HUP0100776A2 - Gyulladásos sejtek önszabályzott apoptózisa génterápiával - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya új terápiás eljárás, amelyben gyulladásosrendellenességet kezelnek emlős páciensben apoptózis szelektívindukálásával a páciens gyulladásos, TNFa-t termelni képes sejtjeibenvagy a gyulladás helyén lévő sejtjeiben úgy, hogy a sejtekbe bevisznekegy egyedi, önszabályzó kiméra nukleinsav-molekulát, amely TNFa-promóterenhanszer-régióhoz kapcsolt TNFa-promóter (TNFp)) általvezérelt, apoptózist-indukáló génként (AIG) Granzyme-B-fehérjét kódolónukleinsavszekvenciát tartalmaz, amely viszont továbbá 3'UTR-nukleinsavszekvenciához van kapcsolva. A találmány tárgya ilyen kiméranukleinsav-konstrukciók előállítására szolgáló eljárások kidolgozása,alkalmazásuk és azokat tartalmazó készítmények előállítása. Agyulladásos rendellenességet úgy kezelik, hogy ilyen kezelésre szorulópáciensnek beadnak találmány szerinti kiméra nukleinsavmolekulátgyógyászatilag hatásos mennyiségben tartalmazó készítményt. Atalálmány tárgya továbbá eljárás apoptózis indukálása TNF -AIG kiméranukleinsavval transzfektált sejtekben, TNFa-t nem termelő, szomatikussejt-variánsok in vitro szelekciójára egy sejtpopulációban, TNFa-t nemtermelő populáció kialakulásáért felelős, domináns negatív/dominánsszupresszív gének azonosítására, valamint TNFa-termelés szabályzásáértfelelős termékek azonosítására. Ó

Description

7.Q . 9.52/BE 'pűíOC436_s^_{G sk} KÖZZÉTÉTELI

Szabadalmi Iroda PÉLDÁNY

H-1062 Budapest. Andrássy ύΐ 113. Telefon: 34-24-950, Fax; 34-24-323

Gyulladásos sejtek önszabályzott apoptózisa génterápiával

A találmány tárgya a molekuláris biológia és az immunológia szakterületére vonatkozik. Pontosabban a találmány tárgya apoptózis indukálása gyulladásos sejtekben úgy, hogy beviszünk apoptózist (programozott sejtpusztulást vagy nem-nekrotikus sejtpusztulást) indukálni képes géneket ezekbe a sejtekbe.

Sok gyulladásos állapotban citokinek, például IL-1, IL-10,

GM-CSF és TNFa túltermelődnek gyulladásos sejtek tömeges aggregációjának és felhalmozódásának eredményeként [Brennan F. M. et al., British Medical Bulletin 51/2, 368-384 (1995)] . Citokinek túlszabályzása és/vagy szabályozatlansága gyulladt szövetben közvetlenül vagy közvetve felelős lehet krónikus gyulladásos betegségek súlyosbodásáért. Például a legszembetűnőbb patológia reumatoid artritiszben (RA) a gyulladás lokális helyén jelenik meg (azaz a szinoviális ízületeknél) . Ennélfogva valószínű, hogy RA-ban szenvedő páciensek szinoviális ízületeiben termelődő citokinek fontos szerepet játszanak a betegség folyamatában. Ezen citokinek közül, feltételezések szerint az IL-1 és a TNFa felelős az RA-t jellemző porcpusztulásért és csonterózióért [ Dayer J.M. et al., J. Exp. Med. 165, 1208-1215 (1985); Gowen M. et al., Nature 306, 378-380 (1983)] . Kimutatták, hogy fokozott mennyiségű IL-1 és TNF jelenléte a szinoviális ízületekben felgyorsítja a kollagén-indukált artritisz kifejlődését rágcsálókban [Brennan F.M. et al., Clin. Expt. Immunoi. 97/1, 1-3 (1994)] .

Az apoptózis alapvető fiziológiai folyamat az embrionális fejlődésben és a szövet-homeosztázis fenntartásában [Raff, M.C.,

Nature 356, 397 (1992); Vaux, D.L. et al., Cell 76, 777 (1994)] . Ebben a döntő fontosságú természetes folyamatban fennálló összeférhetetlenség különféle neopláziás, neurodegeneratív és autoimmun betegségeket eredményez [Thompson, C. B., Science 267, 1456 (1995)] . A jellemző biokémiai folyamatok, például a szignáltranszdukciós kaszkád viszonylag összetettek és még nem teljesen értjük azokat. Különféle stimulusok, például specifikus receptorok (például TNFR1 vagy Fás) aktiválódása olyan evolúciósán konzervatív végrehajtó mechanizmust indítanak el, amelyek számos jeltovábbító folyamatsort magukban foglalva, összehangoltan celluláris pusztulást okoznak [ Ashkenazi, A. és Dixit, V. M., Science 181, 1305 (1998)] .

Granzyme-B egy szerinproteáz, amely elsősorban citotoxikus Tlimfociták és természetes killer-sejtek citoplazmatikus granulumaiban található. Granzyme-B fontos szerepet játszik célsejtekben való apoptotikus változások indukálásában citotoxikus, sejt-közvetített pusztítás útján [Huesel J. W. et al., Cell 7 6, 977-987 (1994); Shi, L. et al. , J. Exp. Med. 176, 1521-1529 (1992)], részben néhány kaszpáz hasításának katalizálásában és aktiválásában [ Salvesen, G. S. és Dixit, V. M., Cell 91, 443-446 (1997)], valamint kaszpázoktól független folyamatsorokban [Andrade, F. et al., Immunity 8, 451-460 (1998)] . Strukturálisan a Granzyme-B olyan polipeptidként termelődik, amely egy vezetőpeptidet tartalmaz, inaktiváló dipeptiddel (Gly-Glu) elválasztva az aktív Granzyme-B-polipeptidtől. A kaszpázokhoz hasonlóan, a Granzyme-B aszparaginsavnál képes specifikusan szubsztrátokat felismerni hasításra.

68.670/BE

A TNFa olyan citokin, amelyet főleg monociták, makrofágok és limfociták szintetizálnak aktiválásra adott válaszként. Expreszszióját szabályzó klasszikus elemek a proximális vagy disztális promóterrégióban helyezkednek el (összefoglaló irodalomként lásd: Pauli, U. , Critical Rev. in Eukaryotic Gene Expression 4, 323-344 (1994) . Az alábbiakban összefoglaljuk azokat a régiókat, amelyek közlemények szerint szignifikáns szerepet játszanak a TNFa-promóter aktivitásában:

a) TNFa-reszponzív elemek, amelyekről kimutatták, hogy a -100. és -125, bázispárok között helyezkednek el. A -108. és -101. bázispárok közötti régió TGAGCTTCA-palindromot tartalmaz, amely hasonló az ΆΡ-1-szekvenciához, amely PMA-reszponziv elemeket tartalmaz. Több kópia -125. és -85. bázispárok közötti szekvencia 7-11-szeres indukciót eredményez a riportergén expreszsziójában [ Leitman, D. et al., J. Biol. Chem. 266, 9343 (1991)] .

b) PMA-reszponziv elemekről kimutatták, hogy a -101. és -286. bázispárok között vannak jelen [Hensel, G. et al., Lymphokine Rés. 8, 347 (1989)] .

c) Anti-CD3 antitesttel indukált (valamint Ca-ionoforral indukált) reszponziv elemekről kimutatták, hogy a -118. és -80. bázispárok között helyezkednek el. A KappaB3-szekvencia (GGGTTTCTCC) ebben a régióban helyezkedik el, amelynek nagy jelentősége van a TNFa-promóter Ca-ionofór általi, CsA-szenzitiv aktiválásához. Ezekről az elemekről feltételezték, hogy saját promóterükkel együtt képesek optimálisan működni [Goldfield et al., J. Exp. Med . 178, 1356 (1993)] .

d) U937-sejtekben a PMA-reszponziv elemek a -95. és -36.

68.670/BE bázispárok között helyezkednek el, és a cAMP-reszponziv elemeket (CRE) a -107. és -99. bázispárok közé térképezték. Ez a régió nem reszponzív PMA-ra [ Economou, J. S. et al., J. Exp. Med. 17 0, 321 (1989)] .

e) Mindhárom kappaB-hely [azaz kappaBl (-587. és -577. között), kappaB2 (-210. és -202. között) és kappaB3 (-98. és -87. között)] virus-indukálható fehérjét képes kötni, bár ezen helyek deléciója nem befolyásolja a vírus-indukálhatóságot [ Goldfield, A. et al., PNAS 87, 9769 (1990)] . Továbbá kappaB-helyek deléciós mutánsaival kimutatták, hogy nem elsődleges célpontjai a humán TNFa-gén PMA-stimulációjának [Goldfield, A. et al., J. Exp. Med. 174, 73 (1991)] .

f) Rágcsálót alkalmazó rendszerben a -1059, -695 és -655 bp TNFa-promóterkonstrukciók erősen LPS-indukálhatók. Az LPS-indukálhatóság nagymértékben csökken -451 bp konstrukcióban, és tovább csökken -301 és -241 bp konstrukciókban. A TNFa-promóter -1059 bp fragmentuma csendes volt makrofágokban, és erősen expresszálódott LPS-stimuláció után. Az aktiváció legnagyobb visszaesése -695. és -655. bp között volt, amely kappaB-elemet tartalmazott rágcsálóból származó TNFa-promóterben [ Shakov, A. N. et al., J. Exp. Med. 171, 35 (1990); Drouet et al., J. Immunoi. 147, 1694 (1991)] .

A TNFa-gén 3' -végi nem-transzlálódó régiójában (3' UTR) lévő elemekről ismeretes, hogy fontosak poszttranszkripciós szabályzáshoz. A 3'UTR hatását analizálták rágcsálót alkalmazó rendszerben, ahol homológ promóterrel együtt az LPS-indukálhatóság nagyon erős volt. Rágcsálóból származó TNFa-promóterrendszert

68.670/BE alkalmazva kimutatták, hogy a 3' UTR hatékonyan gátolt CATaktivitást három nem-makrofág sejtvonalban, mégpedig HeLa-, NIH3T3- és L929-sejtvonalban. A TTATTTAT-szekvencia néhányszor ismétlődött a 3' UTR-ben, és feltételezték, hogy ez szerepet játszik a szabályzásban [ Han, J. et al., J. Immunology 146, 18431848 (1991); Crawford, F. K. et al., J. Bioi. Chem. 271, 2238322390 (1996)] .

Különféle sejtek, például aktivált makrofágok, aktivált Tsejtek, makrofágszerű szinoviociták, valamint fibroblasztszerű szinoviociták és transzformált, makrofágszerű szinoviociták (melyeket pannocitáknak is neveznek) vannak jelen a gyulladt ízületekben. A pannus-nak nevezett terjedő struktúra szinoviociták és pannociták hiperpláziás természetéből ered. A pannus kialakulását sejtek túlzott mértékű proliierációja és/vagy ezen sejtekben lévő csökkent mértékű apoptózis eredményezi. Kimutatták, hogy ezen sejtekben a proliferatív index viszonylag alacsony. Ezért a szinoviocitákban kialakuló hiperplázia a szinoviális sejtvonal apoptózisában lévő abnormalitásoknak tulajdonítható. Az apoptózis végső fázisában lévő sejtek gyakorisága a szinoviumban alacsony. Leírtak olyan p53—mutációs abnormalitásokat, amelyek rezisztenciát eredményezhetnek apoptózisra az RA szinoviális fibroblasztokban. Továbbá fokozott mennyiségű TNF α-t és ΙΕ-Ιβ-et termelnek a szinoviális szövet különféle sejttípusai a porc-pannus csatlakozási pontnál, például makrofág-vonalhoz tartozó sejtek, makrofágszerű szinoviociták, aktivált Tsejtek és valószínűleg fibroblasztszerű szinoviociták [ Chu C.Q. et al., Arthritis & Rheumatism 34, 1125-1132 (1991); Deleuran

68.670/BE

B.W. et al., Arthritis & Rheumatism 35, 1170-1178 (1992)] . Ez gyulladásos sejtek beszűrődését és több olyan gyulladást okozó citokin és faktor termelődését állandósítja, amelyek felelősek a szinoviális sejtproliferációért. A fentebb leírt gyulladásos hatásokon kívül a TNFa egyedi és kulcsfontosságú szerepet játszik különféle gyulladást megelőző eseményekben.

A TNFa IL-lp-aktivitást indukál monocitákban. Valóban kimutatták, hogy anti-TNFa semlegesítő antitestek csökkentik az öszszes IL-ip-termelést [Portillo et al., Immunoi. 66, 170-175 (1989); Brennan F. M. et al., British Medical Bulletin 51/2, 368-384 (1995)] . így tehát a gyulladást okozó TNFa-citokin hatásának blokkolásán kívül további előny az azonos mértékben destruktív, gyulladást megelőző mediátor, az IL-Ιβ termelésének csökkentése. Továbbá jól ismert, hogy a TNFa gyulladással kapcsolatos, más géneknek is transzkripciós aktivátora. Például TNFa jelenléte más citokinek (például GM-CSF) és sejtfelszíni receptorok, például II. osztályú HLA-antigének és adhéziós molekulák termelődését stimulálja [ Alvaro-Garcia J.M. et al., J. Exp. Med. 146, 865-875 (1989)], amely aktivált T-sejtek és neutrofilek folyamatos kialakulását eredményezi, amelyek ízületi gyulladást és hiperpláziát, végül a porc és csont fokozott mértékű pusztulását okozza [ Allen J.B., J. Exp. Med. 171, 231 (1990)] .

A gyulladásos rendellenességek elleni hagyományos terápia tipikusan tüneti gyulladás ellen irányul. Ilyen terápiák csak átmeneti javulást biztosítanak a betegség előrehaladásának szignifikáns késleltetése nélkül. Ezzel ellentétben, TNFa-t és más, gyulladást okozó folyamatokban indukálódó faktorokat célzó terá68.670/BE piák valószínűleg ígéretesebbek. Például· kollagén-indukált artritisz állatokban felállított modelljeiben anti-TNFa-antitest és szolubilis TNFa-receptor-IgG-kiméra hatékonyan csökkentette a lábduzzadást, ízület-, porc- és csontleépülést [Williams R.O. et al., Proc. Natl. Acad. Sci 89, 9784-9788 (1992)] . Humanizált anti-TNFa-antitesteket és TNFa-receptor-IgG kiméramolekulákat egyaránt alkalmazó, emberen végzett kísérletek drámai eredményeket hoztak [Elliot M.J. et al., Arthritis and Rheumatism 36, 1681-1690 (1993); Elliot M.J. et al., Lancet 343, 1105-1110] . Bár ezen TNF -antagonistákat alkalmazó kezelés jól tolerálhatónak tűnik, rekombináns fehérjékre specifikus antitestek termelődését is eredményezi. így ezek a terápiák nem alkalmasak hosszú távú kezelésre, és nem érik el a betegség valódi visszafejlődését.

A WO 97/07828. számú szabadalmi iratban leírtak génterápiás eljárást olyan celluláris tályogban vagy krónikus gyulladásos betegségben szenvedő páciens kezelésére, amely defektív apoptózist szabályzó gén (konkrétan p53) eredménye volt. A kezelés helyreállította a defektust olyan promóterhez kapcsolt vad típusú gén alkalmazásával, amely az apopózist szabályzó génexpreszsziót vezérli.

A betegség előrehaladásának tényleges módosítása céljából, TNFcc folyamatos bevitelére van szükség TNFa-ra specifikus terápiákkal. Ilyen folyamatosan fenntartott terápiás eljárás nem praktikus az említett biológiai ágensek alkalmazásával és nehézkessé tenné azok beadását hosszú távon.

Egy alternatív terápiás lehetőség, hogy a gyulladt ízületi hártyát sebészeti úton [Herold N. és Schroder H.A., Acta Orthop. 68.670/BE

Scand. 66, 252-254 (1995); Ogilvie-Harris D.J. és Weisleder L., Arthroscopy 11, 91-95 (1995)], kémiai eszközökkel [Cruz-Esteban C. és Wilke W.S., Bailliere's Clinical Rheumatol. 9, 787-801 (1995)] vagy besugárzással indukált synovectomiával [CruzEsteban C. és Wilke W.S., Bailliere' s Clinical Rheumatol. 9, 787-801 (1995)] eltávolítják. Az artroszkópiás sebészeti beavatkozást követő eredmények a jelentéktelen és a jó között változóak. Nem-sebészeti synovectomiát (ízületi hártya műtéti eltávolítása) különböző kémiai ágensekkel, például ozmiumsav, alkiláló ágensek, például nitrogén-mustár és tiotepa, valamint metotrexát alkalmazásával végeznek. Sajnos a nem-sebészeti synovectomiák (beleértve a kémiai és besugárzással indukáltat) eljárása bonyolult, csak rövid időre biztosítanak javulást, és az ízületi hiperpláziát egyenlőtlenül csökkentik. Továbbá a nem-sebészeti alternatív megoldások többsége potenciálisan teratogén. Ráadásul az érintett szövet kémiai károsodása nem-sebészeti synovectomiában, valamint a sebészetileg indukált szövetpusztítás gyakran maga okoz gyulladásos választ. Végül meg kell jegyezni, hogy ezek a megközelítések rendelkeznek azokkal a kockázatokkal és mellékhatásokkal, amelyek szokásos gyógyszerterápiával és behatoló sebészeti eljárásokkal együtt járnak, például a kórházi kezelés és rehabilitáció költségei és kellemetlensége.

Ennek megfelelően van igény hatékony terápiás megközelítésre gyulladásos rendellenességek kezelésére általánosságban és konkrétan RA esetén.

A találmány tárgyát TNFa-t termelő sejtek új, apoptózisindukált elpusztítására szolgáló eljárások és készítmények képe68.670/BE

zik. A találmány szerinti megoldás kidolgozása során célul tűztük ki olyan egyedi, kiméra nukleinsavmolekulák előállítását, amelyek legalább egy TNFa-promóterenhanszer-régióval [amely 4., 5., 11. vagy 12. számú (SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11 vagy SEQ ID NO: 12) nukleinsavszekvenciát tartalmaz vagy ezek konzervatív szubsztitúcióit vagy allélvariánsait] rendelkeznek TNFa-promóterhez kapcsolva, a TNFa-promóter továbbá Granzyme-Bfehérjét vagy konzervatív szubsztitúcióját kódoló nukleinsav-szekvenciához vagy allélvariánsához van kapcsolva, amely viszont továbbá 3'UTR-nukleinsavszekvenciához van kapcsolva.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során másik célul tűztünk ki TNFp-AIG és hasonló kiméra nukleinsav-konstrukciók összeállítását, azok előállítására szolgáló eljárások kidolgozását, azok alkalmazását és azokat tartalmazó készítmények előállítását .

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során továbbá célul tűztünk ki gyulladásos rendellenesség kezelésére szolgáló eljárás kidolgozását, amelyben ilyen kezelésre szoruló páciensnek beadunk találmány szerinti kiméra nukleinsavmolekulát gyógyászatilag hatásos mennyiségben tartalmazó készítményt.

A találmány szerinti megoldás kidolgozása során még további célul tűztünk ki eljárás kidolgozását apoptózis indukálására TNF α-AIG-jelű, kiméra nukleinsavval transzfektált sejtekben, eljárás kidolgozását TNFa-t nem termelő, szomatikus sejt-variánsok in vitro szelekciójára egy sejtpopulációban, eljárás kidolgozását TNFa-t nem termelő populáció kialakulásáért felelős, domináns/negatív gének azonosítására, valamint eljárás kidolgozását

68.670/BE

TNFa-termelés szabályzásáért felelős termékek azonosítására.

Ezek és más célkitűzések könnyen érthetővé válnak szakember számára a találmány szerinti megoldás alábbi részletes ismertetése alapján.

Az ábrák rövid ismertetése:

Az 1. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a találmány szerinti TNFpAIG kiméra nukleinsavat. Az apoptózist indukáló gén (AIG) a Granzyme-B.

A 2. ábrán vázlatosan ábrázoljuk a találmány szerinti TNFpAIG kiméra nukleinsavak alkalmazásával végzett génterápia eredményeit .

A 3. ábrán összefoglaljuk a TNFa-promóter indukálható ciszelemeinek azonosítására használt deléciós konstrukciókat, amelyben riporterrendszerként luciferáz-génexpressziót (Luc) alkalmazunk.

A 4.a ábrán bemutatjuk annak a reprezentatív kísérletnek eredményeit, amelyet TNFa-promóter deléciós konstruciójával vezérelt, luciferáz-génexpresszió meghatározásával hajtottunk végre tranziensen transzfektált Jurkat-sejtekben. A hisztogramok stimulációs indexnek felelnek meg, PMA aktiváló ágenssel való indukálhatóság mértékeként. Jurkat-sejtek TNFa-t termeltek PMAval való stimuláció után.

A 4.b ábrán bemutatjuk annak a reprezentatív kísérletnek eredményeit, amelyet TNFa-promóter deléciós konstruciójával vezérelt, luciferáz-génexpresszió meghatározásával hajtottunk végre tranziensen transzfektált THP-l-sejtekben. A hisztogramok stimulációs indexnek felelnek meg, LPS aktiváló ágenssel való

68.670/BE indukálhatóság mértékeként. A THP-l-sejtek TNFa-t termeltek LPSel való stimuláció után.

Az 5. ábra a TNFocpGB előállításának folyamatábrája, amelyben a TNFa-promóter és Granzyme-B kiválasztott natív elemeit alkalmazuk.

A 6. (a és b) ábrán azon reprezentatív kísérletek eredményeit foglaljuk össze, amelyeket kiméra TNFp-Granzyme-B (TNFpGB) expressziójának vizsgálatára végeztünk. Tranziensen transzfektált Jurkat-sejtekben (6.a ábra) expresszáltunk TNFpGB különböző kiónjait. Granzyme-B expressziójának mértékét Western-blot analízissel határoztuk meg, anti-Granzyme-B-antitest alkalmazásával. A transzfektált sejtekben lévő Granzyme-B-nek megfelelő sávokat nyilakkal azonosítottuk. TNFpGB kiméra nukleinsavak expresszálásával indukált apoptózist Jurkat-sejtekbe való tranziens transzfekcióval határoztuk meg (6.b ábra). Az apoptózist „Cell Death Elisa alkalmazásával határoztunk meg. Mindkét kísérletben, a bevonalkázott oszlopdiagramok nem-stimulált kontrolioknak felelnek meg, amelyben a sejteket a bemutatott, kiméra nukleinsavval transzfektáltuk és a transzfektált sejteket nem stimuláltuk PMA-val. Az üres hisztogramok PMA-val való stimulálás után, az indukált apoptózist mutatják, a kontroll transzfekciókban (-1005Luc3' UTR-el transzfektálva) vagy Granzyme-B-t expresszálni képes, kiméra nukleinsavval.

A 7. (a és b) ábrán grafikusan ábrázoljuk a találmány szerinti TNFp-AIG kiméra nukleinsavat, amely több kópia, TNFa-promóterből származó, indukálható cisz-elemet tartalmaz, amely viszont az AIG (7.a ábra) expresszióját vezérli. Grafikusan ábrá68.670/BE ♦'· ί·*. * .* zoljuk továbbá a találmány szerinti TNFpAIG kiméra nukleinsavat, amely AIG-expressziót vezérlő, több kópia indukálható TNFa-promóter-cisz-elemet tartalmaz, amelytől szintézisirányban található a TNFa-gén 3'-végi nem-transzlálódó régiója (TNF3' UTR) (7.b ábra) . A TNFa-gén 3' UTR-je szerepet játszik a TNFa indukálható expressziójának szabályzásában [ Han, J. et al., J. Immunology 146, 1843-1843 (1991); Crawford, E.K: et al. , J. Bioi. Chem. 272, 21120-21137 (1997); és 9. ábra] .

A 8. (a és b) ábra TNFa-szuperpromóter-Granzyme-B kiméra konstrukciók előállításának vázlatos folyamatábrája.

A 9. ábrán a TNF3' UTE luciferáz-riportergén indukálható expressziójára kifejtett, szabályzó hatását bemutató, két kísérlet eredményeinek összefoglalását láthatjuk. Fibroblaszt sejtvonalat tranziensen transzfektáltunk. A pontozott oszlopdiagramok TNFpLuc indukálhatóságát ábrázolják TNF3'UTR nélkül, és az üres oszlopdiagramok TNFpLuc indukálhatóságát ábrázolják TNF3' UTR jelenlétében. Hasonló eredményeket kaptunk Jurkat-sejtben.

A 10. ábrán grafikusan ábrázoljuk TNFa-t nem termelő, szomatikus sejt-variánsok szelekcióját TNFa-t termelő sejtpopulációban, és TNFa-termelésért felelős, domináns negatív szupresszív gének azonosítását.

A 11.a ábrán grafikusan ábrázoljuk a TNFa-promóter alábbi azonosított enhanszerrégióit (ER) : ERI (4. számú szekvencia), ER2 (5. számú szekvencia), ER3 (11. számú szekvencia) és ER4 (12. számú szekvencia), valamint a két kópia ER inszercióját a natív -120TNFa-promótertől szintézisiránnyal szemben.

A 11.b ábrán bemutatjuk annak a kísérletnek eredményeit, ame

68.670/BE lyet olyan natív -120TNFa-promóterrel vezérelt, luciferáz-génexpresszió meghatározásával hajtottunk végre, amely promóterhez két kópia ERI, ER2, ER3 és ER4 enhanszerrégiókat kapcsoltunk az 5'-végénél. A luciferáz-gén expresszióját vezérlő konstrukciót tranziensen transzfektáltuk Jurkat-sejtekbe. A hisztogramok stimulációs indexnek felelnek meg, PMA aktiváló ágenssel való indukálhatóság mértékeként. Jurkat-sejtek TNFa-t termeltek PMA-val való stimuláció után.

A 11.c ábrán bemutatjuk annak a kísérletnek eredményeit, amelyet olyan natív -120TNFa-promóterrel vezérelt, luciferáz-génexpresszió meghatározásával hajtottunk végre, amely promóterhez két kópia ERI, ER2, ER3 és ER4 enhanszerrégiókat kapcsoltunk az 5' -végénél. A luciferáz-gén expresszióját vezérlő konstrukciót tranziensen transzfektáltuk THP-l-sejtekbe. A hisztogramok stimulációs indexnek felelnek meg, LPS aktiváló ágenssel való indukálhatóság mértékeként. A THP-l-sejtek TNFa-t termeltek LPS-el való stimuláció után.

A 12. ábrán grafikusan ábrázoljuk a -706TNFpGB3' UTR kiméra nukleinsavszekvenciát, amelyben a promóterfragmentum szekvenciáját kisbetűvel jelöltük, a linkértragmentum szekvenciáját dőlt nagybetűvel jelöltük, a Granzyme-B-fragmentum szekvenciáját nagybetűvel jelöltük és a TNFa3' UTR-fragmentum szekvenciáját aláhúzott kisbetűvel jelöltük.

A 13. ábrán grafikusan ábrázoljuk a -1005TNFpGB3' UTR kiméra nukleinsavszekvenciát, amelyben a promóterfragmentum szekvenciáját kisbetűvel jelöltük, a linkerfragmentum szekvenciáját dőlt nagybetűvel jelöltük, a Granzyme—B—fragmentum szekvenciáját

68.670/BE nagybetűvel jelöltük és a TNFa3' UTR-fragmentum szekvenciáját aláhúzott kisbetűvel jelöltük.

A találmány leírás szerinti megoldása terápiás készítményekben alkalmazható, új, kiméra nukleinsavmolekulák biztosításával és ilyen készítmények alkalmazására szolgáló eljárások kidolgozásával legyőzi a szakterületen fennálló nehézségeket.

A leírásban a 3' UTR-rövidítés jelentése 3' -végi nem-transzlálódó régió.

Az „AIG-rövidítés apoptózist indukáló gént jelent. Az AIG közé tartozik a Granzyme-B.

A „CsA-rövidítés jelentése ciklosporin-A, amely biológiailag aktív, gomba eredetű metabolit, immunszupresszív tulajdonságokkal .

A „DN-rövidítés domináns/negatív-géntermékeket jelent, amelyek negatív hatást képesek kifejteni más gének vagy géntermékek expressziójára vagy funkciójára.

Az „ER-rövidítés jelentése enhanszerrégió, ahol ERI a 4. számú szekvenciával, ER2 az 5. számú szekvenciával, ER3 a 11. számú szekvenciával és ER4 12. számú szekvenciával rendelkezik.

Az „GB-rövidítés jelentése Granzyme-B.

A „PMA-rövidítés jelentése forbol-mirisztát-acetát.

Az „RA-rövidítés jelentése reumatoid artritisz.

A „TNFa-rövidítés jelentése alfa-tumornekrózis-faktor.

A „TNF-promóter, „TNFa-promóter és „TNFp kifejezések a leírásban egymással felcserélhetők. Hacsak az ellenkezőjét nem állítjuk, ezek a kifejezések a natív TNFa minimális promóterszekvenciának megfelelő teljes nukleotidszekvenciát jelentik, egy

68.670/BE vagy több enhanszerelemhez kapcsolva szintézisiránnyal szemben, amelyek akár természetes körülmények között, nativan jelen vannak, akár géntechnológiailag lettek módosítva laboratóriumban.

Aminosav-,, szubsztitúciókat úgy definiálunk, mint aminosavak cseréjét egy másikra. Természetes körülmények között konzervatívak, ha a szubsztituált aminosav hasonló strukturális és/vagy kémiai tulajdonságokkal rendelkezik. Konzervatív csere például leucin szubsztitúciója izoleucinnal vagy valinnal, aszpartát szubsztitúciója glutamáttal, vagy treonin szubsztitúciója szerinnel.

„Konzervatív variánsok egy polipeptidben lévő aminosavszubsztitúciókat jelentenek.

„Allélvariánsok nukleinsav- és fehérjeszinten való variációt jelentenek, konzervatív vagy nem-konzervatív szubsztitúciók következtében, amelyek ugyanannak a génnek alternatív formáját hozzák létre.

„Riporter-molekulák olyan kémiai csoportok, amelyeket nukleinsav- vagy aminosav-szekvenciák jelölésére alkalmazunk. Ilyenek lehetnek például radioaktív nuklidok, enzimek, fluoreszcens, kemilumineszcens vagy kromogén ágensek. A riportermolekulák adott nukleinsav- vagy aminosav-szekvenciával asszociáltak, azok jelenlétét jelzik, és lehetővé teszik azok mérését.

„Riportergének funkcionális fehérjét, például luciferázt kódoló nukleinsavakat és fragmentumaikat jelentik, amelyeket heterológ promóterek aktivitásának meghatározására lehet alkalmazni.

Egy polinukleotid vagy nukleinsav „funkcionális fragmentuma a nukleotidszekvencia egészét vagy kevesebb nukleotiddal rendelkező részletét tartalmazza, melyet elegendő genetikai anyagként

68.670/BE

lehet alkalmazni egy gén transzkripciójának iniciálására vagy egy polipeptid funkcionális alegységének kódolására.

A találmány szerinti megoldás arra a nyilvánvaló tényre épül, hogy gyulladásos sejtek apoptózisának jótékony terápiás hatása van bizonyos gyulladásos betegségekben. A találmány tárgyát képezi pontosabban génterápiával kiváltott, önszabályzó apoptózis. Tágabban véve, a találmány szerinti megoldásban, a kiméra nukleinsav legalább egy promóterenhanszert tartalmaz egy minimális promoter legalább egy funkcionális kópiájához kapcsolva, a promoter egy olyan gén vagy gének kombinációja, amely gyulladásos sejtekben vagy a gyulladás helyén lévő sejtekben aktiválódik, továbbá legalább egy kópia apoptózist indukáló génhez (AIG) van kapcsolva, így az AIG expresszióját a promoter vezérli, és így gyulladásos sejteket képes megcélozni. Gyulladásban aktiválódó, indukálható gének promóterei tartalmazhatnak például TNFtx-promóterből származó nukleinsavszekvenciát, vagy konzervatív szubsztitúcióját vagy allélvariánsait. A találmány szerinti kiméra nukleinsavak tartalmaznak enhanszert, promótert és AIGelemeket közvetlenül, disztálisan, proximálisan, vagy ezek kombinációjával kapcsolva. A fentebb említettek és a lentebb részletesen tárgyaltak szerint, a találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint több kópia enhanszert, promoter és/vagy AIG-ot alkalmazunk a maximális hatékonyság érdekében.

A találmány szerinti megoldás még tökéletesebb megértése céljából, az alábbi részletes ismertetésben szemléltetés céljából a hangsúlyt olyan kiméra nukleinsavakra helyezzük, amelyek legalább egy TNFa-promóterenhanszert tartalmaznak minimális TNFa68.670/BE

-promoter legalább egy funkcionális kópiájához kapcsolva, és továbbá egy AIG legalább egy kópiájához kapcsolva. Bár az alábbi példákban szintén ilyen típusú konstrukciókat alkalmazunk, szakember számára nyilvánvaló, hogy a leírás szerinti alapkonstrukciókat meg lehet változtatni más megvalósítási módokat létrehozva, amelyekben a találmány szerinti termékeket, eljárásokat, módszereket és készítményeket más, gyulladásban aktiválódó, indukálható gént tartalmazó promóterrel alkalmazzuk, például a fentebb felsorolt típusú, hasonló funkcióval rendelkező promóterekkel, amelyeket a fertőzés helyénél lévő sejtekhez lehet célba juttatni.

Az „apoptózist indukálni képes gént (amelyet néha AIG-ként rövidítünk) egy TNFa-promóter (TNFp) vagy gyulladásban aktiválódó, más indukálható gén vezérli. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint szelektíven indukálunk apoptózist olyan sejtekben, amelyek képesek TNFa-t termelni. A TNFa-AIG-ot vagy más kiméragént kényelmesen bevihetünk in vivo, szokásos génterápiás technikákat alkalmazva. A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a kiméragén előnyösen TNFp-AIG, amely csak olyan sejtekben expresszálódik, amelyek gyulladással társítható citokint, TNFa-t képesek termelni. Továbbá, mivel a TNFp-AIG-kiméragén TNFa-promóterelemeket tartalmaz, indukálható, TNFp-szelektív transzkripciós faktorokat is elvon. Ez az elvonás a TNFa endogén termelésének csökkenését eredményezi. A találmány tárgyát képezik konkrétan TNFp-AIG és hasonló génkonstrukciók, kiméra nukleinsavakat tartalmazó sejtek, eljárások apoptózis indukálására kiméra nukleinsavakkal transzfektált sejtekben, kiméra

68.670/BE nukleinsavakat tartalmazó gyógyszerkészítmények, eljárások TNF -t nem termelő, szomatikus sejt-variánsok in vitro szelekciójára TNFa-t termelő sejtpopulációban és hasonlóban, eljárás TNFa-termelésért felelős, domináns negatív/domináns szupresszív gének azonosítására, valamint terápiás eljárások a kiméra nukleinsavak alkalmazásával.

A találmány szerinti, példaként alkalmazott TNFp-AIG-kiméra nukleinsavak tárgyalását az alábbi, szemléltetés célját szolgáló szekvenciákkal tesszük érthetőbbé:

1. számú szekvencia (SEQ ID NO: 1): a teljes hosszúságú, referenciaként szolgáló, humán TNFa-promóterszekvenciának megfelelő nukleotidszekvencia, egy közleményben leírtak szerint [Takashiba S. et al., Gene 131, 307-308 (1993)] . Az itt használt nukleotid-számozást alkalmazzuk ebben a szekvenciában is.

2. számú szekvencia (SEQ ID NO: 2): a találmány szerinti megoldásban alkalmazott gén natív TNFa-promóterszekvenciája (-1077 nukleotid a transzkripciós start-helytől, TSS) . Kisebb különbségek vannak az 1. számú (SEQ ID NO: 1) és 2. számú (SEQ ID NO: 2) szekvencia szerinti TNFp-szekvenciákban. Ilyen különbségeket a TNFa-promóter nukleotidszekvenciájában már leírtak [Takashiba S. et al., Gene 131, 307-308 (1993)] .

3. számú szekvencia (SEQ ID NO: 3): a natív, minimális TNFa-promóterszekvencia (-120. nukleotidtól a TSS-ig), amely legalább egy enhanszerelemet tartalmaz [ k3 hely; lásd Pauli, U., Grit. Rev. in Eucaryotic Gene Expression 4_, 323-344 (1994); Rhoades K.L. et al., J. Biol. Chem. 267, 22102-22107 (1992); és Takashiba S. et al., Gene 131, 307-308 (1993)] .

68.670/BE

4. számú szekvencia (SEQ ID NO: 4): -1005-től -905. nukleotidokat tartalmazó, TNFa-promóter 1. számú enhanszerrégiója (ERI) .

5. számú szekvencia (SEQ ID NO: 5): -706-tól —517. nukleotidokat tartalmazó, TNFa-promóter 2. számú enhanszerrégiója (ER2).

6. számú szekvencia (SEQ ID NO: 6): bevitt többszörös klónozó hely (MOS), melyet genetikailag terveztünk a -120pGL3-konstrukcióban, a -120 minimális TNFa-promótertől szintézisiránnyal szemben.

7. számú szekvencia (SEQ ID NO: 7): a TNFa-gén 3'-végi nem-transzlálódó régiója (3'UTR) [ Nedwin, G.E. et al., Nucleic Acid Research ,13, 6361-6373 (1985)] .

8. számú szekvencia (SEQ ID NO: 8): a teljes hosszúságú Granzyme-B.

9. számú szekvencia (SEQ ID NO: 9): a teljes hosszúságú Granzyme-B, amely nem tartalmaz vezetőpeptidet és inaktiváló dipeptidet kódoló nukleotidokat.

10. számú szekvencia (SEQ ID NO: 10): a teljes hosszúságú Granzyme-B, amely vezetőpeptidet kódoló nukleotidokat tartalmaz, de nem tartalmaz inaktiváló di-peptidet kódoló nukleotidokat.

11. számú szekvencia (SEQ ID NO: 11): -234-tól -120. nukleotidokat tartalmazó, TNFa-promóter 3. számú enhanszerrégiója (ER3).

12. számú szekvencia (SEQ ID NO: 12): -234-tól -65. nukleotidokat tartalmazó, TNFa-promóter 4. számú enhanszerrégiója (ER4).

13. számú szekvencia (SEQ ID NO: 13) : -706TNFpGB 3' UTR kiméra nukleinsav.

68.670/BE *

14. számú szekvencia (SEQ ID NO: 14): -1005THFpGB 3'UTR kiméra nukleinsav.

A találmány szerinti kiméra nukleinsav-konstrukciók előállítására szolgáló TNFa-promóter elemeit olyan elemek közül választjuk ki, amelyek képesek a TNFa-promóter által vezérelt terápiás gén expresszióját indukálni. Ezeket a promóterelemeket a leírásban a TNFa-promóter „indukálható cisz-elemeinek, „cisz-indukálható elemeinek vagy „enhanszerelemeinek nevezzük.

Az enhanszerelemek fizikailag kötve lehetnek a minimális promóterszekvenciához, vagy egy olyan linkerszekvencia választhatja el azokat a minimális promótertől, amely rendelkezhet vagy nem rendelkezhet egyedi restrikciós helyekkel. Tehát, a fentebb összefoglaltak szerint, az enhanszerelemek közvetlenül, disztálisan, proximálisan vagy ezek bármilyen kombinációiban kapcsolódhatnak a találmány szerinti kiméra nukleinsavakhoz. Ezeket tipikusan a promóterszekvenciától szintézisiránnyal szemben építettük be. TNFa-enhanszerelemek például 4., 5., 11. és 12. számú szekvenciával rendelkeznek; ezek funkcionális fragmentumai vagy variánsai és kombinációi is alkalmazhatók. A találmány szerinti néhány előnyös génkonstrukció az enhanszerelemek több kópiájával rendelkezik, azaz 2 vagy több kópiával. A találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint körülbelül 2-25, szűkebben véve 2-10 és még szűkebben véve 2-5 kópiát tartalmaz.

A „TNF-promóter, „TNFa-promóter és „TNFp kifejezések a leírásban egymással felcserélhetők. Hacsak nem állítjuk az ellenkezőjét, ezek a kifejezések a natív, minimális TNFa-promóterszekvencia teljes nukleotidszekvenciájára vonatkoznak, amely egy

68.670/BE vagy több, szintézisiránnyal szemben lévő enhanszerelemhez (akár természetes azaz natív módon jelen van, vagy géntechnológiailag lettek módosítva laboratóriumban) van kapcsolva, például az 1., 2. vagy 3. számú szekvencia, vagy ezek bármilyen funkcionális fragmentuma, variánsa és keveréke. Ezen TNF -szekvenciák és a leírás szerinti más szekvenciák sok funkcionális fragmentuma és variánsa legalább 80%-os szekvencia-homológiát mutat, és bizonyos esetekben 90%-nál nagyobb szekvencia-homológiát mutat a natív és géntechnológiailag módosított párjukhoz, de ezek szakember számára ismeretesek, és az idézett hivatkozásokban definiálták azokat.

A találmány tárgyát képezi új terápiás eljárás, amelyben egy emlős sejtjeibe beviszünk TNFa-promóter (TNFp) által vezérelt, apoptózist-indukáló gént (AIG) tartalmazó kiméra nukleinsavat. A találmány szerinti kiméra nukleinsavakra szolgálnak példaként a 13. és 14. számú szekvenciák; ezek bármilyen funkcionális fragmentumait vagy variánsait is lehet alkalmazni. Anélkül, hogy ragaszkodni kívánnánk bármilyen elmélethez, a TNFp vezérlésének eredményeként AIG csak olyan sejtekben expresszálódik, amelyek gyulladást okozó citokint, TNFa-t termelnek. Ennélfogva bármilyen TNFa-t expresszáló sejt önpusztítóvá válik, miközben azok a sejteket, amelyek nem expresszálnak TNF -t, nem éri semmilyen hatás. Ez a módszerrel előnyösen bármilyen TNF -t termelő sejtet meg lehet célozni, például aktivált makrofágokat, aktivált T-sejteket, makrofágszerű, fibroblasztszerű szinoviocitákat és RA-ízületekben lévő primer sejteket. Valóban, a megcélzott TNF -t termelő sejt lehet olyan, amely normálisan tartalmaz vagy normálisan nem tartalmaz vagy expresszál apoptózis-gént natív, módosítatlan

68.670/BE formában. Ennélfogva a találmány szerinti kiméra nukleinsavak és eljárások alkalmazásával a TNFa celluláris forrásait el lehet pusztítani nagymértékben szelektív módon.

A találmány szerinti TNFp-AIG kiméra nukleinsav alkalmazásának másik előnye, hogy a TNFp elvon olyan transzkripciós faktorokat, amelyekre az endogén TNFp-nek szüksége van, ezáltal az endogén TNFa-termelődésének csökkenéséhez vezet. Egy példában a TNFp a terápiásán megcélzott sejtben óriási feleslegben volt jelen. Ezt úgy lehet elérni, hogy több kópia transzfektált gént viszünk be a sejtbe. Más módszer szerint, a találmány szerinti TNFp-AIG kiméra nukleinsav a TNFa-promóter indukálható ciszelemeit több kópiában tartalmazhatja. A fentebb említettek szerint, a TNFp „indukálható enhanszerelemeinek több kópiája van jelen a találmány szerinti TNFp-AIG kiméra nukleinsavakban, a találmány néhány előnyös megvalósítási módja szerint. Mivel a TNFp-konstrukció indukálható cisz-elemeinek több kópiája jelen van, a transzfektált sejtben a TNFa termeléséhez szükséges transzkripciós faktorokat elvonják az exogén módon bevitt szekvenciák. Ezt az előnyös TNFp-AIG-konstrukciót fokozott hatékonyság jellemzi a TNFp-specifikus transzkripciós faktorokért való kompetícióban olyan találmány szerinti kiméra nukleinsavakhoz viszonyítva, amelyek csak egyetlen enhanszerelemet tartalmaznak TNFp-hez kapcsolva. Az így előállított „indukálható szuperpromóter (1) hatékonyabban képes kompetícióba lépni TNFa-specifikus indukálható transzkripciós faktorokért, és (2) fokozott módon képes apoptózist indukáló gén expresszióját vezérelni a többszörös enhanszerelemek miatt.

68.670/BE

Például reumatoid artritiszben szenvedő pácienseken kimutatták, hogy a synovectomiának, azaz az ízületi szövet eltávolításának klinikailag jótékony hatása van. A hagyományos és sebészeti synovectomiás eljárásoktól eltérően, az itt leírt sejt-célzott terápiás eljárás csak TNFa-t termelő sejteket céloz meg. Tehát előnyösen, a TNFp—AIG-kiméragén bevitele és expressziója, és azt közvetően apoptózis indukálása nem indukál gyulladásos választ. Ennek megfelelően, a találmány szerinti eljárások öszszehasonlíthatóan szelektívek és minimális szövetkárosodást eredményeznek, valamint csökkentik a gyulladást.

Az itt leírt termékek és eljárások alkalmasak más gyulladásos rendellenességek kezelésére is. Ilyen gyulladásos rendellenességek például szklerózis multiplex, Guillain-Barre-féle szindróma, Crohn-féle betegség, fekélyes vastagbélgyulladás, pikkelysömör (psoriasis), Graft-versus-host betegség, lupus erithematosus, inzulinfüggő diabetes mellitus, pszoriázisos ízületi gyulladás (artritisz), szarkoidózis, hiperszenzitív pneumonitisz (allergiás túlérzékenység okozta tüdőgyulladás), spondilitisz ankilopoetika és hasonló csigolyaízületi gyulladások, Reiter-féle szindróma és szisztémás szklerózis. Tehát a találmány szerinti eljárásokban gyulladásos rendellenességet kezelünk egy páciensben úgy, hogy ilyen kezelésre szoruló páciensnek beadjuk a találmány szerinti kiméra nukleinsavat tartalmazó gyógyászati készítmény gyógyászatilag hatásos mennyiségét. Apoptózist indukálunk a páciens gyulladásos sejtjeiben vagy a gyulladás helyén lévő sejtjeiben úgy, hogy a sejtekbe beviszünk legalább egy, találmány szerinti kiméra nukleinsavat, és tipikusan gyógyászati—

68.670/BE lag elfogadható hordozót, és a készítményt szakember által ismert, standard módon beadjuk a páciensnek. A gyógyszerkészítményt közvetlenül a gyulladás helyére lehet juttatni lokális topikális, intravénás, intraperitoneális és hasonló módszerekkel. További módszereket lentebb ismertetünk.

A terápiás alkalmazásokon kívül, a találmány szerinti kiméra nukleinsavakat különféle szűrési és szelekciós eljárásokban alkalmazhatjuk. Az egyik ilyen eljárásban TNFa-t nem termelő szomatikus sejt-variánsokat lehet in vitro szelektálni TNFa-t termelő sejtpopulációban úgy, hogy TNFp-AIG-kiméra nukleinsavat beviszünk a TNFa-t termelő sejtpopulációba. TNFa-t termelő sejtek apoptózison mennek keresztül. TNFa-t nem termelő sejtek tovább élnek. A túlélő fenotípussal rendelkező sejtvariánsok szelekciójával könnyen lehet TNFa-t nem termelő sejteket azonosítani. Ilyen szelekciós eljárást lehet alkalmazni olyan gének expreszsziójának meghatározására, amelyek „in-trans hatnak TNFa-promóter aktivitásának szabályzására, ezáltal csökkentve a TNFa-termelést. Ilyen géneket más rendszerekben domináns negatív (DN)/domináns szupresszív génként jellemeznek [Behrends S. et al., J. Biol. Chem. 270, 21109-21113 (1995); Zhang S. et al., J. Bioi. Chem. 270, 23934-23936 (1995); Watowich S.S. et al., Mól. Cell Bioi. 14/6, 3535-3549 (1994)] .

Egy további in vitro módszerben, a találmány szerinti TNFp-AIG kiméra nukleinsavat TNFa-t nem termelő sejtpopuláció kialakulásáért felelős, domináns negatív gének azonosítására lehet alkalmazni. Ebben az eljárásban találmány szerinti TNFp-AIG kiméra nukleinsavat beviszünk TNFa-t termelő sejtekbe. Domináns negatív

68.670/BE gén hiányában ezeknek a sejteknek apoptózison kell átmenni aktiváláskor. Ezért levonhatjuk azt a következtetést, hogy a túlélő variánsok domináns negatív génnel rendelkeznek, amely képes leszabályozni TNFa-termelést. A domináns negatív gént könnyen lehet azonosítani cDNS-könyvtár előállításával és sejtvonalak (például Jurkat és THP-1) transzfektálásával. Ezek a sejtek indukálható TNFp-AIG kiméra nukleinsav vagy TNFp-luciferáz-gén stabil transzfektánsai. TNFp-AIG-al transzfektált sejteket szelektálunk a túlélő fenotípus alapján, in vitro aktivációt követően; a túlélő fenotípus jelzi a DN-gének hatását. TNFpluciferáz-génnel transzfektált sejtekben a luciferáz-aktivitás csökkenése jelzi a DN-gén hatását. Ezzel az eljárással azonosított, domináns negatív géneket jövőbeli terápiás ágensként lehet alkalmazni. Ilyen gének jöhetnek szóba TNFa-termelés csökkentését célzó génterápiákban való alkalmazásra.

Géntranszferre alkalmazott módszerek két, tágan vett csoportba sorolhatók:

1. Közvetlen megközelítés: A terápiás gén in situ transzdukciója célsejtekbe, például szinoviocitákba, a terápiás gént hordozó, alkalmas vektor alkalmazásával. A terápiás gént tartalmazó vektort közvetlenül a betegség által sújtott területre (például artritiszes ízületbe) injektáljuk.

2. Közvetett megközelítés: A terápiás gén ex-vivo transzfekciója célsejtekbe, például szinoviocitákba. Ebben a megközelítésben, az ízületi hártyát eltávolítjuk az ízületről, szinoviocitákat izolálunk és in vitro tenyésztjük azokat. Az in vitro tenyésztett sejteket transzfektáljuk a terápiás génnel, és gene

68.670/BE tikailag módosított szinoviocitákat visszatranszplantáljuk az ízületi hártyába.

Az in vivo bevitelre számos vektort elemeztek arra nézve, hogy mennyire hatékonyan képesek gént célba juttatni [ Nita et al., Arthritis & Rheumatism 39/5, 820-828 (1996)] . Génterápiára alkalmazott vektorok közül a retrovírusokból származó vektorokat fejlesztették ki messze a legjobban. Ezek képesek genetikai anyagot inszertálni a gazdaszervezet genomjába, és képesek stabil transzfektánsokat előállítani. Ezek a vektorok azonban nem képesek nem-osztódó sejteket fertőzni, és mivel a gazdaszervezet genomjába inszertálódnak, az inszerciós mutagenezis lehetőségét nem lehet kizárni. Ehhez képest az adenovírusokból származó vektorok képesek megfertőzni osztódó valamint nem-osztódó sejteket egyaránt, és DNS-t célba juttatni episzómálisan. Az adenovírusalapú vektorok hátránya, hogy ezek a vektorok tovább termelnek virális fehérjéket a megfertőzött sejtekben, amely potenciális antigénné teszi azokat. A vírus-alapú vektorok harmadik típusa Herpes simplex vírusokból (HSV) származik, amely szintén képes osztódó valamint nem-osztódó sejteket megfertőzni.

Nem-virális vektorrendszerek közül kationos liposzómákat és csupasz plazmid-DNS-eket vizsgáltak. A liposzómák fejlesztése haladt előre leginkább, bár bizonyos sejttípusok, például izomsejtek és bőrsejtek felveszik, megtartják és expresszálják a csupasz plazmid-DNS-t.

Alkalmazhatunk részecske-közvetített gént célba juttató rendszert is [ Rakhmilevich et al., PNAS 93, 6291 (1996)] , amely egy ígéretes megközelítés.

68.670/BE • * '* * * · ♦ · * - ♦ ♦ W ♦ ϊ '

Az alábbi „in vivo gént célba juttató eljárásokat alkalmazzuk a találmány szerinti kiméragének bevitelére:

(1) Nita és munkatársai [ Arthritis & Rheumatism 39, 820-823 (1996)] :

In vivo kísérlet nyulakban:

Az egyes vektorokat intraartikulárisan injektáljuk egy térdízületbe. Vírusvektorok esetén 0,5 ml fiziológiás sóoldatban felszuszpendált 10⁸ és 10⁹ közötti részecskét injektálunk térdenként .

Liposzóma-DNS-komplexeket (200 nmol DC-Chol komplexálva 20 μσ DNS-el/ml) 1 ml fiziológiás sóoldatban injektálunk térdenként.

(2) „Methods in Molecular Medicine: Gene Therapy Protocols; szerk. Paul Robbins (1997), Barr és munkatársai, 205-212. old.

Adenovírus-alapú vektor alkalmazása célba juttatásra hepatocitákba: patkányból származó hepatociták 1 x 10¹¹ PFU 100 g állatba .

Kutyákban (12-17 kg) a kapuvéna körülbelül 1,5 x 10¹¹ PFU/kg perfúziójával 1 kópia adenovírus-genom jut a gazdaszervezet-DNS diploid kópiájára.

Nyulakban (2-4 kg) 1,5 x 10¹³ vírusrészecske (körülbelül 1,5 x 10¹¹ PFU) ad 100%-os hepatocita-transzdukciót; 4 x 10¹² vírusrészecske ad 50-75%-os transzdukciót.

Yang N-S és munkatársai, 281-296:

Arannyal jelölt részecskékkel közvetített génbevitel: Emlős bőrszövet transzfekciója 0,1, 0,5, 1,0 és 2,5 pg DNS/mg részecskével lineáris összefüggést ad a transzgén expressziójának mértékével .

68.670/BE • •>4 ⁴ » * .Λ.· Λ. ·» - ' *-Λ

Nabel és munkatársai, 297-305:

Liposzómával közvetített génbevitel emberekbe:

1. eljárás: 15 nmol DC-Chol/Dope-liposzómákat összekeverünk 1 μς DNS-el 0,7 ml-ben. A fenti keverékből 0,2 ml-t injektálunk a páciens melanóma-csomójába. Katétert alkalmazó bevitelre 0,6 ml oldatot juttatunk az artériába.

2. eljárás: 15 nmol DMRIE/Dope-liposzómákat összekeverünk 5 μ g DNS-el 1,0 ml-ben.

Közvetlenül a tumorba irányuló injekciókban a DNS koncentrációja 3 μg-tól (4,5 nM DMRIE/Dope-val komplexálva) 300 μg-ig (450 nM DMRIE/Dope-val komplexálva) terjedő tartományban van.

(3 ) Roessler és munkatársai, 369-374:

Génbevitel az ízületi hártyába:

A terápiás gént tartalmazó, 10⁹-10¹² adenovírus-részecskedózist alkalmazunk ízületenként. Az optimális dózist azonban mindegyik adott kísérletsorozatra empirikusan kell meghatározni, és ez függ az alkalmazott rekombináns adenovirus genomi vázának tulajdonságaitól, valamint az expresszálandó transzgéntől.

Közvetett megközelítésre sokféle módszert dolgoztak ki, például kationos lipidre vagy kationos polimerre alapuló transzfekciót és elektroporációt.

A fentebb idézett bármelyik technikát szakember képes megváltoztatni az adott igényeknek megfelelően. Ilyen módosítások végrehajtása gyakorlati tapasztalatokkal rendelkező szakember tudásába tartozik, és nincs szükség indokolatlan kísérletekre. Ezek a nyilvánvaló variációk a találmány igényelt oltalmi körébe tartoznak .

68.670/BE

Példák

A találmány szerinti megoldás alaposabb megértése céljából bemutatjuk az alábbi példákat. Ezek a példák a találmány néhány előnyös megvalósítási módjának szemléltetését szolgálják, amelyekkel semmilyen módon nem kívánjuk a találmány igényelt oltalmi körét korlátozni.

1. példa

TNFp-Granzyme-B-konstrukciók előállítása

A TNF-promóter cisz-enhanszerelemei által vezérelt, kiméra Granzyme-B (ugyanazon régió vagy különböző régiók egy vagy több kópiájának) előállítása céljából a riportergén optimális indukálható expressziójáért felelős, kérdéses régiókat azonosítjuk.

TNFa-promóterelemek szelekciója kiméra nukleinsav előállításához

A TNFa-promóter régióit polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáljuk, a TNFa-promóter különböző deléciós konstrukcióit tartalmazó primerek (3. ábra) alkalmazásával. Különböző egyéb celluláris rendszerekben, más kutatók által azonosított régiókat használunk referenciaként [Rhoades et al., J. Biol. Chem. 267, 22102-22107 (1992); Leitman et al., Mol. Cell. Bioi. 12, 13521356 (1992); Pauli U., Crit. Reviews Eukaryotic Gene Expression 4, 323-344 (1994)] . A PCR-el amplifikált géneket azután egy riportergéntől, például luciferáz-géntől szintézisiránnyal szemben klónozzuk kereskedelemben elérhető, promótermentes vektorba. Ezeket a konstrukciókat konstitutív és indukálható expresszió68.670/BE jukra teszteljük különböző sejtvonalakban, például Jurkat-sejtvonalban (T-limfoblasztoid), U973-sejtvonalban (mielomonocita), THP-l-sejtvonalban (monocita), fibroblasztokban vagy in vitro tenyésztett humán szinoviocitákban. A riportergén indukálható expressziójáért felelős régiók azonosítása elsődlegesen két TNF -t termelő sejtvonal, Jurkat (PMA-val való stimuláció után) és THP-1 (LPS-el való stimuláció után) sejtvonal alkalmazásával kapott eredményekre alapul (4.a és 4.b ábra). Ezeket a sejteket tranziensen transzfektáljuk jól ismert eljárások és kereskedelemben elérhető reagensek, például DEAE-dextrán és Superfect alkalmazásával. A riportergén indukálható expressziójáért felelős, TNF -promoter cisz-elemeit azután TNFp-Granzyme-B kiméra nukleinsavak előállítására alkalmazzuk.

TNFp-Granzyme-B kiméra nukleinsavak előállítása.

Granzyme-B-t kódoló régió amplifikálásához oligo-dT prímért, és templátként olyan cDNS-t alkalmaztunk, amely PHA/anti-CD3-al aktivált, humán perifériás vérlimfocitákból származott, amelyeket IL-2-t tartalmazó tápközegben tartottunk fent. Az 1-7., és 21-27. kódonoknak megfelelő, szensz primereket alkalmaztuk a Granzyme-B teljes hosszúságú (8. számú szekvencia) vagy rövidített (9. számú szekvencia) formáinak amplifikálására. Az antiszensz primerek ugyanazok voltak mindkét amplifikációban, amelyekből származó termékek megfeleltek a stop-kódonig (azaz 248ig) tartó résznek. Előállítottunk dipeptid-deletált Granzyme-Bkonstrukciókat (10. számú szekvencia), templátként teljes hoszszúságú Granzyme-B-t (8. számú szekvencia) alkalmaztunk. Olyan mutagén szensz és antiszensz komplementer primereket alkalmaz

68.670/BE tünk deléció előállítására, amelyeket 15 nukleotid szegélyezett mindkét oldalon, de nem tartalmazták a 19. és 20. kódonoknak megfelelő (inaktiváló dipeptid) , hat nukleotidot. A konstrukciókat „QuickChange mutagenesis kit (Stratagene) alkalmazásával állítottuk elő. A dipeptid-deletált Granzyme-B-t kódoló nukleinsav-fragmentumokat szubklónoztuk a TNFa-promótertől szintézisirányban, helyettesítve a luciferáz-gént a TNFa-promóterek -706 és -1005 deléciós konstrukcióiban (5. ábra). A TNFa-gén egész 3' -nemtranszlálódó régióját (7. számú szekvencia) PCR-amplifikáltuk, és a TNFa-promóter -706 és -1005 deléciós fragmentumai által vezérelt, dipeptid-deletált Granzyme-B-gént kódoló nukleinsav-fragmentumtól szintézisirányban inszertáltuk. A kiméra nukleinsavak teljes szekvenciáját bemutatjuk 13. és 14. számú szekvenciaként.

TNF -szuperpromóter-Granzyme-B kiméra nukleinsavak előállítása.

A TNF -promoter két, tágan vett, előnyös régióját, azaz ERl-et (-1005-től -905-ig) (4. számú szekvencia) és ER2-t (-706-tól -517-ig) (5. számú szekvencia), amelyek a fentebb leírt riportergén indukálható expressziójáért felelős elemeket tartalmazzák (4.a és 4.b ábra), PCR-amplifikáltuk, és a natív minimális promótertől (-120-tól TSS-ig, 3. számú szekvencia) szintézisiránnyal szemben ligáijuk, egyetlen vagy több kópiában. A TNFa-promóter két további régióját ER3-at (-234-től -120-ig, 11. számú szekvencia) és ER4-et (-234-től -65-ig, 12. számú szekvencia) szintén potenciális enhanszerrégióként azonosítjuk, amelyeket a lentebb leírt stratégiában kimérakonstrukciók előállítására alkalmazunk. A szuperpromóter a fentebb említett, indukálható promóterelemeket

68.670/BE tartalmazó régiók több (2-10) kazettáját tartalmazza (7. ábra). Ezt a kérdéses régiók PCR-amplifikálásával érjük el olyan primerek alkalmazásával, melyeket az egyes primerek 5' -végénél inszertált restrikciós helyekkel szintetizáltunk. Ezek az egyedi restrikciós helyek a kérdéses, amplifikált génterméket szegélyezik. A PCR-el amplifikált AIG-ot előnyösen a TNFa-szuperpromótertől szintézisirányban klónozzuk, a natív TNFa-promóter esetén leírt, eredeti konstrukcióban lévő luciferéz-riportergént helyettesítve (5. ábra).

TNFa-szuperpromóter és egyedi restrikciós helyeket (ezek a restrikciós helyek nincsenek jelen a kérdéses TNFa-promóter és Granzyme-B kiválasztott elemeiben) tartalmazó linkerszekvencia előállítására szolgáló sémákat vázolunk az alábbiakban hatékony irányított inszerció céljából, és bemutatjuk a 8. ábrán.

1. séma:

1. LÉPÉS: A minimális TNFa-promóter (-120 TSS-ig) inszerciója pGL3-alapú (promoter nélküli) luciferáz-vektorba (Promega):

A TNFp-AIG kiméra nukleinsav előállítására alkalmazott pGL3-alapvektorok elemei az alábbiak:

KpnI.SacI.Miül.Nhel.Smal.Xhol.BglII.Hindii!.[ luciferáz] .Xbal_

A minimális promótert PCR-el amplifikáljuk Xhol és BglII.Hindii! hasítóhelyeket tartalmazó primerek alkalmazásával, így az Xhol az amplifikált termék 5' -végéhez, és a BglII.HindlII-helyek az amplifikált termék 3' -végéhez kerülnek. Ezt a fragmentumot inszertáljuk a pGL3-alapvektor polilinkerébe ugyanezen restrikciós helyek felhasználásával. Ezt a konstrukciót Al-konstrukció-nak nevezzük és az alábbiakban bemutatjuk:

68.670/BE _KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.(-120-tól TSS-BglII-ig).Hindii!.

[ luciferáz] .Xbal_

2. LÉPÉS: Az enhanszerfragmentumot (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) számos restrikciós helyet tartalmazó primerek alkalmazásával PCR-amplifikáljuk. Az így kapott fragmentum KpnI.AatlI.BssHII restrikciós helyeket tartalmaz az 5' -végnél, és Nsil.Spel.Miül hasítóhelyeket tartalmaz a 3' -végnél az alábbiak szerint:

5'-KpnI.AatlI.BssHII. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) .Nsil.Spel.MluI-3. A fragmentumot az 1. lépésben előállított Al-konstrukció-ba inszertáljuk KpnI és Miül restrikciós helyek felhasználásával. Ezt a konstrukciót Bl-konstrukció-nak nevezzük és az alábbiakban bemutatjuk:

__KpnI.AatlI-BssHII.(ERI, ER2, ER3 vagy ER4).Nsil.Spel.Miül.Nhel. Smal.Xhol. (-120-tól TSS-BglII-ig) .HindlII.[ luciferáz] .Xbal__

3. LÉPÉS: A TNFoc-enhanszerfragmentumot (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) AatlI és BssHII restrikciós helyeket tartalmazó primerek alkalmazásával amplifikáljuk, az alábbi PCR-terméket előállítva: 5' -AatlI. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) .BssHII-3' . Ezt a fragmentumot klónozzuk a „Bl-konstrukció-ba ugyanezen restrikciós helyek felhasználásával. Ezt a konstrukciót „Cl-konstrukció-nak nevezzük, és az alábbiakban bemutatjuk:

_KpnI.AatlI.(ERI, ER2, ER3 vagy ER4).BssHII.(ERI, ER2, ER3 vagy ER4) .Nsil.Spel.Miül.Nhel.Smal.Xhol. (-120-tól TSS-BglII-ig) .Hindin. [ luciferáz] .Xbal_

4. LÉPÉS: A TNFa-enhanszerfragmentumot (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) Nsil és Spel restrikciós helyeket tartalmazó primerek alkalmazásával amplifikáljuk, az alábbi PCR-terméket előállítva:

68.670/BE

5' -Nsil. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4).SpeI-3' . Ezt a fragmentumot klónozzuk a „Cl-konstrukció-ba, ugyanezen restrikciós helyek felhasználásával. Ezt a konstrukciót „Dl-konstrukció-nak nevezzük, és az alábbiakban bemutatjuk:

Kpnl.AatH. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) . BssHII . (ERI, ER2, ER3 vagy ER4).Nsil.(ERI, ER2, ER3 vagy ER4).Spel.Miül.Nhel.Smal.Xhol. (-120-tól TSS-BglII-ig)-Hindii!. [ luciferáz] .Xbal_

5. LÉPÉS: Granzyme-B-t kódoló régiókat PCR-el amplifikáljuk BglII és Xbal restrikciós helyeket tartalmazó primerek alkalmazásával, így az alábbi fragmentumhoz jutunk: 5' -BglII. (GranzymeB)XbaI-3. Ezt a fragmentumot a „Dl-konstrukció-ba inszertáljuk ugyanezen restrikciós helyek felhasználásával. Az így kapott konstrukciót „El-konstrukció—nak nevezzük, és az alábbiakban bemutatjuk:

KpnI . Aatn . (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) .BssHII. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4).Nsil.(ERI, ER2, ER3 vagy ER4).Spel.Miül.Nhel.Smal.Xhol. (-120-tól TSSBglII-ig) .[ Granzyme-B] .Xbal_

Az alábbiakban egy alternatív, 2. sémát ismertetünk:

2. séma:

1. LÉPÉS: Ugyanaz, mint az 1. sémában az „Al-konstrukció előállítása, amellyel az alábbi konstrukcióhoz jutunk: _KpnI.SacI.Miül.Nhel.Smal.Xhol.(-120-tól TSS-BglII-ig).Hindin. [ luciferáz] .Xbal_

2. LÉPÉS: További többszörös klónozó hely (6. számú szekvencia) inszerciója:

Két komplementer (5' -foszforilált) oligonukleotiodot szintetizálunk kereskedelemben elérhető források alkalmazásával:

68.670/BE

Nhel.SacII.EcoRV.AflII.AatlI.AvrII.Spel.PvuII.Xhol._ Ezeket az oligonukleotidokat összehibridizáljuk, és azután az „Al-konstrukció Nhel és Xhol helyeibe klónozzuk. Az eredményként kapott konstrukciót „B2-konstrukció-nak nevezzük, és az alábbiakban bemutatjuk:

KpnI.SacI.Miül.Nhel.SacII.EcoRV.AflII.AatlI.AvrII.Spel.PvuII.Xhol. (-120-tól TSS-BglII-ig) .Hindii!.[ luciferáz] .Xbal_

3. LÉPÉS: A TNFcc-enhans zerf ragmentumot (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) 5'-végi Spel.PvuII restrikciós helyeket és a 3' -végi Xholhelyet tartalmazó primerek alkalmazásával amplifikáljuk, az alábbi PCR-terméket előállítva: 5' -Spel.PvuII. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4). XhoI-3' . Ezt a fragmentumot klónozzuk a „B2-konstrukció-ba Spel és Xhol restrikciós helyek felhasználásával. Ezt a konstrukciót „C2-konstrukcíó-nak nevezzük, és az alábbiakban bemutatj uk:

KpnI.SacI.Miül.Nhel.SacII.EcoRV.AflII.AatlI.AvrII.Spel.PvuII. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) .Xhol. (-120-tól TSS-BglII-ig) .Hindii!. [ luciferáz] .Xbal_

4. LÉPÉS: A TNFa-enhanszerf ragmentumot (ERI, ER2, ER3 vagy ER4) 5'-végi AvrII.Spel restrikciós helyeket és 3' -végi PvuIIhelyet tartalmazó primerek alkalmazásával amplifikáljuk, az alábbi PCR-terméket előállítva: 5' -AvrII.Spel. (ERI, ER2, ER3 vagy ER4).PvuII-3' . Ezt a fragmentumot klónozzuk a „C2-konstrukció-ba AvrII és PvuII restrikciós helyek felhasználásával. Ezt a konstrukciót ,, D2-konstrukció-nak nevezzük, és az alábbiakban bemutatjuk:

KpnI.SacI.Miül.Nhel.SacII.EcoRV.AflII.AatlI.AvrII.Spel.(ERI,

68.670/BE

ER2, ER3 vagy ER4).Xhol.(-120-tól TSS-BglII-ig) .Hindii!. [ luciferáz] .Xbal_

Tehát ezen stratégia alkalmazásával egyidejűleg legalább hét kópia enhanszerrégiót (ERI, ER2, ER3 vagy ER4, egyenként vagy kombinációban) lehet hozzáadni az előzőhöz, egy vagy több restrikciós hely felhasználásával, a kiválasztott enhanszerrégiók PCR-amplifikációjában. Ha a kívánt számú enhanszerrégió-kópiát hozzáadtuk, AIG-ot inszertálunk a szuperpromótertől szintézisirányban, az 1. séma 5. lépésében leírtak szerint.

A TNFp-Granzyme-B-kiméragén indukálható expresszióját a fentebb említett sejtvonalak tranziens transzfekciójával teszteljük. A TNFp-Granzyme-B nukleinsav expresszióját a transzfektált sejtek apoptózisának detektálásával mérjük, AIG—ot expresszáló fehérjék mennyiségének meghatározásával Western-blotokban, kereskedelemben beszerezhető antitestek alkalmazásával, és proteáz-aktivitás meghatározásával kereskedelemben beszerezhető, jól dokumentált, specifikus, szintetikus tetrapeptid-szubsztrát alkalmazásával.

Riportergén TNFp-vezérelt expressziójának szabályzása.

A TNFoc-gén 3' -végi nem-transzlálódó régiója fontos szerepet játszik a TNFa bioszintézisének szabályzásában. Szerepet játszik a TNFa-gén transzlációs expressziójában normál, nem aktivált állapotban. Nagy jelentősége van annak, hogy ezek az elemek lehetővé tesznek de-repressziót, ha TNFa-t termelő sejteket külső stimulusokkal aktiváljuk [ Han, J. et al., J. Immunology 146, 1843-1848 (1991); Crawford, F. K. et al., J. Biol. Chem. 271, 22383-22390 (1996)] .

68.670/BE

Olyan genetikai konstrukciókat állítunk elő, amelyekben az egész 3' -végi nem-transzlálódó régiót (13. számú szekvencia) a deléciós fragmentumok, azaz -120-, -706- és -1005-TNFapromóterek által vezérelt luciferáz-géntől szintézisirányban inszertáljuk. Ezen konstrukciók tranziens expressziójának eredményeit a 9. ábrán foglaljuk össze. A stratégia alkalmazásával 3' UTR-t szintén inszertáltunk a Granzyme-B-től szintézisirányban, a TNFpGB kiméra konstrukcióba (6.a, 6.b és 13. ábra).

2. példa

Tesztelő eljárások

In vitro módszerek:

Luciferáz-aktivitás vizsgálati eljárása: A luciferázaktivitást kereskedelemben elérhető reagensek (Promega) alkalmazásával határoztuk meg.

Granzyme-B-génexpresszió:

(a) A transzfektált sejtlizátumok Western-blotjait antiGranzyme-B-antitest alkalmazásával hívtuk elő.

(b) Transzfektált sejtek apoptózisa: Transzfektált sejtek Granzyme-B-nek tulajdonítható apoptózisát a sejtmagvak propídium-jodiddal való festésével detektáltuk [Krishan, A., J. Cell Bioi. 66, 188-193 (1994)] , kereskedelemben beszerezhető „Cell Death ELISA kit (Boehringer Mannheim) alkalmazásával.

Állatmodellek:

IL-ip-indukált artritisz nyúlban felállított modellje [ Pettipher E. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 8749-8753 (1986)] : IL-ip-t „New Zealand fehér nyulak térdízületeibe injek

68.670/BE tálunk. Az IL-Ιβ intraartikuláris injekciója leukociták dózisfüggő beszűrődését okozza az ízületi térbe és proteoglikán elvesztését az ízületi porcból.

Antigén-indukált artritisz: Antigén (ovalbumin) intraartikuláris injekciója térdízületekbe leukocita-felhalmozódást és porcdegradációt indukál, amely erősen emlékeztet az emberekben előforduló reumatoid artritiszre. Az injekciót követően az ízület duzzadása 14 napig fennmaradt.

„Scid-egér és emberi szinoviocita-modell [Houri J. M. et al., Current Opinions in Rheumatol. 2' 201-205 (1995); Sack U. et al., J. Autoimmunity 9, 51-58 (1995); Geiler T. et al., Arthritis & Rheumatism 37, 1664-1671 (1994)] : Ezek közelmúltban kifejlesztett artritisz-modellek, amelyekben RA-páciensekből származó, friss szinoviális szövetet ültetnek be normál humán porccal együtt scid-egerekbe szubkután a vesetok alá [ Geiler T. et al·., Arthritis & Rheumatism 37, 1664-1671 (1994)] vagy a térdízületekbe [Sack U. et al., J. Autoimmunity 9, 51-58 (1995)] . Az implantátum artritisz-szerű jellemzőkkel növekszik, nagy celluláris sűrűségű pannus-szövet alakul ki, bekövetkezik csont és porcerózió, multinukleáris óriássejtek fejlődnek ki és szinoviális fibroblasztok behatolnak a porcba.

Közvetett módszer: Szinoviocitákat in vitro transzfektálunk terápiás hatású génnel és visszaültetjük nyulakba. Ezekben a nyulakban artritiszt indukálunk IL-Ιβ injektálásával, és meghatározzuk a terápiás gén aktiválást követő expresszióját. A kiméragén aktiválással indukált expressziója apoptózist indukál a transzplantált sejtekben.

68.670/BE

Közvetlen módszer: Kiméragének intraartikuláris injekciója. A fentebb leírt bármelyik gént célba juttató eljárást, például csupasz plazmid-DNS bevitelét, kationos liposzóma-közvetített bevitelt lehet alkalmazni. Vírusvektor-alapú bevitel esetén a kiméragéneket alkalmas vektorokba klónozzuk. A vektorokat azután módosítjuk a vektorokban lévő eukarióta promótert deletálva. Alkalmas vektorokba inszertált, terápiás gének intraartikuláris injekciója azután terápiás valamint profilaktikus hatás fejt ki.

3. példa

TNFa-t nem termelő szomatikus sejt-variánsok szelekciója

Sejteket (THP-1, Jurkat) stabilan transzfektálunk in vitro TNFp-AIG kiméra nukleinsavval. Néhány stimulációs ciklus után, amely apoptózist indukál a TNFp-AIG-gént expresszáló sejtekben, a túlélő sejteket egyesítjük. Ezekből a sejtekből cDNS-könyvtárat állítunk elő, amelyet funkcionális klónozásra alkalmazunk [Legerski R. és Peterson C., Nature 359, 70-73 (1992); Jaattela M. et al., Oncogene 10, 2297-2305 (1995)] .

4. példa

Domináns negatív (DN) gének azonosítása és jellemzése

TNFp-AIG-al stabilan transzfektált THP-1- és Jurkat-sejteket ismételt stimulációs ciklusoknak vetjük alá TNFp-AIG expreszsziójának aktiválása céljából. Azok a sejtek, amelyek nem expresszálnak negatív szabályzó géneket, apoptózison mennek keresztül, míg azok, amelyek domináns negatív géneket expreszszálnak, túlélnek. Ezekben a túlélő sejtekben a DN-géntermékek

68.670/BE „in-trans módon hatnak a TNFa-promóterrel, ezáltal gátolják az AIG-transzkripciót eredményező aktiválásukat, végül túlélő fenotípust eredményeznek. Előállítunk ezen sejtekből származó, poliadenilált mRNS alkalmazásával cDNS-könyvtárat. A TNFp-AIG-el transzfektált THP-1- vagy Jurkat-sejteket apoptózistól megmentő DN-géneket funkcionális klónozással azonosítjuk, más génekre leírtak szerint. [Legerski R. és Peterson C., Nature 359, 70-73 (1992); Jaattela M. et al., Oncogene 10, 2297-2305 (1995)] .

A fenti leírás szakember számára tartalmaz kitanítást a találmány szerinti megoldás gyakorlati kivitelezése céljából, és nem kívánjuk részletezni valamennyi nyilvánvaló módosítását és variációját, amely szakember számára nyilvánvaló a leírás elolvasása által. Azonban valamennyi nyilvánvaló módosítás és variáció a találmány igényelt oltalmi körébe tartozik, melyet az alábbi szabadalmi igénypontokban definiálunk. A szabadalmi igénypontokkal le kívánjuk fedni az összes igényelt vegyületet és lépést, bármilyen sorrendben, amelyek alkalmazásával hatékonyan el lehet érni a kitűzött célokat, hacsak a szövegösszefüggésből konkrétan nem következik az ellenkezője.

A leírásban idézett közleményeket teljes egészükben, kifejezetten a kitanítás részének tekintjük.

68.670/BE (Szekvenciák jegyzéke)

SEQUENCE LISTING (1) GENERAL INFORMATION:

(i) APPLICANT:

(A) NAME: Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.

(B) STREET: 900, Ridgebury Road (C) CITY: Ridgefield (E) COUNTRY: USA (F) POSTAL CODE (ZIP): CT-06877 (G) TELEPHONE: ++1/203/798-9988 (H) TELEFAX: ++1/203/791-6183 (ii) TITLE OF INVENTION: SELF-REGULATED APOPTOSIS OF INFLAMMATORY CELLS BY GENE THERAPY (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 14 (iv) COMPUTER READABLE FORM:

(A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (v) PRIOR APPLICATION DATA:

(A) APPLICATION NUMBER: 60/076,316 (B) FILING DATE: 27-FEB-1998 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :1:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1178 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: native minimal TNF-alpha promoter (B) LOCATION: 1..1178 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:1:

ggggaagcaa aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc agggtctgga ggggcggggg 60 tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg gttacaggag 120

68.670/BE acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg agtatcgggg accccccctt aacgaagaca gagcctccag gacctccagg tatggaatac ctggggccct gagaagtgag agcttcatga agccaagact gaaaccagca ttatgagtct ccagtggtct gtgaattccc gggggtgatt tgctaccccc acccagcctt tcctgaggcc tccccgcaga cccaaacaca ggcctcagga ttctctccct caaggactca gctttctgaa ctgcatcctg tctggaagtt agaaggaaac gaggcaatag gttttgaggg gcatggggac atcagtcagt ggcccagaag acccccctcg ggggtatcct tgatgcttgt gtgtccccaa agaaaccgag acagaaggtg cagggcccac tctccaccaa ggaagttttc cgctggttga agggacatat aaaggcagtt gttggcacac agcagaggac cagctaagag ggagagaagc agacgccaca tcccctgaca agctgccagg gtaggagaat gtccagggct atggaagtcg 180 gggccatgta gagggcccca gggagtgaaa 240 aggggacgtt taagaagata tggccacaca 300 aaaaaatcag ggaccccaga gttccttgga 360 ccgggtcaga atgaaagaag aaggcctgcc 420 tcactccccg ggctgtccca ggcttgtccc 480 tcaagctgcc accaagcccc cagctccttc 540 ctcaacacag cttttccctc caaccccgtt 600 gcccctccca gttctagttc tatctttttc 660 agaccacaga cctggtcccc aaaagaaatg 720 ggggttcagc ctccagggtc ctacacacaa 780 gaatcggagc agggaggatg gggagtgtga 840 ctttccaaat ncccgccccc gcgatggaga 900 taccgcttcc tccagatgag cttatgggtt 960 atgattcttt ccccgccctc ctctcgcccc 1020 ccagccagca gacgctccct cagcaaggac 1080 aactgcagac cccccctgaa aacaaccctc 1140 caggttct 1178 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :2:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 1096 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: Human TNF-alpha promoter (B) LOCATION: 1..1096 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:2:

gaggccgcca gactgctgca ggggaagcaa agggtctgga ggggcggggg tcagggagct tgaggaatgg gttacaggag acctctgggg gtccagggct atggaagtcg agtatgggga agggccccag ggagtgaaag agcctccagg aagaagatat ggccacacac tggggccctg gaccccagag ttccttggaa gccaagactg tgaaagaaga aggcctgccc cagtggggtc ggggctgtcc caggcttgtc cctgctaccc gccaccaagc ccccagctcc ttctccccgc cacagctttt ccctccaacc ccgttttctc tcccagttct agttctatct ttttcctgca acagacctgg tccccaaaag aaatggaggc tcagcctcca gggtcctaca cacaaatcag aggagaagct gagaagatga aggaaaagtc 60 cctgggagat atggccacat gtagcggctc 120 agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat 180 ccccccctta acgaagacag ggccatgtag 240 acctccaggt atggaataca ggggacgttt 300 agaagtgaga gcttcatgaa aaaaatcagg 360 aaaccagcat tatgagtctc cgggtcagaa 420 tgtgaattcc cgggggtgat ttcactcccc 480 ccacccagcc tttcctgagg cctcaagcct 540 agggacccaa acacaggcct caggactcaa 600 tccctcaagg actcagcttt ctgaagcccc 660 tcctgtctgg aagttagaag gaaacagacc 720 aataggtttt gaggggcatg gggacggggt 780 tcagtggccc agaagacccc cctcggaatc 840

68.670/BE ggagcaggga caaatccccg cttcctccag tctttccccg cagcagacgc ggatggggag cccccgcgat atgagctcat ccctcctctc tccctc tgtgaggggt ggagaagaaa gggtttctcc gccccaggga atccttgatg ccgagacaga accaaggaag catataaagg cttgtgtgtc aggtgcaggg ttttccgctg cagttgttgg cccaactttc cccactaccg gttgaatgat cacacccagc

900

960

1020

1080

1096 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 139 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: native minimal TNF-alpha promoter (B) LOCATION: 1..139 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :3:

ccgcttcctc cagatgagct catgggtttc tccaccaagg aagttttccg ctggttgaat 60 gattctttcc ccgccctcct ctcgccccag ggacatataa aggcagttgt atggcacacc 120 cgccagcaga cgctccctc 139 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :4:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 123 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: TNF-alpha promoter enhancer region 1 (ERI) (B) LOCATION: 1..123 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :4:

ggggcggggg tcagggagct cctgggagat atggccacat gtagcggctc tgaggaatgg 60

68.670/BE gttacaggag acctctgggg agatgtgacc acagcaatgg gtaggagaat atg gtccagggct 120

123 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:5:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 190 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: TNF-alpha promoter enhancer region 2 (ER2) (B) LOCATION: 1..190 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:5:

tccttggaag ccaagactga aaccagcatt atgagtctcc gggtcagaat gaaagaagaa 60 ggcctgcccc agtggggtct gtgaattccc gggggtgatt tcactccccg gggctgtccc 120 aggcttgtcc ctgctacccc cacccagcct ttcctgaggc ctcaagcctg ccaccaagcc 180 cccagctcct 190 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :6:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 223 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: multiple cloning sites genetically engineered upstream of the minimal TNF-alpha promoter in the -120pGL3 construct (B) LOCATION: 1..223 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :6:

68.670/BE ggtaccgagc tcttacgcgt gctagccgcg gatatcttaa gacgtcctag gactagtcag ctgctcgagc cgcttcctcc agatgagctc atgggtttct ccaccaagga agttttccgc tggttgaatg attctttccc cgccctcctc tcgccccagg gacatataaa ggcagttgtt ggcacaccca gccagcagac gctccctcag cagatctaag ctt

120

180

223 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :7:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 787 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: TNF-alpha untranslated region (B) LOCATION: 1..787 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO:7:

tctagaggag gacgaacatc caaccttccc aaacgcctcc cctgccccaa tccctttatt 60 accccctcct tcagacaccc tcaacctctt ctggctcaaa aagagaattg ggggcttagg 120 gtcggaaccc aagcttagaa ctttaagcaa caagaccacc acttcgaaac ctgggattca 180 ggaatgtgtg gcctgcacag tgaagtgctg gcaaccacta agaattcaaa ctggggcctc 240 cagaactcac tggggcctac agctttgatc cctgacatct ggaatctgga gaccagggag 300 cctttggttc tggccagaat gctgcaggac ttgagaagac ctcacctaga aattgacaca 360 agtggacctt aggccttcct ctctccagat gtttccagac ttccttgaga cacggagccc 420 agccctcccc atggagccag ctccctctat ttatgtttgc acttgtgatt atttattatt 480 tatttattat ttatttattt acagatgaat gtatttattt gggagaccgg ggtatcctgg 540 gggacccaat gtaggagctg ccttggctca gacatgtttt ccgtgaaaac ggagctgaac 600 aataggctgt tcccatgtag ccccctggcc tctgtgcctt cttttgatta tgttttttaa 660 aatatttatc tgattaagtt gtctaaacaa tgctgatttg gtgaccaact gtcactcatt 720 gctgagcctc tgctccccag gggagttgtg tctgtaatcg ccctactatt cagtggcgag 780 atctaga 787 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:8:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 839 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA

68.670/BE (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: full length Granzyme B (B) LOCATION: 1..839 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :8:

atgcaaccaa tcctgcttct gctggccttc ctcctgctgc ccagggcaga tgcaggggag 60 atcatcgggg gacatgaggc caagccccac tcccgcccct acatggctta tcttatgatc 120 tgggatcaga agtctctgaa gaggtgcggt ggcttcctga tacaagacga cttcgtgctg 180 acagctgctc actgttgggg aagctccata aatgtcacct tgggggccca caatatcaag 240 gaacaggagc cgacccagca gtttatccct gtgaaaagag ccatccccca tccagcctat 300 aatcctaaga acttctccaa tgacatcatg ctactgcagc tggagagaaa ggccaagcgg 360 accagagctg tgcagcccct caggctacct agcaacaagg cccaggtgaa gccagggcag 420 acatgcagtg tggccggctg ggggcagacg gcccccctgg gaaaacactc acacacacta 480 caagaggtga agatgacagt gcaggaagat cgaaagtgcg aatctgactt acgccattat 540 tacgacagta ccattgagtt gtgcgtgggg gacccagaga ttaaaaagac ttcctttaag 600 ggggactctg gaggccctct tgtgtgtaac aaggtggccc agggcattgt ctcctatgga 660 cgaaacaatg gcatgcctcc acgagcctgc accaaagtct caagctttgt acactggata 720 aagaaaacca tgaaacgcta ctaactacag gaagcaaact aagcccccgc tgtaatgaaa 780 caccttctct ggagccaagt ccagatttac actgggagag gtgccagcaa ctgaataaa 839 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :9:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 782 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: truncated Granzyme B (devoid of the leader peptide and inactivating dipeptide) (B) LOCATION: 1..782 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :9:

atgatcatcg ggggacatga ggccaagccc cactcccgcc cctacatggc ttatcttatg 60 atctgggatc agaagtctct gaagaggtgc ggtggcttcc tgatacaaga cgacttcgtg 120 ctgacagctg ctcactgttg gggaagctcc ataaatgtca ccttgggggc ccacaatatc 180 aaggaacagg agccgaccca gcagtttatc cctgtgaaaa gagccatccc ccatccagcc 240 tataatccta agaacttctc caatgacatc atgctactgc agctggagag aaaggccaag 300 cggaccagag ctgtgcagcc cctcaggcta cctagcaaca aggcccaggt gaagccaggg 360 cagacatgca gtgtggccgg ctgggggcag acggcccccc tgggaaaaca ctcacacaca 420

68.670/BE ctacaagagg tgaagatgac agtgcaggaa gatcgaaagt gcgaatctga cttacgccat 480 tattacgaca gtaccattga gttgtgcgtg ggggacccag agattaaaaa gacttccttt 540 aagggggact ctggaggccc tcttgtgtgt aacaaggtgg cccagggcat tgtctcctat 600 ggacgaaaca atggcatgcc tccacgagcc tgcaccaaag tctcaagctt tgtacactgg 660 ataaagaaaa ccatgaaacg ctactaacta caggaagcaa actaagcccc cgctgtaatg 720 aaacaccttc tctggagcca agtccagatt tacactggga gaggtgccag caactgaata 780 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :10:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 833 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: inactivating di-peptide deleted Granzyme B (B) LOCATION: 1..833 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :10:

atgcaaccaa tcctgcttct gctggccttc ctcctgctgc ccagggcaga tgcaatcatc 60 gggggacatg aggccaagcc ccactcccgc ccctacatgg cttatcttat gatctgggat 120 cagaagtctc tgaagaggtg cggtggcttc ctgatacaag acgacttcgt gctgacagct 180 gctcactgtt ggggaagctc cataaatgtc accttggggg cccacaatat caaggaacag 240 aagccgaccc agcagtttat ccctgtgaaa agagccatcc cccatccagc ctataatcct 300 aagaacttct ccaatgacat catgctactg cagctggaga gaaaggccaa gcggaccaga 360 gctgtgcagc ccctcaggct acctagcaac aaggcccagg tgaagccagg gcagacatgc 420 agtgtggccg gctgggggca gacggccccc ctgggaaaac actcacacac actacaagag 480 gtgaagatga cagtgcagga agatcgaaag tgcgaatctg acttacgcca ttattacgac 540 agtaccattg agttgtgcgt gggggaccca gagattaaaa agacttcctt taagggggac 600 tctggaggcc ctcttgtgtg taacaaggtg gcccagggca ttgtctccta tggacgaaac 660 aatggcatgc ctccacgagc ctgcaccaaa gtctcaagct ttgtacactg gataaagaaa 720 accatgaaac gctactaact acaggaagca aactaagccc ccgctgtaat gaaacacctt 780 ctctggagcc aagtccagat ttacactggg agaggtgcca gcaactgaat aaa 833 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :11:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 114 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear

68.670/BE (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: enhancer region 3: -234 to -120 TNF-alpha promoter (B) LOCATION: 1..114 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :11:

gcagggagga tggggagtgt gaggggtatc cttgatgctt gtgtgtcccc aactttccaa 60 atccccgccc ccgcgatgga gaagaaaccg agacagaagg tgcagggccc acta 114 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :12:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 169 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: enhancer region 4: -234 to -65 TNF-alpha promoter (B) LOCATION: 1..169 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :12:

gcagggagga tggggagtgt gaggggtatc cttgatgctt gtgtgtcccc aactttccaa 60 atccccgccc ccgcgatgga gaagaaaccg agacagaagg tgcagggccc actaccgctt 120 cctccagatg agctcatggg tttctccacc aaggaagttt tccgctggt 169 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :13:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 2270 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA

68.670/BE (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: chimeric gene : -706TNFpGB3'UTR (B) LOCATION: 1.. 2270 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :13:

ctcgagtcct tggaagccaa gactgaaacc gaagaaggcc tgccccagtg gggtctgtga tgtcccaggc ttgtccctgc tacccccacc aagcccccag ctccttctcc ccgcagggac ttttccctcc aaccccgttt tctctccctc ttctagttct atctttttcc tgcatcctgt ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg tccagggtcc tacacacaaa tcagtcagtg gggaggatgg ggagtgtgag gggtatcctt cccgcccccg cgatggagaa gaaaccgaga ccagatgagc tcatgggttt ctccaccaag cccgccctcc tctcgcccca gggacatata acgctccctc agcagatcta tgcaaccaat cagggcagat gcaatcatcg ggggacatga ttatcttatg atctgggatc agaagtctct cgacttcgtg ctgacagctg ctcactgttg ccacaatatc aaagaacagg agccgaccca ccatccagcc tataatccta agaacttctc aaaggccaag cggaccagag ctgtgcagcc gaagccaggg cagacatgca gtgtggccgg ctcacacaca ctacaagagg tgaagatgac cttacgccat tattacgaca gtaccattga gacttccttt aagggggact ctggaggccc tgtctcctat ggacgaaaca atggcatgcc tgtacactgg ataaagaaaa ccatgaaacg atccaacctt cccaaacgcc tcccctgccc ccctcaacct cttctggctc aaaaagagaa gaactttaag caacaagacc accacttcga cagtgaagtg ctggcaacca ctaagaattc tacagctttg atccctgaca tctggaatct aatgctgcag gacttgagaa gacctcacct cctctctcca gatgtttcca gacttccttg cagctccctc tatttatgtt tgcacttgtg tttacagatg aatgtattta tttgggagac ctgccttggc tcagacatgt tttccgtgaa tagccccctg gcctctgtgc cttcttttga gttgtctaaa caatgctgat ttggtgacca caggggagtt gtgtctgtaa tcgccctact agcattatga gtctccgggt cagaatgaaa 60 attcccgggg gtgatttcac tccccggggc 120 cagcctttcc tgaggctcaa gcctgccacc 180 ccaaacacag gcctcaggac tcaacacagc 240 aaggactcag ctttctgaag cccctcccag 300 ctggaagtta gaaggaaaca gaccacagac 360 ttttgagggg catggggacg gggttcagcc 420 gcccagaaga cccccctcgg aatcggagca 480 gatgcttgtg tgtccccaac tttccaaatc 540 cagaaggtgc agggcccact accgcttcct 600 gaagttttcc gctggttgaa tgattctttc 660 aaggcagttg ttggcacacc cagccagcag 720 cctgcttctg ctggccttcc tcctgctgcc 780 ggccaagccc cactcccgcc cctacatggc 840 gaagaggtgc ggtggcttcc tgatacaaga 900 gggaagctcc ataaatgtca ccttgggggc 960 gcagtttatc cctgtgaaaa gacccatccc 1020 caacgacatc atgctactgc agctggagag 1080 cctcaggcta cctagcaaca aggcccaggt 1140 ctgggggcag acggcccccc tgggaaaaca 1200 agtgcaggaa gatcgaaagt gcgaatctga 1260 gttgtgcgtg ggggacccag agattaaaaa 1320 tcttgtgtgt aacaaggtgg cccagggcat 1380 tccacgagcc tgcaccaaag tctcaagctt 1440 ctactaagaa ttctctagag gaggacgaac 1500 caatcccttt attaccccct ccttcagaca 1560 ttgggggctt agggtcggaa cccaagctta 1620 aacctgggat tcaggaatgt gtggcctgca 1680 aaactggggc ctccagaact cactggggcc 1740 ggagaccagg gagcctttgg ttctggccag 1800 agaaattgac acaagtggac cttaggcctt 1860 agacacggag cccagccctc cccatggagc 1920 attatttatt atttatttat tatttattta 1980 cggggtatcc tgggggaccc aatgtaggag 2040 aacggagctg aacaataggc tgttcccatg 2100 ttatgttttt taaaatattt atctgattaa 2160 actgtcactc attgctgagc ctctgctccc 2220 attcagtggc gagatctaga 2270

68.670/BE (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO :14:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 2570 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: DNA (vi) ORIGINAL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (ix) FEATURE:

(A) NAME/KEY: chimeric gene : -1005TNFpGB3'UTR (B) LOCATION: 1..2570 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO :14:

ctcgagggcg ggggtcaggg agctcctggg atgggttaca ggagacctct ggggagatgt ggctatggaa gtcgagtatg gggacccccc ccagggagtg aaagagcctc caggacctcc atatggccac acactggggc cctgagaagt agagttcctt ggaagccaag actgaaacca aagaaggcct gccccagtgg ggtctgtgaa gtcccaggct tgtccctgct acccccaccc aagcccccag ctccttctcc ccgcagggac ttttccctcc aaccccgttt tctctccctc ttctagttct atctttttcc tgcatcctgt ctggtcccca aaagaaatgg aggcaatagg tccagggtcc tacacacaaa tcagtcagtg gggaggatgg ggagtgtgag gggtatcctt cccgcccccg cgatggagaa gaaaccgaga ccagatgagc tcatgggttt ctccaccaag cccgccctcc tctcgcccca gggacatata acgctccctc agcagatcta tgcaaccaat cagggcagat gcaatcatcg ggggacatga ttatcttatg atctgggatc agaagtctct cgacttcgtg ctgacagctg ctcactgttg ccacaatatc aaagaacagg agccgaccca ccatccagcc tataatccta agaacttctc aaaggccaag cggaccagag ctgtgcagcc gaagccaggg cagacatgca gtgtggccgg ctcacacaca ctacaagagg tgaagatgac cttacgccat tattacgaca gtaccattga gacttccttt aagggggact ctggaggccc tgtctcctat ggacgaaaca atggcatgcc tgtacactgg ataaagaaaa ccatgaaacg atccaacctt cccaaacgcc tcccctgccc ccctcaacct cttctggctc aaaaagagaa gaactttaag caacaagacc accacttcga cagtgaagtg ctggcaacca ctaagaattc tacagctttg atccctgaca tctggaatct agatatggcc acatgtagcg gctctgagga 60 gaccacagca atgggtagga gaatgtccag 120 cttaacgaag acagggccat gtagagggcc 180 aggtatggaa tacaggggac gtttaagaag 240 gagagcttca tgaaaaaaat cagggacccc 300 gcattatgag tctccgggtc agaatgaaag 360 ttcccggggg tgatttcact ccccggggct 420 agcctttcct gaggcctcaa gcctgccacc 480 ccaaacacag gcctcaggac tcaacacagc 540 aaggactcag ctttctgaag cccctcccag 600 ctggaagtta gaaggaaaca gaccacagac 660 ttttgagggg catggggacg gggttcagcc 720 gcccagaaga cccccctcgg aatcggagca 780 gatgcttgtg tgtccccaac tttccaaatc 840 cagaaggtgc agggcccact accgcttcct 900 gaagttttcc gctggttgaa tgattctttc 960 aaggcagttg ttggcacacc cagccagcag 1020 cctgcttctg ctggccttcc tcctgctgcc 1080 ggccaagccc cactcccgcc cctacatggc 1140 gaagaggtgc ggtggcttcc tgatacaaga 1200 gggaagctcc ataaatgtca ccttgggggc 1260 gcagtttatc cctgtgaaaa gacccatccc 1320 caacgacatc atgctactgc agctggagag 1380 cctcaggcta cctagcaaca aggcccaggt 1440 ctgggggcag acggcccccc tgggaaaaca 1500 agtgcaggaa gatcgaaagt gcgaatctga 1560 gttgtgcgtg ggggacccag agattaaaaa 1620 tcttgtgtgt aacaaggtgg cccagggcat 1680 tccacgagcc tgcaccaaag tctcaagctt 1740 ctactaagaa ttctctagag gaggacgaac 1800 caatcccttt attaccccct ccttcagaca 1860 ttgggggctt agggtcggaa cccaagctta 1920 aacctgggat tcaggaatgt gtggcctgca 1980 aaactggggc ctccagaact cactggggcc 2040 ggagaccagg gagcctttgg ttctggccag 2100

68.670/BE aatgctgcag gacttgagaa gacctcacct agaaattgac acaagtggac cttaggcctt 2160 cctctctcca gatgtttcca gacttccttg agacacggag cccagccctc cccatggagc 2220 cagctccctc tatttatgtt tgcacttgtg attatttatt atttatttat tatttattta 2280 tttacagatg aatgtattta tttgggagac cggggtatcc tgggggaccc aatgtaggag 2340 ctgccttggc tcagacatgt tttccgtgaa aacggagctg aacaataggc tgttcccatg 2400 tagccccctg gcctctgtgc cttcttttga ttatgttttt taaaatattt atctgattaa 2460 gttgtctaaa caatgctgat ttggtgacca actgtcactc attgctgagc ctctgctccc 2520 caggggagtt gtgtctgtaa tcgccctact attcagtggc gagatctaga 2570

68.670/BE

Claims (18)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Kiméra nukleinsavmolekula, amely legalább egy TNFa-promóterenhanszer-régiót tartalmaz TNFa-promóterhez kapcsolva, az enhanszerrégió 4., 5., 11-, 12. számú szekvenciát vagy ezek konzervatív szubsztitúcióját vagy allélvariánsait tartalmazza;

   TNFa-promóter továbbá Granzyme-B-fehérjét vagy konzervatív szubsztitúcióját vagy allélvariánsait kódoló nukleinsav-szekvenciához van kapcsolva, amely viszont továbbá 3' UTR-nukleinsav-szekvenciához van kapcsolva.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekula, amely kettő és öt közötti TNFa-promóterenhanszer-régiót tartalmaz, és amelyben bármelyik enhanszer-régió 5., 12. számú szekvenciát vagy ezek kombinációit tartalmazza.
3. 3. A 2. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekula, amelyben a TNFa-promóter 1., 2., 3. számú szekvenciát vagy ezek konzervatív szubsztitúcióját vagy allélvariánsait tartalmazza.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekula, amely nukleinsavmolekulaként 13., 14. számú szekvenciát vagy ezek konzervatív szubsztitúcióját vagy allélvariánsait tartalmazza.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekula, amelyben a 3' -UTR a Granzyme-B-nukleinsavszekvenciától szintézisirányban van ligáivá.
6. 6. Gyógyszerkészítmény, amely 1. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekulát tartalmaz.
7. 7. Eljárás gyulladásos rendellenesség kezelésére egy páciens

   68.670/BE ben, azzal jellemezve, hogy ilyen kezelésre szoruló páciensnek beadunk 6. igénypont szerinti készítményt, gyógyászatilag hatásos mennyiségben.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyulladásos rendellenességként reumatoid artritiszt, szklerózis multiplexet, Guillain-Barre-féle szindrómát, Crohn-féle betegséget, fekélyes vastagbélgyulladást, pikkelysömört (psoriasist), Graft-versus-host betegséget, lupusz eritematózust, inzulinfüggő diabetes mellitust, pszoriázisos ízületi gyulladást (artritiszt) , szarkoidózist, hiperszenzitív pneumonitiszt (allergiás túlérzékenység okozta tüdőgyulladást), spondilitisz ankilopoetikát, Reiter-féle szindrómát vagy szisztémás szklerózist kezelünk .
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gyulladásos rendellenességként reumatoid artritiszt kezelünk.
10. 10. Eljárás minimális TNFa-promóter funkcionális kópiájához, és továbbá funkcionális apoptózist indukáló nukleinsavmolekula legalább egy kópiájához kapcsolt, legalább egy TNFa-promóterenhanszert tartalmazó, kiméra nukleinsavmolekula előállítására, amely apoptózist indukáló nukleinsav expresszióját a TNFa-promóter vezérli, azzal jellemezve, hogy (a) TNFa-promótert tartalmazó nukleinsav molekulát amplifikálunk polimeráz láncreakcióval, a TNFa-promóter deléciós konstrukcióit tartalmazó primerek alkalmazásával;

    (b) klónozzuk az (a)-lépésben kapott, PCR-el amplifikált nukleinsavat egy riporter-nukleinsavtól szintézisiránnyal szemben, egy konstrukciót előállítva;

    68.670/BE

    Mr * · ♦ · • · · » * Λ * * . -· « · * ·. * * '. · * ♦ * (c) teszteljük a (b)-lépésben kapott konstrukciókat konstitutív és indukálható expresszióra legalább egy, TNFa-t termelő sej tvonalban;

    (d) szelektáljuk a sejtvonalban a riporter indukálható expressziójáért felelős TNFa-promótert;

    (e) PCR-el amplifikáljuk azokat a TNFa-promóterrégiókat, amelyek a riporter expresszióját fokozzák, így egy enhanszerhez jutunk, és az enhanszer legalább egy kópiáját ligáljuk a promótertől szintézisiránnyal szemben;

    (f) inszertálunk legalább egy kópia, apoptózist indukáló nukleinsavat a TNFa-promótertől szintézisirányban, helyettesítve a riportert az apoptózist indukáló deléciós nukleinsav-konstrukciókkal; és (g) PCR-el amplifikálunk egy TNFa-3' -UTR-t, és az apoptózist indukáló nukleinsav-molekulától szintézisirányban ligáljuk, a kiméra nukleinsavmolekulát előállítva.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy két vagy több kópia enhanszert inszertálunk a promótertől szintézisiránnyal szemben.
12. 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy riporter nukleinsavszekvenciaként luciferázt alkalmazunk.
13. 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 4., 5., 11 vagy 12. számú szekvenciát tartalmazó enhanszert alkalmazunk .
14. 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy apoptózist indukáló nukleinsavként Granzyme-B-t vagy konzervatív szubsztitúcióit vagy allélvariánsait alkalmazzuk.

    68.670/BE
15. 15. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 13., 14. számú szekvenciával vagy konzervatív szubsztitúciójával vagy allélvariánsaival rendelkező kiméra nukleinsavmolekulát állítunk elő.
16. 16. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a konstrukciók tesztelésére szolgáló sejtvonalként például Tlimfoblasztóid, mielomonocita, monocita, fibroblaszt vagy tenyésztett humán szinoviocita vagy RA-ízületekben lévő primer sejtekből álló sejtvonalat alkalmazunk.
17. 17. Eljárás domináns negatív gének szűrésére, azzal jellemezve, hogy TNFa-t nem termelő sejtpopulációt transzfektálunk 1. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekulát tartalmazó szekvenciával; stimuláljuk az inszertált szekvencia expresszióját; és domináns negatív génekkel rendelkező, túlélő sejteket szelektálunk .
18. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 2. igénypont szerinti kiméra nukleinsavmolekulát tartalmazó szekvenciával transzfektálunk.

    A meghatalmazott:

    68.670/BE