HUP9904413A2 - A kávénövények érését szabályozó tisztított fehérjék, rekombináns DNS-szekvenciák és eljárások - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát tisztítőtt fehérjék és az ezeket kódőló DNS-szekvenciák és rekőmbináns DNS-mőlekűlák képezik, beleértve az ezekkeltranszfőrmált kávénövényeket, az etilén szintéziséhez szükségesenzimek expressziójának szűpresszálására. A DNS-szekvenciákra és arekőmbináns DNS-mőlekűlákra jellemző, hőgy őlyan ACC-szintetáz vagyACC-őxidáz enzimek expressziójáért felelősek, amelyek akávénövényekben az etilén biőszitnézisút elemei. A kávénövényeketőlyan vektőrőkkal transzfőrmálták, amelyek az ACC-szintetáz és/vagyACC őxidáz DNS-szekvenciákat a megfelelő ACC-szintetáz és/vagy ACC-őxidáz mRNS-re nézve antiszensz irányban tartalmazzák. Az eredményülkapőtt antiszensz mRNS az XMI mRNS-hez kapcsőlódik, ezáltal azetilénszintézis anyagcsereútjában lévő egy vagy két enzimet kódőlómRNS-t inaktiválja. A leírt DNS-szekvenciákat felhasználhatják arrais, hőgy kőszűpresszivóal az ACC-szintetáz vagy ACC-őxidáz szintézisétblőkkőlják. Mindkét esemény eredményeként a transzfőrmált sejtekképtelenné válnak az etilén szintetizálására, anélkül, hőgyanyagcseréjük más módőn megváltőzőtt vőlna. ŕ

Description

6*7.241/SZE

S.B. G. & K.

Nemzetközi

Szabadalmi Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113 Telefon: 34-24-950, Fax: 34 24-323

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

A kávénövények érését szabályozó tisztított fehérjék, rekombináns

DNS szekvenciák és eljárások

A találmány tárgyát a kávénövények érésének szabályozására szolgáló tisztított fehérjék, rekombináns DNS szekvenciák, az ezekkel transzformált gazdák és eljárások képezik. Részletesebben, ezen szabadalmi leírás tisztított fehérjékre és olyan rekombináns DNS szekvenciákra vonatkozik, amelyek a kávé termésére specifikus 1aminociklopropán-l-karboxilsav(ACC) szintetáz és az ACC oxidáz gének expressziójának szupresszálására használhatók. A találmány továbbá az ilyen szekvenciákkal transzformált kávénövényekre vonatkozik, ezzel a beavatkozással a növények az éréshez szükséges etilén szintézisére képtelenné válnak. A találmány külső eredetű etilén felhasználásával lehetővé teszi a transzformált kávénövények termésének szinkronizált és szabályozott érését.

A kávét a Coffea genuszba tartozó növények, általában a C. arabica faj, pörkölt magjaiból állítják elő. A babok a kávénövény magjai és a termés feldolgozásával nyerik, kiváló minősége miatt a légideálisabbra érlelt termés uralja az árat. A múltban a jó minőségű gourmet kávét kézzel szedték. Erre szükség van, mivel a kávéfa termése nem egységesen érik, és így egyazon fán érett és éretlen termések egyaránt vannak. A múltban ez nem okozott komoly problémát, mivel a legtöbb kávét a föld olyan régióiban termesztették, ahol a munkaerő bőségesen rendelkezésre állt és olcsó volt. A munkaerő-felesleg és az olcsó munkaerő megszűnése napjainkban a kávétermelés gazdaságosságának fő csökkentő tényezője. A világ egyes régióiban, mint például a legnagyobb kávétermelő országban Brazíliában - a termelékenység növelésére azt a megoldást választották, hogy a termést lekopasztással gyűjtik be, azaz a munkások gyorsan minden termést eltávolítanak az ágakról, függetlenül attól, hogy azok érettek vagy éretlenek. Ez növeli a begyűjtés sebességét, de csökkenti a jobb minőségű babok mennyiségét, mivel a termés egy része éretlen (zöld).

Továbbá, az egységes érés hiánya súlyosan korlátozza a mechanikai begyűjtés hatékonyságát. A fáról az érett termés (ami a cseresznyéhez hasonlít) eltávolításához szükséges mechanikai erő megegyezik a zöld termés leszedéséhez szükséges erővel. így a mechanikai betakarítógépek nem tesznek megfelelő különbséget a zöld és az érett cseresznyeszerú termés között, és így az érett terméssel együtt jelentős mennyiségű éretlen termést is begyújtenek. Ez nagymértékben csökkenti az érett termés hozamát és korlátozza a termelékenységet. Ha a kávé termésének érését úgy szabályozhatnánk, hogy minden termés egy időben érjen, akkor mind a lekopasztási eljárás, mind a kézzel gyűjtés sokkal hatékonyabbá válna és a begyűjtött termés minősége jobb lenne. Ez növelné a kávétermelés jövedelmezőségét.

Ahogy több más gyümölcsnél [Yang és Hoffman: Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 155(1984)], ugyanúgy a kávénál, az érés végső stádiumában, a növény által termelt etilén fontos szerepet játszik. Ha a kávé termésének érése az érettség egy bizonyos állapotát eléri, akkor külső eredetű etilén alkalmazásával a termések indukálhatóvá válnak [Crisosto és mtsai: J. Haw. Pac. Agri. 3, 13-17(1991)]. Ez az etilén jelentőségét mutatja a kávé termésének végső érési folyamatában.

Az etilén egy kétlépéses reakcióban S-adenozil-metioninból (SAM) szintetizálódik. Az első lépésben SAM-ból az ACC szintetáz 1aminociklopropán-l-karboxilsavat (ACC) képez. A legtöbb növényben ez egy sebességmeghatározó lépés. A végső lépés az ACC konverziója etilénné, amit az ACC oxidáz katalizál [Yang és Hoffman: Ann. Rev. Plant Physiol. 35, 155(1984)].

¹ Az etilén bioszintézisének kémiai (például ezüstionok, vagy széndioxid) vagy biotechnológiai [Oeller és mtsai: Science 254, 437(1991)] gátlása blokkolja az érés végső fázisait. Ez a gátlás etilénnel megfordíthatóvá válik.

Ennek megfelelően, a kávénövények szabályozott érésének egyik stratégiájában, az etilén bioszintézisútban lévő specifikus enzimek szintézisét gátoljuk. A jelen találmány egyik megvalósítási formája a kávénövények genetikai megváltoztatására vonatkozik az ACC szintetáz szintézisének kiküszöbölése révén; míg egy másik az ACC oxidáz szintézisének szupresszióját alkalmazza. A bemutatott előnyben részesített megvalósítási formákban ezen enzimek közül az egyiket vagy mindkettőt szupresszáljuk a kávénövények olyan DNS-sel történő transzformálásával, amely egy olyan mRNS átiratát kódolja, ami antiszensz arra az mRNS-re nézve, amely a szupresszálandó enzim szintézisének expressziójáért felelős részt kódolja. Lásd Oeller és munkatársainak munkásságát, akik hasonló stratégia felhasználásával a paradicsom érésének szabályozásáról számoltak be [Oeller és mtsai: Science 254, 437(1991)].

Számos ACC szintetáz és ACC oxidáz gén izolálásához rekombináns DNS technikákat alkalmaztak. Bár, napjainkig a kávéban lévő ACC szintetáz és ACC oxidáz géneket még nem azonosították vagy még nem szekvenálták.

Az etilén szintézishez szükséges enzimek szupressziójának elérése érdekében a kávé gazdanövények transzformálásához a tisztított fehérjék alapján meghatározott kódoló DNS szekvenciákat és rekombináns DNS molekulákat használtunk fel. A DNS szekvenciákra és a rekombináns DNS molekulákra jellemző, hogy azok a kávénövényekben lévő etilén bioszintézisút elemei közé tartozó expresszált ACC szintetáz enzim vagy ACC oxidáz enzim kódjának felelnek meg.

Az ACC szintetáz és/vagy az ACC oxidáz DNS szekvenciákat tartalmazó vektorokkal a kávénövényeket transzformáltuk. A vektorba a megfelelő RNS kialakításáért felelős transzformációs szekvenciákat úgy inszertáltuk, hogy azok az expresszált ACC szintetáz és/vagy az ACC oxidáz mRNS-éhez képest antiszensz irányultságú RNS-t eredményezzenek. Az eredményül kapott antiszensz RNS kötődik az mRNS-(ek)hez, ezzel az etilén szintézis bioszintézisútjában lévő enzimet kódoló egy vagy több mRNS inaktiválódik. A leírt DNS szekvenciákat az ACC szintetáz vagy ACC oxidáz szintézisének blokkolásában is lehet alkalmazni, a ko-szupresszió felhasználásával. Mindkét megközelítési forma eredménye az, hogy a transzformált növények képtelenné válnak etilén szintézisére anélkül, hogy ez anyagcseréjük bármely más területét befolyásolná.

A transzformált növények termésének érése exogén etilénnel szabályozhatóvá válik. Az etilén alkalmazása teljes növénynél a növény összes termésének éréséhez vezet, ami lehetővé teszi a kávé hatékonyabb mechanikai betakarítását.

Ezután ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábra egy olyan teljes cDNS szekvencia, ami a kávé termésében expresszálódó ACC szintetázt kódolja.

A 2. ábra a kávé termésében található ACC szintetáz azon aminosavszekvenciáját mutatja be, amit az 1. ábrán bemutatott cDNS szekvencia alapján határoztunk meg.

A 3. ábra egy olyan cDNS szekvencia, ami a kávé termésében expresszálódó ACC oxidázt kódolja.

A 4. ábra a kávé termésében található ACC oxidáz azon aminosavszekvenciáját mutatja be, amit a 3. ábrán bemutatott cDNS szekvencia alapján határoztunk meg.

Azért, hogy az itt leírt találmány részleteiben jobban érthetővé váljon, a következő részletes leírást tesszük közzé. A leírásban a következő szakkifejezéseket használtuk:

' Nukleotid: a DNS vagy az RNS molekulák monomer egysége, ami egy cukorcsoportból (pentóz), egy foszfátcsoportból és egy nitrogént tartalmazó heterociklikus bázisból épül fel. A bázis a cukorcsoporhoz glikozidos szénatomon (a pentóz 1' szénatomja) keresztül van hozzákötve, a bázis és a cukor ilyen kombinációját nukleozidnak nevezik. A négy DNS bázis az adenin (A), a guanin (G), a citozin (C) és a timin (T). A négy RNS bázis az A, G, C és az uracil (U).

DNS szekvencia: a nukleotidok lineáris elrendezése, amiben az egyik a nukleotida másikhoz az egymás mellett lévő 3' és 5' szénatomok között kialakult foszfodiészter kötések révén kapcsolódik.

Kodon: három nukleotidot tartalmazó DNS szekvencia (triplett), ami mRNS-en keresztül egy aminosavat, egy transzlációs kezdőjelet, vagy egy transzlációt befejező jelet kódol. Például, a TTA, TTG, CTT, CTC, CTA és CTG nukleotid tripletek a leucin (Leu) aminosavat kódolják, a TAG, TAA és a TGA transzlációt befejező jelek, és az ATG transzlációs kezdőjel, ami egyben a metionin (Met) aminosavat is kódolja.

Polipeptid: az aminosavak lineáris elrendezése, amelyet az aminosavak karboxil- és aminocsoportja peptidkötésen keresztül kapcsol egybe.

' Genom: egy sejt vagy egy vírus teljes DNS-e. Inter alia tartalmaz polipeptid anyagokat kódoló strukturális géneket, valamint promotert, transzkripciós és transzlációs kezdő és befejező helyeket.

Gén: Egy olyan DNS szekvencia, amely templátján vagy mRNS-én keresztül egy specifikus polipeptidre jellemző aminosavszekvenciát kódol.

Transzkripció: az a folyamat, amely során egy gén vagy DNS szekvencia alapján mRNS keletkezik.

Transzláció: az a folyamat, amely során mRNS segítségével egy polipeptid képződik.

Expresszió: polipeptid kialakításéira egy génnel vagy DNS szekvenciával végbemenő folyamat. Nem más mint a transzkripció és a transzláció kombinációja.

Plazmid: egy olyan nem-kromoszómédis, duplaszálú DNS szekvencia, amely egy sértetlen replikont tartalmaz úgy, hogy az a gazdasejtben lehetővé teszi a plazmid replikációját. Ha a plazmidot egysejtű szervezetbe juttatjuk be, akkor a plazmid DNS hatására a szervezet jellemzői megváltozhatnak, vagy átalakulhatnak. Például, ha egy tetraciklin rezisztenciát (TETR) hordozó plazmiddal transzformáljuk az előzőleg tetraciklinre érzékeny sejtet, akkor így az rezisztensé válik. A plazmiddal transzformált sejtet transzformánsnak hívjuk.

' Fág vagy bakteriofág: bakteriális vírusok, amelyek legtöbbje fehérje burokba vagy tokba (kapszid) bezárt DNS szekvenciát tartalmaz.

A klónozáshoz használt hordozó: ez lehet plazmid, fág DNS, kozmid vagy más DNS szekvencia, ami a gazdasejtben képes replikálódni, jellemzője, hogy egy vagy kisszámú endonukleáz hasítóhelyet tartalmaz, melynél az ilyen DNS szekvenciák meghatározott módon vághatok anélkül, hogy ennek következtében a DNS lényeges biológiai funkciója elveszne, mint például a replikáció, a burokfehérjék termelése, vagy anélkül hogy a promoter vagy a kötőhelyek elvesznének, és amelyek a transzformált sejtek azonosítására alkalmas markereket tartalmaznak, mint például tetraciklin vagy ampicillin elleni rezisztenciát. A klónozáshoz használt hordozó molekulát gyakran vektornak nevezik.

Klónozás: egy olyan eljárás, mely soréin ivartalan szaporítással a szervezetek vagy DNS szekvenciák egy sokaságát kapjuk meg az ilyen szervezetből vagy szekvenciából.

Rekombináns DNS molekula vagy hibrid DNS: egy olyan különböző genomokból származó DNS szegmenst tartalmazó molekula, amelyet az élő sejteken kívül egymás végeihez csatoltak, és amely képes az élő sejtekben fennmaradni.

.......

' eDNS: egy adott polipeptidet kódoló mRNS-sel komplementer DNS szál.

A jelen találmány a kávénövényekben az etilén bio szintézisének szabályozására szolgáló stratégiájában első esetben foglalkozik azon gének meghatározásával, amelyek az etilén anyagcsereút két enzimét kódolja, nevezetesen az ACC szintetáz és az ACC oxidáz expressziójáért felelős gént. A szóban forgó enzimek szintézisének blokkolása elvárható, abban az esetben, ha a vadtípusú kávénövények transzformációja az egyik vagy mindkét gént tartalmazó olyan konstrukciókkal történik, amelyekben a gén vagy a gének a normális génekhez képest antiszensz irányban helyezkednek el. A transzformáló szekvencia irányának megfelelően átíródott mRNS a normális irányban átíródó mRNS-hez hozzákötődik, ezzel a normális hírnök molekulát inaktiválja és az enzim szintézisét gátolja.

A kávénövényekben lévő ACC szintetáz és ACC oxidáz enzimek expressziójáért felelős DNS szekvenciák izolálására a kávénövényből készített cDNS könyvtárat szűrtük olyan szintetikus DNS próbákkal, amelyek esetében elvártuk, hogy az előforduló nukleotid szekvenciákat tartalmazzák. Ezek az elvárt szekvenciák olyan nukleotid szekvenciák tanulmányozásán alapultak, amelyek más hasonló klímáin élő és egyéb növényekben a megfelelő enzimet kódoló génekben előfordulnak.

Az ACC szintetázt vagy az ACC oxidázt kódoló génnek megfelelő cDNS-t felhasználtuk az embrionális kávénövények transzformálásához. Transzformáló vektorként a pBI-121 plazmidot használtuk. Az ACC szintetáz vagy az ACC oxidáz expressziójáért felelős kódoló DNS szekvenciát megfordított irányban a karfiolmozaik vírus 35S promotere mellé a plazmidba inszertáltuk. Az erről átírt RNS komplementer a megfelelő enzimek aminosavszekvenciáját kódoló mRNS-sel. A teljes konstrukciót bakteriális gazdákban '· >

megsokszoroztuk. A gazdákat szétroncsoltuk és a sokszorozott vektort kolloidális aranyhoz kapcsoltuk. A vektort tartalmazó, nagy sebességre felgyorsított aranyrészecskéket bejuttattuk a kávénövény szöveteinek sejtjeibe, ahogy azt az 5,107,065 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi bejelentésben leírták. A sikeresen transzformált fiatal növényeket antibiotikum rezisztenciájuk alapján azonosítottuk. Attól függően, hogy a növények transzformációjához milyen gént használtunk, a transzformált növények vagy ACC szintetázt vagy ACC oxidázt nem termeltek. A transzformált növények termésének érését exogén etilénnel indítottuk meg.

1. Példa:

A kávétermésre specifikus ACC szintetáz cDNS izolálása:

A kávé termésének érésében résztvevő ACC szintetáz génszekvencia izolálásához egy cDNS könyvtárat készítettünk a különböző érettségi fázisból származó kávé termések perikarpium és mezokarpium szöveteinek keverékéből. Ezt a könyvtárat olyan PCR termék felhasználásával szűrtük, amelyet ugyanazon mRNS-ből készített első-szál cDNS-böl szintetizáltunk, mint amelyet más szervezetekből származó ACC szintetáz szekvenciának megfelelő konszenzus szekvenciák könyvtárainak és degenerált oligonukleotid primerjeinek elkészítéséhez használtunk. Ez a példa lényegében a mRNS izolálásával, egy cDNS könyvtár készítésével és a megfelelő cDNS klónozáséinak további lépéséivel foglalkozik.

a) A mRNS izolálása:

A különböző fejlődési állapotban lévő kávé termés (C. arabic L., cv. Guatemalan) perikarpium és mezokarpium szöveteinek 66 grammjából az össz-RNS-t izoláltuk, felhasználva a Levi és munkatársai által leírtakat [Levi és mtsai: Hort Science 27(12), 1316-1318 (1992)]. A fagyasztott perikarpium és mezokarpium szöveteket két percig tartó őrléssel egy háztartási kávédarálóban (Salton Model GC-5; Salton Maxam Housewares Group, Mt. Prospect, IL) egy kisdarab szárazjéggel együtt porítottuk. A porított termésszövethez a következő összetételű oldatból 200 μΐ adtunk: 200 mM trisz[hidroximetil]aminometán sósav (TRISZ-HC1) (pH 8,5), 1,5 % nátriumdodecilszulfát (SDS), 300 mM LiCl, 10 mM dinátrium-etilén-diamintetraecetsav (NaaEDTA), 1,5 % nátrium-dezoxikolát (vegyes%), 1,5 % Nonidet P-40 (Sigma Chemical Co.) (térfogat%), 0,5 mM tiokarbamid, 1 mM aurintrikarboxilsav, 10 mM ditiotreitol (DTT), 75 mM βmerkaptoetanol, 2 % poli(vinil-pirrolidon) (PVP) és 2 % polivinilpolipirrolidon (PVPP), és ezután Polytron szövethomogenizátorral (Tekmar, Cincinnati, OH) egyenletessé tettük. A 2 percig tartó homogenizálás után 200 μΐ kloroformot adtunk hozzá és a homogenizálást további három percig folytattuk. A homogenizátumot 250 μΐ-es cetrifuga csövekbe (Nalgene) vittük át és 15 percig 2500 g-n centrifugáltuk. A felső vizes fázist eltávolítottuk és 12 μΐ 5 M NaCl-dal összekevertük, egyenlő részben két centrifugacsőbe szétosztottuk, és mindegyikhez 150 μΐ etanolt adtunk. A keveréket egy éjszakán át -20 °C-on tartottuk. Az RNS-t 15 percig tartó 4 °C-on végzett 4000 g-s centrifugálással összegyűjtöttük. Az RNS-t 50 μΐ TE 1-ben (50 mM TRISZ-HC1 [pH = 8,0] , 10 mM Na₂EDTA) feloldottuk és 10 percig tartó 4 °C-on végzett 12000 g-s centrifugálással tisztítottuk. A felülüszót egy új centrifugacsöbe öntöttük és 3 μΐ 5 M NaCl-ot és 30 μΐ izopropanolt adtunk hozzá. Keverés után -20 °C-on egy éjszakán át tároltuk. Az RNS-t 10 percig tartó 14000 g-s centrifugálással összegyűjtöttük. Az RNS-t 20 μΐ 70 %-os jéghideg etanollal mostuk, és az előzőekben leírtaknak megfelelően centrifugálással összegyűjtöttük. A 10 percig tartó vákuumban történt szárítás után az RNS-t 50 μΐ TE1 pufferben felszuszpendáltuk és 10 μΐ 12 M LiCl-ot adtunk hozzá. Az oldatot 4 °Con 48 óráig inkubáltuk, ezután az RNS-t 10 percig tartó 14000 g-s centrifugálással összegyűjtöttük és 30 μΐ TE1 pufferben felszuszpendáltuk. 15 μΐ 5 M kálium-acetát hozzáadása után az RNS-t 0 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk, majd 10 percig tartó 14000 g-s centrifugálással összegyűjtöttük és 50 μΐ TE1 pufferben felszuszpendáltuk. Az RNS-hez 3 μΐ 5 M NaCl-ot és 110 μΐ 95 %-os etanolt adtunk, és az RNS-t - éjszakán át 20 °C-on inkubáltuk. Az RNS-t 10 percig tartó 14000 g-s centrifugálással összegyűjtöttük és 20 μΐ 70 %-os jéghideg etanollal mostuk, a fentiekben leírtaknak megfelelően centrifugálással összegyűjtöttük, 10 percig tartó vákuumban történt szárítás után 600 μΐ TE1 pufferben felszuszpendáltuk. Az RNS-t mikrocentrifugacsövekbe vittük át és centrifugáltuk (14000 g, 30 percig 4 °C), ezután ebből két új mikrocentrifugacsöbe egyenként 300 μΐ-t tettünk. Az eredetileg centrifugált csövet további 300 μΐ TE1 pufferrel mostuk. A három cső fnindegyikéhez külön-külön 18 μΐ 5 M NaCl-ot és 636 μΐ 100 %-os etanolt adtunk. A felfordításokkal végrehajtott keverés után a csöveket éjszakán át -20 °C-on tartjuk. Az RNS-t 30 percig tartó 14000 g-s centrifugálással összegyűjtöttük és 1 μΐ 70 %-os jéghideg etanollal mostuk. A fentiekben leírtaknak megfelelően végzett centrifugálás és szárítás után az RNS-t 400 μΐ steril vízben felvettük. Összesen 1,04 mg ossz-RNS-t kaptunk.

A mRNS-t (poll-A + RNS) a PolyATtract® mRNA izolációs rendszer '· ✓

IV felhasználásával (Promega Corporation, Madison, WI) izoláltuk. Két izoláció összmennyiségét a következőképpen kaptuk meg. Az izolációkhoz egyenként 0,48 mg össz-RNS-t 800 μΐ RNáz-mentes vízben feloldottunk. Miután az össz-RNS-t 10 percig 65 °C-on melegítettük, 3 μΐ 50 pM/ml biotinezett oligo(dT)-t és 20,7 μΐ 20 X SSC-t (az 1 X SSC 150 mM NaCl-t és 15 mM nátrium-citrátot tartalmaz) adtunk hozzá, és a keveréket lassan, hozzávetőleg 30 percig, szobahőmérsékletűre engedtük hülni. A sztreptavidin paramágneses részecskék (a PolyATtrack® mRNA Isolation System IV részeként állt rendelkezésünkre) egy aliquotját háromszor mostuk 0,5 X SSC-ben és 0,1 ml 0,5 X SSC-ben újra felvettük. A biotinezett oligo(dT)-t tartalmazó RNS oldatot hozzáadtuk a mosott sztreptavidin paramágneses részecskékhez. A szobahőmérsékleten végzett 10 percig tartó ihkubálás után a csapdába esett mRNS-t tartalmazó paramágneses részecskéket a cső oldalához helyezett mágnes segítségével kivontuk.

A felülúszót eltávolítottuk és a részecskéket 0,3 ml 0,1 X SSC-vel négyszer mostuk. A mRNS-t a biotinezett oligo(dT) részecskékről 200 μΐ RNáz mentes vízben történt szuszpendálással eltávolítottuk. Egy további lemosást végeztünk úgy, hogy a két csőhöz egymás után 150 μΐ vizet adtunk. A lemosott frakciókat (550 pl) egybegyújtöttük és mikrocentrifugában centrifugáltuk 14000 rpm-mel 30 percig 4 °C-on. A felülúszót két mikrocentrifugacsőbe osztottuk szét, és miután 1/10 térfogat 3 M NaCl-ot és 600 μΐ etanolt adtunk hozzá, az RNS-t a csövek -20 °C-on történő egy éjszakán át tartó inkubálása után a fentiekben leírt centrifugálással kinyertük. Az RNS-t 1 ml jéghideg 70 %-os etanollal egyszer mostuk, és spektrumát 230 nm-től 330 nm-ig Shimadzu UV 160U spektrofotométerrel felvettük. Hozzávetőleg 6 pg mRNS-t nyertünk 1,04 mg össz-RNS-ből.

b) A cDNS könyvtár elkészítése:

Az első és a második cDNS szálakat ZAP-cDNA szintézis készlettel (Stratagene, La Jolla, CA) készítettük el. A 20 μΐ vízben oldott 6 pg mRNS-t 5 percig 65 °C-on inkubáltuk. 2 pl 100 mM metil-higanyt adtunk hozzá és az inkubációt szobahőmérsékleten 10 percig folytattuk. 4 pl 700 mM β-merkaptoetanol hozzáadása után az inkubációt további 5 percig folytattuk. A denaturált mRNS-hez 5 μΐ 10 X elsöszál puffért (a készletben megtalálható), 5 μΐ 100 mM DTT-t, 3 μΐ nukleotid keveréket (a dATP, a dGTP, a dTTP és az 5-metil-dCTP mindegyikéből 10 mM-t tartalmaz), 2 μΐ 1,4 μg/μl linker-primert: 5'-GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTT TTTTTTTT-3' (a szekvencia száma: 1), μΐ RNáz blokkolót és 5 μΐ vizet adtunk. A primernek mRNS-hez történő kapcsolódása érdekében a reakcióelegyet 10 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk és ezután 3 μΐ 20 U/μΙ M-MuLV reverz transzkriptázt adtunk hozzá. A reakcióelegy 0,5 μΐ-ét átraktuk egy olyan csőbe, ami 0,5 μΐ (0,625 pM) 800 Ci/mM [a-³²P] dATP-t tartalmazott. Mindkét reakciót 37 °C-on 1 óráig inkubáltuk. A radioaktívan jelölt reakciót a későbbi gélanalízishez -20 °C-on lefagyasztottuk. A fő reakció 45 μΐ-éhez 40 μΐ másodikszál puffért, 15 μΐ 100 mM DTT-t, 6 μΐ nukleotid keveréket (10 mM dATP, dGTP, dTTP és 26 mM dCTP), 268,3 μΐ vizet és 2 μΐ (2,5 pM) 800 Ci/mM [cr³²P]dATP-t adtunk. Keverés után a reakcióelegyhez 4,5 μΐ 1 U/μΙ RNáz-H-t és 19,2 μΐ 5,2 U/μΙ Escherichia coli DNS polimeráz I-et adtunk és 16 °C-on 2,5 óráig inkubáltuk. A reakcióelegyet 400 μΐ fenol:kloroform (1:1) oldattal extraháltuk. A fázisokat mikrocentrifugában 5 percig tartó centrifugálással elválasztottuk és a vizes fázist leszívtuk majd kloroformmal újból extraháltuk. A vizes fázist az előzőekben leírt centrifugálással nyertük ki.

A kettős szálú cDNS-t 33,3 μΐ 3 M nátrium-acetáttal (pH = 5,2) és 867 μΐ 100 % etanollal kicsaptuk és egy éjszakán át -20 °C-on inkubáltuk. A cDNS-t mikrocentrifugában 4 °C-on végzett 60 percig tartó 14000 g-s centrifugálással kinyertük. A cDNS-t 1 ml 80 %-os etanollal mostuk, szobahőmérsékleten mikrocentrifugában végzett 14000 g-s centrifugálással kinyertük, vákuumban megszárítottuk és 45 μΐ desztillált vízben feloldottuk. A felszuszpendált kettős szálú cDNS-ből 3 μΐ-t eltávolítottunk és a későbbi gélelektroforézises analízishez -20 °C-on tároltuk.

A kettős szálú cDNS megmaradt 42 μΐ-éhez 5 μΐ 10 X Klenow puffért (puffer #3; Stratagene-től szereztük be), 2,5 μΐ 2,5 mM-os nukleotidokat (dCTP, dGTP, dATP és dTTP), és 0,5 μΐ 5 U/μΙ Escherichia coli DNS polimeráz I Klenow fragmenst adtunk. 37 °C-on 30 percig történt inkubálás után 50 μΐ vizet adtunk hozzá, és a reakcióelegyet egyező térfogatú fenol:kloroform (1:1) keverékkel, majd a fentieknek megfelelően kloformmal extraháltuk. Miután 7 μΐ 3 M nátrium-acetátot (pH = 5,2) és 226 μΐ 100 %-os etanolt adtunk hozzá, a csonka végú kettős szálú cDNS-t jégen 30 percig inkubáltuk és mikrocentrifugában 14000 g-vel 4 °C-on 60 percig centrifugáltuk. A c*DNS-t 300 μΐ 70 %-os etanollal mostuk, centrifugáltuk és szárítottuk, ahogy azt az előzőekben már leírtuk. A szárított cDNS-hez 7 μΐ 0,4 μg/μl EcoRI linkért adtunk. Az EcoRI linker felépítése a következő: 5'-AATTCGGCACGAG-3' (2. számú szekvencia)

3'-GCCGTGCTC-5'

Miután vortexszezéssel a cDNS-t felszuszpendáltuk, 1 μΐ 10 X ligáló puffért, 1 μΐ 10 mM ATP-t és 1 μΐ 4 Weiss U/μΙ T4 DNA ligázt adtunk hozzá, majd a reakcióelegyet éjszakán át 8 °C-on inkubáltuk. A ligázt 70 °C-on történő 30 perces melegítéssel inaktiváltuk. Az EcoRI linkerek 5' végeit, amelyek a cDNS-hez nem kapcsolódtak, polinukleotid kináz segítségével foszforileztúk. A ligálási reakcióhoz a ZAP-cDNA szintézis készletben (Stratagene, La Jolla, CA) található hármas számú pufferből 1 μΐ 10 X puffért, 2 μΐ 10 mM ATP-t, 6 μΐ vizet és 1 μΐ 10 U/ml T4 polinukleotid kinázt adtunk. Miután 30 percig 37 °C-on kinázzal kezeltük a reakciót, hőkezeléssel (70 °C, 30 perc) állítottuk le. A linkerprimerben az Xhol ragadós végeket a mRNS 3' végének megfelelő cDNS végén Xhol emésztéssel alakítottuk ki. A cDNS-hez 28 μΐ Xhol puffért és 3 μΐ 40 U/μΙ Xhol restrikciós endonukleázt adtunk hozzá és a reakcióelegyet 37 °C-on 1,5 óráig inkubáltuk.

Az cDNS-t, amely 5' végén EcoRI ragadós végekkel és 3' végén Xhol ragadós végekkel rendelkezik (az eredeti mRNS-hez viszonyítva), egy Sephacryl S-400 spin oszlopon méret szerint szétválasztottuk. Az oszlopkromatográfiát a következőképpen végeztük el. A cDNS-hez 5 μΐ 10 X STE-t (100 mM TRISZ (pH = 7,0), 5 mM EDTA és 100 mM NaCl) adtunk, ezután a cDNS-t felvittük az 1 ml Sephacryl S-400-at (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) tartalmazó fecskendőoszlop tetejére. A fecskendő aljához egy 500 μΐ-es mikrocentrifugacsövet helyeztünk és így belehelyeztük egy centrifugacsőbe, majd 2 percig 400 g-vel centrifugáltuk. A fecskendő tetejére 60 μΐ 1 X STE-t pipettáztunk, és egy új centrifugacsövet helyeztünk az oszlop alá, ezután a centrifugálást hasonlóan végeztük mint a fentiekben. A folyamatot addig ismételtük, amíg hat frakciót kaptunk. A frakciók cDNS megoszlásának meghatározásához mindegyik frakció körülbelül 10 %át 1 %-os agaróz gélen elektroforetizáltuk. A frakciók maradékait egyező térfogatú fenol: kloroform keverékkel, majd ezután kloroformmal, a fentiekben leírtaknak megfelelően extraháltuk és 2 térfogatnyi 100 %-os etanol hozzáadásával kicsaptuk. Egy éjszakán át -20 °C-on történt inkubáció után a cDNS-t mikrocentrifugában 4 °C-on 60 percig tartó 14000 rpm-es centrifugálással kinyertük. A cDNS frakciók mindegyikét 200 ni 80 %-os etanollal mostuk és szárítottuk az előzőekben leírtaknak megfelelően. Az 1-es cDNS frakciót 3 μΐ steril vízben, míg a 2-es cDNS frakciót 10,5 μΐ steril vízben újra félszuszpendáltuk. Az etidium-bromidos lemezen történő meghatározási módszerben a DNS mennyiségi meghatározásához mindkét frakcióból fél μΐ-t használtunk fel. A legnagyobb cDNS molekulákat tartalmazó 1-es és 2-es frakciókat kombináltuk. A kombinált frakciók 12,5 ml-ében hozzávetőleg 100 ng cDNS volt. Egy Speed-Vac-ban ezt a frakciót 2,5 μΐ-re csökkentettük és jégen tároltuk. A 3-as cDNS frakciót 10,5 μΐ steril vízben újra felszuszpendáltuk, és későbbi felhasználásáig -20 °C-on megőriztük.

Az 1-es és 2-es cDNS frakcióból 1/100 ng-ot 1 μg Uni-ZAP™ (Stratagene, La Jolla, CA) vektorba ligáltunk, ez egy lambda ZAP vektor, amit EcoRI és Xhol restrikciós endonukleázokkal emésztettek. Az 1-es és 2-es cDNS frakciókat (2,5 μΐ) hozzáadtuk 0,5 μΐ 10 X ligációs pufferhez, 0,5 μΐ 10 mM ATP-hez, 1 μΐ 1 pg/μΐ Uni-Zap XR vektorhoz és 0,5 μΐ 4 Weiss U/μΙ T4 DNA ligázhoz. A reakcióelegyet 8 °C-on körülbelül 44 óráig inkubáltuk. A ligációs reakció elegyének 1 μΐ-es aliquotjához hozzáadtuk a Gigapack II Gold bakteriofág λ pakolókészletböl (Stratagene, La Jolla, CA) származó 1 μΐ FreezeThaw kivonatot. Ezután 15 μΐ szonikált kivonatot adtunk hozzá és mindezeket óvatosan összekevertük. A pakolást szobahőmérsékleten végeztük. Két óra elteltével mindegyik pakolóelegyhez 500 μΐ SM puffért és 20 μΐ kloroformot adtunk és a törmeléket mikrocentrifugában rövid centrifugálással eltávolítottuk. A bepakolt fágokat egy új mikrocentrifugacsőbe tettük. 10 μΐ kloroformot adtunk hozzá és a bepakolt fágokat felhasználásukig 4 °C-on tároltuk. Ennek a primer könyvtárnak a titere arra utal, hogy 0,7 X 10⁶ rekombináns plakk van jelen.

c) A primer könyvtár sokszorozása:

600 μΐ Escherichia coli XL 1 -Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA) törzset ODóoo-on mérve 0,5-ig növesztettünk, és mind a 16 csőhöz a primer könyvtár törzsoldatából 32,5 μΐ-t adtunk. 37 °C-on végzett 15 perces inkubáció után mindegyik csőhöz 6,0 ml 48 °C-os fedőagart (5 g/1 NaCl, 2 g/1 MgSO4x7H2O, 5 g/1 élesztőkivonatot, 10 g/1 NZ amint [pH = 7,5] és 0,7 % agaróz) adtunk és tartalmukat 150 X 15 mm-es NZY lemezekre ( 5 g/1 NaCl, 2 g/1 MgSO4x7H2O, 5 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 NZ amin [pH = 7,5] és 15 g/1 Difco agar) öntöttük. A lemezeket egy éjszakán át 37 °C-on inkubáltuk, majd 10 ml SM pufferrel felülrétegeztük és gyenge rázással további 8 óráig 4 °C-on inkubáltuk. Az SM puffért egy steril pipettával összegyűjtöttük és 250 ml-es centrifugacsöben tároltuk. Mindegyik lemezt további 10 ml SM pufferrel mostuk és hozzáadtuk az előzőleg gyűjtött SM pufferhez. 5 % végkoncentrációig kloroformot adtunk hozzá és a fágoldatot szobahőmérsékleten 15 percig inkubáltuk, majd a sejttörmelék eltávolítása érdekében 10 percig 2000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót egy steril polipropilén csőben gyűjtöttük össze és 0,3 % végkoncentrációig kloroformot adtunk hozzá. A sokszorozott könyvtárat 4 °C-on tároltuk.

d) A specifikus gének szűréséhez a sokszorozott könyvtár lemezelése:

A sokszorozott könyvtár titerét a fentiekben leírtaknak megfelelően határoztuk meg. Hozzávetőleg 50000 rekombináns plakkhoz 600 μΐ előzőekben leírtaknak megfelelően növesztett Escherichia coli XL1Blue MRF' tenyészetet adtunk. 15 percig tartó 37 °C-on végzett inkubáció után 6,5 ml 48 °C-os fedöagart adtunk hozzá és a sejteket 150 X 15 mm-es NZY lemezekre öntöttük. 200 000 rekombináns plakkot tartalmazó 4 lemezt készítettünk és ezeket 37 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk. A lemezeket ezután 4 óra alatt 4 °C-ra hütöttük, és az alábbiakban leírtaknak megfelelően a plakkok kiemelésére használtuk fel.

e) A kávé ACC szintetáz génekkel homológ oligonukleotidok azonosítása és elkészítése:

Egy előző kísérletben, amit az Amerikai Egyesült Államok-beli, 08/485,107 számú szabadalmi leírásban már leírtunk, és amit itt referenciaként építettünk be, különböző növényekben előforduló ACC szintetázok általános bázisszekvenciáját azonosítottuk és ezt itt a továbbiakban konszenzus szekvenciának nevezzük. Ezekre a tanulmányokra alapozva három (3) teljesen degenerált prímért fejlesztettünk ki a konszenzus szekvenciáknak megfelelő kávé elsőszál cDNS régióinak PCR-rel történő amplifikációjához. A felhasznált primerek szekvenciái a következők:

ACS 167: 5'-GCCAAGCTTCCRTGRTARTCYTGRAA-3' (3. számú szekvencia)

ACS289: 5'-TTYCARGAYTAYCAYGGHYT-3' (4. számú szekvencia)

ACS885: 5'-CCHGGDARNCCYAWRTCTTT-3' (5. számú szekvencia)

f) Az elsöszál kávé cDNS kinyeréséhez használt reverz transzkriptáz reakció:

Az elsöszál kávé cDNS kinyeréséhez a reverz transzkriptáz reakciókat 20 μΐ végtérfogatban a GeneAmp RNA PCR Core készlet (Perkin Elmer, Foster City, CA) felhasználásával végeztük el. Először, 0,9 μg 3 μΐ vízben lévő kávétermés mRNS-t mikrocentrifugacsöben összekevertünk 1 μΐ 50 μΜ random hexamerrel és 6 μΐ steril vízzel és 5 percig 65 °C-on inkubáltuk. Az elegyet 3 percig szobahőmérsékleten hagytuk és a folyadékot a centrifugacsö aljára rövid centrifugálással ·· ·/ : *.' összegyűjtöttük. Ehhez az elegyhez 2 μΐ PCR puffer II-t (a fentiekben említett készletből), 4 μΐ 25 mM MgCh-t, 2 μΐ 10 mM dNTP-ket, 1 μΐ RNAsin-t (20 η/μ1)έ8 1 μΐ reverz transzkriptázt (50 u/μΐ) adtunk. A reakcióelegyet 1 óráig 42 °C-on inkubáltuk, ezek után a reverz transzkriptázt 95 °C-on vízfürdőben 5 percig hővel inaktiváltuk.

g) A kávé ACC szintetáz gén sokszorozására végzett polimeráz láncreakció:

A polimeráz láncreakciót (PCR) [Saiki és mtsai: (1988)] GeneAmp készlet felhasználásával, az előzőekben leírtaknak megfelelően, végeztük 50 μΐ reakció-térfogatban, ami a következő komponenseket tartalmazta: 10 μΐ elsőszál cDNS keveréket, 4 μΐ PCR puffer Π-t, 1 μΐ 25 mM MgCh-ot, 2,5 μΐ 20 μΜ ACS 167 prímért (3. számú szekvencia), 2,5 μΐ 20 μΜ ACS885 prímért (5. számú szekvencia), 29,5 μΐ steril H2O-t, és 0,5 μΐ Tag DNS polimerázt (5 u/μΐ). A PCR-t 35 ciklusban végeztük ciklusonként 94 °C-on 1 percig, 44 °C-on 1 percig és 72 °C-on 2 percig. A PCR reakcióterméket agaróz gélelektroforézissel analizáltuk, felhasználva 1,5 % SeaPlaque agarózt (FMC BioProducts, Rockland, ME) és méretmarkerként HaelII-mal emésztett XI74 DNS-t (Promega Corporation, Madison, WI). Egy hozzávetőleg 650 bp nagyságú PCR terméket kaptunk.

h) A PCR termékek sokszorozása különböző primerekkel:

A kapott 650 bp nagyságú fragmenst a gélből kivágtuk és 1,5 mles mikrocentrifugacsőbe helyeztük. Miután 200 μΐ steril vizet adtunk hozzá, a 650 bp nagyságú fragmenseket 5 percig 90 °C-ra melegítettük, majd lehútöttük szobahőmérsékletűre és mikrocentrifugában 5 percig 14000 rpm-mel centrifugáltuk. A sokszorozott DNS-t tartalmazó felülúszót eltávolítottuk és egy új steril 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőbe tettük. A PCR reakciót 25 μΐ-ben végeztük, X amihez templátként felhasználtunk az előzőekben sokszorozott DNSből 0,4 μΐ-t, valamint 2,5 μΐ 10 X PCR puffért (10 mM trisz-HCl [pH = 9,0], 0,1 % Triton X-100), 2 μΐ 25 mM MgCb-ot, 5 μΐ 1 mM dNTP-ket, 1 μΐ 20 μΜ ACS289 prímért (5. számú szekvencia), 1 μΐ 20 μΜ ACS885 prímért (2. táblázat), 12,8 μΐ H2O-t, és 0,3 μΐ Tag DNA polimerázt (5 u/μΐ) (Promega Corporation, Madison, WI). A PCR-t 35 ciklusban végeztük ciklusonként 94 °C-on 1 percig, 45 °C-on 1 percig és 72 °C-on 2 percig. A PCR reakciótermékből 5 μΐ-t agaróz gélelektroforézissel az előzőekben leírtaknak megfelelően analizáltunk. Egy hozzávetőleg 603 bp nagyságú PCR terméket figyelhettünk meg. A reakcióelegy maradékához 8 μΐ steril vizet, 10 μΐ 3 M nátrium-acetátot (pH = 5,2) és 220 μΐ 100 % etanolt adtunk. Miután -20 °C-on egy éjszakán át inkubáltuk, a DNS-t 4 °C-on 30 percig tartó 14000 rpm-es centrifugálással kinyertük. A DNS-t 400 μΐ jéghideg 75 %-os etanollal mostuk, és 25 μΐ steril vízben felszuszpendáltuk. Az etidium-bromidos lemezmódszerrel meghatározott DNS koncentrációja 10 ng/pl-nek adódott.

i) A kávétermésre specifikus ACC szintetáz DNS jelölése:

A PCR által előállított ACC szintetáz DNS és a Prime-a-Gene készlet (Promega Corporation, Madison, WI) felhasználásával egy random primer próbát állítottunk elő. A DNS-ből (25 ng) 2,5 μΐ-t 27,5 μΐ steril vízhez adtunk, és a DNS-t 5 percig tartó forralással denaturáltuk. Az 50 μΐ végtérfogat eléréséhez a denaturált DNS-hez 10 μΐ 5 X jelölőpuffert, 2 μΐ jelöletlen dNTP-ket (mindegyikből 20 μΜ-t; dCTP, dGTP, dTTP), 2 μΐ 1 mg/ml acetilezett BSA-t, 1 μΐ 5υ/μ1 Escherichia coli DNS polimeráz Klenow I fragmenst és 5μ1 (50 pCi) [a³²P]dATP-t (3000 Ci/mM) (Dupont-NEN) adtunk hozzá. Miután 1 óráiig szobahőmérsékleten tartottuk, a reakciót 2 μΐ 0,5 M NasEDTA-val és 2 perces forralással leállítottuk.

j) A sokszorozott könyvtár szűrése az ACC szintetázra specifikus próbával:

A négy 150 x 15 mm-es NZY lemez mindegyikéről, amelyek egyenként 50000 rekombináns kiónt tartalmaztak, a plakkokat kiemeltük. Négy 132 mm-es megnedvesített nylon transzfermembránt (Micron Separations, Incorporated, Westborough, MA) 10 másodpercig 5 X SSC pufferrel telített kromatográfiás papírra helyeztünk. A membránokat 5 percig a rekombináns plakkokat tartalmazó lemezekre helyeztük, majd eltávolítottuk és 2 percig a tagokkal fedett oldalukkal felfelé 0,5 M NaOH-val és 1,5 M NaCl-dal telített kromatogáriás papíron inkubáltuk. A membránokat ezután 5 percig 0,5 M TRISZ-HC1lel és 1,5 M NaCl-dal telített kromatogáriás papírra áthelyezve neutralizáltuk. Miután röviden, 20 másodpercig, 0,2 M TRISZ-HCl-t (pH = 7,5) tartalmazó 2 X SSC-vel telített kromatográfiás lapokon kezeltük, a szűrőket itatással kiszárítottuk. 1 óráig tartó levegőn történő szárítás után a membránokat Stratalinker 1800-ban (Stratagene, La Jolla, CA) 12,000 pJoules 260 nm-es UV fénnyel kezeltük.

A négy membránt 65 °C-on 2 óráig Hybaid Mark II hibridizációs kazánban (National Labnet Company, Woodbridge, NJ), HB-OV-BL palack felhasználásával, 100 ml 6 X SSPE-t (52,2 g/1 NaCl, 8,3 g/1 NaH₂PO4xH2O, 2,2 g/1 Na2EDTA (pH = 7,4)), 5 X Denhardt-féle oldatot (1 g/1 Ficoll, 1 g/1 poli(vinil-pirrolidon), 1 g/1 BSA [pentax frakció V]), 0,5 % SDS-t és 100 pg/ml denaturált hering sperma DNS-t tartalmazó oldatban elöhibridizáltuk.

• · ··· · · ·· 29 ’··’ ··’ I

A hibridizációt 65 °C-on 12 óráig 0,5% SDS-t, 100 pg/ml denaturált hering sperma DNS-t, és a fentiekben leírt 52 μΐ random primer próbát tartalmazó 10 ml 6 X SSPE oldatban végeztük el. A hibridizációs periódus végén a hibridizációs oldatot eltávolítottuk és a membránokat rövid ideig 100 ml 0,5 % SDS-t tartalmazó 2 X SSC oldatban 65 °C-on mostuk. Ezután további 30 percig azonos térfogatú friss pufferrel 65 °C-on mostuk. A membránokat még kétszer 30 percig 65 °C-on 100 ml 0,5 % SDS-t tartalmazó 0,2 X SSC-vel mostuk, celofán zacskóba csomagoltuk és 70 °C-on 24 óráig elővilágított Fuji RXgcu Röntgen filmre exponáltuk. Tíz pozitív kiónt kaptunk. A plakkok azonosításához az azonosított plakkoknak megfelelő eredeti lemezek területeit eltávolítottuk és 20 μΐ kloroformot tartalmazó 1 ml SM pufferbe helyeztük. Az egyedi plakkok kinyeréséhez tíz közül ötöt alacsonyabb sűrűség mellett újra lemezeltünk és a fentiekben leírtaknak megfelelően újraszúrtük.

k) A kávétermés ACC szintetáz kiónjainak jellemzése:

A kísérletileg feltételezett kávé ACC szintetáz cDNS kiónok méretét polimeráz láncreakcióval határoztuk meg olyan primerek felhasználásával, amelyek a klónozó vektorban jelenlévő T3 és T7 promoterek egy részére homológok, és a cDNS inszerciós helyét szegélyezik. A primerek szekvenciái a következők:

• · ··· · ··· ’ ·· ··’ J

T3: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (6. számú szekvencia) T7: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3' (7. számú szekvencia)

A PCR-t a fentiekben leírtaknak megfelelően végeztük el, azzal az eltéréssel, hogy egy ciklus 95 °C-on 1 percig, 50 °C-on 1 percig és 72 °C-on 2 percig tartott. Az analízist az előzőekben már ismertetett agaróz gélelektroforézissel végeztük el.

A legnagyobb kiónokat in vivo kivágással fagemidként kaptuk meg. Egy egyedülálló plakkból szármázó fág törzsoldatából 200 μΐ-t összekevertünk 200 μΐ ODeoo-on mérve 1,0-ig növesztett Escherichia coli XL 1-Blue MRF' (Stratagene, La Jolla, CA) sejtekkel. 1 μΐ ExAssist (Stratagene, La Jolla, CA) segítőfágot (>1 X 10⁶ pfu/μΐ) adtunk hozzá, és a csöveket 37 °C-on 15 percig inkubáltuk. Ezután 3 ml steril LB táplevest adtunk hozzá és rázás közben 3 óráig 37 °C-on inkubáltuk. Miután a fenti oldatot 20 percig 70 °C-on melegítettük és 15 percig 1000 g-vel centrifugáltuk, a kapott felülúszóból, ami fonalas fágrészecskékként pakolt kivágott pBluescript fagemid részecskéket tartalmaz, 1 ml-t átraktunk egy steril 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőbe és 4 °C-on tároltuk. A fagemideket úgy nyertük, hogy 25 μΐ törzsoldatot adtunk 200 ml ODöoo-on mérve 1,0 sűrűségig növesztett Escherichia coli Solar sejtekhez (Stratagene, La Jolla, CA). 15 perces 37 °C-on történt inkubáció után 200 μΐ sejtkeveréket 50 μg/ml ampicillint tartalmazó 100 X 15 mm-es NZY agarra lemezeltünk. Az egyedi kolóniákat 10 ml 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táplevesbe oltottuk és egy éjszakán át 37 °C-on termosztátban rázatással növesztettük. A sejteket 1,5 ml-es mikrocentrifugacsövekben ismételt centrifugálással koncentráltuk és a plazmid DNS-t plazmid mini készlet (QIAGEN) segítségével tisztítottuk. A baktériumokat tartalmazó üledéket vízzel mostuk és 0,3 ml Pl pufferben felszuszpendáltuk. Ezután, 0,3 ml P2 alkalikus lízispuffert adtunk hozzá, gyengén X összekevertük, és legalább 5 percig szobahőmérsékleten tartottuk. Miután 0,3 ml jéghideg P3 puffért adtunk hozzá, a kivonatokat 10 percig jégen inkubáltuk, és a csöveket hatszor megforgatva összekevertük, a kivonatokat ezután 10 percig jégen inkubáltuk és mikrocentrifugában 15 percig 14000 rpm-mel centrifugáltuk. A felülúszókat eltávolítottuk és QIAGEN-tip 20 oszlopokra vittük, amelyeket előzőleg 1 ml QDT pufferrel egyensúlyba hoztunk. A kivonatokat gravitációs hatás felhasználásával engedtük az oszlopokba belépni. Ha a kifolyás befejeződött, akkor az oszlopokat négyszer 1 ml QC pufferrel mostuk. A DNS-eket a QIAGEN-tip 20 oszlopokról 0,8 ml QF pufferes mosással eluáltuk, és az eluátumokat 1,5 ml-es mikrocentrifugacsövekbe gyűjtöttük. A DNS-t 0,7 térfogat (560 μΐ) izopropanol hozzáadásával csaptuk ki. A csöveket azonnal 30 percig 14000 rpm-mel centrifugáltuk és a felülúszót óvatosan eltávolítottuk. A DNS-t tartalmazó üledékeket 1 ml jéghideg 70 %-os etanollal mostuk, fentieknek megfelelően centrifugáltuk és levegőn 5 percig szárítottuk. Az egyik plazmidizolálásból származó DNS fluorometriás analízissel 0,1 pg/μΐ koncentrációjú volt.

A szekvenálási reakciókat 8 μΐ fagemid DNS (0,8 pg) és 4 μΐ T3 vagy T7 szekvenáló primer (0,8 ρΜ/μΙ) összekeverésével végeztük el. Ezen minták automatikus DNS szekvenálását az University of Hawaii Biotechnology Service Center-ben végeztük el. A cDNS 5' és 3' végein egyaránt körülbelül 350 bp nagyságú szekvenciát kaptunk. Új szekvenáló primereket szintetizáltunk az előző szekvenciák végeinek felhasználásával és hasonlóan használtuk fel azokat mint az előzőekben a cDNS mindkét száljának teljes meghatározásához. A kávétermésben expresszálódó ACC szintetáz teljes szekvenciáját az 1. ábrán mutatjuk be. A kávétermésben expresszálódó ACC szintetáz levezetett aminosavszekvenciáját a 2. ábrán adjuk meg.

A kávé ACC szintetáz cDNS klón szekvenciáját és a levezetett fehérje szekvenciáját a GenBank-ban lévő más ACC szintetáz gének szekvenciájával összehasonlítottuk. A kávétermésből izolált cDNS 68,3 %-tól 58,1 %-ig azonosnak mutatkozik más, a GenBank-ban lévő ACC szintetázzal. Ezenkívül, ezen cDNS-ből kikövetkeztetett fehérje szekvencia 67,9 %-tól 50,5 %-ig azonos más ACC szintetázokkal. Ez a cDNS egyedülálló abban, hogy más 1500 bp-nál nagyobb szekvenciával nem mutatott 68,3 %-nál nagyobb azonosságot.

2. Példa:

A kávétermésére specifikus ACC oxidáz izolálása

a) Az ACC oxidázra specifikus oligonukleotid primerek szintézise:

Az össz-RNS és a mRNS izolálását, valamint a kávé termésére specifikus cDNS szintézisét az előzőekben leírtaknak megfelelően végeztük.

A GenBank-ból kapott tizenkét féle ACC oxidáz szekvenciáit a GCG (Genetics Computer Group, Madison, WI) Pileup programja segítségével sorba állítottuk. A transzlációs kezdő kodontól hozzávetőleg 1000 bp-ra lévő szakaszt konzervatívnak találtuk és az ennek a régiónak megfelelő degenerált oligonukleotid prímért szintetizáltuk, a primer szekvenciája a következő:

5'-TCATIGCKKCRAKIGGTTC-3' (8. számú szekvencia)

Inozinnal (I) jelöltük azokat a helyeket, ahol a szekvenciák nem voltak azonosak, mivel ezekben a helyzetekben A, T, G vagy C egyaránt előfordulhat. Azokban a pozíciókban, ahol a félreérthető ség kétszeres volt, ott keverten alkalmaztuk a bázisokat (T/G vagy A/G). Ezenkívül elkészítettünk egy olyan második prímért, amely a papaya termésében expresszálódó ACC oxidáz cDNS-sel homológ, amit egyébként korábban már laboratóriumunkban klónoztunk, és ami a transzlációs kezdő kodontól hozzávetőleg 372 bp-nyira van:

5'-GACACTGTGGAGAGGCTGAC-3' (9. számú szekvencia)

A kávé termésében expresszálódó ACC oxidáz egy részének sokszorozásához a PCR reakcióban két prímért használtunk. A PCR reakció a következő komponenseket tartalmazta: 0,2 μΐ (10 ng) 3-as cDNS frakció (lásd az 1. példát), 5 μΐ 10 X PCR puffer, 3 μΐ 25 mM MgCh, 1 μΐ 10 mM dNTP-k (mind a négyből), 1 μΐ 20 μΜ-os oldat mindegyik primerből, 0,3 μΐ Taq DNS polimeráz (Promega Corporation, Madison, WI) és 38,5 μΐ víz. A PCR-t 35 ciklusban végeztük ciklusonként 94 °C-on 1 percig, 50 °C-on 1 percig és 72 °C-on 2 percig. Az utolsó ciklusban egy 5 perces 72 °C-os inkubációt végeztünk. 20 μΐ PCR reakcióterméket az előzőekben leírtaknak megfelelően 1,5 %-os agaróz gélelektroforézissel analizáltunk és egy hozzávetőleg 800 bp nagyságú terméket figyelhettünk meg. A DNS-t a gélből kivágtuk és 200 μΐ steril vízzel 1,5 ml-es mikrocentrifugacsőben összekevertük. 5 percig tartó forralás után 2 μΐ templátot használtunk fel egy 50 μΐ-es PCR reakcióban ugyanazokkal a primerekkel mint az előzőekben. A gélelektroforézist az előzőekben leírtaknak megfelelően végeztük, fel használva a PCR reakció 20 μΐ-ét egy 800 bp nagyságú egyedüli termék jelenlétében. A PCR reakció megmaradt 30 μΐ-éhez 20 μΐ kloroformot és 100 μΐ vizet adtunk. Összekeverés után mikrocentrifugában 2 percig 14000 rpm-mel centrifugáltuk. A DNS-t tartalmazó felső vizes fázist eltávolítottuk, és mikrocentrifugacsőben tisztítottuk. A DNS egy részét radioaktívan jelöltük a fentiekben leírt random primeres szintézissel.

b) A sokszorozott könyvtár szűrése random primeres próbákkal:

Az 1. példában leírt sokszorozott kávétermés cDNS-t használtuk fel az előzőekben leírt 150 X 10 mm-es NZY lemezek elkészítéséhez. A prehibridizációt, a hibridizációt és a kiónok kinyerését az előzőekben leírtaknak megfelelően végeztük, azzal az eltéréssel, hogy próbaként a PCR-rel kapott ACC oxidáz szekvenciát használtuk.

c) A kávétermés ACC oxidáz cDNS kiónok jellemzése:

A kávé ACC oxidáz cDNS kiónok méretét polimeráz láncreakcióval határoztuk meg, felhasználva a T3 és T7 promoterekre homológ primereket az 1. példában leírtak szerint.

A legnagyobb kávé ACC oxidáz cDNS klón szekvenciáját az 1. példában leírtaknak megfelelően kaptuk meg, és a GenBank-ban található ACC oxidázokkal hasonlítottuk össze. A 3. ábra a kávé termésére specifikus ACC oxidáz szekvenciát mutatja be. A meghatározott cDNS az ACC oxidázt kódolja, mivel szekvenciája 50,4 °/ő-tól 82,5 %-ig azonos a GeneBank-ban található más ACC oxidáz nukleinsavszekvenciájával. Tehát a kikövetkeztetett fehérje szekvenciája 32,5 %-tól 86,5 %-ig azonos más ACC oxidáz szekvenciájával.

3. példa

Vektorok készítése antiszensz ACC szintetáz és ACC oxidáz transzkriptumok expresszálására

Az ACC szintetáz és az ACC oxidáz cDNS-eket arra használhatjuk, hogy módosítsuk a kávé etiléntartalmát, például aminosav expresszióval vagy ko-szuppresszióval. Az alábbiakban ismertetjük a felhasználás egyik példáját, a pKRl vektorral. Ez csak egy példa, és számos más növényi transzformációs vektor használható az ACC szintetáz és az ACC oxidáz cDNS-ekkel. A pKRl-et a pB121 vektor (Clontech Laboratories) módosításával hoztuk létre.

Két 38 bázispár méretű szintetikus szekvenciát, amik a cre-specifikus rekombináz lox felismerési helyeit tartalmazzák, beépítünk a pBI121 neomicin-foszfotranszferáz II (NPT II) szelekciós marker környezetébe. Ezek a lox helyek lehetővé teszik, hogy a növényi genomba való integrációja után az NPT II gént eltávolítsuk a konstrukcióból [Dale and Ow: Proceedings of the National Academy of Sciences,

ÚSA 88, 10558 (1991)], de nem lényegesek az ACC szintetáz és az ACC cDNS-ek antiszensz orientációjú oxidáz funkciójához.

Három szintetikus oligonukleotidot szintetizáltunk a Dale és Ow által meghatározott [Dale and Ow: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 10558 (1991)] loxP szekvenciák alapján. Ezeknek az oligonukleotidoknak a szekvenciája az alábbi: loxA: 5 AGCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3 ’ loxB: 5 AGCTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3 ’ és loxC: 5ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAGCT-3 ’

A loxB mind a loxA mind a loxC komplementer szála. Ha a loxA-t és a loxB-Ι illesztjük egymáshoz, akkor kétszálú molekulát képeznek, ami egy 4 bázisos, a Hindii! hasítási hellyel komplementer túlnyúló véget tartalmaz, ami lehetővé teszi, hogy a kétszálú szekvenciát egy HindlII hasítási helyre beépítsük, például abba, ami a pBI-121-ben az NPT II génnel szomszédos NOS transzkripciós terminációs szekvencia után található. Ha a loxC-t illesztjük a loxB-hez, akkor egy tompavégü kétszálú DNS-t kapunk, ami a lox felismerési helyet tartalmazza.

A pBI-121 plazmid NPT II génje köré szintetikus lox helyeket építettünk be, az alábbiak szerint. A pBI-121 plazmidot 2 óra hosszat 37 °C-on Pmel restrikciós enzimmel (New England Biolabs, Beverly,

MA) emésztjük, a gyártó által biztosított reakciópufferben. A pBI-121nek egyetlen Pmel hasítási helye van, közvetlenül az NPT II gént meghajtó NOS promoter szomszédságában. Egy szintetikus lox helyet hozunk létre, ekvimoláris mennyiségű loxB-t és loxC-t illesztünk egymáshoz, oly módon, hogy 95 °C-ra melegítjük a keveréket, majd lassan szobahőmérsékletre hütjűk, utána pedig a Pmel restrikciós enzimmel emésztett pBI-121 plazmidba ligáljuk. A 30 μΐ térfogatú reakcióelegy tartalmaz ligáló puffért (New England Biolabs, Beverly, MA), 60 nmol/1 Pmel restrikciós enzimmel emésztett pBI-121 plazmid DNS-t, 3 μΐ-t az illesztett loxB/loxC 1 pmol/l koncentrációjú törzsoldatából, 4 egység Pmel-et és 4000 egység magas koncentrációjú T4 DNS ligázt (New England Biolabs, Beverly, MA). A ligálást éjszakéin át 16 °C-on végezzük. A ligáló reakcióelegyből 1-4 μΐ-t elektroporálunk Escherichia coli XL 1-Blue sejtekbe (Stratagene), majd LB lemezekre szélesztjük, ami 50 μg/ml kanamicint, 50 μΐ 20 mg/ml koncentrációjú X-gal-t és 10 μΐ 100 mmol/1 koncentrációjú IPTG-t tartalmaz. A fehér telepeket izoláljuk, majd friss LB-kanamicin anyalemezekre visszük át.

A lox hasítási helyeket tartalmazó telepeket telephibridizációval azonosítjuk. Az anyalemezeket 4 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd nylon membránokra blottoljuk. A membránokat friss LB-kanamicin lemezekre visszük át, majd éjszakán át 37 °C-on szaporítjuk. A membránokat 0,5 mol/1 nátrium-hidroxid oldaton úsztatjuk 10 percig, majd semlegesítjük 0,5 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó, 0,5 mol/1 TRIS-HC1 (pH=8,0) oldaton 2 percig úsztatva, majd 2 X SSC-vel mossuk.

A membránokat azután 55 °C-on 3 óra hosszat elöhibridizáljuk 20 ml 6 X SSPE, 5 X Denhardt oldat, 0,5% SDS és 100 pg/ml fragmentált heringsperma DNS összetételű oldatban. Az elő-hibridizációs oldatot 10 ml friss oldattal helyettesítjük, ami 8,4 X 10⁶ cpm, az 5’ végén [³²P] jelzést hordozó loxC-t tartalmaz (a jelzést T4 polinukleotid kinázzal vittük be). Az 50 μΐ térfogatú jelölő reakcióelegy 50 pmol loxCt, polinukleotid kináz reakciópuffert (Promega), 15 μΐ 3000 Ci/mmol [³²P] ATP-t (DuPont-NEN) és 20 egység T4 polinukleotid kinázt (Promega) tartalmaz. A reakcióelegyet 10 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd a terméket a be nem épült ATP-től Sephadex G-25 centrifugált oszlopon választjuk el. A hibridizációt éjszakán át 55 °C-on végezzük. A szűröket 55 °C-on kétszer mossuk 100 ml 2 X SSC-vel, ami 0,5% SDSt tartalmaz, majd egyszer mossuk 100 ml 1 X SSC-vel, ami 0,5% SDS-t tartalmaz, és az előzőkben ismertetett módon autoradiografáljuk. Számos telepről derült ki, hogy hogy intenzíven hibridizálódik, ezeket választottuk ki a további jellemzéshez. A plazmid DNS-t Magic Minipreps DNA Purification System®) (Promega) segítségével tisztítjuk, majd Pmel restrikciós enzimmel emésztjük, az előzőkben ismertetett módon. A lox hasítási helyet tartalmazó plazmidokban már nem található meg a Pmel hasítási hely. A Pmel restrikciós enzimmel végzett emésztésnek ellenálló plazmidokat automata DNS szekvenálással tovább elemezzük, a University of Hawaii Biotechnology Service Center-ben, annak igazolására, hogy beépítettük a lox hasítási helyet.

A lox helyet a kívánt orientációban tartalmazó plazmidot HindlII restrikciós enzimmel emésztjük, loxK/loxB heteroduplexekké összekeverve, amik HindlII tapadós végeket tartalmaznak, de a HindlII felismerési hely nem teljes, majd az előzőkben ismertetett módon egymáshoz illesztjük őket és ligáljuk. A ligáló reakcióelegy 2,5 pg HindlII restrikciós enzimmel emésztett plazmidot, 1,25 pmol ZoxA/ZoxB-t, ligáló puffért (Promega), 6 egység T4 DNS ligázt (Promega) és 1,25 egység HindlII restrikciós enzimet (Promega) tartalmaz 30 pl végtérfogatban. A pKRl plazmidot SacI restrikciós enzimmel emésztjük. A 173 pl-es reakcióelegy tartalmaz 10 pg pKRl-et, több enzimhez használható puffért (Promega) és 20 egység SacI restrikciós enzimet (Promega). 1 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd 25 mmol/1 koncentrációjú dATP, dCTP, dGTP és dTTP törzsoldatból 0,70,7 pl-t, végül 10 egység T4 DNS polimerázt (Promega) adunk hozzá.

Ezt a reakcióelegyet, amivel a SacI emésztési terméket tompavégúvé lehet alakítani, 30 percig inkubáljuk 15 °C-on. Miután a T4 DNS polimerázt 15 percig tartó, 75 °C-on végzett inkubálással inaktiváltuk, 24 egység Smal restrikciós enzimet adunk hozzá, majd a reakcióelegyet két óra hosszat szobahőmérsékleten inkubáljuk. A reakciót úgy állítjuk le, hogy a reakcióelegyet 15 percig 80 °C-on tartjuk. A DNS-t 17 μΐ 3 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát és 375 μΐ 100%-os etanol hozzáadásával állítjuk le. Egy óra hosszat -70 °C-on tartjuk, majd a DNS-t centrifugálással eltávolítjuk, egy mikrocentrifugában 20 percig teljes sebességgel centrifugálva 4 °C-on. A DNS-t 70%-os etanollal mossuk, csökkentett nyomáson szárítjuk, majd 88 μΐ vízben oldjuk. 10 μΐ 10X bél alkalikus foszfatázt (Promega), majd 20 egység borjúbél alkalikus foszfatázt adunk hozzá, végül a reakcióelegyet 2 óra hosszat 37 °C-on tartjuk. A reakciót 4 μΐ 0,5 mol/1 EDTA hozzáadásával és 10 percig 75 °C-on való tartásával állítjuk le. A mintát azonos térfogatú vízzel telített fenollal extraháljuk, majd azonos térfogatú fenolkloroform eleggyel (1:1) és végezetül kloroformmal extraháljuk. A DNSt kicsapással nyerjük ki, 0,1 térfogat 3 mol/1 koncentrációjú nátriumacetát és 2,5 térfogat 100%-os etanol hozzáadásával.

A kávé ACC szintetáz és ACC oxidáz cDNS inszerteket az eredeti plazmidokból, a pACS és a pACO plazmidokból szabadítjuk fel, restrik ciós enzimek alkalmazásával, az alábbiak szerint. 10 pg pACS plazmidot emésztünk 100 μΐ térfogatban, ami 10 μΐ 10X, több restrikciós enzimhez használható puffért (Promega) és 40 egység Smal restrikciós enzimet tartalmaz. Éjszakán át 25 °C-on végzett inkubálás után 40 egység BsrI restrikciós enzimet adunk hozzá, majd a reakciót 67 °C-on folytatjuk tovább. Kétórás, 67 °C-on végzett inkubálás után a reakciócsövet 10 percig jégben hütjük, majd 37 °C-on inkubáljuk tovább. A reakcióelegyet 1 μΐ 10 mmol/1 koncentrációjú dNTP-vel (dATP, dCTP, dGTP és dTTP), 1 μΐ 1 mg/ml acetilezett BSA-val és 15 egység T4 DNS polimerázzal (Promega) egészítjük ki. A reakcióelegyet 5 percig 37 °C-on inkubáljuk, a DNS tompavégúvé alakítása érdekében. Miután a DNS polimerázt inaktiváltuk, 30 percig 75 °C-on való inkubálással, a térfogatát Speed-Vac®-ban 50 μΐ-re csökkentve. Az emésztési termékeket elektroforézissel választjuk szét 1%-os SeaPlaque agaróz gélen. Az 1,6 kilobázis méretű kávé ACC szintetáz cDNS-t kivágjuk az agaróz gélből, majd a cDNS inszertet az agaróz emésztésével nyerjük ki, az emésztéshez 1,12 egység Agár ace-t (Promega) használva. A reakcióelegyet 30 percig 45 °C-on inkubáljuk, majd a DNS-t 24 μΐ 3 mol/1 koncentrációjú nátrium-acetát (pH=5,2) és 600 μΐ 95%-os etanol hozzáadásával csapjuk ki. Az etanollal kicsapott cDNS-t 30 percig szobahőmérsékleten centrifugáljuk, a felülúszót élöntjük, majd az üledéket jéghideg 70%-os etanollal mossuk, és az előzőkben ismertetett módon centrifugáljuk. Az üledéket 100 μΐ vízben oldjuk, majd a pKRl vektorba való tompavég ligálásban használjuk.

Az ACC oxidáz cDNS inszertet ugyanúgy állítjuk elő, mint ahogy azt az előzőkben a pACS cDNS-re ismertettük. 10 pg pACO plazmidot emésztünk 100 μΐ térfogatban, ami tartalmaz 10 μΐ 10X C puffért (Promega), 1 μΐ 1 mg/ml acetilezett BSA-t, 30 egység Bali-t és 30 egység bamboo-t. 2 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd a reakcióelegyet 1 μΐ 10 mmol/1 koncentrációjú dNTP-vel (dATP, dCTP, dGTP és dTTP) és 15 egység T4 DNS polimerázzal (Promega) egészítjük ki. A reakcióelegyet 5 percig 37 °C-on tartjuk, tompavég létrehozása céljából. Miután a DNS polimerázt inaktiváltuk, 30 percig 75 °C-on való inkubálással, a térfogatát Speed-Vac®-ban 50 μΐ-re csökkentve. Az emésztési termékeket elektroforézissel választjuk szét 1%-os SeaPlaque agaróz gélen. Az 1 kilobázis méretű kávé ACC oxidáz cDNS-t kivágjuk az agaróz gélből, majd a cDNS inszertet az agaróz emésztésével nyerjük ki, az emésztéshez 1,12 egység Agár ace-t (Promega) használva. A cDNS-nek az agarózból való tisztítására az ACC inszert tisztítására használt módszereket használjuk. Az üledéket 50 μΐ vízben oldjuk, majd ezt követően a pKRl vektorba való tompavégligálásban használjuk.

A tisztított ACC szintetáz és ACC oxidáz inszerteket pKRl vektorba ligáljuk, 500 ng pKRl vektort (a Smal/SacI fragmens, tompa végűvé alakítva és foszfatázzal kezelve) és vagy az ACC szintetázból vagy az ACC oxidázból 150 ng-ot összekeverve külön-külön csövekben. Mindegyik vektor/inszert keverék térfogatatát 8 μΐ-re csökkentjük, Speed-Vac® alkalmazásával. Mindegyik vektor/inszert csőhöz 1 μΐ 10X ligáz puffért (Promega) és 1 ml T4 DNS ligázt (10 egység) adunk. A csövek tartalmát 48 óra hosszat 8 °C-on inkubáljuk.

Mindegyik ligálási terméket 40 μΐ XL-1 Blue sejtekkel keverjük össze (a sejteket előzőleg előkészítjük elektroporációhoz, majd -70 °Con tároljuk), majd elektroporációt hajtunk végre, “Electro Cell Manipulator 600” (ECM 600, BTX Inc., CA) alkalmazásával, 2,35 kVos, 5 msec-es impulzusok alkalmazásával. Közvetlenül az elektroporáció után 1 ml LB puffért adunk az egyes csövekhez, majd 1 óra hosszat, 250/perc fordulatszámmal inkubáljuk egy rotációs rázógépen. Az inkubálás után a baktériumokat centrifugáljuk (1400/perc, 2 perc), majd a térfogatot 100 μΐ-re csökkentjük. Az elegyből 50 μΐ-t LB 40 μg/ml kanamicint tartalmazó lemezekre szélesztünk, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A kanamicines lemezeken kinövő telepeket további szűrővizsgálatnak vetjük alá, olyan kiónok azonosítására, amik tartalmazzák az ACC szintetáz vagy ACC oxidáz inszerteket. Az egyes kiónokat steril fogpiszkálóval izoláljuk, majd friss LB-kanamicin lemezekre oltjuk le, rácsos elrendezésben. Mindegyik cDNS inszert (ACC szintetáz és ACC oxidáz) esetében három lemezt készítünk. Miután a rácsos elrendezésben éjszakán át növesztettük, a baktériumokról lenyomatot készítünk Magna nylon membránokra (MSI, MA). A membránokat azután egymás után kezeljük 10%-os SDS-sel 5 percig, 0,5 mol/1 koncentrációjú nátrium-hidroxiddal és 1,5 mol/1 koncentrációjú nátrium-kloriddal 15 percig, végül 2X SSC és 0,2 mol/1

X koncentrációjú TRIS-HC1 összetételű oldattal 2 percig. Hagyjuk hogy a membránok légszárazra száradjanak, majd 20 percig 80 °C-on sütjük, végül 120,000 pJoule energiájú UV besugárzással keresztkötéseket alakítunk ki bennük (Strata Linker UV crosslinker 1800, Stratagene, CA).

A membránokat 2 óra hosszat 6X SSPE, 5X Denhardt oldat, 0,5%-os SDS és 100 pg/ml heringsperma DNS összetételű oldatban 65 °C-on előhibridizáljuk. Az ACC szintetáz és ACC oxidáz próbákat Ready-to-Go DNS-jelző gyöngyökkel (Pharmacia) szintetizáljuk meg. Mindegyik cDNS inszertből 50 ng-ot denaturálunk, 45 μΐ vízben forralva és jégbehútéssel leállítva a denaturációt. A 45 μΐ térfogatú denaturált DNS-t Ready-to-Go DNS-jelző gyöngyökkel és 5 μΐ [³²P] dCTPvel (3000 Ci/mmol) keverjük össze, majd 30 percig 37 °C-on inku baljuk. A próba megszintetizálása után a csöveket vízben 4 percig forraljuk, majd jégbehútjük. Az előhibridizálási puffért elöntjük, majd 10 ml előmelegített hibridizációs puffért (6X SSPE, 0,5% SDS és 100 pg/ml heringsperma DNS) teszünk mindegyik hibridizációs elegybe, majd hozzáadjuk a denaturált próbát. A hibridizációt éjszakán át 65 °C-on hajtjuk végre.

A membránokat röviden mossuk 2X SSC és 0,5% SDS összetételű pufferben. Egy második mosást is végzünk, ugyanazzal a pufferrel, 30 percig. A membránokat kétszer mossuk 0,2X SC és 0,5X SDS összetételű pufferrel. Mindegyik mosás időtartama 30 perc. A membránokat azután autoradiografáljuk. Az autoradiogram előhívása után öt pKRl klón azonosítottunk ACC szintetáz inszerttel és 24 kiónt azonosítottunk ACC oxidáz inszerttel. Az egyes kiónokban a gén orientációját PCR-rel, restrikciós emésztéssel és a vektor/in szert kapcsolódási pont DNS szekvenciájának meghatározásával határozzuk meg. Mind a 29 kiónnak (5 ACC szintetáz és 24 ACC oxidáz) megfelelő baktérium-telepből egy kis részt izolálunk fogpiszkálóval, majd 20 μΐ steril Milli-Q vízben szuszpendáljuk (sejthigítás). A 25 μΐ-es PCR reakcióelegyek tartalmaznak 2 μΐ-t a fenti sejthigításokból, 0,5 μΐ-t az egyes 10 mmol/1 koncentrációjú dATP, dCTP, dGTP és dTTP törzsoldatokból, 1,5 μΐ 25 mmol/1 koncentráció MgCh oldatot, 2,5 μΐ 10X puffért (Promega), 1-1 μΐ-t az alábbiakban megadott primerek 20 pmol/l koncentrációjú oldatából, 3,5 μΐ 5 egység/μΐ koncentrációjú Taq DNS polimerázt (Promega) és 16,2 μΐ steril Milli-Q vizet. Az ACC szintetáz kiónokhoz használt primerek az alábbiak: 35S primer (5'-CCA CTA TCC TTC GCA AGA CC-3'); ACSR₇ (5’-TTG CCA TCT TCG ACA AGA CT3); és ACSL₄ (5’-CTG TTG TCA GCT GTG CTA-S’). Hasonlóképpen, az ACC oxidáz kiónok az alábbiak: 35S primer; ACOR₄ (5’-G’A CTT CTG AGA TGT TGG AA-3’); és ACOLi (5’-TGG TGG AGA GCA AGG AAT TG3*). A hőmérsékleti ciklusok az alábbiak: 10 perc 94 °C-on; 35 ciklus: 1 perc 94 °C, 1 perc 50 °C, 1 perc 72 °C; és 5 perc 72 °C. A pKRl/ACC szintetáz konstrukció PCR termékeinek várt mérete 320 bázispár (35S és ACSR7) az értelmes orientáció esetében és 850 bázispár (35S és ACSL4) az antiszensz orientáció eetében. Hasonlóképpen, a pKRl/ACC oxidáz konstrukció PCR termékeinek várt mérete 400 bázispár (35S és ACOR4) az értelmes orientáció esetében és 800 bázispár (35S és ACOLi) az antiszensz orientáció esetében. Mind az ACC szintetáz mind az ACC oxidáz esetében egy-egy plazmidot, az értelmes és antiszensz orientációjú cDNS konstrukcióval, tovább vizsgálunk a plazmid és a cDNS közötti kapcsolódási pont DNS szekvenálásával, az orientáció igazolása céljából. A DNS szekvencia meghatározását az előzőkben ismertetett módon végezzük. A bináris vektorokat, amik az ACC szintetázt antiszensz orientációban (jele pKRCACS-A), az ACC szintetázt értelmes orientációban (pKRCACS-S), az ACC oxidázt antiszensz orientációban (pKRCACO-A) és az ACC oxidázt értelmes orientációban (pKRCACO-S) tartalmazzák, a mellékelt, 1-4. ábrákon mutatjuk be.

4. példa

Agrobaktériumok elektroporációja pKRl plazmiddal, ami tartalmazza az ACC szintetáz (pKRCACS-S és pKRCACS-A) és az ACC oxidáz (pKRCACQ-S és pKRCACO-A) cDNS-eket, értelmes és antiszensz orientációban

Az Agrobacterium LBA 4404 törzset egyetlen telepből kiindulva ODooo sűrűségig szaporítjuk 100 ml YM folyékony táptalajban (0,4 g/1 élesztőkivonat, 10 g/1 mannit, 0,1 g/1 nátrium-klorid, 0,2 g/1 MgSCU x 7 H2O, 0,5 g/1 KH2PO4, pH=7,5), 28 óra hosszat 29 °C-on rotációs rázón rázatva a tenyészetet. Az elektroporációt az “Electro Cell Manipulator 600” (ECM 600, BTX Inc., CA) alkalmazásával hajtjuk végre. A 200 ng DNS-t tartalmazó pKRCACS-A, a pKRCACO-A, a pKRCACS-S vagy a pKRCACO-S plazmid oldatokból 3,5 μΐ-es alikvot részeket keverünk össze 50 μΐ koncentrált Agrobacterium sejtekkel, majd átvisszük egy előre lehűtött, 2 mm-es réssel rendelkező küvettába (BTX Inc., CA), majd egy 5 ms-os, 2,35 kV nagyságú impulzust alkalmazunk. Az YM folyadék táptalajból egy ml-t, ami 50 pg/ml kanamicint tartalmaz, adunk az elektroporáción átesett sejtekhez, majd hagyjuk hogy regenerálódjanak 1 óra hosszat 29 °Con, egy rotációs rázón 250/perc fordulatszámmal rázatva. A sejteket 4000 x g-vel centrifugáljuk, majd 100 μΐ friss YM folyékony táptalajban szuszpendáljuk. A transzformált baktériumokat YM agarlemezeken szelektáljuk (YM folyékony táptalaj, ami 15 g/1 Bacto-agart tartalmaz), amit 50 μg/ml kanamicinnel egészítettünk ki.

Az Agrobacterium transzformációjának 29 °C-on, 48 órán át végzett inkubálás után való igazolását úgy végezzük el, hogy mindegyik transzformációból 10 telepet friss YM-agar/kanamicin lemezekre izolálunk, kirajzolt rácsszerkezetnek megfelelően. Az ACC szintetáz és az ACC oxidáz gén jelenlétét és orientációját PCR-rel határozzuk meg, a 35S prímért a belső génre specifikus egyik primerrel együtt alkalmazva. Mindegyik telepből egy kis mennyiséget 20 μΐ steril Milli-Q vízbe viszünk át, steril fogpiszkálót használva. A PCR reakciókat az előzőkben ismertetett módon hajtjuk végre, ezekből a sejtszuszpenziókból 2 μΐ-t használva templát DNS-ként. Az ACC szintetáz értelmes orientációjához a 35S és az ACSR? primereket használjuk, és a várt, 320 bázispár méretű terméket kapjuk. Az ACC szintetáz 35S és ACSL4 antiszensz primerei a várt, 850 bázispár méretű terméket eredményezik. Hasonlóképpen, az ACC oxidáz szintetáz értelmes orientációjához a 35S és az ACOR4 primereket használjuk, és a várt, 400 bázispár méretű terméket kapjuk. Az ACC oxidáz 35S és ACOLi antiszensz primerei a várt, 800 bázispár méretű terméket eredményezik. Mindegyik orientációból kiválasztottunk egy telepet egy kávélevél-szövet transzformációjához.

5. példa

Kávélevél szövet fertőzése a pKRCACS-S, a pKRCACO-S, a pKRCACS-A és a pKRCACO-A plazmidokat tartalmazó Agrobaktériumokkal

Ferde hajtásokon nőtt érettt fiatal kávéleveleket sterilezűnk 30%os Clorox oldatban 30 percig, majd háromszor mossuk sterilezett desztillált vízben. A középső erezet és a levél széle közötti lapból körülbelül 7 mm²-es darabokat vágunk ki, és folyékony MS (Murashige és Skoog, 1962) táptalajba tesszük egy 10⁹ sejt/ml sűrűségű Agrobacterium szuszpenzióval együtt, majd három óra hosszat együtt tenyésztjük. A levélszövetet sterilezett papírtörülközőkkel megszárítjuk, majd 2,0 g/1 Phytagel hozzáadásával szilárdított MS táptalajon három napig együtt tenyésztjük a megmaradt Agrobacterium-mal.

A levélszövetet ismét steril papírtörülközővel lenyomatoljuk a megmaradt Agrobacterium eltávolítására, majd kalluszt indukáló táptalajra visszük (MS táptalaj, ami 2,4-D kinetint tartalmaz; Sondahl és Sharp, 1977), ami 500 pg/ml karbenicillint, és vagy 100-300 pg/ml kanamicin monoszulfátot vagy 10-20 pg/ml geneticint (G418) tartalmaz. 13 napos sötétben, 25 °C-on végzett tenyésztés után primer kalluszok kezdtek megjelenni.

6. példa

A pKRCACS-S, a pKRCACQ-S, a pKRCACS-A és a pKRCACO-A plazmidokat tartalmazó kávélevél kallusz-szövet továbbtenyésztése

Az antibiotikum-rezisztens kalluszokat három hónapig havonta továbboltjuk Μ II embrió-indukciós táptalajra (alapsók, fél-koncentrációjú MS sók, 10 mg tiamin HC1, 40 mg cisztein HC1, 100 mg mioinozit, 40 g szacharóz, 2 mg BA, 1 mg piridoxin, 1 mg nikotinsav, 2,0 g phytagel, pH=5,65; Yasuda és Fuji, 1985), ami 300 pg/ml karbenicillint és 150-200 pg/ml kanamicint tartalmaz. Ezeket a kalluszokat azután harminc napig 100 gg/ml kanamicint tartalmazó M II táptalajon tovább tenyésztjük, majd újabb harminc napig 50 pg/ml kanamicint tartalmazó Μ II táptalajon tenyésztjük tovább. Ebben az utolsó táptalajban szomatikus embriók keletkeznek. A szomatikus ,·\ ,·· ·»·· *· embriók fénycső megvilágítás mellett növényi hajtásokká fejlődtek Μ III csíráztató táptalajon, amiben nincsenek növekedés-szabályozó anyagok (alapsók, teljes koncentrációjú MS sók, 10 mg tiamin HC1, 40 mg cisztein HC1, 100 mg mio-inozit, 40 g szacharóz, 2 g phytagel, pH=5,65; Sondahl és Sharp, 1977).

Az előző példák csak bemutató jellegűek, ezeket nem kell úgy tekinteni, hogy a találmányhoz csatolt igénypontokban közzétett oltalmi kört korlátoznák.

1. Ábra: A Coffea arabica-bó\ származó ACC szintetáz levezetett amino savszekvenciája (10. számú szekvencia)

Met 1

Glu

Phe

Ser

Leu 5

Lys

Asn

Glu

Gin

Gin 10

Gin

Leu

Leu

Ser

Lys 15

Met

Ala

Thr

Asn

Asp

Gly

His

Gly

Glu

Asn

Ser

Pro

Tyr

Phe

Asp

Gly

Trp

Lys

Ala

Tyr

20 Asp

Ser

Asp

Pro

Tyr

25 His

Pro

Thr

Arg

Asn

30 Pro

Asn

Gly

Vai

lie

35 Gin

Met

Gly

Leu

Ala

40 Glu

Asn

Gin

Leu

Cys

45 Phe

Asp

Leu

He

Glu

50 Glu

Trp

Vai

Leu

Asn

55 Asn

Pro

Glu

Ala

Ser

60 He

Cys

Thr

Ala

Glu

65 Gly

Ala

Asn

Lys

Phe

70 Met

Glu

Vai

Ala

He

75 Tyr

Gin

Asp

Tyr

His

80 Gly

Leu

Pro

Glu

Phe

85 Arg

Asn

Ala

Vai

Ala

90 Arg

Phe

Met

Glu

Lys

95 Vai

100

105

110

Arg Gly Asp Arg Vai Lys Phe Asp

115

Gly Ala Thr Gly Ala His Glu Thr

130135

Glu Asp Ala Phe Leu Vai Pro Thr

145150

Asp Leu Arg Trp Arg Thr Gly Met

160165

Ser Ser Asn Asp Phe Lys Vai Thr

180

Gin Lys Ala Gin Glu Ala Asn lie

195

Asn Pro Ser Asn Pro Leu Gly Thr

210215

Asp lie Vai Thr Phe lie Asn Asp

225230

Glu lie Tyr Ser Ala Thr Vai Phe

240245

Ser Glu He He Glu His Asp Vai

260

Leu Vai Tyr Ser Leu Ser Lys Asp

275

Gly He Leu Tyr Ser Tyr Asn Asp

290295

Met Ser Ser Phe Gly Leu Vai Ser

305310

Ser Met Leu Ser Asp Glu Ala Phe

320325

Ser Glu Arg Leu Ala Ala Arg His

340

Gin Vai Gly He Gly Thr Leu Lys

355

Pro Asn Arg He Vai Met Ser Gly

120 125

Leu Ala Phe Cys Leu Ala Asp Pro

140

Pro Tyr Tyr Pro Gly Phe Asp Arg

155

Gin Leu Leu Pro He Vai Cys Arg

170175

Lys Glu Ser Met Glu Ala Ala Tyr

185190

Arg Vai Lys Gly Phe Leu Leu Asn

200205

Vai Leu Asp Arg Glu Thr Leu lie

220

Lys Asn lie His Leu lie Cys Asp

235

Ser Gin Pro Glu Phe lie Ser lie

250255

Gin Cys Asn Arg Asp Leu lie His

265270

Leu Gly Phe Pro Gly Phe Arg Vai

280285

Ala Vai Vai Ser Cys Ala Arg Lys

300

Thr Gin Thr Gin His Leu lie Ala

315

Met Asp Lys He lie Ser Thr Ser

330 335

Gly Leu Phe Thr Arg Gly Leu Ala

345 350

Ser Ser Ala Gly Leu Tyr Phe Trp

360 365

Met Asp Leu Arg Arg Leu Leu Arg Glu Ser Thr Phe Glu Ala Glu Met

370 375380

Glu Leu Trp Arg lie He He His Glu Vai Lys Leu Asn Vai Ser Pro

385 390395

Gly Leu Ser Phe His Cys Ser Glu Pro Gly Trp Phe Arg Vai CysPhe

400 405 410415

Ala Asn Met Asp Asp Glu Ser Vai Arg Vai Ala Leu Arg Arg HeHis

420 425430

Lys Phe Vai Leu Vai Gin Gly Lys Ala Thr Glu Pro Thr Thr Pro Lys

435 440445

Ser Arg Cys Gly Ser Ser Lys Leu Gin Leu Ser Leu Ser Phe Arg Arg

450 455460

Leu Asp Glu Arg Vai Met Gly Ser His Met Met Ser Pro His Ser Pro

465 470475

Met Ala Ser Pro Leu Vai Arg Ala Thr

480485

2. Ábra: A kávé termése által expresszált ACC szintetáz gén szekvenciája (11. számú szekvencia)

GTAATCTCTT CTAAAATCAA CCATTCTCTT CATTCTTCAC TTGACAAGGC CACTGCATTC60

TTCATTCTTT CTTGATATAT AGCCATTTTT TTCATTCTTT CTTGATATAT AGCCATTTTT120

TTCATTCTTT CTTCATTCAT TGTCTGGAGA AGTTGGTTGA GTTTTCTTGA AAATTCAAGC180

AAAACA ATG GAG TTC AGT TTG AAA AAC GAA CAA CAA CAA CTC TTG TCG AAG231

ATG GCA ACC AAC GAT GGA CAT GGC GAA

TGG AAG GCA TAT GAT AGT GAT CCT TAC GGT GTT ATA CAG ATG GGA CTC GCA GAA ATC GAG GAA TGG GTT CTG AAC AAT CCA GAA GGA GCG AAC AAA TTC ATG GAA GTT GGC TTG CCA GAG TTC AGA AAT GCT GTA AGA GGT GAC AGA GTC AAG TTC GAT CCC GGG GCA ACC GGA GCT CAT GAA ACT CTG

AAC	TCG	CCT	TAT	TTT	GAT	GGT	279
CAT	CCC	ACC	AGA	AAT	CCT	AAT	327
AAT	CAG	TTA	TGC	TTT	GAT	TTG	375
GAG	GCT	TCC	ATT	TGC	ACA	GCA	423
GCT	ATC	TAT	CAA	GAT	TAT	CAT	471
GCA	AGG	TTC	ATG	GAG	AAG	GTG	519
AAC	CGC	ATT	GTG	ATG	AGT	GGT	567
GCC	TTC	TGT	TTA	GCT	GAC	CCT	615

GAA GAT GCG TTT TTG GTA CCC ACA CCA TAT TAT CCA GGA TTT GAT CGG663

GAT TTG AGG TGG CGA ACA GGG ATG CAA CTT CTT CCA ATT GTT TGT CGC711

AGC TCC AAT GAT TTT AAG GTC ACT AAA GAA TCC ATG GAA GCT GCT TAT759

CAG AAA GCT CAA GAA GCC AAC ATC AGA GTA AAG GGG TTC CTC TTA AAT807

AAT CCA TCA AAT CCA TTG GGA ACT GTT CTT GAC AGG GAA ACT TTG ATT855

GAT ATA GTC ACA TTC ATC AAT GAC AAA AAT ATC CAC TTG ATT TGT GAT903

GAG ATA TAT TCT GCC ACC GTC TTC AGC CAG CCC GAA TTC ATC AGC ATC951

TCT GAA ATA ATT GAG CAT GAT GTT CAA TGC AAC CGT GAT CTC ATA CAT999

CTT GTG TAT AGC CTG TCC AAG GAC TTG GGC TTC CCT GGA TTC AGA GTT1047

GGC ATT TTG TAT TCA TAT AAT GAC GCT GTT GTC AGC TGT GCT AGA AAA1095

ATG TCG AGT TTC GGC CTT GTT TCA ACA CAA ACT CAG CAT CTG ATT GCA1143

TCA ATG TTA TCG GAC GAA GCA TTT ATG GAC AAA ATC ATT TCC ACG AGC1191

TGA GAG AGA TTA GCT GCA AGG CAT GGT CTT TTC ACA AGA GGA CTT GCT1239

CAA GTA GGC ATT GGC ACC TTA AAA AGC AGT GCG GGC CTT TAT TTC TGG1287

ATG GAC TTA AGG AGA CTC CTC AGG GAG TCC ACA TTT GAG GCA GAA ATG1335

GAA CTT TGG AGG ATC ATA ATA CAT GAA GTC AAG CTC AAT GTT TCA CCA1383

GGC TTA TCT TTC CAT TGC TCA GAA CCA GGA TGG TTC AGA GTT TGC TTT1431

GGC AAC ATG GAC GAC GAA AGT GTG AGA GTT GCT CTC AGA AGA ATC CAC1479

AAA TTT GTG CTT GTT CAG GGC AAG GCA ACA GAG CCA ACA ACT CCA AAG1527

AGT CGC TGC GGA AGC AGC AAA CTT CAA CTC AGC TTA TCT TTC CGC AGA1575

TTG GAC GAA AGG GTG ATG GGA TCG CAT ATG ATG TCC CCT CAC TCC CCG1623

ATG GCT TCA CCT TTG GTT CGG GCT ACA TAAATCATTT CTTGATCAGA TCATATAGCA 1680

AAGATTCCTG AGTAAATACT CGAAACCCTT TCTGGATAAC TGAAAAGAGA GTTGTTGATT1740

CTTTGCTGTA TCATACAAAC ACGTTACAGG CATTTTTTGG CCATCTGATG CGTGCAAATT1800

GCATCAAATG CTTTTATTAT TGTCATATTC ATTTGTGTAC CTTGGTTTTC CTTGCCCTTC1860

AGTCCTCCTT GTTTTTTGTT TCTTTGTTAT TATTTTCTTC CAGTTGATCA GTTAAACGAA1920

GGAAGCTCAA TTGTTTCAAG CTATTAGTAA CAGATCATTT TGTAATAGCA ATAGTTTCAG1980

GATTCTGAAA TGAAAGTTTA TCATTTTTCC ATCATTTTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA2040

Megjegyzés: ezen szekvencia kódoló részében a bázisokat kodononként csoportosítva mutattuk be.

3. Ábra: a kávétermésében expresszálódó ACC oxidáz cDNS szek- venciájából levezetett fehérje szekvencia (12. számú szekvencia)

Met Ala Thr Phe

Pro Leu lie Asp Met Glu Lys Leu Asp Gly Glu Glu Arg Ala Ala Thr

10 1520

Met Gly Vai lie Lys Asp Ala Cys Glu Ser Trp Gly Phe Phe GluVai

3035

Leu Asn His Gly lie Ser Asn Glu Leu Met Asp Thr Vai Glu Arg Leu 40 4550

Thr Lys Glu His Tyr Lys Lys Cys Met Glu Leu Lys Phe Lys Glu Met 55 6065

Vai Glu Ser Lys Glu Leu Glu Ala Vai Gin Thr Glu lie Asn Asp Leu 70 7580

Asp Trp Glu Ser Thr Phe Phe Leu Arg His Leu Pro Vai Ser Asnlie

90 95100

Ser Glu Vai Pro Asp Leu Asp Asp Glu Tyr Arg Lys Vai Met LysGlu

105 110115

Phe Ala Leu Gin Leu Glu Lys Leu Ala Glu Leu Leu Leu Asp Leu Leu

120 125130

Cys Glu Asn Leu Gly Leu Glu Lys Gly Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Tyr 13 140145

Gly Thr Lys Gly Pro Thr Phe Gly Thr Lys Vai Ser Asn Tyr Pro Pro 150 155160

Cys Pro Arg Pro Glu Leu lie Lys Gly Leu Arg Ala His Thr AspAla

165 170 175180

Gly Gly lie lie Leu Leu Phe Gin Asp Asp Lys Vai Ser Gly LeuGin

185 190195

Leu Leu Lys Asp Gly Glu Trp Vai Asp Vai Pro Pro Met Arg His Ser

200 205210

He Vai He Asn He Gly Asp Gin Leu Glu Vai He Thr Asn Gly Lys

215 220225

Tyr Lys Ser Vai Met His Arg Vai He Ala Gin Pro Asp Gly Asn Arg

230 235240

Met Ser Leu Ala Ser Phe Tyr Asn Pro Gly Ser Asp Ala Vai lieTyr

245 250 255260

Pro Ala Pro Ala Leu Vai Glu Lys Glu Ala Glu Asp Lys Gin lieTyr

265 270275

Pro Lys Phe Vai Phe Glu Asp Tyr Met Lys Leu Tyr Ala Gly Leu Lys

280 285290

Phe Gin Ala Lys Glu Pro Arg Phe Glu Ala Met Lys Ala Vai Glu Ser

295 300305

Thr Vai Asn Leu Gly Pro He Ala Thr Vai'

310315

4. Ábra: a kávé termésben expresszálódott ACC oxidáz eDNS szekvenciája (13. számú szekvencia)

TGTAAACGAA GCATAAGCAC AAGCAAACAC AAACTAGAAA GAGAG ATG GCT ACA TTC 57

CCC CTA ATC GAC ATG GAG AAG CTT GAC ATG GGA GTC ATA AAA GAT GCT TGT GAA TTG AAT CAT GGG ATA TCT AAT GAG CTC ACA AAG GAG CAT TAC AAG AAA TGT ATG GTG GAG AGC AAG GAA TTG GAA GCT GTT GAC TGG GAA AGT ACC TTC TTC TTG CGC TCA GAA GTC CCT GAT CTT GAT GAT GAA TTT GCG TTG CAA CTT GAG AAA CTA GCA TGC GAG AAC CTT GGC CTA GAG AAA GGC GGC ACC AAA GGA CCA ACC TTT GGC ACC TGC CCT CGT CCA GAA CTG ATC AAG GGC GGC GGC ATC ATC CTG CTG TTC CAG GAT CTC CTC AAG GAT GGT GAA TGG GTG GAT ATT GTA ATC AAC ATC GGC GAC CAA CTT TAC AAG AGT GTG ATG CAC CGG GTG ATA

GGT GAA GAG AGG GCT GCC ACT105

AGC TGG GGC TTC TTT GAG GTG153

ATG GAC ACA GTG GAG AGG CTA201

GAA CTA AAG TTC AAG GAA ATG249

CAG ACT GAG ATC AAT GAT TTG297

CAT CTT CCT GTT TCC AAC ATC345

TAC AGA AAG GTT ATG AAG GAA393

GAG CTC CTG TTG GAC TTG CTA441

TAT CTG AAG AAA GCC TTC TAT489

AAA GTC AGC AAT TAC CCT CCA537

CTC CGG GCA CAC ACC GAT GCC585

GAC AAG GTC AGC GGT CTC CAG633

GTT CCG CCT ATG CGC CAC TCC681

GAG GTA ATC ACA AAT GGA AAA729

GCT CAA CCA GAT GGG AAC AGA777

..· :

ATG TCA CTA GCA TCA TTC TAC AAT CCA GGA AGT GAT GCA GTG ATC TAT 825 CCA GCA CCG GCA TTG GTT GAG AAA GAG GCA GAG GAC AAG CAG ATA TAT 873 CCC AAG TTT GTG TTC GAG GAC TAC ATG AAG CTC TAT GCT GGC CTT AAG 921 TTC CAA GCT AAA GAG CCC AGG TTT GAA GCC ATG AAG GCC GTG GAA AGC 959 ACC GTA AAC TTG GGT CCA ATC GCA ACT GTT TGAGATAATA CACGCTTTGA 1019 TCTGCTGCTG TCTTATAATG CGCGTTTGCG TAATCATATC CTAGCATAGT ATATCTGAGA 1079 TCTGAGTCTG TATTGTGGTG TGAGTTTGGT TTAGCCCCTT GTTAATGCTT GGATTGGACT 1139 AGTTAAATGT GGAGCTGGTT TGTTAGATAA GATAGTCTTG CCAGGATCTT TGAGTAAATA 1199 TGATTCTGCG GAAGTCTGCG GTGAATGATA ACGTGTAAAG CAATCCGAAA GTTACCTTTC 1259 TGGGGCTTTG TCATATGCAA TGGAGAAGGA ATCTTCCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1319 _A 1320

Claims (55)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Kávénövényből származó ACC szintetáz, melynek aminosavszekvenciáját a 10. számú szekvenciavázlaton tettük közzé.

2. Az 1. igénypont szerinti ACC szintetáz, aholis a kávénövény Coffea arabica.

3. Lényegében tiszta nukleinsav szekvencia, amely egy kávénövény által termelt ACC szintetáz expresszióját kódolja, és a 11. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleotid szekvenciát tartalmazza.

4. Lényegében tiszta nukleinsav szekvencia, amely egy kávénövény által termelt ACC szintetáz expresszióját kódolja, és az ACC szintetáz a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciát tartalmazza.

5. Kávénövényből származó ACC oxidáz, melynek aminosavszekvenciáját a 12. számú szekvenciavázlaton tettük közzé.

6. Az 5. igénypont szerinti ACC oxidáz, aholis a kávénövény Coffea arabica.

7. Lényegében tiszta nukleinsav szekvencia, amely egy kávénövény által termelt ACC oxidáz expresszióját kódolja, és a 13. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleotid szekvenciát tartalmazza.

8. Lényegében tiszta nukleinsav szekvencia, amely egy kávénövény által termelt ACC oxidáz expresszióját kódolja, és az ACC oxidáz a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott amino savszekvenciát tartalmazza.

9. A 3., 4., 7. vagy 8. igénypont szerinti nukleinsav szekvencia, aholis a kávénövény Coffea arabica.

10. Egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciával transzformált kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia egy olyan RNS-t kódol, amely a 10. számú aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetázt kódoló mRNS-hez viszonyítva antiszensz, és hossza elegendő ahhoz, hogy zavarja az ACC szintetáz expresszióját.

11. Egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciával transzformált kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia egy olyan RNS-t kódol, amely a 12. számú aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidázt kódoló mRNS-hez viszonyítva antiszensz, és hossza elegendő ahhoz, hogy zavarja az ACC oxidáz expresszióját.

12. Kávénövény, amit (i) a 7. igénypont szerinti nukleinsav szekvenciával transzformáltunk, és (ii) a 8. igénypont szerinti nuklein- sav szekvenciával transzformáltunk.

13. Egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciával transzformált kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expresszióját kódoló mRNS-hez viszonyítva értelmes irányú, és az RNS hossza elegendő ahhoz, hogy zavarja az ACC szintetáz expresszióját.

14. Egy kávénövényböl izolált nukleinsav szekvenciával transzformált kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expresszióját kódoló mRNS-hez viszonyítva értelmes irányú, és az RNS hossza elegendő ahhoz, hogy zavarja az ACC oxidáz expresszióját.

15. Kávénövény, amit (i) a 13. igénypont szerinti nukleinsav szekvenciával transzformáltunk, és (ii) a 14. igénypont szerinti nukleinsav szekvenciával transzformáltunk.

16. Kávénövény, amit egy olyan nukleinsav szekvenciával transzformáltunk, ami a 10. számú aminosav szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciát kódolja.

17. A 16. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából antiszensz orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

18. A 16. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából értelmes orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

19. Kávénövény, amit egy olyan nukleinsav szekvenciával transzformáltunk, ami a 12. számú aminosav szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciát kódolja.

20. A 19. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából antiszensz orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

21. A 19. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából értelmes orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

22. Kávénövény, ami egy izolált első, a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia expresszióját kódoló nukleinsav szekvenciával, valamint egy izolált második, a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia expresszióját kódoló nukleinsav szekvenciával van transzformálva.

23. A 22. igénypont szerinti kávénövény, aholis az első és második nukleinsav szekvencia közül legalább az egyik antiszensz orientációban hozzá van kapcsolva egy transzkripciós promoterhez.

24. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely antiszensz orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expresszióját kódolja.

25. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát ✓ építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely antiszensz orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expresszióját kódolja.

26. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy (i) a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely antiszensz orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expresszióját kódolja; és (ii) a növény genomjába egy kávénövényböl izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely antiszensz orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expresszióját kódolja.

27. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely értelmes orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expresszióját kódolja. ✓

28. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely értelmes orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expresszióját kódolja.

29. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy (i) a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely értelmes orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expresszióját kódolja; és (ii) a növény genomjába egy kávénövényből izolált nukleinsav szekvenciát építünk be, ami egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, amely értelmes orientációjú ahhoz az mRNS-hez viszonyítva, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expresszióját kódolja

30. Kávébab, amely a 19-29. igénypontok bármelyike szerinti kávénövényből származik.

31. Transzformációs vektor, amely a transzkripciós promotert (a) a 11-es számú nukleinsav szekvenciához; vagy (b) a 10-es számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciához ; vagy (c) a 13-as számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleinsav szekvenciához; vagy (d) a 12-es számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciához működésében kapcsoltan tartalmazza.

32. A 31. igénypont szerinti transzformációs vektor, ahol az értelmes irányú nukleinsavszekvencia a transzkripciós promoterhez működésében kapcsolt.

33. A 31. igénypont szerinti transzformációs vektor, ahol az antiszensz irányú nukleinsavszekvencia a transzkripciós promoterhez működésében kapcsolt.

34. Kávénövény, ami a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciát kódoló, izolált nukleinsav szekvenciával van transzformálva.

35. A 34. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából antiszensz orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

36. A 34. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából értelmes orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

37. Kávénövény, ami a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciát kódoló, izolált nukleinsav szekvenciával van transzformálva.

38. A 37. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából antiszensz orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

39. A 37. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából értelmes orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

40. Kávénövény, ami transzformálva van (i) egy izolált nukleinsav szekvenciával, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciát expresszálja; és (ii) egy izolált nukleinsav szék venciával, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciát expresszálja.

41. A 40. igénypont szerinti kávénövény, áholis a nukleinsav szekvenciák közül legalább egy működés szempontjából antiszensz orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

42. A 40. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvenciák közül legalább egy működés szempontjából értelmes orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

43. Transzformált kávénövény, amit úgy állítunk elő, hogy egy transzformáló vektort építünk be egy kávénövénybe, és a transzformáló vektor tartalmaz egy transzkripciós promotert, működés szempontjából hozzákapcsolva (i) egy izolált nukleinsav szekvenciához, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia expresszióját kódolja; (ii) egy izolált nukleinsav szekvenciához, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia expresszióját kódolja

44. A 43. igénypont szerinti kávénövény, aholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából értelmes orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

45. A 43. igénypont szerinti kávénövény, áholis a nukleinsav szekvencia működés szempontjából antiszensz orientációban van egy transzkripciós promoterhez kapcsolva.

46. Transzformált kávénövény sejt, amit úgy állítunk elő, egy első transzformáló vektort és egy második transzformáló vektort építünk be egy kávénövény sejtbe, mikoris az első transzformáló vektor egy transzkripciós promotert tartalmaz, működés szempontjából egy olyan nukleinsav szekvenciához kapcsolva, amely a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia expresszióját kódolja, a második transzformáló vektor pedig egy transzkripciós promotert tartalmaz, működés szempontjából egy olyan nukleinsav szekvenciához kapcsolva, amely a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia expresszióját kódolja.

47. A 46. igénypont szerinti transzformált kávénövény sejt, amiben a nukleinsav szekvenciák közül legalább az egyik antiszensz orientációban kapcsolódik a transzkripció promoteréhez.

48. Kávénövény, ami a 34-47. igénypontok bármelyike szerinti transzformált kávénövény sejtből van regenerálva.

49 A 48. igénypont szerinti kávénövények bármelyikéből szár- mazó kávébab.

50. Eljárás kávénövény sejt nukleinsawal történő transzformációjára, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkriptumot kódol, ami a kávénövényben képződő ACC szintetáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve antiszensz irányú, és az eljárás következő lépéseket tartalmazza:

kávénövényből izolált nukleinsavat tartalmazó transzformáló vektor biztosítása, amely a 10-es számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosavszekvenciával rendelkező ACC szintetáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol, ahol a nukleinsavszekvencia a promoterhez működésében antiszensz irányban kapcsolt; és a transzformáló vektor kávényö vény sejtekbe történő inszertálása, ahol ezek után a nukleinsav szekvencia a kávénövény sejtek genomjába beépül.

51. Eljárás a kávénövény sejt nukleinsawal történő transzformációjára, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkriptumot kódol, ami a kávénövényben képződő, a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve antiszensz, és a következő lépéseket tartalmazza:

kávénövényböl izolált nukleinsavat tartalmazó transzformáló vektor biztosítása, amely egy, a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol, ahol az antiszensz irányú nukleinsavszekvencia egy transzkripciós promoterhez működésében kapcsolt; és a transzformáló vektor kávényövénysejtekbe történő inszertálása, ahol ezek után a nukleinsavszekvencia a kávénövény sejtek genomjába beépül.

52. Eljárás a kávénövény sejt transzformálására (i) egy nukleinsavval, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, ami a kávénövényben képződő ACC szintetáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve antiszensz irányú, és (ii) egy nukleinsawal, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, ami a kávénövényben képződő ACC oxidáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve antiszensz irányú; és az eljárás a következő lépéseket tartalmazza:

egy első transzformáló vektor biztosítása, amely egy első transzkripciós promotert tartalmaz, működés szempontjából egy kávénövényből izolált első nukleinsav szekvenciához kapcsolva, ami a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával ren92 'delkezö ACC szintetáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol; és egy második transzformáló vektor biztosítása, amely egy második transzkripciós promotert tartalmaz, működés szempontjából egy kávénövényből izolált második nukleinsav szekvenciához kapcsolva, ami a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol; és az első és a második nukleinsav szekvencia közül legalább az egyik működés szempontjából antiszensz orientációban kapcsolódik a transzkripciós promoteréhez; és a transzformáló vektor kávénövény sejtekbe történő inszertálása, ahol ezek után a nukleinsavszekvencia a kávénövény sejtek genomjába beépül.

53. Eljárás egy kávénövénysejt nukleinsawal történő transzformációjára, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkriptumot kódol, ami a kávénövényből származó ACC szintetáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve értelmes orientációjú, és a következő lépéseket tartalmazza:

kávénövényböl izolált nukleinsavat tartalmazó transzformáló vektor biztosítása, amely egy, a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol, ahol az értelmes irányú nukleinsavszekvencia egy transzkripciós promoterhez működésében kapcsolt; és a transzformáló vektor kávényövénysejtekbe történő inszertálása, ahol ezek után a nukleinsavszekvencia a kávénövény sejtek genomjába beépül.

54. Eljárás egy kávénövény sejt nukleinsawal történő transzformációjára, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkriptumot kódol, ami a kávénövényből származó ACC oxidáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve értelmes orientációjú, és a következő lépéseket tartalmazza:

kávénövényböl izolált nukleinsavat tartalmazó transzformáló vektor biztosítása, amely egy, a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol, ahol az értelmes irányú nukleinsavszekvencia egy transzkripciós promoterhez működésében kapcsolt; és a transzformáló vektor kávényövénysejtekbe történő inszertálása, ahol ezek után a nukleinsavszekvencia a kávénövény sejtek genomjába beépül.

55. Eljárás a kávénövény sejt transzformálására (i) egy nukleinsawal, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, ami a kávénövényben képződő ACC szintetáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve értelmes irányú, és (ii) egy nukleinsawal, azzal jellemezve, hogy a nukleinsav egy olyan RNS transzkripcióját kódolja, ami a kávénövényben képződő ACC oxidáz expressziójáért felelős szekvenciát kódoló mRNS-re nézve értelmes irányú; és a következő lépéseket tartalmazza:

egy első transzformáló vektor biztosítása, amely egy első transzkripciós promotert tartalmaz, múködés szempontjából egy kávénövényből izolált első nukleinsav szekvenciához kapcsolva, ami a 10. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC szintetáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol; és egy második transzformáló vektor biztosítása, amely egy második transzkripciós promotert tartalmaz, működés szempontjából egy kávénövényböl izolált második nukleinsav szekvenciához kapcsolva, ami a 12. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával rendelkező ACC oxidáz expressziójának gátlásához szükséges elegendő hosszúságú RNS transzkriptumot kódol; és az első és a második nukleinsav szekvencia közül legalább az egyik működés szempontjából antiszensz orientációban kapcsolódik a transzkripciós promoteréhez; és a transzformáló vektor kávénövénysejtekbe történő inszertálása, ahol ezek után a nukleinsavszekvencia a kávénövénysejtek genomjába beépül.

A meghatalmazott