[go: up one dir, main page]

HUP0500059A2 - Eljárás rekombináns polipeptid előállítására - Google Patents

Eljárás rekombináns polipeptid előállítására Download PDF

Info

Publication number
HUP0500059A2
HUP0500059A2 HU0500059A HUP0500059A HUP0500059A2 HU P0500059 A2 HUP0500059 A2 HU P0500059A2 HU 0500059 A HU0500059 A HU 0500059A HU P0500059 A HUP0500059 A HU P0500059A HU P0500059 A2 HUP0500059 A2 HU P0500059A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
nucleotide sequence
host cell
recombinant polypeptide
cells
desired recombinant
Prior art date
Application number
HU0500059A
Other languages
English (en)
Inventor
Kurt Schörgendorfer
Jörg Windisch
Renate Kunert
Florian Unterluggauer
Original Assignee
Sandoz Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23304597&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUP0500059(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sandoz Ag. filed Critical Sandoz Ag.
Publication of HUP0500059A2 publication Critical patent/HUP0500059A2/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás a kívánt rekombináns polipeptidetexpresszáló transzformált eukarióta gazdasejtek előállítására, melyeljárásban valamely eukarióta gazdasejtbe bejuttatnak: (a) egy elsőpolinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a kívánt rekombinánspolipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciát; és (ii) aszelektálásra alkalmas markert kódoló második nukleotid szekvenciát,mely második nukleotid szekvencia a gazdasejt szelekciós szerreltörténő érintkeztetésekor amplifikálódik, és (b) egy másodikpolinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegébenazonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy amásodik nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotidszekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markertkódol; mely első polinukleotid vektor és második polinukleotid vektora gazdasejt genomjába stabilan integrált. Ó

Description

700008/SM á Szabadalmi Ügyvivői Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113.
Telefon: 461-1000, Fax: 461-1099
- ANYG
Eljárás rekombináns polipeptid előállítására
Sandoz GmbH., Kundl, AT
Feltalálók:
SCHÖRGENDORFER Kurt,
Niederbreitenbach 172, A-6322, Langkampfen, AT
WINDISCH Jörg,
Land 192z, A-6233 Kramsach, AT
KUNÉRT Renate,
Galileigasse 5, A-2232 Deutsch-Wagram, AT
UNTERLUGGAUER Florian,
Prof. Sinwelweg 2/5, 6330 Kufstein, AT
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP02/13297
A bejelentés napja: 2002.11.26.
Elsőbbsége: 2001.11.28. (US 60/333, 868)
A nemzetközi közzététel száma: WO 03/046187 A1
A jelen találmány rekombináns polipeptideket, így pl. humán eritropoetint expresszáló gazdasejtek előállítására és az ilyen polipeptidek előállítására szolgáló eljárásokra vonatkozik. A találmány főként két vektor alkalmazásán alapuló expressziós rendszerekre vonatkozik, mely vektorok különböző markereket tartalmaznak, vonatkozik továbbá az ilyen rendszereket alkalmazó eljárásokra.
A vörösvérsejt-képződés szabályozásáért főként az 1977-ben felfedezett glikoprotein hormon, az eritropoetin (Epo) a felelős. Akkoriban az Epo izolálását és tisztítását megnehezítette, hogy a kiindulási anyag - az aplasztikus anémiás betegek vizelete - korlátozottan állt rendelkezésre. így a tisztított hormonból csak szubmikrogrammos mennyiségek álltak rendelkezésre a kutatáshoz.
Az első tisztítási próbálkozások az 1970-es évek végén zajlottak affinitás kromatográfiás oszlopon, agarózon megkötött lektinek alkalmazásával. A búzacsírán és fitohemagglutidinen megkötött eritropoetint és a vizeletből nyert preparátumot ezután Epo-ra dúsították (legfeljebb 100-szoros dúsítást tudtak elérni).
A korai 1980-as évekre a humán eritropoetin DNS szekvenciáját megállapították és klónozták. Az eritropoetin egy láncú glikoprotein, molekulatömege közelítőleg 30-34 kDa. A molekula négy ciszteinil-maradékot tartalmaz, melyek két, láncon belüli diszulfid-hidat képeznek a Cys 7 és Cys 161 aminosavak között, illetve a Cys 29 és Cys 33 között. A Cys 7 és Cys 161 aminosavak közötti diszulfid-híd biológiai aktivitás szempontjából kritikusnak mutatkozott. Az eritropoetin erősen glikozilezett; molekulatömegének kb. 35-40%-ás szénhidrátok teszik ki. A vizeletből nyert preparátumok esetében a szénhidrát mennyiségében eltérések mutatkozhatnak, de ez nem a vesekiválasztás utáni állapotot, hanem az Epo-nak a vizeletből való kinyerése utáni állapotot tükrözi, vagyis az előállítási eljárás van rá hatással. A keringő vérplazmában lévő eritropoetin formának vagy formáknak az oligoszacharid struktúráját még nem határozták meg, mivel eddig ezeket a formákat még nem izolálták. Az eritropoetinben három aszpargin van (Asn 38, Asn 24 és Asn 83), melyeken N-glikozilezödés mehet végbe, és egy szerint (Ser 129), melyen O-glikozileződés játszódhat le.
A rekombináns humán eritropoetint (rhEpo) többféle emlőssejtben, így pl. kínaihörcsög-ovárium (Chinese hamster ovary; CHO) sejtekben, hörcsög bébi vese (baby hamster kidney; BHK) sejtekben és Hela sejtekben is expresszálták. A különböző sejttípusokban expresszált rhEpo glikozilezettsége eltérő (Takeuchi és Kobata beszámolója, 1991, Glycobiology 1(4), 337-346). Az rhEpo kereskedelmi célú előállításához a proteint nagy mértékben kell expresszálni nagy in vivo aktivitással. Az expresszió fokozásának egyik módja, hogy dhfr-deficiens CHO-sejtekbe egy olyan vektort transzfektálnak, amely dihidrofolát-reduktáz (dhfr) gént és humán Epo gént tartalmaz
[Lee és munkatársai: J. Biotech 69, 85-93 (1999)]. Ha a tenyészethez metotrexátot (MTX) adnak, az a dhfr gén és a hozzákapcsolódó Epo gén esetében is nagy kópiaszámot eredményez.
A jelen találmány tárgya javított eljárás olyan gazdasejtvonalak előállítására, amelyek rekombináns polipeptideket, így pl. humán eritropoetint expresszálnak. Azt találtuk, hogy ha gazdasejtbe két olyan vektort viszünk be, melyek mindegyike valamely rekombináns polipeptid, így pl. az rhEpo expresszióját vezérlő epxressziós kazettával rendelkezik, de az egyik vektor olyan gént tartalmaz, mely a szelekciós szer (pl. dhfr) hatására a gazdasejtben amplifikálódik, míg a másik vektor a szelektálásra alkalmas markert tartalmazza, mimellett a vektorok lényegében azonosak, akkor lehetővé válik a rekombináns polipeptid exressziója szempontjából kívánatos tulajdonságokkal rendelkező gazdasejtek generálása és szelektálása.
A jelen találmány első aspektusa tehát eljárás a kívánt rekombináns polipeptidet expresszáló transzformált eukarióta gazdasejtek előállítására, mely eljárásban valamely eukarióta gazdasejtbe bejuttatunk:
(a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciát; és (ii) a szelektálásra alkalmas markert kódoló második nukleotid szekvenciát, mely második nukleotid szekvencia a gazdasejt szelekciós szerrel történő érintkeztetésekor amplifikálódik, és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a második nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markert kódol;
mely első polinukleotid vektor és második polinukleotid vektor a gazdasejt genomjába integrálódik.
Kedvező és előnyös esetben az első és második polinukleotid vektort egyidejűleg juttatjuk be a gazdasejtbe. A másik lehetőség, hogy az első és a második polinukleotid vektort egymást követően visszük be a gazdasejtbe.
A gazdasejt előnyösen valamely emlőssejt, előnyösebben kínaihörcsög-ovárium (CHO)-sejt.
Szelekciós szer bármely olyan vegyület vagy készítmény lehet, mely képes a második nukleotid szekvencia amplifikációját előidézni a gazdasejtnek az ilyen szelekciós szerrel történő érintkeztetésekor. A második nukleotid szekvencia előnyösen egy dihidrofolát-reduktáz polipeptidet kódol és a szelekciós szer metotrexát. A kívánt rekombináns polipeptid előnyösen az eritropoetin.
A harmadik nukleotid szekvencia jellemezőén antibiotikummal (pl. G-418 vagy neomicin) szembeni rezisztenciát kódol (vagyis a harmadik nukleotid szekvencia neomicin foszotranszferázt kódol). A szakemberszámára nyilvánvaló, hogy a neomicincsoportba tartozó más antibiotikumok is használhatók.
A jelen találmány egyik foganatosítási módja eljárás humán eritropoetint epxresszáló transzformált eukarióta gazdasejtek előállítására, mely eljárásban CHO gazdasejtbe bejuttatunk:
(a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a humán eritropoetint kódoló első nukleotid szekvenciát, és (ii) a dihidrofolát-reduktázt kódoló második nukleotid szekvenciát; és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a dihidrofolátreduktázt kódoló nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely valamely aminoglikozid foszfotranszferázt kódol, mely a G-418, neomicin, vagy a neomicin-csoportba tartozó más antibiotikum iránti rezisztenciát hordozza;
mely első polinukleotid vektor és második polinukleotid vektor a gazdasejt genomjába integrálódik.
A jelen találmány szerinti itt ismertetett összes eljárásokban előnyösen az első nukleotid szekvencia, a második nukleotid szekvencia és a harmadik nukleotid szekvencia működőképesen össze van kapcsolva egy erős promóterrel, jellemzően valamely virális promóterrel, mint amilyen pl. egy SV40 korai promoter. Előnyösen a három nukleotid szekvencia mindegyike egymástól függetlenül áll működésképes kapcsolatban egy erős promóterrel, előnyösen az SV40 korai promóterrel. A megfelelő policisztronos expressziós egységek alkalmazása szintén lehetséges.
Hasonlóképpen a jelen találmány szerinti itt ismertetett összes eljárásokban előnyösen az első nukleotid szekvencia, a második nukleotid szekvencia és a harmadik nukleotid szekvencia működőképesen további szabályozó elemekkel (mint amilyen a transzkripció lezáródását szabályozó szekvencia) van összekapcsolva. Egy előnyös foganatosítási mód szerint ez a szabályozó elem az SV40 nagy T poliadenilációs jelet kódoló szekvencia. Előnyösen az ilyen nagy T poliadenilációs jelet kódoló szekvencia az ismert, természetes előfordulású közbenső (intervening) szekvenciát is tartalmazza.
A jelen találmány egy másik aspektusát az eukarióta gazdasejtek képezik, melyek a találmány első aspektusa szerint állíthatók elő. Előnyösen a kívánt rekombináns polipeptid, melyet a gazdasejt expresszál, az eritropoetin, jellemzően a hEpo. A gazdasejt előnyösen valamely emlőssejt, előnyösebben CHO-sejt.
A jelen találmány harmadik aspektusa transzformált eukarióta gazdasejt, mely egy vagy több kromoszómájába integráltan tartalmaz:
(a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciát; és (ii) a szelektálásra alkalmas markert kódoló második nukleotid szekvenciát, mely második nukleotid szekvencia a gazdasejt szelekciós szerrel történő érintkeztetésekor amplifikálódik, és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első poinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a második nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markert kódol;
Előnyösen a kívánt rekombináns polipeptid, melyet a gazdasejt expresszál, az eritropoetin, jellemzően a hEpo. A gazdasejt előnyösen valamely emlőssejt, előnyösebben CHO-sejt.
Egy előnyös foganatosítási mód szerint a második nukleotid szekvencia dihidrofolát-reduktáz polipeptidet kódol. A kívánt rekombináns polipeptid előnyösen az eritropoetin, jellemzően a hEpo.
A találmány egy foganatosítási módja olyan emlős gazdasejt, mely egy vagy több kromoszómájába integráltan, célszerűen stabilan integráltan tartalmaz:
(a) egy polinukleotid szekvenciát, mely a dihidrofolát-reduktáz polipeptidet és az eritropoetint kódolja, és (b) egy, az (a) polinukleotid szekvenciától különböző polinukleotid szekvenciát, mely az eritropoetint és azt a polipeptidet kódolja, mely egy antibiotikummal szemben a rezisztenciát hordozza.
A gazdasejt előnyösen CHO-sejt. Az antibiotikum előnyösen G-418, neomicin, vagy más, a neomicin-csoportba tartozó hasonló antibiotikum.
A jelen találmány negyedik aspektusa eljárás a kívánt rekombinációs polipeptid előállítására, mely eljárásban a találmány második és harmadik aspektusa szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik az első nukleotid szekvencia expresszióját. Jellemzően a gazdasejteket is valamely szelekciós szer jelenlétében tenyésztjük, mely szer az első nukleotid szekvencia amplifikációját eredményezi. Előnyösen a második nukleotid szekvencia egy dihidrofolát reduktáz polipeptidet kódol és a szelekciós szer a metotrexát.
Egy előnyös foganatosítás! mód szerint a kívánt rekombinációs polipeptid a humán Epo.
A rekombináns polipeptid előnyösen a táptalajba jut szekréció útján. Az eljárás további tipikus lépése az expresszálódott kívánt rekombináns polipeptid kinyerése a tápközegből. Alternatív vagy kiegészítő megoldásként a rekombináns polipeptidet a transzformált gazdasejtböl is kinyerhetjük.
A találmányhoz tartozik továbbá az itt leírt kompozíció, mely a találmány negyedik aspektusa szerinti eljárással előállított glikozilezett rekombináns humán eritropoetint tartalmazza.
A jelen találmány ötödik aspektusát egy olyan kompozíció képezi; mely tartalmaz:
(a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciát, és (ii) a szelektálásra alkalmas markert kódoló második nukleotid szekvenciát, mely második nukleotid szekvencia amplifikálódik, amikor a gazdasejtet olyan szelekciós szerrel hozzuk érintkezésbe, mely képes a nukleotid szekvencia amplifikációját előidézni, ha a gazdasejtet ilyen szelekciós szerrel érintkeztetjük, és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a második nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markert kódol.
A kívánt rekombináns polipeptid előnyösen a humán eritropoetin. A második nukleotid szekvencia előnyösen a dihidrofolát-reduktázt, a harmadik nukleotid szekvencia előnyösen a neomicin foszfotranszferázt kódolja.
A jelen találmány vonatkozik a fenti kompozíció alkalmazására is egy olyan eljárásban, melyben a kívánt rekombináns polipeptidet expresszáló eukarióta gazdasejteket állítunk elő.
A jelen találmány vonatkozásában az itt leírt előnyös vagy konkrétabb foganatosításai módok egymással kombinálhatok, miáltal a találmány újabb előnyös foganatosításai módjaihoz jutunk.
Hacsak másképp nem definiáljuk, az összes műszaki és tudományos terminusokat a szakember számára szokásos értelemben használjuk (pl. sejttnyésztés, molekuláris genetika, nukleinsav kémia, hibridizációs módszerek és biokémiai szakkifejezései). A molekuláris, genetikai, biokémiai és kémiai eljárásokban standard módszereket használunk, (lásd általában, Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual második kiadás, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. és Ausubel és munkatársai: Short Protocols in Molecular Biology (1999) negyedik kiadás, John Wiley & Sons, Inc. - továbbá a Current Protocols in Molecular Biology teljes változata, melyeket a jelen leírás részének tekintünk.)
Az itt leírt eukarióta gazdasejt bármely eukarióta eredetű sejt lehet (akár primersejt, akár érett, kötött sejt), amely heterológ polipeptidek expressziójára adaptálható. Ez tehát a legtágabb értelemben lehet primer sejt valamely tenyészetben lehet szövet és szerv valamely szerv-kultúrában, szöveti implantátum, teljes organizmus és elfogadott sejtvonal. Az előnyös foganatosítási mód esetében elfogadott sejtvonalból származó sejttenyészetet jelent, mint amilyenek a CHO, BHK, COS és Hela sejtek.
A leírásban az expresszió a nukleinsav kódoló szekvenciából jellemzően a szekvencia transzkripciója/transzlációja útján végbemenő polipeptid-termelést jelenti. Az expresszálódott polipeptidet a gazdasejt kiválaszthatja (szekréció) vagy ezek a sejtben is akkumulálódhatnak; a jelen találmány esetében az expresszió előnyösen a sejtekből való polipeptid szekréciót jelenti. Az expressziós szint változó lehet, de előnyö
-”··· sen magas; a sejt által termelt össz-proteinnek kb. 1%-a, előnyösen 10%-a, 25%-a vagy akár 50 fölötti % is az expresszálni kívánt polipeptid lehet.
A rekombináns polipeptid bármely, rekombináns nukleinsav technikával előállítani kívánt polipeptid lehet. A polipeptid és a peptid polimerek, melynek monomerjei aminosavak, amelyek peptid- vagy diszulfid-kötéssel kapcsolódnak egymáshoz. A polipeptid megjelölés vonatkozhat akár a teljes hosszúságú természetes előfordulású aminosav-láncra vagy, ennek fragnesé-re vagy pl. egy olyan pepiidre, mely a szóban forgó polipeptid egy választott régióját képezi, és akár egy olyan aminosav-polimerre vagy ennek fragmensére vagy peptidjére, amely részben vagy egészben nem természetes előfordulású. Az ennek fragmense megjelölés egy olyan aminosavszekvenciára vonatkozik, mely a teljes hosszúságú polipeptidnek egy kb.8 - kb.500 aminosav hosszúságú része; ez előnyösen kb.8 - kb.300, előnyösebben kb.8 - kb.200, és még előnyösebben kb.1O - kb. 50 vagy 100 aminosav hosszúságú. Ha ez a polipeptid az Epo, akkor kedvező esetben ennek fragmensei kb.8 - kb.150 aminosav hosszúságúak, előnyösen kb. 15, 20 vagy 30 - kb.50, 100 vagy 130 aminosav hosszúságúak. A peptid megjelölés rövid aminosav-szekvenciára vonatkozik, amely 10-40 aminosav hosszúságú, előnyösen 10-35 aminosav hosszúságú. A láncban ezen kívül a természetben nem előforduló aminosavak, így pl. β-alanin, fenil-glicin és homoarginin is szerepelhetnek. A találmány értelmében használhatunk gyakran előforduló, nem génkódolt aminosavakat is. A találmányban alkalmazott aminosavak mindegyike lehet akár D-, akár L optikai izomer. Az L-izomerek az előnyösek. Ezenkívül más peptidomimetrikumok is hasznosak lehetnek pl. a jelen találmány szerinti polipeptidek linkerszekvenciáiban lásd Spatola, 1983, in Chemistry and Biocemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein, Marcel Dekker, New York, p. 267).
Alkalmas rekombináns polipeptidek pl. a gyógyszerészeti szempontból érdekes fehérjék, mint amilyen pl, az Epo, az alvadási faktorok (így pl. a Vili, és IX. faktor), a koagulációban szerepet játszó szerek (pl. a hirudin), a hormonok (pl. az inzulin, az emberi és állati növekedési hormonok, a folikuluszt stimuláló hormon, a lutenizáló hormon), az egyéb terápiás hatású proteinek, így az antitestek és más immunglobulinok, alfa-globin, béta -globin, gamma-globin, granulocita makrofág kolónia stimuláló faktor, tumor nekrózis faktor, interleukinek, makrofág kolónia stimuláló faktor, granulocita kolónia stimuláló faktro, maszt sejt növekedési faktor, p53 tumor szuppreszorral, interferonokkal, melanómával kapcsolatban hozható antigén vagy B7, és bármely más protein, melyet-főként nagyobb mennyiségben-expresszálni kívánunk.
A polinukleotid vektor olyan, nukleinsavakból felépülő vektor, melyet alkalmazva a nukleinsavat kódoló szekvenciát bejuttatjuk a sejt genomjába, ahol az integrálódik. A gazdasejt genomjába történő integrálódással a gazdasejt stabilan transzformált lesz; ilyenkor stabil integráció-ról beszélünk. A polinukleotid vektorok - melyeket az alábbiakban részletesebben is ismertetünk - lehetnek plazmidok, fertőző ágensek (vírusok, vírusszerű részecskék, virális nukleinsavak), kozmidok, fagomidok, transzpozonok, pakolt DNS vagy a nukleinsav bármely más formái, melyek alkalmasak arra, hogy a sejtekbe bejuttassuk őket.
Jellemzően plazmidokat alkalmazunk, mert ezek egyszerűen használhatók, a szakirodalomból jól ismertek és nem igényelnek olyan szabályozást, mint a fertőző ágensek, így pl. a vírusok. Az integrálódás vagy stabil integrálódás azt jelenti, hogy a vektor nukleinsav szekvenciájának legalább egy része integrálódik a gazdasejt genomjába vagy hogy az megmarad valamely kromoszómális szervben. Az az előnyös, ha legalább az első és második/harmadik nukleotid szekvencia integrálódik a gazdasejt genomjába. Kedvező esetben a vektor teljes szekvenciája integrálódik a gazdasejt genomjába.
A transzformáció azt jelenti, hogy genetikai anyagot juttatnak be egy sejtbe úgy, hogy a genetikai anyag megnyilvánul a most már transzformált-nak nevezett .·. '·. ** sejtben. Félreértések elkerülése érdekében közöljük, hogy ez nem a rákos transzformáció, amikor túlélő (immortalized) sejtek jönnek létre onkogén anyagok, onkogén vírusok és hasonlók hatására.
Az amplifikáció azt jelenti, hogy a kódoló szekvenciák kópiaszáma megnő valamely szelekciós nyomás hatására. így pl. ismeretes, hogy ha MTX-et szelekciós szerként alkalmazunk, ennek hatására a heterológ dhfr gén amplifikálódik és megnő a kópia szám azon a lokuszon, ahol ez a gazdasejt genomjába integrálódott. A dhfr génekhez kapcsolódó szekvenciák (vagyis azok a szekvenciák, amelyek ezekhez fizikailag közel vannak) együtt amplifikálódnak a dhfr génekkel. Ez a kívánt szekvenciák kópiaszámának növekedését és az általuk kódolt géntermékek expressziójának fokozódását eredményezi.
A szelekciós szerek jellemzően olyan ágensek, amelyek a sejteknél stresszt vagy más versenyhátrányt idéznek elő, hacsak nincs a sejtekben valamely olyan géntermék jelen, mely a szelekciós szer hatását gyengíti. Tehát: a metotrexát toxikus hatású a sejtekre, de ezt a hatást a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) - a dhfr gén génterméke semlegesíti. Az együtt amplifikálható rendszerek példái a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) metotrexát (MTX), a bakteriális xantin - guanin-foszforibozil transzferáz enzim (mely a 6-(4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxo-5-ftalanil)-4-metil-4-hexénsavval szembeni rezisztenciának a mediátor-anyaga); ezek a normális, funkcionáló gén jelenlétében amplifikálódnak (mint ahogy a glutamin-szintetáz amplifikálódik metionin-szulfoximin [MSX] jelenlétében). Az ilyen rendszerek önmaguk amplifikálódnak, mint ahogy a nukleinsav is önmaga amplifikálódik a rokon-típusú ágens részéről jelentkező szelekciós nyomás hatására.
Azon rendszerek példái, amelyeket önmagukban nem tekintenek amplifikálhatónak pl. az antibiotikum rezisztenciagének; ezek az antibiotikumokkal, pl. az amplicillinnel vagy a G-418/neomicinnel szembeni rezisztenciát adják.
A találmány szerinti vektorok - a szelekcióra alkalmas markerektöl eltekintve hasonló szekvenciával rendelkeznek. Az első szelekcióra alkalmas marker egy amplifikálható gén; a másiknak nem kell amplifikálhatónak lennie. A lényegében azonos kifejezés azt jelenti, hogy a szelektálható marker szekvenciát kivéve, ezek azonosak, vagy közel azonosak. A gyakorlatban a két vektor ugyanazon a kiindulási vektoron alapul és ebben a szelekcióra alkalmas marker gént cserélik ki. Tehát a fennmaradó szekvenciák azonosak lesznek, kivéve a spontán változásokat, melyek előfordulhatnak. Kedvező esetben a szekvenciák, kivéve a marker géneket a megfelelő szabályozó régiókkal együtt, több mint 85%-ban azonosak, előnyösen 90%-ban azonosak és még előnyösebben legalább 95, 98, 99%-ban vagy még teljesebb mértékben azonosak.
A. polinukleotid vektorok
A gazdasejtek előállítására szolgáló találmány szerinti eljárásban két lényegében azonos vektort viszünk be. Ezek lényegében azonosak; amiben különböznek, az a következő: az egyik vektor egy gént kódoló szekvenciát tartalmaz, mely a gazdasejt kromoszómájába integrálódik és a szelekció hatására amplifikálódik; a másik vektor egy másik szelekcióra alkalmas markert kódoló szekvenciát tartalmaz, pl. egy antibiotikum rezisztenciagént.
A második szelekcióra alkalmas marker önmagában előnyösen nem amplifikálható.
A vektorok, melyek jellemzően cirkuláris plazmidok (bár lineárisak is lehetnek), általában DNS molekulák. A vektorok szokásosan egy prokarióta eredetű replikációs régiót tartalmaznak, mely lehetővé teszi, hogy baktériumsejtben, pl. E coli-ban szaporodjanak.
Az első vektor tartalmazza az első nukleotid szekvenciát, mely lényegében egy expressziós kazetta, mely képes arra, hogy a kívánt rekombináns polipeptid (polypeptide of interest; POI), így pl. az Epo, eukarióta gazdasejtben, jellemzően valamely emlőssejtben történő expresszióját vezérelje. Tehát: az első expressziós kazetta tartalmazza a POI aktuális kódoló szekvenciáját működőképesen összekapcsoltan valamely szabályozó szekvenciával, mely vezérelni tudja a kódoló szekvenciának a gazdasejt általi expresszióját. A működésképesen összekapcsolt kifejezés azt jelenti, hogy a leírt komponensek olyan kapcsolatban vannak, mely lehetővé teszi, hogy az elvárt módon funkcionáljanak. A szabályozó szekvencia és a kódoló szekvencia között ligázzal úgy hozzák létre a működőképes összekapcsolódást, hogy a kódoló szekvencia expresszióját a szabályozó szekvenciákkal kompatibilis körülmények között lehessen elérni.
A Poi-t kódoló szekvenciával működésképesen összekapcsolt szabályozó szekvenciák példái a promoterek/növekedés indítók és más, az expressziót szabályozó szignálok, beleértve a transzkripció terminátort. A szabályozó szekvenciákat úgy változtathatjuk meg, hogy azok azzal a gazdasejttel, amelybe az expressziós vektort bejuttani kívánjuk, kompatibilisek legyenek. A promoter jól ismert szakszó, és beletartoznak azok a méret és komplexitás szempontjából eltérő nukleinsav-régiók, melyek a minimál promotertől a menetiránnyal ellentétes (upstream) elemeket és növekedés-indítókat (enhancer) is tartalmazó promoterekig terjednek. A promoter pl. származhat egy olyan sejt genomjából, mely sejtben az expressziót létre akarjuk hozni. Előnyösen virális promotereket használunk, mert ezek általában magas szintű transzkripciót hoznak létre. Az ilyen promoterek példái az SV40 korai promoter és ennek aktív fragmensei, a Molony egérleukémia vírus (Moloney murine leukemia virus; MMLV) hosszú szakaszon azonos összetételű (long terminal repeat; LTR)-promoter, a Rous-szarkóma virus (RSV) LTR-promoter vagy a humán citomegalovírus (CMV) IE-promoter.
Minthogy a vektorok replikációját szokásosan E. coli-ban folytatjuk le, a láncba előnyösen E. coli genetikai markert és E. coli replikációs origót építünk be. Ilyeneket E.
coli, plazmidokból nyerhetünk, mint amilyenek a pBR322, a Bluescript® vektor vagy valamely pUC plazmid és, pl. pUC18 vagy pUC19; ezek mind E. coli replikációs origót, mind E. coli genetikai markert (ez viszi be az antibiotikummal, pl. az ampicilinnel szembeni rezisztenciát) tartalmaznak.
Előnyös lehet, ha a promoter befolyásolható (inducible), olyan értelemben, hogy a POI expressziós szintje a sejt élettartama alatt szabályozható. Inducible azt jelenti, hogy a promoter alkalmazásával elért expressziós szint szabályozható. A szabályozó szekvenciákat pl. transzkripciós szabályozó elemekkel (pl. enhancer szekvenciákkal) módosíthatjuk, hogy a szabályozó szekvenciákkal vezérelt transzkripciós szint jobban reagáljon a transzkripciós modulátorokra. Kimérés promótereket is alkalmazhatunk, melyek a fent leírt különböző promóterek közül kettőből vagy többől is tartalmaznak szekvencia-elemeket.
Egy előnyös foganatosítás mód szerint a POI az eritropoetin, főként a humán Epo. A humán Epo-szekvencia a GenBank-ban M11319.1 számon hozzáférhető. Kívánatos lehet azonban a humán Epo-szekvenciába egy vagy több járulékos szénhidrát kapcsolódási hely bevitele, mint amilyenek pl. az US 5,856,298 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett [Asn60] Epo, [Asn125, Ser127]Epo, [Thr125]Epo és [Pro124, Thr125]Epo.
Az első vektor egy második nukleotid szekvenciát is tartalmaz, mely lényegében egy expressziós kazetta, amely a gazdasejt genomjába integráltan akkor amplifikálódik, amikor a gazdasejtet olyan szelekciós szerrel érintkeztetjük, amely a nukleotid szekvencia amplifikációjat idézi elő. Az eukarióta sejtek, főként az emlőssejtek bizonyos gének amplifikációját szelekciós nyomás, jellemzően valamely enzim inhibitor hatására bekövetkező reakció meglétekor, elő tudják idézni, s ez az adott gén kópiaszámának megnövekedését eredményezi, miáltal a gén expressziós szintje is megnő. Az addicionális génkópiák fenntartása történhet intrakromoszomálisan, vagy extrakromoszomális genetikai anyag, pl. minute kromoszómák formájában (áttekinthető ismertetést lásd: Genes VI., Lewin, 1997, Oxford University Press, Oxford, U.K. 975-978 oldal). Egy jól jellemzett példa a dihidrofolát-reduktáz gén, amely metotrexát (MTX) hatására amplifikálódik. További példák: a CAD-gén (mely az UMP szintézis első három lépésében szerepet játszó proteint kódolja), amely traszkarbamiláz inhibitorok hatására amplifikálódik; és a glutamin-szintetáz (lásd: WO 97/04462), amely metioninszulfoximin hatására amplifikálódik.
Ahogy az első expressziós kazatta, úgy a második expressziós kazetta is egy olyan gén aktuális kódoló szekvenciáját tartalmazza, mely képes amplifikálódni valamely szabályozó szekvenciával működőképesen összekapcsoltan, mely szabályozó szekvencia a kódoló szekvencia expresszióját vezérli a gazdasejtben.
A második vektor lényegében olyan, mint az első vektor, azzal a különbséggel, hogy a szelekciós nyomás (pl. dhfr) hatására amplifikálódó gént kódoló szekvencia helyett szelekcióra alkalmas markert, jellemzően az antibiotikum rezisztenciát közvetítő polipeptidet kódoló nukleotid szekvenciát pl. neomicin-foszfotranszferázt tartalmaz. A további antibiotikum-rezisztencia gének példái a puromicin- vagy hígromicinrezisztenciát kódoló gének.
A találmány egyik kulcsfontosságú jellemzője, hogy a két vektor lényegében csak abban különbözik egymástól, hogy második vagy harmadik nukleotid szekvencia van-e bennük. Anélkül, hogy valamilyen elmélethez kívánnánk kötni a kérdést, úgy véljük, hogy a két vektor közötti lényegi azonosság teszi lehetővé, hogy a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvencia amplifikálódjék. Míg a szelektálásra alkalmas markert kódoló harmadik nukleotid szekvencia a tenyészet primer szelekciójához markerként szolgál, addig a szelekciós nyomás hatására amplifikálódó második nukleotid szekvencia az integrálódott szekvenciák amplifikációját idézi elő, beleértve a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciáét is.
Nem szükséges azonban, hogy a vektorok második/harmadik nukleotid szekvencián kívüli régiói 100%-ban azonosak legyenek, mert kis mértékű különbség megengedhető. A vektorok második/harmadik nukleotid szekvencián kívüli szekvenciái jellemzően legalább 95, 98. vagy 99%-ban kell, hogy azonosak legyenek.
Mindazonáltal kényelmes olyan vektorokat alkalmazni, melyek a második/harmadik nukleotid szekvenciát leszámítva azonosak, mert így a gyakorlatban ugyanaz a vektor a klónozás alapja az első és a második vektor esetében is. Pl. egy, a második és harmadik nukleotid szekvenciát nem tartalmazó, de alkalmas klónozó helylyel rendelkező vektorból generálható a klónozó vektor, melybe a választható második vagy harmadik nukleotid szekvencia inszertálható.
B. A kívánt rekombináns polipeptidet expresszáló gazdasejtek előállítása
Az első és a második polinukleotid vektort bármely alkalmas módszerrel bejuttathatjuk a megfelelő gazdasejtbe. Pl. az emlőssejtek nukleinsav-felvételét számos ismert transzfekciós módszerrel, így pl. elektroporációval, vagy transzfekciós ágenst alkalmazó más módszerrel segíthetjük elő. Az ilyen ágensek példái a kationos szerek (pl. kalcium-foszfát és DEAE-dextrán) és a lipofektánsok (pl. lipofectam™ és transfectam™). A vektorokat jellemzően a transzfekciós szerrel kompozícióvá keverjük össze. Célravezető lehet, ha a második vektort feleslegben alkalmazzuk az első vektorhoz képest. Pl. az első vektor: második vektor keverési aránya 1:5 és 1:100 közötti, konkrétabban 1:10 és 1:50 közötti lehet.
Az előnyös gazdasejtek emlőssejtek, pl. rágcsáló vagy emberi sejtek, mint amilyenek pl. a CHO, BHK, COS és HeLa-sejtek. Különösen előnyösek a CHO-sejtek. Egy előnyös foganatosítási mód szerint a gazdasejtek kezdetben hiányosak a második nukleotid szekvenciában jelenlévő génre (pl. dhfr). Ilyen dhfr-re deficiens CHO sejteket Urlaub és Chasin írt le (PNAS, 77, 4216-4220, 1980) és ezek ATCC CRL-9096 szá mon hozzáférhetők az ATCC-nél. Ezeket a Budapesti Szerződés szerint ATCC PTA3672 deponálási számon az American Type Culture Collection-nál (ATTC; Rockville, Md. 20852, USA) 2001. augusztus 29-én helyezték letétbe. DNS-konstrukciók készítéséhez és a jelen találmány szerinti eljáráshoz felhasználható túlélő (immortalized) humán sejtvonalak további példái a következők: HT1080 sejtek (ATCC CCL 121) HeLa sejtek és HeLa sejt-származékok, (ATCC CCL 2, 2.1 és 2.2), MCF-7 emlőrák-sejtek (ATCC BTH 22), K-562 leukémia-sejtek (ATCC CCL 243), KB karcinoma-sejtek (ATCC CCL 17), 2780AD petefészek karcinoma-sejtek (Van dér Blick, A.M. és munkatársai., Cancer Res, 48:5927-5932 (1988), Raji sejtek (ATCC CCL 86), WiDr vastagbél adenokarcinoma-sejtek (ATCC CCL 218), SW620 vastagbél adenokarcinoma-sejtek (ATCC CCL 227), Jurkat-sejtek (ATCC TIB 152), Namalwa-sejtek (ATCC CRL 1432), HL-60-sejtek (ATCC CCL 240), Daudi-sejtek (ATCC CCL 213), RPMI 8226-sejtek (ATCC CCL 155), U-937-sejtek (ATCC CRL 1593), Bowes Melanoma-sejtek (ATCC CRL 9607), WI-38VA13 2R4 alfajhoz tartozó (ATCC CLL 75.1) és MOLT-4-sejtek (ATCC CRL 1582) valamint heterohibridóma sejtek, amelyek humán sejtek és valamely más fajból származó sejtek fúziójával készültek. Szekunder humán fibroblaszt törzsek, így pl. Wi-38 (ATCC CCL 75) és MRC-5 (ATCC CCL 171) is alkalmazhatók.
A transzfekciót végezhetjük szokásosan, mikrotiterü lemezeken, de más tenyésztő edényt is használhatunk. A transzfekciót követően a sejteket jellemzően szelekciós táptalajon (olyan táptalaj, mely szelektálja azokat a sejteket, amelyek a szelekciósra alkalmas markert expresszálják) tenyésztjük, míg össze nem folynak, majd a tenyésztést amplifikációs táptalajon folytatjuk; ez a táptalaj tartalmazza a második nukleotid szekvencia amplifikálódását kiváltó szelekciós szert, pl. az MTX-et. MTX eseo tében a szer jellemzően kb. 48 nM (4,8 x 10' M) koncentrációban van jelen.
Ezután a kiónokat - melyeket jellemzően a szelekciós szer ugyanazon vagy hasonló koncentrációja jelenlétében tenyésztünk - szelektáljuk és a rekombináns protein termelődése szempontjából pl. ELISA és/vagy immunfluoreszcens módszerrel szkineljük. A szkrin alapján választjuk ki a legtermelékenyebbeket.
Ideális esetben a szelektált kiónokat növekedési tulajdonságok, kromoszómális stabilitás, rekombináns polipeptid termelékenység és rekombináns protein aktivitás szempontjából tovább teszteljük.
A kromoszomális stabilitást vizsgálhatjuk sejt morfológiai és/vagy DNS-tartalom elemzési alapon (pl. Coulter számlálós DNS analízis). A nagyobb magvú kiónok általában a diploidénál nagyobb kromoszóma komplementtel rendelkeznek. Ezek a kiónok valószínűleg kevésbé stabilak és ezeket a kísérletekből kivonjuk. Azok a kiónok előnyösek, melynek magi DNS-tartalma lényegében azonos a szülői gazdasejt transzfekciót és szelekciót megelőző DNS-tartalmával.
A rekombináns protein termelékenységet a sejtekben és/vagy a tenyészet felülúszójában SDS-PAGE/Western biot technikával teszteljük (ott, ahova a protein szekretálódott; Epo esetében a felülúszóban végezzük a vizsgálatot). A tesztelést az MTX (vagy más, megfelelő szelekciós szer) egy adott tartományán belül végezzük. Célszerű, ha nemcsak a protein mennyiségét, hanem a protein keletkezési formáját is figyelemmel kísérjük (főként, ahol többféle izo-forma, pl. különbözőképpen glikozilezett izo-formák képződhetnek, mint pl. az Epo esetében).
A találmány szerinti eljárásban előnyösen egy vagy több további szubklónozási lépést is elvégzünk; ekkor a szelektált kiónokat a szelekciós szer növekvő koncentrációinak tesszük ki, s ez eredményezi a második nukleotid szekvencia amplifikálódását. A
Q dhrf és MTX rendszereseiében a kezdő klónozási lépések jellemzően 10’ M-os MTX koncentrációknál történnek, melyet ezután legfeljebb 10’6M koncentrációig növelünk.
Ezekben a további klónozási lépésekben tehát a sejt-klónokból próba tenyésztést végzünk a szelekciós szer (pl. MTX) koncentrációtartományban és meghatározzuk a rekombináns protein titerét. A szubklónozást előnyösen a szelekciós szer azon kon centrációjáig (vagy afölött is) folyatjuk, míg a szubklónok protein- termelésében már nem mutatkozik szignifikánst növekedés az alacsonyabb koncentrációkon mérthez képest. Ez az érték Epo és CHO sejtek esetében kb. 380 nM (3,8 x 10’7M). Egy előnyös foganatosítási mód esetében a sejteket a szelekciós szer progresszíven emelkedő koncentrációi jelenlétében tenyésztjük a kívánt legmagasabb koncentrációig.
A szubklónokat ezután tovább tesztelhetjük, hogy a tulajdonságaikat a fent leírt módon meghatározzuk. Adott esetben további szubklónozási lépéseket végezhetünk, jellemzően a szelekciós szer (pl. MTX) emelt koncentrációi mellett. A példákban 1,54 μΜ (1,54 x 10'6M) MTX jelenlétében végzünk egy szubklónozási lépést Más esetekben a MTX koncentrációja akár 10 μΜ (1 x 10’5M)-ra, vagy efölé is emelhető.
A talámány szerinti Epo-t expresszáló szelektált gazdasejtek előnyösen μg/106 sejt/nap értéket meghaladó mennyiségben termelnek Epo-t, 7,7 x 10’7M vagy 1,54 x 10'6 M MTX koncentráció mellett; még előnyösebb esetben ez az érték meghaladja a 20, 25 vagy 30 μg/105 sejt/nap-ot. Az is előnyös, ha a találmány szerinti gazdasejt magi DNS tartalma lényegében azonos a szülői gazdasejt transzfekció előtti magi DNS tartalmával (pl. egy CHO dhfr-sejt).
Célszerű lehet ha a találmány szerinti gazdasejteket szérummentes táptalajhoz adaptáljuk; erre jellemzően az utolsó szubklónozási lépés után kerül sor. Ezt úgy érjük el, hogy a táptalajra oltott sejteket összefolyásig tenyésztjük, majd a tenyésztő táptalajt szérummentesre cseréljük, vagy a szérum koncentrációt sorozatos átoltásokkal fokozatosan zéróra csökkentjük. Előnyös, ha a sejteket a növesztéshez is adaptáljuk szuszpenziós kultúra formájában.
A szelektált gazdasejtvonalakat folyékony nitrogénben standard módszerrel tartósítjuk.
····*··« ·
'.l·
C. Protein-termelés
A találmány szerinti gazdasejteket a kívánt rekombináns fehérje, pl. az rhEpo expresszálására használhatjuk. Transzfektált gazdasejtek alkalmazásával végzett polipeptid expresszálási eljárások a szakirodalomból ismertek. A tenyésztési körülményeket úgy választjuk meg, hogy az első nukleotid szekvencia a kívánt polipeptidet expresszálja. A jelen találmány értelmében előnyösen szuszpenziós kultúrát vagy rázópalackos kultúrát alkalmazó eljárással dolgozunk. A kívánt polipeptidet expresszáló gazdasejteket szelekciós szer (pl. MTX vagy megfelelő ezzel egyenértékű szer) jelenlétében vagy anélkül tenyésztjük. A gazdasejtek tenyésztését előnyösen szérummentes táptalajon végezzük.
A rekombináns proteint a tenyészet felülúszójából vagy tenyészetből nyert sejtpellétből nyerhetjük ki. (Epo expresszió esetében a tenyészet felülúszójából). A rekombináns proteint ezután jellemzően egy vagy több lépésben tisztítjuk (lásd pl. Broudy és munkatársai, 1988. Archives of Biochemistry and Biophysics 264, 329-336; Ghanem és munkatársai, 1994, Preparative Biochemistry 24(2), 127-142); a tisztítást pl. affinitás kromatográfia és/vagy ioncserés kromatográfia segítségével végezzük.
A rekombináns polipeptidet (konkrétan az Epo-t) tartalmazó kompozícióban, melyet a találmány szerinti gazdasejtek expresszálnak, s amelyből ezeket tisztítással nyertünk ki, a rekombináns polipeptid lényegében tiszta, pl. legalább 90%-os, 95%-os vagy 99%-os tisztaságú
A tisztított protein biológiai aktivitását in vitro és/vagy in vivo határozhatjuk meg. Egy alkalmas in vitro tesztet Hammerling és munkatársai írtak le [J. Pharm. Biomed. Anal 14(11), 1455-69 (1996)]; ez egy eritroid sejtvonal proliferativ stimulálására és ennek tesztelésére vonatkozik. Alkalmas in vivo tesztet Gharem és munkatársai ismertettek a fenti cikkben, ez policitémiás egerek vörös vérsejtjeibe bevitt 59Fe meghatározásá ra vonatkozik.
.u. .:λ ϊ: <*
A jelen találmány egyik előnyös foganatosítási módja szerint olyan sejttenyészetet alkalmazunk, ahol (a) tenyészetben lévő gazdasejtben a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló nukleotid szekvencia van jelen, mely szekvencia irányítja a kívánt rekombináns polipeptidnek a gazdasejtben végbemenő expresszióját; (b) szérummentes táptalaj van jelen, mely tartalmaz (i) vizet, növényi eredetű peptont, ozmózis nyomás szabályozót, puffért, energiaforrást, aminosavakat, lipidforrást, vagy prekurzort, vasforrást, vastól eltérő fémionokat, egy vagy több vitamint és kofaktorokat; és (ii) semmilyen teljes hosszúságú polipeptidet nem tartalmaz; és (c) a gazdasejteket a táptalajon olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik a kívánt rekombináns polipeptid expresszióját.
A kívánt rekombináns polipeptid előnyösen a humán eritropoetin. A gazdasejt kínahörcsög-ovárium (CHO)-sejt lehet. Ezeket a módszereket a jelen leírás példáiban írjuk le.
Az eritropoetin kinyerését/tisztítását a sejttenyészetböl a következőképpen végezhetjük: (a) a sejttenyésztö táptalajból a gazdasejteket, a sejtes elemeket és törmeléket centrifugálással (tányéros szeparátorral) és ezt követő mélységi szűréssel (depth filtration) eltávolítjuk, s kapjuk a tisztított táptalaj-felülúszót; (b) a felülúszó vezetőképességét 5 ms/cm-re vagy ennél kisebb értékre, a pH értéket kb. 7,0 - 8,0 értékre állítjuk be; (c) a b) lépésben kapott felülúszót anioncserélő töltettel ellátott kromatografáló oszlopra visszük, az oszlopot mossuk, az rhEpo-t eluáljuk, az elúciós csúcsnak megfelelő rhEpo frakciókat felfogjuk; (d) a c) lépésben kapott, az elúciós csúcsnak megfelelő rhEpo frakciókat egyesítjük és fordított fázisú kromatográfiás lépéssel tisztítjuk; ehhez olyan gyantát használunk, mely közepes nyomáson (< 10 bár) alkalmazható és ellenáll a nagy töménységű nátrium-hidroxidnak; az rhEpo-t az oszlopról szerves oldószerrel, lineáris gradienst alkalmazva, eluáljuk; (e) a d) lépésben eluált egy vagy több rhEpo tartalmú frakciót anioncserélö kromatografáló töltetet tartalmazó oszlopra visszük, az oszlopot mossuk, és az rhEpo-t lineáris só-gradienst alkalmazva eluáljuk; (f) az e) lépésben eluált rhEpo tartalmú frakciókból a szializáltság mértéke alapján egy vagy több frakciót kiválasztunk; és (g) az (f) lépésben eluált egy vagy több rhEpo tartalmú frakcióból gélszűrőt alkalmazó méret-kizárásos kromatográfiával távolítjuk el a potenciális dimereket és nagyobb aggregátumokat; és az rhEpo-tartalmú eluálumokat összegyűjtjük.
A c) lépésben használt anioncserélő előnyösen Q-HyperD F™ anioncserélő (gyártó: BioSepra), mely kerámia alapú. A d) lépésben alkalmazott polisztrol gyanta előnyösen Source 30RPC™ (Pharmacia) az e) lépésben használt anioncserélő pedi előnyösen Pharmacia Q Sepharose High Performance™. A g) lépésben használt gélszűrő előnyösen Pharmacia Superdex 75 (preparativ minőség).
A módszereket a jelen leírás példáiban írjuk le. A találmányt közelebbről a következő példákkal szemléltetjük, mely példák nem korlátozó jellegűek; nevezetesen a példák a jelen találmány előnyös foganatosítási módjai.
PÉLDÁK
Anyagok
Gazdaseitvonal
Kínaihörcsög-ovárium (CHO) dihidrofolát-reduktáz hiányos sejtek (ATCC CRL9096) Ezeket a Budapesti szerződés szerint ATCC PTA-3672 deponálási számon az American Type Culture Collection-nál (ATTC; Rockville, Md. 20852, USA) 2001. augusztus 29-én helyezték letétbe.
A sejttenyésztésnél használt táptalajok
Tenyésztő táptalaj: DMEM, kiegészítve a következőkkel: L-Glutamin, 4 mM, 10%FCS, HT (Hipoxatnin, Timidin) 1x
Szelekciós táptalaj: DMEM, kiegészítve a következőkkel: L-Glutamin, 4 mM, dializált FCS, 10% és G418, 0,5 mg/ml
Amplifikációs táptalaj: DMEM, kiegészítve a következőkkel: L-Glutamin, 4 mM, dializált FCS, 10% és G418, 0,5 mg/ml és MTX (metotrexát), 4,8 x10'8M- 1,54 x 10'6M.
Fagyasztó táptalaj: DMEM, kiegészítve a következőkkel: L-Glutamin, 4 mM, FCS 10% és DMSO, 10%.
Szérummentes adaptációs táptalaj a rekombináns sejtvonalakhoz: 1:1 DMEM/Ham-féle F12, kiegészítve a következőkkel: L-Glutamin, 6mM, szója pepton/UF, 0,25%, Hibridóma kiegészítő, 1x, Pluronic-F68, 0,1%, G418, 0,5 mg/ml, MTX, 1,54x 10'6M szérummentes termelő táptalaj: 1:1 DMEM/Ham-féle F12, kiegészítve a következőkkel: szója pepton/UF, 0,25%, Hibridóma kiegészítő, 1x, Lutrol, 0,1%, MTX, 1,54 x 10'6M, glükóz, 1g/l és NaHCO3, 2,5 g/l szérummentes fagyasztó táptalaj a rekombináns sejtvonalakhoz: PBS, PVP-10, 20%, DMSO, 5%, hibridóma kiegészítő, 100 x etanolamin, 2,5 x 10’3M, vas(lll)-citrát, 2,5 x 10'2M, L-aszkorbinsav, 2,0 x 10‘3M, nátrium-szelenit, 5,0 x 10'6M.
Plazmid konstrukciók pEpo/neo
Ez a plazmid kódolja az Epo kódoló régióját és a neomicin rezisztencia gént két különböző expressziós kazetta részeként; mindegyiket SV40 korai promoter/terminátor szekvencia szabályozza. A konstrukció részleteit az 1. példában ismertetjük.
pEpo/dhfr , · · · · * 24 .:..3...:..
Ez a plazmid kódolja az Epo kódoló régióját és a dhfr-t két különböző expressziós kazetta részeként; mindegyiket SV40 korai promoter/terminátor szekvencia szabályozza. A konstrukció részleteit a 2. példában ismertetjük.
A sejttenyésztésnél alkalmazott módszerek A CHO-dhfr növesztése
Dihidrofolát-reduktáz hiányos CHO-sejteket (Urlaub és munkatársai: 1980, PNAS 77 (7), 4216-4220) DMEM tenyésztő táptalajon növesztünk heti kétszeri 1:10 arányú megosztással (elvétellel).
A CHO-sejtek transzfektálása cm2-es palackokba (T-flask bottle) vagy 96-lyukú lemezekre cm2-enként 1-5x104 sejtet oltunk a lipofektin transzfekciót megelőző napon. A megfelelő plazmidokat megfelelő arányban összekeverjük és a gyártói utasításnak megfelelően a lipofektin reagenshez (GIBCO/BRL) adjuk (0,5-1 μΙ/cm ). Ezután a sejteket befedjük 4-16 órára a szérummentes DMEM-ben lévő transzfekciós koktéllal, mielőtt a DNStartalmú táptalajt tenyésztő táptalajra cserélnénk. Majd miután a sejteket 24-48 órán át szérumtartalmú táptalajon tenyésztettük, a sejteket szelektív táptalajra visszük át. A transzfektált sejtállományt először a sejtek összefolyásáig szelektív táptalajon, majd amplifikációs táptalajon (4,8 x 10'8M MTX) tenyésztjük, majd a sejttenyészet felülúszóját ELISA-módszerrel Epo-termelés szempontjából szkrineljük. Meghatározzuk, melyek a legjobb termelők, az MTX-koncentrációt kétszeresére növeljük és a legjobb termelő sejteket tenyésztjük tovább.
* · · ··· · u.· .:<♦ ·./
Analitikai módszerek
ELISA-módszer Epo kimutatására különböző mátrixokban
Antitestek:
poliklonális szérum: nyúl-anti Epo, biotines (R&D Systems; katalógus szám: AB286-NA) monoklonális antitest: egér-anti Epo (Genezyme: katalógus kód: AE7A5)
EILISA pufferek:
Bevonó puffer:: 8,4 g/l nátrium-hidrogén-karbonát, 4,2 g/l nátrium-karbonát, pH 9,6-9,8 Mosó puffer: 0,2 g/l kálium-klorid, 1,15 g/l dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát,
0,2 g/l kálium-dihidrogén-foszfát, 8 g/l nátrium-klorid, 0,1% Tween20 Hígító puffer: 2% polivinilpirrolidon (Sigma; kat.szám: PVP-40T) a mosópufferben Mintázó puffer: 0,5% α-monotio-glicerin, hígító pufferben
Festő puffer: 7,3% g/l citromsav-dihidrát, 11,86 g/l dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát, pH 4,8-5,0
Festő oldat: 100 μΙ o-feniléndiamin oldat/10 ml festő puffer és μΙ hidrogén-peroxid/10 ml festő puffer o-feniléndiamin törzsoldat: PP:L0017.
Módszer
Az alkalmazott ELISA-módszer ng/ml koncentrációkban mutatja ki az Epo-t; nevezetesen a kimutathatósági határ kb. 10 ng/ml nagyságrendben van, 500 ng/ml-röl indulva és a nyolc kétszeres hígítást végezve. Az egyik monoklonális antitest az Epo első 26 aminosavjának bevonó rétegeként kötődik az Epo-hoz. A következő lépésben az Epo specifikusan az enzimmel összekapcsolható antitesthez kötődik. A kimutatás alapja, hogy a nyúl antiszérum felismeri a biotines Epo-t. A kapcsolódást úgy tesszük .ή. .:λ ->
láthatóvá, hogy az anyagot sztreptavidin-peroxidázzal a lemezhez kötjük, majd ofeniléndiaminnal megfestjük.
Immunfluoreszencia
6-lyukú lemez fedősávjára 5 x 104 sejt/200 μΙ Epo-t expresszáló CHO-sejtet oltunk és a lemezt 24-72 órán át inkubáljuk. Az adherens sejteket PBS-sel (foszfáttal pufferolt sóoldat) kétszer mossuk, 5 percig -20°C-os metanollal fixáljuk, levegőn megszárítjuk, majd PBS-sel újra átöblítjük. A nem specifikus fehérjéket 20% borjúembrió szérumot (FCS) tartalmazó PBS-sel inkubálva telítjük, majd 1 órán át az anti-Epo-t inkubáljuk. A reakciót fluoreszcein-izotiocianáttal (FITC) konjugált anti-egér IgG-vel tesszük láthatóvá. A fluoreszcenciát konfokális mikroszkóppal (gerjesztési hullámhossz:488 nm, emissziós hullámhossz 515 nm fölött) mutatjuk ki.
Sejtmag-méret meghatározás
Anyagok p
Coulter Counter , ZM modell (Coulter Electronics Inc).
p
Coulter Channelyzer , modell 256
Inkubáló oldat: Citromsav, 0,1 M, TritonxIOO, 2%
Izotóniás elektrolit (katalógus szám: 844 8011; Coulter Euro Diagnostic GmbH) Az elektromosan vezetőképes folyadékban szuszpendált részecskéket
Coulter-számlálóval méret és szám szerint osztályozzuk. A folyadékot vákummal mindkét oldalán elektróddal ellátott kapillárisba juttatjuk. Az ellenállás-változásra jellemző feszültség impulzust a Coulter Channelizer-rel digitalizáljuk. A sejtmagméret korrelációban van a sejtek DNS-tartalmával, s ez teszi lehetővé a diploid és poliploid kromoszómák megkülönböztetését.
Módszer « · ··* ·
-·.·»-.:.. -··/
Közelítőleg 1 x 106 CHO-sejtet PBS-sel egyszer átmosunk, majd a sejteket 2 ml inkubációs oldatban szuszpendáljuk és 4-5 órán át az oldatban hagyjuk. A Coulter Counter a következő specifikus lépésekkel dolgozik:
SDS-poliakrilamid-elektroforézis és Western-blot módszer
Anyagok
SDS-gélek: Novex Trisz-glicin 4-20%
Mintázó puffer: Trisz glicin SDS 2x (Novex LC 2676)
Futtató puffer: Trisz glicin SDS (Novex LC 2675)
Blot puffer: NaB4O7· 10 H2O, 50 mM, SDS, 0,1%, metanol, 20%
Biot mátrix: PVDF Immobilon P 0,45 μΜ (Millipore; K8JM8238H).
Mosópuffer: lásd: ELISA mosópuffer
Hígító puffer: 1% tejport tartalmazó mosó puffer
Detektáló puffer: nátrium-klorid, 0,1 M, Trisz-HCI, 0,1M, pH 9,5
Módszer
Az Epo-tartalmú mintákat 30 ng/20 μΙ koncentrációjú 1x-es mintázó pufferben, mely 1% oc-MTG-t tartalmaz, visszük fel az SDS-gélre. Az elektroforézis után a fehréjékről PVDF immobilon membránon lenyomatot (biot) készítünk, 2 óra elteltével az Epo-t - az Epo első 26 aminosavjának kimutatására alkalmas monoklonális antitesttel - specifikusan megfestjük. A kötődést alkálikus foszfatázzal konjugált anti egér IgG segítségével és NBT/BCIP festéssel tesszük láthatóvá.
Izoelektromos fókuszálás
Anyagok:
Rendszer: Multiphor II (Amersham Biossiences)
IPG-gél: pH 2,5-7 * Μ* * »·’ ·* *··* ·*
Duzzasztó puffer: 9 g karbamid, 0,5 g CHAPS, 0,04 g DTE, 0,5 ml resolyte (pH 3,5-10), 10 μΙ brómfenol-kék (0,1%), vízzel 25 ml-re kiegészítve.
Mintázó puffer: IPG mintázó puffer (pH 3-10), 25 μΙ 625 μΙ vízben.
Blot-készítésnél használt puffer: 2,93 g glicin, 5,81 g Trisz, 20 ml metanol,
0,375 g SDS, 1000 ml-re vízzel kiegészítve
Biot mátrix: PVDF Immobilon P 0,45 μΜ (Millipore; K8JM8238H)
Mosó puffer: lásd: ELISA mosópuffer
Hígító puffer: 1% tejport tartalmazó mosópuffer
Detektáló puffer: nátrium-klorid, 0,1M, Trisz-HCI, 0,1 M, pH 9,5.
Módszer:
Az Epo-tartalmú mintákat (500-1000 ng/50 μΙ), sómentesítve, mintázó pufferrel 1:1 arányban hígítva visszük fel a duzzasztott állapotú IPG-gélre. A vizsgálatnál az első percben 300 V-ot alkalmazunk, majd a feszültséget lineárisan növeljük és 1 óra alatt érjük el a 3500 V-ot. A fókuszálási eljárás teljes időtartatamára 10 mA és 10 W limitet állítunk be. Ezután a fehérjékről PVDF immobilon membránon lenyomatot készítünk (egy éjszakán át tartó diffúzió vagy elektroblot), majd az Epo-t - az Epo első 26 aminosavjának kimutatására alkalmas monoklonális antitesttel - specifikusan megfestjük. A kötődést alkálikus foszfatázzal konjugált anti egér IgG segítségével és NBT/BCIP festéssel tesszük láthatóvá.
DNS-tartalom meghatározása
A rekombináns sejtvonalak DNS-tartalmát a CHO-dhfr gazdasejtvonalával FACS (flurescence activated cell sorter) analízissel hasonlítjuk össze.
Anyagok:
Mosó puffer: 0,1 M Trisz-HCI (pH 7,4), 2 mM magnézium-klorid, 0,1% Tritonx100 Festő puffer: 0,3 pg/ml DAPI (Höchst) a mosópufferben * · · · · · * · 29 .ή. .ű. %?
Módszer
5x105 sejtet PBS-sel mosunk és jéghideg 70%-os etanollal fixálunk. Ezután a sejteket mosópufferrel kétszer átmossuk, majd a festő pufferben 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. A DNS-tartalmat FACS Vantage készülékkel (Becton and Dickinson) 359 nm gerjesztési és 450 nm emissziós hullámhossznál mérjük.
In vitro specifitási teszt
A TF-1 humán eritroleukémiás sejtvonal (German Colluction of Microorganisms and Cell Cultures) növekedése IL3-vagy 4GM-CSF-függő. Ezek a citokinek szinergetikus hatással vannak a szaporodásukra, ugyanakkor az Epo bizonyos ideig megtartja életképességét. A sejteket rutinszerűen GM-CSF-et és Epo-t tartalmazó táptalajon növesztjük.
A teszthez használt kiegészítők:
Tenyésztő táptalaj: RPMI 1640 táptalaj, mely a következő adalékokat tartalmazza: 4mM glutamin (Gin), 10% FCS, 20 μg/ml transzferrin, 10 μΜ β-merkaptoetanol, 12 ng/ml rhGM-CSF és 3 egység/ml rh Epo.
Teszt táptalaj: RPMI 1640 táptalaj, melynek kiegészítői: 4 mM Gin, 100 pg/ml transzferrin és 2 mg/ml BSA (bovine serum albumin).
Módszerek
A funkcionalitási tesztet 96-lyukú lemezeken az MTT életképességi teszt (Hamemrling és munkatársai: 1996, J. Pharm. Biomed, Anal. 14 (11), 1455-69) mintájára végezzük. A mintákat 1:2 arányban hígítjuk nyolc alkalommal, 100 ng Epo per ml teszt-táptalaj szintről indulva. Minden egyes hígításból, a standard hígításból és a vakból 50 μΙ-t visszünk fel a 96-lyukú teszt-lemezre. A TF-1 sejteket háromszor hideg PBS30 X .:λ λ*1·.?
sel mossuk, majd a teszt-táptalajt 2x105 sejt per ml teszt-táptalaj értékűre állítjuk be. A 96-lyukú lemez minden mélyedését 50 μΙ ilyen sejt-szuszpenzióval borítjuk be és a tenyészetet 72 órán át széndioxid atmoszférában inkubáljuk. Ezután a tenyészethez 10 μΙ MTT (tiazolil-kék)-oldatot adunk (6 mg/ml, PBS-ben) és az inkubálást 37°C-on 4 órán át folytatjuk. A festéket 100 μΙ SDS/HCI-lel (10% SDS 0,1 M sósav-oldatban) oldjuk ki újabb 4 óra alatt, sötétben, majd az Epo-függö életképesség mértékét fotometrikusan 550/690 nm-nél meghatározzuk.
1. Példa: Az Epo/neo plazmid létrehozása
1. A p2-neo létrehozása
1.1 . Vektor fragmens előállítása pSV2neo-ból, mely vektor az SV40 korai promptért tartalmazza
A vektor létrehozásának alapja a pSV2neo-ban lévő pBR322 plazmid-váz (backbone). A kisebbik EcoRI-Pvull restrikciós fragmens tartalmazza a pBR322 vázat és a szomszédos Pvull-Hindl11 fragmenst, mely tartalmazza a SV40-böl származó SV40 korai promoted:.
A pSV2 neo plazmidot (ATCC 37149) EcoRI és HindiII restrikciós enzimmel hasítjuk. A két kapott fragmens 3092 bp és 2637 bp hosszúságú. A 2637 bázispár hoszszúságú fragmensben van benne az EcoRI-Pvull restrikciós fragmens, mely a pBR322 vázat és a szomszédos Pvul l-Hind 111 fragmenst tartalmazza, benne az SV40 korai promoter egy fragmensével. A 2637 bp fragmenst kinyerjük és gél-elektroforézissel tisztítjuk.
1.2 . A neomicin rezisztenciaqén előállítása
A neo-gént a pSV2 neo Tn5 transzpozonjából nyerjük. Ezt amplifikáljuk mint olyan fragmenst, mely a génnek csak a kódoló régióját tartalmazza. A klónozási stratégia részeként ennek mindkét végére, a restrikciós endonukleázokat felismerő helyeket
visszünk be. A Hindin felismerő helyet az Upstream (menetirányban) amplifikációs primerbe építjük be, az EcoRi és a Spel felismerő helyet pedig a downstream (menetiránnyal ellentétes) primerbe. Az amplifikált régió az pSV2 neo szekvenciájában a 2846-tól a 1938-ig terjedő nukleotidszekvenciának felel meg (Génbank hozzáférési szám: U02434). Az oligonukleotidokat a következőképpen jelöljük.
Oligo 2001-01: hossz: 38mer
5' - ggg gga age ttg ttg gga age cet gca aag taa act gg - 3' SEQ.ID.No.1
5’ Hindiik aaqctt - q (= 2846 os pozícióba pSV2neo-ban) ttggaagccctg SEQ.ID.No.2
Oligo 2004-02: hossz 42 mer
5’- ggg gaa ttc act apt gag tcc ege tea gaa gaa etc gtc aag - 3' SEQ.ID.No.3
5' EcoRI/Spel:
gaa ttc actagt - g (=1938-os pozícióba pSV2neo-ban) agtcccgctcagaa SEQ.ID.No.4
A 2004-01 és 2004-02 primer amplifikációs termékét PCR-módszerrel (polimeráz láncreakcióval), Pwo polimerázt (Roche Diagnostics) alkalmazva állítjuk elő. Az eljárási paraméterek a következők: 20 ng pSV2neo, az egyes primerekből 10-10 pmol, 10 nmol dNTPs, 2,5 egység Pwo polimeráz, a gyártótól kapott pufferrel 50 μΙ-re kiegészített össztérfogat. Hőmérsékleti profil: 5 perc 95°C, 35-ször (30 sec 95°C, 20 sec 65°C, 90 sec 72°C), 3 perc 72°C, tárolás 4°C-on a további felhasználásig.
A kapott 935 bp hosszúságú DNS-fragmenst DNS izoláló oszlopon (Mini, Wizard Promega GmbH), tisztítjuk, EcoRI és Hindlll enzimmel emésztjük, agaróz gélen tisztítjuk, Spin oszlopot (Supelco) alkalmazva eluáljuk.
1.3 A p1-neo létrehozása
Az amplifikált EcoRI-HindlII neo-gén fragmenst a pSV2-neo-ból származó EcoRI-Hindlll vektor-fragmenssel enzimatikusan a Ligation Express (Clontech) ragasztjuk össze (ligáljuk), s ezt egy E.coli gazdaszervezetbe (E.coli SURE (stratagen) transz-
formáljuk. A transzformált sejteket 50 mg/l ampicillint tartalmazó LB táptalajon növesztve szelektáljuk.
A plazmid-DNS-t a klónokból izoláljuk és felépítésüket EcoRI és Ncol alkalmazásával restrikciós analízissel ellenőrizzük (3 fragmens, 2527 bp, 780 bp és 251 bp hoszszúsággal). A várt fragmenseket tartalmazó plazmid-DNS-t további vizsgálattal ellenőrizzük: a konstrukciók releváns részeit szekvenáljuk. A bizonyítottan SV40 korai promoted és neomicin rezisztenciagént tartalmazó plazmid-DNS-t p1-neo-nak nevezzük.
1.4 Az SV40LTpolyA/IVS jelzésű SV40 terminátor előállítása
Polimeráz láncreakcióban használt primereket terveztünk a pSV2neo-ban jelenlévő SV40 terminátor régió egy fragmensének (a 751-től 1598-ig menő nukleotidszekvencia) amplifikálásához. Az upstream primer egy Spel hasítási helyet is tartalmaz. A pSV2neo 751. pozíciójában már jelenlévő BamHI hasítási helyen kívül egy EcoRI hasítási helyet is be kell építeni a downstream primerbe; ezt egy 6 nukleotidból álló térkitöltő szekvencia választja el a BamHI-től. A két primer szekvenciája a következő: Oligo 2004-05: hossz 40 mer 5' - ggg gac tag ttt gtq aag gaa cet tac ttc tgt ggt gtg a - 3' SEQ.ID.No.5
5' Spel: actag -1 (= 1598 pozíció a pSV2neo-ban) ttgtgaagga SEQ.ID.No.6
Oligo 2004-06: hossz: 46 mer
5'- ggg gga att egg agg ggg ate cag aca tga taa gat aca ttg atg a - 3' SEQ.ID.No.7 5' EcoRI/BamHI: gaatte - g (=751 pozíció a pSC2neo-ban) gatcc agacatgataag SEQ.ID.No.8
A 2004-05 + 204-06 primerek amplifikációs termékét a Pwo polimeráz (Roche Diagnostics) alkalmazásával PCR-módszerrel állítottuk elő a fent leírt módon. A kapott, ··'V < 4 * V ·*♦· λ,, ·*'- >.
873 bázispár hosszúságú DNS-fragmaenst DNS izolálásra rendszeresített oszlopon tisztítjuk, EcoRI és Spel enzimmel emésztjük és gélen tisztítjuk.
1.5 p2-neo előállítása p1-neo plazmid-DNS-t EcoRI + Spel enzimekkel emésztjük. A kapott linearizált fragmest tisztítjuk, az SV40LTpolyA/IVS-t tartalmazó amplifikált fragmenssel ligálással összekapcsoljuk és E.coli gazdasejtbe transzformáljuk. A transzformált sejteket 50 mg/l ampicilinnel kiegészített LB-táptalajon növesztve szelektáljuk.
A klónokból izolált plazmid-DNS felépítését restrikciós analízissel EcoRI (1 fragmens 4411 bp hosszúsággal), Ncol (2 fragmens 3631 bp és 780 bp hosszúsággal) és Sphl (3 fragmens 3499 bp, 840 bp és 72 bp hosszúsággal) alkalmazásával vizsgáljuk. A várt fragmenseket tartalmazó plazmid-DNS-eket a konstrukció releváns részeinek szekvenálásával tovább vizsgáljuk. A bizonyítottan SV40LTpolyA/IVS-t tartalmazó plazmid-DNS-t p2-neo-nak nevezzük.
2. A p3 plazmid létrehozása
2.1 Az SV40 korai promoter fragmens előállítása
Az SV40 korai promoter fragmenst a pSV2neo plazmidból állítjuk elő. A fragmens mérete majdnem azonos azzal, amelyből a p2 plazmidot konstruáltuk. A fragmens végeket azonban úgy módosíthatjuk, hogy ott BamHI és Notl felismerő helyeket alakítunk ki. A promoter amplifikáláshoz használt oligunokleotid primereket a követ kezőképpen terveztük meg:
Oligo 2004-07: Hossz: 38 mer
5'- ggg ggg atc ctg tgg aat gtg tgt cag tta ggg tgt gg - 3' SEQ.ID.No.9
5' BamHI: ggatcc-t (=3435 pozíció a pSV2neo-ban) gtggaat....... SEQ.ID.No. 10
Oligo 2004-08: Hossz: 46 mer
5'- ggg ggc ggc ege age ttt ttg caa aag cet agg cet cca aaa aag c - 3' SEQ.ID.No. 11 .·*. *’*, /% •'S * · » ·Μ „ 34 <*·* »5·· ·*·- *
5' Noti: qcqqccqc - a (=3093 pozíció a pSV2neo-ban) gctttttgcaaaag... SEQ.ID.No.12 A 2004-07 + 2004-08 primerek amplifikációs termékét polimeráz láncreakcióval, Pwo polimerázt (Roche Diagnostics) alkalmazva a fenti módon állítottuk elő. A kapott, 365 bp hosszúságú DNS-fragmenst DNS izolálásra rendszeresített oszlopon tisztítjuk, BamHI és Notl enzimmel emésztjük és gélen tisztítjuk.
2.2 A pBluescript vektor-rész előállítása pBluescript II Sk + DNS-t egymást követően BamHI illetve Notl enzimmel hasítunk. A DNS-t alkálikus foszfatázzal defoszforilezzük. A BamHI/Notl fragmenst a kis fragmensből agaróz-gélelektroforézissel végzett tisztítással nyerjük, s ezután használjuk fel ligáláshoz.
2.3 A p3 plazmid előállítása és felépítésének igazolása
Az amplifikált BamHI-Notl fragmenst - amely az SV40 korai promotert tartalmazza - T4 DNS-ligáz (Promega GmbH) segítségével kapcsoljuk össze az előállított pBluescript II Sk + vektorral. Az E. Coli SURE (Stratagene) transzformált sejtekből a plazmid-DNS-t izoláljuk és 100 mg/l ampicillinnel kiegészített LB táptalajon növesztett telepekből tisztítva kinyerjük.
A kapott DNS-t EcoRI plusz Ncol restrikciós analízissel (2 fragmens, 3039 bp és 253 bp hosszúsággal) vizsgáljuk. A várt fragmenseket szolgáltató két plazmid-DNS-t ezután szekvenálással tovább vizsgáljuk. Az SV40 korai promoter mindkét szálát szekvenáljuk, hogy minden pozíció igazolt legyen. A kapott plazmidot p3-nak nevezzük.
3. A humán Epo cDNS izolálása
3.1 Az ossz RNS izolálása TRIzol® reagenssel
Az Epo RNS-t emberi veseszövetekböl (melyeket a Lainzer Krankenhaus-tól kaptunk) TRIzol® reagenssel izoláltuk, mely reagens fenol és guanidin-izotiocianát egy35 fázisú oldata. A sejt-lízis során a guanidin-izotiocianát vízoldható komplexet képez az RNS-sel, miközben a sejtek fölrepednek. Kloroform hozzáadása és centrifugálás után két fázisra válik szét a rendszer: az RNS-t tartalmazó vizes és egy szerves fázisra. A vizes fázist elválasztjuk, abból az RNS-t izopropanollal kicsapjuk, etanollal mossuk, levegőn megszárítjuk és RNS-áz-mentes vízben újra szuszpendáljuk.
Az emberi veseszövet fragmenseit kis darabokra aprítjuk, 100 μm-es sejtszűrőn átpréseljük, centrifugáljuk (179 x g/10 perc), a kapott pelletet háromszor PBS-sel mossuk. A pelletet ezután PBS-ben újra szuszpendáljuk, steril csövekbe szétosztjuk, -196°C-ra lefagyasztjuk és a további felhasználásig -80°C-on tároljuk.
A fagyott szövetet 1 ml TRIzol® hozzáadásával lizáljuk, homogenizáljuk és 5 percig 15-30°C-on inkubáljuk, hogy a teljes disszociációt biztosítsuk. Ezután a csövekbe 200 μΙ kloroformot adunk, a csöveket rázogatjuk, 2-3 percig 15-30°C-on inkubáljuk, majd 12000 x g-vel 10 percig centrifugáljuk. A centrifugálás után a felső vizes fázist vigyázva friss csőbe visszük át, 500 μΙ izopropanollal összekeverjük és 10 percig 1530°C-on inkubáljuk. A kicsapódott RNS-t centrifugáljuk (12000 x g, 10 perc), a pelletet etanollal mossuk, újra centrifugáljuk, levegőn megszárítjuk, és RNS-áz-mentes DEPC-vízben oldjuk. Az ossz RNS-tartalmat fotometrikusan, 260 nm-nél mérjük.
OD260nm = 40 μg RNS/ml
Az OD260nm és OD28nm (a proteinek abszorbancia maximuma) arányából az izolált RNS tisztasága becsülhető. Ez 1,6 és 1,8 közötti kell, hogy legyen.
3.2 mRNS izolálása Dynabeads Oligo (dT)25 segítségével
Az Dynabeads Oligo (dT)25 az mRNS elkülönítéséhez használt direkt kit és úgy működik, hogy az eukarióta mRNS poliadenozinos farok-RNS részét hibridizációs technikával olyan szupermágneses polisztirol részecskékhez köti, mely részecskék felületén kovalensen kötött 25 nukleotid hosszúságú dezoxi-timidilát-lánc helyezkedik el. A mág neses gyöngyökön megkötött mRNS-t Dynal mágneses részecske koncentrálóval (Dynal magnetic particle concentator; Dynal MPC®) szeparálhatjuk.
Mosó puffer: Trisz-HCI 100 mM, pH 8,0; LiCI, 0,15 mM; EDTA 1 mM 2x kötöpuffer: Trisz-HCI 20 mM, pH 7,5; LiCI 1 mM; EDTA 2 mM.
μg ossz RNS-hez 100 pl Dynabeads Oligo (dT)25-t különítünk el
Dynal MPC®-ben, és ezt 2x mosó-pufferrel kétszer átmossuk. Közben az ossz RNS térfogatát 200 μΙ-re állítjuk be 1x mosó-pufferrel és 65°C-on végzett 4 perces inkubálással az RNS-t denaturáljuk. Ezután az RNS-t a gyöngyökkel összekeverjük, a keveréket 5 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd Dynal MPC®-ben elkülönítjük. A gyöngyöket 1x mosó-pufferrel kétszer mossuk. A Dynabeads Oligo (dT)25-t ezután az eluciós-pufferrel (2x 10 μΙ) 4 percig 65°C-on inkubáljuk, s eközben a poliadenilezett RNS eluálódik. A gyöngyöket Dynal MPC®-ben elválasztjuk és a felülúszót azonnal új RNS-áz mentes mikrocentrifugacsövekbe visszük át. Az eluátum közvetlenül felhasználható a reverz transzkripcióhoz.
3.3 . Reverz transzkripció
Az Epo-specifikus prímért 80°C-on végzett 4 perces inkubálással denaturáljuk, az mRNS-t pedig 65°C-on végzett 5 perces inkubálással. Jegelt, 1,5 ml-es steril mikrocentrifugacsöbe a következő komponenseket tesszük:
Reagens Végkoncentráció
mRNS 10 μΙ
MMLV (200 Ε/μΙ) 0,25 μΙ
Boehringer PCR puffer (10x) 2 μΙ
dNTPs (10 mM) 2 μΙ
MgCI2 (50 mM) 1 μΙ
Epo for (100 pmol/μΙ) 1 μΙ
DTT (0,1 M) 0,25 μΙ
RNS-áz inhibitor (40 Ε/μΙ) 0,25 μΙ
h2o 3,25 μΙ
Inkubáció: 60 perc, 37°C
Inaktiválás: 5 perc, 100°C
3.4 Polimeráz láncreakció
1,5 ml-es 4°C-on tartott steril mikrocentrifugacsöbe a következő komponenseket tesszük:
Reagens Epo
Templát cDNs Epo 5 μΙ
polimeráz Vent 1E (0,5 μΙ)
polymeráz buffer (10x) Vent puffer 1 x (10 μΙ)
dNTPs (10 mM) 200 μΜ (2 μΙ)
MgCI2 (50 mM) /
Primer előre (10 pM) 30 pM (3 μΙ)
Primer visszafele (10 pM) 30 pM (3 μΙ)
DMSO /
H2O 76,5 μΙ
A PCR-módszer paraméterei a következők:
PCR-ciklus
1. Denaturáció 95°C 2 perc
2. Denaturáció 94°C 45 sec
3. Primer megolvasztása 58°C 30 sec
4. Kiterjedés 72°C 1 perc
5. Befejező kiterjedés 72°C 10 perc
6. Ciklusok száma 30
A PCR-rel lefolytatott amplifikáció termékeit agaróz gélelektroforézissel elemezzük.
3.5 Agaróz qélelektroforézis x BX puffer: brómfenol-kék 0,25%; xilol cianol 0,25 %, glicerin 30%.
TAE puffer: Trisz bázis 242 g; jégecet 57,1 ml; EDTA (0,5 M, pH 8,0) 100 ml;
vízzel 1000ml-re kiegészítve.
Lambda-marker III: 10 pg bakterofág, lambda-vadtípus-Dann
2,5 μΙ Hindlll + 2,5 μΙ EcoRI + 20 μΙ puffer R (Fermentas), vízzel
200 μΙ-re feltöltve;
óra emésztés 37°C-on; 20 perc inaktiválás 65°C-on; kiegészítés 40 μΙ BX-pufferrel.
g agarózt és 99 g 1x TAE-puffert mikrohullámú kemencében megolvasztunk, kb. 60°C-ra hütjük és 3 μΙ etidium-bromid törzsoldatot (10 mg/ml) adunk hozzá. A gélen 1x TAE-pufferben 100-300 V-on, kb. 30 percig végezzük az elválasztást az elválasztani kívánt DNS-fragmensek hosszától függően. Minden sávra 10 ml mintát viszünk fel 2 μΙ 6x BX-pufferben. A DNS-fragmensek azonosítását Lambda/Hindlll emésztéssel kapott molekulatömeg-standarddal való összehasonlítás alapján végezzük.
3.6 PCR-termékek és vektorok előállítása a liqáláshoz
3.6.1. Vektor-DNS és az inszert enzimes hasítása a ragadós végeken végzett klónozáshoz egység restrikciós enzimet és a megfelelő restrikciós puffereket a gyártó utasításának megfelelően 1 pg vektor-DNS-hez és inszerthez keverünk. A keveréket 37°C on (Smal esetén 30°C-on) 30-60 percig (az alkalmazott enzimtől, vektortól és inszerttől függően) inkubálunk. Ezután az enzimet 65°C-on 10 percig tartó hevítéssel inaktiváljuk és a reakcióelegyet agaróz gél-elektroforézissel elemezzük.
3.6.2. Liqálás plRESneoSV40 vektor
A pIRESneo vektor (Clontech Laboratories) az encephalomyocarditis vírus (ECMV) számára belső riboszóma behatolási helyet (internal ribosome entry site; IRES) tartalmaz, mely lehetővé teszi egy mRNS-ből származó két nyitott leolvasókeret transzlációját. A pIRESneo expressziós kazettája tartalmazza a humán citomegalovírus (CMV) nagy közvetlen korai promoterét, ezt egy többszörös klónozó hely (MCS), az ECMV IRES követi, majd a neomicin foszfotranszferáz gén és a marha növekedési hormon poliadenilációs szignálja következik. Ebben a vektorban a CMV-promoter helyett SV40 korai promoter van.
A vektor és a PCR-termék összekapcsolása T4 DNS ligázzal történik. Az optimális ligálás érdekében kb. 20 ng vektort és 200 ng inszertet (a hossztól függően) alkalmazunk kb. 1:10 molarányban, a következő reagensekkel összekeverten és vízzel 10 μΙ-re kiegészítetten. Az elegyet egy éjszakán át 15°C-on és 3 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk. A ligáz hővel való inaktiválása 65°C-on, 10 percig tartó inkubálással történik.
Reagens Végső mennyiség
plRESneoSV40 vektor ~ 20 ng
Inszert (Epo) ~ 200 ng
T4 DNS Ligáz 1E(1 μΙ)
Puffer (5x) 1x (2 μΙ)
h2o ad 10 μΙ
3.6.3. Baktériumok és táptalajok
JM109 (Promega, USA)
LB-táptalalj kazeinből nyert pepton 10 g; élesztőkivonat 5 g; nátrium-klorid 10 g, vízzel 1000 ml-re feltöltve és a pH 7,0-re állítva 5M nátriumhidroxiddal
LB-agar 15 g agar 1000 ml LB-táptalajban
LB-Amp 100 μΙ ampicillin (100 mg/ml) 1000 ml LB-táptalajban
SOC-táptalaj bakto-tripton 20 g; élesztőkivonat 5 g; nátrium-klorid 10 mM; kálium-klorid 3 mM; magnézium-klorid 10 mM; glükóz 20 mM; magnézium-szulfát 10 mM.
3.6.4 . Transzformáció kalcium-klorid alkalmazásával
A kompetens baktérium (JM109) előkészítése ml LB-táptalajra E. Coli-t (JM109) oltunk és egy éjszakán át 37°C-on növesztjük. 4 ml baktérium tenyészetet LB-táptalajjal 1:100 arányban hígítunk és a tenyésztést mindaddig folytatjuk, míg az OD26onm értéke eléri a 0,8-at. A baktériumokat 4500 fordulat/perc sebességgel 4°C-on 10 percig centrifugáljuk és a sejt-pelletet újra szuszpendáljuk. 10 ml 0,1 M kalcium-klorid/50 ml baktérium-szuszpenziót (4°C) használunk. A sejteket centrifugáljuk, a pelletet 2 ml 0,1 M kalcium-kloridban szuszpendáljuk, alikvot részeit 100 μΙ össztérfogatra hozzuk, folyékony nitrogénben kifagyasztjuk és -80°C-on tároljuk.
Transzformáció
Előfagyasztott 17 x 100 nm-es polipropilén tenyésztő-csövekben lévő JM109 kompetens baktériumokhoz 5-10 ng plazmid-DNS-t adunk, kíméletesen összekeverjük és 30 percre jégre tesszük. A sejteket ezután 45 másodpercig hősokk-kezelésnek teszszük ki, pontosan 42°C-os vízfürdőben, rázogatás nélkül, majd 2 percre azonnal jégre tesszük. Ezután a csövekbe 900 μΙ SOC-táptalajt teszünk és a tenyészeteket 30 percig 37°C-on inkubáljuk, mielőtt az LB-Amp-tartalmú lemezekre felvinnénk 100 μΙ baktériumszuszpenziót.
3.6.5 . Szkrínelés és glicerines tenyészetek létrehozása
Az ampicillinrezisztens telepeket az inszertált DNS-fragmensre PCR-módszerrel szkrineljük. Az ampicillinrezisztens telepekből vett részleteket összekeverjük a PCR reakcióeleggyel és a klónozott DNS.fragmensre specifikus primerekkel (lásd alább). A pozitív telepek PCR-módszerrel amplifikált DNS-sávokat adtak az agaróz gélelektroforézisnél. Ezeket a telepeket ezután LB-Amp táptalajon továbbtenyészjük további analízis és plazmid-tisztítás céljából. További alkalmazáshoz és tároláshoz a kívánt baktériumtenyészet 1 ml-ét 500 μΙ glicerinhez keverjük (87 %) és -80°C-on tároljuk.
3.6.6 Wizard® Plusz SV Miniprep DNS tisztító rendszer
Sejt újra szuszpendálására használható oldat: Trisz-HCI 50 nM, pH 7,5; EDTA 10 mM, RN-áz A, 100 pg/ml.
Sejt lízishez használható oldat: nátrium-hidroxid 0,2 M, SDS 1%.
Semlegesítő oldat: guanidin-hidroklorid 4,09 M; kálium-acetát 0,759 M; jégecet 2,12 M, pH 4,2.
Oszlop mosóoldat: kálium-acetát 60 mM, Trisz-HCI 10 mM, pH 7,5; etanol 60%.
2,3 ml LB-Amp táptalajra egyetlen telepet oltunk át és a tenyészetet egy éjszakán át 37°C-on inkubáljuk. Az elegyet centrifugáljuk (12000 x g, 5 perc), a kapott pelletet 250 μΙ újra szuszpendálásához használható oldatban, majd 250 μΙ sejt-lízishez használható oldatban szuszpendáljuk, a szuszpenziót a csövek négyszeri átforgatásával fölkeverjük és szobahőmérsékleten 1-5 percig inkubáljuk. Az elegyhez ezután 10 μΙ alkálikus proteáz-oldatot (szobahőmérsékleten 5 percig inkubálva) és 350 μΙ semlegesítő oldatot adunk. A csöveket négyszeri átforgatással azonnal fölkeverjük és a bakteriális lizátumot 12000 x g-vel szobahőmérsékleten 10 percig centrifugáljuk. A kitisztult lizátumot Spin-oszlopra visszük át és centrifugáljuk (12000 x g, 5 perc) és az oszlopot a mosóoldattal (750 μΙ/250 μΙ) kétszer mossuk. A DNS-t 100 μΙ nukleázmentes vízzel eluáljuk.
3.6.7 A plazmidok szekvenálása
Az inszertált szekvenciákat az IBL (Gerasdorf, Ausztria) és a GenXpress (Maria Wörth, Ausztria) szekventálta specifikus primerek segítségével. Az Epo és az SV40 korai promoter amplifikálásához, valamint a szekvencia analízishez használt oligonukleotid primereket az alábbiakban soroljuk fel.
Oligonukleotid primer Szekvencia
SV40 korai promoter
SV40 korai Clal for* 5'-aga tcg atc aag ctt ttt gca aaa gcc tag-3' SEQ.ID.No. 13
SV40 korai Nrul back** 5'-agt ege gag ege age acc atg gcc tg-3' SEQ.ID.No.14
SV40 korai 281 back 5'-gcc cag ttc ege cca ttc-3' SEQ.ID.No. 15
Epo:
Epo BamHI for 5'-tag gat cet cat ctg tcc cet gtc ctg c-3' SEQ.ID.No.16
Epo EcoRI back 5'-tag aat tcc gcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc-3' SEQ.ID.No.17
Epo 221 for 5'-taa etttgg tgt ctg gga-3' SEQ.ID.No.18
Epo 204 back 5'-tcc cag aca cca aag tt-3' SEQ.ID.No.19
pIRESneo:
pIRESneo 181 back 5'-tta ggg tta ggc gtt ttg cg-3' SEQ.ID.No. 20
pIRESneo 1016 for 5'-act cac ccc aac age cg-3' SEQ.ID.No.21
pIRESneo 2786 for 5'-ggcc aaa caa cag atg gct-3' SEQ.ID.No.22
pIRESneo 200 back 5'-tgg aaa gag tea aat ggc-3' SEQ.ID.No.23.
* for = forward (előre) ** back = backward (visszafele)
4. a p5 plazmid létrehozása
4.1 Az Epo génfragmens előállítása
Az Epo (humán eritropoetin) struktúrgént PCR-módszerrel amplifikáljuk DNS templátként pSVGPIRNEO-t alkalmazva. Az Epo-szekvencia a GenBank M11319.1 hozzáférési számán megszerezhető. A Notl és Kspl enzim felismerő helyeket az upstream illetve a downstream primerbe építettük be. A primereket a következő szerkezetűre terveztük:
Oligo 2004-09;
Hossz: 45 mer
5'-ggg ggc ggc ege atg ggg gtg cac gaa tgt cet gcc tgg ctg tgg -3'
SEQ.ID.No.24
5' Notl:
gcggccgc a(=665 pozíció a PSVGPIRNEO-ban) tgggggtg
SEQ.ID.No.25
Oligo 2004-10;
Hossz: 44 mer
5'-ggg gcc gcg qtc atc tgt ccc ctg tcc tgc agg cet ccc ctg tg-3'
5' Kspl: ccgcgg-t (=1246 pozíció a PSVGPIRNEO-ban) catctgtcccct
SEQ.ID.No.26
SEQ.ID.No.27
A 2004-09 + 2004-10 primerek amplifikációs terméket Pwo-polimeráz (Roche Diagnostics) alkalmazásával, a már ismertetett PCR-módszerrel állítottuk elő. A kapott 604 bázispár hosszúságú DNS-fragmenst DNS izoláló oszlopon tisztítjuk, Kspl és Notl enzimmel emésztjük és gélen tisztítjuk. A kapott 592 bp hosszúságú Kspl/Notl fragmenst az alábbiakban ismertetésre kerülő tripla ligálásnál használjuk fel.
4.2 . A SV40LTpolyA/IVS záró régiójának előállítása
A SV40LTpolyA/IVS terminátor régióját - mely a pSV2neo-ból származik PCR-módszerrel újra klónozzuk a p2neo létrehozásával az 1.4. pontban már leírtakhoz hasonlóan, azzal az eltéréssel, hogy más restrikciós endonukleázokat felismerő helyeket terveztünk beépíteni a primerekbe, nevezetesen egy Kspl (=SaclI) helyet kell bevinni az upstream primerbe és Sacl és EcoRI felismerő helyet a downstream primerbe. Oligo 2004-11; Hossz: 42 mer
5'-ggg gcc qcq qtt tgt gaa acc tta ctt ctg tgg tgt gac-3' SEQ.ID.No. 28
5' Kspl: ccgcqq-t (= 1598 pozíció a pSV2neo-ban) ttgtgaaggaa SEQ.ID.No 29
Oligo 2004-12; Hossz: 46 mer
5'-ggg qqa get cga att cga tcc aga cat gat aag ata cat tag g-3' SEQ.ID.No.30
5' Sacl/EcoRI: gagete gaatte-g (=752 pozíció a pSV2neo-ban)atccagacatg SEQ.ID.No.31
A 2004-11 + 2004-12 primerek amplifikációs termékét a Pwo-polimerázt (Roche Diagnostics) alkalmazva, PCR-módszerrel a fent leírt módon állítjuk elő. A kapott 873 bp hosszúságú DNS-fragmenst DNS izolálásra rendszeresített oszlopon tisztítjuk, és Kspl és Sacl enzimmel emésztjük. A kapott 858 bp hosszúságú DNS-fragmenst ezután gélen tisztítjuk.
4.3 A p3 vektor-rész előállítása
A p3 plazmid-DNS-t Notl, majd Sacl enzimmel emésztjük. A DNS-t alkálikus foszfatázzal kezeljük és a vektor-fragmenst gélen tisztítjuk.
4.4 . Tripla liqálás és a p5 plazmid izolálása
A p3 plazmidból Notl és Sacl kezeléssel kapott vektor-részt, a Kspl és Notl kezeléssel nyert Epo-gént, valamint a Kspl és Sacl kezeléssel kapott SV40LTpolyA/IVS záró régiót egy ligálási reakcióban kapcsoljuk össze (Ligation Express, Clontech). A transzformánsokat 100 mg/l amplicillinnel kiegészített LB-táptalajon szelektáljuk.
A mindkét inszertált fragmenst tartalmazó pozitív transzformánsokat telephibridizációs technikával, mind a 2004-09/2004-10, mind a 2004-11/2004-12 amplifikált fragmenseket jelzett szondaként alkalmazva, választjuk ki. Azt a 10 kiónt, amely mindkét szondával pozitív hibridizációs szignált adott, használjuk fel a midi méretben végzett plazmid-elöállításához (Qiagen).
A restrikciós analízist BamHI (1 fragmens 4723 bp hosszúsággal), EcoRi (2 fragmens, 2913 és 1810 bp hosszúsággáal) és Pvull (4 fragmens 2513, 1204, 903 és 103 bp hosszúsággal) enzimekkel végezzük. Azt a két kiónt, melyek a helyes restrikciós fragmenseket tartalmazzák, kiválasztjuk és szekvenálással leellenőrizzük. A teljes kazettát pBluescript II Sk+ vektorba klónozva szekvenáljuk és az eredményt a várt nukleotid-szekvenciával összehasonlítjuk. Minden egyes nukleotidot sikeresen azonosítani tudtunk. A plazmidokat p5-nek nevezzük.
5. pEpo/neo létrehozása
5.1 pEpo/neo 12-1 létrehozása p5 plazmid-DNS-t BamHI és EcoRi enzimekkel emésztünk és a kapott, 1792 bp hosszúságú fragmenst - mely az SV40 promoter-Epogén-SV40 terminátor kazettának felel meg - gélen tisztítjuk.
p2-neo-plazmidot szintén BamHI és EcoRI enzimekkel emésztünk és a kapott linearizált vektort gélen tisztítjuk. A DNS-t ezenkívül alkálikus foszfatázzal defoszforilezzük és Amicon Micropure enzim-eltávolítóval tisztítjuk.
A 4411 bp hosszúságú vektor-fragmenst és a p5-böl származó 1792 bp hosszúságú kazettát ligálással (Ligation Express, Clontech) összekapcsoljuk és E.Coli SUREba transzformáljuk. A Plazmid-DNS-t 70 mg/l ampicillinnel kiegészített LB-táptalajon növesztett különféle transzformánsok közül izoláltuk és Pvull, EcoRI és Ncol restrikciós endonukleázokkal végzett emésztést követően analizáltuk.
A várt fragmenseket (EcoRI: 6191 bp, Ncol: 4085, 1326 és 780 bp, valamint Pvull: 3273, 2130, 685 és 103 bp) tartalmazó kiónokat szelektáljuk és pEpo/neo 12-nek nevezzük.
A DNS-t további tisztítás céljából újra E.ColiSURE-ba transzformáljuk (lásd fent) és a plazmid-DNS-t Midi-prep eljárással (Qiagen) egyetlen telepről inokulált kultúrából preparáljuk ki (pEpo/neo-12-1). A resktrikciós analízist a következő enzimekkel végeztük: BamHI, Hindlll, EcoRI, Ncol, Notl, Pstl, Spel, Sphl, Pvull, Narl. A várt fragmenseket és méreteket azonosítani tudtuk, bizonyítva, hogy a klón valóban pEpo/neo klón.
5.2 A pEpo/neo konstruálásának befejezése
A pEpo/neo-12-1-ben lévő Epo-gén upstream régiójában változtatást eszközöltünk a start ATG-től számított -3. pozícióban. Egy addicionális nukleotid A-t juttattunk be, mely a start ATG-től számított -3. pozícióban G purin bázist eredményezett. Ha ebben a pozícióban egy purin van, javulhat a gén expressziós szintje. Ebből a célból az Epo-gént újra amplifikáltuk a 2004-09-a jelzésű adaptált upstream primer alkalmazásával: Oligo 2004-09-a Hossz: 46 mer
5'- gggggcggccgcaatgggggtgcacgaatgtccgcctggctgtgg-3'
SEQ.ID.No.32 ·»«ι 47 ·:·· ’x’· -X
A 2004-09-a + 2004-10 primerek amplifikációs termékét Pwo polimeráz (Roche Diagnostics) alkalmazásával, a fent leírt PCR-módszerrel állítottuk elő. A kapott 605 bp hosszúságú DNS-fragmenst DNS izolálásra rendszeresített oszlopon tisztítjuk és Kspl és Notl enzimekkel emésztjük. A kapott 593 bp hosszúságú DNS-fragmenst ezután gélen tisztítjuk.
A pEPo/neo-12-1 plazmid-DNS-t Kspl illetve Notl enzimmel emésztjük az Epogén eltávolítása céljából. Az 5599 bp hosszúságú fragmenst ezután gélen tisztítjuk. A két előállított DNS-t ligátással összekapcsoljuk (Ligation Express, Clontech). A plazmid -DNS-t 70 mg/l ampicillinnel kiegészített LB-táptalajon növesztett telepek transzformánsaiból izoláljuk és tisztítjuk. A DNS-ek restrikciós alanízise első közelítésben Ncol alkalmazásával történt.
A pozitív kiónt szelektáljuk és a DNS-t Midi-prep módszerrel (Qiagen) izoláljuk. A részletes restrikciós analízist a következő enzimekkel végeztük: BamHI, Hindi 11, EcoRI, Ncol, Notl, Pstl, Spel, Sphl, Pvull, Narl. A várt fragmenseket és méreteket azonosítani tudtuk, bizonyítva, hogy a klón valóban pEpo/neo. A teljes kazettát (SV40 korai promoter - neo gén - SV40LTpolyA/IVS - SV40korai promoter - Epo gén SV40LTpolyA/IVS) pBR 322 vektor-részbe inszertáltan szekvenáltuk és a kazetta minden egyes nukleotidját azonosítottuk.
2. Példa: Az Epo/dhfr plazmid létrehozása
1. A p2-dhfr-CDS létrehozása
1.1 A dhfr-qén előállítása
A vektor létrehozásához használt dhfr-gén egér cDNS-böl származik, mely a pLTRdhfr26 plazmidban (ATCC 37295) van jelen. Az egér dhfr eDNS (MUSDHFR) nukleotid szekvenciája a GenBank L26316 hozzáférési számán megszerezhető.
...... “ *'
A pLTRdhfr26-ból származó dhfr amplifikálásához olyan primereket terveztünk, amelyekkel az 56. pozícióban lévő start ATG-töl a 619. pozícióban lévő TAA stopkodonig terjedő kódoló régiót tartalmazó fragmens állítható elő. Mint ahogy azt a neomicin rezisztenciagén amplifikációjánál már leírtuk, Hindlll, illetve Spel felismerő helyeket viszünk be az upstream illetve a downstream amplifikációs primerekbe. A reverz primerbe egy EcoRI felismerő helyet is beviszünk a Spel hely mellett. Az oligonukleotidok szekvenciája a következő: Oligo 2004-13: Hossz: 39 mer
- ggg gaa get tat ggt teg acc att gaa ctg cat cgt ege - 3' SEQ.ID.No. 33
5' Hindlll: aagett - A (= 56 pozíció a MUSDHFR-ben) TGgttcgaccattg SEQ.ID.No 34
Oligo 2004-14: Hossz: 42 mer
5'-ggg gaa ttc act agt tag tet ttc ttc teg tag act tea aac - 3' SEQ.ID.No.35
5' EcoRI/Spel:
gaatte actag -1 (= 619 pozíció a MUSDHFR-ben) tagtctttcttctcgtagacttcaaact
SEQ.ID.No.36
A 2004-13 + 2004-14 számú primerek amplifikációs termékét Pwo-polimerázt alkalmazva (Roche Diagnostics) a már ismert PCR-módszerrel állítjuk elő. A kapott 588 bp hosszúságú DNS-fragmenst DNS izolálásra rendszeresített oszlopon tisztítjuk, Hindlll és EcoRI enzimmel emésztjük és gélen tisztítjuk.
1.2 A p1-dhfr-CDS előállítása
Az amplifikált_EcoRI-Hindl11 dhfr gén-fragmenst és a pSV2-neo-ból származó EcoRI-HindlII vektor-fragmenst ligálással kapcsoljuk össze (Ligation Express; Clontech), majd E.Coli gazdaszervezetbe transzformáljuk. A transzformánsokat 50 mg/l ampicillinnel kiegészített LB-táptalajon való növesztéssel szelektáljuk. A transzformánsokból a plazmid-DNS-t izoláljuk, és 50 mg/l ampicillinnel kiegészített LBtáptalajon növesztett telepekből szelektálva tisztítjuk.
A plazmid-DNS-t a kiónokból izoláljuk, EcoRI plusz Seal enzimekkel végzett restrikciós analízissel ellenőrizzük (3 fragmens 2225 bp, 514 bp és 473 bp hosszúsággal).
Az elvárásnak megfelelő fragmenseket tartalmazó DNS-eket a konstrukció releváns részeinek szekvenálása útján tovább ellenőrizzük. Az azonosított SV40 korai promotert és dihidrofolát-reduktáz gént tartalmazó plazmid-DNS-t p1-dhfr-CDS -nek nevezzük. A szekvencia-analízis egy eltérést tárt fel a dhfr-génben a MUSDHFR-re publikált szekvenciához képest; nevezetesen a MUSDHFR szekvencia 451. pozíciójában lévő T helyett nálunk C van. Az ezt követő szekvenálás kimutatta, hogy ez az eltérés a kiindulási plazmidban is megvan. Ez az eltérés azonban nem okoz változást a nukleotidszekvencia által kódolt aminosavszekvenciában, mert mind a CTT, mind a CTC a lencint kódolja.
1.3 A p2- dhfr-CDS előállítása
A p1- dhfr-CDS plazmid-DNS-t EcoRI + Spel enzimekkel emésztjük. A kapott linearizált fragmenst tisztítjuk és az SV40LTpolyA/IVS-t tartalmazó amplifikált fragmenssel ligálással összekapcsoljuk (lásd fent). Transzformáció és szelekció után a kapott plazmidokat restrikciós analízissel elemezzük Accl-t alkalmazva (3 fragmens 2994, 855 és 216 bp hosszúsággal). Néhányat kiválasztunk és Hindi (2 fragmens 3466 bp illetve 599 bp hosszúsággal), Afllll (2 fragmens 2872 bp és 1193 bp hosszúsággal) és Bgll (2 fragmens 2371 bp illetve 1694 bp hosszúsággal) enzimeket használva tovább elemezzük.
Az elvárásnak megfelelő fragmenseket helyes méretben tartalmazó plazmidDNS-t szekvenálással tovább vizsgáljuk. Az így azonosított plazmidot p2 -dhfr-CDS-nak nevezzük.
2. A pEpo/dhfr létrehozása
2.1 pEpo/dhfr-21 előállítása p5 plazmid-DNS-t BamHI és EcoRI enzimekkel emésztünk és a kapott 1792 bp hosszúságú fragmenst - mely az SV40 promoter -Epogén - SV 40 terminátor kazettának felel meg - gélen tisztítjuk.
A p2-dhfr-CDS plazmidot szintén BamHI és EcoRi enzimmel emésztjük, a linearizált vektort gélen tisztítjuk és Supelco spin oszlopok alkalmazásával eluáljuk. A DNS-t ezen kívül alkálikus foszfatázzal defoszforilezzük és Amicon Micropure enzim eltávolítóval tisztítjuk.
A 4053 bp hosszúságú p2-dhfr-CDS vektort és az 1792 bp hosszúságú p5eredetű kazettát ligálással összekapcsoljuk (Ligation Express, Clontech) és E.coli SURE-ba transzformáljuk. A 70 mg/l ampicillinnel kiegészített LB-táptalaljon növesztett transzformáns telepeket hibridizáljuk szondaként Epo-gént (PCR-termék) alkalmazva. A különböző pozitív kiónokból izolált plazmid-DNS-t Ncol restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel elemezzük.
A várt fragmenseket (Ncol: 4085 bp és 1760 bp) tartalmazó kiónt szelektáljuk és pEpo/dhfr-21-nek nevezzük. A DNS-t további tisztítás céljából újra E.coli SURE-ba transzformáljuk (lásd fent) és a plazmid-DNS-t Midi-prep módszerrel (Qiagen) egyetlen telepről inokulált kultúrából kinyerjük (pEpo/dhfr-21-1).
A restrikciós analízist a következő enzimekkel végezzük: BamHI, HindiII, EcoRI, Ncol, Notl, Pstl, Spel, Sphl, Pvull, Narl. Minden várt fragmenst és méretet megtaláltunk, megerősítve, hogy a klón a helyes pEpo/dhfr-21.
2. 2 Az pEpo/dhfr konstruálásának befejezése
Úgy járunk el, mint a pEpo/neo esetében: az Epo/dhfr21-ben lévő Epo-gén upstream régiójában változtatást eszközlünk a start ATG-hez viszonyított -3. pozíciójá ban. Egy addicionális nukleotid A-t bejuttatva a start ATG-től számított -3. pozícióban G purin-bázist kapunk. Az Epo-gént újra amplifikáljuk az 1. példa 4. 2. pontjában leírt módon.
A pEpo/dhfr21 plazmid-DNS-t Kspl és Notl enzimmel emésztjük az Epo-gén eltávolítása céljából, majd az 5259 bp hosszúságú fragmenst gélen tisztítjuk.
Az előállított két DNS-t ligálással összekapcsoljuk (Ligation Express, Clontech). A transzformánsokból a plazmid-DNS-t izoláljuk és 70 mg/l ampicillinnel kiegészített LB-táptalajon tenyésztett telepekből szelektálva tisztítjuk. A DNS-eket restrikciós analízissel első közelítésben Ncol enzimmel hasítva vizsgáljuk.
A pozitív kiónt szelektáljuk és a DNS-t Midi-prep módszerrel (Qiagen) izoláljuk. A részletes restrikciós analízist a következő enzimekkel végezzük: BamHI, Hindin, EcoRI, Ncol, Notl, Pstl, Spel, Sphl, Pvull, Narl. Az összes várt fragmenst és méretet azonosítani tudtuk, igazolva, hogy a klón valóban a pEpo/dhfr.
A teljes kazettát (SV40 korai promoter - dhfr gén - SV40LTpolyA/IVS - SV40 korai promoter - Epo gén - SV40LTpolyA/IVS) pBR322 vektor-részbe inszertáltuk, és a kazetta minden egyes nukleotidját szekvenálással is azonosítottuk.
3. Példa pEpo/neo-ból és pEpo/dhfr-ből létrehozott rekombináns CHO-sejtek cm2-es T-palackokba vagy 96-lyukú lemezekre cm2-enként 1-5x104 sejtet oltunk a lipofektin transzfekciót megelőző napon. A két plazmidot 50: 1 = Epo/neo:Epo/dhfr arányban összekeverjük és hagyjuk a lipofektin-reagensen (Gibco/BRL) a gyártói utasításnak megfelelően megtapadni.
Röviden: 0,25 μg DNS/cm2 és 1,5 μΙ lipofektin-reagens/cm2 mennyiségekkel dolgoztunk és ezt a DNS/lipid koktélt 200 μΙ/cm2 sejt-réteghez használtuk. A sejteket a transzfekciós koktéllal 4 órára szérummentes DMEM-ben befedjük, majd a
DNS-tartalmú táptalajt tenyésztő táptalajra cseréljük. A tenyésztést 24 órán át szérumot tartalmazó táptalaon folytatjuk le, majd átváltunk szelektív táptalajra. A transzfektált sejtállományt a szelektív táptalajon összefolyásig, ezt követően pedig amplifikációs tápo talajon tenyésztjük (4,8x10' Μ MTX), mielőtt a sejttenyészet felülúszóját ELISAmódszerrel Epo-termelés szempontjából szkrinelnénk. A legjobban termelőket behatároljuk és 2-szeresére növelt MTX koncentráció mellett ezeket továbbtenyésztjük. 7 rekomináns sejtállományt szelektáltunk és ezeket növekedési tulajdonságok, Epotermelőképesség, fehérje összetétel (Western-blot elemzés), Epo-funckonalitás és kromoszómális stabilitás szempontjából összehasonlítottuk.
T25-palackokban a transzfekciót a következő mennyiségekkel végeztük: 2,5 pg pEpo/neo, 0,05 pg pEpo/dhfr és 15 pl lipofektin (09/T25/1 és 09/T25/2) per T25 palack és 2 pg pEpo/neo, 0,4 pg pEpo/dhfr és 15 pl lipofektin (09/T25/3 és 09/T25/4) per T25 palack.
Ezenkívül öt lemez mindegyikét a következőkkel transzfektáltuk: 10 pg pEpo/neo, 0,2 pg pEpo/dhfr és 60 pl lipofektin per lemez (09/96/1-09/96/5); további 5 lemez esetében 8 pg pEpo/neo, 1,6 pg pEpo/dhfr és 60 pl lipofektin per lemez (09/96/609/96/10). A 11. és 12. lemezeket 6,25 pg pEpo/neo, 0,08 pg pEpo/dhfr és 37,5 pl ο lipofektin alkalmazásával transzfektáltuk (lemezenként). Röviden: 0,25 pg DNS/cm és
1, 5 pl lipofektin-reagens/cm mennyiségekkel dolgoztunk és ezt a DNS/lipid koktélt 200 pl/cm sejt-réteghez használtuk.
Transzfekciót sorozatban főként mikrotiterű lemezeken végzünk, korábbi kísérleteink ugyanis azt mutatták, hogy egy tenyésztő egységben a kiónok száma maximum 35. Ez azt jelenti, hogy a monoklonális transzfektáns izolálása így egyszerűbb, mint ha a T-palackban lévő többszáz kiónból kellene izolálni. Az 1. táblázatban feltüntettük a kiónok számát 96-lyukú lemezenként és az ELISA-módszerrel mért titereket amplifikációs nyomás alkalmazása esetén és anélkül. A transzfektált sejtállományt a szelektív táptalajon összefolyásig, ezt követően pedig amplifikációs táptalajon tenyésztjük (4,8x10'8M MTX), mielőtt a sejttenyészet felülúszóját ELISA-módszerrel Epotermelés szempontjából szkrinelnénk. Közelítőleg 1000 tenyésztő mélyedést szkireltünk és 50 ilyen tenyészetet teszteltünk Epo-termelőképesség szempontjából növekvő MTXkoncentráció mellett. A legjobb termelőket behátároltuk, az MTX koncentrációt kétszeresére növeltük és a legjobb termelőket tovább tenyésztettük.
A szelekciót és az első amplifikációs lépéseket 96-lyukú lemezeken végeztük, és miután az összes kiónt, amelyeket 4,8x10’8M MTX jelenlétében növesztettünk, szkrineltük, 7 kiónt szelektáltunk. Ezeket a következőképpen jelöljük: 09/96/1F5, 09/96/3D5, 09/96/3H5, 09/96/5D4, 09/96/5H1, 09/96/6C5 és 09/96/7E6, és ezek növekedési tulajdonságait, Epo-termelőképességüket, protein-összetételüket(Western biot), Epo funkciolanitásukat és kromoszómális tulajdonságiait összehsonlítottuk.
1. Táblázat: rekombináns CHO-sejtek: Epo/neo-val és Epo/dhfr-rel végzett transzfekciók T25 Palackban:
Transzfekció Kiónok száma per T25-palack Qp, 9,6 x 10'8 M MTX ^g/106 sejt/d]
09/T25/1 (50:1) 136 0,16
09/T25/2 (50:1) 107 2,6
09/T25/3 (5:1) 459 0,14
09/T25/4 (5:1) 648 0,9
96-lyukú lemezen
T ranszfekció Kiónok száma per lemez Szelektált klón
09/96/1 (50:1) 47 1F5
09/96/2 (50:1) 46
09/96/3 (50:1) 50 5D5, 3H5
09/96/4 (50:1) 52
09/96/5 (50:1) 49 5D4, 5H4
09/96/6 (5:1) 416 6C5
09/96/7 (5:1) 556 7E9
09/96/8 (5:1) 392
09/96/9 (5:1) 427
09/96/10 (5:1) 352
09/96/11 (75:1) 49
09/96/12 (75:1) 60 12A9
A különböző kiónok amplifikációja
Klón Qp [μg/10 sejt/d]
9,6 x 10 öM MTX 1,9 x 10'zM MTX 3,8 x 10’zM MTX
09/96/1F5 11 11,4 17,1
09/96/3 D5 8,4 14,4 11,4
09/96/3 H 5 8,2 14,1 12,9
09/96/5D4 4,9 3,8 3,6
09/96/5H1 4,7 7,1 6,7
09/96/6C5 4,2 3,8 3,6
09/96/7E9 5,5 8,8 8,9
09/96/12A9 6
A sejtek megduplázódás! ideje minden klón esetében azonosnak tűnik és a tenyészetből heti két alkalommal 1:2 és 1:5 arányban történhet elvétel. Ha az MTX koncentrációt 9,6 x 10'8-ról 1,9 x 10'7-re emeljük, fokozódik a produktivitás; ugyanakkor az MTX koncentráció újabb megduplázása nem befolyásolja az ELISA eredményt. A szubklónozást ezért 3,8 x 10'7 M MTX koncentrációnál végezzük. Az immunfluoreszcenciás vizsgálatot 1,9 x 10'7M MTX koncentrációnál végezzük, melynél az egyes (single) tenyészetek között nincs szignifikáns különbség.
A sejt morfológiai jellemzőit fény mikroszkóppal és Coulter számláló segítségével végzett magi DNS vizsgálattal hasonlítottuk össze. A 09/96/7E9, 09/96/6C5, 09/96/5H1, 09/96/5D4 és 09/96/3D5 kiónok sejtmag méreteloszlása a CHO-DHFR gazdasejtvonaléval azonos. A 09/96/1F5 és 09/96/3H5 sejtvonalaknak viszont nagyobb a sejtmagjuk. Korábbi kísérletekből tudjuk, hogy ez a nagyobb kromoszómaszám következménye. Ezért úgy döntöttünk, hogy a 09/96/3D5 kiónt stabilizáljuk tovább.
Epo tekintetében TF-1 sejteken a funkcionalitási tesztben mind a két tenyészet felülúszójából ugyanolyan lejtésű görbét kaptunk, mint a rekombinás gyógyszerészeti termék esetében.
A rekombináns proteint SDS-PAGE és Western biot módszerrel minden egyes MTX koncentrációnál vizsgáltuk és a rekombináns tenyészetek felülúszói csak apró eltéréseket mutattak. A kiónok Epo-t termelnek.
Összefoglalás és megbeszélés
Rekombináns, Epo-t expresszáló CHO-sejtvonal szelekcióját ismertettük az eukarióta expressziós vektorok konstruálásától kezdve, az emlőssejtek transzfektálásán át, a poliklonális Epo-t expresszáló sejtállomány izolálásáig. A vizsgálatok alapját főként az ELISA-módszer, az immunlfluoreszcens, Western blotting és in vitro funkcionalitási tesztek képezték. Ezek a módszerek olyan koncentrációtartományban is elfogadottak, ahol alacsony termelékenységű sejtállomány felülúszóiban csak ng/ml mennyiséget kell szkrinelni és olyanokon is, ahol a rekombináns sejtek stabilizáltabbak.
Egy rekombináns CHO-sejtállományt hoztunk létre, melyben a gén kópia számát lépésenként, egészen 3,8 x 10'7 M MTX koncentrációig elmenve - növeltük. A sejttenyészetböl hetenként kétszer 1:3 és 1:4 közti arányban történhet elvétel, és minden alkalommal emelt Epo-szinteket mértünk ELISA-módszerrel.
4. Példa
A rekombináns sejtvonal további szelekciója
További stabilizálás céljára a 09/96/3D5 rekombináns sejtállományt használtuk. Az MTX koncentrációt lépésenként 0,38 μΜ-ra növeljük. Ennél az amplifikációs szintnél a rekombináns 3D5 sejtek szubklónozását lemez-mélyedésenként 10 és 20 sejttel végezzük. A mélyedésekből nyert tenyészetek felülúszóit egyes (single) klónnal szkrineltük ELISA-módszer segítségével. A 2. táblázat a szubklónozás körülményeit és a 3D5 rekombináns sejtállomány 0,38 μΜ MTX jelenlétében észlelt teljesítmény adatait foglalja össze. Egyes (single) kiónok felülúszóit (300 felülúszó) teszteltük és azokat a kiónokat, amelyeknek 4 nappal az átoltás után az Epo-titere emelt színtű volt, 24 lyukú lemezeken 0,77 μΜ MTX jelenlétében szelektáltuk.
2. Táblázat: szubklónozási körülmények és a 3D5 sejtállomány lemezen észlelt telje- sítménye 0,38 uM MTX jelenlétében
A 96-lyukú lemez száma Inokulált sejtek száma mélyedéseként % gyarapodást mutató mélyedések % egyes (single) kiónok
25 (No. 6-30) 10 13% 77%
5 (No. 1-5) 20 24% 54%
Ezek közül a kiónok közül hetet folyékony nitrogénben lefagyasztottunk és a gén kópiaszám további növelése céljából növekvő MTX koncentrációk jelenlétében (1,54 μΜ a végkoncentráció) szelektáltuk.
A 3. táblázat a lemezen fennálló körülményeket és teljesítményeket mutatja a stabilizálás második körében. Itt a 09/96/3D5/1H9 és 09/96/3D5/18E5 kiónokat szubklónozzuk, utoljára 1,54 μΜ MTX jelenlétében. A mélyedésenként! sejtszámot 4 sejtre csökkentettük. 260 egyes kiónt szkrineltünk, melyek minden egyes szubkultivációjából több mint 20 kiónt vittük át T-palackba termelékenység szempontjából történő szkrinelés céljából. A termelő kiónok végső megválasztása a következő kritériumok alapján történt: az adott kiónra jellemző expressziómérték, a tenyésztési körülmények és a sejtmag-méret-eloszlás. A tetraploid kiónokat kizárjuk, mert tapasztalataink szerint az ilyen sejtek gyakran komplikált növekedési jellegzetességeket mutatnak a bioreaktorokban. A szkrin alapján 6 szubklónt (négy 1H9 és két 18E5) választottunk ki, és ezeket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. A választott szubklónok a következők:
09/96/3D5/1H9/4C2 09/96/3D5/1H9/6C2 09/96/3D5/6D4
09/96/3D5/1H9/15B4 09/96/3D5/18E5/7A6 09/96/3D5/18E5/15C3
3. Táblázat
Szubklónozási feltételek és a 3D5/1H9 és 3D5/18E5 szubklón lemezen mutatott teljesítménye 1,54 uM MTX jelenlétében
3D5/1H9
A 96-lyukú lemez száma Inokulált sejtek száma mélyedéseként % gyarapodást mutató mélyedések % egyes (single) kiónok
8 (No. 9-16) 10 6,4% 85%
8 (No. 1-8) 30 19% 46%
3D5/18E5
A 96-lyukú lemez száma Inokulált sejtek száma mélyedéseként % gyarapodást mutató mélyedések % egyes (single) kiónok
8 (No. 9-16) 4 15% 56%
8 (No. 1-8) 8 29% 44%
5. Példa
Adaptáció a szérummentes tenyésztő táptalajhoz
A 4. példa szerint kiválasztott hat rekombináns sejtvonalat vontuk be a szérummentes tenyésztési feltételekhez való adaptációba az utolsó szubklónozási lépés után.
A szubklónozás után a 7.-12. passzázsnál a sejteket kb. 5 x 104 sejt/cm2 menynyiségben T-25 palackokba oltjuk át, majd 3-4 napon a sejtek összefolyásáig tenyésztjük. Ekkor a táptalajt teljes egészében szérummentes adaptációs táptalajra cseréljük és ezután a táptalaj 80%-át naponta új táptalajra cseréljük. Az adaptációs idő elteltével, amikor majdnem minden sejt szuszpenzióban nő, a kiónokat kétszer egy héten átoltjuk és szuszpenziós kultúraként tenyésztjük.
A kiónokat 11-13 átoltásig szérummentes adaptációs táptalajon tenyésztjük majd lefagyasztjuk. 6 ampullát (mindegyikben 5 x 106 sejttel) fagyasztunk le minden sejtvonalból folyékony nitrogénben, szérummentes fagyasztó táptalajjal. Felengedés után a kiónokat szérummentes termelő-táptalajon tenyésztjük.
A termelő klón kiválasztása céljából a felengedés utáni második vagy harmadik passzázs felülúszóit analizáljuk.
Az analitikai tesztbe a következő vizsgálatok tartoznak:
Specifikus növekedési mérték [μ] - (μ=Ιη (x2/xi)/nap)
Specifikus produktivitás [qp] - (Qp = termék-létrehozás x 106/(sejtszám x nap)
Western biot
Izoelektromos fókuszálás
DNS-tartalom és stabilitás
Klón-stabilitás ·* · · * · · ···· ···· ···· *· **
Mind a hat sejtvonalat tenyészteni tudtuk szérummentes táptalajon és hetente kétszer volt elvétel. A lefagyasztást is szérum nélkül végeztük és felengedés után a tenyésztő táptalajt szérummentes termelő táptalajra cseréltük.
passzázs után különböző protein- és sejt-jellemzőket határoztunk meg és egy termelő kiónt (09/96/3D5/1H9/6C2; rövidítve 6C2) és egy tartalék kiónt (09/96/3D5/1H9/4C2; rövidítve: 4C2) választottuk ki.
6. Példa
A rekombináns sejtvonalak összehasonlítása
A 4. és 5. példában leírt 6 sejtvonal növekedési tulajdonságait több héten át végzett megfigyelések (sejt-szám a tenyészetben, elvételi arányok az átoltásoknál) alapján számoltuk. Az Epo-termelőképességét ELISA-módszerrel teszteltük. Az adatokból a specifikus produktivitást és a specifikus növekedési mértéket a fent leírt módon kiszámoltuk.
A standard tenyésztési körülmények között nyert adatokat (3 nap tenyésztés után 1:3 elvételi arány mellett) a 4. táblázat mutatja.
A sejt-számot (Coulter számlálóval mérve) az elvételt követően és további 3 nap után, szintén megadtuk a táblázatban.
4. Táblázat
A rekombináns CHO-klónok specifikus produktivitása és növekedési sajátságaik
4C2 6C2 6D4 15B4 7A6 15C3
Átoltott sejtek száma [x 105 sejt/ml] 2,17 2,67 2,89 0,71 2,38 2,16
Végső sejt-szám [x 105 sejt/ml] 7,27 9,35 8,8 2,61 6,41 6,15
Specifikus növekedés mértéke μ [nap1] 0,4 0,42 0,37 0,43 0,33 0,35
SDS-PAGE elválasztás redukáló körülmények között
A hat sejtvonal felülúszóit SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel választjuk el és ezeket molekulatömeg-különbség szempontjából hasonlítjuk össze. A hat felülúszó azonos SDS-mintázatot ad, egy folttal, mely gyakran látható az ilyen erősen glikozilezett proteinek esetében.
Az összehasonlításra alkalmas, forgalomban lévő termék jobban elkülönülő sávként migrál, vélhetőleg, mert jól elkülönülő sávokat választottak el a lefele haladó műveletben.
IEF-Western biot
Az IEF-Western biot elemzés a glikoproteinek potenciális mikroheterogenitását tárja fel. A gélre olyan mennyiségű proteint vittünk fel, hogy 14 sáv váljon láthatóvá. A Western biot lenyomaton egy karakteres kettős sáv látszik kb. a gél közepén; közvetlenül a kettős sáv alatti sávot definiáljuk egyes számú sávként, és a gélnek ebben a savas részében 9-10 sáv látható. Az összehasonlításra alkalmas, forgalomban lévő termék négy főbb sávot adott, melyek a heterogén termékben a 6-9. sávnak felelnek meg.
A rekombináns sejtek DNS tartalma
A DNS-tartalom arányos a sejtvonalak kromoszómaszámaival. A rekombináns sejtvonal stabilitását részben a kromoszómaszám befolyásolja, és a DNS-tartalom azonosságát a gazdasejtvonallal (CHO dhfr) történő összehasonlítás útján igazoltuk. Összefoglalás és megbeszélés
A fentiekben rekombináns, Epo-t expresszáló CHO-sejtvonalak izolálását írtuk le. Két körben lefolytatott szubklónozás után hat sejtvonal különböző tulajdonságait ha .»!. .:λ ··>
sonlítottuk össze, s ennek alapján jelöltük ki a végső termelő kiónt. Az analitika főként ELISA-, Western biot- és IEF-teszten valamint FACS-elemzéssel végzett DNS mérésen alapult.
A rekombináns tenyészet felülúszóinak Western biot lenyomatán néhány többlet sáv (kis molekulatömegnek megfelelő sáv) mutatkozott a forgalomban lévő tisztított protein lenyomatához képest. A többlet sávokkal kapcsolatban egy lehetséges magyarázat, hogy ezek izoformoknak tulajdoníthatók, melyek a lefele haladó műveleteknél eltűnnek az összehasonlításra használt kereskedelmi terméket eredményezve. Egy másik lehetőség, hogy a fiktív sávokat mutattunk ki, mert az SDS-felvétel nem volt teljes. Az izoelektromos fókuszálás minden sejttenyészet felülúszójában azonos izoformmegoszlást mutatott ki, függetlenül ezek Qp értékétől.
A legjobban termelő és legkönnyebben kezelhető klón a 6C2, és ezt választottuk ki termelő kiónnak. Tartalék kiónnak a 4C2 kiónt választottuk. Mind a két klón rázó palackban szaporítható.
7. Példa
CHO-sejtek tenyésztése T-palackokban
A rekombináns humán eritropoetint kínaihörcsög-ovárium (CHO) sejtvonalban, T-palackokban, szérummentes körülmények között állítjuk elő. A tenyésztést 2,67 x 105 sejt/ml sejt-sűrűséggel indítjuk. 3 napos inkubációs idő után 9,35 x 105 sejt/ml végső sejt-sűrűséget érünk el (μ= 0,42 nap'1).
Az 1-6. példában számos olyan CHO-klón előállítását írtuk le, amelyek Epo-t expresszálnak. A 4. és 5. példa szerinti hat klón közül a 6C2 kiónt választjuk a többi klón felülmúló produktivitása és növekedése miatt.
-··..·
8. Példa
CHO-sejtek tenyésztése bioreaktorban
A 6C2 (T43C6C2) CHO-sejtvonalat folyamatos rendszerű (Fed-Batch mode) 150 l-es bioreaktorban tenyésztjük. A sejttenyésztést aminosavval kiegészített 50:50 DMEM/Ham's F12 táptalajon végezzük, mely 25% növényi pepiidet, 0,1% lutrolt, 1,54 μΜ metotrexátot (MTX), 4 g/l glükózt, 2,5 g/l nátrium-hidrogén-karbonátot, etanolamint, ferri-citrátot, aszkorbinsavat és nátrium-szelenitet tartalmaz. A táptalaj semmilyen drága funkcionális proteint (rekombináns vagy természetes) nem tartalmaz. Állati eredetű komponensek is vannak jelen. 56 I táptalajra kb. 5 x 105 sejt/ml sejtet oltunk. A pO2 értéket 50%-os levegő telítettségnek megfelelő értékre, a hőmérsékletet 37°C-ra, a pH-t pedig 7,0-re állítjuk be és a fermentáció során ezeket állandó értéken tartjuk.
A glükóz koncentrációt 1 g/l fölött tartjuk. 4 nap elteltével a reaktorban lévő anyagot friss táptalajjal 150 I térfogatra egészítjük ki. A 9. nap után a sarzshoz 1875 ml tápanyagkoncentrátumot adunk, mely aminosavakat, szénhidrátot és növényi eredetű peptont tartalmaz. 10 nap után újabb 1875 ml tápanyakoncentrátumot adunk az elegyhez. Két nappal később (a 12. napon) az eritropoetint tartalmazó felülúszót elkülönítjük.
9. Példa
Eritropoetin termelés bioreaktorban metotrexát nélkül
A 6C2 CHO-sejtvonalat 5 l-es Fed-Batch bioreaktorban tenyésztjük (Kamp 5 B51 és -2 jelzésű fermentorok). A táptalaj ugyanaz mint a 8. példában. Az első bioreaktorban (Kamp 4 B5-1) a táptalaj 1,54 μΜ MTX-et tartalmaz, a második (Kamp 4 B5-2) MTX nélküli táptalajjal üzemel.
A glükóz-koncentrációt 1 g/l fölött tartjuk. Kb. 5 x 105 sejt/ml sejtet oltunk 1250 ml táptalajra. A pO2 értéket 50%-os levegő telítettségnek megfelelő értékre, a hőmérsékletet 37°C-ra, a pH-t pedig 7,0-re állítjuk be és a fermentáció során ezeket állandó érté• · * · · · · * * 63 Λ..ΰ.:λ ’··.>
ken tartjuk. 2 nap elteltével a reaktort 5 l-re töltjük föl friss táptalajjal. A 6., 7., 8., 9. és 10. nap után a sarzshoz 50-120 ml tápanyagkoncentrátumot adunk, mely aminosavat, szénhidrátot és növényi eredetű peptont tartalmaz. A 11. napon az eritropoetint tartalmazó felülúszót elkülönítjük.
A metotrexát nélküli tenyészetből származó anyag volt a jobb, ennek ugyanis jobb a glikozilezettsége.
10. Példa
Eritropoetin termelése bioreaktorban, dúsított táptalajon
A 6C2 CHO-sejtvonalat 5 l-es Fed-Batch rendszerű bioreaktorban (Kamp 11 B5 1 és -2) tenyésztjük. Az 1. bioreaktort ugyanúgy működtetjük, mint a 9. példában (Kamp 4 B5-2). A 2. bioreaktorban a sejttenyésztést aminosavban dús adalékkal kiegészített 50:50 DMEM/Ham's F12 táptalajon végeztük, amely 0,325% növényi pepiidet, 0,1% lutrolt, 6,4 g/l glükózt, 2,5 g/l nátrium-hidrogén-karbonátot, etanolamint, ferri-citrátot, aszkorbinsavat, nátrium-szelenitet és 0,6 g/l foszfátot tartalmaz. Kb. 5 x 105 sejt/ml sejtet oltunk 1250 ml táptalajra. A pO7 értéket 50% levegő telítettségnek megfelelő értékre, a hőmérsékletet 37°C-ra állítjuk be. Az induláskor a pH-t 7,1 értékre állítjuk, s ezt a fermentáció folyamán lépcsőzetesen 6,9-re csökkentjük.
A tenyésztés folyamán a 2. bioreaktorban a glükóz-koncentrációt 3-4 g/l szinten tartjuk. 2,5 nap elteltével a reaktort friss táptalajjal 5 I térfogatig töltjük fel. A 6., 7., 8., 9. és 10. nap után a sarzshoz dúsított tápanyag-koncentrátumot adunk, amely aminosavakat, szénhidrátot és növényi eredetű peptont tartalmaz. A 11. napon az Epo-t tartalmazó felülúszót elkülönítjük.
A tápanyagokkal dúsított (aminosav, glükóz, pepton és foszfát) táptalaj, valamint a pH eltolás 7,1-ről 6,9-re azt eredményezte, hogy az Epo végkoncentráció több, mint kétszeres és a glikozilezettségi profil megfelelő.
11. Példa
Eritropoetin termelése bioreaktorban állati eredetű komponens jelenléte nélkül
A 6C2 CHO-sejtvonalat 5 l-es Fed-Batch rendszerű biorekatorban (Kamp 17 B51) tenyésztjük. Az összes paramétereket a 10. példa (Kamp 4 B5-2) szerinti értékre állítottuk; a különbségeket megadjuk. A 2. bioreaktorban a sejttenyésztéshez használt táptalaj semmilyen állati eredetű komponenst nem tartalmazott. Pl. azokat az aminosavakat (ilyen pl. a tirozin vagy a cisztein), amelyek tipikusan állatokban fordulnak elő (pl. lazacban vagy emberi hajban), szintetikus aminosavakra cseréltük.
2,5 nap elteltével a reaktort friss táptalajjal 5 I térfogatig töltjük fel. az 5., 6., 7., 8. és 9. nap után a sarzshoz tápanyag-koncentrátumot adunk, amely aminosavakat, szénhidrátot és növényi eredetű peptont tartalmaz. A 9-10. napon az eritropoetint tartalmazó felülúszót elkülönítjük.
A semmilyen állati eredetű komponenst sem tartalmazó táptalajról az előzővel összemérhető Epo-végkoncentrációt kaptunk. A tenyészet azonban lassabban nő és egy addicionális tápanyag-koncentrátum adagot igényel.
12. Példa
Eritropoetin termelése bioreaktorban, dúsított (vitaminok, nyomelemek) táptalajon
A 6C2 CHO-sejtvonalat 10 l-es Fed-Batch rendszerű (Kamp 12 C) bioreaktorban tenyésztjük. A bioreaktort a 11. példában (Kamp 11 B5-2) leírtak szerint működtetjük a következő eltérésekkel:
A sejttenyésztéshez használt táptalaj aminosavban dús adalékkal kiegészített 50:50 DMEM/Ham's F12, amely 0,325 % növényi pepiidet, 0,1% lutrolt, 6,4 g/l glükózt, 2,5 g/l nátrium-hidrogén-karbonátot, etanolamint, ferri-citrátot, vitaminokat, nyomelemeket, nátrium-szelenitet és 0,6 g/l foszfátot tartalmaz. A koncentrátumban lévő kompo nenseket megdupláztuk és vitaminokkal dúsítottuk. Kb. 5 x 105 sejt/ml sejtet oltunk 4500 ml táptalajra. A pO2 értéket 50% levegő telítettségnek megfelelő értékre, a hőmérsékletet 37°C-ra állítjuk be. Az induláskor a pH-t 7,1 értékre állítjuk, s ezt a fermentáció folyamán lépcsőzetesen 6,9-re csökkentjük
A tenyésztés során a bioreaktorban a glüküz-koncentrációt 3-4 g/l szinten tartjuk. 3 nap elteltével a reaktort friss táptalajjal 10 l-re töltjük fel. A 6., 7., 8., 9., 10., 11. és 12. nap után a sarzsot dúsított tápanyag-koncentrátum hozzáadásával kiterjesztjük. A 13. napon az eritropoetint tartalmazó felülúszót elkülönítjük.
13. Példa
Az Epo kinyerése
A sejtek elválasztása
Rekombináns humán eritropoetint állítunk elő kínahörcsög-ovárium (CHO)sejtvonal segítségével szérummentes körülmények között, szakaszos betáplálással lefolytatott fermentációval (discontinuos fed batch fermentation). A fermetáció után (4 x kb. 1+2 adagban végzett kiterjesztési lépés 2 különböző bioreaktorban) a literenként kb. 200-300 mg rh Epo-t tartalmazó fermentlevet 2-8°C-ra hűtjük és minden közbenső tárolás nélkül, először tányéros centrifugával végzett centrifugálással, majd egymást követő mélységi-szűréssel (depth-filtration; Seitz Bio 10 vagy Cuno A90M08 szűrő; teljesítmény: 300 liter/m2 szűrőfelület), majd 0,2 μ-os szűrőn való átbocsátással (PP Polygard 0,1 μm, Sartobran P, Sartorius; vagy Duropore 0,22 μ, Millipore) tisztítjuk. A nagy mértékű sejtlízis és az ebből következő gazdasejt-protein (host cell proteins; HCP) szennyeződés elkerülése érdekében fontos először is az elkülönítés optimális időpontjainak megválasztása (kb. 12 nap a főtenyészetben; az oxigénfogyasztás stagnál); másodszor: olyan sejt szeparáló berendezés használata, melyet speciálisan a törékeny eukarióta sejtek szeparálására fejlesztettek ki, mint amilyen pl. a CSC6 (6000 m2 ECA,
15500 x g, kb. 200 liter/óra; Westfalia), amely hidrohermetikus megoldású betápláló bemenettel rendelkezik, vagy BTPX 250 (11000 m2 ECA, 13000 x g 300 liter/óra: Alfa Laval), mely anyag-kímélő bemenettel és fogazott kimenettel rendelkezik. A különböző szeparálás! módok - beleértve a tangenciális áramlással végzett szűrést és centrifugálást is - összehasonlításával kimutathatók a nyíróerő okozta sejt-lízisben a különbségek (erre az intracelluláris marker enzim, az LDH kibocsátásának mértékéből következtethetünk). A centrifugálás biztosítja a legkíméletesebb elválasztást ( < 3E LDH/mg rhEpo); így ezt preferáljuk.
Alternatív lehetőség, ha csak a fent említett tányéros centrifugát alkalmazzuk a sejt elválasztási lépésben (mélységi szűrés nélkül); egy másik alternatíva, hogy csak mélységi szűrést alkalmazunk (centrifugálást nem).
Anioncserélőskromatoqráfiás (anion exchange; AEX) elválasztás
A nyers felülúszó szűrését követően a szűrletet kb. háromszoros térfogatú vízzel hígítjuk, hogy a vezetőképesség 5 mS/cm vagy ennél kevesebb legyen és a pH-t Triszbázissal 7,5-re állítjuk mielőtt az anyagot AEX-gyantára fölvinnénk.
Az AEX oszlop gyanta-ágy magassága kb. 10-20 cm, töltete Q Ceramic HyperD F (Biosepra) jó áramlási sajátságokkal. Az oszlopot 20 mM Trisz-szel (pH 7,5) és 50 mM nátrium-klorid-oldattal ekvilibráljuk. A hígított sejt-felülúszót ezután (10-15 mg rhEpo per ml gyanta) 4-8 cm/perc áramlási sebességgel az oszlopra visszük, az oszlopot 10-15 oszlop-térfogatnak (columm volume; CV) megfelelő mennyiségű ekvilibráló pufferrel mossuk. A terméket többfokozatú elucióval nyerjük, vagyis nagyobb vezetőképességű pufferre (20 mM Trisz, pH 7,5 150 mM-os nátrium-klorid-oldattal) váltunk át.
Az eluciós csúcsnak megfelelő frakciókat egyesítve kb. 50-60%-os kitermelést kapunk.
Alternatív megoldás lehet, ha az egyesített frakciókat ultraszüréssel koncentráljuk; ezzel a közbenső térfogatot csökkentjük és standardizáljuk a következő precipitáci• ♦ · · 67 A-.«e.
ós lépés körülményeit. Előnyösen 5-10 kDa visszatartású membránt használunk és a céltermék koncentrációt kb. 20 mg/ml-re állítjuk be.
Ammónium-szulfátos kicsapás
Az előző lépésben kapott egyesített frakciót rendszerint tovább tisztítjuk a szenynyezőként jelenlévő gazdasejt-proteinek (HCP) 2,4 M ammónium-szulfátos kicsapásával. Ennél az ammónium-szulfát koncentrációnál a csapadékban gyakorlatilag nincs termék, és HCP-mentes, tiszta felülúszó marad vissza, melyben az ammónium-szulfát koncentrációt hígítással < 240 mM-osra kell csökkenteni, mielőtt a következő tisztítási lépésre, az RPC-re (fordított fázisú kromatográfia) sor kerülne.
A kicsapást a következőképpen hajtjuk végre: 1 térfogat, a gyantáról eluált egyesített frakcióhoz 1,5 térfogat ammónium-szulfát törzsoldatot (4M ammónium-szulfát, 20 mM Trisz, pH 7,5) adunk, az elegyet 30 percig 10-15°C-on inkubáljuk és a csapadékot szűréssel elkülönítjük; először mélységi szűrés (Seitz Bio 10 vagy Cuno A90M08), majd 0,2 μ-os szűrés (Sartobran P, Sartorius; vagy Duropore 0,22 μ Millipore). Ha nagy az eluciós térfogat, vagyis híg az rhEpo-t tartalmazó egyesített frakció ( < 5 mg rhEpo/ml), akkor a HCP-kicsapást adott esetben végzett ultraszúréses koncentrálással (10 kDa cutoff) javíthatjuk.
Az ammónium-szulfátos kicsapás hatékonyabb, mint a hidrofób kölcsönhatással járó kromatográfia.
Az előző precipitációs lépésből visszamaradt ammónium-szulfát mennyiségét csökkentendő a terméket tartalmazó felülúszót a fent említett módon hígítani kell. Alternatív lehetőséget az ultraszűrés/diaszűrés jelent.
Előnyösen 5-10 kDa visszatartású membránt használunk, és az ammóniumszulfát koncentrációt 240 mM-nál kisebbre, a termék koncentrációját kb. 30 mg/ml-re állítjuk be. Az ultraszűrési lépésben 20 mM Trisz/HCI puffért (pH 7,0) használunk.
*·. /·. /·. *· :
% Λ .*». ►
Fordított fázisú kromatoqráfia
A következő tisztítási lépés a fordított fázisú kromatográfia, mely több szempontból is hasznos: a) a különböző izoformokat cukorvázuk alapján jól elválasztja (előbb az erősen glikozilezett/szialilezett forma eluálódik, aztán a kevésbé glikozilezett/szialilezett forma); b) a rezidunális gazdasejt-proteineket ez a nagy nyomású kromatográfiás módszer eltávolítja; és c) a kromatográfia hatásos lépés a vírus eltávolítására valamint a szerves oldószer hatására bekövetkező vírus inaktiválódás szempontjából is. A Source 30RPC (Amersham Biosciences) egy polimer gyanta, amely a közepes nyomáson ( < 10 bar) működik és b) nagy töménységű nátrium-hidroxiddal tisztítható. Az előnyös gyanta-ágy magasság 10-15 cm, az ajánlott betáplálás 8-12 mg rhEpo per ml gyanta.
Az RPC lépés előtt a terméket tartalmazó felülúszó ammónium-szulfát koncentrációját 0,24 M alatti értékre állítjuk be. Ezt a kondicionálást végezhetjük sorozatos azonnali hígításos megoldással (1 térf. rhEpo-felülúszó + 4 térf. 20 mM Trisz/HCI pH 7,0 + 5 térf. 50%-os acetonitril 20 mM Trisz-HCI (pH 7,0)-ben) az RPC-betáplálás alatt; vagy a drága oldószer megtakarítása érdekében előnyösen újra ultraszúrést /diaszűrést végzünk (ultraszürő 10 kDa visszatartási értékkel)), 20 mM Trisz/HCI pH 7-tel szemben a betáplálás előtt. Az oszlop betáplálás előtti ekvilibrálását és betáplálás utáni mosását 25 térfogat % acetonitrilt tartalmazó 20 mM-es Trisz-szel (pH 7,0) végezzük. A termék eluálása lineáris gradiens szerint 25%-ról 50%-ra növelt acetonitril-tartalmú eleggyel történik. Az elució során kis frakciókat (főként kb. 0,2 CV; alternative kb. 0,3-0,5 CV) gyűjtünk és a gyűjtő edénybe előzetesen 4 térfogat hígító puffért (50 mM Trisz, pH 7) töltünk, hogy az oldószer-koncentráció rögtön csökkenjen; a nagy oldószerkoncentráció ugyanis aggregálódást okozhat és zavarja a soron következő AEX kromatográfiát. Az elúciós csúcsot adó frakciók kb. első felét gyűjtjük össze és ezt dolgozzuk fel a továbbiakban. Ez az állomány tartalmazza ugyanis a preferált, nagyobb mértékben glikozilezett izoformokat. Ezzel a frackionálási megoldással eltüntetjük a dez-O glikozilezett rhEpo-t, melyben a Seri26 pozícióban az O-glikán hiányzik, és amely a sejttenyészetben akár 20%-ban is jelen lehet.
Egy alternatív eljárás szerint a frakciókat gyűjtő edénybe előzetesen 0,5 térfogat 20 mM-os Trisz-t (pH 7,0) teszünk - a fent ismertetett 4 térfogat helyett- és a frakciót ezzel 20-40 percig, vagy tovább inkubáljuk, hogy a vírus az oldószer hatására inaktíválódjon. Az inkubálási lépés után a frakciókhoz további 3,5 térfogat 20 mM-os Tirsz-t (pH 7,0) adunk az eredeti hígítatlan frakció térfogatra számolva és ezzel a vírus inaktivitását leállítjuk.
A frakciókat ( akár vírus inaktivitással, akár anélkül gyűjtöttük) további tisztítás céljából egyesítjük. A frakció - egyesítést rendszerint a maximális OD-érték 50-100%ánál kezdjük a görbe felszálló ágán és a leszálló ág 70-80%-a fölötti résznek megfelelő frakciókkal fejezzük be.
A korábbi elúciós frakciók gazdasejt proteineket, a későbbi elúciós frakciók kevésbé szialilizált és kevésbé aktív izoformokat tartalmazhatnak. Ezenkívül CZE-analízist is végezhetünk, mellyel biztosabbá tehetjük bizonyos izoformok frakcióinak azonosítását.
Anioncserés kromatográfia
A hígított RPC egyesített frakciót nagy teljesítményű anioncserés kromatografáló oszlopra visszük föl, mely segít a specifikus izoformok szelektív elkülönítésében és a gazdasejt proteinek eltávolításában. Ezúttal az izoformokat izoelektromos pont alapján, azaz a sziálsavak száma alapján választjuk el, mely szám a glikozilezettség mértékével arányos. Nagy felbontású gyantaként Q-Sepharose HP-t (Amersham Biosciences) használunk, melynek kiváló az elválasztóképessége. A gyantaágy magassága 15-20 cm. Minden körülményt, így a betáplálást, a gradienst és gyantaágy magasságot úgy választjuk meg, hogy a termék koncentráció meglehetősen kicsi legyen, különben mar káns utó-csúcsot kapunk az elúció során a termék oldszer-okozta aggregációja következtében.
Az RPC egyesített frakciót 2-4 mg Epo per ml gyanta arányban Q-Sepharose HP oszlopra visszük fel, melyet 20 mM Trisz-szel (pH 7) ekvilibráltunk. Az ekviribráló pufferrel végzett mosás után a terméket 10 oszlop-térfogatnak megfelelő eluenssel (ekvilibráló pufferben oldott nátrium-klorid; só-gradiens 0 -» 300 mM NaCI) eluáljuk. 0,1 CV vagy 0,25 CV frakciókat szedünk, és CZE alapján állapítjuk meg, hogy mely frakciók tartalmazzák a kívánt eritropoetin izoformot. Az AEX egyesített frakció jellemzően az elúciós csúcs második felének megfelelő, erősen glikozilezett és szialilizált izoformokat tartalmazó eluátumot tartalmazza.
A folyamat -ellenőrzését kapilláris zónás elektroforézissel (CZE) végezve pontosan definiált eritropoetin izoform-keveréket kaphatunk még akkor is, ha különböző fermentálás! körülmények vagy gazdaszervezetek alkalmazása miatt csak kevés erősen szialilizált izoform van jelen.
A CZE nagy felbontású módszer, mely különböző töltésű izoformok elválasztására alkalmas és kvantitatív eredményt ad az egyes frakciókban lévő minden egyes izoform vonatkozásában. Ennek az információnak a birtokában lehet konzisztens izoform profilhoz jutni és a megfelelő frakciókat egyesíteni. A korán eluálandó , kevésbé szialilizált izoformokat általában kihagyjuk és csak a későn eluálandó frakciókat egyesítjük.
Méret-kizárásos kromatoqráfia
Utolsó kromatográfiás lépésként az AEX egyesített frakció tisztaságát méretkizárásos úton finomíthatjuk tovább; ez a módszer eltávolítja a potenciális dimereket és nagyobb aggregátumokat és puffer-cserét biztosít a végső formuláláshoz. Ebben a lépésben Superdex 75 preparatív minőséget (Pharmacia) használunk, melynek nagyobb betáplált térfogatok (legfeljebb az oszlop térfogat 15%-a) esetén is jó a felbontóképessége. Az előnyös gyantaágy magasság 60-80 cm.
Minthogy az előző lépés szerinti AEX-kromatográfiát nem lehet úgy lefolytatni, hogy az egyesített frakcióban a termék nagy koncentrációban legyen jelen, az egyesített frakciót a gél szűrés előtt be kell töményíteni. Ezt ultraszűréssel végezzük el 10 kDa visszatartású ultraszürő-membránt használva; ezzel kb. 10-szeresre koncentrált lesz az ultraszűrőn fennmaradó anyag (4F-retentate) kb. 10 mg eritropoetin/ml töménységgel.
Az UF-retentate-ból kb. 3-7 CV%-nyi mennyiséget közvetlenül viszünk fel a Superdex 75 (preparatív minőség) oszlopra, melyet előzetesen ekvilibráltunk (ekvilibrálószer: 20 mM nátrium-foszfát pH 7,0, 75 mM nátrium-klorid). Kb. 1-1,5 CV után a termék kezd az oszlopról eluálódni és az elúciós csúcsnak megfelelő eluátumot gyűjtjük össze.
Nano-szűrés
Egy esetleges vírus-terhelést elkerülendő, egy inaktíváló (dead-end) vírusszűrést is végrehajtunk. Ezt a szűrést egy speciális membránon végezzük, mely olyan kialakítású, hogy akár 15 nm-es részecskéket is el lehet vele távolítani (ilyen pl. a Planova 15 N; Asahi). Alternatív inaktiváló nano-szűrő egységek pl. a PÁLL Ultipor VF, DV20 minőség vagy a Millipore Viresolve NFP szűrőbetétek és kapszulák. Különösen a kis, burokfehérjével nem rendelkező vírusok (pl. parvovirus) esetében nincs is más eszköz a vírus eltávolítására vagy inaktiválására.
A méret-kizárásos kromatografálásnál kapott egyesített frakciót steril szűrés után, alkalmas membránnal ellátott inaktiváló (dead-end) filteren átbocsátjuk; a kapott szűrlet adja az ömlesztett hatóanyagot. Alternatív megoldásként a nano-szűrést az ultraszüréses betöményítés és a méret-kizárosos kromatografálás közé is beiktathatjuk.
A fenti leírásban említett minden publikációt a jelen leírás részének tekintünk. A találmány szerinti rendszer és a leírt módszerek különböző modifikációi és változatai a szakember számára nyilvánvalóak, anélkül, hogy el kellene térnie az oltalmi körtől és a találmány szellemétől. Bár a találmányt konkrét, előnyös megvalósítási módok kapcsán irtuk le, az igényelt találmány nem korlátozható igazságtalanul ezekre. Valójában a találmány foganatosítására leírt lehetőségek azon módozatai, melyek a molekuláris biológiában járatos szakember számára nyilvánvalóak, szándékaink szerint benne vannak a következő igénypontok oltalmi körében.

Claims (24)

  1. 73 - SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás a kívánt rekombináns polipeptidet expresszáló transzformált eukarióta gazdasejtek előállítására, mely eljárásban valamely eukarióta gazdasejtbe bejuttatunk:
    (a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciát; és (ii) a szelektálásra alkalmas markert kódoló második nukleotid szekvenciát, mely második nukleotid szekvencia a gazdasejt szelekciós szerrel történő érintkeztetésekor amplifikálódik, és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a második nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markert kódol;
    mely első polinukleotid vektor és második polinukleotid vektor a gazdasejt genomjába integrálódik.
  2. 2. Az 1. igénypont szerint eljárás, azzal jellemezve, hogy a második nukleotid szekvencia valamely dihdirofolát-reduktáz polipeptidet kódol és a szelekciós szer a metotrexát.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kívánt rekombináns polipeptid a humán eritropoetin.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a harmadik nukleotid szekvencia antibiotikum-rezisztenciát kódol.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antibiotikum a G-418, a neomicin vagy a neomicincsoportba tartozó más antibiotikum.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt kínaihörcsög-ovárium (CHO)-sejt.
  7. 7. Transzformált eukarióta gazdasejt mely egy vagy több kromoszójájába integráltan tartalmaz: (a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (i) a kívánt rekombináns polipeptidet kódoló első nukleotid szekvenciát; és (ii) a szelektálásra alkalmas markert kódoló második nukleotid szekvenciát, mely második nukleotid szekvencia a gazdasejt szelekciós szerrel történő érintkeztetésekor amplifikálódik, és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a második nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markert kódol.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a második nukleotid szekvencia valamely dihidrofolát-reduktáz polipeptidet kódol.
  9. 9. A 7. igénypont szerinti gazdasejt, ahol a kívánt rekombináns polipeptid az eritropoetin.
  10. 10. A 7. igénypont szerinti gazdasejt, mely CHO-sejt.
  11. 11. Eljárás a kívánt rekombináns polipeptid termelésére, mely eljárásban a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti transzformált gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik az első nukleotid szekvencia expresszióját.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, amelyben a gazdasejtet olyan szelekciós szer jelenlétében tenyésztjük, mely a második nukleotid szekvencia amplifikációját eredményezi.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, amelyben a második nukleotid szekvencia valamely dihdirofolát-reduktáz polipeptidet kódol és a szelekciós szer a metotrexát.
  14. 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, amelyben a kívánt rekombináns polipeptid az eritropoetin.
  15. 15. A 11. igénypont szerinti eljárás, amelyben az expresszálódott, kívánt rekombináns polipeptid szekréció útján a táptalajba jut.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, amelyben az expresszálódott, kívánt rekombináns polipeptidet a táptalajból nyerjük ki.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, amelyben a kívánt rekombináns polipeptid az eritropoetin.
  18. 18. Transzformált emlős gazdasejt, amely egy vagy több kromoszómájába stabilan integráltan tartalmaz (a) egy polinukleotid szekvenciát, mely a dihidrofolát-reduktáz polipeptidet és az eritropoetint kódolja, és (b) egy, az (a) polinukleotid szekvenciától különböző polinukleotid szekvenciát, mely az eritropoetint és azt a polipeptidet kódolja, mely egy antibiotikummal szemben a rezisztenciát hordozza.
  19. 19. Eljárás rekombináns humán eritropoetin előállítására, azzal jellemezve, hogy a 18. igénypont szerinti gazdasejtet olyan körülmények között tenyésztjük, melyek lehetővé teszik humán eritropoetint kódoló polinukleotid szekvencia expresszióját.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtet metotrexát jelenlétében tenyésztjük.
  21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expresszálódott kívánt rekombináns polipeptid szekréció útján a táptalajba jut.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az epxresszálódott, kívánt rekombináns polipeptidet a táptalajból kinyerjük.
  23. 23. Kompozíció, mely tartalmaz (a) egy első polinukleotid vektort, mely tartalmazza (í) az első nukleotid szekvenciát, mely a kívánt rekombináns polipeptidet kódolja, és (ii) a második nukleotid szekvenciát, mely ha a gazdasejt genomjába integráltan van jelen, amplifikálódik, ha a gazdasejtet olyan szelekciós szerrel hozzuk érintkezésbe, mely a nukleotid szekvencia amplifikálódását idézi elő; és (b) egy második polinukleotid vektort, melynek nukleotid szekvenciája lényegében azonos az első polinukleotid vektoréval, azzal az eltéréssel, hogy a második nukleotid szekvencia helyett egy harmadik nukleotid szekvenciát tartalmaz, mely egy másik szelekcióra alkalmas markert kódol.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti kompozíció, melyben a kívánt rekombináns polipeptid a humán eritropoetin.
    A meghatalmazott szabadalmi ügyvivő az S.B.G. & K. Szabadalmi Ügyvivői Iroda tagja
    H-1062 Budapest, Andrássy út 113 Tblefon: 461-1000 Fax: 461-1099
HU0500059A 2001-11-28 2002-11-26 Eljárás rekombináns polipeptid előállítására HUP0500059A2 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33386801P 2001-11-28 2001-11-28
PCT/EP2002/013297 WO2003046187A1 (en) 2001-11-28 2002-11-26 Method for producing a recombinant polypeptide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUP0500059A2 true HUP0500059A2 (hu) 2005-04-28

Family

ID=23304597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0500059A HUP0500059A2 (hu) 2001-11-28 2002-11-26 Eljárás rekombináns polipeptid előállítására

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20050084969A1 (hu)
EP (1) EP1453966B1 (hu)
JP (1) JP4723185B2 (hu)
KR (1) KR20040063937A (hu)
CN (1) CN1596310A (hu)
AU (1) AU2002358047A1 (hu)
BR (1) BR0214489A (hu)
CA (1) CA2468832A1 (hu)
HR (1) HRP20040477A2 (hu)
HU (1) HUP0500059A2 (hu)
IL (1) IL161909A0 (hu)
MX (1) MXPA04005191A (hu)
NO (1) NO20042173L (hu)
NZ (1) NZ533133A (hu)
PL (1) PL370550A1 (hu)
RU (1) RU2004119814A (hu)
SI (1) SI1453966T1 (hu)
WO (1) WO2003046187A1 (hu)
ZA (1) ZA200403802B (hu)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005033135A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-14 Daewoong Co., Ltd. Process for purifying human thrombopoietin with high content of sialic acid
AR053416A1 (es) * 2005-11-10 2007-05-09 Protech Pharma S A Combinacion de glicoisoformas para el tratamiento o prevencion de la septicemia, linea celular transgenica productora de glicoformas de eritropoyetina, composicion farmaceutica que comprende a dicha combinacion, procedimientos para obtener la linea celular, procedimiento para producir dicha combinac
KR101280704B1 (ko) 2007-10-12 2013-07-01 에프. 호프만-라 로슈 아게 다수의 핵산으로부터의 단백질 발현
WO2012077128A1 (en) * 2010-12-07 2012-06-14 Intas Biopharmaceuticals Limited A novel cell line development process to produce recombinant proteins using twin vector expression system
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
SG11201507230PA (en) 2013-03-12 2015-10-29 Abbvie Inc Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014138921A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Apotex Inc. Enhanced liquid formulation stability of erythropoietin alpha through purification processing
JP6050289B2 (ja) * 2013-07-11 2016-12-21 Ｊｃｒファーマ株式会社 組換え蛋白質高発現細胞株の選択法
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
BR112019016970A2 (pt) 2017-03-10 2020-04-07 Hoffmann La Roche método para produzir um anticorpo multiespecífico

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4965199A (en) * 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
IL74909A (en) * 1984-04-20 1992-01-15 Genentech Inc Preparation of functional human factor viii and dna sequences,expression vectors,transformed microorganisms and cell lines used therein
DE3624453A1 (de) * 1986-07-19 1988-01-28 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung von humanem antithrombin iii (atiii), dafuer geeignete vektoren und wirtszellen, so erhaltenes, biologisch aktives atiii und dieses enthaltende arzneimittel
EP0319206A3 (en) * 1987-11-30 1990-04-18 Berlex Laboratories, Inc. Gene amplification
IL118201A (en) * 1995-05-11 2004-12-15 Roche Diagnostics Gmbh Preparation comprising a protein with human erythropoietin activity which is free of serum and non-recombinant mammalian protein and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1453966A1 (en) 2004-09-08
RU2004119814A (ru) 2005-04-20
WO2003046187A1 (en) 2003-06-05
NO20042173L (no) 2004-08-11
IL161909A0 (en) 2005-11-20
ZA200403802B (en) 2005-07-01
SI1453966T1 (sl) 2012-11-30
AU2002358047A1 (en) 2003-06-10
PL370550A1 (en) 2005-05-30
KR20040063937A (ko) 2004-07-14
JP2005510242A (ja) 2005-04-21
CN1596310A (zh) 2005-03-16
CA2468832A1 (en) 2003-06-05
EP1453966B1 (en) 2012-07-11
JP4723185B2 (ja) 2011-07-13
MXPA04005191A (es) 2005-04-29
HRP20040477A2 (en) 2005-06-30
BR0214489A (pt) 2004-10-19
NZ533133A (en) 2006-02-24
US20050084969A1 (en) 2005-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUP0500059A2 (hu) Eljárás rekombináns polipeptid előállítására
US12384852B2 (en) Genetically modified NK-92 cells having a safety switch
JP4293908B2 (ja) 組換えヒトエリスロポエチンのクロマトグラフィー精製
NZ533084A (en) Cell culture process
KR100361997B1 (ko) 안정한살균/투과성-증가단백질산물및그것을포함하는제약학적조성물
WO2003046162A2 (en) Process for the production of polypeptides in mammalian cell cultures
AU2006277568B2 (en) Expression vector and methods of producing high levels of proteins
US6555373B1 (en) Methods for identifying human cell lines useful for endogenous gene activation isolated human cell lines identified thereby, and uses thereof
RU2801178C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА IGA2m1-ИЗОТИПА В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
ZA200302414B (en) Methods for preparing human thrombopoietin polypeptides by mammalian cell cultures.
CN117242175A (zh) 超唾液酸化细胞

Legal Events

Date Code Title Description
FD9A Lapse of provisional protection due to non-payment of fees