HUP0001120A2 - Vectors and methods for gene transfer to cells - Google Patents
Vectors and methods for gene transfer to cellsInfo
- Publication number
- HUP0001120A2 HUP0001120A2 HU0001120A HUP0001120A HUP0001120A2 HU P0001120 A2 HUP0001120 A2 HU P0001120A2 HU 0001120 A HU0001120 A HU 0001120A HU P0001120 A HUP0001120 A HU P0001120A HU P0001120 A2 HUP0001120 A2 HU P0001120A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sequence
- cells
- protein
- vector
- adenovirus
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
- C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10345—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/40—Vectors comprising a peptide as targeting moiety, e.g. a synthetic peptide, from undefined source
- C12N2810/405—Vectors comprising RGD peptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
·.·.···:···
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
Képviselő:
Danubia
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
Budapest
Vektorok és eljárások sejtekbe irányuló gén transzferre
A találmány tárgyát nem-nativ aminosav-szekvenciát tartalmazó kiméra adenovirus-burokproteinek képezik, amelyek sokkal hatékonyabban képesek a burokproteint tartalmazó vektor sejtekbe történő bejutását irányítani, mint az egyébként hasonló, de vad-típusú adenovírus-burokproteint hordozó vektorok. A kiméra burokprotein előnyösen, fiber-, hexon- vagy penton-protein. A találmány tárgyát képezik továbbá, a fenti kiméra adenovírus-burokproteineket tartalmazó rekombináns vektorok, ilyen vektorokkal transzfektált gazdasejtek, valamint ilyen vektorok előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások.
A találmány szerinti eljárás alkalmas különböző gének gazdaszervezetekbe történő - a korábbiaknál hatékonyabb bejuttatására.
Az adenovírusok az Adenoviridae víruscsaládba tartoznak, amelyet két nemzetségre osztunk, nevezetesen, a Ma st adenovirus és Aviadenovirus nemzetségekre. Az adenovírusok külső burok (peplon) nélküli, körülbelül 65Aktaszámunk: 87951-1045/PÁ
80 nanométer átmérőjű szabályos ikozahedronok [Horne és mtsai.: J. Mól. Bioi. 84 (1959)]. Az adenovíruskapszidot (a vírus-nukleinsavat körülvevő fehérjeburkot) 252 kapszomer alkotja, amelyek közül 240 hexon, 12 pedig penton [Ginsberg és mtsai.: Virology 28, 782 (1966)]. A hexonok és pentonok három különböző virus-polipeptidből származnak [Maizei és mtsai.: Virology 36, 115 (1968);
Weber és mtsai.: Virology 7 6, 709 (1977)]. A hexon három azonos, egyenként 967 aminosavból álló polipeptidet tartalmaz, amelyet 2. polipeptidnek nevezünk [Roberts és mtsai.: Science 232, 1148 (1986)]. A penton, a kapszidhoz kapcsolódó pentonbázist, valamint a pentonbázishoz nem-kovalens módon kötődő, és a abból kinyúló fibert tartalmaz. A fiberprotein három azonos, egyenként 582 aminosavból álló polipeptidből áll, amelyet 4. polipeptidnek nevezünk. A 2. szerotipusú adenovirus (Ad2) pentonbázis-proteinje öt azonos, egyenként 571 aminosavat tartalmazó, 3. polipeptidnek nevezett protein-alegységből felépülő gyűrű alakú komplex [Boudin és mtsai.: Virology 92, 125 (1979)]. Az adenovírusburokban (kapszidban) kimutathatók még az úgy nevezett 9., 6. és 3.a proteinek, amelyekről feltételezzük, hogy a viruskapszid stabilizálásában játszanak szerepet [ Stewart és mtsai.: Cell 67, 145 (1991); Stewart és mtsai.: EMBO J. 12 (7), 2589 (1993)].
Miután az adenovirus sejtekhez kötődött, receptorok közvetítésével, a sejt klatrinnal fedett endocitás vezikulumaiba jut [Svensson és mtsai.: J. Virol. 51, 687 (1984); Chardonnet és mtsai.: Virology 40, 462 (1970)]. A sejtekbe jutó virionok lépcsőzetesen alkotórészeikre bomlanak, amely során a vírus számos struktúrproteinje leválik [Greber és mtsai.: Cell 75, 477 (1993)]. A burok leépülése folyamán a vírusrészecskék, pH-függő mechanizmus révén, a sejt endoszómáinak szétesését eredményezik [Fitzgerald és mtsai.: Cell 32, 607 (1983)]; a folyamat lényege még- kevéssé ismert. Ezt követően, a vírusrészecskék a sejt nukleáris pórus-komplexébe jutnak [Dales és mtsai.: Virology 56, 465 (1973)], amelyen keresztül a vírusgénem a magba kerül, megindítva a tényleges fertőzési folyamatot.
Ahhoz, hogy az adenovírusok hatékonyan kapcsolódjanak sejtekhez és azokat hatékonyan fertőzzék, két különböző, sejtreceptor egyidejű jelenlétére van szükség [Wickham és mtsai.: Cell 7 3, 309 (1993)]. Először, a vírus az Ad2fiberproteinen keresztül a sejthez kapcsolódik, egy eddig még nem azonosított receptorhoz történő kötődés révén. Ezután, a pentonbázis av-integrinekhez kötődik, amely utóbbiak közé, extracelluláris mátrix-molekulákhoz és más molekulákhoz történő sejtadhéziót közvetítő, heterodimer sejtfelszíni receptorok tartoznak [Hynes: Cell 69, 11 (1992)].
A fiberprotein trimer [Devaux és mtsai.: J. Molec. Biol. 215, 567 (1990)], amelyet a következő régiókra osztunk: farok (tail), nyél (shaft) és gomb (knob). A fiber nyelét képező régiót 15 aminosavból álló ismétlődő egységek építik fel, amelyek feltehetően, egymással váltakozó β-szálakat és β-iveket képeznek [Green és mtsai.: EMBO J. 2, 1357 (1983)]. A fiber nyelét képező régió hossza, és a 15 aminosavból álló ismétlődő egységek száma az egyes ···· ··*· adenovírus-szerotípusok közt eltérő. Például, az Ad2fibernyél 37 nanométer hosszú és 22 ismétlődő egységet tartalmaz, míg az Ad3-fiber 11 nanométer hosszú és 6 ismétlődő egységet tartalmaz. A fiberprotein receptorkötő doménja a gombrégióban, a protein utolsó 200 aminosavát kódoló régióban található [Henry és mtsai.: J. Virology 68 (8), 5239 (1994)]. A trimerizációért felelős régió szintén a protein gombrégiójában található [Henry és mtsai.: (1994) lásd fent]. Az utolsó 40 aminosavat nem-tartalmazó deléciós mutáns nem képez trimekeket, és nem képes pentonbázishoz kötődni [Novelli és mtsai.: Virology 185, 365 (1991)]. A fiberprotein trimerizációja tehát a pentonbázishoz történő kötődés feltétele. Azok a nukleáris lokalizációs szignálok, amelyek a protein citoplazmában történő szintetizálódását követően, annak magba történő bejutását irányítják, hogy azok ott vírusrészecskékké álljanak össze, a protein Nterminális régiójában találhatók [Novelli és mtsai.: (1991), lásd fent]. A fiber és a hexon együttesen, a vírus fő antigén-determinánsai, és ugyancsak meghatározzák a vírus szerotípus-specifitását [Watson és mtsai.: J. Gén. Virol. 6_9, 525 (1988) ] .
Rekombináns adenovírus-vektorokat a korábbiakban már alkalmaztak egy vagy több rekombináns gén sejtekhez történő célzott eljuttatására, amikor is, a gént kezelésre szoruló beteg sejtekhez vagy szövetekhez juttatták. Ilyen vektorok azzal az előnyös tulajdonsággal rendelkeznek, hogy az adenovírus-proteinek expresszálódásához nincs szükség a gazdasejt proliferációjára [Horwitz és mtsai.: Virology,
- 5 Raven Press, New York, 2. kötet, 1679-1721. oldal (1990); valamint Berkner: BioTechniques 6, 616 (1988)]. Ezen felül, ha a szomatikus génterápiával célzottan a tüdő szöveteit kívánjuk kezelni, a fenti a vektorok alkalmazása azzal a további előnnyel jár, hogy azok eredetileg is trofizmust mutatnak a légzőszervek epithelsejtjei iránt [Straus: Adenoviruses, Plenan Press, New York, 451-496. oldal (1984)] .
Adenovírusok humán génterápiás vektorként történő alkalmazása a további potenciális előnyökkel jár: (i) ilyen vektorok alkalmazása esetén, rekombináció ritkán figyelhető meg; (ii) adenovírus-vektorok, jelenlegi ismereteink szerint, humán malignus elváltozásokkal nem hozhatók kapcsolatba, a humán adenovírus-fertőzések gyakori előfordulása ellenére; (iii) az adenovírus-genom (amely lineáris, kettős szálú DNS), úgy módosítható, hogy az alkalmassá váljon különböző méretű idegen gének befogadására; (iv) adenovírusvektorok DNS-e nem épül be a sejtek kromoszómájába, miáltal annak hatása átmeneti, és valószerűtlen, hogy a sejt normális funkcióit gátolja; (v) az adenovírusok képesek nemosztódó vagy véglegesen differenciálódott sejtek, például az agy és tüdő sejtjeinek fertőzésére; továbbá (vi) élő, elengedhetetlenül replikációs képességgel rendelkező adenovírusok humán vakcinaként történő alkalmazása biztonságosnak bizonyult [Horwitz és mtsai.: (1990), lásd fent; Berkner és mtsai.: (1988), lásd fent; Straus és mtsai.:(1984), lásd fent; Chanock és mtsai.: JAMA 195, 151 (1966); Haj-Ahmad és mtsai.: J. Virol. 57, 267 (1986); va lamint Ballay és mtsai.: EMBO 4, 3861 (1985); WO/94/17 832 számú PCT közzétételi irat].
Az adenovirus-közvetítette génterápia hátránya, hogy a vektor alkalmazását követően két héttel, a génexpresszió jelentős mértékű csökkenése figyelhető meg. Számos terápiás alkalmazás esetén, az expresszió csökkenése a vírusvektor ismételt beadását teszi szükségessé. Az ismételt adagolást követően azonban, neutralizáló ellenanyagok képződnek a vírusvektor fiber- és hexon- proteinjeivel szemben [Wohlfart és mtsai.: J. Virology 62, 2321 (1988); Wohlfart és mtsai.: J. Virology 56, 896 (1985)]. A vírussal szemben irányuló ellenanyagválasz gátolhatja a vírusvektor ismételt beadásának hatékonyságát.
Rekombináns adenovírusok génterápiás célból történő alkalmazásának további hátránya, hogy bizonyos sejtek esetében, nehéz adenovirus-közvetítette géntranszfert előidézni. Például limfociták, amelyek alv-integrin adenovírusreceptorokat nem-hordoznak, adenovírusokkal nehezen fertőzhetők [Silver és mtsai.: Virology 165, 377 (1988); Horvath és mtsai.: J. Virology 62(1), 341 (1988)]. Az adenovírusok említett jellemzője - nevezetesen, hogy nem képesek valamennyi típusú sejt fertőzésére -, arra késztette a kutatókat, hogy módot keressenek adenovírusok olyan sejtekbe történő bejuttatására, amelyek adenovírussal egyébként nem fertőzhetők, például azért, mert nem hordoznak adenovírusreceptorokat. Például, a vírust, emlőssejtek számára megfelelő ligandumot képező molekulát (például transzferrint) tartalmazó DNS-polilizin-komplexhez kapcsolták [lásd példá ul, Wagner és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 6099 (1992); WO/95/26412 számú PCT közzétételi irat]. Hasonlóképp, az adenovírus-fiberproteinek szférikusán blokkolhatok ellenanyagokkal, és a vírusrészecskéhez kémiai úton, szövet-specifikus ellenanyagok kapcsolhatók [Cotten és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 6094 (1992).
A fenti megközelítési módok hátránya az, hogy további lépéseket kell alkalmaznunk, hogy nagy méretű molekulákat, például polilizint, receptor-ligandumokat vagy ellenanyagokat kovalens módon a vírushoz kapcsoljunk [Cotten.: (1992), lásd fent; Wagner és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 6099 (1992)]. Ez a vektor méretének növekedését, és egyúttal, az előállítási költségek emelkedését eredményezi. Ezen felül, a célzott részecske-komplexek struktúrája nem homogén, és azok hatékonyságát lényegesen befolyásolja, az alkalmazott vírusrészecskék, kapcsoló molekulák és célzó molekulák aránya. A fenti megközelítési mód alkalmazása adenovírus-közvetítette génterápia számára hozzáférhető sejtek körének bővítésére, tehát egyáltalán nem optimális.
Nem régiben, az in vivo adenovírus-közvetítette génterápia hatékonyságát megkérdőjelezték, még olyan sejtek esetében is, amelyekbe az adenovírusok közismerten hatékonyan bejutnak [Grubb és mtsai.: Nature 371, 802 81994); Dupuit és mtsai.: Human Gene Therapy 6, 1185 (1995)]. A Fíberreceptort, amelyen keresztül az adenovírusok először lépnek kapcsolatba a sejtekkel, nem sikerült azonosítani, és a receptorok különböző szövetekben történő megoszlását sem vizsgálták. Általánosságban feltételezték, hogy a tüdő ·· ·
- 8 ben és bélben található epithelsejtek elegendő mennyiségben termelik a fiberreceptort ahhoz, hogy azok optimális módon transzdukálhatók legyenek. Eddig azonban, ezt nem támasztották alá vizsgálatokkal. Valójában, egyes vizsgálatok arra utaltak, hogy adenovirus-gének kevésbé hatékonyan jutnak be differenciálódott tüdőepitheliumba, mint proliferálódó vagy nem-differenciálódott sejtekbe [Grubb és mtsai.: lásd fent; Dupuit és mtsai.: lásd fent).
Adenovírusokról kimutatták, hogy számos szövetet képesek transzdukálni, például tüdőepithel-sejteket [Rosenfeld és mtsai.: Cell 68, 143 (1992) ] ; izomsejteket [Quantin és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2581 (1992)]; endothelsejteket [Lemarchand és mtsai.: Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 6482 (1992)]; fibroblasztokat [Anton és mtsai.: J. Virology £9, 4600 (1995)]; valamint idegsejteket [La Salle és mtsai.: Science 259, 988 (1993)]. A fenti vizsgálatok többségében azonban, igen nagy számú vírusrészecskét alkalmaztak a transzdukció előidézésére, gyakran több, mint sejtenként 100 plakk-képző egységet (plaque forming units, pfu) , azaz, 100-as fertőzési többszörösnek (multiplicity of infection, MOI) megfelelő vírusrészecskét. Az, hogy a transzdukció eléréséhez magas MOI-értékeket kell alkalmaznunk, előnytelen, mivel magas dózisok alkalmazásával, az adenovírus-fertőzéssel kapcsolatosan létrejövő immunválasz is szükségszerűen felerősödik.
Továbbra is szükség van tehát vektorokra, például adenovírus-vektorokra, amelyek alacsony MOI-értékek alkalmazása mellet is nagy hatékonysággal képesek sejteket fér9 . ·. :.:. j‘ ···· ··»· tőzni, és amelyek a fertőzés szempontjából széles gazdaspektrummal rendelkeznek. Megkíséreltük a rekombináns adenovirus génterápiával kapcsolatos említett problémák legalább egy részének leküzdését. Közelebbről, a találmány tárgyát képezik széles gazdaspektrummal rendelkező vektorok (például adenovírus-vektorok), amelyek alacsony MOI-értékek alkalmazása mellet is nagy hatékonysággal képesek sejtekbe jutni, miáltal csökkenthető a rekombináns adenovírusvektorok beadandó mennyisége, és csökkenthetők az adagolással kapcsolatos esetleges mellékhatások / komplikációk. A találmány tárgyát képezi továbbá, génterápiás eljárások, amelyek szerint homogén adenovírusokat alkalmazunk, amelyek vírusrészecskéjét az adenovírus-genom szintjén módosítottuk, anélkül, hogy a vírusrészecskék további kémiai átalakítására lenne szükség. A találmány említett és egyéb megvalósítási módjai és előnyei, valamint további, újdonságot jelentő sajátságai nyilvánvalóak lesznek az alábbi részletes leírás alapján.
Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát képezik kiméra adenovírusburokproteinek (például fiber-, hexon- vagy penton- proteinek) , amelyek annyiban térnek el a vad-típusú (azaz, natív) fiberproteintől, hogy abba nem-natív aminosav-szekvenciát építettünk be, előnyösen, a karboxi-terminális végre vagy annak közelébe. Az így kapott kiméra adenovírus-burokproteinek sokkal hatékonyabban képesek a burokproteint tar- ···· V ---· · · ♦ · · z · · · . f r r - io talmazó vektor sejtekbe történő bejutását irányítani, mint az egyébként azonos, de a kiméra adenovírus-burokprotein helyett vad-típusú adenovírus-burokproteint hordozó vektorok. A hatékonyabb bejutás egyik közvetlen következménye az, hogy a kiméra adenovírus-burokprotein képessé teszi az adenovírust számos olyan sejttípushoz történő kötődésre és azokba történő bejutásra, amelyekbe a vad-típusú burokproteint tartalmazó adenovírusok tipikusan nem képesek bejutni, vagy csak alacsony hatékonysággal képesek bejutni. A találmány tárgyát képezik továbbá, a kiméra adenovírusburokproteint tartalmazó adenovírus-vektorok, valamint ilyen vektorok előállítására és alkalmazására szolgáló eljárások.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a leíráshoz csatolt ábrákat.
Az 1. ábrán látható oszlopgrafikonon vad-típusú adenovírusok, különböző sejttípusokhoz történő kötődését szemléltetjük (az alkalmazott vírusmennyiség százalékában kifejezve) .
A 2. A-B ábrákon a vad-típusú adenovírus-fibergén végéhez kapcsolt nukleinsav-szekvenciát ábrázoltuk (2.A ábra) , miáltal a karboxi-terminális végen nem-natív aminosavszekvenciát hordozó, kiméra adenovírus-fiberproteint kaptunk (2.B ábra). Az ábrán látható, hogy a poliA-toldalék hossza, és következésképp, a kapott proteinben a lizinek száma változhat.
A 3. ábrán a pAd-BS-59-100-UTV-jelzésű kiírtéra fiberproteint tartalmazó adenovirus transzfervektor, közti transzfervektoron keresztül történő előállításának vázlatos ábrázolása látható. Közelebbről, a pAD-NS-83-100- (más néven, P193NS-83-100- vagy pNS-83-100-) vektorból kiindulva állítottuk elő a fibert nem kódoló [azaz, (F) ] pAD-NS-83100- (más néven, p!93NS(ÁF)- vagy pNS(ÁF)-] vektort (Areakcióút); a pAD-NS-83-100 (F~)-vektorból kiindulva állítottuk elő a pAD-NS-83-100-UTV- (más néven, pl93NS(F5*)-, pl93(F5*)~ vagy pNS(F5*)-] vektort (B- reakcióút); és a pAD-NS-83-100-UTV-vektorból kiindulva állítottuk elő a pADBS-59-100-UTV-vektort (C-reakcióút).
A 4.A-D ábrákon a GV10-UTV előállításánál alkalmazott oligonukleotidokat tüntettük fel, azaz, a 9. azonosítószámú szekvencia szerinti (4.A ábra), a 10. azonosítószámú szekvencia szerinti (4.B ábra), a 11. azonosítószámú szekvencia szerinti (4.C ábra) és a 12. azonosítószámú szekvencia szerinti (4.D ábra) láncindító oligonukleotidokat.
Az 5. ábrán Western-blot vizsgálat eredménye látható, amely szerint, a kiméra adenovírus-burokprotein (UTV) mérete megnövekedett a vad-típusú fiberprotein (WT) méretéhez képest.
A 6.A-B ábrákon látható grafikonokon vad-típusú fiberproteint tartalmazó vektor (azaz, GVlO-vektor; üres háromszögek) és kiméra fiberproteint tartalmazó adenovírusvektor (azaz, GV10-UTV-vektor; sötét karikák) kötődését hasonlítottuk össze, receptort hordozó (A549; 6 .A ábra) és receptort nem-hordozó sejtek esetében (HS-68; 6.B ábra).
- 12 A 7. ábrán a kötődött UTV mennyiségét ábrázoltuk (beütésszám/perc; count per minute, CPM), különböző kompetitorok koncentrációjának függvényében (μg/ml), egy olyan vizsgálatban, amelyben kiméra adenovírusfiberprotein, receptort nem-tartalmazó sejtekhez (például HS-68-fibroblasztokhoz) történő kötődésének gátlására a következő szolúbilis faktorokat alkalmaztuk: kondroitinszulfátot (üres karikák); heparint (sötét karikák); mucint (sötét háromszögek); és lazacsperma-DNS-t (üres háromszögek) .
A 8. ábrán a kötődött UTV mennyiségét ábrázoltuk (CPM), különböző enzimek hígításainak függvényében, egy olyan vizsgálatban, amelyben kiméra adenovírusfiberprotein, receptort nem-tartalmazó sejtekhez (például HS-68-fibroblasztokhoz) történő kötődésének gátlására a következő enzimeket alkalmaztuk: kondroitináz (üres karikák, szaggatott vonal); heparináz (üres karikák, folyamatos vonal) ; és szialidáz (háromszögek, folyamatos vonal).
A 9. ábrán látható oszlopgrafikonon lacZ-riportergén, vad-típusú fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektor (azaz, GV10) és kiméra fiberproteint tartalmazó adenovírusvektor (azaz, GV10-UTV) alkalmazásával történő bejuttatásának hatékonyságát hasonlítottuk össze, a riportergén különböző receptor-plusz (receptort hordozó) és receptor-minusz (receptort nem-hordozó) sejtekben meghatározott expressziója alapján (azaz, relative light units; RLU, vagyis relatív fényintenzitás-egységek meghatározása alapján).
A 10. ábrán látható oszlopgrafikonon lacZ-riportergén, vad-típusú fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektor (azaz, GV10) és kiméra fiberproteint tartalmazó adenovírusvektor (azaz, GV10-UTV) alkalmazásával történő bejuttatásának hatékonyságát hasonlítottuk össze, egértüdőben, a riportergén expressziója alapján (azaz, relative light units; RLU, vagyis relatív fényintenzitás-egységek meghatározása alapján).
A 11. ábrán látható oszlopgrafikonon, vad-típusú fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektorhoz (azaz, GV10vektorhoz; sötét oszlopok) és kiméra fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektorhoz (azaz, GV10-UTV-vektorhoz; üres oszlopok) protein-DNS-kölcsönhatáson keresztül potenciálisan kötődött riportergén (azaz, a pGUS-vektorban található riportergén) sejtekbe történő bejuttatásának hatékonyságát hasonlítottuk össze, 293-sejtek, A549-sejtek és H700-Tsejtek esetében.
A 12. ábrán a pl93(F*)- [a 3. ábrán pAD-NS-83-100-UTV-, vagy más néven, pl93(F*)- vagy pNS(F*)-] jelzésű, adenovirus fiberkimérák előállítására alkalmazott plazmid részleteit, valamint a plazmid által kódolt mutáns fiberprotein C-terminális részének szekvenciáját ábrázoltuk (a poliadenilezési helyet vastag betűvel szedtük).
A 13. ábrán, a pl93NS(F*)pGS(K7)- [más néven, pl93(F5*)pGS(K7)- vagy pNS(F5*)pK7-] jelzésű, adenovírusfiberkimérák előállítására alkalmazott plazmidot ábrázol tuk .
- 14 A 14. ábrán a pBSS-75-100-pGS(null)- [más néven, pBSS75-100-ÁE3-pGS(null)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 15. ábrán a pBSS-75-100-pGS(RK32) - [más néven, pBSS75-100-ÁE3-pGS(RKKK) 2~ vagy pBSS-75-100-ÁE3-pGS(RKKK2)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 16. ábrán a pBSS-75-100-pGS(RK33)- [más néven, pBSS75-100-ÁE3-pGS(RKKK) 3- vagy pBSS-75-100-ÁE3-pGS(RKKK3)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 17. ábrán a p!93NS-F5F2K- (más néven, pl93-F5F2K-) plazmidot ábrázoltuk.
A 18. ábrán a pl93NS-F5F2K(RKKK) 2- [más néven, pl93NSF5F2K(RKKK2)-, pl93NS-F5F2K(RK32)- vagy pl93-F5F2K(RKKK2)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 19. ábrán a pl93NS-F5F2K(RKKK) 3- [más néven, pl93NSF5F2K(RKKK3)-, p!93-F5F2K(RKKK3)- vagy pl93-F5F2K(RK33)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 20. ábrán a pACT(RKKK)3- [más néven, pACT(RKKK3)~ vagy pACT(RK33)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 21. ábrán a pACT(RKKK)2- [más néven, pACT(RKKK2)vagy pACT(RK32)~] plazmidot ábrázoltuk.
A 22. ábrán a pACT-Hll-plazmidot ábrázoltuk.
A 23. ábrán a pACT-Hll (RKKK) 2- [más néven, pACTH11(RKKK2)~ vagy pACT-Hll(RK32)-] plazmidot ábrázoltuk.
A 24. ábrán a pl93-F5F9sK- [más néven, pl93-F5F9KShort-] plazmidot ábrázoltuk.
A 25. ábrán a pSP-delta-plazmidot ábrázoltuk.
- 15 ·/·:·;· ··:· ··:·
A 26. ábrán a pSP2-alpha-plazmidot ábrázoltuk. A J betű a plazmádban megszüntetett PpulOI-helyek eredeti pozícióját jelöli.
A 27. ábrán a pSP2-alpha2-plazmidot ábrázoltuk. A J a plazmádban megszüntetett PpulOI-helyek eredetá pozácáóját jelölá.
A 28. ábrán a fertőzést követő napok függvényében ábrázoltuk az FFU/sejt (Fluorescens Focus Units, fluoreszcens fókusz egység) értékeket, Ad5- (üres karikák), AdZ.F(RGD)- (sötét négyzetek) vagy AdZ.F(pK7)- vektorral (üres háromszögek) fertőzött 293-sejtek esetében.
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát képezik - többek között - kiméra burokproteint, például kiméra fiber-, penton- és/vagy hexon- proteint tartalmazó rekombináns adenovírusok. A kiméra burokprotein nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz, a natív aminosav-szekvencián felül· vagy ahelyett. Ez a nemnatív aminosav-szekvencia képessé teszi a kiméra fibert (vagy a kiméra fibert tartalmazó vektort) arra, hogy sokkal hatékonyabban kötődjék sejtekhez és jusson be sejtekbe.
A találmány tárgyát képezik tehát nem-natív aminosavszekvenciát tartalmazó kiméra adenovírus-burokproteinek, amelyek sokkal hatékonyabban képesek a burokproteint tartalmazó vektor sejtekbe történő bejutását irányítani, mint az egyébként azonos, de a kiméra adenovírus-burokprotein helyett vad-típusú adenovírus-burokproteint hordozó vekto• · ···· · ···· e«J·
- 16 rok (azaz, kiméra adenovirus-burokproteint nem-tartalmazó, vad-típusú adenovirus-burokproteint tartalmazó vektorok).
Kiméra burokprotein
A találmány szerinti burokproteinek előnyösen, fiberproteinek (elsősorban, adenovírus-fiberproteinek), penton-proteinek (elsősorban, adenovírus-pentonproteinek) és hexonproteinek (elsősorban, adenovírus-hexonproteinek). Közelebbről, a találmány szerinti burokproteinek előnyösen, adenovirus fiber-, penton- vagy hexon- proteinek. A burokprotein-gén bármely humán vagy nem-humán adenovírusszerotípusból származhat, azonban előnyösen, Ad2- vagy Ad5adenovírus-szerotípusokból származik.
A burokproteint kimérának nevezzük akkor, ha az olyan aminosavakat tartalmaz, amelyek a vad-típusú adenovírusból izolált proteinben (azaz, a natív proteinben vagy vad-típusú proteinben) tipikusan nincsenek jelen. Az ilyen burokproteinek tehát nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaznak. Nem-natív aminosav-szekvenciának nevezünk bármely aminosav-szekvenciát, amely adott szerotipushoz tartozó adenovirus natív fíberproteinjében nincs jelen, és amelyet előnyösen, génexpresszió szintjén (azaz, nem-natív aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav-szekvencia inszertálásával) juttattunk a fiberproteinbe.
A fenti, nem-natív aminosav-szekvencia olyan aminosavszekvenciát tartalmaz (azaz, meghatározott sorrendben következő aminosavakat tartalmaz), amely a kiméra proteint képessé teszi arra, hogy új sejtfelszíni kötőhelyeken keresztül sejtekhez kötődjék, és azokba bejusson (azaz, UTV- 17 . :.:. .* :.:. :.j.
szekvenciát vagy Universal Transfer Vector szekvenciát, univerzális transzfervektor-szekvenciát tartalmaz); és/vagy a nativ/nem-nativ, nem-nativ/nem-nativ vagy nativ/nativ szekvenciák közé beépítve olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek a keletkező kiméra protein meghatározott konfigurációjának létrejöttét vagy fenntartását biztosítják (azaz, spacer; távtartó szekvenciákat tartalmaz) . Minthogy a nem-natív aminosav-szekvenciát egy másik aminosavszekvenciába vagy annak helyére inszertáljuk, és a kiméra burokprotein aminosav-szekvenciáját előnyösen, nukleinsavszinten módosítjuk, a kiméra burokprotein azon aminosavszekvenciáj a, amely a vad-típusú burokproteinben található szekvenciától különbözik (azaz, az UTV-szekvencia és távtartó szekvencia) előnyösen, tartalmazhat egészében nemnatív aminosav-szekvenciát, vagy tartalmazhatja natív és nem-natív aminosavak elegyét.
Sejtfelszíni kötőhelynek receptort (előnyösen, protein-, szénhidrát-, glikoprotein- vagy proteoglikán- receptort) , valamint bármely, ellentétes töltésű molekulát nevezünk (azaz, előnyösen, pozitív töltésű nem-natív aminosavszekvenciát tartalmazó kiméra burokproteinhez képest ellentétes töltésű molekulákat nevezünk); vagy más típusú molekulákat nevezünk, amelyekkel a kiméra burokproteinek, sejtekhez történő kötődésük érdekében képesek kölcsönhatásba lépni, és ezáltal, a vektor sejtekbe történő bejutását elősegíteni. Potenciális sejtfelszíni kötőhelyek például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, a következők: negatív töltésű heparin, heparán-szulfát,
- 18 ··· ····· • · ···· · ···· ···· ·· · · · · hialuronsav, dermatán-szulfát és kondroitin-szulfát csoportok, például glikozaminoglikánokon található csoportok, amelyek tartalmazhatnak továbbá sziálsav-, szulfát- és/vagy foszfát- csoportokat; mucinokon, glikoproteineken és gangliozidokon található sziálsav-csoportok; I. fő hisztokompatibilitási komplex (MHC-I) glikoproteinek; membránglikoproteineken közönségesen előforduló szénhidrátkomponensek, például mannóz, N-acetil-galaktózamin, Nacetil-glükózamin, fukóz, galaktóz és hasonlók; val ami nt foszfát-csoportok, például nukleinsavakon található ilyen csoportok. A találmány szerinti kiméra burokproteinek és azok alkalmazására szolgáló eljárások azonban nem korlátozódnak sejt-kölcsönhatások valamely meghatározott mechanizmusára (azaz, meghatározott sejtfelszíni kötőhellyel létrejövő kölcsönhatásra), ilyen következtetés nem vonható le.
Továbbá, az ilyen sejtfelszíni kötőhelyek „újak, amennyiben azok adenovírus-burokproteinekkel (azaz, vadtípusú adenovírus-burokproteinnekkel, például fiberproteinekkel) létrejövő kölcsönhatások számára a korábbiakban nem voltak hozzáférhetőek, vagy csak igen kis mértékben voltak hozzáférhetőek, ami abban nyilvánult meg, hogy a vad-típusú adenovírus-burokproteint tartalmazó vektorok egyes sejtekbe kis hatékonysággal voltak képesek bejutni, a kiméra adenovírus-burokproteineket, például a találmány szerinti fiberproteineket tartalmazó vektorokhoz képest. Ezen felül, a kötőhely abban az értelemben is új, hogy a sejtek többségén - ha nem mindegyikén - megtalálható, függetlenül azok eredetétől. Ez eltér attól a sejtkötőhelytől amellyel a
- 19 ··· « · · · · • · ···· · ···· ·«!« vad-típusú adenovírus-fiberprotein feltehetően kölcsönhatásba lép, amely a sejtek csupán egy alcsoportján van jelen, vagy csak sejtek egy alcsoportján hozzáférhető, amint azt a vad-típusú adenovírus-fiberproteint tartalmazó vektorok csökkent hatékonyságú bejutása jelzi.
Arra, hogy a vektor sejtekbe történő „bejutásának hatékonyságát mennyiségileg meghatározzuk, több módszer áll rendelkezésünkre. Például, a sejtekbe történő bejutás hatékonyságát számszerűsíthetjük úgy, hogy kiméra burokproteint juttatunk vektorba, előnyösen, vírusvektorba, és az alkalmazott fertőzési többszörös (MOI) függvényeként követjük a vektor sejtekbe történő bejutását (például úgy, hogy a vektorral valamely gént, például riportergént juttatunk a sejtekbe) . Ebben az esetben, ha egy kiméra adenovírus-burokproteint tartalmazó vektor alacsonyabb MOI-értékek mellett jut be a sejtekbe, mint a vele egyébként megegyező, de a kiméra adenovírus-burokprotein helyett vad-típusú adenovírus-burokproteint tartalmazó vektor, azt jelenti, hogy a kiméra vektor „sokkal hatékonyabban jutott a sejtekbe .
Hasonlóképp, a bejutás hatékonyságának mennyiségi meghatározását végezhetjük úgy, hogy vizsgáljuk a kiméra vagy vad-típusú burokproteint tartalmazó vektorok; vagy szolúbilis, kiméra vagy vad-típusú burokproteinek sejtekhez történő kötődési képességét. Ebben az esetben, amennyiben a kiméra adenovírus-burokproteint tartalmazó vektor vagy a kiméra burokprotein hatékonyabban képes kötődni sejtekhez, mint a vele egyébként megegyező, de a kiméra adenovirus- 20 - • · · ·»·»· • · ···· · ···· ·*|· burokprotein helyett vad-típusú adenovírus-burokproteint tartalmazó vektor vagy a vad-típusú burokprotein, arra következtetünk, hogy az előbbi hatékonyabban képes sejtekbe jutni vagy „sokkal hatékonyabban képes sejtekbe jutni.
A találmány szerinti nem-natív aminosav-szekvenciákat előnyösen, egy belső (eredetileg a kapszid részét képező) burokprotein-szekvenciába vagy annak helyére inszertáljuk. Más eljárás szerint, a találmány szerinti nem-natív aminosav-szekvenciát előnyösen, valamely protein C-terminális végén vagy annak közelében helyezzük el. Közelebbről, amennyiben a találmány szerinti burokprotein fiberprotein, a nem-natív aminosav-szekvenciát előnyösen, a protein Cterminális végén vagy annak közelében helyezzük el. Arnenynyiben a találmány szerinti burokprotein penton- vagy hexon- protein, a nem-natív aminosav-szekvenciát előnyösen, a protein felszínen megjelenő hurokrégiójába inszertáljuk, például, az alábbi példákban ismertetettek szerint, az adenovírus-hexonprotein 1. és/vagy 2. hipervariábilis régiójába inszertáljuk [Crawford-Miksza és mtsai.: J. Virol. 70. 1836 (1996)]. A nem-natív aminosav-szekvenciát tehát előnyösen, a burokprotein olyan régiójában helyezzük el, amelyen keresztül az képes sejtekkel kölcsönhatásba lépni, és sejtekhez kötődni.
A találmány szerinti eljárás alkalmazható továbbá olyan adenovírus-vektorok előállítására, amelyek UTVszekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmaznak, valamely meghosszabbított (vagy tüskeszerűen kiemelkedő, „spiked) struktúrában, közelebbről, hexon- és/vagy
- 21 ··· ····· • · ···· * »»»· **/* pentonbázis- proteinekben, úgy, hogy az eredetinél hoszszabb hexon- és/vagy pentonbázis- proteinek jöjjenek létre, és az inszertált aminosav-szekvencia a virion-kapszidba épült proteinből kifelé nyúljon ki. Közelebbről, ilyen tüskeszerűen kiemelkedő burokproteinek rekombináns adenovirusvektorokba építhetők, olyan, „megrövidített nyelű (az alábbiakban részletesen ismertetett) fíberproteinekkel együtt, amelyek nyelét megrövidítettük, és adott esetben, amelyek gombját más szerotípusú adenovírusvektor (trimerizációért felelős domént is tartalmazó) gombjával helyettesítettük, mint amelyből a fiberprotein fennmaradó részei származnak.
A fentiek szerint, a megrövidített nyelű fiberproteineket előnyösen, beépíthetjük UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó kiméra pentonbázisproteint hordozó adenovírusba; vagy tüskeszerűen kiemelkedő („spiked) kiméra pentonbázís-proteint hordozó, és adott esetben, a fenti proteinben UTV-szekvenciákat vagy UTVszerű szekvenciákat tartalmazó adenovírusba. Továbbá, a megrövidített nyelű fiberproteineket beépíthetjük UTVszekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó kiméra hexonproteint hordozó adenovírusba; vagy tüskeszerűen kiemelkedő kiméra hexonproteint hordozó, és adott esetben, a fenti hexonproteinben UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó adenovírusba.
Előnyösen, a nem-natív aminosav-szekvenciákat egy másik nem-natív aminosav-szekvencián keresztül kapcsoljuk a proteinhez, azaz, egy távtartó („spacer) szekvencián ke
- 22 ·»» ♦♦···
·..· ··:· : *·.·· ··»· resztül. A távtartó szekvencia hidat képez a natív proteinszekvencia és a nem-natív szekvencia között; valamely nemnatív szekvencia és egy másik nem-natív szekvencia között; vagy egy natív szekvencia és egy másik natív szekvencia között. A távtartó szekvenciát előnyösen, annak biztosítása érdekében építjük a proteinbe, hogy a sejtfelszíni kötőhelyet tartalmazó nem-natív szekvencia kiemelkedjék a kiméra protein három dimenziós struktúrájából (közelebbről, a kiméra protein természetben előforduló, például kapszid részeként előforduló formájának, három dimenziós struktúrájából), úgy, hogy az képes legyen sejtekkel kölcsönhatásba lépni és azokhoz kötődni. Amennyiben egy belső (natív) burokprotein-szekvenciába vagy annak helyére távtartó szekvenciát inszertálunk, a keletkező kiméra burokproteinben jelen lehet egy vagy több távtartó szekvencia is.
Bármely hosszúságú távtartó szekvenciát alkalmazhatunk; előnyösen, a burokproteinhez körülbelül 3-400 aminosavból álló távtartó szekvenciát kapcsolunk, hogy tüskeszerűen kiemelkedő („spiked) (az alábbiakban részletesebben ismertetett) burokproteineket kapjunk; a leírásban ismertetett további alkalmazás céljára előnyösen, a burokproteinhez körülbelül 3-30 aminosavból álló távtartó szekvenciát adunk. A távtartó szekvencia bármely aminosavakat tartalmazhat. Előnyösen, a távtartó szekvencia nem gátolja a burokprotein működését, és közelebbről, nem gátolja az egyéb nem-natív aminosav-szekvenciák (UTV-szekvenciák vagy UTV-szerű szekvenciák) működését.
- 23 A távtartó szekvencián felüli nem-natív aminosavszekvenciák - azaz, az UTV-szekvencia ugyancsak bármilyen hosszúságú lehet, előnyösen, körülbelül 3-30 aminosav hosszúságú (bár adott esetben, a távtartó szekvenciához hasonlóan, az UTV-szekvencia ennél hosszabb, például körülbelül 400 aminosav hosszúságú is lehet). A fenti szekvenciát alkotó aminosavak előnyösen, pozitív töltésű aminosavak, amelyek képesek eukariota sejt felszínén előforduló negatív töltésű csoportokhoz kötődni, és előnyösen, képesek eukariota sejtek többségének (ha nem mindegyikének) felszínén előforduló negatív töltésű csoportokhoz kötődni. Közelebbről, ilyen, eukariota sejtek felszínén előforduló negatív töltésű csoportok, amelyekhez az UTV-szekvenciák kapcsolódnak, alkotják a fent említett „sejtfelszíni kötőhelyeket .
Előnyösen, a nem-natív aminosav-szekvencia lizint, arginint vagy hisztidint tartalmaz. Más eljárás szerint, ilyen szekvenciában előforduló aminosavakként alkalmazhatunk negatív töltésű aminosavakat, amelyek képesek pozitív töltésű sejtfelszíni kötőhelyekhez kötődni, például előnyösen, a nem-natív aminosav-szekvencia aszparagint vagy glutamint is tartalmazhat.
A találmány szerinti burokprotein nem-natív aminosavszekvenciája tehát előnyösen, a következő szekvenciák valamelyikét tartalmaz: 1. azonosítószámú szekvencia (azaz, Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys); 2. azonosítószámú szekvencia (azaz, Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg); vagy 3. azonosító számú szekvencia (azaz, Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa,
- 24 ahol „Xaa Lys vagy Arg); amely szekvenciák C-terminális végéről 1, 2, 3, 4 vagy 5 aminosavat deletálhatunk. Amenynyiben burokproteinként fiberproteint alkalmazunk, a protein előnyösen, a következő szekvenciák valamelyikét tartalmaz: 1. azonosítószámú szekvencia, 2. azonosítószámú szekvencia, 3. azonosítószámú szekvencia, 4. azonosítószámú szekvencia (azaz, Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys) vagy 5. azonosítószámú szekvencia (azaz, Alá Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys); amely szekvenciák C-terminális végéről 1, 2, 3, 4 vagy 5 aminosavat deletálhatunk.
Heparinhoz kötődő szekvenciák, heparin-szerű receptorokhoz történő kötődésben is szerepet játszhatnak [Sawitzky és mtsai.: Med. Microbiol. Immunoi. 182, 285 (1993)]. Hasonlóképp, a pepiidben vagy proteinben található, úgy nevezett „heparin-kötő szekvenciák közvetíthetik a peptid vagy protein és más sejtfelszíni kötőhelyek, például sejtfelszíni heparán-szulfát proteoglikánok közti kölcsönhatás létrejöttét is [Thompson és mtsai.:J. Biol. Chem. 269, 2541 (1994)]. A fentiek szerint, a nem-natív aminosav-szekvencia (azaz, az UTV-szekvencia) előnyösen, ilyen szekvenciákat tartalmaz, ezen felül, eukariota sejtek felszínén széles körben előforduló, negatív töltésű csoportok felismerésére képes további szekvenciákat tartalmaz.
Közelebbről, a nem-natív aminosav-szekvencia előnyösen, két bázikus aminosavat (általában Arg-t) tartalmaz, egymástól 20 Angstrom (í) távolságban, egy alfa-hélix ellentétes oldalára nézőén [Margalit és mtsai.:J. Bioi. Chem.
* * * * *·’ ···· ·,,* ···· · · χ· <
268, 19228 (1993); Ma és mtsai.: J. Lipid Res. 35, 2049 (1994)]. A fenti két aminosav között előnyösen, további bázikus aminosavak találhatók, a hélix egyik oldalára nézőén, míg a másik oldalon nem-poláris aminosavak találhatók, amfipátiás struktúrát alkotva, amely előnyösen, tartalmazza az XBBXBX- szekvenciát (49. azonosítószámú szekvenciát) vagy XBBBXXBX- szekvenciát (50. azonosítószámú szekvenciát), ahol B bázikus aminosav (például Lys, Arg, stb.) és X valamely más aminosav.
Ugyancsak előnyösen, az nem-natív UTV-aminosavszekvencia a következő szekvenciák valamelyikét tartalmaz: LIGRKKT (51. azonosítószámú szekvencia); LIGRK (52. azonosítószámú szekvencia); vagy LIGRR (53. azonosítószámú szekvencia) , amelyek fibronektinen és hősokk-proteineken előforduló, ismert heparin-kötő szekvenciák [Hansen és mtsai.:Biochim. Biophys. Acta 1252, 135 (1995); 7-7 Lysvagy Arg- aminosavat tartalmazó inszerciókat vagy 7 aminosavból álló, Lys- vagy Arg- aminosavak elegyét tartalmazó inszerciókat [Fromm és mtsai.: Arch. Biochem. Biophys. 323, 279 (1985)]; az IGFBP-3 és IGFBP-5 körülbelül 18 aminosavból álló, heparin-kötő szekvenciát tartalmazó ismert bázikus C-terminális régióját [Booth és mtsai.: Growth Regül. 5, 1 (1995)]; vagy a RHAMN-jelzésű HA-receptor 35 aminosavból álló C-terminális régiójában található két hilauronán(HA-) kötő elem egyikét vagy mindkettőt [Yang és mtsai.:J. Cell Biochem. 56, 455 (1994)]; egy, heparin-kötö konszenzus-szekvenciákat tartalmazó, a Staphylococcus aureus vitronektin heparin-kötő formája alapján tervezett szinte
- 26 tikus peptidet (Ala347-Arg361) [Liang és mtsai.: J. Biochem. 116, ¢51 (1994)]; az 1. szarvasmarha herpeszvírus glll-glikoprotein 129-310. aminosav-poziciói közt található öt heparinkötő hely egyikét vagy azok közül többet; vagy a pseudorabies vírus glll-glikoprotein 90-275. aminosavpoziciói közt található négy heparinkötő hely egyikét vagy azok közül többet [Liang és mtsai.: Virol. 194, 233 (1993)]; a pseudorabies vírus glll-glikoprotein 134-141. aminosav-poziciói közt található aminosav-szekvenciát [Sawitzky és mtsai.: Med. Microbiol. Immunoi. 182, 285 (1993); humán lipoprotein lipáz 279-282. és 292-304. pozícióiban található, töltéssel rendelkező aminosavaknak megfelelő heparinkötő régiókat [Ma és mtsai.: lásd fent]; az N22W-jelzésű, 22 aminosavból álló szintetikus peptidet, amely az NVSPPRRARVTDATETTITISW szekvenciával rendelkezik (54. azonosítószámú szekvencia); vagy a fenti, fibronektin alapján tervezett szintetikus peptid heparinkötő sajátsággal bíró TETTITIS-fragmensét (55. azonosítószámú szekvencia) [Ingham és mtsai.:Arch. Biochem. Biphys. 314, 242 (1994)]; az Alzheimer béta-amiloid perkurzor protein (APP), valamint különböző egyéb APP-szerú proteinek ektodomén cinkkötő helyén található, heparin-affinitást befolyásoló GVEFVCCP-elemet (56. azonosítószámú szekvencia) [Bush és mtsai.: J. Biol. Chem. 229, 26618 (1994)]; a laminin-A-lánc keresztrégiójából (cross-region) származó, 8 aminosavból álló peptideket [Tashiro és mtsai.: Biochem. J. 302, 73 (1994)]; a szerin proteáz gátló antitrombin-III heparinkötő régióin alapuló szintetikus peptideket, például az F123.... . .... . . ... . . . · ♦ ·..· ··:· : ”.·· ··*· - 27 G148. és K121-A134. pozícióknak megfelelő peptideket [Tyler-Cross és mtsai.: Protein Sci. 3, 620 (1994)]; az APP 14 K-s N-terminális fragmensét, valamint egy, az Nterminális régió közelében található régiót (azaz, a 96110. aminosavaknak megfelelő régiót), amelyekről feltételezzük, hogy heparinkötő régiók [Small és mtsai.: J. Neurosci. 14, 2117 (1994)]; a heparinkötő epidermális növekedési faktor szerű növekedési faktor (HB-EGF) 21 aminosavból álló szekvenciáját, amelyet magas lizin és arginin tartalom jellemez [Thompson és mtsai.: J. Biol. Chem. 269, 2541 (1994)]; a trombospondin heparinkötő régióját tartalmazó, hep-1 szintetikus peptidnek megfelelő, 17 aminosavból álló régiót [Murphy-Ullrich és mtsai.: J. Bioi. Chem. 268, 26784 (1993); a humán von Willebrand faktor 23 aminosavból álló, heparinkötő szekvenciáját (Y565-A587.) [Tyler-Cross és mtsai.: Arch. Biochem. Biophys. 306, 528 (1993)]; a fibronektin eredetű, PRARI-jelzésű heparinkötő pepiidet (57. azonosítószámú szekvencia) [és a fenti szekvenciát tartalmazó nagyobb peptideket, például WQPPRARI (58. azonosítószámú szekvencia)] [Woods és mtsai.: Mol. Biol. Cell. 4, 605 (1993)]; a 4. vérlemezke faktor heparinkötő régióját [Sato és mtsai.: Jpn. J. Cancer Res. 84, 484 (1993)]; valamint a fibroblaszt növekedési faktor receptor tirozin kinéz transzmembrán glikoproteinben található K18K-szekvenciát [Kan és mtsai.: Science 259, 1918 (1993)].
Ezen felül, az UTV-szekvencia tartalmazhat más, a csatolt példákban ismertetett szekvenciákat is. UTVszekvenciaként előnyösen, a következő szekvenciák valame··«· · ···· · · • « · ♦ · · · ♦ ·..· ··:· : ·τ - 28 lyikét alkalmazzuk: 1. azonosítószámú szekvencia, 2. azonosítószámú szekvencia, 3. azonosítószámú szekvencia, 4. azonosítószámú szekvencia, 5. azonosítószámú szekvencia, 20. azonosítószámú szekvencia, 22. azonosítószámú szekvencia, 24. azonosítószámú szekvencia, 26. azonosítószámú szekvencia, 28. azonosítószámú szekvencia, 30. azonosítószámú szekvencia, 32. azonosítószámú szekvencia, 34. azonosító számú szekvencia, 36. azonosítószámú szekvencia, 38. azonosítószámú szekvencia, 40. azonosítószámú szekvencia, 42. azonosítószámú szekvencia, 46. azonosítószámú szekvencia, 48. azonosítószámú szekvencia, 49. azonosítószámú szekvencia, 50. azonosítószámú szekvencia, 51. azonosítószámú szekvencia, 52. azonosítószámú szekvencia, 53. azonosító számú szekvencia, 54. azonosítószámú szekvencia, 55. azonosítószámú szekvencia, 56. azonosítószámú szekvencia, 57. azonosítószámú szekvencia, 58. azonosítószámú szekvencia, 73. azonosítószámú szekvencia, 74. azonosítószámú szekvencia, 76. azonosítószámú szekvencia, 78. azonosítószámú szekvencia, 90. azonosítószámú szekvencia vagy 93. azonosítószámú szekvencia. A fenti szekvenciák abban az esetben is alkalmazhatók, ha azok C- vagy N- terminális végéről 1, 2 vagy 3 aminosavat deletáltunk. Továbbá, azzal a kikötéssel, hogy távtartó szekvenciaként bármely aminosav-szekvenciát alkalmazhatunk, amely nem gátolja a protein működését, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a fenti UTV-szekvenciák távtartó szekvenciát is tartalmazhatnak.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a nem-natív aminosav-szekvenciák a fenti szekvenciák „megfe- 29 - • β·«> · ·*·· · · • « · · * • · · < · * · * .... . ..,.
lelőit (ekvivalenseit) is tartalmazhatják (azaz, „UTVszerű szekvenciákat is tartalmazhatnak). „Megfelelő (ekvivalens) szekvenciának nevezünk bármely szekvenciát, amely az eredeti proteinnel azonos funkciót tölt be (esetleg kis eltérést mutat a hatékonyság tekintetében), de amelynek aminosav-szekvenciája vagy strukturális sajátsága az eredeti proteinétől kis mértékben mégis különbözik. Közelebbről, megfelelő szekvencián értünk olyan szekvenciákat, amelyek a szekvencián belül egy vagy több, „konzervatív aminosavszubsztitúciót tartalmaznak. „Konzervatív aminosavszubsztitúciónak olyan aminosav-szubsztitúciót nevezünk, amikor egy aminosavat hasonló töltésmegoszlású, hidrofil/hidrofób sajátságú, méretű és/vagy konfigurációjú másik aminosavval helyettesítettünk (például Val-aminosavat Ile-aminosavval). Ezzel szemben, „nem-konzervatív aminosavszubsztitúcióról beszélünk akkor, ha egy aminosavat eltérő töltésmegoszlású, hidrofil/hidrofób sajátságú, méretű és/vagy konfigurációjú másik aminosavval helyettesítettünk (például Val-aminosavat Phe-aminosavval).
Kiméra burokproteint kódoló nukleinsavak
Az előzőekben ismertetettek szerint, a nem-natív aminosav-szekvenciát előnyösen, DNS módosításán keresztül juttatjuk a proteinbe. A találmány tárgyát képezik tehát a találmány szerinti burokproteinek valamelyikét kódoló izolált és tisztított nukleinsavak is, amelyekben a nem-natív aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav-szekvencia, a poliadenilezési helyet megelőzően, tartalmazza a 6. azono • V* 4 · · · «
·..···:· : ·τ
- 30 sítószámú szekvenciát (azaz, GGA TCC AA szekvenciát). Hasonlóképp, a találmány tárgyát képezik az alábbi szekvenciák valamelyikét tartalmazó izolált és tisztított nukleinsavak is: 7. azonosítószámú szekvencia (azaz, GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT) ; 8. azonosítószámú szekvencia (azaz, GCC GGA TCC AAC AAG AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA); 19. azonosítószámú szekvencia; 21. azonosítószámú szekvencia; 23. azonosítószámú szekvencia; 25. azonosítószámú szekvencia; 27. azonosítószámú szekvencia; 29. azonosítószámú szekvencia; 31. azonosítószámú szekvencia; 33. azonosítószámú szekvencia; 35. azonosítószámú szekvencia, 37. azonosítószámú szekvencia; 39. azonosítószámú szekvencia; 41. azonosítószámú szekvencia; 45. azonosítószámú szekvencia; 47. azonosítószámú szekvencia;72. azonosítószámú szekvencia; 75. azonosítószámú szekvencia; 77. azonosítószámú szekvencia vagy 89. azonosítószámú szekvencia. A találmány tárgyát képezik továbbá, a fenti nukleinsav-szekvenciák konzervatív módosítást tartalmazó variánsai.
Egy nukleinsav-szekvencia „konzervatív módosítást tar talmazó variánsainak olyan variánsokat nevezünk, amelyek konzervatív aminosav-szubsztitúció eredményképp jöttek létre. Ezzel szemben, egy nukleinsav-szekvencia „nemkonzervatív módosítást tartalmazó variánsainak olyan vari ánsokat nevezünk, amelyek nem-konzervatív aminosavszubsztitúció eredményképp jöttek létre. Ilyen módosításokat létrehozhatunk a technika állása szerint jól ismert eljárásokkal, például a csatolt példákban ismertetett eljárá sok szerint, vagy kereskedelemben hozzáférhető reagens
- 31 készletek és vektorok alkalmazásával (lásd például: „New England Biolabs, Inc., Beverly, ΜΆ; Clontech, Palo Alto, CA). Ezen felül, ilyen (például sejtekhez történő kötődési képességet és azokba történő bejutást befolyásoló) szubsztitúciók létrehozására alkalmas eljárásokat ismertetünk az alábbi példákban.
Ilyen kiméra burokproteinek előállítására alkalmazható eljárások, közelebbről, a szekvencia DNS-szinten történő bejuttatására alkalmas eljárások a technika állása szerint jól ismertek; annak módját egy kiválasztott kiméra proteinen keresztül a 2. ábrán szemléltetjük, és a csatolt pél dákban ismertetjük. Röviden, az eljárás szerint, valamely szekvenciát juttatunk a burokprotein szekvenciájába (előnyösen, a 6. azonosítószámú szekvencia szerinti szekvenciát vagy annak konzervatív módosítást tartalmazó variánsát). A találmány egy, a csatolt példákban ismertetett előnyös megvalósítási módja szerint, a nem-natív szekvenciát a stopkódont és poliadenilezési helyet megelőzően építjük be a szekvenciába, úgy, hogy az a keletkező protein olvasási keretének eltolódását eredményező mutáció létrejöttét, és a kiméra proteinbe további aminosavak beépülését eredményezze .
Általánosságban, ezt úgy érhetjük el, hogy a fíberszekvenciát, a szekvencia módosításának megkönnyítése érdekében plazmidba vagy más vektorba klónozzuk. Ezt követően, a létrehozandó, olvasási keret eltolódást eredményező mutáció helyét határoló restrikciós helyeket azonosítunk. Kettős szálú szintetikus oligonukleotidot állítunk elő, egy
- 32 mást átfedő, szintetikus, egy szálú „szensz és „antiszensz oligonukleotidokból [például a következő „szensz és „antiszensz oligonukleotidokból: TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C (9. azonosítószámú szekvencia) és AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA (10. azonosítószámú szekvencia), lásd 4. ábra], úgy, hogy a kettős szálú oligonukleotid tartalmazza a célzott szekvenciát határoló restrikciós helyeket. A plazmidot vagy más vektort a restrikciós enzimekkel hasítjuk, és a kompatibilis ragadós (kohezív) végekkel rendelkező oligonukleotidszekvenciát a plazmidba vagy vektorba ligáljuk, a vadtípusú DNS helyére. A mutált szekvenciát a burokprotein kódoló szekvenciájába bejuttathatjuk továbbá más, in vitro hely-specifikus mutagenezis létrehozására alkalmas, a technika állása szerint ismert, és például, kereskedelemben hozzáférhető reagenskészletekkel kivitelezhető eljárásokkal is (például PCR technikával).
Miután a szekvenciát bejuttattuk a kiméra burokproteinbe, a szekvenciát kódoló nukleinsav-fragmenst izolálhatjuk, például PCR-amplifikációval, 5'- és 3'- végi láncindító oligonukleotidok alkalmazásával. A kiméra fiberprotein vonatkozásában például, a fragmens izolálható PCR-technikával, a következő láncindító oligonukleotidok alkalmazásával: TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA (11. azonosítószámú szekvencia) és CGT GTA TCC ATA TGA CAC AGA (12. azonosító számú szekvencia), amelyeket a 4. ábrán tüntettünk fel. A fenti láncindító
- 33 oligonukleotidok említett módon történő alkalmazásával, restrikciós helyekkel (ebben az esetben, Ndel- és BamHIhelyekkel) határolt, amplifikált, kiméra fibert kódoló fragmenst nyerünk, amelyek segítségével a fragmens könnyen szubklónozható. Kiméra burokprotein előállítására alkalmazhatók azonban más eljárások is.
A fentiek szerint, olvasási keret eltolódást eredményező mutációt a burokprotein kódoló szekvenciájának bármely részén létrehozhatunk. A 6. azonosítószámú szekvencia vonatkozásában például, ezt a szekvenciát beiktathatjuk a burokprotein gén, burokprotein C-terminális részét kódoló régiójába (azaz, a TAA stopkódont közvetlenül megelőzően), vagy inszertálhatjuk a kódoló régió előbbi részeibe, például Alá (azaz, A) és Gin (azaz, Q) aminosavakat kódoló kódonok közé, miáltal a fent említett, 5. azonosítószámú szekvenciát tartalmazó kiméra proteint kódoló, 8. azonosítószámú szekvencia szerinti kódoló szekvenciát kapjuk. Hasonlóképp, a fenti megközelítési mód alkalmazásával, a kódoló szekvencia még korábbi szakaszaiban is létrehozhatunk olvasási keret eltolódást eredményező mutációt, például úgy, hogy azt egy belső (azaz natív) burokproteinszekvenciába iszertáljuk vagy annak helyére inszertáljuk.
Továbbá, a kettős szálú oligonukleotid további, a szekvencia módosítását megkönnyítő restrikciós helyeket is tartalmazhat. Például, a vektorba inszertált 6. azonosítószámú szekvencia módosított BamHI-helyet tartalmaz; ez a restrikciós hely annyiban „módosított, hogy a palindróma felismerő szekvencián felül, további nukleotidokat is tar
- 34 ··· ·····
·..· ··:· : ··:· ·ν talmaz. Ezt a szekvenciát előállíthatjuk úgy is, hogy az bármely egyéb, a DNS-manipulációt megkönnyítő restrikciós helyet tartalmazzon. A burokprotein kódoló szekvenciájába inszertáiva, a fenti szekvencia nem csak olvasási keret eltolódást eredményező mutációt hoz létre, hanem alkalmazásával, további kódoló szekvenciák is bejuttathatok a burokprotein génbe. Közelebbről, az ily módon bejuttatott kódoló szekvenciák tartalmazhatnak lizint, arginint vagy hisztidint kódoló kódonokat; vagy aszparagint vagy glutamint kódoló kódonokat, egymagukban vagy valamilyen kombinációban. Továbbá, ezeket az aminosavakat kódoló kódonokat egy új transzlációs stopkódon követheti, lehetővé téve azt, hogy olyan kiméra protein termelődjék, amelybe meghatározott számú aminosavat tartalmazó nem-natív aminosavszekvencia épül be. A fenti aminosavakat kódoló kódonokat és a transzlációs stopkódont a burokproteinbe épített, olvasási keret eltolódást eredményező mutációt eredményező új restrikciós helyre inszertálhatjuk, úgy, hogy a megfelelő szekvenciákat tartalmazó, az említett restrikciós helyekkel (például 5f— és 3'- végi BamHI—helyekkel) határolt oligonukleotidot állítunk elő; vagy azokat beépíthetjük más, szakember számára ismert eljárásokkal.
A natív receptorkötő szekvenciát helyettesítő DNS mérete korlátozott lehet, például azáltal, ha az a fiber megzavart hajtogatódását vagy pentonbázis/fiber komplex nem megfelelő összeépülését eredményezi. Előnyösen, a fenti aminosav-szekvenciákat (például lizint, arginint, hisztidint, aszparagint, glutamint és hasonlókat) kódoló
- 35 ··· ·····
·..· ··:· : ··:· ··/·
DNS-t inszertálunk a fiber génszekvenciába, amelyből a natív receptorkötő szekvenciát deletáltuk vagy más módon előidézett mutációval megváltoztattuk. Ezen felül, más DNSszekvenciákkal, például távtartó szekvenciát alkotó aminosavakat kódoló szekvenciákkal helyettesíthetjük a natív burokprotein kódoló szekvenciát.
Kiméra burokproteint tartalmazó vektorok
A leírásban „vektornak géntranszferre alkalmas hordozót nevezünk; a kifejezést szakember számára ismert értelemben használjuk. A találmány különböző előnyös megvalósítási módjai szerint, négy vektortípust alkalmazunk: plazmidokat, fágokat, vírusokat vagy liposzómákat. Plazmidokat, fágokat és vírusokat nukleinsav formájában juttathatunk a sejtekbe, liposzómákat pedig nukleinsavak szállítására alkalmazhatunk. A géntranszferre alkalmazható vektorokat a továbbiakban transzfervektoroknak nevezzük.
Előnyösen, a találmány szerinti vektorok vírusvektorok, közelebbről, külső burokkal (peplonnal) nem rendelkező vírusok, azaz peplonnal nem-rendelkező RNS- vagy DNS- vírusok. A vírus lehet továbbá, peplonnal rendelkező vírus, azaz, valamely peplonnal rendelkező RNS- vagy DNS- vírus. Ezek a vírusok előnyösen, burokproteineket (kapszidproteineket) tartalmaznak. Előnyösen, a vírus-burokprotein a kapszidból kiemelkedő protein, miáltal az képes sejtekkel kölcsönhatásba lépni. Peplonnal rendelkező RNS- vagy DNSvírusok esetében előnyösen, a burokprotein valójában egy lipid-burok-glikoprotein [azaz, úgy nevezett tüske („spike) vagy peplomer].
- 36 • · · ««···
·..* ··:· : ··:· ··*·
Közelebbről, a vektor előnyösen, a következő családok valamelyikébe tartozó, peplonnal (külső burokkal) nemrendelkező vírus (azaz, RNS- vagy DNS- vírus) : Hepadnadviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenovíridae vagy Picornaviridae. Peplonnal nem rendelkező vírusként előnyösen, Hepadnaviridae családba tartozó vírust alkalmazunk, közelebbről, Hepadnavirus nemzetségbe tartozó vírust alkalmazunk. Parvoviridae családba tartozó vírusként előnyösen, Parvovirus nemzetségbe tartozó vírust (például emlősök vagy madarak parvovirusait) vagy Dependovirust [például, adeno-asszociált vírusokat (AAV-vírusokat) ] alkalmazunk. Papovaviridae családba tartozó vírusként előnyösen, Papillomavirinae alcsaládba tartozó vírusokat (például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, az 1-48. típusú humán papillomavírusokat; HPV); vagy a Polyomavirinae alcsaládba tartozó vírusokat (például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, a JC-, SV40- vagy BK- polyomavírusokat) alkalmazzuk. Adenovíridae családba tartozó vírusként előnyösen, Mastadenovirus nemzetségbe tartozó vírusokat (például emlős adenovírusokat); vagy Aviadenovirus nemzetségbe tartozó vírusokat (például madár adenovírusokat) alkalmazunk. Picornaviridae családba tartozó vírusként előnyösen, Hepatitis-A-vírust (HAV), Hepatitis-B-vírust (HBV) vagy non-A, non-B hepatitis vírust alkalmazunk.
Hasonlóképp, a vektor lehet a Herpesviridae vagy Retroviridae családokba tartozó, peplonnal rendelkező vírus, vagy lehet Sindbis vírus. A találmány egy előnyös meg
·.? :·:· *·:· :,r
- 37 valósítási módja szerint, peplonnal rendelkező vírusként Herpesviridae családba tartozó vírust alkalmazunk, közelebbről, a következő alcsaládokba vagy nemzetségekbe tartozó vírusokat: Alphaherpesvirinae (például a Herpes simplex vírusok) , Simplexvirus (például Herpes simplex szerű vírusok) , Varicellavirus (például varicella vagy pseudorabiesszerű vírusok), Betaherpesvirinae (például a citomegalovírusok), Cytomegalovirus (például a humán cytomegalovírusok), Gammaherpesvirinae (például a limfocita-asszociált vírusok) vagy Lymphocryptovirus (például EB-szerű vírusok).
Peplonnal rendelkező vírusként előnyösen, alkalmazhatunk továbbá, Retroviridae családba tartozó RNS-vírusokat (azaz, előnyösen, valamely retrovírust), közelebbről, a következő nemzetségekbe vagy alcsaládokba tartozó vírusokat: Oncovirinae, Spumavirinae, Spumavírus, Lentivirinae vagy Lentivirus. Oncovirinae alcsaládba tartozó RNS-vírusként előnyösen, 1- vagy 2- típusú humán T-limfotróph vírust (azaz, HTLV-1- vagy HTLV-2- vírust); szarvasmarha leukémia vírust (BLV); madár leukózis-szarkóma vírust [például Rousszarkóma vírust (RSV)]; madár mieloblasztózis vírust (AMV); madár eritroblasztózis vírust (AEV); Rous-asszociált vírust (például RAV- 1-50., RAV-0); emlős C-típusú vírust [például Moloney-féle egér leukémia vírust (MuLV)]; Harvey-féle egér szarkóma vírust (HaMSV); Abelson-féle egér leukémia vírust (A-MuLV) ; AKR-MuLV; macska leukémia vírust (FeLV); majom szarkóma vírust, retikuloendoteliózis vírust (RÉV); lép nekrózis vírust (SNV); B-típusú vírust [például egér
- 38 emlőtumor vírust (MMTV)], vagy D-típusú vírust (például Mason-Pfizer majomvírust (MPMV), SAIDS vírusokat) alkalmazunk. Lentivirus alcsaládba tartozó RNS-vírusként előnyösen, 1- vagy 2- típusú humán immundeficiencia-vírust [azaz, HIV-1- vagy HIV-2- vírusokat, ahol a HIV-l-vírust a korábbiakban limfadenopátia-asszociált 3. vírusnak (HTLV-IIIvírusnak) és szerzett immundeficiéneia szindrómával (AIDS) kapcsolatos vírusnak (ARV) nevezték]; vagy más, AIDS- vagy AIDS-szerű betegségből izolált vagy azzal kapcsolatba hozható HIV-1- vagy HIV-2- szerű vírusokat. A leírásban a HÍV rövidítés vagy az AIDS-vírus vagy humán immundef iciencia-vírus kifejezések általánosságban, a fenti HIV-vírusokra, valamint HIV-szerű vagy HIV-asszociált vírusokra vonatkoznak. Ezen felül, Lentivirus alcsaládba tartozó vírusként előnyösen, Visna/maedi vírust (például birkákat fertőző vírust); macska immundeficiencia-vírust (FIV); szarvasmarha lentivírust,· majom immundef iciencia-vírust (SIV); lovak fertőző vérszegénységét okozó vírust (EIAV); vagy kecskék ízületi gyulladását és agyvelőgyulladását okozó vírust (CAEV) alkalmazhatunk.
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, adenovírus-vektort (azaz, Adenoviridae családba tartozó vírusvektort, előnyösebben, Mastadenovirus nemzetségbe tartozó vírust) alkalmazunk. Ilyen vektorok előnyösen, Ad2- vagy Ad5- vektorok, bár más szerotípusú adenovírus-vektorok is alkalmazhatók. Géntranszferre alkalmazhatunk vad-típusú adenovírus-vektorokat (azaz, replikációra képes vektorokat). Más eljárás szerint, alkal mázhatunk legalább egy olyan módosítást hordozó genetikai anyagot tartalmazó adenovírus-vektorokat, amely a vírust replikációra képtelenné teszi. Az adenovírus-genom módosítása lehet például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, DNS-szegmens addiciója, DNS-szegmensek átrendezése, DNS-szegmens deléciója, DNS-szegmens helyettesítése vagy DNS-lézió létrehozása. Az érintett DNS-szegmens lehet csupán egyetlen nukleotid méretű; vagy akár 36 kilobázis (kb) nagyságú (azaz, az adenovírus-genom hozzávetőleges méretének megfelelő méretű); vagy lehet egy adenovírus-virionba becsomagolható maximális méretű nukleinsav-szekvenciának megfelelő méretű (azaz, körülbelül 38 kb) . Előnyösen, az adenovírus-genom El-, E2-, E3- vagy E4- régiójában hozunk létre módosítást. Hasonlóképp, adenovírus-vektorok lehetnek kointegrátumok, azaz, az adenovírus-szekvenciákkal ligáivá tartalmazhatnak más szekvenciákat is, például más vírus- vagy plazmid- szekvenciákat .
Vírusvektorok (például replikáció-deficiens adenovírus-vektorok) tartalmazhatnak teljes kapszidokat (azaz, vírusgenomot, például adenovírus-genomot tartalmazó kapszidokat); vagy üres kapszidokat (azaz, olyan kapszidokat, amelyekből a vírusgénem hiányzik, vagy amelyekben azt fizikai vagy kémiai eljárásokkal lebontottuk). Hasonlóképp, mivel rendelkezésünkre állnak olyan eljárások, amelyekkel vírusokat, plazmidokat vagy fágokat nukleinsavszekvenciák (azaz, RNS vagy DNS) formájában juttathatunk sejtekbe, vektorok (azaz transzfervektorok) tartalmazhatnak • · · · · · · · ···· ··:· : ··:· ♦·/·
- 40 csupán RNS-t vagy DNS-t, az azokkal kapcsolódó proteinek, például kapszidproteinek, és külső burok (peplon) lipidek nélkül is. Továbbá, mivel liposzómák, sejtmembránokkal fuzionálva, tartalmukat a sejtekbe juttatják, transzfervektorokként alkalmazhatunk liposzómákat is (például kereskedelemben hozzáférhető liposzómákat, lásd például: Life Technologies, Bethesda, MD), a burokproteineket kódoló folyamatos nukleinsav-szekvenciákkal együtt. Amikor azt mondjuk tehát, hogy vektorok kiméra adenovírus-burokproteint tartalmaznak, transzfervektorok pedig kiméra adenovírusburokproteint kódolnak, liposzóma transzfervektorokról azt mondhatjuk, hogy azok kódolnak, amennyiben azok olyan nukleinsavakat tartalmaznak, amelyek valóban proteineket kódolnak.
A találmány szerinti vektorok tartalmazhatnak további szekvenciákat és mutációkat is, egyeseket például magában a burokproteinben. Például, a találmány szerinti vektorok előnyösen, utas gént („passenger gene) hordozó nukleinsavszekvenciát is tartalmaznak.
„Nukleinsavnak polinukleotidot (DNS-t vagy RNS-t) nevezünk. Gén kifejezés alatt proteint vagy naszcens RNSmolekulát kódoló nukleinsav-szekvenciát értünk. Utas génnek (passenger gene) nevezünk valamely találmány szerinti vektorba (például transzfervektorba) szubklónozott gént, amely az említett vektorban tipikusan nincs jelen, és amelynek gazdasejtbe történő bejuttatása az intracelluláris környezet észrevehető változásával jár együtt [például dezoxi-ribonukleinsav (DNS), ribonukleinsav (RNS), peptid
- 41 .··· vagy protein szintjének növekedésével; vagy a fentiek termelődés! vagy lebontási sebességének megváltozásával]. Génterméknek, adott génről vagy kódoló szekvenciáról átiródott, még nem transzlálódott RNS-molekulát (azaz, mRNSmolekulát vagy antiszensz RNS-molekulát); vagy adott gén vagy kódoló szekvencia alapján átiródott mRNS-molekuláról transzlálódott polipeptidláncot (azaz, proteint vagy pepiidet) nevezünk. Mig a gének kódoló szekvencián kívül nem-kódoló szekvenciákat is tartalmaznak, a kódoló szekvenciák nem tartalmaznak nem-kódoló (azaz, szabályozó) DNS-szekvenciákat. Valamely gént vagy kódoló szekvenciát rekombinánsnak nevezünk, ha a molekulában a bázisok sorrendjét a természetben tipikusan előforduló gén vagy kódoló szekvencia bázissorrendjéhez képest megváltoztattuk; vagy ha az adott bázissorrend tipikusan nem fordul elő a természetben. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint, génként vagy kódoló szekvenciaként alkalmazhatunk teljes egészében vagy részben szintetikus úton előállított szekvenciákat; azok tartalmazhatnak genomi vagy komplementer DNS- (cDNS- ) szekvenciákat; és azok lehetnek DNS vagy RNS formájában.
Nem-kódoló szekvenciák vagy szabályozó szekvenciák le hetnek például promóter-szekvenciák. Promóternek olyan DNS-szekvenciákat nevezünk, amelyek RNS polimeráz kötődését idézik elő, miáltal megindítják az RNS-szintézist. Enhanszereknek cisz-működésű DNS-elemeket nevezünk, amelyek szomszédos gének átíródását fokozzák vagy gátolják. A transzkripciót gátló enhanszereket silencer elemeknek
- 42 ··· «···· « · ···· · ···· ·*·· ·· · · · · is nevezzük. Az enhanszerek különböznek a csupán promóterekben megtalálható, szekvencia-specifikus DNS-kötő proteinek számára kötőhelyet tartalmazó (promóterelemeknek is nevezett) DNS-szekvenciáktól, amennyiben azok működésüket kifejthetik bármely orientációban, és elhelyezkedhetnek az átíródott régiótól esetleg több száz kilobázispár távolságra, attól 3'-irányban is. Azt mondjuk, hogy egy kódoló szekvencia funkcionálisan kapcsolt egy promóterrel azaz, a kódoló szekvencia és a promoter utas gént (passenger gene) alkot], ha a promoter képes előidézni az adott kódoló szekvencia transzkripcióját.
A fentiek szerint, utas gén bármely gén lehet, előnyösen, terápiás gén vagy riportergén. Előnyösen, az utas gén képes expresszálódni a sejtben, amelybe a vektort bejuttattuk. A gén tartalmazhat például riportergént, vagy a sejtben valamilyen módon kimutatható proteint kódoló nukleotid-szekvenciát. A gén lehet továbbá, hatását protein- vagy RNS- szinten kifejtő terápiás gén. A bejuttatott terápiás gén által kódolt protein alkalmazható lehet például örökletes betegségek kezelésére; például cisztikus fibrózis kezelésében alkalmazható a cisztikus fibrózis transzmembrán-átvezetőképesség szabályozó proteint kódoló cDNS. A terápiás gén által kódolt protein, terápiás hatását kifejheti sejtpusztulás előidézésén keresztül is. A gén expressziója önmagában is vezethet sejtpusztuláshoz, például a diftéria-toxin-A gén expresszálódása esetén; vagy a gén expresszálódása szelektív módon érzékenyítheti a sejteket bizonyos gyógyszerek sejtpusztulást előidéző hatásával
- 43 ··· · · · · · ·..· ··:· : ··:· ··»’ szemben, például a HSV timidin kináz gén a sejteket érzékennyé teszi vírusellenes vegyületekkel, például aciklovir, ganciklovir és FIAU [1-(2-dezoxi-2-fluoro-p-D-arabinofuranozil)-5-joduracil] hatásával szemben.
Ezen felül, a terápiás gén kifejtheti hatását RNSszinten, például „antiszensz nukleinsav-szekvencia vagy ribozim kódolásával; összeállitódást (splicing) vagy 3'végi érést (például poliadenileződést) előidéző protein kódolásával; vagy a gén kódolhat olyan proteint, amely a sejtben, egy másik gén expressziójának szintjét módosítva fejti ki hatását (ahol a génexpresszió kifejezést, a transzkripció megindításától az érett protein keletkezéséig terjedő folyamatot magában foglaló tágabb értelemben használjuk) , többek között, az mRNS-felhalmozódás szintjének megváltoztatásán keresztül; az mRNS-transzport módosításán keresztül; és/vagy a poszttranszkripciós szabályozás megváltoztatásán keresztül. A „terápiás gén kifejezést tehát olyan értelemben használjuk, hogy az vonatkozzon a fenti, és génterápia alatt általánosságban értett bármely egyéb, szakember számára ismert értelmezésre. Hasonlóképp, rekombináns adenovírusokat alkalmazhatunk génterápiás célra; vagy arra, hogy a gén expresszálódásának hatásait adott sejtben vagy szövetben, ín vitro vagy in vivo tanulmányozzuk .
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, kiméra burokproteint, például fiberproteint tartalmazó rekombináns adenovírust; vagy utas gént vagy meghatározott sejtekben expresszálódni képes géneket tartalmazó rekombináns adenovírust előállíthatunk transzfervektor, előnyösen, vírus- vagy plazmid- transzfervektor alkalmazásával. Ilyen transzfervektorok előnyösen, a fent ismertetett kiméra adenovírus-burokprotein génszekvenciákat tartalmaznak. A kiméra burokprotein génszekvencia a deletált natív szekvenciák helyén vagy a natív szekvenciákon felül, nem-natív szekvenciákat tartalmaz.
Rekombináns kiméra burokprotein génszekvenciát (például fiber gén szekvenciát) adenovírus-transzfervektorból baculovírusba vagy megfelelő prokariota vagy eukariota expressziós vektorba vihetünk át, hogy azt expresszáljuk; receptor- vagy protein-specifitását és -aviditását, trimerképző képességét, pentonbázis-kötő képességét és más biokémiai sajátságait meghatározzuk.
A találmány tárgyát képezik tehát kiméra adenovírusburokprotein génszekvenciát (előnyösen, fibergénszekvenciát) tartalmazó rekombináns baculovirusok, valamint prokariota vagy eukariota expressziós vektorok is, amelyek a fenti meghatározás szerint, egyúttal „transzfervektorok. A kiméra burokprotein génszekvencia (például fiber-génszekvencia) natív aminosav-szekvenciák helyén vagy a natív szekvenciákon felül, nem-natív szekvenciákat tartalmaz, amelyek a keletkező kiméra burokprotein-szekvenciát (például fiber-génszekvenciát) képessé teszik a natív szekvencia kötőhelyétől eltérő kötőhelyekhez történő kötődésre. Azáltal, hogy a kiméra gént adenovírus-vektorból baculovírusba vagy prokariota vagy eukariota expressziós vektorba visszük át, magasabb szintű protein-expressziót érhetünk el (úgy, hogy az össz-protein körülbelül 5-50 %-át kiméra fiber tegye ki).
A találmány szerinti vektor a burokproteint kódoló szekvenciában, annak helyén vagy azon kívül, további szekvenciákat is tartalmazhat, amelyek a burokproteint, például fiberprotein trimer-képző képességét befolyásolják, vagy proteáz enzimek által felismert szekvenciát tartalmaznak. Trimer-képző képességét befolyásoló szekvenciának egy vagy több, olyan szekvenciát nevezünk, amely a kiméra burokproteint, azaz fiberproteint képessé teszi trimer-képzésre. Proteáz enzimek által felismert szekvencián olyan szekvenciákat értünk, amelyeket proteázok hasítani képesek, miáltal azok a kiméra burokprotein (vagy annak egy része) eltávolítását, és a rekombináns adenovirus sejtekhez történő kötődését eredményezik, más burokproteineken keresztül. Amennyiben ilyen szekvenciákat fiberprotein természetű burokproteinek esetében alkalmazunk, a proteáz felismerő hely előnyösen, nem befolyásolja a fiber-trimerizációt vagy a fiberprotein receptor-specifitását. Például, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a fiberproteint vagy annak egy részét proteáz felismerő szekvenciák segítségével eltávolítjuk, majd az új sejtfelszíni kötőhelyet a pentonbázis- vagy hexon- burokproteinbe építjük be, előnyösen, a fent ismertetett távtartó szekvencia segítségével.
A találmány szerinti vektorok és transzfervektorok előállítása vonatkozásában, transzfervektorokat ismert molekuláris és genetikai technikákkal állíthatunk elő, például szakember számára ismert eljárások szerint. Vektorokat
- 46 Η · « ····· • · ··*· ♦ **£* (például virionokat vagy vírusrészecskéket) vírusvektorok alkalmazásával állítunk elő. Például, a találmány szerinti kiméra burokproteineket tartalmazó vírusvektorokat előállíthatunk úgy, hogy E4-komplementáló szekvenciákat nemtartalmazó sejtekbe a következőket juttatunk: (1) kiméra fibert és a vad-típusú E4-gént tartalmazó lineáris vektort; és (2) a 3. ábra szerinti, E4“- típusú lineáris vektort. A csatolt példákban ismertetettek szerint, a fenti eljárás a szekvenciák rekombinációját eredményezi, miáltal olyan vektor jön létre, amely a kiindulásul szolgáló E4'-vektor egy részét és az E4+-vektor egy részét, közelebbről, a kiméra fíberszekvenciákat hordozó régiót tartalmaz.
Hasonlóképp, a fíber-kiméra-tartalmú részecskéket előállíthatjuk ismert sejtvonalakban, például adenovírusvektorok esetében általánosan alkalmazott sejtvonalakban. A részecskék felszaporítását és tisztítását követően, a részecskéket, amelyekről a fibert el kívánjuk távolítani, olyan szekvencia-specifikus proteázokkal végzett emésztéssel tesszük fíbermentessé, amely proteázok hasítják a fiberproteineket, és felszabadítják azokat a vírusrészecskékről, miáltal fibert nem-tartalmazó részecskék jönnek létre. Például a trombin ismert aminosavszekvenciákat ismer fel és azoknál hasít, amely szekvenciák viszont beépíthetők a vektorba [Stenflo és mtsai.:J. Bioi. Chem. 257, 12280 (1982)]. Továbbá, vektorkonstrukció során alkalmazhatunk fíbergént nem-tartalmazó deléciós mutánsokat, például a következő mutánsokat: H2dl802, H2dl807 és H2dll021 [Falgout és mtsai.: J. Virol. 62, 622 81988)].
Ezek a fibermentes részecskék stabilnak bizonyultak, és azok képesek sejtekhez kötődni, és sejteket fertőzni (Falgout és mtsai.: lásd fent). Az így kapott részecskék alkalmazásával meghatározott szövetek célozhatok meg, a pentonbázis-proteinen vagy más burokproteinen keresztül, előnyösen, egy vagy több, találmány szerinti nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmazó burokproteinen keresztül.
Ezen felül, további módosításokat hordozó kiméra fiberproteineket tartalmazó rekombináns adenovírusokat előállíthatunk úgy, hogy a fiberprotein receptorkötő és trimerizációért felelős doménjait tartalmazó natív gombrégiót eltávolítjuk, és azt nem-natív trimerizációs doménnal [Peterandler és mtsai.: Biochemistry 31, 12272 (1992)] és találmány szerinti nem-natív aminosav-szekvenciával helyettesítjük. Kiméra fiberproteint tartalmazó rekombináns adenovirust előállíthatunk úgy is, hogy a gombrégióban pontmutációt hozunk létre, és trimerizációra képes kiónokat izolálunk. Mindkét esetben, és a natív receptor-specifikus kötőszekvenciák fent említett eltávolítása és helyettesítése esetében is, új proteinkötő doménok adhatók a fiberprotein C-terminális végéhez vagy a fiberprotein felszínen megjelenő hurokrégióihoz, oly módon, a nem-natív aminosav-szekvenciát kódoló nukleinsav-szekvencia egy vagy több kópiáját a megfelelő pozíciókba inszertáljuk. Előnyösen, az így keletkező fiberprotein képes trimert képezni, és ezáltal képes pentonbázis-proteinhez kötődni.
A kiméra fiberproteinek előállítására szolgáló fent ismertetett eljárások alkalmazhatók továbbá más kiméra bu
- 48 rokproteinek előállítására is, például kiméra hexon- vagy penton- proteinek előállítására.
Az alábbiakban, szemléltetés kedvéért, a találmány néhány alkalmazási lehetőségét ismertetjük.
A találmány tárgyát képezik kiméra proteinek, amelyek sejtekhez képesek kötődni, és nagy hatékonysággal képesek vektorok sejtekbe történő bejuttatását közvetíteni, valamint az említett proteineket tartalmazó vektorok és transzfervektorok. A kiméra burokprotein többféle célra alkalmazható, például adenovirus sejtekhez történő kötődésének in vitro tanulmányozására [például Scatchard-analízissel, Wickman és mtsai. által a korábbiakban ismertetettek szerint, lásd fent (1993)]; adenovirus receptorokhoz történő kötődésnek in vitro gátlására (például, ellenanyagok, peptidek és enzimek alkalmazásával, a csatolt példákban ismertetett módon); vagy in vivo, adenovírus-fertőzés megakadályozására, kihasználva azt a jelenséget, hogy azok az adenovírusok sejtekbe történő bejutását közvetítő kötőhelyekért versengenek.
Kiméra burokproteineket tartalmazó vektorok alkalmazhatók továbbá törzsek és új vektorok előállítására. Például, a nem-natív aminosav-szekvencia képes nukleinsavakhoz kötődni, és sejtekbe juttatható, hogy rekombináció révén, új vektorokat nyerjünk. Hasonlóképp, vektorok alkalmazhatók génterápiás célra. Például, a találmány szerinti vektorok alkalmazhatók számos betegség kezelésére, úgy, hogy célzott sejtekhez, a rendellenességet kijavító DNS-t juttatunk, például hiányzó vagy károsodott funkciót kódoló DNS-t; vagy meghatározott sejtpusztitó hatóanyagot, például csak intracellulárisan ható citotoxint kódoló DNS-t juttatunk. Ilyen kezelés alkalmazható lehet például a következő betegségek esetében: tumorok, például melanoma, glióma vagy tüdőtumorok,· genetikai rendellenességek, például cisztikus fibrózis, hemofilia vagy izomdisztrófia; kórokozóval történt fertőzések, például humán immundeficiencia vírus fertőzés, tuberkulózis vagy hepatitis; szívbetegségek, például angioplasztikát követően ismételten kialakuló érszűkület megelőzése vagy nekrotikus szövetek vérellátását fokozó angiogenezis elősegítése; vagy autoimmun betegségek, például Crohn-betegség, colitis vagy reumatoid arthritis.
Közelebbről, génterápiát alkalmazhatunk olyan szöveteket érintő betegségek, rendellenességek vagy állapotok kezelésére is, amelyek látszólag nem tartalmaznak nagy menynyiségben olyan receptorokat, amelyekhez a vad-típusú adenovírus-fiberproteinek kötődni képesek, tehát olyan szövetek esetében, a jelenleg alkalmazott adenovirus közvetítette génterápiás megközelítési módok hatékonysága nem éri el az optimális szintet (például, gének monocitákba / makrofágokba, fibroblasztokba, idegsejtekbe, izomsejkbe és epithelsejtekbe történő bejuttatására). Ilyen sejtekből álló szövetek (és ilyen szöveteket érintő betegségek, rendellenességek vagy állapotok) például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, a következők: endothel (angiogenezis, érszűkület ismételt kialakulása, gyulladás és tumorok); idegszövet (például tumorok és
- 50 Alzheimer-betegség); epithelium (például a bőr, szaruhártya, bél és tüdő rendellenességei); érképzőrendszeri sejtek [például humán immundeficiencia virus (HIV1-, HIV-2), malignus elváltozások és vérszegénység]; simaizom (például érszűkület ismételt kialakulása); fibroblasztok (például gyulladások).
Ezen felül, terápiás gén bejuttatása helyett, a találmány szerinti vektorok (közelebbről adenovírus-vektorok) alkalmazásával riportergént vagy valamilyen típusú markergént is bejuttathatunk. Markergének és riportergének alkalmazhatók például a sejtdifferenciálódás vizsgálatára és sejtek sorsának tanulmányozására irányuló vizsgálatokban, és feltehetően, diagnosztikus célokra. Továbbá, valamely ismert riportergén, például β-galaktozidáz riportergén, zöld fluoreszcens proteint („green fluorescent protein, GÉP) kódoló gén vagy β-glukuronidáz gén alkalmazható in vivo, például élő gazdaszervezetben végzett vizsgálatokban, vagy például, sejtek célzott eltávolításának eszközeként [lásd például, Minden és mtsai.: Biotechniques 20, 122 (1996); Youvan: Science 268, 264 (1995); 5 432 081 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Deonarain és mtsai.: Br. J. Cancer 7 0, ^86 (1994)].
Hasonlóképp, gént gazdaszervezetbe juttathatunk meghatározott protein in vivo előállítása céljából. A fentiekkel összhangban, transzgenikus állatokat alkalmaztak például rekombináns polipeptidek, transzgenikus szarvasmarha fajok tejében történő előállítására (lásd például, WO 93/25567 számú nemzetközi közzétételi irat). „Nem-terápiás gén-
transzfert végezhetünk továbbá, humán betegségek állati modellben történő tanulmányozása céljából (például, transzgenikus egereket és más transzgenikus állatokat alkalmazhatunk tumorképződés tanulmányozására irányuló vizsgálatokban, például a p53-jelzésű tumor-szupresszor gén működésének megszüntetésére; transzgenikus modelleket alkalmazhatunk károsodott glukóz-tolerancia vizsgálatára és humán Alzheimer amiloid-prekurzor-protein modellekben, a glukóz -métából izmus és Alzheimer-betegség patogenezisének tanulmányozására, stb.).
A fenti alkalmazási lehetőségek nem ölelik fel az öszszes lehetséges alkalmazási módot, és világos, hogy a találmány tárgyát képezik a fentiekből következő, de a leírásban részletesen nem ismertetett további alkalmazási lehetőségek is. Továbbá, a találmány szerinti megoldás különböző megvalósítási lehetőségeinek alkalmazása számos előnynyel jár.
Például, a találmány szerinti univerzális célba juttató vektorok (universal targeting vector) alkalmazása a következő előnyökkel jár: (1) a vektor potenciálisan valamennyi sejt és szövet esetében alkalmazható; (2) egyetlen vektor alkalmazható valamennyi sejtvonal esetében, nincs szükség más vektor egyidejű tanszfektálására; (3) a vektor alkalmazásával hatékonyabb génszállítás érhető el, mint vad-típusú fiberproteint tartalmazó vektorral; (4) a vektor - ellentétben korábbi vektorokkal - nem céloz meg specifikus sejteket, ehelyett - úgy tűnik -, általánosságban fokozza a transzdukció hatékonyságát; (5) a vektor alacso- 52 nyabb dózisban [azaz, alacsonyabb fertőzési többszörös (MOI) érték mellett] képes géntranszfert közvetíteni, mint a vad-típusú fiberproteint tartalmazó vektor, miáltal valószínűleg csökkennek a jelenleg hozzáférhető adenovírusvektorok alkalmazásával járó dózisfüggő hátrányok; (6) a vektor rendelkezésre álló sejtvonalak alkalmazásával szaporítható és fenntartható.
Az univerzális célba juttató vektorok, például az adenovirus természetű univerzális célba juttató vektorok azon képessége, hogy potenciálisan valamennyi szövethez vagy a legtöbb szövethez kötődnek, és azok sejtjeibe bejutnak, számos előnnyel jár. Ilyen előnyök például a következők: a géneket több szövetbe, a korábbi vektoroknál nagyobb hatékonysággal juttatják be; rendelkezésünkre áll egyetlen vektor, amely képes géneket juttatni valamennyi szövetbe; és a génszállításhoz szükséges összetevők egyszerűen előállíthatok. Ezen felül, ilyen univerzális célba juttató vektorok képesek exogén DNS-t sejtekbe juttatni, úgy, hogy a vektor a DNS-t protein/DNS kölcsönhatáson keresztül, „a hátán viszi be („piggy-backing) a sejtbe.
Továbbá, ilyen univerzális célba juttató vektorok alkalmazása azzal az előnnyel járhat, hogy azok a géneket lényegesebb nagyobb (például 10-100-szor nagyobb) hatékonysággal juttatják olyan sejtekbe, amelyek kisebb mennyiségben expresszálnak vad-típusú fiberproteinek számára kötőhelyül szolgáló fíber-receptorokat, ezen felül, a géneket nagyobb hatékonysággal juttatják vad-típusú fiberproteinek számára kötőhelyül szolgáló fiber-receptorokat expresszáló
- 53 sejtekbe vagy szövetekbe is. Továbbá, a vektorok csökkentett dózisban történő alkalmazása ugyancsak csökkenti az adenovirusok alkalmazásával kapcsolatos gyulladást; az adenovirusokra adott humorális választ; és az adenovirusok által kiváltott citotoxikus T-limfocita választ.
Ezen felül, ilyen vektorok alkalmazása azért is előnyös, mert azok szokásos módon izolálhatok és tisztíthatok. Mivel a vektorban a genom szintjén hoztunk létre változtatásokat - ellentétben más vektorokkal -, annak előállítását követően nincs szükség bonyolult és költséges módosításokra [lásd például, Cotten és mtsai.: lásd fent; Wagner és mtsai.: lásd fent). Hasonlóképp, nincs szükség különleges receptor-expresszáló sejtvonalak alkalmazására. UTVvektorok hasonló titerben szaporíthatok, mint a fibermódosítást nem-tartalmazó vad-típusú vektorok.
Adagolási módok
A találmány szerinti vektorok és transzfervektorok sejtekkel érintkeztethetők, in vitro vagy in vivo. A leírásban „érintkeztetésen értünk bármely eljárást, amellyel vektorok sejtekbe juttathatók; az eljárás nem korlátozódik a bejuttatás valamely meghatározott módjára, ilyen következtetés nem vonható le. A bejuttatás különböző módjai szakember számára jól ismertek, és azok néhány példáját az alábbiakban ismertetjük.
A fentiek szerint, a vektort bejuttathatjuk például in vitro (például, ex vivo típusú génterápiás eljárásokban vagy szövettenyészeti vizsgálatokban) vagy in vivo,
- 54 elektroporációval, transzformációval, transzdukcióval, konjugációval vagy három résztvevős keresztezéssel végzett génkicserélődéssel („triparental mating), kotranszfekcióval, ko-infekcióval, kationos lipidekkel létrehozott membránfúzióval, DNS-sel fedett mikrolövedékkel, nagy sebességgel végzett bombázással, egy-egy sejt közvetlen mikroinjekálásával és hasonlókkal. Hasonlóképp, a vektor bejuttatható kationos lipidek, például liposzómák alkalmazásával. Ilyen liposzómák kereskedelemben hozzáférhetőek (például Lipofectin®, Lipofectamine® és hasonlók; Life Technologies, Gibco BRL, Gaithesburg, MD) . Továbbá, a találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, alkalmazhatók nagyobb transzferkapacitással és/vagy in vivo alacsonyabb toxicitással rendelkező liposzómák (lásd például, WO 95/21259 számú nemzetközi közzétételi irat). Rendelkezésre állnak más eljárások is, és azok szakember számára ismertek.
A leírásban „gazdán (és gazdából származó sejten) bármely gazdát értünk, amelybe a találmány szerinti vektorok bejuttathatok; ez lehet állat, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, kétéltű, madár, hal, rovar, hüllő vagy emlős. Előnyösen, a gazdaszervezet emlős, például rágcsáló, főemlős (például csimpánz, majom, nagy farkatlan majom („ape), gorilla, orangután, vagy gibbon), macskaféle, kutya, patás (például kérődző vagy sertés); és közelebbről, ember.
Minthogy univerzális célba juttató vektorok, úgy tűnik bármely sejtbe képesek bejutni, sejtként bármely olyan sej
- 55 tét alkalmazhatunk, amelybe ilyen vektorok képesek bejutni. Közelebbről, univerzális célba juttató vektorok alkalmazhatók, alacsony vagy a kimutathatóság küszöbét el nem érő szintű fiberreceptort expresszáló sejtekbe irányuló géntranszferre, például - de anélkül, hogy igényünket az alábbiakra korlátoznánk -, endothel-, simaizom-, ideg--, vérképzőrendszeri, vagy fibroblaszt- sejtekbe.
Szakember számára világos, hogy a találmány szerinti vektorok (közelebbről, adenovírus-vektorok) állatnak, génterápiás célból [lásd például, Rosenfeld és mtsai.: Science 252, 431 (1991); Jaffe és mtsai.: Clin. Res. 39(2), 302A (1991); Rosenfeld és mtsai.: Clin. Res. 39(2), 311A (1991); Berkner: Biotechniques 6, 616 (1988)], kemoterápiás célból vagy vakcinázás céljából történő beadására megfelelő módszerek állnak rendelkezésre, és bár a beadás több különböző módon történhet, valamely beadási mód közvetlenebb és hatékonyabb reakciót eredményezhet, mint más módok. Gyógyászatilag elfogadható vivőanyagok szakember számára ugyancsak ismertek, és könnyen hozzáférhetőek. Az adott vivőanyag kiválasztását részben, a rekombináns vektor bejuttatására alkalmazott módszer határozza meg. A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint, tehát számos különféle készítmény alkalmazható. Az alábbi eljárások és vivőanyagok csupán a szemléltetést szolgálják, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
Szájon át történő beadásra alkalmas készítmények lehetnek például az alábbiak: (a) folyékony oldatok, például az aktív összetevő hatékony mennyiségét, hígítószerben,
- 56 például vízben, fiziológiás sóoldatban vagy narancslében oldhatjuk; (b) az aktív összetevő meghatározott mennyiségét szilárd granulákként tartalmazó kapszulák, tasakocskák vagy tabletták; (c) megfelelő folyadékban elkészített szuszpenziók; vagy (d) megfelelő emulziók. Tabletták tartalmazhatnak egy vagy több, alábbi összetevőt: laktóz, mannitol, kukoricakeményítő, burgonyakeményítő, mikrokristályos cellulóz, gumiarábikum, zselatin, kolloidális szilícium-dioxid, nátrium-croscarmellose, talkum, magnézium-sztearát, sztearinsav és más vivőanyagok; színezékek; hígítóanyagok; pufferoló anyagok, nedvesítő anyagok, tartósítok, ízesítőszerek, és gyógyászatilag kompatibilis vivőanyagok. Cukorka formában előállított készítmények tartalmazhatják az aktív hatóanyagot valamilyen ízesítőanyaggal, rendszerint szacharózzal és gumiarábikummal vagy tragakanttal kombinálva; pasztillák tartalmazhatják az aktív hatóanyagot valamilyen semleges alapanyagba, például zselatinba vagy glicerinbe keverve, szaharózzal vagy gumiarábikummal együtt; ezen felül, emulziók, gélek és hasonlók az aktív hatóanyagon felül tartalmazhatnak a technika állása szerint ismert vivőanyagokat .
A találmány szerinti vektorok vagy transzfervektorok, egymagukban vagy más összetevőkkel kombinálva, kiszerelhetek inhalációs adagolásra alkalmas aeroszol formájában. Ezek az aeroszol-készítmények túlnyomás alatt tartott hajtógázzal elegy!thetők, például diklór-difluor-metánnal, propánnal, nitrogénnel vagy hasonlókkal. Azok kiszerelhetők
- 57 ··· · · · · · %.· ··:· : ··:· ··:· továbbá túlnyomás alatt nem tartott készítményekként, például porlasztó vagy permetező készülékekben.
Parenterális adagolásra alkalmas készítmények lehetnek vizes vagy nem-vizes, izotóniás steril injekciós oldatok, amelyek tartalmazhatnak antioxidánsokat, puffereket, bakteriosztatikus szereket, és az oldatokat a recipiens vérével izotóniássá tevő oldott összetevőket; lehetnek továbbá vizes vagy nem-vizes steril szuszpenziók, amelyek tartalmazhatnak szuszpendáló anyagokat, szolubilizáló szereket, sűrítő anyagokat, stabilizátorokat vagy tartósítószereket. A készítményt kiszerelhetjük egységnyi dózist tartalmazó vagy több dózist tartalmazó zárt tartályokban, például ampullákban vagy fiolákban, és tárolhatók fagyasztva szárított (liofilizált) állapotban, amelyhez az alkalmazást megelőzően csupán a steril folyékony vivőanyagot, például vizet kell hozzáadnunk, hogy injektálható készítményt kapjunk. Vényre készült injekciós oldatokat és szuszpenziókat a fent ismertetett steril porokból, granulákból vagy tablettákból készíthetünk.
Továbbá, a találmány szerinti vektorok és transzfervektorok kiszerelhetők kúpok formájában, úgy, hogy azokat különböző alapanyagokkal, például emulgeáló alapanyagokkal vagy vízoldékony alapanyagokkal elegyítjük.
Hüvelyen át történő beadásra alkalmas készítményeket előállíthatunk pesszáriumokként, tamponokként, krémekként, gélekként, pasztákként, habokként vagy sprayként, amelyek az aktív hatóanyagon felül, a technika állása szerint ismert hordozóanyagot is tartalmazhatnak.
- 58 ·..· ··:· : ··:· ·τ
A találmány szerinti eljárás vonatkozásában, az állatnak vagy embernek beadott dózis függ az adott géntől, az alkalmazott készítménytől, a beadás módjától és a kezelendő helytől és organizmustól. A dózisnak azonban elegendő menynyiségű hatóanyagot kell tartalmaznia ahhoz, hogy terápiás hatást váltson ki.
A fent említettek szerint, a találmány szerinti vektor vagy transzfervektor in vitro is alkalmazható. Ilyen vektorok alkalmazhatók a kutatás eszközeként, adenovírusok sejtekhez történő kötődésének és sejtek fertőzésének tanulmányozására, valamint kötőhely-ligandum kölcsönhatás vizsgálatára alkalmas eljárásokban. Hasonlóképp, a natív receptorkötő szekvencián felül, vagy ahelyett nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmazó rekombináns burokproteinek alkalmazhatók például receptor-ligandum kölcsönhatás vizsgálatára irányuló eljárásokban, és adhéziós proteinekként, in vitro vagy in vivo.
A találmány szerinti megoldást az alábbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk .
1. példa
Az alábbi példában, különböző sejteken található adenovírus-receptor szintek vizsgálatát ismertetjük, vadtípusú adenovirus, sejtekhez történő kötődési képességének meghatározásán keresztül.
- 59 ·..· ··:· : ··.’· ··:·
Kísérleteinkben vad-típusú fibert hordozó adenovírusok, különböző szövetekből származó sejtekhez történő kötődési képességét vizsgáltuk. Ad5-törzshöz tartozó adenovírus-részecskéket [3H]-timidinnel jelöltünk, a korábbiakban ismertetettek szerint [lásd például, Wickham és mtsai.: Cell 73, 309 (1993)]. Timidin-j elölt adenovírust adtunk, a receptorok szaturációjához elegendő mennyiségben, 200 μΐ, 10s sejtet tartalmazó szuszpenzióhoz, amelyet előzőleg 30-60 percig, 20 pg/ml szolúbilis fiberprotein jelenlétében vagy anélkül inkubáltunk. A sejteket egy órán át, 4 °C-on a vírussal inkubáltuk, majd hideg, foszfát pufferes fiziológiás sóoldattal (PBS) háromszor mostuk. A sejtfrakcióban maradt beütésszámot szcintillációs számlálóban mértük. A specifikus kötődést úgy határoztuk meg, hogy a fiber jelenlétében mért, sejtekkel asszociált beütésszámot (azaz, percenkénti beütésszámot,· „counts per minute, cpm) kivontuk a fiber jelenléte nélkül mért, sejtekkel asszociált beütésszámból. A fiber jelenlétében mért kötődés soha nem haladta meg a reakcióban alkalmazott összes radioaktív vírusrészecske 2 %-ának megfelelő mennyiséget. Az eredményeket triplikátumban végzett meghatározások átlagaként adtuk meg.
Az 1. ábra szerint, különböző szövetekből származó sejtek jelentős hányada kis mennyiségű fíberreceptort expresszált vagy egyáltalán nem expresszált ilyen receptorokat; erre utal, hogy a vad-típusú adenovirus a fenti sejtekhez viszonylag kevésbé volt képes kötődni. Építhet eredetű sejtek (azaz, „receptor-plussz) sejtek, például Chang-, HeLa- és A549- sejtek) nagy mértékű adenovirus
·..· ··:· : ··;· ··/·
- 60 kötő képességgel rendelkeztek. Ezzel szemben, nem-epithel sejtek (azaz, „receptor-mínusz sejtek, például monocita/makrofág sejtek, fibroblasztok, idegsejtek, simaizomsejtek és endothelsejtek) körülbelül 10-szer alacsonyabb vagy annál is kisebb víruskötő képességgel rendelkeztek, mint az epithel-szerű sejtek.
A fenti eredmények megerősítik azt a korábbiakban fel nem ismert tényt, hogy az adenovírusok viszonylag kevésbé képesek receptor-minusz nem-epithel sejtekhez kötődni, és ezáltal, azokba bejutni, mint receptor-plussz, epithel sejtekbe. A kötődési képesség eme hiányának valószínűleg az az oka, hogy a fenti sejteken kevés receptor található vadtípusú adenovirus-fiberproteinek számára.
2. példa
Az alábbi példában, kiméra burokproteint, közelebbről, kiméra adenovírus-fiberproteint tartalmazó adenovírusvektor előállítását ismertetjük.
Hogy legyőzzük azokat a transzdukciós nehézségeket, amelyeket klinikai jelentőséggel bíró szöveteken, például nem-epithel szöveteken a fíberreceptorok korlátozott száma okoz, a 2.A-2.B ábrákon látható módon, módosított adenovírus-vektort állítottuk elő, amelyet „univerzális transzfervektornak vagy UTV-nek neveztünk. Közelebbről, olvasási keret eltolódást eredményező mutációt hoztunk létre egy adenovírus-burokprotein génben, nevezetesen, a fíbergénben. A vad-típusú adenovirusban, a nem-módosított fíbergén az olvasási keretbe illeszkedő transzlációs stopszignált (TAA) és transzkripciós poliadenilezési szignált (AATAAA) tartalmaz. A poliadenilezési szignál poliA-farok hozzáadását eredményezi a transzkriptum 3'-végéhez. A poliA-farok tipikusan körülbelül 20-200 nukleotidot tartalmaz. A transzkripciót és a transzkripciós termék magból történő kijutását követően, a TAA-stopszignál a transzláció befejeződését eredményezi a riboszómán.
Ezzel szemben, az UTV-vektor módosított fibergénje nem tartalmaz olvasási keretbe illeszkedő „stopszignált. Normális transzkripciót, és az mRNS-hez poliA-toldalék hozzáadódását követően, stopkódon hiányában, a riboszóma folytatja a transzkriptum transzlációját, a poliA-régió mentén. Minthogy az AAA-kódon lizin-aminosavat kódol, az UTV-ben található kiméra fíbergén transzlációs terméke polilizinaminosavak sorát tartalmazza, a C-terminális végen; például Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys (1. azonosítószámú szekvencia) szekvenciát tartalmaz. Lehetséges, hogy a polilizin aminosav-sor hosszát valamilyen celluláris folyamat korlátozza, mivel a kiméra fiberprotein tipikusan körülbelül 330 polilizin aminosavat tartalmaz. Minden esetre, a polilizin-lánc hozzáadódását eredményező protein-módosítás, valamint az alább ismertetett további módosítások lehetővé teszik, hogy az UTV hatékonyan kötődjék olyan sejtekhez, amelyek vad-típusú adenovirus fiberproteinek számára nem tartalmaznak nagy mennyiségű receptort (azaz, receptormínusz sejtekhez).
A vektorkonstrukció és a vektorok jellemzése során, szakember számára ismert molekuláris és genetikai techniká• * · · · · · · ·..···:· : ··:···«· - 62 kát alkalmaztunk, ilyen technikák például a következők: törzsek, plazmidok és vírusok előállítása, gélelektroforézis, DNS-manipulációk, például plazmid-izolálás, DNS-klónozás és szekvenálás, Western-blot-analizis és hasonlók; ilyen technikák részletes leírása megtalálható ismert laboratóriumi kézikönyvekben (lásd például, Maniatis és mtsai.: „Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, „Cold Spring Harbor, NY (1992); Ausubel és mtsai.: „Current Protocols in Molecular Biology (1987)]. A molekuláris biológiai eljárások során alkalmazott restrikciós enzimek és más enzimek kereskedelemben hozzáférhetőek (lásd például, Boehringer Mannheim, Inc., Indianapolis, Indiana; New England Biolabs, Beverly, Massachusetts; Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland), és azokat a gyártó utasításai szerint alkalmaztuk. A kísérleteinkben alkalmazott sejteket, például a 293-jelzésű, transzformált humán embrionális vesesejtvonalat (azaz, CRL 1573-sejteket) és az „American Type Culture Collection (ATCC) gyűjteményéből származó egyéb sejteket standard steril tenyésztő reagensek, tápfolyadék és technikák alkalmazásával tartottuk fenn, a korábbiakban ismertetettek szerint [Erzerum és mtsai.: Nucl. Acids Research 21, 1607 (1993)].
A fíber-stopkódon olvasási keret eltolódást eredményező mutációját úgy hoztuk létre, hogy egy adenovirus transzfervektorba módosított BamHI-helyet iktattunk be (azaz, GGATCCAA szekvenciát; lásd 6. azonosítószámú szekvencia). A módosítást a 3. ábrán látható módon hoztuk létre, a pAd-NS83-100- (más néven, pl93NS-83-100- vagy pNS-83-100-)
- 63 « · * · · · · ♦ ·..· ··:· : ··:· ♦·*· transzferplazmidból kiindulva. A pAd-NS-83-100-plazmidot úgy kaptuk, hogy az Ad5-genom fibergént tartalmazó, a genomi térkép 83-100. egységének megfelelő régióját átfedő Ndel-Sall-fragmensét pNEB193-plazmidba klónoztuk (New England Biolabs, Beverly, MA).
A pAD-NS-83-100-plazmid Ndel-Munl-fragmensét BamHIhelyet tartalmazó szintetikus oligonukleotiddal helyettesítettük, amelyet úgy állítottunk elő, hogy abban fenti helyet, a klónozás megkönnyítésére 5'-végi Ndel-hely és 3'végi Munl-hely határolja. A kettős szálú szintetikus oligonukleotid-fragmenst egymást átfedő, szintetikus, egy-szálú szensz és antiszensz oligonukleotidokból állítottuk elő, azaz a 4.A és 4.B ábrákon látható „TAT GGA GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT TTC AAC GTG TTT ATT TTT C szekvenciájú szensz láncindító oligonukleotidból (9. azonosítószámú szekvencia) és „AAT TGA AAA ATA AAC ACG TTG AAA CAT AAC ACA AAC GAT TCT TTA TTG GAT CCT CCA szekvenciájú antiszensz láncindító oligonukleotidból (10. azonosítószámú szekvencia). Az átfedő oligonukleotidok végeit úgy terveztük, hogy azok a Ndel- és MunI- helyekkel kompatibilis, közvetlen klónozásra alkalmas túlnyúló régiót tartalmazzanak.
Az így kapott transzferplazmidból - azaz, a pAD-NS-83100 (F~)-plazmidból [más néven, pl93NS(ÚF)- vagy pNS (AF) plazmidból] - a fíbergén első 50 bázisa kivételével hiányzik a fíbergén kódoló szekvenciája (azaz, „fiber-minusz). A vektor tartalmazza továbbá, a teljes, E4-jelzésű adenovirus kódoló szekvenciát. A plazmidban, a szintetikus
Ndel/Munl-oligonukleotidba építve megtartottuk az ΑΑΤΆΑΆ poliadenilezési szignált, és az tartalmazza az új BamHI restrikciós helyet.
A mutációval módosított fíbergént úgy inszertáltuk a fíber-minusz pAd-NS-83-100-plazmidba, hogy a fíbergént szintetikus szensz és antiszensz láncindító oligonukleotidok alkalmazásával, polimeráz láncreakciós eljárással (PCR) amplifikáltuk, eközben, a génbe módosított BamHIhelyet hoztunk létre, a fíbergén utolsó kódonját követően, miáltal mutáns fíbergént kaptunk. Ez, a génbe iktatott módosított BamHI-hely egyúttal glicin- és szerin- aminosavakat kódol, és a módosítás a GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT kiméra nukleinsav-szekvenciát eredményezi (7. azonosítószámú szekvencia). Az így kapott, módosított fíbergén tehát a keletkező kiméra fíberproteinben „Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys aminosav-szekvenciájú (4 azonosítószámú szekvencia) toldalékot kódol, amelyben a polilizin-sor hossza változhat. A fíbergén amplifikációjára a következő szintetikus oligonukleotidokat alkalmaztuk: „TCCC CCCGGG TCTAGA TTA GGA TCC TTC TTG GGC AAT GTA TGA (11. azonosítószámú szekvencia) és „CGT GTA TCC ΑΤΆ TGA CAC AGA (12. azonosítószámú szekvencia), a fenti oligonukleotidokat a 4.C és 4.D ábrákon szemléltetjük.
Ezt követően, az amplifikált génterméket Ndel és BamHI restrikciós enzimekkel hasítottuk, és a pAd-NS-83-100 jelzésű fíber-minusz plazmid Ndel/BamHI-helyére klónoztuk, így kaptuk a pAd-NS-83-100-UTV-jelzésű transzfervektort [más néven, pl93NS(F5*), pl93(F5*) vagy pNS(F5*)]. A pAd
NS-83-100-UTV teljes Ndel-Sall adenovirus-szekvenciáját a pAd-BS-59-100-jelzésű, fiber-minusz plazmidba klónoztuk, így kaptuk a pAd-BS-59-100-UTV-plazmidot [más néven, pl93NS(F5*)pl93(F5*)- vagy pNS(F5*)~ plazmidot].
Az UTV-adenovírusvektort homológ rekombinációval állítottuk elő, 293-sejtekben. Nevezetesen, az E4+ pAD-BS-59100-UTV-transzfervektort Sall-enzimmel linearizáltuk, és előzőleg A2F-adenovírus-vektorral fertőzött 293-sejtekbe transzfektáltuk. Az A2F-vektor GVlO-vektorból származott. Az Ad5-alapú GVlO-vektor tartalmazza a LacZ-gént, a Rousszarkóma vírus promoter szabályozása alatt (azaz, RSV-lacZgént tartalmaz). A ríportergént a GVlO-vektor El-régiójába inszertáltuk (azaz, a vektor ΕΓ) . A GVlO-vektor ezen felül, deléciót hordoz az E3-régióban, de E4+. A GV10vektorral szemben (amely tehát RSV-lacZ, El, E3', E4+) , az A2F deléciót tartalmaz a létfontosságú E4-adenovírusgénben, de E3+ (azaz, RSV-lacZ, El, E3 + , E4~) .
A 293-sejtek El-komplementáló szekvenciát tartalmaznak, de nem tartalmaznak E4-komplementáló szekvenciákat. Az E4-komplementáló szekvenciák hiánya következtében, az E4~tipusú A2F-vektorok nem képesek replikálódni a 293sejtekben. Amennyiben azonban, A2F-vírusokat és pAd-BS-59100-UTV-vektorkat együtt juttatunk 293-sejtekbe, homológ rekombináció jön létre az UTV-transzfervektor és az A2Fadenovírusgenom közt, miáltal 293-sejtekben replikálódni képes, kiméra fiberproteint tartalmazó, E3+, E4+ adenovírusgenom keletkezik. A fenti módon kapott UTVvektort GV10-UTV-vektornak neveztük.
- 66 ..j. ..r
A GVIO-UTV-vektort ismert plakkizolálási technikával izoláltuk, 293-sejtek alkalmazásával. Három egymást követő plakktisztitási lépést követően, a kapott GV10-UTV-vektor tartalmazta a fíbermutációt, és E4 A2F-vektor kontaminációtól mentes volt. Azt, hogy a GV1O-UTV-vektorban a kiméra fiberszekvencia valóban jelen van, a fiber-mRNS szekvenálásával igazoltuk, reverz transzkriptáz - polimeráz láncreakciós (RT-PCR) eljárással, amely vizsgálat megerősítette a kiméra fíber-mRNS-ben poliadenin-toldalék jelenlétét .
Hasonlóképp, a vektor kiméra fiberprotein termelő képességét Western-blot eljárással is igazoltuk. Ebből a célból, 293-sejteket 5-ös fertőzési többszörös (MOI) érték mellett (azaz, sejtenként 5 plakk-képző egység alkalmazásával) fertőztünk, vad-típusú adenovírus-fiberproteint tartalmazó GVlO-vektorral, vagy kiméra fiberproteint tartalmazó GV10-UTV-vektorral. A fertőzést követően két nappal, a sejteket mostuk és háromszor ismételt fagyasztással és olvasztással, PBS-ben lizáltattuk. A lizátumot centrifugálással feltisztítottuk, és 10 %-os nátrium-dodecyl-szulfát / polikarilamid gélre vittük fel. Elektroforézist követően, a proteineket nitrocellulózra vittük át, és a fíberrel szemben irányuló poliklonális ellenanyagok alkalmazásával, kemilumineszcens eljárással kimutattuk. A Western-blot eredményét az 5. ábrán szemléltetjük. Amint az az ábrán látható, a proteinek vándorlásából arra következtethetünk, hogy a kiméra UTV-fíber körülbelül 1,5-2,0 kilodaltonnal nagyobb, mint a vad-típusú módosítatlan, 62 kilodalton fiberprotein.
A fenti eredmények alapján kijelenthető, hogy a találmány szerinti eljárás alkalmazható fíberproteinben módosítás létrehozására, úgy, hogy kiméra fiberproteint kapjunk. Hasonló technikákkal módosítások hozhatók létre a hexonvagy penton- proteinekben is; vagy létrehozhatunk más hasonló módosításokat (például a burokprotein kódoló szekvenciáját argininből, lizinből és/vagy hisztidinből; és/vagy aszparaginből és/vagy glutaminból felépülő aminosavlánccal toldhatjuk meg; vagy abba a fenti szekvenciák valamelyikét inszertálhatjuk) .
3. példa
Az alábbi példában, kiméra burokproteint, közelebbről, kiméra fiberproteint tartalmazó adenovírusvektor sejtekhez történő kötődését hasonlítottuk össze vad-típusú adenovírusvektor kötődési képességével, szolúbilis vadtípusú fiberprotein jelenlétében vagy annak hiányában.
Az alábbi kísérletekben olyan sejteket alkalmaztunk, amelyekhez az 1. példában ismertetettek szerint, adenovírusok nagy hatékonysággal kötődnek („receptor-pluszsejteket); vagy amelyekhez alacsony hatékonysággal kötődnek („receptor-minusz-sejteket). Receptor-plussz sejtekként A549-jelzésű, epithel-sejtvonalat alkalmaztunk, a receptormínusz sejtek képviselőjeként pedig HS-68-jelzésű fibroblaszt-sejtvonalat alkalmaztunk. A549- vagy HS-68sejtekből álló összefüggő tenyészeteket 4 °C-on, a szolúbi
- 68 ··;· ··«· lis fiberprotein 0 μg/ml koncentrációjától körülbelül 10 gg/ml koncentrációjáig terjedő koncentrációsor jelenlétében előinkubáltunk. A kiméra fiberproteint tartalmazó GV10-UTV-vektor (UTV) vagy vad-típusú fiberproteint tartalmazó GVlO-vektort (WT) triciált timidinnel jelöltünk, az 1. példában ismertetettek szerint. Ezután, körülbelül 2 órán át, 4 °C-on, körülbelül 20 000 cpm [3H]-timidin-jelölt GV10-UTV- vagy GV10- vektort inkubáltunk a sejtekkel. A sejteket hideg PBS-sel háromszor mostuk, és a sejtasszociált cpm-et szcintillációs számlálóban meghatároztuk. Az eredményeket duplikátumban végzett mérések átlagaként adtuk meg, és azokat az A549-sejtvonal esetében a 6. A, a HS68-sejtvonal esetében a 6.B ábrán összegeztük.
Amint az a 6.A-B ábrákon látható, a GVT10-UTV-vektor által expresszált kiméra fiberprotein nagy hatékonysággal kötődött mind receptor-plussz (6.A ábra), mind receptormínusz (6.B ábra) sejtekhez. Ezzel szemben, a vad-típusú fibert tartalmazó GV10-vektor sokkal hatékonyabban kötődött receptor-plussz sejtekhez. Közelebbről, a radioaktívan jelölt GV10-UTV-vektor 2-2,5-ször jobban kötődött fíberreceptort kimutatható mennyiségben expresszáló sejtekhez (azaz, A549-jelzésű alveoláris epithelsejtekhez), mint a GV10-vektor. Míg a GV10-vektor esetében, a kötődés szinte teljesen gátolható volt a kötőhelyekért versengő rekombináns fiberprotein alkalmazásával, annak hozzáadása a GV10-UTV-vektor kötődését csak körülbelül 40 %-ban gátolta. A vad-típusú adenovírus-fíbert tartalmazó GV10-vektor egyáltalán nem kötődött HS-68-jelzésű, fíber-receptort nem • · « · · w · « * · t · · ···· · ·«·· ·♦·
- 69 - ····** hordozó, humán fityma-fibroblaszt sejtekhez. Ezzel szemben, a GVIO-UTV-vektor hatékonyan kötődött HS-68-sejtekhez, és a kötőhelyekért versengő fiberprotein hozzáadása nem befolyásolta a kötődést.
A fenti eredmények szerint, a kiméra burokproteint (azaz, kiméra fiberproteint) tartalmazó GVIO-UTV-vektor nem a vad-típusú adenovírus-fíberreceptoron keresztül kötődik a sejtekhez, hanem eddig még azonosított fíberreceptoron keresztül. Ezen felül, az eredmények igazolják, hogy kiméra burokprotein, például kiméra fiberprotein adenovírusvektorba történő beépítése az eddigieknél előnyösebb tulajdonságokkal rendelkező adenovírus-vektort eredményez. Nevezetesen, a GV10-UTV-vektorban létrehozott módosítások révén a vektor, a vad-típusú adenovirus említett, viszonylag korlátozott kötődési képességével szemben, képessé válik receptor-mínusz sejtekhez, közelebbről nem-epithel sejtekhez történő kötődésre; ezen felül, a módosított vektor receptor-plussz sejtekhez is hatékonyabban kötődik.
4. példa
Az alábbi kísérletekben azt vizsgáltuk, hogy különböző szolúbilis faktorok és a fenti szolúbilis faktorok gátlószerei (inhibitorai) hogyan befolyásolják kiméra fiberproteint tartalmazó adenovirusok, receptor-mínusz HS68-fibroblaszt-sejtekhez történő kötődését.
A következő kísérletekben GVIO-UTV-vektor kötődésének gátlását vizsgáltuk, különböző negatív töltésű molekulák, például lazacsperma-DNS, mucin, kondroitin-szulfát és
- 70 heparin alkalmazásával. A kondroitin-szulfát és a heparin negatív töltésű molekulák, amelyek töltését szulfátcsoportok jelenléte eredményezi. A mucin negatív töltése sziálsav-csoportok jelenlétének köszönhető, a DNS negatív töltése pedig a molekulába beépült foszfát-csoportoknak köszönhető. Körülbelül 20 000 cpm UTV-t inkubáltunk 250 μΐ kötődés-vizsgálati pufferben [azaz, Dulbecco-féle módosított Eagle tápfolyadékban (D-MEM)], szobahőmérsékleten, körülbelül 30 percig, negatív töltésű molekulák IxlO'3 μg/ml körülbelül lxlO4 μg/ml koncentrációinak jelenlétében. Az inkubálást követően, az elegyeket jégen lehűtöttük, majd 24 rekeszű lemezekre oltott és előzőleg lehűtött HS68sejtekhez adtuk. A sejteket körülbelül 1 órán át inkubáltuk, majd PBS-sel háromszor mostuk. A sejtasszociált cpm-et szcintillációs számlálóban meghatároztuk, az eredményeket duplikátumban végzett mérések átlagaként adtuk meg.
A 7. ábra szerint, míg a kötőhelyekért versengő vadtípusú fiberprotein jelenléte nem befolyásolta a GV10-UTVvektor (azaz, kiméra fibert tartalmazó vektor) HS68sejtekhez történő kötődését, negatív töltésű kompetitormolekulák gátolták a GV10-UTV kötődést. Mind a négy molekula képes volt gátolni a GV10-UTV HS68-sejtekhez történő kötődését, bár ebben a tekintetben a heparin és a DNS bizonyult a leghatékonyabbnak. Ezek a molekulák nem befolyásolják lényeges mértékben a GV10-vektor (azaz, vad-típusú fibert hordozó vektor) kötődését fíberreceptort nagy meny
- 71 nyiségben expresszáló sejtekhez (azaz, A548-sejtekhez; az erre vonatkozó adatokat nem tüntettük fel).
A fenti adatok szerint, negatív töltésű molekulák képesek a GV10-UTV-vektor sejtekhez, kiméra fíberproteinen keresztül létrejövő kötődését gátolni. A gátlás oka feltehetően az, hogy a negatív töltésű molekulák a GV10-UTVfíberen található pozitív töltésű polilizin-aminosav csoporthoz kötődnek. Az említett eredmények arra ösztönöztek bennünket, hogy megvizsgáljuk a fenti negatív töltésű molekulákat hasító enzimek hatását a GV10-UTV-vektor sejtekhez történő kötődésére.
HS68-sejteket 24 rekeszű lemezekre oltottunk, és a sejteket heparináz (Sigma, St. Louis, MO), kondroitináz (Sigma), valamint szialidáz (Boehringer Mannheim, Inc) enzimek körülbelül 1 - 10000-szeres tartományba eső hígításaival, 37 °C-on, 45 percig; majd 4 °C-on, 15 percig előinkubáltuk. A kondroitináz kondroitin-szulfátot, a heparináz heparint és heparin-szulfátot, a szialidáz pedig szialinsavat hasít. A hígítások készítésekor a következő koncentrációjú oldatokból indultunk ki: heparináz: 25 egyég/ml (egység= 0,1 pmól/óra; pH=7,5 mellett; 25 °Con); kondroitináz: 2,5 egyég/ml (egység= 1,0 pmól/perc; pH=8,0 mellett; 37 °C-on); és szialidáz: 0,25 egyég/ml (egység= 1,0 ümól/perc; pH=5,5 mellett; 37 °C-on). Az inkubálást követően, a sejteket hideg PBS-sel háromszor mostuk, és körülbelül 1 órán át, 4 °C-on, 20 000 cpm jelölt GV10-UTV-vektorral inkubáltuk. Ezt követően, a sejteket hideg PBS-sel háromszor mostuk, és a sejt-asszociált cpm-et
- 72 szcintillációs számlálóban meghatároztuk. Az eredményeket duplikátumban végzett mérések átlagaként adtuk meg.
A 8. ábrán látható eredmények szerint, a HS68-sejtek előkezelése, a sejtfelszínről negatív töltésű csoportok eltávolítását eredményező enzimekkel, megerősíti, hogy a kiméra fiberproteint tartalmazó GV1O-UTV-vektor a sejtfelszínen található negatív töltésű kötőhelyekkel lép kölcsönhatásba. Közelebbről, mind a heparináz, mind a szialidáz képes a GV1O-UTV-vektor kötődését csökkenteni, bár a HS68sejtek vonatkozásban, a heparináz sokkal hatékonyabbnak bizonyult, mint a szialidáz.
A fenti eredmények szerint, tehát a kiméra fiberproteint tartalmazó vektorok (például GV10-UTV-vektor) - szemben a vad-típusú adenovírussal -, oly módon képesek sejtekbe jutni, hogy sejtfelszinen található negatív töltésű molekulákkal lépnek kölcsönhatásba, az eddig ismertektől eltérő módon. Az eredmények megerősítik továbbá, hogy pozitív töltésű csoportokat (például lizint) tartalmazó vektorok helyett alkalmazhatunk negatív töltésű csoportokat (például aszparagint vagy glutamint) tartalmazó vektorokat is, hogy a vektorokat sejtfelszinen található pozitív töltésű molekulákhoz történő kötődésen keresztül a sejtekbe juttassuk.
5. példa
Az alábbi példában azt hasonlítottuk össze, hogy kiméra burokproteint, például kiméra fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektor (például GV10-UTV) és vad-tipusú burok
- 73 proteint, például ilyen fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektor (például GV10) milyen hatékonysággal képes géneket különböző sejttípusokba juttatni.
Az alábbi kísérletekben a lacZ-gén sejtekbe történő bejuttatásának hatékonyságát hasonlítottuk össze, vadtípusú fiberproteint tartalmazó vektor (azaz, GVlO-vektor) és kiméra fiberproteint hordozó vektor (azaz, GV10-UTVvektor) esetében, a következő sejtek alkalmazásával: epithelsejtek (azaz, HeLa-, A549-, HepG2- és H700-T- sejtek) ; simaizomsejtek (azaz, HA-SCM- és HI-SCM- sejtek); endothelsejtek (azaz, HUVEC- és CPAE- sejtek); fibroblaszt sejtek (azaz, HS68- és MRC-5- sejtek); glioblasztóma sejtek (azaz, U118-sejtek) és monocita makrofágok (azaz, THP-1sejtek). Az adenovírussal végzett transzdukciót megelőzően egy nappal, körülbelül 2xl05 sejtet oltottunk 24 rekeszű lemezekre. Ezután, az egyes rekeszeket 250 μΐ térfogatban, 1-es MOI-érték mellett, GVlO-vektorral (azaz, vad-típusú adenovirus fiberproteint tartalmazó vektorral) vagy GV10UTV-vektorral (azaz, kiméra adenovírus-fíbert hordozó vektorral) fertőztük, körülbelül 1 órán át. Ezt követően, a sejteket mostuk, két napig inkubáltuk, majd a sejtlizátumok lacZ-aktivitását meghatároztuk. Az eredményeket duplikátumban végzett mérések átlagaként adtuk meg.
A 9. ábrán látható eredmények szerint, a GV10-UTVvektor alkalmazása, riportergén különböző típusú sejtvonalakba történő bejuttatására megerősíti, hogy a kiméra fiberprotein jelenléte (UTV alkalmazása) a vad-típusú (GV10) vektorhoz képest körülbelül 5-300-szor fokozza a • · ···· · ···· ···· «· · · · · lacZ-gén bejutásának hatékonyságát, fíberreceptort kis mennyiségben vagy a kimutathatóság határát el nem érő menynyiségben expresszáló sejtekbe (azaz, receptor-mínusz sejtekbe) . Fíberreceptort nagy mennyiségben expresszáló sejtek esetében (azaz, receptor-plussz sejtek esetében), a kiméra fiberprotein beépülése a GV10-UTV-vektorba körülbelül 3szorosára növeli a gén-bejuttatás hatékonyságát.
A receptor-mínusz nem-epithel sejtek, vad-típusú fiberproteint tartalmazó adenovírussal (azaz, GV10vektorral) történő transzdukciója esetében megfigyelhető, a receptor-plussz epithelsejtekhez képest alacsony szintű génexpresszió, közvetlen összefüggésbe hozható a vektor, fenti sejttípusok esetében, a 3. példában ismertetettek szerint meghatározott viszonylag alacsony kötődési képességével. Eredményeink igazolják azt a feltevést, amely szerint, a vad-típusú adenovírus-fiberprotein számára kötőhelyül szolgáló receptorok alacsony szintű expressziója, a jelenleg alkalmazott adenovírus-vektorok esetében, jelentős mértékben korlátozza a sejtek hatékony transzdukcióját.
Hasonlóképp, vizsgáltuk a kiméra burokprotein (azaz, a kiméra fiberprotein) azon képességét, hogy in vivo mennyiben fokozza a géntranszfert. Három Balb/c-egeret fertőztünk intranazálisan, körülbelül lxlO8 pfu (plakk-képző egység) GVlO-vektorral, 50 μΐ, 10 mmól/1 MgCl2-t és 10 mmól/1 Trist (pH=7,8) tartalmazó fiziológiás sóoldatban. További három egeret GV10-UTV-vektor megfelelő dózisával fertőztünk, két egér pedig csak sóoldatot kapott. Az állatokat a beadást követően két nappal leöltük, és a tüdőket lacZ-aktivitásra
·..· ··:· : ·’.*·
- 75 nézve vizsgáltuk. A tüdőket oly módon készítettük elő az analízisre, hogy azokat folyékony nitrogénben hirtelen lefagyasztottuk, a szöveteket mozsár és mozsártörő alkalmazásával eldörzsöltük, és az eldörzsölt szöveteket 1,0 ml lacZ-riporter-lízispufferben lizáltattuk (Promega Corp., Madison, WI) . A lacZ-aktivitás meghatározására fluorometriás eljárást alkalmaztunk, és a kísérletek eredményeit az egyes állatcsoportok esetében meghatározott aktivitások átlagaként adtuk meg.
A fenti kísérletek eredményeit a 10. ábrán szemléltetjük. Amint az az ábrán látható, a kiméra fiberproteint tartalmazó GV10-UTV-vektor (UTV) által közvetített in vivo géntranszfer egértüdőben, átlagosan 8-szor hatékonyabb volt, mint a vad-típusú fiberproteint tartalmazó vektor (GV10) által közvetített géntranszfer.
Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a kiméra burokprotein (ebben az esetben, kiméra fiberprotein) beépülése adenovírus-vektorba, mind in vitro, mind in vivo, jelentős mértékben növeli a vektorközvetítette géntranszfer hatékonyságát, a vad-típusú fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektorokhoz képest. Ezen felül, a fenti eredmények alátámasztják azt a következtetést, hogy a fiberreceptor alacsony szintű expressziója jelentős mértékben hozzájárul ahhoz, hogy a géntranszfer hatékonysága, tüdőben és más szövetekben, elmarad az optimálistól. Továbbá, eredményeink igazolják, hogy a tüdőbe és más szövetekbe irányuló géntranszfer esetében (például a CFRT-gén bejuttatásának vonatkozásában) a
- 76 GVlO-UTV-vektor és más hasonló UTV-vektorok előnyösebben alkalmazhatók, mint a jelenleg rendelkezésre álló adenovirus-vektorok.
6. példa
Az alábbi példában a találmány szerinti, kiméra burokproteint (például kiméra fiberproteint) tartalmazó vektor azon képességét vizsgáltuk, hogy mennyiben képes protein/DNS-kölcsönhatáson keresztül utas génnek megfelelő DNS-sel („passenger DNA) kölcsönhatásba lépni, ezáltal, a DNS-t a „hátán a sejtbe juttatni.
Ezekben a kísérletekben vad-típusú fibert tartalmazó adenovírus-vektort (azaz, GVlO-vektort) és kiméra fibert tartalmazó adenovírus-vektort (azaz, GV10-UTV-vektort) alkalmaztunk, receptor-plussz epithelsejtekbe (azaz, 293-, A549- és H700-T- sejtekbe) irányuló géntranszfer vizsgálatára. Kontroll kísérletekben, a sejteket a vektorral transzdukáltuk, a fentiekben már ismertetettek szerint. A kísérleti körülmények mellett, a vektorokat a βglukuronidáz riportergént tartalmazó pGUS-plazmiddal inkubáltuk, lehetőséget teremtve arra, hogy a kiméra adenovirus-fiberprotein komplexet képezzen a plazmid-DNSsel. Közelebbről, körülbelül 5xl07 aktív GV10- vagy GV10UTV- részecskét (azaz, fluoreszcens fókusz egységet, „Fluorescence Focus Units, ffu) inkubáltunk 1 órán át, körülbelül 2,5 μρ pGUS-plazmid-DNS-sel. Ezt követően, az elegyet olyan szuszpenzióhoz adtuk, amely, 250 μΐ, 10 % borjúszérumot tartalmazó DMEM-tápfolyadékban 2xl05 sejtet tar- 77 ··· ·····
·..· ··;· : ··;· ·τ talmazott, a felsorolt sejtek valamelyikéből. A transzdukciót követően 10 nappal, fluorometriás eljárással, mind a β-glukuronidáz-, mind a β-galaktozidáz- aktivitást meghatároztuk. A sejtek β-glukuronidáz-expresszióját a lacZ-expresszióra utaló β-galaktozidáz-aktivitás meghatározására alkalmazott eljáráshoz hasonló módon vizsgáltuk, úgy, hogy a β-glukuronidáz által katalizált reakció során, az X-glu-szubsztrátból keletkező kék színreakciót adó terméket kimutattuk.
A fenti kísérlet eredményeit a 11. ábrán szemléltettük. Mind a GVlO-vektor (azaz, vad-típusú fiberproteint tartalmazó vektor), mind a GV10-UTV-vektor (azaz, kiméra fiberproteint tartalmazó vektor) alkalmazásával hasonló szintű lacZ-expressziót értünk el, amikor a riportergént „cisz-módon (a vektor-DNS-be inszertálva) epithelsejtekbe juttattuk. Ezzel szemben, a β-glukuronidáz gén expressziójának meghatározása alapján arra következtettünk, hogy, a vad-típusú vektor valamennyi epithelsejt esetében, viszonylag kis mértékben volt képes a pGUS-plazmidot a sejtekbe juttatni. A géntranszfer általunk tapasztalt alapszintje, a korábbiakban leírtak szerint, valószínűleg „bystander molekulák receptor által közvetített felvételének (receptor-mediated uptake, RME) eredménye volt (lásd, a WO 95/21259 számú PCT közzétételi irat). A kiméra fiberproteint tartalmazó GV10-UTV-vektor alkalmazásával azonban, a pGUS-plazmidot sokkal hatékonyabban tudtuk sejtekbe juttatni. 293-jelzésű sejtekbe irányuló géntranszfer esetében, a pGUS-plazmid által irányított β-glukuronidáz- 78 ·..···;· : ··:· ·τ expresszió meghaladta a GV10-UTV-vektorral cisz-kötésben bejuttatott riportergén által előidézett expressziót.
A fenti eredmények alapján kimondhatjuk, hogy a találmány szerinti kiméra burokproteint, például kiméra fiberproteint tartalmazó vektorok alkalmazásával, a vektorhoz cisz-módon nem-kapcsolódó nukleinsavak hatékonyabban juttathatók sejtekbe. A hatékonyabb géntranszfer magyarázata feltehetően, a kiméra fiberen található negatív töltésű aminosavakon (például polilizin-lánc egyes tagjain) keresztül létrejövő protein/DNS-kölcsönhatásokban rejlik, amely kölcsönhatások által a vektor a nukleinsavakhoz kötődik; bár a hatékonyabb géntranszfer más magyarázata is elképzelhető .
7. példa
A következő példában, olyan további plazmidok előállítását ismertetjük, amelyek a fiberprotein C-terminális végén UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó fiberproteineket kódolnak.
Az említett további, kiméra adenovírus-fiberproteint tartalmazó plazmidokat a 2. példában ismertetett pl93(F5*)~ [12. ábra; más néven pl93NS(F5*) vagy pNS(F5*)] és pAd-NS83-100-UTV- plazmidokból kiindulva állítottuk elő. Amint az a 12. ábrán látható, a pl93(F5*)-plazmid mutációt hordozó fíbergént tartalmaz, amelyben BamHI-hely található az utolsó fiberprotein-kódon és az eredeti olvasási kerethez képest eltolódott fíberprotein-stopkódon között. Az általunk előállított további mutáns transzferplazmid a fiber C
- 79 terminális végén, glicin/szerin ismétlődő egységekből álló linker szekvenciát, célba juttató szekvenciát és stopkódont tartalmaz. Az említett plazmidokat úgy állítottuk elő, hogy a pl93(F5*)-plazmid BamHI-helyére szintetikus oligonukleotidokat klónoztunk, így kaptuk a 13. ábrán látható pl93NS(F5*)pGS(K7)- [más néven, pl93(F5*)pGS(K7) vagy pNS(F5*)pK7-] trans zferplazmidot.
A vad-típusú Ad-fíbergén a következő szekvenciát tartalmaz :
TCA TAC ATT GCC CAA GAA ΤΆΑ AAA AGAA (59.
azonosítószámú szekvencia);
Ser Tyr lie Alá Gin Glu (60. azonosítószámú szekvencia) ;
ahol „TAA terminációs kódon, és a poliadenilezési helyet vastag betűvel jelöltük. A pl93NS(F5*)-plazmidban található, mutációt hordozó fíbergén C-terminális végének szekvenciája a következő:
TCA TAC ATT GCC CAA GAA GGA TCC AATAAA GAA (19. azonosítószámú szekvencia);
Ser Tyr He Ala Gin Glu Gly Ser (20. azonosítószámú szekvencia);
ahol az aláhúzott szekvencia a fíberproteinben mutációval létrehozott BamHI-helyet, a vastag betűvel szedett rész pedig a poliadenilezési helyet jelöli. Ezzel szemben, a pl93NS(F5*)pGS(k7)-plazmidban található fíbergén Cterminális végének szekvenciája a következő:
G S GSGSGSGS KKKKKKK (22. azonosítószámú szekvencia);
·..· ··:· : ·τ ·τ
- 80 ahol az aláhúzott szekvencia a fíberproteinben mutációval létrehozott BamHI-helyet, a vastag betűvel szedett rész pedig a gén C-terminális végéhez hozzáadott polilizinláncot jelöli. Ezt az aminosav-szekvenciát a következő nukleinsav-szekvencia kódolja: GGA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAG AAA AAG AAG AAG TAA (21. azonosítószámú szekvencia), ahol „TAA terminációs kódon.
A pl93NS(F5*)pGS(k7)- transzferplazmid előállításánál a következő szintetikus oligonukleotidokat alkalmaztuk: pKS7s (szensz) : GA TCA GGA TCA GGT TCA GGG AGT GGC TCT AAA AAG AAG ΆΆΆ. AA.G AAG AAA TAA G (61. azonosítószámú szekvencia); pK7a (antiszensz): GA TCC TTA CTT CTT CTT TTT CTT CTT TTT AGA GCC ACT CCC TGA ACC TGA TCC T ( 62. azonosítószámú szekvencia). A szensz és antiszensz oligonukleotidokat egyenlő moláris mennyiségben elegyítettük, és pl93NS(F5*)plazmid BamHI-helyére klónoztuk, így kaptuk a p!93NS(F5*)pGS(k7)-transzferplazmidot. Azt, hogy a pl93NS(F5*)pGS(k7)-plazmidban az inszert helyes orientációban van, PCR-eljárással igazoltuk, a pK7s-jelzésű szensz láncindító oligonukleotid és az A5a32938-jelzésű, CAGGTTGAATACTAGGGTTCT szekvenciájú, 3'-irányú antiszensz láncindító oligonukleotid alkalmazásával (63. azonosítószámú szekvencia). Ezen felül, az inszertnek megfelelő DNSszekvencia meghatározásával is igazoltuk, hogy a plazmid helyes orientációban, tartalmazza az inszertet; a szekvenálásnál az A5a32938-jelzésű láncindító oligo nukleotidot alkalmaztuk.
A pl93NS(F5*)-transzferplazmidból kiindulva, további mutáns transzferplazmidokat állítottunk elő, amelyek a fentieken felül, a fiberprotein C-terminális végén, a vektor célba juttatását elősegítő („targeting) UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmaztak. Közelebbről a következő plazmidokat állítottuk elő: pl93NS(F5*)pGS(null) [más néven, pl93(F5*)pGS(null) vagy pl93(F5*)pGS], pBSS-75100-pGS(null), pBSS-75-100-pGS(RK32), pBSS-75-100-pGS(RK33) és pBSS-75-100-pGS(tat).
A p!93NS(F5*)pGS(null)-plazmidot úgy előállítottuk elő, hogy az alábbi, egymást átfedő komplementer oligonukleotidokat szintetizáltuk, és közvetlenül, BamHIenzimmel emésztett p!93NS(F5*)-plazmidba ligáltuk: pGSs: GATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAAA (64. azonos!tószámú szekvencia); és GATCTTTAACTAGTCGAGCCACTGCCAGATCCTGAACCG (65. azonosítószámú szekvencia) A helyes orientációjú inszertet tartalmazó kiónt PCR-eljárással ellenőriztük, a pGSs- jelzésű láncindító oligonukleotid és az A5a32938jelzésű, CAGGTTGAATACTAGGGTTCT szekvenciájú, 3'-irányú antiszensz láncindító oligonukleotid alkalmazásával. Ezen felül, az inszertnek megfelelő DNS-szekvencia meghatározásával is igazoltuk, hogy a plazmid helyes orientációban, tartalmazza az inszertet; a szekvenálásnál az A5a32938jelzésű láncinditó oligonukleotidot alkalmaztuk.
A 14. ábrán látható pBSS-75-100-pGS(null)-vektort [más néven, pBSS-75-100-AE3-pG(null)-vektort] úgy állítottuk elő, hogy a pBSS-75-100-vektorban található Nhel-Sallfragmenst a p!93NS(F5*)pGS(null)-vektor megfelelő
- 82 •v ··»· fragmensével helyettesítettük. Ezután, az eredeti génben, a fiber kiméragénből már hiányzó Spel-helyet megszüntettük, oly módon, hogy a plazmidot Spel-enzimmel részlegesen emésztettük, a végeket Klenow-fragmenssel feltöltöttük, és a vektort újból ligáltuk. Az így kapott vektor tartalmazza az alábbi nukleinsav-szekvenciát: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGTTAA (23. azonosítószámú szekvencia) (ahol „TAA terminációs kódon), amely nukleinsav-szekvencia a következő aminosav-szekvenciát kódol: Alá Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ser (24. azonosítószámú szekvencia) .
A pBSS-75-100-pGS(RK32)- [más néven, pBSS-75-100-AE3pGS(RKKK) 2- vagy pBSS-75-100-ÁE3-pGS(RKKK2)-], pBSS-75-100pGS(RK33)- [más néven, pBSS-75-100-ÁE3-pGS(RKKK) 3- vagy pBSS-75-100-ÁE3-pGS(RKKK3)-] és pBSS-75-100-pGS (tat)plazmidokban található inszerteket úgy állítottuk elő, hogy azok Spel-enzimmel emésztett pBSS-75-100-pGS(null)plazmidba közvetlenül ligálhatók legyenek. A 15. ábrán látható pBSS-75-100-pGS(RK32)-plazmidot a két alábbi, átfedő, komplementer oligonukleotid alkalmazásával állítottuk elő: RK32s: CTAGAAAGAAGAAACGCAAAAAGAAGA (66. azonosítószámú szekvencia); és RK32a: CTAGTCTTCTTTTTGCGTTTCTTCTTT (67. azonosítószámú szekvencia). Az így kapott vektor tartalmazza az alábbi nukleinsav-szekvenciát: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAGAAACGCAAAAAGAAGACTAGTTAA (25. azonosítószámú szekvencia) (ahol „TAA terminációs kódon) , amely nukleinsav-szekvencia a következő aminosavszekvenciát kódol: Alá Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly
- 83 .... ..t.
Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (26. azonosítószámú szekvencia).
A 16. ábrán látható pBSS-75-100-pGS(RK33)-vektort a két alábbi, átfedő, komplementer oligonukleotid alkalmazásával állítottuk elő: RK33s: CTAGAAAGAAGAAGCGCAAAAAAAAAAGAAAGAAGAAGA (68. azonosítószámú szekvencia); és RK33a: CTAGTCTTCTTCTTTCTTTTTTTTTTGCGCTTCTTCTTCTTT (69. azonosítószámú szekvencia). Az így kapott vektor tartalmazza az alábbi nukleinsav-szekvenciát: GCCCAAGAAGGATCCGGTTCAGGATCTGGCAGTGGCTCGACTAGAAAGAAGAAGCGCAAAAAAAAAGAAAGAAGAAGACTAGTTAA (27. azonosítószámú szekvencia) (ahol „TAA terminációs kódon), amely nukleinsav-szekvencia a következő aminosav-szekvenciát kódol: Alá Gin Glu Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Thr Ser (28. azonosítószámú szekvencia).
A pBSS-75-100-pGS(tat)-plazmidot a két alábbi, átfedő, komplementer oligonukleotid alkalmazásával állítottuk elő: TATs: CT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA T (70. azonosítószámú szekvencia) és TATa: CT AGA TGC CCG TCT TCG TTG CCT GCG CTT TTT TCT CCC ATA A (71. azonosítószámú szekvencia). Az így kapott vektor tartalmazza az alábbi nukleinsav-szekvenciát: ACT AGT TAT GGG AGA AAA AAG CGC AGG CAA CGA AGA CGG GCA TCT AGT (72. azonosítószámú szekvencia) (ahol „TAA terminációs kódon), amely nukleinsav-szekvencia a következő aminosav-szekvenciát kódol: Thr Ser Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Alá Ser Ser (73. azonosítószámú szekvencia).
- 84 ··;· ··,·
A helyes orientációjú inszertet tartalmazó kiónt mindhárom plazmid esetében PCR-eljárással ellenőriztük, a megfelelő szensz láncindító oligonukleotid (RK32s, RK33s vagy TATs) és az A5a32938-jelzésű, 3'-irányú antiszensz láncindító oligonukleotid alkalmazásával. Ezen felül, mindhárom plazmid esetében, az insze'rtnek megfelelő DNS-szekvencia meghatározásával.is igazoltuk, hogy azok helyes orientációban, tartalmazzák az inszertet; a szekvenálást az A5a32938jelzésű láncindító oligonukleotid alkalmazásával végeztük.
8. példa
A következő példában olyan plazmidok előállítását ismertetjük, amelyek a fíber-hurokban UTV-doménokat tartalmazó proteineket kódolnak.
A fiberprotein felszínen megjelenő hurokrégiójában UTV-szekvenciát (és/vagy távtartó szekvenciát) tartalmazó proteineket kódoló plazmidokat úgy állítottunk elő. hogy a fent ismertetett szekvenciák egyikét a fíberproteinbe építettük (vagy abba további UTV-szerű szekvenciákat építettünk) . A p!93NS(F5*)-plazmid-transzfervektorból kiindulva állítottuk elő a 17. ábrán látható pl93NS-F5F2K- (más néven, pl93-F5F2K~) jelzésű további transzfervektort. A p!93NS-F5F2K-plazmid egyedi Spel restrikciós helyet tartalmaz az Ad-fíbergén, a protein felszínen megjelenő hurokrégióját kódoló részében. Nevezetesen, a pl93NS-F5F2Kplazmidban található fíbergén a következő fíberszekvenciát tartalmaz:
- 85 ATT ACA CTT AAT GGC ACT AGT GAA TCC ACA lie Thr Leu Asn Gly Thr Ser Glu Ser Thr GAA ACT (29. azonosítószámú szekvencia);
Glu Thr (30. azonosítószámú szekvencia);
ahol az aláhúzott szekvencia fíbergénben létrehozott új Spel-helyet jelöli.
Ezt követően, a fenti vektor Spel-helyére klónoztuk a vektort célba juttató („targeting) szekvenciákat. Közelebbről, egymást átfedő szensz és antiszensz oligonukleotidok alkalmazásával, heparinkötő domént tartalmazó, 8 bázikus aminosavból álló RKKKRKKK-láncot [Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys; 74. azonosítószámú szekvencia) klónoztunk a pl93-F5FK-vektor Spel-helyére.
| (RKKK) 2-szekvenciaként | alkalmazhatjuk például | az aláb- | |
| bi | szekvenciát: | ||
| TCT | AGA AAA AAA AAA | CGC AAG AAG AAG | ACT |
| Thr | Arg Lys Lys Lys | Arg Lys Lys Lys | Thr |
AGT (75. azonosítószámú szekvencia);
Ser (76. azonosítószámú szekvencia).
A 7. példában ismertetett, 27 nukleotidból álló, RK32s-jelzésű szensz oligonukleotidot és a 27 nukleotidból álló, RK32a-jelzésű antiszensz oligonukleotidot alkalmaztuk az RKKKRKKK-peptidszekvenciát (74. azonosítószámú szekvenciát) tartalmazó poliGS (RKKK) 2-szekvencia klónozására. A pl93NS-F5F2K (RKKK) 2-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a kötődomént kódoló DNS-szekvenciát a pl93NS-F5FK2-plazmid Spel-helyére klónoztuk. A kötődomént kódoló átfedő szensz és antiszensz oligonukleotidokat először hibridizáltattuk • · · ····*
·..· ··:· : i’ -r
- 86 egymással, majd közvetlenül a Spel restrikciós helyre ligáitűk, így kaptuk a 18. ábrán látható pl93NSF5F2K (RKKK) 2-plazmidot. Ez a plazmid más néven pl93NSF5F2K(RKKK2)-, pl93NS-F5F2K(RK32)- vagy pl93-F5F2K(RKKK2)plazmidnak nevezzük. A pl93NS-F5F2K (RKKK) 2-plazmid módosított fíbergomb-hurokrégiójának érintett része a következő szekvenciát tartalmazta:
| ATT | ACA | CTT | AAT | GGC | ACT | AGA | AAG | AAG | AAA |
| lie | Thr | Leu | Asn | Gly | Thr | Arg | Lys | Lys | Lys |
| CGC | AAA | AAG | AAG | ACT | AGT | GAA | TCC | ACA | |
| Arg | Lys | Lys | Lys | Thr | Ser | Glu | Ser | Thr | |
| GAA | ACT | (31. | azonosítószámú szekvencia); | ||||||
| Glu | Thr | (32 . | azonosítószámú szekvencia). |
Továbbá, az (RKKK) 3-szekvenciát vagy annak más változatát is inszertálhatjuk a p!93NS-F5F2K-plazmidba. Ilyen szekvenciaként alkalmazhatjuk például a következő szekven-
| ciát : |
| TCC AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA |
| Thr Arg Lys Lys Lys Arg Lys Lys Lys Arg |
| AAG AAG AAG ACT AGT (77. azonosítószámú szekven- |
| cia) ; |
| Lys Lys Lys Thr Ser (78. azonosítószámú szekven- |
| cia) . |
A fenti szekvencia inszertálását a 39 nukleotidból álló, (RKKK) 3(s)-jelzésű szensz oligonukleotid [azaz, a „CT AGA AAG AAG AAG CGC AAA AAA AAA AGA AAG AAG AAG A szekvenciájú oligonukleotid (79. azonosítószámú szekvencia)] és a 39 nukleotidból álló, (RKKK)3(a)-jelzésű antiszensz oligo
- 87 nukleotid [azaz, a „CT AGT CTT CTT CTT TCT TTT TTT TTT GCG CTT CTT CTT T szekvenciája oligonukleotid (80. azonosítószámú szekvencia)] alkalmazásával végezhetjük. Az így kapott plazmidot pl93-NS (RKKK) 3-plazmidnak neveztük, és a 19. ábrán szemléltetjük. A fenti plazmid más néven, pl93NSF5F2K(RKKK3)-, p!93-F5F2K(RKKK3)- vagy pl93-F5F2K(RK33)-] plazmádként is ismert. A pl93NS-F5F2K (RKKK) 3-plazmidban a módosított fibergomb-hurokrégió érintett része a következő szekvenciát tartalmazta:
| CTT | AAT | GGC | ACT | AGA | AAG | AAG | AAG | CGC | AAA |
| Leu | Asn | Gly | Thr | Arg | Lys | Lys | Lys | Arg | Lys |
| AAA | AAA | AGA | AAG | AAG | ACT | AGT | GAA | TCC | |
| Lys | Lys | Arg | Lys | Lys | Thr | Ser | Glu | Ser |
ACA (33. azonosítószámú szekvencia);
Thr (34. azonosítószámú szekvencia).
9. példa
A következő példában, UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó kiméra pentonbázis-proteint kódoló plazmidok előállítását ismertetjük.
A pACT (ÁRGD)-transzferplazmidot [az 5 559 099. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban pATplazmidként említett plazmidot] az Ad5-genom egyedi BamHI/Pmel-fragmensét (13 259-21 561. nukleotidoknak megfelelő fragmenst) tartalmazó plazmid módosításával kaptuk, és az - többek között- olyan pentonbázis-proteint kódol, amely az av-integrin-kötődomént képező, 8 aminosavból álló régiónak megfelelő deléciót hordoz, és amelyben a deletált régi- • * · · · • · · · · · η ·
- 8 8 - ·..···:· : ·τ·τ ót egyedi Spel-helyet tartalmazó szekvenciával helyettesítettük, exogén szekvenciák inszertálásának megkönnyítése célj ából.
A 20. ábrán látható pACT (RKKK) 3-plazmidot [más néven, pACT(RKKK3)- vagy pACT(RK33)- plazmidot] úgy állítottuk elő, hogy a RK33s- és RK33a- jelzésű komplementer átfedő oligonukleotidokat közvetlenül, Spel-enzimmel emésztett pACT(ÁRGD)-piazmidba ligáltuk. Azt, hogy a klón valóban helyes orientációban tartalmazza az inszertet, PCR-eljárással ellenőriztük, a plazmád esetében az RK33a-jelzésű szensz láncindító oligonukleotid, valamint az A5sl5002-jelzésű, 5'-irányú szensz láncindító oligonukleotid alkalmazásával. Ezen felül, az inszertnek megfelelő DNS-szekvencia meghatározásával is megerősítettük, hogy a plazmid helyes orientációban tartalmazza az inszertet; a szekvenálást az A5sl5002-jelzésű láncindító oligonukleotid alkalmazásával végeztük.
A pACT-(RKKK) 3-plazmidban, a kiméra pentonbázisprotein keletkezését eredményező UTV-doménnak megfelelő régió a következő szekvenciát tartalmaz:
| AAC | GAT | ACT | AGA | AAG | AAG | AAG | CGC | AAA | AAA |
| Asn | Asp | Thr | Arg | Lys | Lys | Lys | Arg | Lys | Lys |
| AAA | AGA | AAG | AAG | AAG | ACT | AGT | GCC | ||
| Lys | Arg | Lys | Lys | Lys | Thr | Ser | Alá |
| ACA | (35. | azonosítószámú | szekvencia); |
| Thr | (36. | azonosítószámú | szekvencia). |
| A 21. | ábrán látható | pACT(RK32)-plazmidot [ más néven, |
pACT(RKKK2)- vagy pACT(RKKK) 2- plazmidot] hasonló módon ál- 89 -
líthatjuk elő, az RK32S- és RK32a- jelzésű, átfedő láncinditó oligonukleotidok alkalmazásával. A pACT-(RKKK) 2plazmidban, a kiméra pentonbázis-protein keletkezését eredményező UTV-doménnak megfelelő régió a következő szekvenciát tartalmaz: 3
| AAC | GAT | ACT | AGA | AAG | AAG | AAG | AGA | AAG | AAG |
| Asn | Asp | Thr | Arg | Lys | Lys | Lys | Arg | Lys | Lys |
| AAG | ACT | AGT | GCC | ACA | (37. | azonosítószámú | szekven |
cia) ;
Lys Thr Ser Alá Thr (38. azonosítószámú szekvencia) .
10. példa
A következő példában, UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó adenovirus-hexonproteint kódoló plazmidok előállítását ismertetjük, közelebbről, az adenovirus-hexonprotein felszínen megjelenő hurokrégiójában ilyen szekvenciákat tartalmazó proteineket kódoló plazmidok előállítását ismertetjük.
Ilyen plazmidokat egy másik transzferplazmid, nevezetesen, a 22. ábrán látható, pACT-Hll-jelzésű plazmid alkalmazásával állíthatunk elő. A pACT-Hll-plazmidot a pACTplazmidból (az Ad5-genom 13 259-21 561. nukleotidjait tartalmazó plazmidból) kiindulva nyertük, amely plazmid tartalmazza a hexonprotein kódoló szekvenciájának nagy részét (azaz, körülbelül a 18 842-21 561. nukleotidoknak megfelelő régiót). Közelebbről, a pACT-Hll-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy Xbal-helyet iktattunk be az Ad5-hexonprotein 1.
hurokrégiójának megfelelő szekvenciába. Hasonló technikák alkalmazásával Xbal-helyet vagy más alkalmas restrikciós helyet hozhatunk létre az 1. vagy a 2. hurokrégiónak megfelelő szekvenciában, vagy a hexonprotein más, felszínen megjelenő hurokrégióját kódoló szekvenciában. Az Ad5-DNS 1. hurokrégiójának megfelelő szekvenciát PCR-eljárással, szensz és antiszensz láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk, egyúttal, az 1. hurokrégióban egyedi Xbal-hely létrejöttét eredményező mutációt hoztunk létre. A következő láncindító oligonukleotidokat alkalmaztuk: a pACT-plazmidban eredetileg is előforduló Apai restrikciós helyet tartalmazó szensz láncindító oligonukleotidot: GGACAGGGGCCCTACTTTTAAGCCCTACTCTGGCA (81. azonosítószámú szekvencia); és az egyedi BsrGI restrikciós helyet tartalmazó antiszensz láncindító oligonukleotidot: ATCTTCACTGTACAATACCACTTTAGGAGTCAAGTTATCACCTCTAGATGCGGTCGCCT (82 . azonosítószámú szekvencia). Ezt követően, az Xbal-helyet tartalmazó PCR-terméket BsrGI- és Apai- enzimekkel hasítottuk, és a pACT-plazmidba klónoztuk, az Apal-BsrGI-fragmens helyére. Az így kapott, pACT-Hll-jelzésű plazmid egyedi Xbal-helyet tartalmaz, amely felhasználható UTVszekvenciáknak a hexon 1. hurokrégiójába történő inszertáiására. Azt, hogy a pACT-Hll-klón valóban tartalmazza az Xbal-helyet, Xbal-enzimmel végzett restrikciós emésztéssel igazoltuk, amely emésztésnek a plazmid linearizálódását kell eredményeznie.
A mutációt nem-hordozó 1. hexonhurok aminosav szekvenciája - többek között - TEATGNGDNL szekvenciát (83.
- 91 ··/· ·τ azonosítószámú szekvencia) tartalmaz. Ezzel szemben, mutációt hordozó 1. hexonhurok aminosav-szekvenciája, a pACTHll-plazmidnak megfelelő vad-típusú szekvenciában előforduló TEA-szekvenciát követően, TASRGDNL szekvenciát tartalmaz (40. azonosítószámú szekvencia) (azaz, az ACCGCATCTAGAGGTGATAACTTG nukleinsav-szekvencia által kódolt aminosavszekvenciát; 39. azonosítószámú szekvencia). Ezután, a pACT-Hll-plazmidban található egyedi Xbal-helyre a vektor, különböző típusú sejtek által történő felvételét elősegítő szekvenciák (universal targeting sequences, univerzális célba juttató szekvenciák) klónozhatok, abba például az RK32s- és RK32a-jelzésű átfedő oligonukleotidok alkalmazásával, RKKKRKKK szekvencia klónozható (74. azonosítószámú szekvencia). Ily módon kaptuk például a 23. ábrán látható pACT-Hll (RKKK) 2-plazmidot [más néven, pACT-Hll (RK32) - vagy pACT-Hll(RKKK2)-] plazmidot. Ez a plazmid az alábbi szekvenciát tartalmaz:
| ACC | GCA | TCT | AGA | AAG | AAG | AAA | CGC | AAA |
| Thr | Alá | Ser | Arg | Lys | Lys | Lys | Arg | Lys |
| AAG | AAG | ACT | AGA | GGT | GAT | AAC | ||
| Lys | Lys | Thr | Arg | Gly | Asp | Asn |
TTG (41. azonosítószámú szekvencia);
Leu (42. azonosítószámú szekvencia).
A hexonprotein 1. hurokrégiójába és/vagy 2. hurokrégiójába más UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat is klónozhatunk. Például, hasonló megközelítési módot alkalmazhatunk a 2. hexonhurkot kódoló szekvencia mutációjára, így kaphatjuk az egyedi restrikciós helyet (például
- 92 ··· « · b · « ·..· ··:· : ·ν* ··*·
Xbal-helyet) tartalmazó pACT-H12-plazmidot (az erre vonatkozó adatokat nem tüntettük fel), amelybe további UTVszekvenciák klónozhatok.
A pACT-Hll (RKKK) 3-plazmidot [más néven, pACTH11(RKKK3)- vagy pACT-Hll(RK33)- plazmidot] a RK33s- és RK33a- jelzésű, komplementer átfedő oligonukleotidok alkalmazásával állíthatjuk elő, úgy, hogy a PCR-terméket közvetlenül, Xbal-enzimmel emésztett pACT-Hll-plazmidba ligáijuk. Azt, hogy a klón helyes orientációban tartalmazza az inszertet, PCR-eljárással igazolhatjuk, a plazmáddal hibridizálódó, RK32-jelzésű szensz láncindító oligonukleotid, valamint egy megfelelő, 3'-irányú antiszensz láncindító oligonukleotid alkalmazásával. Ezen felül, az inszertnek megfelelő DNS-szekvencia meghatározásával is ellenőrizhetjük, hogy a plazmid tartalmazza-e az inszertet, a helyes orientációban; a szekvenálást a 3'-irányú antiszensz láncindító oligonukleotid alkalmazásával végezzük. Hasonló módon eljárva állíthatunk elő a fentiekhez hasonló transzfervektorokat, például a pACT-H12(RKKK)2 vagy pACT-H12(RKKK)3 transzfervektorokat.
11. példa
A következő példában, megrövidített nyelű fiberproteint kódoló plazmidok előállítását ismertetjük. Közelebbről, az alábbi példában a pl93-F5F9sK-plazmid előállításának menetét ismertetjük.
A pl93-F5F9sK- [más néven, pl93-F5F9K-Short-J plazmidot a 24. ábrán ábrázoltuk. Ez a vektor olyan kiméra
- 93 fiberproteint kódol, amelyben az Ad5-vektor fíbernyélszekvencia körülbelül két harmadát deletáltuk, és az Ad5fibergombnak megfelelő szekvenciát az Ad9-fibergomb szekvenciájával helyettesítettük.
A pl93-F5F9K-Short-plazmidot a pl93NS(F5*)plazmidból kiindulva állítottuk elő. A GGACTAGTAGCATTTAATAA AAAAGAAGAT AAGCGC (84. azonosítószámú szekvencia) és CCGGATCCTC ATTCTTGGGC GATATAGG (85. azonosítószámú szekvencia) láncindító oligonukleotidok alkalmazásával amplifikáltuk a fíbergén fíbernyél-régiójának utolsó ismétlődő egységét és a fíbergombot kódoló Ad9-szekvenciákat. Ezt követően, a PCR-terméket ismert technikákkal tisztítottuk, majd Nhel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztettük, amely kezelés lehetővé tette azt, hogy a PCR-terméket P193NS(F5*)-transzferplazmid Nhel/BamHI-régiójának helyére klónozzuk. Az így kapott, megrövidített nyelű fiberproteint, az alábbiakban ismertetettek szerint, adenovírusvektorok előállítására alkalmazhatjuk. Ezen felül, a megrövidített nyelű fíberproteinbe inszertálhatjuk a fenti UTVszekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat, és az így nyert fiber alkalmazható vektorok, sejtekhez történő eljuttatására .
12. példa
A következő példában olyan plazmidok előállítását ismertetjük, amelyek valamely meghosszabbított struktúrában, közelebbről, hexon- és/vagy pentonbázis- proteinben UTVszekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó pro
- 94 teineket kódolnak, és amelyek olyan, az eredetinél hosszabb hexon- és/vagy pentonbázis- proteinek keletkezését eredményezik, amelyek könnyebben képesek sejtekkel érintkezésbe lépni, és vektorok, különböző sejtekhez történő célba juttatásában részt venni. A keletkező kiméra proteinek tüskések (spiked) abban az értelemben, hogy a vírus felszínéről kiemelkedő, inszertált nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaznak.
A penton gén, RGD-szekvenciát követő, 32 aminosavból álló α-helikális doménját kódoló régiójának amplifikálására a következő láncindító oligonukleotidokat alkalmazhatjuk: l-alpha(s) : GGGCTGCAGGCGGCCGCAGAAGCTGAAGAGGCAGCCACACGGGCTGAGGAGAA (86. azonosítószámú szekvencia); valamint 1alpha(a): GGGGTGCACACAGCTTCGGCCTTAGCGTTAGCCTGTTTCTTCTGAGGCTTCTCGACCT (87. azonosítószámú szekvencia). Az amplifikált szekvencia az alábbi, 32. aminosavból álló szekvenciát kódol: ATRAEEDRAEAEAAAEAAAPAAQPEVEKPQKK (88. azonosítószámú szekvencia). Alkalmazhatunk továbbá olyan láncindító oligonukleotidokat is, amelyek a végeken további a-helikális szekvenciát kódolnak, úgy, hogy például a következő szekvenciát kódoló amplifikált DNS-szekvenciát kapjuk:
CTG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA GCC ACA CGG GCT GAG
Lau Gin Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Ala Ala Thr Arg Alá Glu
GAG AAG CGC GCT GAG GCC GAA GCA GCG GCC GAA GCT GCC GCC CCC
Glu Lys Arg Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Alá Pro
GCT GCG CAA CCC GAC GTC GAG AAG CCT CAG AAG AAA CAG GCT AAC
Ala Ala Gin Pro Glu Val Glu Lys Pro Gin Lys Lys Gin Alá Asn
GCT AAG GCC GAA GCT GTG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA
Ala Lys Ala Glu Ala Val Gin Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Alá
- 95 • · ···· · ···· ···· • · · · · ·
GCC ACA CGG GCT GAG GAG AAG CGC Ala Thr Arg Ala Glu Glu Lys Arg
GAA GCT GCC GCC CCC GCT GCG CAA Glu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gin
AAG AAA CAG GCT AAC GCT AAG GCC
Lys. Lys Gin Ala Aan Ala Lys Ala
GCT GAG GCC GAA GCA GCG GCC Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala
CCC GAG GTC GAG AAG CCT CAG Pro Glu Val Glu Lys Pro Gin
GAA GCT GTG CAC
Giu Ala yai-HlA (90. azonosítószámú szekvencia); ahol a vastag betűvel szedett szekvencia a láncindító oligonukleotidok által kódolt nem-penton szekvenciának felel meg, az aláhúzott szekvencia pedig a két kompatibilis restrikciós hely - Sfcl és ApaLI által kódolt aminosav-szekvenciát képvisel. Ezek az aminosavak, az α-hélix struktúra meghatározására tervezett számítógépes programok szerint, egyúttal biztosítják az alfahélix struktúra épségét.
A fenti aminosavakat kódoló PCR-termék Sfcl- és ApaLIenzimekkel hasítható, újból ligálható, és a fenti két enzimmel ismételten hasítható. Amennyiben hasonló helyeket hasonló helyekkel ligálunk, azok a fenti enzimekkel ismételten hasíthatok lesznek; ha azonban, azokat a kompatibilis, de eltérő helyekkel ligáljuk, az a restrikciós hely megszűnését eredményezi. Az ismételten ligáit termék hasításával tehát több fragmens keletkezik, amelyek mérete a PCR-termék eredeti méretének különböző számú többszöröse. Ezek között lesznek teljes mértékben hasított fragmensek (körülbelül 150 bázispár méretű fragmensek); körülbelül 300 bázispár méretű fragmensek (egy megszüntetett restrikciós helyet tartalmazó fragmensek); körülbelül 450 bázispár
- 96 • · ···· · ···· ···· • · * · * * méretű fragmensek (két megszüntetett restrikciós helyet tartalmazó fragmensek); stb. A fenti eljárással az eredeti, 50 aminosavból álló szekvenciát (lalpha) megduplázhatjuk (2alpha), megtriplázhatjuk (3alpha), stb.,lehetővé téve azt, hogy valamely proteinbe nagy méretű, megszakítást nemtartalmazó a-helikális régiókat klónozzunk, miáltal nagyobb tüskéket vagy protein-nyúlványokat kapunk.
Például, a 2alpha megduplázott termék (azaz, 2alpha2) a pSPdelta-plazmid (lásd 25. ábra) első PpulOI-helyére klónozható, így kapjuk a pSP2alpha-plazmidot (lásd 26. ábra) . A pSPdelta-plazmidot a pUC19-plazmidból kiindulva állítottuk elő; vagy azt előállíthatjuk valamely más alkalmas klónozó plazmádból is. A pSPdelta-tarnszferplazmid alkalmazásával további módosításokat is létrehozhatunk a penton- vagy hexon- proteinben, amely módosítások lehetővé teszik, hogy az UTV-szekvencia (vagy valamely más célba juttató szekvencia) kiemelkedjék a virion felszínéről. A célba juttató szekvenciának ez, a tüske-szerű struktúrában történő kiemelkedése (azaz, torony-szerű kiemelkedése) minimalizálja a fiberproteinek, penton- és hexon- proteinek, valamint a sejtfelszín közti kölcsönhatást akadályozó szférikus gátlását, és nagyobb lehetőséget teremt arra, hogy a kiméra penton- és hexon- proteinek kölcsönhatásba lépjenek a sejtfelszínnel.
A pSPdelta-plazmid UTV-szekvenciák beépítésére alkalmas egyedi Spel-helyet tartalmaz. A Spel hasítási helyet mindkét oldalról PpulOI klónozó helyek határolják, amelyek lehetővé teszik az UTV-szekvenciának a virion felszínéről
- 97 ·..· ··:· : ··.·· ··:· történő kiemelkedését eredményező aminosavakat kódoló DNSszekvenciák inszertálását. A pSPdelta-plazmidot úgy állítottuk elő, hogy a pUC19-plazmid egyedi Xbal-helyére átfedő oligonukleotidokat klónoztunk, amelyeket úgy terveztünk, hogy azok közvetlenül inszertálhatók legyenek az Xbalhelyre. Közelebbről, szensz oligonukleotidként a következő oligonukleotidot alkalmaztuk: CTAGAGCAGCTATGCATGAAGGGACTAGTGGAGAGATGCATGCAGCCT (91. azonosítószámú szekvencia). Antiszensz komplementer oligonukleotidként a következő szekvenciájú oligonukleotidot alkalmaztuk: CTAGAGGCTGCATGCATCTCTCCACTAGTCCCTTCATGCATAGCTGCT (92. azonosítószámú szekvencia). Az oligonukleotidokat egyenlő moláris arányban elegyítettük, és pUCl9-plazmid Xbal-helyére klónoztuk. A megfelelő inszert jelenlétét az inszertnek megfelelő régió szekvenálásával, és a plazmid Ppul01-enzimmel történő hasításával igazoltuk. Az inszert két végén található Xbalhelyek, további kiónok előállítása során megkönnyítik az inszert eltávolítását.
Mivel a pSP-delta-plazmidban két PpulOI-hely található, a plazmid PpulOI-enzimmel részlegesen emészthető, úgy, hogy az enzim csak az egyik helyen hasítson. Az ApaLI- és Sfcl- helyeket tartalmazó PCR-termék ligálása a kompatibilis PpulOI-helyre, megszünteti a plazmidban az első PpulOIhelyet, és egyúttal, az ApaLI- és Sfcl- helyek megszűnését eredményezi. A fenti megszüntetett restrikciós helyeket a 26. ábrán (a pSP2alpha-plazmidot bemutató ábrán)j-betűvel jelöltük. A pSP2alpha2-plazmid fennmaradó PpulOI-helyére további duplikátum termék klónozható, így kaptuk 27. ábrán
- 98 •··· ··£· látható pSP2alpha2-plazmidot, amely UTV-szekvenciák vagy más hasonló, célba juttató szekvencia klónozására alkalmas Spel-helyet tartalmaz. A következtetett 2alpha2-protein másodlagos struktúrájának számítógépes analízise szerint, az a Spel klónozó helynek megfelelő régiótól eltekintve, teljes egészében alfa-hélix struktúrát vesz fel.
Tehát, míg a pSPdelta-plazmid a következő szekvenciát tartalmaz:
| TCT | AGA | GCA | GCT | ATG | CAT | GAA | GGG | ACT | AGT |
| Ser | Arg | Alá | Alá | Met | His | Glu | Gly | Thr | Ser |
| GGA | GAC | ATG | CAT | GCA | GCC | TCT | |||
| Gly | Glu | Met | His | Alá | Alá | Ser |
AGA (43. azonosítószámú szekvencia);
Arg (44. azonosítószámú szekvencia);
a pSP2alpha-plazmid az alábbi szekvenciát tartalmaz:
TCT AGA GCA GCT ATG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA
Ser Arg Ala Ala Met Gin Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Alá
GCC ACA CGG GCT GAG GAG AAG CGC GCT GAG GCC GAA GCA GCG
Ala Thr Arg Ala Glu Glu Lys Arg Ala Glu Ala Glu Ala Alá
GCC GAA GCT GCC GCC CCC GCT GCG CAA CCC GAG GTC GAG AAG
Ala Glu Ala Ala Ala Pro Ala Alá Gin Pro Glu Val Glu Lys
CCT CAG AAG AAA CAG GCT AAC GCT AAG GCC GAA GCT GTG CAG
Pro Gin Lys Lys Gin Ala Asn Ala Lys Ala Glu Alá Val Gin
GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA GCC ACA CGG CCT GAG GAG
Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Ala Ala Thr Arg Alá Glu Glu
AAG CGC GCT GAG GCC GAA GCA GCG GCC GAA GCT GCC GCC CCC
Lys Arg Ala Glu Ala Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Alá Pro
GCT GCG CAA CCC GAG GTC GAG AAG CCT GAG AAG AAA CAG GCT
Ala Ala Gin Pro Glu Val Glu Lys Pro Gin Lys Lys Gin Alá
AAC GCT AAG GCC GAA GCT GTG CAT GAA GGG ACT AGT GGA GAG
Asn Alá Lys Ala Glu Alá Vál His Glu Gly Thr Ser Gly Glu <
ATG CAT GCA GCC TCT AGA Met His Ala Alá Ser Arg
- 99 (45. azonosítószámú szekvencia);
(46. azonosítószámú szekvencia);
a pSP2alpha2-plazmid pedig a következő szekvenciát tartalmaz:
TCT AGA GCA GCT ATG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA GCC Ser Arg Ala Ala Met Gin Ala Ala Ala Glu Ala Glu Glu Ala Alá
ACA CGG GCT GAG GAG AAG CGC GCT GAG GCC GAA GCA GCG GCC GAA
Thr Arg Alá Glu Glu Lys Arg
GCT GCC GCC CCC GCT GCC CAA Ala Ala Ala Pro Ala Alá Gin
AAA CAG GCT AAC GCT AAG GCC
Lys Gin Ala Asn Ala Lys Alá
GCT GAA GAG GCA GCC ACA CGG
Ala Glu Glu Ala Alá Thr Arg
GAA GCA GCG GCC GAA GCT GCC Glu Ala Ala Ala Glu Ala Alá
GAG AAG CCT CAG AAG AAA CAG
Glu Lys Pro Gin Lys Lys Gin
CAT GAA GGG ACT AGT GGA GAG
His Glu Gly Thr Ser Gly Glu
GAG GCA GCC ACA CGG GCT GAG
Glu Ala Ala Thr Arg Alá Glu
GCG GCC GAA GCT GCC GCC CCC
Ala Ala Glu Ala Ala Alá Pro
CCT CAG AAG AAA CAG GCT AAC
Pro Gin Lys Lys Gin Alá Asn
GCC GCA GAA GCT GAA GAG GCA
Ala Ala Glu Ala Glu Glu Alá
GCT GAG GCC GAA GCA GCG GCC
Ala Glu Ala Glu Ala Ala Alá
CCC GAG GTC GAG AAG CCT CAG
Pro Glu Val Glu Lys Pro Gin
GAA GCT GTG CAT GCA GCC TCT
Glu Ala Val His Ala Alá Ser
Ala Glu Ala Glu Ala Ala Alá Glu
CCC GAG GTC GAG AAG CCT CAG AAG Pro Glu Val Glu Lys Pro Gin Lys
GAA GCT GTG CAG GCG GCC GCA GAA Glu Ala Val Gin Ala Ala Alá Glu
GCT GAG GAG AAG CGC GCT GAG GCC
Ala Glu Glu Lys Arg Ala Glu Alá
GCC CCC GCT GCG CAA CCC GAG GTC Ala Pro Ala Alá Gin Pro Glu Val
GCT AAC GCT AAG GCC GAA GCT GTG
Ala Asn Ala Lys Ala Glu Alá Val
ATG CAG GCG GCC GCA GAA GCT GAA Met Gin Ala Ala Ala Glu Alá Glu
GAG AAG CGC GCT GAG GCC GAA GCA
Glu Lys Arg Ala Glu- Ala Glu Alá
GCT GCG CAA CCC GAG GTC GAG AAG
Ala Alá Gin Pro Glu Val Glu Lys
GCT AAG GCC GAA GCT GTG CAG GCG
Ala Lys Ala Glu Ala Val Gin Alá
GCC ACA CGG GCT GAC GAG AAG CGC Ala Thr Arg Alá Glu Glu Lys Arg
GAA GCT GCC GCC CCC GCT GCG CAA Glu Ala Ala Ala Pro Ala Alá Gin
AAG AAA CAG GCT AAC GCT AAG GCC Lys Lys Gin Ala Asn Ala Lys Alá
AGA
Arg (47. azonosítószámú szekvencia);
(48. azonosítószámú szekvencia).
- 100 ·*· ····· ·..· ··:· : ··:· ·τ
A pSP2alpha2-plazmid Spel-helyére célba juttató szekvenciák, például UTV-szekvenciák vagy UTV-szerű szekvenciák klónozhatok. Közelebbről, a Spel-helyre klónozhatjuk az RK32s- és RK32a- jelzésű átfedő oligonukleotidokat, így kapjuk a pSP2alpha2(RKKK) 2- [más néven, pSP2alpha2(RK32)vagy pSP2alpha2(RKKK2)-] plazmidot. Hasonló módon állíthatjuk elő a pSP2alpha2(RKKK) 3-, [más néven, pSP2alpha2(RK33)vagy pSP2alpha2(RKKK3)-] plazmidokat. Eljárhatunk úgy is, hogy Xbal-emésztéssel a plazmidból a teljes 2alpha2 ahelikális domént eltávolítjuk, és azt pACT(ARGD) kompatibilis Spel-helyére klónozzuk, így kapjuk a pACT2alpha2 (RKKK) 2-plazmidot [más néven, pACT-2alpha2 (RKKK2) vagy pACT2alpha2(RK32)- plazmidot]. Hasonló technikákkal állíthatjuk elő a pACT-2alpha2 (RKKK) 3-plazmidot [más néven, pACT-2alpha2(RKKK3)- vagy pACT2alpha2(RK33)- plazmidot].
Hasonlóképp, tüskeszerűen kiemelkedő kiméra hexonproteineket (azaz, azok kiemelkedését eredményező szekvenciákat tartalmazó proteineket) nyerhetünk oly módon, hogy a 2alpha2-jelzésű α-helikális domént pACT-Hll-plazmid Xbalhelyére klónozzuk, így kapjuk a pACT-Hll-2alpha2(RKKK) 2plazmidot [más néven, pACT-Hll-2alpha2(RKKK2)- vagy pACTHll-2alpha2(RK32)- plazmidot]. Hasonló technikák alkalmazásával állíthatjuk elő a pACT-H12-2alpha2 (RKKK) 2-plazmidot [más néven, pACT-H12-2alpha2(RKKK2)- vagy pACT2-H12alpha2(RK32)-plazmidot].
- 101 -
13. példa
A következő példában további, az adenovírus-fiberproteinben UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó adenovirus-vektorok előállítását ismertetjük.
A fíberben UTV-módosítást tartalmazó adenovirusvektorok előállítására alkalmazható eljárások szakember számára ismertek. A fenti plazmidokból előállíthatunk UTVfíbervektorokat például úgy, hogy először a plazmid-DNS-t Sall-enzimmel linearizáljuk, majd a DNS-t transzfekcióval olyan, 293-jelzésű csomagoló sejtvonalba (packaging cell line) juttatjuk, amelyet a transzfekciót közvetlenül megelőzően, E4-deléciót hordozó adenovírussal fertőztünk. Az E4-deléciót hordozó adenovírusok nem képesek replikálódni 293-sejtekben és hasonló sejtvonalakban, amelyek csak az adenovirus El-régió jelenlétét biztosítják, in trans. A módosított fibergént és az E4-régiót tartalmazó plazmidok rekombinációja az E4-deléciót hordozó DNS-sel, replikációra képes, E4-régiót tartalmazó, a módosított fibergént hordozó vektor keletkezését eredményezi.
A fent ismertetettek szerint, a pl93NS(F5*)-, pGS(K7), pBSS-75-100pGS(null)-, pBSS-75-100pGS(RKKK) 2-, pBSS-75lOOpGS(RKKK) 3-, pBSS-75-1OOpGS(tat)-,pl93NS-F5F2K(RK32)- és pl93-F5F9sK- plazmidokat Sall-enzimmel linearizáltuk, és 293-jelzésű sejtekbe transzfektáltuk, amelyeket a transzfekciót megelőzően egy órával, E4-deléciót hordozó, GV11A.Z-jelzésű [a LacZ-gént citomegalovírus (OMV) promoter szabályozása alatt tartalmazó] adenovírus-vektorral fertőztünk; vagy amelyet GV11A.S-jelzésű [a szekretoros alkalikus
- 102 • * · · · · · · ·..· ··:· : ··:· ·τ foszfatáz gént CMV-promóter szabályozása alatt tartalmazó] adenovirus-vektorral fertőztünk. így kaptuk a következő adenovírus-vektorokat: AdZ.F(pK7), AdZ.F(pGS), AdZ.F(RKKK)2 [más néven, AdZ.F(RKKK2) vagy AdZ.F(RK32)], AdZ.F(RKKK)3 [más néven, AdZ.F(RKKK3) vagy AdZ.F(RK33)], AdZ.F(tat), AdZ.F5F2K(RKKK)2 [más néven, AdZ.F5F2K(RKKK2) vagy AdZ.F(RK32)], valamint AdZ.F5F9sK [más néven, AdZ.F5F9KShort], amelyeket 293-sejtek fertőzésével, plakk-képző vektorok izolálásával, és a fenti eljárás ismétlésével tisztítottunk .
Valamennyi vektor esetében, az inszert PCR-amplifikációjával, valamint az adott vektorral fertőzött 293sejtekből Hirt-extrakcióval nyert vírus-DNS restrikciós analízisével igazoltuk, hogy azok a megfelelő szekvenciát tartalmazzák. Adott esetben, Western-blot analízist is végezhetünk a korábbiakban ismertetettek szerint), a proteinek méretének vizsgálatára. Vektorrészecskékből és/vagy vektorral fertőzött sejtek lizátumából származó, poliakrilamidgélen elektroforetizált fiberprotein Westernblot-analizise szerint, a kiméra fiberprotein mobilitása eltolódik a módosítatlan protein mobilitásához képest; az eltolódás mértéke megfelel a kiméra proteinben található további aminosav-szekvenciák jelenlétének. Például, az AdZ.F(pK7)-részecskék Western-blot-analízise szerint, annak fíberproteinjei, a módosítatlan fibert tartalmazó AdZvektorból származó fiberprotein vándorlásához képest a gélen felfelé tolódtak el, az AdZ.F(pK7)-fíberproteinben található további aminosavak jelenlétének megfelelően.
• · * · k · « ···· · ···· •
- 103 A leírásban ismertetett egyéb plazmidok a fent ismertetettekkel megegyező eljárással (vagy annak kis mértékben módosított változatával) alakíthatók adenovírus-vektorokká.
14. példa
Az alábbi példában olyan adenovírus-vektorok előállítását ismertetjük, amelyek az adenovirus pentonbázisproteinben tartalmaznak UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat.
Kiméra pentonbázis-proteineket tartalmazó adenovírusvektorok előállítását ismertetik például Wickham és mtsai. [J. Virol. 70, 6831 (1996)]. A fent ismertetett, kiméra pentonbázis-proteint tartalmazó pACT-vektorok [például a pACT-2alpha2(RKKK) 2-z pACT-Hll-2alpha2(RKKK) 2-, pACT-H122alpha2(RKKK) 2- vagy pACT(ÁRGD)- jelzésű transzferplazmidok] például BamHI enzimmel emészthetek, a plazmid linearizálása céljából. Az Ad5-DNS XmnI restrikciós endonukleázzal emészthető, amely a vad-típusú Ad5-DNS-t, az Ad5-genom 14 561. és 15 710. pozícióinak megfelelően hasítja. A két nagyobb méretű fragmenst szétválasztjuk a kisebb, 1 kb nagyságú darabtól, majd azokat a linearizált plazmáddal együtt, megfelelő sejtvonalba (például 293sejtvonalba) transzfektáljuk, miáltal rekombináns vírusokat kapunk.
Az ily módon nyert adenovírus-vektorokat a potenciális szennyezést képező módosítatlan vektoroktól tisztítjuk, úgy, hogy 293-sejteket fertőzünk, különálló plakkokat izolálunk, és a fenti eljárást megismételjük. A kapott vekto- 104 rok esetében, az adott vektorral fertőzött 293-sejtekből Hirt-extrakcióval nyert virus-DNS restrikciós analízisével igazoljuk, hogy azok a pentonbázis-régióban a megfelelő szekvenciát tartalmazzák. Az inszert jelenlétét kimutathatjuk továbbá, a virus-DNS megfelelő régiójának amplifikációjával nyert PCR-termékek szekvenálásával is. Poliakrilamidgélen elektroforetizált kiméra pentonbázis-protein Western-blot-analízise szerint, a kiméra mobilitása eltolódott a módosítatlan pentonbázis-protein mobilitásához képest, a kiméra proteinben található további aminosavszekvenciák jelenlétének megfelelően.
15. példa
A következő példában olyan adenovírus-vektorok előállítását ismertetjük, amelyek a hexonproteinben tartalmaznak UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat.
Az AdZ .H (RKKK) 2~virust úgy állítottuk elő, hogy átfedő DNS-szekvenciákat tartalmazó, pACT-Hll(RK32) Pmel-BamHI szekvenciával rekombinálódni képes bal és jobb vektorkarokat izoláltunk, hogy a rekombináció révén intakt AdZ.H(RK32)-genomot kapjunk. A bal kart úgy nyertük, hogy tisztított Ad5-DNS-t Agel-jelzésű restrikciós enzimmel emésztettünk, amely az Ad5-DNS-t a következő pozíciókban hasítja: 14 499., 15 283., 19 017., 23 063., 23 656., 23 411. és 31 102.. Ezt követően, a 0-14 499. pozícióknak megfelelő fragmens bal karként alkalmazható, és a többi fragmenstől gélelektroforézissel szétválasztható. A jobb kart úgy állíthatjuk elő, hogy Ad5-DNS-t Drdl-enzimmel * ···· · · • · · · · * · · · · to · to
- ΐ05 - ·..···:* : “»”*r emésztünk. A Drdl-enzim az Ad5-DNS-t a következő pozíciókban hasítja: 5 458., 7 039., 14 004., 15 593., 17 257. és 21 023.. A 21 023-35 938. pozícióknak megfelelő fragmens jobb karként alkalmazható, és a többi fragmenstől gélelektroforézissel szétválasztható. A fenti két fragmenst ezután, a pACT-Hll(RK32)-plazmidból származó Pmel/BamHIfragmenssel együtt, 293-sejtekbe transzfektáljuk. A Pmelenzim az Ad5-genomot a 13 258. pozícióban hasítja, a BamHIenzim pedig a 21 562. pozícióban hasítja. Hasonló technikák alkalmazásával állíthatjuk elő az AdZ.H(RKKK) 3-konstrukciót.
16. példa
Az alábbi példában, a megrövidített nyelű fiberproteineket tartalmazó vektorok előállítását ismertetjük.
Az alábbiakban ismertetett eljárás, amely szerint p!93-F5F9K-short-transzferplazmidból kiindulva állítottunk elő adenovírust, más megrövidített nyelű fiberproteint tartalmazó adenovírus-vektorok előállítására is alkalmazható. Nevezetesen, az adenovírusok számára esszenciális fontosságú E4-régiót tartalmazó pl93-F5F9K-short-transzferplazmidot Sall-enzimmel emésztettük, és olyan 293-sejtekbe transzfektáltuk, amelyeket a transzfekciót megelőzően 1 órával, AdSE.E4Gus-adenovírus-vektorral fertőztünk. Az AdSE.E4Gus-adenovirus-vektorból hiányzik az adenovírusok E4-régiója, és E4-génnel történő kiegészítés hiányában az nem képes 293-sejtekben replikálódni. A vektor tehát csak akkor válik képessé 293-sejtekben történő replikációra, ha
- 106 az AdSE.E4Gus-DNS pl93-F5F9K-short-plazmid-DNS-sel rekombinálódik, és az E4-génnel kiegészül. Továbbá, a rekombináció eredményeképp, az újonnan képződő vektor, a plazmád által kódolt, mutációt hordozó fiberproteint kódoló szekvenciákat is tartalmaz. A pl93-F5F9K-short fiberkimérát tartalmazó, életképes, rekombináns E4+-adenovirusokat úgy izoláltunk, hogy a transzfekciót követően 5 nappal, a transzfektált sejtek lizátumát plakk-képző képességre nézve vizsgáltuk. Az így kapott, AdSE.F5F9K-short-vektort ismert virológiái technikákkal izoláltuk és tisztítottuk, ezen belül, azok plakk-képző képességének vizsgálatát, 293sejteken, még két alkalommal megismételtük. Azt, hogy a vektor a megfelelő inszertet tartalmazza, PCR-eljárással és a vírus-DNS restrikciós analízisével igazoltuk. A fíbergén egyes végein hibridizálódó láncindító oligonukleotidok alkalmazásával bizonyítottuk, hogy a megrövidített kiméra fiberproteint kódoló génnek megfelelő méretű PCR-termék keletkezett. A vektor-DNS restrikciós analízise szerint, az új vektor, az Ad9-fibergombban előforduló egyedi restrikciós helyeknek megfelelő restrikciós helyeket tartalmazott.
17. példa
Az alábbi példában, megrövidített nyelű fiberproteineket és UTV-szekvenciákkal vagy UTV-szerű szekvenciákkal kiegészített kiméra pentonbázis-proteineket tartalmazó adenovírus-vektorok előállítását ismertetjük.
Ilyen adenovírus-vektorokat előállíthatunk úgy, hogy az AdS.F9sK-vírus-DNS-t Xmal-enzimmel emésztjük, a fent is- 107 • *» ···· · ···· ··£· mertetettek szerint. Ezt követően, a pACT-Hll(RK32)plazmidot Pmel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük. A restrikciós enzimekkel emésztett vírus- és plazmid- DNS-t tisztítjuk, és 293-sejtekbe transzfektáljuk. Az így kapott vektorokat 293-sejteken, két alkalommal, plakk-tisztítással izoláltuk, és a vektorral fertőzött 293-sejtekből Hirtextrakcióval nyert virus-DNS·restrikciós analízisével igazoltuk, hogy azok a megfelelő szekvenciát tartalmazzák a pentonbázis-régióban.
Az inszert jelenlétét kimutathatjuk továbbá úgy, hogy a virus-DNS inszertnek megfelelő régióját amplifikáljuk, és az így nyert PCR-termékeket szekvenáljuk. Poliakrilamidgélen elektroforetizált kiméra pentonbázis-protein Westernblot-analízise szerint, a kiméra pentonbázis-protein mobilitásának eltolódása figyelhető meg, a módosítatlan pentonbázis-protein mobilitásához képest, a kiméra proteinben található további, nem-natív aminosav-szekvenciák jelenlétének (és natív aminosavszekvenciák hiányának) megfelelően.
További plazmidok, amelyek térképét a leírásban közöltük, de amelyeket nem alakítottunk adenovírus-vektorokká, a fentiekben vázolt eljárással vagy ahhoz képest kis mértékben módosított eljárással alakíthatók adenovírusvektorokká. Közelebbről, a megrövidített nyelű fiberproteinek tüskeszerűen kiemelkedő kiméra pentonbázisproteint tartalmazó adenovírusba építhetők, amely utóbbiakba - adott esetben -, UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat is inszertálhatunk.
·. :.:. .* :·?·
- 108 -
18. példa
Az alábbi példában, megrövidített nyelű fiberproteineket és UTV-szekvenciákkal vagy UTV-szerű szekvenciákkal kiegészített kiméra hexonproteineket tartalmazó adenovírus-vektorok előállítását ismertetjük.
Vírus-DNS-t a megrövidített nyelű fiberproteint kódoló vektorból, például az AdZ.F9sK-vektorból izolálhatunk, és azt a fent ismertetett restrikciós enzimekkel hasíthatjuk, hogy UTV-szekvenciákkal kiegészített kiméra hexonproteineket tartalmazó vektorokat nyerjünk. Egyébként, például a 17. példában leírtakkal azonos módon járunk el. Az így kapott vektornak tartalmaznia kell a megrövidített nyelű fiberproteineket és az UTV-szekvenciákkal vagy UTV-szerű szekvenciákkal kiegészített kiméra hexonproteineket. A fenti eljárás, más hexonproteineket tartalmazó, további transzfervektorok előállítására is alkalmazható. Közelebbről, a megrövidített nyelű fiberproteinek tüskeszerűen kiemelkedő kiméra hexonproteint tartalmazó adenovírusba építhetők, amely utóbbiakba - adott esetben -, UTVszekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat is inszertálhatunk.
19. példa
Az alábbi példában ismertetett kísérletekben vektorok, közelebbről, a találmány szerinti, UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó adenovírus-vektorok különböző sajátságait vizsgáltuk.
- 109 . *· *·Ζ· ·* ···· ··/·
Annak igazolására például, hogy az inszertált UTVszekvenciák vagy UTV-szerű szekvenciák nem befolyásolják a vírusok összeépülését, vizsgálhatjuk a vírusvektorok szaporodási kinetikáját. Az UTV-szekvenciákat tartalmazó plazmidok képviselőjeként a pAd.F(pK7) szaporodási jellemzőit vizsgáltuk, és vad-típusú adenovirus (Ad5), valamint AdZ.F(RGD)-adenovírus-vektor szaporodási képességével hasonlítottuk össze, amely utóbbi vektor, a SACDCRGDCFCGTS szekvenciába (93. azonosítószámú szekvenciába) építve, RGD-peptid-elemet tartalmaz. A fenti vizsgálatok szerint, 293-sejteket fertőztünk, sejtenként 5 aktív vírusrészecske alkalmazásával, azaz 5-ös fertőzési többszörös (MOI) érték mellett, Ad5-, AdZ.F(RGD)- vagy AdZ.F(pK7)adenovírusokkal, és a fertőzést követően 1, 2, valamint 3 nappal összegyűjtött sejtekben, meghatároztuk az egy sejtre jutó fertőző részecskék számát (azaz, fluoreszcens fókusz egységet, „Fluorescence Focus Units, FFU). Az AdZ.F(RGD)vagy AdZ.F(pK7)-adenovírusok esetében meghatározott titerek valamivel alacsonyabbak voltak, mint az Ad5-vírus alkalmazásával kapott titerek, de attól nem tértek el lényegesen. A 28. ábrán látható, hogy az AdZ.F(RGD)- és AdZ.F(pK7)adenovirusok esetében mért legmagasabb titerek, az Ad5vírus alkalmazásával kapott titerek 80 %-át, illetve 56 %át érték el. A fenti eredmények szerint, szekvenciák, közelebbről, UTV-szekvenciák vagy UTV-szerű szekvenciák hozzáadása a fiberprotein végéhez, a két vektor szaporodási kinetikáját nem befolyásolta lényegesen. Továbbá, az eredmények arra engednek következtetni, hogy UTV-szekvenciákat
- 110 -
vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó további vektorok sem fognak rendellenes szaporodási jellemzőket mutatni.
Ezen felül, UTV-szekvenciákat vagy UTV-szerű szekvenciákat tartalmazó vektorokat arra nézve is vizsgálhatunk, hogy azok sejtekhez történő kötődési képességét vagy génszállító képességét milyen mértékben gátolják negatív töltésű molekulák (például heparin, heparán-szulfát, kondroitin-szulfát, stb.); szolúbilis adenovírus-burokproteinek; vagy a sejtek előkezelése különböző, negatív töltésű csoportokat hasító hatóanyagokkal (például kondroitinázzal, heparinázzal, szialidázzal, stb.) [lásd például, Wickham és mtsai.: Nature Biotechnology 14, 1570 (1996); valamint az 1-18. példákat]. Szolúbilis fiberproteinek, az UTV-vektorok sejtekhez történő kötődésének nagyobb részét nem gátolják [Wickham és mtsai.: (1996) lásd fent]. A fenti eredmények alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy UTV-szekvenciák vagy UTV-szerű szekvenciák beépítése penton-, hexon- vagy fiber- proteinekbe, nem gátolja a kiméra burokproteint tartalmazó rekombináns adenovirus génszállító képességét.
Továbbá, in vivo fertőzést vagy teljes vér jelenlétében történő in vitro transzfekciót végezhetünk annak vizsgálatára, hogy a találmány szerinti UTV-vektorok szisztémás alkalmazását esetleg nem korlátozza-e az, hogy a rekombináns adenovírusok polikationjai a vérben polianionokkal szaturálódnak. Amennyiben ilyen kötődés gátolja az adott vírust a célzott sejt transzdukciójában, az magasabb dózisban is beadható, előnyösen, megfelelő óvintézkedéseket téve
- Ill • ’· :··· *·:· ··»· • · · · ’ annak érdekében, hogy a magasabb dózissal kapcsolatos immunválasz kialakulását megakadályozzuk (például úgy, hogy egy eltérő szerotipusú adenovirusvektort adunk be; vagy a WO 96/12 406 számú PCT nemzetközi közzétételi iratban ismertetett technikákat alkalmazzuk; Mastrangeli és mtsai.: Human Gene Therapy 2/ 79 (1996)].
Valamennyi, a leírásban idézett szakirodalmi hely, például szabadalmi leírás, közzétételi irat, valamint közlemény, teljes terjedelmében a kitanítás részét képezi úgy, mintha azokat teljes terjedelmükben közöltük volna.
Bár a találmányt előnyös megvalósítási példákon keresztül szemléltettük, szakember számára nyilvánvaló, hogy azokban számos olyan módosítás hajtható végre, amely szintén alkalmas megoldást eredményez, és a találmány a leírásban ismertetettektől eltérő módon is alkalmazható. A találmány tárgyát képezik az ilyen változatok és egyéb megvalósítási módok is. Ennek megfelelően, a találmány tárgyát képezi a csatolt igénypontokban megfogalmazott oltalmi körtől és a találmány tárgykörétől el nem térő valamennyi módosí tás .
- 112 SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 8 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
AZ 1. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 8 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: peptid
A 2. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 8 aminosav
TÍPUSA: aminosav
- 113 *·· ····· • · ···· · ···· ··/·
HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid
A 3. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 15 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid
A 4. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 18 aminosav
TÍPUSA: aminosav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: peptid
- 114 -
AZ 5. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Alá Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Lys Lys Lys 15 10 15
Lys Lys Lys
A 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 8 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS AZ 6. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GGA TCC AA 8
Gly Ser 1
A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 30 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS A 7. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: GGA TCC AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA TGT 30
Gly Ser Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu Cys 15 10
- 115 a a a « · * · · : -:···»·
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 36 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: kettős TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: genomi DNS
A 8. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GCC GGA TCC AAC AAG AAT AAA GAA TCG TTT GTG TTA 3 6
Alá Gly Ser Asn Lys Asn Lys Glu Ser Phe Val Leu 1 5 10
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 55 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS
A 9. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TATGGAGGAT CCAATAAAGA ATCGTTTGTG TTATGTTTCA ACGTGTTTAT TTTTC 55
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 57 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy • *· ϊ·ϊ· ·* ···· ’·ί*
- 116 - ” * *
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS
A 10. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ATTGAAAAAA TAAACACGTT GAAACATAAC ACAAACGATT CTTTATTGGA
TCCTCCA 57
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 43 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS
A 11. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TCCCCCCGGG TCTAGATTAG GATCCTTCTT GGGCAATGTA TGA 43
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: szintetikus DNS
A 12. AZONOSÍTÓ SZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
CGTGTATCCA TATGACACAG A
Claims (25)
- - 117 ·,,· ··;* : **·* * ?*SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Kiméra adenovirus-burokprotein, amely nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz valamely belső burokprotein szekvenciába vagy annak helyére inszertálva, és amely eukariota sejtek szélesebb köréhez képes hatékonyan kötődni, mint a vad-típusú adenovirus-burokprotein; továbbá, eukariota sejtek meghatározott típusára nem-szelektív.
- 2. Kiméra adenovirus-burokprotein, amely nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz valamely belső burokprotein szekvenciába vagy annak helyére inszertálva, és amely hatékonyan kötődik epithelsejtekhez, simaizom-sejtekhez, endothelsejtekhez, fibroblaszt-sejtekhez, glioblasztómasejtekhez és monocita-sejtekhez.
- 3. Kiméra adenovirus-burokprotein, amely nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz valamely belső burokprotein szekvenciába vagy annak helyére inszertálva, és amely hatékonyan kötődik az eukariota sejtek többségéhez.
- 4. Kiméra adenovirus-burokprotein, amely nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz, és amely a vad-típusú, 5-ös szerotípusú fíberproteinnél hatékonyabban kötődik a következő sejtekhez: HA-SMC-, HuVec-, CPAE-, HS-68-, MRC-5-, U118- és THP-l-sejtekhez.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti adenovirusburokprotein, amely hatékonyan kötődik lényegében valamenynyi eukariota sejthez.- 118 .... ..r.
- 6. Kiírtéra adenovírus-burokprotein, amely nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz, és amely hatékonyan kötődik egy, az eukariota sejtek többségének felszínén megtalálható csoporthoz.
- 7. Az 5. igénypont szerinti adenovírus-burokprotein, amely negatív töltésű csoportokhoz kötődik.
- 8. A 6. igénypont szerinti adenovírus-burokprotein, amely a következő sejtfelszíni csoportok legalább egyikéhez kötődik: heparin, heparin-szulfát, hilauronsav, dermatánszulfát, sziálsav, keratin-szulfát vagy kondroitin-szulfát.
- 9. A 6. igénypont szerinti adenovírus-burokprotein, amely heparin-szulfát csoportokhoz kötődik.
- 10. A 6. vagy 7. igénypont szerinti adenovírus-burokprotein, amely egy, lényegében az összes eukariota sejt felszínén megtalálható csoporthoz kötődik.
- 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus-burokprotein, amely nem-natív aminosav-szekvenciaként, három vagy több pozitív töltésű aminosavat tartalmazó szekvenciát tartalmaz.
- 12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus-burokprotein, amely a protein felszínen megjelenő hurokrégiójában tartalmaz nem-natív aminosav-szekvenciát.
- 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus-burokprotein, amely natív aminosav-szekvenciát és 3tól körülbelül 30-ig terjedő számú polilizin-aminosavból álló, karboxi-terminális nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz.- 119 -
- 14. A 13. igénypont szerinti adenovírus-burokprotein, amely legalább egy aminosavnyi deléciót hordozó natív aminosav-szekvenciát tartalmaz.
- 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus-burokprotein, amely távtartó szekvenciát hordozó nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz.
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus-burokprotein, amely a következő szekvenciák valamelyikét magában foglaló nem-natív aminosav-szekvenciát tartalmaz: 1., 2., 3., 4., 5., 20., 22., 24., 26., 28., 30., 32., 34., 36., 38., 40., 42., 46., 48., 49., 50., 52., 53., 54., 55., 56., 57., 58., 73., 74., 76., 78., 90. vagy 93. azonosítószámú szekvenciákat.
- 17. A 16. igénypont szerinti adenovírus-burokprotein, amely a 4. vagy 5. azonosítószámú szekvenciák szerinti, körülbelül 3-30 lizint tartalmazó nem-natív aminosavszekvenciát tartalmaz.
- 18. Az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti adeno- vírus-burokprotein, amely fiberprotein.
- 19. Az 1-18. igénypontok bármelyike szerinti adeno- vírus-burokprotein, amely hexon- vagy penton-protein.
- 20. Vektor, amely 1-19. igénypontok bármelyike szerinti adenovírus-burokproteint tartalmaz vagy kódol.
- 21. A 20. igénypont szerinti vektor, amely külső burokkal nem-rendelkező vírusvektor.
- 22. A 21. igénypont szerinti vektor, amely adenovírusvektor.• · ·; ! « <·:·:· f ··?· ··*·- 120 -
- 23. A 20-22. igénypontok bármelyike szerinti vektor, amely utas gént is tartalmaz.
- 24. Gazdasejt, amely 20-23. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaz.
- 25. Eljárás sejt géntechnológiai úton történő módosítására, azzal jellemezve, hogy a sejtet a 19-22. igénypontok bármelyike szerinti vektorral érintkeztéljük.A meghatalmazott:DANUBIASzabadalmi és Védjegy Iroda Kft.Dr. Pethő Árpád
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/701,124 US5846782A (en) | 1995-11-28 | 1996-08-21 | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0001120A2 true HUP0001120A2 (en) | 2000-07-28 |
Family
ID=24816168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0001120A HUP0001120A2 (en) | 1996-08-21 | 1996-11-27 | Vectors and methods for gene transfer to cells |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US5846782A (hu) |
| EP (1) | EP0920514B1 (hu) |
| JP (1) | JP2001503250A (hu) |
| AT (1) | ATE382695T1 (hu) |
| AU (1) | AU732770B2 (hu) |
| CA (1) | CA2263140A1 (hu) |
| DE (1) | DE69738432T2 (hu) |
| HU (1) | HUP0001120A2 (hu) |
| WO (1) | WO1998007865A1 (hu) |
Families Citing this family (230)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5820868A (en) | 1993-12-09 | 1998-10-13 | Veterinary Infectious Disease Organization | Recombinant protein production in bovine adenovirus expression vector system |
| US6465253B1 (en) | 1994-09-08 | 2002-10-15 | Genvec, Inc. | Vectors and methods for gene transfer to cells |
| US5846782A (en) * | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US6127525A (en) * | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| US5770442A (en) | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| US6783980B2 (en) * | 1995-06-15 | 2004-08-31 | Crucell Holland B.V. | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy |
| ES2333425T5 (es) * | 1995-06-15 | 2012-08-28 | Crucell Holland B.V. | Sistemas de empaquetado para adenovirus recombinante humano destinados a terapia génica |
| US6096548A (en) | 1996-03-25 | 2000-08-01 | Maxygen, Inc. | Method for directing evolution of a virus |
| US6420629B1 (en) * | 1996-09-09 | 2002-07-16 | B.C. Research Inc. | Process of increasing plant growth and yield and modifying cellulose production in plants |
| FR2758822B1 (fr) * | 1997-01-30 | 1999-07-02 | Centre Nat Rech Scient | Utilisation d'un polypeptide a titre de recepteur cellulaire des adenovirus |
| US6432699B1 (en) * | 1997-03-28 | 2002-08-13 | New York University | Viral vectors having chimeric envelope proteins containing the IgG-binding domain of protein A |
| FR2761689B1 (fr) * | 1997-04-02 | 1999-06-25 | Transgene Sa | Fibre adenovirale modifiee et adenovirus cibles |
| BR9809173A (pt) * | 1997-05-28 | 2000-08-01 | Genvec Inc | Adenovìrus alternativamente direcionados |
| AU8097698A (en) | 1997-06-23 | 1999-01-04 | University Of Saskatchewan | Bovine adenovirus type 3 genome |
| CA2327545A1 (en) * | 1998-02-06 | 1999-08-12 | Uab Research Foundation | Adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the hi loop of the fiber knob |
| US6815200B1 (en) | 1998-02-17 | 2004-11-09 | The Uab Research Foundation | Modified adenovirus containing a fiber replacement protein |
| US20050095231A1 (en) * | 1998-02-17 | 2005-05-05 | Curiel David T. | Modified adenovirus containing a fiber replacement protein |
| ATE342350T1 (de) * | 1998-02-17 | 2006-11-15 | Uab Research Foundation | Modifizierte adenoviren welche ein faserersatzprotein enthalten |
| AU4070499A (en) | 1998-04-30 | 1999-11-16 | Cornell Research Foundation Inc. | Adenoviral vectors with tandem fiber proteins |
| US20040043489A1 (en) * | 1998-07-08 | 2004-03-04 | Menzo Havenga | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells and methods of use |
| US20030017138A1 (en) * | 1998-07-08 | 2003-01-23 | Menzo Havenga | Chimeric adenoviruses |
| WO2000012738A1 (en) * | 1998-08-27 | 2000-03-09 | Aventis Pharma S.A. | Targeted adenovirus vectors for delivery of heterologous genes |
| JP2002538767A (ja) * | 1998-09-29 | 2002-11-19 | ザ ユーエイビー リサーチ ファンデイション | 樹状細胞およびｂ細胞の遺伝子組換えによる免疫調節 |
| US6929946B1 (en) | 1998-11-20 | 2005-08-16 | Crucell Holland B.V. | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for smooth muscle cells, and/or endothelial cells |
| US6395875B1 (en) * | 1999-01-25 | 2002-05-28 | Brookhaven Science Associates Llc | Recombinant soluble adenovirus receptor |
| US7157266B2 (en) * | 1999-01-25 | 2007-01-02 | Brookhaven Science Associates Llc | Structure of adenovirus bound to cellular receptor car |
| JP2000279178A (ja) * | 1999-02-24 | 2000-10-10 | Japan Found Cancer Res | ウイルスベクター |
| US6869936B1 (en) * | 1999-03-04 | 2005-03-22 | Crucell Holland B.V. | Means and methods for fibroblast-like or macrophage-like cell transduction |
| US6824771B1 (en) * | 1999-05-12 | 2004-11-30 | The Uab Research Foundation | Infectivity-enhanced conditionally-replicative adenovirus and uses thereof |
| US20040175362A1 (en) * | 1999-05-12 | 2004-09-09 | Curiel David T. | Infectivity-enhanced conditionally-replicative adenovirus and uses thereof |
| US20050232900A1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-10-20 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| US6492169B1 (en) * | 1999-05-18 | 2002-12-10 | Crucell Holland, B.V. | Complementing cell lines |
| US6913922B1 (en) * | 1999-05-18 | 2005-07-05 | Crucell Holland B.V. | Serotype of adenovirus and uses thereof |
| DE60024442T2 (de) * | 1999-06-11 | 2006-08-03 | MediGene, Inc., San Diego | Verwendung von viralen vektoren und geladenen molekülen für die gentherapie |
| US6656730B1 (en) * | 1999-06-15 | 2003-12-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs |
| WO2001016344A1 (fr) * | 1999-08-27 | 2001-03-08 | Transgene S.A. | Fibre adenovirale modifiee et utilisations |
| AU7322600A (en) * | 1999-09-17 | 2001-04-24 | Tgt Laboratories, S.A. De C.V. | Recombinant adenoviral vectors and their utilization in the treatment of varioustypes of hepatic, renal and pulmonary fibrosis and hypertrophic scars |
| US6955808B2 (en) * | 1999-09-24 | 2005-10-18 | Uab Research Foundation | Capsid-modified recombinant adenovirus and methods of use |
| EP1214098B1 (en) | 1999-09-24 | 2006-11-22 | The Uab Research Foundation | Capsid-modified recombinant adenovirus and methods of use |
| AU1087701A (en) * | 1999-10-15 | 2001-04-30 | Canji, Inc. | Targeted vectors |
| US7560527B1 (en) | 1999-11-25 | 2009-07-14 | Transgene S.A. | Modified adenovirus fibre and uses |
| DE60111733T2 (de) * | 2000-04-12 | 2006-05-18 | Amersham Health As | Integrinbindende peptidderivate |
| US7332337B2 (en) * | 2000-05-16 | 2008-02-19 | Galapagos Nv | Viral vectors having tissue tropism for T-lymphocytes, B- and mast cells |
| EP1157999A1 (en) * | 2000-05-24 | 2001-11-28 | Introgene B.V. | Methods and means for enhancing skin transplantation using gene delivery vehicles having tropism for primary fibroblasts, as well as other uses thereof |
| EP1285081A2 (en) * | 2000-05-30 | 2003-02-26 | ICH Productions Limited | Improved methods of transfection |
| JP2004512015A (ja) * | 2000-06-02 | 2004-04-22 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 変異ファイバー蛋白質を有するアデノウィルス粒子 |
| US6762031B2 (en) | 2000-06-16 | 2004-07-13 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Targeting viral vectors to specific cells |
| US6524572B1 (en) * | 2000-06-26 | 2003-02-25 | Rainbow Therapeutic Company | Targeting recombinant virus with a bispecific fusion protein ligand in coupling with an antibody to cells for gene therapy |
| US20020164333A1 (en) * | 2000-07-10 | 2002-11-07 | The Scripps Research Institute | Bifunctional molecules and vectors complexed therewith for targeted gene delivery |
| GB0017720D0 (en) * | 2000-07-19 | 2000-09-06 | Got A Gene Ab | Modified virus |
| DE60116513T2 (de) * | 2000-08-10 | 2006-09-21 | Crucell Holland B.V. | Adenovirenvektoren zur transduktion der chondrozyten |
| US20040033605A1 (en) * | 2000-09-20 | 2004-02-19 | Menzo Havenga | Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for dendritic cells |
| US7235233B2 (en) * | 2000-09-26 | 2007-06-26 | Crucell Holland B.V. | Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts |
| NO20004795D0 (no) * | 2000-09-26 | 2000-09-26 | Nycomed Imaging As | Peptidbaserte forbindelser |
| EP1191104A1 (en) * | 2000-09-26 | 2002-03-27 | Introgene B.V. | Gene delivery vehicles and use thereof in the preparation of a medicament and/or vaccine |
| US6573092B1 (en) | 2000-10-10 | 2003-06-03 | Genvec, Inc. | Method of preparing a eukaryotic viral vector |
| US20030202963A1 (en) * | 2000-10-12 | 2003-10-30 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method of treating cancer |
| MXPA00011713A (es) * | 2000-11-28 | 2002-05-31 | Tgt Lab S A De C V | Vectores recombinantes virales y no virales conteniendo el gen humano del activador de plasminogeno derivado de urocinasa y su utilidad en el tratamiento de diversos tipos de fibrosis hepatica, renal, pulmonar, pancreatica, cardiaca y cicatrices hipe |
| WO2002064746A2 (en) * | 2001-02-14 | 2002-08-22 | Uab Research Foundation | Combined transductional and transcriptional targeting system for improved gene delivery |
| US20030138405A1 (en) * | 2001-04-17 | 2003-07-24 | Juan Fueyo | Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways |
| EP1404371B1 (en) | 2001-07-10 | 2019-03-13 | GE Healthcare UK Limited | Peptide-based compounds for targeting intergin receptors |
| US20060275262A1 (en) * | 2001-07-26 | 2006-12-07 | Mathis James M | Conditionally replicating viruses and methods for cancer virotherapy |
| US20040002060A1 (en) * | 2002-01-24 | 2004-01-01 | Novartis Ag | Fiber shaft modifications for efficient targeting |
| ES2335657T3 (es) * | 2002-04-25 | 2010-03-31 | Crucell Holland B.V. | Medios y metodos para la produccion de vectores de adenovirus. |
| US20030206916A1 (en) * | 2002-05-03 | 2003-11-06 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Immunogenic peptides |
| CN1548537B (zh) * | 2002-12-27 | 2010-05-05 | 深圳市源兴生物医药科技有限公司 | 疫苗制备方法和抗肿瘤疫苗 |
| US20040166091A1 (en) | 2003-02-24 | 2004-08-26 | Genvec, Inc. | Materials and methods for treating disorders of the ear |
| US20070275915A1 (en) * | 2003-04-15 | 2007-11-29 | Cell Genesys, Inc. | Tmprss2 Regulatory Sequences and Uses Thereof |
| US20070212675A1 (en) * | 2003-04-15 | 2007-09-13 | Novartis Ag | Flap Endonuclease (Fen1) Regulatory Sequences And Uses Thereof |
| CA2524499A1 (en) | 2003-05-14 | 2004-11-25 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa | Broadening adenovirus tropism |
| WO2005001103A2 (en) * | 2003-06-20 | 2005-01-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses |
| US7291498B2 (en) * | 2003-06-20 | 2007-11-06 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods of generating chimeric adenoviruses and uses for such chimeric adenoviruses |
| ES2391975T3 (es) * | 2003-07-25 | 2012-12-03 | Genvec, Inc. | Vacunas a base de vector adenovírico |
| US7519698B2 (en) * | 2003-09-26 | 2009-04-14 | Ricoh Co., Ltd. | Method and system for extracting information from networked devices in a multi-protocol remote monitoring system |
| WO2005051432A1 (en) * | 2003-11-14 | 2005-06-09 | Genvec, Inc. | Therapeutic regimen for treating cancer |
| CN101343625A (zh) * | 2004-02-23 | 2009-01-14 | 克鲁塞尔荷兰公司 | 病毒纯化方法 |
| WO2005086922A2 (en) | 2004-03-10 | 2005-09-22 | Board Of Regents, University Of Texas System | Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes |
| US7473418B2 (en) | 2004-03-25 | 2009-01-06 | Cell Genesys, Inc. | Pan cancer oncolytic vectors and methods of use thereof |
| EP2567967A3 (en) | 2004-04-12 | 2013-08-21 | GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Method of using adenoviral vectors to induce an immune response |
| WO2006033679A2 (en) | 2004-05-25 | 2006-03-30 | Chimeracore, Inc. | Self-assembling nanoparticle drug delivery system |
| US20060062764A1 (en) * | 2004-08-25 | 2006-03-23 | Seshidar-Reddy Police | Fiber-modified adenoviral vectors for enhanced transduction of tumor cells |
| WO2006039045A2 (en) * | 2004-09-01 | 2006-04-13 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Adenoviral vectors able to transduce apcs, potential use in immune response generation |
| US20060057127A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Pocheng Liu | Cytokine-expressing cellular vaccines for treatment of prostate cancer |
| WO2006042017A2 (en) | 2004-10-06 | 2006-04-20 | University Of Rochester | Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway |
| JP2008518599A (ja) | 2004-10-28 | 2008-06-05 | ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション | 脊髄損傷疼痛のための末梢送達グルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子治療 |
| EP2290369B1 (en) * | 2004-12-22 | 2013-08-14 | California Institute Of Technology | Methods for proteomic profiling using non-natural amino acids |
| US8999944B2 (en) | 2005-01-20 | 2015-04-07 | University Of Rochester | Thioredoxin interacting protein (TXNIP) as regulator of vascular function |
| US20060205080A1 (en) * | 2005-03-01 | 2006-09-14 | David Frey | Formulations for therapeutic viruses having enhanced storage stability |
| ATE412737T1 (de) * | 2005-04-11 | 2008-11-15 | Crucell Holland Bv | Virusreinigung mit ultrafiltration |
| US20060234347A1 (en) * | 2005-04-13 | 2006-10-19 | Harding Thomas C | Targeting multiple angiogenic pathways for cancer therapy using soluble tyrosine kinase receptors |
| WO2006130806A2 (en) * | 2005-06-01 | 2006-12-07 | University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education | Assay for agonists and antagonists of ion channels and for regulators of genetic expression |
| US7825231B2 (en) * | 2005-06-01 | 2010-11-02 | Darren P. Wolfe | Method of amidated peptide biosynthesis and delivery in vivo: endomorphin-2 for pain therapy |
| US20070053934A1 (en) * | 2005-08-26 | 2007-03-08 | Neville Kallenbach | Polyvalent multimeric composition containing active polypeptides, pharmaceutical compositions and methods of using the same |
| US8450055B2 (en) * | 2005-08-31 | 2013-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Malaria antigen screening method |
| EP1929021A2 (en) * | 2005-08-31 | 2008-06-11 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| US9651543B2 (en) | 2005-08-31 | 2017-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Malaria antigen screening method |
| WO2007059461A2 (en) * | 2005-11-10 | 2007-05-24 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based foot-and-mouth disease vaccine |
| EP1996716B1 (en) | 2006-03-20 | 2011-05-11 | The Regents of the University of California | Engineered anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting |
| US8518105B2 (en) * | 2006-03-24 | 2013-08-27 | Abbott Cardiovascular System Inc. | Methods and apparatuses for coating a lesion |
| EP2013348A4 (en) | 2006-03-30 | 2009-09-02 | Univ California | METHOD AND COMPOSITIONS FOR LOCALIZED SECRETION OF ANTI-CTLA-4 ANTIBODIES |
| US7919079B2 (en) * | 2006-03-31 | 2011-04-05 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Cancer immunotherapy compositions and methods of use |
| EP2018156B1 (en) | 2006-04-07 | 2010-03-17 | Chimeros, Inc. | Compositions and methods for treating b- cell malignancies |
| US20080248060A1 (en) * | 2007-01-09 | 2008-10-09 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based malaria vaccines |
| ES2322637B1 (es) * | 2007-06-26 | 2010-03-05 | Universidad Del Pais Vasco | Microparticulas de alginato modificado con rgd como sistema de liberacion de farmacos. |
| US20120028880A1 (en) | 2007-08-08 | 2012-02-02 | Renata Pasqualini | Vegfr-1/nrp-1 targeting peptides |
| CA2698343C (en) | 2007-09-04 | 2018-06-12 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection |
| US20090202492A1 (en) * | 2008-01-25 | 2009-08-13 | University Of South Florida | Adenovirus vaccine utilizing ikk as adjuvant |
| JP5770633B2 (ja) | 2008-11-03 | 2015-08-26 | クルセル ホランド ベー ヴェー | アデノウイルスベクターの産生方法 |
| JP2012513589A (ja) | 2008-12-23 | 2012-06-14 | ジーイー・ヘルスケア・リミテッド | 骨髄イメージング剤としての９９ｍＴｃ−ペプチド系化合物の応用 |
| WO2010107991A2 (en) | 2009-03-18 | 2010-09-23 | Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment and prevention of cancer |
| WO2010120874A2 (en) | 2009-04-14 | 2010-10-21 | Chimeros, Inc. | Chimeric therapeutics, compositions, and methods for using same |
| CA3120504A1 (en) | 2009-06-10 | 2010-12-16 | New York University | Immunological targeting of pathological tau proteins |
| US9605844B2 (en) * | 2009-09-01 | 2017-03-28 | Cree, Inc. | Lighting device with heat dissipation elements |
| PL2488636T3 (pl) | 2009-10-15 | 2014-07-31 | Crucell Holland Bv | Sposób oczyszczania cząsteczek adenowirusów z hodowli o wysokim zagęszczeniu komórkowym |
| US8470585B2 (en) | 2009-10-15 | 2013-06-25 | Crucell Holland B.V. | Process for adenovirus purification from high cell density cultures |
| US20120219583A1 (en) | 2009-10-16 | 2012-08-30 | Los Alamos National Security, Llc | Nucleic acid sequences encoding expandable hiv mosaic proteins |
| WO2011057254A2 (en) | 2009-11-09 | 2011-05-12 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Simian adenoviral vector-based vaccines |
| BR112012010824A2 (pt) | 2009-11-09 | 2018-03-06 | Genvec Inc | adenovirus simios e métodos de uso |
| EA023816B1 (ru) | 2010-02-15 | 2016-07-29 | Круселл Холланд Б.В. | СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ Ad26 |
| WO2011119773A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-09-29 | Roeth Jeremiah F | Vectors conditionally expressing therapeutic proteins, host cells comprising the vectors, and uses thereof |
| WO2012021730A2 (en) | 2010-08-11 | 2012-02-16 | Genvec, Inc. | Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine |
| WO2012038367A1 (en) | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Crucell Holland B.V. | Therapeutic vaccination against active tuberculosis |
| US9168292B2 (en) | 2010-09-27 | 2015-10-27 | Crucell Holland B.V. | Heterologous prime boost vaccination regimen against malaria |
| WO2012083297A2 (en) | 2010-12-17 | 2012-06-21 | Genvec, Inc. | Adenoviral vectors with modified hexon regions |
| US8920813B2 (en) | 2010-12-20 | 2014-12-30 | Genvec, Inc. | Adenoviral vector-based dengue fever vaccine |
| WO2012092341A1 (en) | 2010-12-28 | 2012-07-05 | University Of Rochester | Methods of modifying insulin signaling using biliverdin reductase (bvr) and bvr derived peptides |
| CA2828411A1 (en) | 2011-03-04 | 2012-09-13 | Intrexon Corporation | Vectors conditionally expressing protein |
| EP2753346B1 (en) | 2011-09-07 | 2020-04-22 | Mount Sinai School Of Medicine | Ceramidase and cell differentiation |
| US8865188B2 (en) | 2011-09-09 | 2014-10-21 | Biomed Realty, L.P. | Methods and compositions for controlling assembly of viral proteins |
| US20130122038A1 (en) | 2011-11-14 | 2013-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department | Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines |
| CN104427992B (zh) | 2012-01-25 | 2017-12-19 | 德那翠丝有限公司 | 生物标志物及使用溶瘤病毒和免疫调节剂的组合疗法 |
| AU2013214776B2 (en) | 2012-02-02 | 2017-11-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenoviruses expressing heterologous tumor-associated antigens |
| JP6188728B2 (ja) | 2012-02-07 | 2017-08-30 | グローバル・バイオ・セラピューティクス・インコーポレイテッドＧｌｏｂａｌ Ｂｉｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 核酸送達の区画化方法ならびにその組成物および使用 |
| ES2582504T3 (es) | 2012-03-12 | 2016-09-13 | Crucell Holland B.V. | Lotes de adenovirus recombinantes con extremos alterados |
| US8932607B2 (en) | 2012-03-12 | 2015-01-13 | Crucell Holland B.V. | Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends |
| US9125870B2 (en) | 2012-03-22 | 2015-09-08 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against RSV |
| WO2013139911A1 (en) | 2012-03-22 | 2013-09-26 | Crucell Holland B.V. | Vaccine against rsv |
| US9790519B2 (en) | 2012-05-29 | 2017-10-17 | Genvec, Inc. | Modified serotype 28 adenoviral vectors |
| EP2908853B1 (en) | 2012-10-21 | 2018-12-05 | University Of Rochester | Thy1 (cd90) as a therapy to control adipose tissue accumulation |
| AU2014236207B2 (en) | 2013-03-14 | 2019-05-23 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions |
| EP2992112B1 (en) | 2013-04-22 | 2020-06-03 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Mutations in pdgfrb and notch3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis |
| SMT201900138T1 (it) | 2013-04-25 | 2019-05-10 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Polipeptidi f di rsv pre-fusione solubili stabilizzati |
| WO2014202570A1 (en) | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Crucell Holland B.V. | Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides |
| WO2015021443A1 (en) | 2013-08-08 | 2015-02-12 | Global Bio Therapeutics Usa, Inc. | Clamp device for minimally invasive procedures and uses thereof |
| MX366880B (es) | 2013-08-08 | 2019-07-29 | Global Bio Therapeutics Inc | Dispositivo de inyección para procedimientos mínimamente invasivos y usos del mismo. |
| HUE041791T2 (hu) | 2013-09-19 | 2019-05-28 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Javított adenovírus-készítmények |
| WO2016037165A1 (en) | 2014-09-07 | 2016-03-10 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating exon skipping anti-viral transfer vector immune responses |
| TWI710635B (zh) | 2014-10-09 | 2020-11-21 | 美商珍維克公司 | 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體 |
| PL3215187T3 (pl) | 2014-11-04 | 2019-04-30 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Szczepionki terapeutyczne HPV16 |
| PL3271729T3 (pl) | 2015-03-18 | 2021-05-04 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Oznaczenia systemów ekspresji rekombinowanej |
| AU2016249798B2 (en) | 2015-04-14 | 2022-05-26 | Janssen Vaccines And Prevention B.V. | Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter |
| WO2017005844A1 (en) | 2015-07-07 | 2017-01-12 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccine against rsv |
| KR20180026734A (ko) | 2015-07-07 | 2018-03-13 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 가용성 융합-전 rsv f 폴리펩티드 |
| AU2016309743B2 (en) | 2015-08-20 | 2019-02-07 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Therapeutic HPV18 vaccines |
| KR20180061264A (ko) | 2015-10-06 | 2018-06-07 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 플라스틱으로 인한 생물학적 약제 분해를 방지하는 방법 |
| EP3371211B1 (en) | 2015-11-04 | 2025-01-01 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Rho-associated protein kinase ("rock") inhibitor for treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment |
| EP3390428B1 (en) | 2016-02-23 | 2019-09-25 | Salk Institute for Biological Studies | High throughput assay for measuring adenovirus replication kinetics |
| WO2017147269A1 (en) | 2016-02-23 | 2017-08-31 | Salk Institute For Biological Studies | Exogenous gene expression in therapeutic adenovirus for minimal impact on viral kinetics |
| EA039095B1 (ru) | 2016-04-05 | 2021-12-03 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Стабилизированные растворимые f-белки rsv до слияния |
| CN109069612A (zh) | 2016-04-05 | 2018-12-21 | 扬森疫苗与预防公司 | 针对rsv的疫苗 |
| EP3448881B1 (en) | 2016-04-26 | 2023-06-07 | Icahn School of Medicine at Mount Sinai | Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment |
| JP7053491B2 (ja) | 2016-05-02 | 2022-04-12 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 治療用ｈｐｖワクチン組み合わせ |
| US11473105B2 (en) | 2016-05-12 | 2022-10-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| KR102421049B1 (ko) | 2016-05-30 | 2022-07-15 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 안정화된 융합-전 rsv f 단백질 |
| US11001858B2 (en) | 2016-06-20 | 2021-05-11 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and balanced bidirectional promoter |
| US10744196B2 (en) | 2016-07-14 | 2020-08-18 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | HPV vaccines |
| MA45996A (fr) | 2016-08-16 | 2021-06-02 | Bluebird Bio Inc | Variants d'endonucléase de homing du récepteur alpha de l'il-10, compositions et méthodes d'utilisation associées |
| MA46059A (fr) | 2016-08-23 | 2019-07-03 | Bluebird Bio Inc | Variants de l'endonucléase homing tim3, compositions et procédés d'utilisation |
| JP7356346B2 (ja) | 2016-09-08 | 2023-10-04 | ２セブンティ バイオ インコーポレイテッド | Ｐｄ－１ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、組成物、および使用方法 |
| US11155832B2 (en) | 2016-09-30 | 2021-10-26 | Genvec, Inc. | Adenovectors for delivery of therapeutic genetic material into T cells |
| EP3526334A4 (en) | 2016-10-17 | 2020-09-30 | Bluebird Bio, Inc. | TGFBETA R2 ENDONUCLEASE VARIANTS, COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
| ES2977435T3 (es) | 2016-11-17 | 2024-08-23 | 2Seventy Bio Inc | Conversor de señal de TGF BETA |
| WO2018111767A1 (en) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Salk Institute For Biological Studies | Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof |
| EP3565572A1 (en) | 2017-01-07 | 2019-11-13 | Selecta Biosciences, Inc. | Patterned dosing of immunosuppressants coupled to synthetic nanocarriers |
| CA3053212C (en) | 2017-02-09 | 2021-04-13 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Potent and short promoter for expression of heterologous genes |
| WO2018152325A1 (en) | 2017-02-15 | 2018-08-23 | Bluebird Bio, Inc. | Donor repair templates multiplex genome editing |
| US11566045B2 (en) * | 2017-03-14 | 2023-01-31 | Zhejiang Fonow Medicine Co., Ltd | Tumor targeting polypeptide and method of use thereof |
| ES3001108T3 (es) | 2017-03-30 | 2025-03-04 | Univ Queensland | Moléculas quiméricas y usos de las mismas |
| US11229692B2 (en) | 2017-05-17 | 2022-01-25 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Methods and compositions for inducing protective immunity against RSV infection |
| IL270776B2 (en) | 2017-05-25 | 2024-11-01 | Bluebird Bio Inc | Cblb endonuclease variants, compositions, and methods of use |
| KR20200053518A (ko) | 2017-09-15 | 2020-05-18 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | Rsv에 대한 면역의 안전한 유도를 위한 방법 |
| EP3687565A1 (en) | 2017-09-27 | 2020-08-05 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Methods of improving cardiovascular function and treating cardiovascular disease using a recombinant ectonucleotide pyrophosphatase phosphodiesterase (npp1) |
| US11779654B2 (en) | 2017-10-04 | 2023-10-10 | 2Seventy Bio, Inc. | PCSK9 endonuclease variants, compositions, and methods of use |
| KR20200086670A (ko) | 2017-10-13 | 2020-07-17 | 셀렉타 바이오사이언시즈, 인크. | 항바이러스 전달 벡터 IgM 반응을 약화시키기 위한 방법 및 조성물 |
| KR102755022B1 (ko) | 2017-10-31 | 2025-01-20 | 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. | 아데노바이러스 벡터 및 이의 용도 |
| US11236361B2 (en) | 2017-10-31 | 2022-02-01 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Adenovirus and uses thereof |
| EA202091104A1 (ru) | 2017-10-31 | 2020-08-12 | Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. | Аденовирус и пути его применения |
| CN111295391B (zh) | 2017-10-31 | 2023-12-05 | 扬森疫苗与预防公司 | 腺病毒及其用途 |
| SMT202200354T1 (it) | 2018-01-23 | 2022-09-14 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vaccino per virus dell'influenza e suoi usi |
| AU2019225251A1 (en) | 2018-02-26 | 2020-10-15 | AnTolRx, Inc. | Tolerogenic liposomes and methods of use thereof |
| BR112020018354A2 (pt) | 2018-03-16 | 2020-12-29 | Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Aumento de fornecimento gênico específico a tecido através de modificação de capsídeo |
| AU2019251356B2 (en) | 2018-04-09 | 2025-06-12 | Salk Institute For Biological Studies | Oncolytic adenovirus compositions with enhanced replication properties |
| EP3806903B1 (en) | 2018-06-14 | 2024-02-14 | 2seventy bio, Inc. | Cd79a chimeric antigen receptors |
| WO2020072059A1 (en) | 2018-10-04 | 2020-04-09 | Bluebird Bio, Inc. | Cblb endonuclease variants, compositions, and methods of use |
| JOP20210106A1 (ar) | 2018-11-13 | 2023-01-30 | Janssen Vaccines And Prevention B V | بروتينات rsv f سابقة الاندماج مستقرة |
| CN113329760A (zh) | 2018-12-10 | 2021-08-31 | 蓝鸟生物公司 | 归巢核酸内切酶变体 |
| TWI852977B (zh) | 2019-01-10 | 2024-08-21 | 美商健生生物科技公司 | 前列腺新抗原及其用途 |
| JP2022521268A (ja) | 2019-02-21 | 2022-04-06 | アンリーシュ イミュノ オンカリティクス，インコーポレイテッド | 腫瘍溶解性アデノウイルスベクター及び使用法 |
| JP2022530439A (ja) | 2019-04-25 | 2022-06-29 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー | 組換えインフルエンザ抗原 |
| MX2021013163A (es) | 2019-04-28 | 2022-02-21 | Selecta Biosciences Inc | Métodos para el tratamiento de sujetos con inmunidad preexistente a vectores de transferencia viral. |
| EP3969044A1 (en) | 2019-05-15 | 2022-03-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Co-administration of seasonal influenza vaccine and an adenovirus based respiratory syncytial virus vaccine |
| US20220193219A1 (en) | 2019-05-15 | 2022-06-23 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Prophylactic treatment of respiratory syncytial virus infection with an adenovirus based vaccine |
| CN114206396A (zh) | 2019-05-28 | 2022-03-18 | 西莱克塔生物科技公司 | 用于减弱抗病毒转移载体免疫应答的方法和组合物 |
| US20230250135A1 (en) | 2019-09-05 | 2023-08-10 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Influenza virus vaccines and uses thereof |
| AU2020358474A1 (en) | 2019-10-03 | 2022-04-07 | Batavia Biosciences B.V. | Adenovirus vectors and uses thereof |
| KR20220076510A (ko) | 2019-10-08 | 2022-06-08 | 트러스티스 오브 보스톤 칼리지 | 다수의 서로 다른 비천연 아미노산을 함유하는 단백질 및 이러한 단백질의 제조 및 사용 방법 |
| NZ789387A (en) | 2019-11-18 | 2025-06-27 | Janssen Biotech Inc | Vaccines based on mutant calr and jak2 and their uses |
| JP2023506768A (ja) | 2019-12-12 | 2023-02-20 | ティン セラピューティックス エルエルシー | 聴覚損失の予防及び治療のための組成物及び方法 |
| TW202144388A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在卵巢癌中表現之新抗原及其用途 |
| TW202144389A (zh) | 2020-02-14 | 2021-12-01 | 美商健生生物科技公司 | 在多發性骨髓瘤中表現之新抗原及其用途 |
| WO2022074464A2 (en) | 2020-03-05 | 2022-04-14 | Neotx Therapeutics Ltd. | Methods and compositions for treating cancer with immune cells |
| TW202204383A (zh) | 2020-04-10 | 2022-02-01 | 美商碩拿生物科學有限責任公司 | 用於治療蛋白質聚集病症之組合物及方法 |
| WO2021209897A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Janssen Biotech, Inc. | Psma and steap1 vaccines and their uses |
| MX2022013288A (es) | 2020-04-28 | 2023-02-22 | Sola Biosciences Llc | Composiciones y metodos para el tratamiento de proteinopatias por la proteina 43 de union a acido desoxirribonucleico (adn) de respuesta transactiva (tdp-43). |
| EP4161953A1 (en) | 2020-06-05 | 2023-04-12 | SOLA Biosciences LLC | Compositions and methods for the treatment of synucleinopathies |
| MX2022015772A (es) | 2020-06-09 | 2023-05-19 | Inozyme Pharma Inc | Proteínas enpp1 o enpp3 solubles y sus usos. |
| EP4176087A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-05-10 | Janssen Biotech, Inc. | A method for determining responsiveness to prostate cancer treatment |
| US12295997B2 (en) | 2020-07-06 | 2025-05-13 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate neoantigens and their uses |
| US20230024133A1 (en) | 2020-07-06 | 2023-01-26 | Janssen Biotech, Inc. | Prostate Neoantigens And Their Uses |
| EP4232462A1 (en) | 2020-10-26 | 2023-08-30 | SOLA Biosciences LLC | Compositions and methods for the treatment of alzheimer's disease |
| IL309957A (en) | 2021-07-14 | 2024-03-01 | 2Seventy Bio Inc | Engineered t cell receptors fused to binding domains from antibodies |
| US20240400626A1 (en) | 2021-10-08 | 2024-12-05 | Sola Biosciences Llc | Compositions and methods for the treatment of p53-mediated cancers |
| EP4413024A2 (en) | 2021-10-08 | 2024-08-14 | SOLA Biosciences LLC | Compositions and methods for the treatment of proteopathies |
| US20230141563A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-05-11 | Selecta Biosciences, Inc. | Methods and compositions for attenuating anti-viral transfer vector igm responses |
| WO2023172624A1 (en) | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Selecta Biosciences, Inc. | Immunosuppressants in combination with anti-igm agents and related dosing |
| IL316032A (en) | 2022-04-08 | 2024-11-01 | Regeneron Pharma | Multicomponent receptor and signaling complexes |
| EP4338727A1 (en) | 2022-09-14 | 2024-03-20 | Roquette Freres | Adenovirus formulations |
| WO2024233783A1 (en) | 2023-05-09 | 2024-11-14 | Cornell University | Expression cassette coding for vascular endothelial growth factor |
| WO2025153530A1 (en) | 2024-01-16 | 2025-07-24 | Novo Nordisk A/S | Albumin-targeted endonucleases, compositions, and methods of use |
| WO2025158316A1 (en) | 2024-01-26 | 2025-07-31 | Janssen Biotech, Inc. | Ovarian neoantigens and use thereof |
Family Cites Families (82)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4593002A (en) * | 1982-01-11 | 1986-06-03 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Viruses with recombinant surface proteins |
| US4487829A (en) * | 1982-03-23 | 1984-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Production and use of monoclonal antibodies against adenoviruses |
| US4578079A (en) * | 1982-08-04 | 1986-03-25 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
| US4589881A (en) * | 1982-08-04 | 1986-05-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4517686A (en) * | 1982-08-04 | 1985-05-21 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4792525A (en) * | 1982-08-04 | 1988-12-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| FR2602790B1 (fr) * | 1986-08-13 | 1990-06-01 | Transgene Sa | Expression d'un antigene specifique de tumeur par un virus vecteur recombinant et utilisation de celui-ci pour le traitement preventif ou curatif de la tumeur correspondante |
| EP0273085A1 (en) | 1986-12-29 | 1988-07-06 | IntraCel Corporation | A method for internalizing nucleic acids into eukaryotic cells |
| US5166320A (en) * | 1987-04-22 | 1992-11-24 | University Of Connecticut | Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells |
| US4956281A (en) * | 1987-06-03 | 1990-09-11 | Biogen, Inc. | DNA sequences, recombinant DNA molecules and processes for producing lymphocyte function associated antigen-3 |
| US5024939A (en) * | 1987-07-09 | 1991-06-18 | Genentech, Inc. | Transient expression system for producing recombinant protein |
| US5674722A (en) * | 1987-12-11 | 1997-10-07 | Somatix Therapy Corporation | Genetic modification of endothelial cells |
| US5672344A (en) * | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| US5223409A (en) * | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
| JP2646013B2 (ja) * | 1988-09-14 | 1997-08-25 | 株式会社ジャパンエナジー | 抗ウイルス剤 |
| US5204445A (en) * | 1988-10-03 | 1993-04-20 | The Scripps Research Institute | Peptides and antibodies that inhibit integrin-ligand binding |
| US5096815A (en) * | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
| US5198346A (en) * | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
| JPH04504361A (ja) * | 1989-04-05 | 1992-08-06 | ノバセル コーポレイション | 感染性標的化複製―欠陥ビリオン |
| US5223394A (en) * | 1989-04-10 | 1993-06-29 | Biogen, Inc. | Recombinant dna molecule comprising lymphocyte function-associated antigen 3 phosphatidylinositol linkage signal sequence |
| WO1991000360A1 (en) * | 1989-06-29 | 1991-01-10 | Medarex, Inc. | Bispecific reagents for aids therapy |
| US5240846A (en) * | 1989-08-22 | 1993-08-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Gene therapy vector for cystic fibrosis |
| US5332567A (en) * | 1989-08-24 | 1994-07-26 | Immunomedics | Detection and treatment of infections with immunoconjugates |
| US5436146A (en) * | 1989-09-07 | 1995-07-25 | The Trustees Of Princeton University | Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors |
| CA2067244C (en) * | 1989-10-20 | 2000-12-19 | Li Shen | Monoclonal antibody specific for iga receptor |
| JP3360108B2 (ja) * | 1989-10-20 | 2002-12-24 | メダレックス インク． | 二つのエフェクター機能を有する二元特異性異種抗体 |
| AU7906691A (en) * | 1990-05-23 | 1991-12-10 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
| US5349053A (en) * | 1990-06-01 | 1994-09-20 | Protein Design Labs, Inc. | Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses |
| US5246921A (en) * | 1990-06-26 | 1993-09-21 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Method for treating leukemias |
| GB2246779B (en) * | 1990-08-03 | 1994-08-17 | Delta Biotechnology Ltd | Tumour-associated protease inhibitors targeted to tumour cells |
| JPH07500961A (ja) * | 1990-10-01 | 1995-02-02 | ユニバーシティ オブ コネチカット | 細胞による選択的内在化を目的としたウイルス及び細胞の標的設定 |
| GB9101550D0 (en) * | 1991-01-24 | 1991-03-06 | Mastico Robert A | Antigen-presenting chimaeric protein |
| CA2115742A1 (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-04 | Ronald G. Crystal | Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract |
| FR2681786A1 (fr) * | 1991-09-27 | 1993-04-02 | Centre Nat Rech Scient | Vecteurs recombinants d'origine virale, leur procede d'obtention et leur utilisation pour l'expression de polypeptides dans des cellules musculaires. |
| NZ244306A (en) * | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
| US5521291A (en) * | 1991-09-30 | 1996-05-28 | Boehringer Ingelheim International, Gmbh | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
| IL103059A0 (en) * | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
| SE503225C2 (sv) * | 1991-10-30 | 1996-04-22 | Leif Lindholm Konsult Ab | Virus-antikroppskomplex för införing av virus i mammalieceller |
| US5661133B1 (en) * | 1991-11-12 | 1999-06-01 | Univ Michigan | Collateral blood vessel formation in cardiac muscle by injecting a dna sequence encoding an angiogenic protein |
| WO1993025234A1 (en) * | 1992-06-08 | 1993-12-23 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for targeting specific tissue |
| US5723287A (en) * | 1992-09-22 | 1998-03-03 | Medical Research Council | Recombinant viruses displaying a nonviral polypeptide on their external surface |
| JPH08501686A (ja) * | 1992-09-25 | 1996-02-27 | ローン−プーラン・ロレ・ソシエテ・アノニム | 中枢神経系、特に脳における細胞への外来遺伝子の転移のためのアデノウィルスベクター |
| GB9223084D0 (en) * | 1992-11-04 | 1992-12-16 | Imp Cancer Res Tech | Compounds to target cells |
| JPH08506008A (ja) * | 1992-11-18 | 1996-07-02 | アーチ ディベロプメント コーポレイション | 心筋及び血管平滑筋へのアデノウィルス介在遺伝子移入 |
| GB9300686D0 (en) * | 1993-01-15 | 1993-03-03 | Imp Cancer Res Tech | Compounds for targeting |
| WO1994017832A1 (en) * | 1993-02-09 | 1994-08-18 | The Scripps Research Institute | Targeting and delivery of genes and antiviral agents into cells by the adenovirus penton |
| DE4311651A1 (de) * | 1993-04-08 | 1994-10-13 | Boehringer Ingelheim Int | Virus für den Transport von Fremd-DNA in höhere eukaryotische Zellen |
| PT698109E (pt) * | 1993-05-10 | 2002-12-31 | Univ Michigan | Transferencia de genes para dentro de celulas epiteliais pancreaticas |
| US5543328A (en) * | 1993-08-13 | 1996-08-06 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having modified fiber proteins |
| WO1995006745A1 (de) * | 1993-09-03 | 1995-03-09 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Vektor für leber-gentherapie |
| US5552311A (en) * | 1993-09-14 | 1996-09-03 | University Of Alabama At Birmingham Research Foundation | Purine nucleoside phosphorylase gene therapy for human malignancy |
| US5534423A (en) * | 1993-10-08 | 1996-07-09 | Regents Of The University Of Michigan | Methods of increasing rates of infection by directing motion of vectors |
| FR2712812B1 (fr) * | 1993-11-23 | 1996-02-09 | Centre Nat Rech Scient | Composition pour la production de produits thérapeutiques in vivo. |
| IT1271461B (it) * | 1993-12-01 | 1997-05-28 | Menarini Ricerche Sud Spa | Anticorpo monoclonale bispecifico anti-cd3/anti-egfr,processo per la produzione e suo uso. |
| US5443953A (en) * | 1993-12-08 | 1995-08-22 | Immunomedics, Inc. | Preparation and use of immunoconjugates |
| US5928944A (en) * | 1994-02-04 | 1999-07-27 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method of adenoviral-medicated cell transfection |
| US6312699B1 (en) * | 1994-03-28 | 2001-11-06 | Uab Research Foundation | Ligands added to adenovirus fiber |
| US7252989B1 (en) * | 1994-04-04 | 2007-08-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Adenovirus supervector system |
| EP0759087B1 (en) * | 1994-05-13 | 2001-03-28 | Chiron Corporation | Compositions and methods for targeting gene delivery vehicles |
| US5571531A (en) * | 1994-05-18 | 1996-11-05 | Mcmaster University | Microparticle delivery system with a functionalized silicone bonded to the matrix |
| FR2721943B1 (fr) * | 1994-06-29 | 1996-08-02 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Adenovirus comprenant un gene codant pour une superoxyde dismutase |
| US5962311A (en) * | 1994-09-08 | 1999-10-05 | Genvec, Inc. | Short-shafted adenoviral fiber and its use |
| US5846782A (en) * | 1995-11-28 | 1998-12-08 | Genvec, Inc. | Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs |
| US5559099A (en) * | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| EP0779923A2 (en) * | 1994-09-09 | 1997-06-25 | Neurocrine Biosciences, Inc. | Interleukin-1 type 3 receptors |
| FR2724846B1 (fr) * | 1994-09-27 | 1996-12-20 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Methode de traitement des cancers par regulation de l'activite des proteines ras |
| EP0787200B1 (en) * | 1994-10-28 | 2005-04-20 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Improved adenovirus and methods of use thereof |
| WO1996014837A1 (en) * | 1994-11-09 | 1996-05-23 | Genetic Therapy, Inc. | Gene therapy for hypercholesterolemia |
| WO1996017073A1 (fr) * | 1994-11-29 | 1996-06-06 | Takara Shuzo Co., Ltd. | Procede pour la production de cellules transformees |
| FR2727867B1 (fr) * | 1994-12-13 | 1997-01-31 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux |
| US6127525A (en) * | 1995-02-21 | 2000-10-03 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral coat protein and methods of using same |
| US5770442A (en) * | 1995-02-21 | 1998-06-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Chimeric adenoviral fiber protein and methods of using same |
| US5622699A (en) * | 1995-09-11 | 1997-04-22 | La Jolla Cancer Research Foundation | Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo |
| EA199800475A1 (ru) * | 1995-11-28 | 1998-12-24 | Дженвек, Инк. | Векторы и способы для переноса генов в клетки |
| EP0880596A1 (en) * | 1995-12-28 | 1998-12-02 | Chiron Corporation | Receptor specific chimeric viral surface polypeptides for viral and particle incorporation and internalization in target cells |
| WO1997038723A1 (en) * | 1996-04-16 | 1997-10-23 | Immusol Incorporated | Targeted viral vectors |
| US6210921B1 (en) * | 1996-09-13 | 2001-04-03 | Robert W. Finberg | CAR: a novel coxsackievirus and adenovirus receptor |
| ATE420182T1 (de) * | 1996-09-25 | 2009-01-15 | Scripps Research Inst | Verpackungszellinien in der verwendung zur erleichterung der entwicklung hocheffizienter adenoviraler vektoren |
| US5877011A (en) * | 1996-11-20 | 1999-03-02 | Genzyme Corporation | Chimeric adenoviral vectors |
| US5922315A (en) * | 1997-01-24 | 1999-07-13 | Genetic Therapy, Inc. | Adenoviruses having altered hexon proteins |
| US6407200B1 (en) | 2001-06-21 | 2002-06-18 | General Electric Company | Method of preparing a poly(arylene ether), and a poly(arylene ether) prepared thereby |
-
1996
- 1996-08-21 US US08/701,124 patent/US5846782A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-27 HU HU0001120A patent/HUP0001120A2/hu unknown
-
1997
- 1997-08-21 AT AT97938497T patent/ATE382695T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-08-21 AU AU40804/97A patent/AU732770B2/en not_active Ceased
- 1997-08-21 DE DE69738432T patent/DE69738432T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1997-08-21 WO PCT/US1997/014719 patent/WO1998007865A1/en active IP Right Grant
- 1997-08-21 CA CA002263140A patent/CA2263140A1/en not_active Abandoned
- 1997-08-21 JP JP51096198A patent/JP2001503250A/ja not_active Ceased
- 1997-08-21 EP EP97938497A patent/EP0920514B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-06 US US09/130,225 patent/US6057155A/en not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-12-06 US US09/455,061 patent/US6329190B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-10-01 US US09/969,192 patent/US6649407B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1998007865A1 (en) | 1998-02-26 |
| JP2001503250A (ja) | 2001-03-13 |
| US5846782A (en) | 1998-12-08 |
| US6329190B1 (en) | 2001-12-11 |
| DE69738432T2 (de) | 2008-12-11 |
| AU732770B2 (en) | 2001-04-26 |
| US6649407B2 (en) | 2003-11-18 |
| US20020151027A1 (en) | 2002-10-17 |
| EP0920514A1 (en) | 1999-06-09 |
| EP0920514B1 (en) | 2008-01-02 |
| DE69738432D1 (de) | 2008-02-14 |
| AU4080497A (en) | 1998-03-06 |
| CA2263140A1 (en) | 1998-02-26 |
| US6057155A (en) | 2000-05-02 |
| ATE382695T1 (de) | 2008-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUP0001120A2 (en) | Vectors and methods for gene transfer to cells | |
| AU724189B2 (en) | Vectors and methods for gene transfer to cells | |
| US6465253B1 (en) | Vectors and methods for gene transfer to cells | |
| US5965541A (en) | Vectors and methods for gene transfer to cells | |
| ES2246533T3 (es) | Fibra adenovirica modificada y adenovirus dianas. | |
| US7235233B2 (en) | Serotype 5 adenoviral vectors with chimeric fibers for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts | |
| WO2000040740A2 (en) | Gene therapy to promote angiogenesis | |
| US20030049843A1 (en) | Gene delivery vectors with cell type specificity for mesenchymal stem cells | |
| EP1446479B1 (en) | Recombinant adenovirus with enhanced therapeutic effect and pharmaceutical composition comprising said recombinant adenovirus | |
| WO2007148148A1 (en) | Inhibition of the liver tropism of adenoviral vectors | |
| EP1325145B1 (en) | Adenoviral vectors for gene delivery in skeletal muscle cells or myoblasts | |
| EP1016727A1 (en) | Gene therapy to promote angiogenesis. | |
| EP1195440A1 (en) | Gene delivery vectors for stem cells | |
| JP2003514577A (ja) | 改変アデノウイルス繊維および使用 | |
| EP1279738A1 (en) | Gene delivery vectors with cell type specificity for mesenchymal stem cells | |
| MXPA98004203A (en) | Vectors and methods for gene transfer acelu | |
| WO2002029073A2 (en) | Gene delivery vectors for stem cells |