailag tiszta vegyületek előállításának problémáit. A fent idézett japán szabadalomban leírt enantioszelektív nitriláz legelsősorban (I) általános képletű R-hidroxi-nitrileket
OH
I
R-C-CN (I)
I
H (II) általános képletű 2-hidroxi-karbonsavakká OH
I
R-C-COOH (II)
I
H képes hidrolizálni. A képletekben R jelentése adott esetben szubsztituált arilcsoport vagy adott esetben szubsztituált heterociklusos csoport. Ez a szabadalmi leírás megállapítja, hogy a mandulasavnitril hidrolízise az említett nitrilázzal lehetővé teszi, hogy 100%-os túlsúllyal R-(-)- enantiomer mandulasav keletkezzék. Az 5. példában megállapítják, hogy az említett nitriláz alifás nitrilek - ilyenek a valeronitril, akrilnitril, a 2-halogénpropionitrilek, a klór-acetonitrilek - hidrolizálására használhatók. Nem határozzák meg azonban pontosan az aszimmetriacentrumnál rendelkező alifás nitrilek ilyen hidrolízisének enantioszelektivitását.
A fenti leírás pontosan meghatározza azt is, hogy az Alcaligenes faecalis eredetű nitriláz optimális aktivitását pH 6,5 és 8,0 között fejti ki, és az említett enzim használatakor - a leírás szerint a hőmérsékletnek mindig 45 °C alatt kell lennie.
Teljesen meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy az Alcaligenes faecalis ATCC 8750 eredetű enzim, amikor 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolízisére használtuk, optikai tisztaság szempontjából szelektivitás nélkül végezte a hidrolízist. Ez az enzim úgy hidrolizálta az említett nitrilt, hogy a két sav racém keveréke képződött anélkül, hogy az egyik vagy a másik izomer túlsúlyba került volna.
A FERM BP-3857 számon letétbe helyezett Rhodococcus sp. HT 29-7 törzs nitrilázát például az EP 610 049 számon közzétett európai és az US 5 296 373 számon közzétett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások - mindkettő a NITTO cég tulajdona - írja le.
Ezekben a szabadalmi leírásokban és főképpen az amerikai leírásban a nitrilázt arra használták, hogy fenilcsoportot tartalmazó racém nitrilekből kiindulva optikailag aktív savakat állítsanak elő. Mindegyik kiindulási nitril aromás gyököt tartalmazott, azaz lényegében a mandelonitril vagy az aromás gyűrűn szubsztituált származékainak hidrolíziséről van szó. A fent említett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 1. példájában közlik, hogy a racém mandelonítrilt Rhodococcus sp. HT 29-7 törzzsel hidrolizálták, és 100% túlsúlyban R-(-)-enantiomer mandulasavterméket kaptak. A 2. példában leírják a gyűrűn szubsztituált származékok hidrolízisét, ami szintén 100%-ban enantiomer mandulasav-származékot eredményezett. Ugyanez volt az eredmény, amikor a hidrolízist a benzaldehid nihiléivel végezték.
A NITTO CHEMICAL cég 610 049 számú európai szabadalmi leírásában közlik, hogy a Rhodococcus sp. HT 29-7 törzset (FERM BP-3857), az Alcaligenes BC35-2 törzset (FERM BP—3318) vagy a Brevibacterium acetylicum IÁM 1790 törzset használták γhelyzetben aromás gyűrűvel szubsztituált a-hidroxinitrilek hidrolízisére, optikailag aktív, fenilcsoporttal szubsztituált α-hidroxi-karbonsavak előállítása céljából. A Rhodococcus HT 29-7 törzzsel kapott savakat mindig enantiomerfelesleggel kapták meg, ami a kiindulási nitril és a foszforsav jelenléte vagy hiánya (a pHt körülbelül 8,2-re állították be) szerint változott.
Meglepő módon az derült ki, hogy a Rhodococcus sp. HT 29-7 törzs (FERM BP-3857) eredetű említett enzim, amikor 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolíziséhez használtuk, enantiomerszelektivitás nélkül hidrolizált. Ez az enzim az említett nitrilt úgy hidrolizálta, hogy a két sav racém keveréke képződött anélkül, hogy az egyik vagy a másik izomer túlsúlyba került volna.
HU 220 860 Bl
1. példa
Az Alcaligenes faecalis ATCC 8750 mikroorganizmust a következő táptalajban tenyésztjük:
A FERM BP-4535 szám alatt letétbe helyezett Gordona terrae nitriláza a 0 610 048 számú európai szabadalmi leírás szerint olyan nitrileket hidrolizál, amelyek γ-helyzetben fenilcsoportot és α-helyzetben hidroxicsoportot tartalmaznak, és hidrolízisük a megfelelő, optikailag aktív savakat eredményezi. Az enantiomerfelesleg minden példában 92% és 100% között változott.
Egészen meglepő volt, hogy amikor a FERM BP-4535 szám alatt letétbe helyezett Gordona terrae MA-1 eredetű említett enzimet 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolízisére használtuk, enantiomerszelektivitás nélkül hidrolizált. Ez az enzim úgy hidrolizálta az említett nitrilt, hogy a két sav racém keveréke képződött az egyik vagy másik izomer túlsúlya nélkül.
A találmány tehát racém, α-szubsztituált 4-(metiltio)-vajsavak előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, racém, α-szubsztituált 4-(metil-tio)-butironitrileknek a következő mikroorganizmusok közül kiválasztott törzs által termelt nitriláz segítségével végzett hidrolízisével: Alcaligenes faecalis (letéti száma: ATCC 8750), Rhodococcus sp. HT 29-7 törzs (letéti száma: FERM BP-3857) vagy Gordona terrae MA-1 törzs (letéti száma: FERM BP-4535).
A találmány szerinti eljárásban a mikroorganizmus eredeti állapotában vagy a szakemberek által jól ismert hordozókon immobilizálva használható.
Másfelől, az enzimet kódoló genetikai információt az eredeti mikroorganizmusból (ilyen az A. faecalis ATCC 8750) átvihetjük olyan mikroorganizmusba, mint a Bacillus subtilis.
A találmány szerinti eljárás egyik változata abból áll, hogy a mikroorganizmus helyett a szabad vagy immobilizált, teljes mértékben vagy részlegesen tisztított enzimet a megfelelő mennyiségben használjuk.
Az α-szubsztituált 4-(metil-tio)-butironitrilek közül előnyben részesítjük a 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitrilt, amely lehetővé teszi a racém metionin hidroxianalógjának az előállítását. A metioninszármazékok előállításának ez a technológiája lehetővé teszi, hogy elkerüljük olyan ásványi melléktermékek nagy mennyiségben való képződését, amelyeknek az elhelyezése egyre nagyobb problémát jelent a környezetvédelmi korlátozások miatt.
A találmány szerint ezek az enzimek 4-11 pH-tartományban fejtenek ki nitrilázaktivitást, optimális aktivitásukat pedig 5-9 pH között érik el. Felhasználásuk hőmérsékleti optimuma 30-60 °C között van, felhasználásukat azonban 30-50 °C között tartjuk előnyösnek.
Előnyösen olyan kiindulási oldattal dolgozunk, amelyben a nitril koncentrációja 10 és 400 mM között van, és előnyösek az 50 és 200 mM közötti koncentrációk. A kapott sav ammóniumsó-koncentrációja amennyiben ez 2 M alatt van, illetve előnyösen 0,1 és
1,5 M közötti - kevéssé befolyásolja az enzim aktivitását.
A találmányt a következő példák segítségével részletesebben ismertetjük anélkül, hogy ezekre korlátoznánk a találmány oltalmi körét.
| Ammónium-acetát | 10 g/1 |
| Élesztőkivonat | 5 g/1 |
| Pepton | 5 g/1 |
| Dikálium-hidrogén-foszfát | 5 g/1 |
| Magnézium-szulfát χ 7H2O | 0,2 g/1 |
| Vas(II)-szulfát χ 7H2O | 30 mg/1 |
| Nátrium-klorid | lg/1 |
| Benzonitril | 0,5 g/1 |
| pH 7,2. | |
| A tenyésztést 30 °C-on végezzük 600 ml táptalajt |
tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikokban. Rázatott tenyésztést végzünk 30 órán át, 150 fordulat/perc mellett. A sejtüledéket learatjuk, 9 g/1 nátrium-klorid tartalmú oldattal mossuk, majd lefagyasztjuk.
Műveleti körülmények a butironitril hidrolíziséhez:
4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril 50 mM Sejtek 5 mg/ml
Foszfátpuffer 200 mM
Hőmérséklet 30 °C
Időtartam 4 óra.
A 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolízisének kinetikai vizsgálata óránként és száraz sejt mg-onként
2,8 μΜ metionin-hidroxi-analóg elsőrendű reakció szerinti képződését mutatta. A képződött sav enantiomer feleslegét folyadékkromatográfiával mértük, ami 80%os savkitermelés mellett 0%-ot tett ki.
2. példa
Az enzim stabilitását úgy vizsgáltuk, hogy szabad sejtekkel 180 órán keresztül követtük a metionin-hidroxi-analóg képződésének a kinetikáját.
A műveleti körülmények a következők:
4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril 100 mM
Sejtek 10 mg/ml
Foszfátpuffer 300 mM 5 ml
Hőmérséklet 25 °C.
A nitrilt egymást követően adagoltuk - miután elfogyott - 100 mM-nyi nitril adagolásával. A megfelelő sav képződését az alábbi táblázat mutatja be.
| Idő (óra) | Képződött sav (mmol/liter) | Aktivitás (pmol/óra/mg száraz sejt) |
| 0 | 0 | 0 |
| 2h | 39 | 1,7 |
| 17 h | 230 | 1,3 |
| 24 h | 312 | 1,7 |
| 47 h | 466 | 1,2 |
| 70 h | 556 | 0,4 |
| 172 h | 860 | 0,6 |
| 180 h | 940 | 0,6 |
A kezdeti aktivitás 2 pmol/óra/mg száraz sejt. Ez a példa bizonyítja, hogy az enzim a sav magas koncentrá3
HU 220 860 Bl dóinak (0,9 M metionin-hidroxi-analóg) a jelenléte ellenére is stabil.
3. példa:
Az enzim stabilitását a szubsztrátum mennyiségének és a képződött sav mennyiségének a függvényében is mértük a következő feltételek mellett.
Az enzim stabilitása a szubsztrátum mennyiségétől függően:
Műveleti körülmények:
Nitril lásd a lenti táblázat adatait
Sejtek 10 mg/ml
Foszfátpuffer 300 mM; pH 7,0 5 ml
Hőmérséklet 25 °C
Időtartam 1 óra.
| Nitril koncentrációja (mM) | Aktivitás (pmol/óra/mg száraz sejt) |
| 50 | 2 |
| 100 | 2 |
| 150 | 2 |
| 200 | 2 |
| 500 | 0 |
Az enzim stabilitása a képződött sav mennyiségétől függően:
Műveleti feltételek:
Nitril 50 mM
Sejtek 2,5 mg/ml
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 1 ml
Hőmérséklet 30 °C
Időtartam 2 óra.
| Sav koncentrációja (mM) | Aktivitás (pmol/óra/mg száraz sejt) |
| 0 | 3,2 |
| 100 | 4,5 |
| 200 | 3,8 |
| 300 | 4,1 |
| 400 | 4 |
| 500 | 4 |
| 600 | 3,4 |
| 700 | 2,8 |
4. példa
A nitriláz tisztítása
Az Alcaligenes faecalis sejteket az 1. példában leírt táptalajban 24 órán át 30 °C-on tenyésztettük.
A tenyészet centrifugálása után az üledéket pufferben [25 mM trisz.HCl; 10% (tömeg/térfogat) glicerin; pH 7,5] vettük fel. A sejtszuszpenziót ultrahanggal kezeltük, majd centrifugáltuk, és így egy nyers kivonatot kaptunk. A nyers kivonatot ezután 30% telítésnél ammónium-szulfáttal csaptuk ki. A kapott csapadékot a pH 7,5 -ős pufferben reszuszpendáltuk, majd egy éjszakán át ugyanezen pufferrel szemben dializáltuk.
A kapott oldatot ezután Q Sepharose Fást Flow HR 26/10 anioncserélő oszlopra - amelyet előzőleg a pH
7,5-ös pufferrel hoztunk egyensúlyba - vittük fel. A nitrilázt 0-1 M nátrium-klorid-gradienssel eluáltuk.
Végül az aktivitást tartalmazó frakciókat egyesítettük, majd hozzáadtunk 1 M ammónium-szulfátot. Ezt az oldatot egy hidrofób kölcsönhatás alapján működő Phenyl Sepharose HR 5/5 oszlopra vittük fel, amelyet előzőleg a pH 7,5-ős pufferrel - amelyhez 1 M ammónium-szulfátot adtunk - hoztunk egyensúlyba. Az aktivitást ezután 1-0 M ammónium-szulfát gradienssel eluáltuk.
A protein molekulatömegét gélszűréssel határoztuk meg; ez körülbelül 260 kD-nak felelt meg. SDS-PAGE gélben egyetlen 43 kD-nak megfelelő sávot figyeltünk meg (95%-os tisztaság).
A 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril A. faecalis eredetű nitrilázzal katalizált hidrolízisének kinetikája, amikor is metionin-hidroxi-analóg képződik, elsőrendű.
| Idő (óra) | Aktivitás (pmol/óra/mg protein) | RR (%) |
| 0 | 0 | 1 |
| 0,5 | 150 | 3 |
| 1 | 171 | 5 |
| 21,5 | 150 | 68 |
| 24,8 | 150 | 77 |
| 29 | 150 | 87 |
5. példa
A pH befolyása:
Műveleti körülmények:
Nitril 50 mM
Protein 50 pg/ml
Acetátpuffer 100 mM; pH 4-5 \
Foszfátpuffer 100 mM; pH 6-7 I . ,
Trisz.HCl puffer 100 mM; pH 8-9 í Borátpuffer 100 mM; pH 10-11 J Hőmérséklet 30 °C
Időtartam 1-2 óra.
| PH | Aktivitás (pmol/óra/mg protein) |
| 4 | 0 |
| 5 | 42 |
| 6 | 232 |
| 7 | 272 |
| 8 | 405 |
| 9 | 412 |
| 10 | 158 |
| 11 | 0 |
HU 220 860 Bl
6. példa
A hőmérséklet befolyása:
Műveleti körülmények:
Nitril 50 mM
Protein 50 pg/ml
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 1 ml
Hőmérséklet 4 °C-tól 60 °C-ig változtatva
Időtartam 1 óra.
| Hőmérséklet (°C) | Aktivitás (μπιοΐ/óra/mg protein) |
| 4 | 45 |
| 10 | 67 |
| 20 | 140 |
| 30 | 272 |
| 40 | 419 |
| 50 | 570 |
| 60 | 333 |
Az enzimműködés optimális hőmérséklete 50 °C. Összehasonlító példa mandelonitrillel:
Műveleti körülmények:
Mandelonitril 7 mM
Protein 5 pg/ml
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 1 ml
Hőmérséklet 30 °C.
| Idő | Aktivitás (pmol/óra/mg protein) | CC |
| 15 | 1000 | 1 |
| 60 | 1030 | 1 |
A tisztított nitriláz csak mandelonitrilre enantioszelektív, 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitrilre nem.
7. példa
4-(Metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolízise Rhodococcus HT 29 7 FERM BP-3857 törzzsel.
A Rhodococcus HT 29 -7 FERM BP-3857 mikroorganizmust az alábbi táptalajban tenyésztjük.
Glicerin 20 g/1
Élesztőkivonat (DIFCO) 3 g/1
Kálium-dihidrogén-foszfát 1 g/1
Dinátrium-hidrogén-foszfát χ 12H2O 4,4 g/1 Nátrium-szulfát 2,8 g/1
Magnézium-klorid χ 6H2O 0,85 g/1
Kalcium-klorid χ 2H2O 0,05 g/1
Mangán-szulfát χ H2O 0,033 g/1
Vas(II)-szulfátx7H2O 0,013 g/1
Cink-szulfát x7H2O 0,005 g/1
Benzonitril 0,5 g/1.
pH 7,5
A tenyésztést 30 °C-on, 600 ml táptalajt tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikokban végezzük. A lombikokat 140 órán át 150 fordulat/perc mellett rázatjuk. A sejtüledéket learatjuk, 9 g/1 nátrium-klorid tartalmú oldattal mossuk, majd lefagyasztjuk.
A pH hatása a hidrolízisre:
Műveleti körülmények: 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril 100 mM Optikai sűrűség 660 nm-nél (OD) 15 Acetátpuffer 100 mM; pH 4-5 Foszfátpuffer 100 mM; pH 6,0-7,0 1 ml
Trisz.HCl puffer 100 mM; pH 8,0-9,0 Borátpuffer 100 mM; pH 10,0-11,0 Hőmérséklet 30 °C
Időtartam 10 óra.
| pH | Savkihozatal (%) |
| 4 | 0% |
| 5 | 100% |
| 6 | 100% |
| 7 | 100% |
| 8 | 100% |
| 9 | 100% |
| 10 | 20% |
| 11 | 0% |
8. példa
A szubsztrátumkoncentráció befolyása Az enzimnek a szubsztrátum mennyiségétől függő stabilitását a következő körülmények között mértük: 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril (lásd a táblázat adatait)
Optikai sűrűség 660 nm-nél (OD) 20 Foszfátpuffer 300 mM; pH 7,0 5 ml
Hőmérséklet 30 °C
Időtartam 2 óra.
| Nitrilkoncentráció (mM) | Savkihozatal (%) |
| 50 | 90% |
| 100 | 44% |
| 200 | 22% |
| 300 | 10% |
| 400 | 0% |
| 500 | 0% |
9. példa
Az enzim stabilitása a képződött sav mennyiségének függvényében
| Műveleti körülmények: | |
| 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril | 100 mM |
| Optikai sűrűség 660 nm-nél | 15 |
| Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 | 1 ml |
| Hőmérséklet | 30 °C |
| Időtartam | 6 óra |
HU 220 860 BI
| Savkonccntráció (mM) | Savkihozatal (%) |
| 0 | 100% |
| 200 | 100% |
| 400 | 100% |
| 600 | 100% |
| 800 | 100% |
| 1000 | 100% |
10. példa
Enantiomer felesleg
Műveleti körülmények:
4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril 140 mM
Optikai sűrűség 660 nm-nél (OD) 14
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 1 ml
Hőmérséklet 20 °C.
| Inkubációs idő (óra) | Savkihozatal (%) | Optikai tisztaság |
| 2h | 15% | 0 |
| 6h | 50% | 0 |
| 24 h | 100% | 0 |
A 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolízisének kinetikai vizsgálata azt mutatta, hogy száraz sejt ingónként a metionin-hidroxi-analóg óránkénti képződése elsőrendű reakció szerint megy végbe. A képződött sav enantiomer feleslegét folyadékkromatográfiával mértük, ami 15-100% közötti savkihozatalnál 0%-kal volt egyenlő.
11. példa
A hőmérséklet befolyása
Műveleti körülmények:
4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril 100 mM
Optikai sűrűség 660 nm-nél (OD) 15
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 1 ml
Hőmérséklet lásd a táblázatot
Időtartam 6 óra.
| T(°C) | Savkihozatal (%) |
| 10 | 70% |
| 20 | 100% |
| 30 | 100% |
| 40 | 100% |
| 50 | 31% |
| 60 | 15% |
12. példa
4-(Metil-tio)-2-hidroxi-butironitril hidrolízise
Műveleti körülmények:
4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitril 23 mM
Optikai sűrűség 660 nm-en (OD) 15
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 1 ml
Hőmérséklet 30 °C.
| Idő (óra) | Savkihozatal (%) | Enantiomer savfeleslcg |
| 0,5 | 40% | n.d. |
| 1 | 51% | 0,12 |
| 2 | 62% | n.d. |
| 5 | 78% | 0,15 |
13. példa
A Gordona terrae MA-1 (FERM BP-4535) tenyésztését a következő körülmények között végeztük:
| Glicerin | 10 g/1 |
| Elesztőkivonat | 0,4 g/1 |
| Dikálium-dihidrogén-foszfát | 6,8 g/1 |
| Dinátrium-hidrogén-foszfát χ 12H2O | 7,1 g/1 |
| Nátrium-szulfát | 2,8 g/1 |
| Magnézium-klorid χ 6H2O | 0,4 g/1 |
| Kalcium-klorid χ 2H2O | 40 mg/1 |
| Mangán-szulfát χ H2O | 4 mg/1 |
| Vas(III)-klorid | 0,6 mg/1 |
| Cink-szulfát | 0,3 mg/1 |
| Benzonitril | 0,5 g/1 |
| pH 7,2. | |
| Az enzim aktivitása: | |
| Tenyésztés után a sejteket mostuk, majd hidroxi- |
(metil-tio)-butironitril jelenlétében mértük az aktivitást.
Műveleti körülmények:
[nitril]=23 mM [sejtek]=6,8 g/1
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0
Hőmérséklet 35 °C.
A hidroxi-(metil-tio)-butironitril hidrolízisének kinetikája elsőrendű. A kezdeti sebesség becsült értéke 13 mM/óra.g száraz sejt.
(Lásd az 1. ábrát: Az AMTP-ciánhidrid hidrolízise Gordona terrae MA-1 segítségével.)
14. példa
Az AMTP-ciánhidrid koncentrációjának hatása a nitriláz aktivitására.
Meghatároztuk a hidroxi-(metil-tio)-butironitril kezdeti koncentrációjának a hatását a nitriláz aktivitására. Az eredményeket a következő táblázat tartalmazza.
Műveleti körülmények:
[sejtek]=5,l g/1
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0
Hőmérséklet 35 °C.
A kinetikai vizsgálatot a 0,5., 1., 2. és 3. órában végeztük.
| Nitrilkonccntráció (mM) | Aktivitás (mmol/óra/g száraz sejt) |
| 50 | 14 |
| 100 | 13 |
| 200 | 15 |
| 300 | 0 |
| 400 | 0 |
HU 220 860 Β1
200 mM nitrilkoncentrációig az enzim aktivitása a szubsztrátkoncentrációval kevéssé változott.
15. példa
A metionin-hidroxi-analóg koncentrációjának a hatása a nitriláz aktivitására.
Ebben a vizsgálatban az ammónium-[4-(metil-tio)2-hidroxi-butirát] nitrilázra kifejtett hatását tanulmányoztuk.
Műveleti körülmények:
[sejtek]=5 g/1 [nitril] = 100 mM
Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0
Hőmérséklet 35 °C.
A karbonsav ammóniumsójának a koncentrációját O-tól 1,5 M-ig változtattuk.
| Savkoncentráció (mol/1) | Aktivitás (μηιοΐ/óra/mg száraz sejt) |
| 0 | 9,4 |
| 0,5 | 14 |
| 1 | 19 |
| 1,5 | 15 |
Az ammónium-[4-(metil-tio)-2-hidroxi-butirát] koncentrációja egyáltalán nem módosította a Gordona terrae MA-1 törzs kezdeti nitrilázaktivitását.
16. példa
A pH és a hőmérséklet befolyása A pH befolyása a Gordona terrae MA -1 nitriláz aktivitására :
Műveleti körülmények:
[nitril] = 100 mM [sejtek]=7,5 g/1 Acetátpuffer 100 mM; pH 4-5 Foszfátpuffer 100 mM; pH 6-7 Trisz.HCl puffer 100 mM; pH 8-9 Borátpuffer 100 mM; pH 10-11 Hőmérséklet 30° C.
A kinetikai vizsgálatot az 1., 2., 4. és 6. órában végeztük.
| PH | Aktivitás (mmol/óra/g száraz sejt) |
| 4 | 0,6 |
| 5 | 2,5 |
| 6 | 7,8 |
| 7 | 9,6 |
| 8 | 15,3 |
| 9 | 18 |
| 10 | 5,7 |
| 11 | 11 |
Műveleti körülményeink között a pH-optimum
8-9 körül van.
A hőmérséklet befolyása a Gordona terrae MA-1 nitriláz aktivitására:
Műveleti körülmények:
[nitril] = 100 mM [sejtek] =7,5 g/1 Foszfátpuffer 100 mM; pH 7,0 Kinetikai vizsgálat az 1. órában.
| T(°C) | Aktivitás (mmol/óra/g száraz sejt) |
| 10 | 0,6 |
| 20 | 2,3 |
| 30 | 3,2 |
| 40 | 3,4 |
| 50 | 3,5 |
| 60 | 1,9 |
Az optimális hőmérséklet 40-50 °C körül van.
Claims (9)
1. Eljárás racém, α-szubsztituált 4-(metil-tio)vajsavak előállítására, azzal jellemezve, hogy racém, aszubsztituált 4-(metil-tio)-butironitrileket Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 vagy Gordona terrae FERM BP-4535 eredetű nitrilázzal hidrolizálunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy racém, α-szubsztituált 4-(metil-tio)-butironitrilként 4-(metil-tio)-2-hidroxi-butironitrilt hidrolizálunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a közeg pH-ját 4-11, előnyösen 5-9 közé állítjuk be.
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist 30-60 °C között, előnyösen 30-50 °C között végezzük.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiindulási oldatban az α-szubsztituált 4-(metiltio)-butironitril koncentrációját 10 és 400 mmol/1, előnyösen 50 és 200 mmol/1 közé állítjuk be.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oldatban a keletkezett α-szubsztituált 4-(metiltio)-vajsav koncentrációja 10-2000 mmol/1, előnyösen 100-1500 mmol/1.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Alcaligenes faecalis ATCC 8750 eredetű nitrilázzal hidrolizálunk.
8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Rhodococcus sp. HT 29-7 FERM BP-3857 eredetű nitrilázzal hidrolizálunk.
9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy Gordona terrae FERM BP-4535 eredetű nitrilázzal hidrolizálunk.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9411301A FR2724931B1 (fr) | 1994-09-22 | 1994-09-22 | Hydrolyse enzymatique des 4-methylthiobutyronitrile |
| FR9502615A FR2731438B1 (fr) | 1995-03-07 | 1995-03-07 | Hydrolise enzymatique des 4-methylthiobutyronitriles |
| PCT/FR1995/001196 WO1996009403A1 (fr) | 1994-09-22 | 1995-09-19 | Hydrolyse enzymatique des 4-methylthiobutyronitrile |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT77079A HUT77079A (hu) | 1998-03-02 |
| HU220860B1 true HU220860B1 (en) | 2002-06-29 |
Family
ID=26231416
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9702057A HU220860B1 (en) | 1994-09-22 | 1995-09-19 | Process for enzymatic hydrolysis of alpha-substituted 4-methyl-thiobutyronitriles |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5814497A (hu) |
| EP (1) | EP0782629B1 (hu) |
| JP (1) | JPH10507631A (hu) |
| KR (1) | KR100398595B1 (hu) |
| CN (1) | CN1077599C (hu) |
| AT (1) | ATE174059T1 (hu) |
| AU (1) | AU699625B2 (hu) |
| BR (1) | BR9509176A (hu) |
| CA (1) | CA2200100A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ84497A3 (hu) |
| DE (1) | DE69506430T2 (hu) |
| DK (1) | DK0782629T3 (hu) |
| ES (1) | ES2126313T3 (hu) |
| FI (1) | FI971198A0 (hu) |
| HU (1) | HU220860B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ292559A (hu) |
| PL (1) | PL180871B1 (hu) |
| RU (1) | RU2144959C1 (hu) |
| SK (1) | SK281956B6 (hu) |
| UA (1) | UA48953C2 (hu) |
| WO (1) | WO1996009403A1 (hu) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4235985B2 (ja) * | 1996-02-29 | 2009-03-11 | 日本曹達株式会社 | 微生物を用いたα―ヒドロキシ酸の製造方法及び新規微生物 |
| FR2755143B1 (fr) * | 1996-10-25 | 1998-11-27 | Rhone Poulenc Nutrition Animal | Procede de preparation de l'acide 2-hydroxy-4-methylthio-butyrique par utilisation d'une nitrilase |
| JPH10179183A (ja) * | 1996-12-20 | 1998-07-07 | Daicel Chem Ind Ltd | カルボン酸の製造方法 |
| US5866379A (en) * | 1997-01-28 | 1999-02-02 | Novus International | Enzymatic conversion of α-hydroxynitriles to the corresponding .alpha. |
| US6037155A (en) * | 1997-02-27 | 2000-03-14 | Nippon Soda Co., Ltd. | Process for preparing α-hydroxy acids using microorganism and novel microorganism |
| FR2787121B1 (fr) * | 1998-12-11 | 2003-09-12 | Aventis Cropscience Sa | Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie |
| JPWO2002052027A1 (ja) * | 2000-12-22 | 2004-04-30 | 日本曹達株式会社 | 微生物触媒を用いた物質生産方法 |
| RU2177034C1 (ru) * | 2001-04-03 | 2001-12-20 | Закрытое акционерное общество "Биоамид" | Штамм бактерий alcaligenes denitrificans-продуцент нитрилазы |
| DE602004021778D1 (de) * | 2003-02-27 | 2009-08-13 | Basf Se | Modifizierte nitrilasen und deren verwendung in verfahren zur herstellung von carbonsäuren |
| DE10316110A1 (de) | 2003-04-09 | 2004-10-28 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxy-4-methylthio-buttersäure Ammoniumsalz |
| CN102911975A (zh) * | 2012-09-12 | 2013-02-06 | 浙江工业大学 | 重组腈水解酶制备2-氨基-4-甲硫基丁酸的方法 |
| CN115806902B (zh) * | 2022-09-01 | 2025-06-27 | 中国医学科学院医药生物技术研究所 | 解纤维戈登氏菌及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK314989A (da) * | 1988-06-27 | 1989-12-28 | Asahi Chemical Ind | Fremgangsmaade til fremstilling af optisk aktive alfa-substituerede organiske syrer, samt mikroorganismer og enzymer anvendelige ved fremgangsmaaden |
| JP3009421B2 (ja) * | 1990-02-28 | 2000-02-14 | 秀明 山田 | 有機酸の生物学的製造法 |
| JPH0440899A (ja) * | 1990-06-08 | 1992-02-12 | Nitto Chem Ind Co Ltd | α―ヒドロキシ―４―メチルチオブチルアミドの生物学的製造法 |
| JPH0440898A (ja) * | 1990-06-08 | 1992-02-12 | Nitto Chem Ind Co Ltd | α―ヒドロキシ―４―メチルチオ酪酸の生物学的製造法 |
| CA2103932A1 (en) * | 1992-11-05 | 1994-05-06 | Ramesh N. Patel | Stereoselective reduction of ketones |
| JP3218133B2 (ja) * | 1993-02-03 | 2001-10-15 | 三菱レイヨン株式会社 | フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
| JP2720140B2 (ja) * | 1993-02-03 | 1998-02-25 | 日東化学工業株式会社 | フェニル基を有する光学活性α−ヒドロキシカルボン酸の製造法 |
-
1995
- 1995-09-19 EP EP95931259A patent/EP0782629B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-19 DE DE69506430T patent/DE69506430T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 SK SK376-97A patent/SK281956B6/sk unknown
- 1995-09-19 WO PCT/FR1995/001196 patent/WO1996009403A1/fr active IP Right Grant
- 1995-09-19 HU HU9702057A patent/HU220860B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 PL PL95319298A patent/PL180871B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 JP JP8510644A patent/JPH10507631A/ja not_active Ceased
- 1995-09-19 DK DK95931259T patent/DK0782629T3/da active
- 1995-09-19 FI FI971198A patent/FI971198A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 NZ NZ292559A patent/NZ292559A/en unknown
- 1995-09-19 AT AT95931259T patent/ATE174059T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 RU RU97106337/13A patent/RU2144959C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 US US08/809,184 patent/US5814497A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 CA CA002200100A patent/CA2200100A1/fr not_active Abandoned
- 1995-09-19 BR BR9509176A patent/BR9509176A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-09-19 CZ CZ97844A patent/CZ84497A3/cs unknown
- 1995-09-19 CN CN95195224A patent/CN1077599C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 KR KR1019970701858A patent/KR100398595B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-19 ES ES95931259T patent/ES2126313T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-19 UA UA97041904A patent/UA48953C2/uk unknown
- 1995-09-19 AU AU34764/95A patent/AU699625B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK37697A3 (en) | 1997-10-08 |
| CN1158640A (zh) | 1997-09-03 |
| SK281956B6 (sk) | 2001-09-11 |
| CZ84497A3 (en) | 1997-06-11 |
| KR970706401A (ko) | 1997-11-03 |
| RU2144959C1 (ru) | 2000-01-27 |
| US5814497A (en) | 1998-09-29 |
| BR9509176A (pt) | 1997-12-23 |
| EP0782629A1 (fr) | 1997-07-09 |
| WO1996009403A1 (fr) | 1996-03-28 |
| AU699625B2 (en) | 1998-12-10 |
| DK0782629T3 (da) | 1999-08-16 |
| CA2200100A1 (fr) | 1996-03-28 |
| KR100398595B1 (ko) | 2004-03-20 |
| NZ292559A (en) | 1998-03-25 |
| UA48953C2 (uk) | 2002-09-16 |
| PL180871B1 (pl) | 2001-04-30 |
| AU3476495A (en) | 1996-04-09 |
| FI971198A7 (fi) | 1997-03-21 |
| JPH10507631A (ja) | 1998-07-28 |
| DE69506430D1 (de) | 1999-01-14 |
| CN1077599C (zh) | 2002-01-09 |
| EP0782629B1 (fr) | 1998-12-02 |
| ES2126313T3 (es) | 1999-03-16 |
| HUT77079A (hu) | 1998-03-02 |
| PL319298A1 (en) | 1997-08-04 |
| FI971198L (fi) | 1997-03-21 |
| FI971198A0 (fi) | 1997-03-21 |
| ATE174059T1 (de) | 1998-12-15 |
| DE69506430T2 (de) | 1999-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5283182A (en) | Preparation of immobilized hydantoinase stabilized with divalent metal ions | |
| HU220860B1 (en) | Process for enzymatic hydrolysis of alpha-substituted 4-methyl-thiobutyronitriles | |
| Matsumoto | Production of 6-APA, 7-ACA and 7-ADCA by immobilized penicillin and cephalosporin amidases | |
| EP0839192A1 (en) | An improved immobilized penicillin g acylase | |
| JPH06343462A (ja) | 新規微生物、Ｌ−α−アミノ酸の製法、新規微生物の突然変異種及び変体の培養法、カルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の獲得法、及びカルバモイラーゼ及び／又はヒダントイナーゼ及び／又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の微生物又は細胞中への挿入法 | |
| EP0610049A2 (en) | Process for producing optically active alpha-hydroxycarboxylic acid having phenyl group | |
| Tsugawa et al. | Production of l-Glutamic Acid from dl-Hydantoin-5-propionic Acid by Microoganisms: Part I. Screening of l-Glutamic Acid-Producing Microorganisms and Some Optimal Conditions for Production of l-Glutamic Acid | |
| HK36997A (en) | Enzymatic production of 7-amino cephalosporanic acid | |
| US5098841A (en) | Process for the preparation of hydroxy acids | |
| Soda et al. | One-pot chemo-enzymatic enantiomerization of racemates | |
| Okachi et al. | Selection of Pseudomonas melanvgenum KY 3987 as a New Ampicillin-producing Bacteria | |
| JPH0785718B2 (ja) | Ｄ−アミノ酸の製造方法 | |
| Nakamura et al. | Production of (R)-3-chloro-1, 2-propanediol from prochiral 1, 3-dichloro-2-propanol by Corynebacterium sp. strain N-1074 | |
| HU214125B (en) | Biotechnological process for preparing s-(+)-2,2-dimethyl cyclopropane-carboxamide | |
| EP0332379A2 (en) | Production process of L-alpha-amino acids | |
| US5316944A (en) | Enzymatic resolution of a racemic mixture of gamma-amino acids using penicillin acylase | |
| US6268185B1 (en) | Production of amino acids and enzymes used therefor | |
| US4906572A (en) | Method of culturing amino acid racemase-producing microorganism of genus pseudomonas | |
| Yamada | Microbial reactions for the production of useful organic compounds | |
| EP0295622B1 (en) | Process for producing l-tryptophan | |
| EP1043401B1 (en) | Methods for producing optically active amino acids | |
| IE891773L (en) | Process for preparing optically active 2-(aryloxy)- or¹2-(arylthio)alkanoic acids | |
| JP2674078B2 (ja) | Ｄ−α−アミノ酸の製造法 | |
| US20100105111A1 (en) | Method for production of optically active amino acid | |
| JP4565672B2 (ja) | 光学活性β−シアノイソ酪酸類及びその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |