HUT65139A - Process for separating biomolecules by using linear polymers - Google Patents

Description

Eljárás biomolekulák elválasztására lineáris polimerek alkalmazásával

Middlesex Sciences, Inc., Mansfield, ΜΑ,*Ά < í? íh

Amerikai Egyesült Államok

Feltaláló:

L.

WOISZWILLO Jamesjj Mansfield

Amerikai Egyesült Államok

A nemzetközi bejelentés bapja: 1993. 01. 07.

Elsőbbsége:

1992. 01. 07. (07/817 610)

A Nemzetközi bejelentés száma: PCT/US93/00073 . ..Λ í\ Nemzetközi közzététel^ szám?: WO 93/14110

77958-6051 OE/Hoj

-2A találmány tárgya eljárás biomolekulák szétválasztására és elválasztására, közelebbről a találmány polimerek alkalmazására vonatkozik proteinek biológiai mintákból való elválasztásánál.

Proteinek elválasztása

A proteinek elválasztása igen fontos a különböző biológiai kutatásoknál, a klinikai diagnosztikánál, valamint gyógyszerek előállításánál, különösen a rekombináns eljárással való gyógyszer előállításnál. A tudományos kutató gyorsan kell, hogy proteinhez jusson úgy, hogy annak nagy specifikus aktivitását megtartsa, az orvosnak biológiai mintákban a proteineket azonosítani kell annak érdekében, hogy pontos diagnózist tudjon felállítani, továbbá a molekuláris biológusnak nagy mennyiségű, a rekombináns organizmusok által termelt proteineket kell kinyerni és tisztítani.

A kutatók a biológiai mintákból a proteinek elválasztását ismert módon sókkal, igy például ammónium-szulfáttal vagy szerves oldószerekkel, igy például etanollal végzett kicsapással végezték. Az ilyen módszereknél azonban a kemikáliákkal való érintkezés gyakran a proteinek denaturálódását okozza. Továbbá, a proteinek elválasztása a csapadékból is nehéz és további denaturálódást.okozhat.

Az ammónium-szulfáttal végzett kicsapási eljárás, amelyet kisózásnak is nevenek, azon a tényen alapszik, hogy a legtöbb protein oldhatósága nagy elektrolitkoncentráció esetén csökken. Ennél az eljárásnál a szulfátot azért alkalmazzák, mivel a többértékü ionok általában hatásosabbak, mint az egyértékü ionok. Ezt az eljárást általában hidegen (0-4°C között) végzik úgy, hogy a pH értékét közel a semleges érték körül tartják. A különböző proteinek különbözőképpen csapódnak ki a hozzáadagolt só koncentrációjától függően. Ezen eljárás hátránya az, hogy a maradék sót a csapadékból vagy a felülúszóból igen nehéz eltávolítani, gyakran erre a célra dialízist alkalmaznak, ez azonban igen időigényes.

A szerves oldószereket gyakran a proteinek frakcionált kicsapására alkalmazzák. Ennél az eljárásnál azonban fennáll a proteinek denaturálódásának veszélye, hacsak a hőmérsékletet nem tartják közel a fagyáspont körüli értéken. Az oldószert továbbá a proteinből el kell távolítani. Az oldószert, igy például az etanolt általában liofilizálással távolitják el a kicsapott proteinekből.

A proteinek tisztításával kapcsolatos legutóbbi fejlesztések a nagy teljesítményű ioncserés, az affinitásos kromatográfia, a hidrofób kölcsönhatás, valamint a gélszüréses kromatográfia köré csoportosultak. A biológiai mintát a kromatográfiás oszlopra viszik és megfelelő oldószerrel frakciókban eluálják, amelyeket ezután a protein aktivitásra vizsgálnak. Ez a módszer azonban drága, időigényes és igen kevéssé alkalmas a proteinek nagyüzemi tisztításához.

Több kutató továbbra is a tradicionális módszereket alkalmazza önmagában, vagy az utóbbi időben kifejlesztett kromatográfiás eljárásokkal kombináltan. így például egy ammónium-szulfáttal végzett kicsapás után a proteint az ammónium-szulfát sótól kromatográfiával választják el. A protein gyakran azonban elveszti az aktivitását vagy denaturálódik az eljárás egy vagy több lépése alatt és ily

-4• · « ··«····· • « · · · ·· ·· « * · * • · · ·« ··« módon kis kihozatalt vagy nem pontos azonosíthatóságot eredményez.

Polimerekkel kapcsolatos tanulmányok

Az 1960-as évek közepén Polson és mtársai (Polson és mtársai, Biochim. Biophys. Acta 82:463-475 (1964)) különböző nagy molekulatümegü polimereket vizsgáltak a proteinek tisztítása céljából, igy például vizsgálták a polietilénglikolt (PEG), dextránt, nonilfenil-etoxilátokat (NPE-k), poli(vinil-alkoholok)at (PVA), valamint a poli(vinil-pirrolidont) (PVP). Polson és mtársai szerint a PEG a leginkább alkalmas a vizsgált polimerek közül a proteinek kicsapására. A PEG hátránya az, hogy el kell távolítani a proteinből vagy DEAE vagy cellulóz töltetű oszlop alkalmazásával olyan körülmények között, amely a proteineket abszorbeálja és a PEG a mosófolyadékkal az oszlopról kimosható vagy pedig oly módon, hogy a proteineket a felülúszóból etanollal kicsapják és a PEG a felülúszóban marad. Polson és mtársai felhívták a figyelmet a PVE, PVP és NPE-k alkalmazásának hátrányaira, mivel ezek igen nagy belső viszkozitással rendelkeznek és ily módon megfigyeléseik szerint ezek a polimerek igen jelentős mértékű protein denaturálódást okoznak. Polson és mtársai eredményeit igazolta és tovább is fejlesztette Zeppezauer és Brishammar (Zeppezauer és Brishammar, Biochim. Biophys. Acta 94:581-583 (1965)), akik vese-proteint csaptak ki három különféle nagy molekulatömegü Polyox™ készítménnyel, amely PEG gyanta és Unión Carbide Corp. (Danbury, CT) gyártmány.

A polietilénglikol (PEG), más néven poli(etilén-oxi)-glikol egy etilén-oxidból és vízből nyert kondenzációs polimer, amelyek általános képlete HO(CH2CH2O)_nH. A PEG-et vízben oldható kenőanyagként alkalmazzák a gumi-, textil- és fémiparban, továbbá az élelmiszereknél, kozmetikumoknál, vizes festékeknél, papirbevonatoknál és csiszolóanyagoknál, továbbá a gyógyszeriparban kenőcsbázisként is felhasználásra kerül.

A dextrán lényegében poliszacharid, amelyet baktériumok termelnek szacharóz szubsztrátumon. A nativ dextránt például a Leuconostoc mesenteroides és Lactobacteria dextranicum baktériumok termelik és a molekulatömege általában magas. Az alacsonyabb molekulatömegü dextránokat plazma térfogat-növelő szerként (töltőanyagként) vagy véráram adjuvánsként alkalmazzák és általában a nativ dextrán depolimerizálásával vagy szintetikus utón állítják elő.

Az NPE-k hosszú szénláncu vegyületek, amelyeket gyakran felületaktív anyagként alkalmaznak, általában derivatizálják, hogy a kívánt oldhatósági követelményeket kielégítse.

A PVA poli(vinil-acetátokból) nyert polimer, amelynél az acetátcsoportot hidroxilcsoporttal helyettesítik, az általános képlete (CH2CH0H)_n. A legtöbb poli(vinil-alkohol) vízben oldható és a műanyagiparban elasztomerként kerül felhasználásra, továbbá a gyógyszeriparban viszkozitást növelő szerként, valamint optalmikus kenőanyagként alkalmazzák.

A PVP egy nem-ionogén, hidrofob polimer, amelynek átlagos molekulatömege kb. 10000 és 700000 közötti érték és az általános képlete (CgHgNOjn· A PVP-t poli[1-(2-oxo-l-pirrolidinil)-etilén]-ként is említik, továbbá ismertek a következő márkanevek: Povidone™, Polyvidone™, RP 143™, Kollidon™, Peregal ST™, Periston™, Plasdone™, Plasmosan™, • · · ········ • · · · · • · ·« · ··· ····· ·· · · • ·· ·· ···

-6Protagent™, Subtosan és Vinisil™. A PVP nem toxikus, igen higroszkópos és vízben vagy szerves oldószerekben könnyen oldódik. A PVP széles felhasználásnak örvend a gyógyszeriparban, igy például komplexáló szerként, továbbá detoxifikáló szerként különböző kemikáliák számára. Használják továbbá tablettázásnál, fotográfiás emulzióként, kozmetikumként, detergensként, adheziv anyagként, továbbá a sör és bor derítésére. A PVP felhasználásra került továbbá mint vérplazma adalékanyag a II. világháborúban, de mivel a nagy molekulatömegü anyagok esetében azt találták, hogy a szövetekben adszorbeálódik, az alkalamzását később ejtették. A PVP-t intravénásán alkalmazták a humán szérum lipidek csökkentésére, mint azt például Sanbar és Smet ismertetik (Sanbar és Smet, Circulation 38:771-776 (1986)).

A PEG, a dextrán, a PVA és a PVP kereskedelmi forgalomban beszerezhető, igy például a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) gyártmányaként. Az NPE-k előállítását általában a vevő végzi és megrendelhető különböző kémiai szerek gyártóitól.

Rekombináns eljárás

Számos proteint, igy például a humán növekedési hormont és az inzulint manapság rekombináns eljárással állítják elő. A proteint kódoló gént egy bakteriális vagy virális vektorba inszertálják és ily módon nagy mennyiségű protein képződését váltják ki, amelyeket ezután a többi, a tápközegben lévő porteintől vagy a fermentációs folyadékból el kell választani. A rekombináns eljárással előállított proteinek gyors és olcsó tisztítási eljárása elősegíti az ezúton előállított proteinek költségeinek csökkentését és növeli a kihozatalt.

• ·· ········ • · · · * ·· ·· · ··· ««··· « · · · • · · · · ···

-7Hatóanyagok

A kívánt hatás érdekében elegendő mennyiségű gyógyászati hatóanyag vagy szer kell, hogy elérje a hatás helyét. Az adagolás helyéről a vérben abszorbeálódó hatóanyag gyakran proteinekhez, igy például albuminhoz kötődik, ami késlelteti a hatóanyagnak a kívánt helyre való jutását. Azokat a hatóanyagokat, amelyek nagyobb affinitással rendelkeznek a szérum proteinekhez, nagyobb dózisban kell alkalmazni a kívánt hatás elérése érdekében.

A gyógyszerek fejlesztése során hatóanyag diszpozíciós vizsgálatokat végeznek annak érdekében, hogy megállapítsák a szérum proteinekhez kötött hatóanyag mennyiségét. A hatóanyag beadagolása után a szérum proteineket kromatográfiával vagy kémiai szerekkel, igy például ammónium-szulfáttal végzett kicsapással elválasztják, meghatározzák a protein frakcióban lévő hatóanyag mennyiségét és ezt összehasonlítják az intakt mintában lévő hatóanyag teljes koncentrációjával analitikai vizsgálatok segítségével. Ezek a módszerek azonban időigényesek és nem szolgáltatnak elegendő információt azon proteinek azonosságára, amelyekhez a hatóanyagok kötődnek.

Vizeletmintákat szintén vizsgáltak a hatóanyag vagy hatóanyag-metabolitok koncentrációjára annak bizonyítására, hogy ezek a hatóanyagok kiválasztódtak és nem maradtak a szervezetben. Az akadályozó proteineket gyakran elválasztják a hatóanyagtól a fentiekben már említett időigényes eljárásokkal.

Albumin elválasztás

Az albumin egy egyszerű protein, amely növények és állatok szöveteiben és nedveiben megtalálható és ismert, hogy a •··« ··· * · · · · • · · · ··· ····· ·· · · • ·· ·· ···

-8baromfi tojások fehérjéjében jelen van. Az albumin vízben oldható, melegre, savval vagy semleges oldatokkal könnyen denaturálható. A szarvasmarha szérum albumin (BSA) a szarvasmarha vérből származtatható és gyakran alkalmazzák in vitro biológiai vizsgálatoknál. A normál humán szérum albumint egészséges személyek vérplazma proteinjeiből nyerik frakcionálással és transzfúziós anyagként kerül felhasználásra. A szérum albumint a diagnosztikában is alkalmazzák, igy például a radio-jód-jelzett szérum albumint a vértérfogat és a kardiális teljesítmény meghatározásánál alkalmazzák. Ezért igen nagy szükség van egy olcsó eljárásra, amellyel nagy mennyiésgben lehet tisztított albumint előállítani.

Immunoglobulin elválasztás

Az IgG, IgM, IgA, IgE és IgD immunoglobulinok, amelyek gerincesek szérum proteinjeinek gamma-globulin frakcióiban találhatók, a keringő antitest populáció alkotói és biztosítják a humorális immunválaszt a különböző fertőzések és betegségek leküzdéséhez. A szérum globulin és albumin arányának mérésével igen jó információt kapunk az immunválasz meglétére és az egyedeknek a fertőzések leküzdésére való képességére. A globulin abnormálisán magas koncentrációja a szérumban gyakran túlburjánzó betegségekre, igy például myelomára vagy Bence Jones proteinekre utal. A tisztított immunoglobulinok igen fontosak a tudományos kutatásban, különösen a vakcinák fejlesztésénél, valamint az olyan egyedek passzív immunizálásánál, akik olyan baktériumok vagy vírusok által okozott fertőzéseknek voltak kitéve, amelyek ellen még vakcina nem áll rendelkezésre. Ezért igen fontos egy gyors módszer az immunoglobulinoknak a • ·· ··«····« * « « * · • · ·· « ··· ····· · · · · • · * ·· · · ·

-9vérből való elválasztására, továbbá diagnosztikai és terápiás célra, amelyeket a kutatásban lehet hasznosítani.

Antitestek

A monoklón antitestek egy előzőleg nemrégen immunizált kis állat lépéből származó normál antitest-képző limfocita és egy myeloma sejtvonal fúziója során képződnek, amikoris hibridoma alakul ki. A myeloma sejt a kívánt antitest folyamatos termelődését váltja ki, amelyet általában az ascites folyadéból nyernek ki. A monoklón antitesteket az ascites folyadékban jelenlévő más proteinektől el kell választani mielőtt reagensként diagnosztikai 'kitekben tudományos alkalmazásra kerülnének vagy a hatóanyaghoz kell kapcsolni, igy egy varázs-golyót képezve, amely a kívánt helyre, igy például a rákos daganathoz irányítható. A poliklón antitesteket úgy nyerik, hogy állatokat, igy például egereket, patkányokat vagy nyulakat antigénnel beoltanak, a vérüket leveszik és elválasztják az antigénhez kapcsolt immunoglobulin frakciókat, például egy affinitásos oszlopon való átengedéssel, amelyhez az antigén immobilizálva lett. A kapott poliklón antitesteket hasonlóképpen használják, mint a monoklón antitesteket, kivéve, hogy a poliklón antitestek specificitása egy adott antigénhez nem túl nagy. Egy egyszerű, olcsó módszer a monoklón és poliklón antitestek elválasztásaira nagymértékben egyszerűsítené az antitestek előállítását.

Spinális (gerinc) folyadék és vizelet analízise

A betegségek és elváltozások orvosi diagnosztizálását gyakran a testfolyadékok, igy például a gerincfolyadék vagy vizelet vizsgálata alapján végzik. A biomolekuláknak az ilyen • · 4 '«*·«··* • 4 « *· •4 4« «44« ····· ·« ·4 · · ····· folyadékokban jelenlévő zavaró anyagoktól való elválasztása gyorsabb és megbízhatóbb diagnózist eredményezhet.

A találmány célja tehát egy egyszerű, olcsó, gyors eljárás biztosítása biomolekulák relatíve tisztán és aktív állapotban való elválasztására.

A fentiek alapján találmányunk tárgya tehát

- eljárás biomolekulák nem-denaturáló elválasztására,

- gyors, reprodukálható eljárás relatíve tiszta proteinek elválasztására,

- eljárás biomolekulák elválasztására biológiai mintákból egy lépésben,

- eljárás nagy mennyiségű, relatíve tiszta proteinek elválasztására,

- eljárás a globulin/albumin arány meghatározására a szérumban, és

- eljárás a hatóanyag diszpozíció meghatározására szérum proteinekben.

A találmány tehát eljárásra, készítményre, valamint egy kitre vonatkozik aktív biomolekuláknak, igy például proteineknek, biológiai mintákból való elválasztására. A mintához egy oldható, lineáris polimert adagolunk, amelynek révén csapadék képződik. A szóban forgó biomolekulát ezután a csapadékból vagy a felülúszóból választjuk el. A szóban forgó biomolekulákat a felülúszótól egy következő polimer kicsapással vagy egy cinkvegyülettel végzett kicsapással végezzük. Egy biológiai detergens adagolása, amely szolubilizálja a protein-komplexeket a mintában a polimerrel végzett kicsapást megelőzően, növeli a kicsapás mértékét.

• · ·· · · · · ····· · · · · • · · ·· ··«

-11Egy adott biomolekula elválasztása függ a mintának a polimer adagolása előtti, alatti vagy utáni pH-jától. A minta pH-ját egy előre meghatározott értékre állítjuk be a polimer adagolás előtt vagy után egy sav vagy bázis adagolásával, előnyösen egy vagy több kis molekulatömegü karboxil- vagy aminocsoportot tartalmazó anyaggal, igy például imidazollal, amino-kapronsavval, egy aminosavval vagy ezek keverékével. Eljárhatunk úgy is, hogy a lineáris polimer pH-ját állítjuk be és az igy beállított pH-ju polimert adagoljuk a mintához és képzünk csapadékot, majd elválasztjuk a biomolekulát egyetlen lépéssel. Az alacsőny molekulatömegü anyag előnyös koncentrációja, amelyet a pH beállításhoz alkalmazunk, függ az elválasztási eljárásnál kívánt pH értékétől.

Polimerként előnyösen poli(vinil-pirrolidon) (PVP) vizes oldatát alkalmazzuk. Alkalmazhatjuk azonban a poli(vinil-pirrolidon) és egy vagy több, további oldható lineáris polimer, igy például polietilénglikol, dextrán, nonilfenil-etoxilát vagy poli(vinil-alkohol) keverékét is, különösen előnyösen poli(vinil-pirrolidon) (PVP) és polietilénglikol (PEG) keverékét alkalmazzuk.

A biológiai mintákból való biomolekula-kicsapást előnyösen szobahőmérsékleten vagy szobahőmérséklet alatti hőmérsékleten, igy például 2 és 20°C közötti értéken végezzük. Még előnyösebben a kicsapást olyan hőmérsékleten végezzük, amelynél a polimer vagy a polimerek keveréke viszkózus, igy például 4°C értéknél.

Egy előnyös kiviteli módozatnál az immunoglobulinoknak egy biológiai mintából, igy például vérszérumból való elválasz

-12tását úgy végezzük, hogy először a polimer oldat, igy például a poli(vinil-pirrolidon) és polietilénglikol oldatának pH-ját állítjuk be semleges értékre. A pH értékét imidazol és aminokapronsav keverékével állítjuk be. A pH-t beállíthatjuk továbbá még például glutaminsavat, hisztidint és lizint tartalmazó aminosav oldattal is. A mintához biológiai detergenst, igy például poli(etilén-oxi)-szorbitánt vagy még előnyösebben poli(etilén-oxi)-szorbitán-monolaurátot tartalmazó oldatot adagolunk, majd a polimer oldatot adjuk a mintához és igy kicsapjuk a relatíve tiszta immunoglobulin frakciót, és a zavaró proteinek pedig, igy például az albumin és más egyéb anyagok a felülúszóban maradnak. A kicsapott gammaglobulint előnyösen egy alkálikus oldatban, igy például glicerint és imidazolt, glicerint és nátrium-hidrogén-karbonátot, imidazolt vagy egy sóoldatot, igy például Trizma™ bázist (trisz(hidroxi-metil)-amino-metán) tartalmazó oldatban reszuszpendáljuk, az oldhatóság és a stabilitás fokozására.

Egy másik előnyös kiviteli módnál a proteineket a vizeletből vagy a gerincfolyadékból úgy csapjuk ki, hogy a poli(vinil-pirrolidont) és polietilénglikolt tartalmazó polimer oldat pHját először semleges értékre állítjuk be glicin oldattal, előnyösen cink-glicinát oldattal, majd az igy kapott polimer oldatot egyesitjük a mintával.

A találmány vonatkozik továbbá egy hatóanyag diszpozíciós eljárásra a szérum proteinekben, amelynél a globulin frakciót izoláljuk, az albumint a felülúszóból kicsapjuk, majd meghatározzuk a hatóanyag mennyiségét mindkét frakcióban.

A találmány vonatkozik továbbá a globulin/albumin arány • · · · «V · ·· • * · · · « · · · k ·> · · ·«4

-13meghatározásárá szérum mintákban diagnosztikai célra, amelysorán a globulint és az albumint a fentiekben leirt módon elválasztjuk, majd meghatározzuk mindkettőben a koncentrációt és az egymáshoz viszonyított arányt.

A következőkben részletesen ismertetjük a biológiailag aktív biomolekuláknak biológiai mintákból lineáris polimerekkel végzett elválasztására alkalmas eljárást, készítményt és kit-et. Az elválasztani kívánt biomolekulák közé tartoznak a proteinek, lipidek, nukleinsavak, szénhidrátok, valamint nem-protein hormonok. Szakember számára nyilvánvaló, hogy az elválasztott biomol'ekula lehet egy célzott molekula is, igy például hatóanyag.

A szóban forgó biomolekulát úgy választjuk el, hogy elegendő mennyiségű oldható, lineáris polimert vagy polimerek keverékét adagoljuk a biológiai mintához, amikoris csapadékot képzünk. A biomolekulát ezután elválasztjuk a csapadékból vagy a felülúszóból dekantálással vagy egy következő kicsapással.

Az adott biomolekula elválasztását más egyéb biomolekuláktól vagy a mintában lévő egyéb zavaró anyagoktól úgy végezzük, hogy a minta pH-ját előre meghatározott értékre állítjuk be vagy a polimer adagolását megelőzően vagy azt követően vagy az adagolás alatt. A minta pH-ját előnyösen 4-9,2 közötti értékre állítjuk be pH-beállitott polimer oldat beadagolásával igy a beállított és a kívánt biomolekula kicsapását és elválasztását egyetlen lépésben végzve. A polimer oldat pH-ját egy savval vagy bázissal végezzük, erre a célra kis molekulatömegü vegyületet alkalmazunk, amely karboxil- vagy aminocsoportot tartalmaz, igy például imidazolt, kapronsavat, egy aminosavat

-14vagy ezek keverékét, amelyek minimális sóképződést eredményeznek. Eljárhatunk úgy is, hogy a pH-beállitást a polimer adagolása előtt vagy után végezzük, ekkor a savat, bázist vagy alacsony molekulatömegü vegyület oldatát közvetlenül a mintához adagoljuk.

A szóban forgó biomolekula elválasztását az igy nyert felülüszóból úgy végezzük, hogy egy második polimer oldatot adagolunk, amely az előzőtől eltérő polimerek keveréke és attól eltérő pH-ju vagy pedig cinkvegyületet, igy például cink-szul fátot adagolunk és ezzel csapjuk ki a biomolekulát a felüluszó ból.

A csapadék mennyiségének és tisztaságának növelése érdekében a mintához a polimer oldat beadagolása előtt előnyösen még biológiai detergenst is adagolunk, amely a protein komplexeket szolubilizálni képes, erre a célra pédlául poli(etilén-oxi)-szorbitánt, poli(etilén-oxi)-étert, igy például 23 lauril-étert (kereskedelmi forgalomba Brig 35™ néven kerül) vagy egy Triton felületaktív anyagot (Triton X-102™) vagy nátrium-dodecil-szulfátot (SDS) alkalmazunk. Az előnyös detergens a poli(etilén-oxi)-szorbitán, különösen előnyösen poli(etilén-oxi)-szorbitán monolaurátot alkalmazunk, amely kereskedelmi forgalomba Tween-20™ néven kerül és a Sigma Chemical Company St. Louis MO gyártmánya. Ugyanettől a cégtől szerezhető be a 23 lauril-éter (Brij 35™) , a Triton X-102™, valamint a nátrium-dodecil-szulfát. Hasonlóképpen kereskedelmi forgalomban beszerezhető és a találmány értelmében felhasználható biológiai detergens anyagok például a következők: anionos biológiai detergensek, igy például kaprilsav, kolsav, 1-dekán

-15szulfonsav, dezoxikolsav, glikokolsav, glikodezoxikolsav, lauril-szulfát, taurokolsav, valamint taurodezoxikolsav, továbbá kationos biológiai detergensek, igy például cetilpiridinium-klorid, dodecil-trimetil-ammónium-bromid, hexadecil-trimetil-ammónium-bromid, vagy tetradecil-trimetil-ammónium-bromid, továbbá ikerionos (amfoter) biológiai detergensek, igy például 3-(3-kolamido-propil-dimetil-ammónió)-1-propán-szulfonát (CHAPS), vagy a 3-(3-kolamido-propil-dimetil-ammónió)-2-hidroxi-l-propánszulfonát (CHAPSO), továbbá nem-ionos biológiai detergensek, igy például n-decil-B-D-glükopiranozid, digitonin™ (digitin), n-dodecil-B-D-glükopiranozid, n-dodecil-B-D-maltozid, n-heptil-B-D-glükopiranozid, n-oktil-a-D-glükopiranozid, nonidet P-40™, n-nonil-B-D-glükopiranozid és Triton X-100™. Ezeket a biológiai detergenseket szintén a Sigma Chemical Company-tól lehet beszerezni.

A detergensek előnyös koncentrációja 0,5 és 5% közötti érték. Előnyösen azonos térfogatú detergens oldatot és mintát elkeverünk és annyi ideig inkubáljuk, amíg a mintában lévő protein komplexek feloldódnak. Általában 5-30 perces inkubálási idő szobahőmérsékleten elegendő.

A mintából történő biomolekula kicsapást előnyösen szobahőmérsékleten (20°C) vagy ez alatti hőmérsékleten végezzük. Különösen előnyösen a kicsapást olyan hőmérsékleten végezzük, amelyen a polimer vagy a polimerek keveréke viszkózus. így például egy PVP-ből és PEG-ből álló polimer keverék 4°C hőmérsékleten enyhén viszkózus. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a hőmérséklet nem lehet a polimer vagy a polimer keverék fagyáspontja alatti érték. Ezért a koplimert vagy a polimer • · ·

-16keveréket olyan hőmérsékleten kell tartani és a kicsapási reakciót olyan hőmérsékleten kell végezni, amely a polimer vagy polimer keverék fagyáspontja és szobahőmérséklet közötti érték, különösen előnyösen 4°C.

Biomolekulák kicsapásához alkalmazott polimerek

A találmány szerint a biomolekulákat megfelelő mennyiségű, vízben oldható lineáris polimerek adagolásával választjuk el, amelyekkel csapadékot képzünk. Ilyenek például a polietilénglikol (PEG), dextrán, nonilfenol etoxilátok, NPE-k, poli(vinil-alkohol) (PVE), poli(vinil-pirrolidon) (PVP) vagy ezek keveréke. Előnyösen PVP vizes oldatát alkalmazzuk, amelyben a PVP molekulatömege 10000 és 360000 közötti érték, különösen előnyösen 40000. A PVP-t vízben oldjuk 1-30 g/100 ml koncentrációban a polimer molekulatömegétől függően. Különösen előnyösen 20 g/100 ml koncentrációt alkalmazunk 40000-es molekulatömegü PVP esetén. A mintához adagolt polimer térfogata attól függ, hogy az elválasztani kívánt biomolekulát a felülúszóban kívánjuk tartani, vagy pedig kicsapjuk.

Polimer térháló

Az oldahtó, lineáris polimert önmagában adagoljuk, vagy két vagy több polimer keveréke formájában, vagy egy polimer térháló formájában. A polimer térháló polimerek nem-kovalens kapcsolódása egy homogén, oldhatatlan, térhálós vagy méhkaptár-szerü szerkezetté, amely nem befolyásolja a kapcsolódott polimerek vizmegkötő tulajdonságait. A polimer térhálókat részletesen Sperling L.H. ismerteti a következő irodalmi helyen: Interpenetrating Polymer Networks and Related Networks, Plenum Press, N.Y., 1981. Egy aromás dicianin • ·

-17vegyületet, igy például a 4,4-biszfenol A dicianátot vagy dicianát és cianát vegyületek keverékét ismertetik a következő irodalmi helyen: Feldman és Huang, Am. Chem. Soc. Symposia Series, 367:244-268 (1988), ezek az anyagok alkalmas reagensek a polimer térhálók kialakítására.

Előnyösen úgy járunk el, hogy két tréfogatnyi dicianát vegyületet elkeverünk egy térfogatnyi polimerrel vagy polimer keverékkel. Ha a kapott keveréket a dicianát olvadási hőmérséklete fölé melegítjük, a dicianát-észterek ciklotrimerizációs reakcióba lépnek és triazin gyűrűket képeznek, ami egy relatív nyitott térháló, amely a polimer molekulákat immobilizálja. A keveréket előnyösen 80-90°C közötti hőmérsékleten 40 percen át melegítjük. A kapott térhálós szerkezet hőre és mechanikai igénybevételre stabil és a viz-abszorbeáló polimerek homogén keverékét biztosítja.

A polimer térhálót előnyösen szivacs vagy méhkaptár-szerü szerkezet formájában adagoljuk a mintához az elválasztani kívánt biomolekula gyors elválasztása érdekében. A térhálóban diszpergált polimerek vizet adszorbeálnak a mintából és igy váltják ki a csapadékképződést. A polimer hálót ezután eltávolítjuk a mintából, a biomolekulát a csapadékból elválasztjuk, vagy a polimer térhálóból alkalmas oldószerrel, igy például vízzel eluáljuk.

pH beállítás

A polimer vagy a minta pH-ját előnyösen előre meghatározott 4-9,2 közötti értékre állítjuk be sav vagy bázis oldattal, amelyek pH-ja 2-10,5 közötti érték. A savas vagy bázikus oldatot a polimer oldathoz adagoljuk, majd ezt

-18adjuk a mintához vagy pedig úgy járunk el, hogy a savas vagy bázikus oldatot közvetlenül a mitához adagoljuk vagy a polimer adagolása előtt vagy után.

A savas vagy bázikus oldat előnyösen alacsony molekulatömegü vegyületet tartalmaz, amely töltéssel rendelkező karboxilcsoportot vagy aminocsoportot hordoz. így például a savas vagy bázikus oldat tartalmazhat imidazolt, amino-kapronsavat, egy vagy több aminosavat, vagy kis molekulatömegü szilán-bázisu szilánvegyületet, amellyel előnyösen elkerülhető a sóképződés. Különösen előnyösen olyan savas vagy bázikus oldatot alkalmazunk, amely amidzol't vagy amino-kapronsavat tartalmaz. Ezek a vegyületek kevésbé költségesek mint az aminosavak. Más módszer szerint a pH-t töltéssel rendelkező aminosavat tartalmazó oldat segítségével állítjuk be, ezek tartalmazhatnak például aszpartinsavat, glutaminsavat, lizint, arginint, hisztidint, vagy ezek sóit, továbbá tartalmazhatnak töltéssel nem rendelkező poláros aminosavakat, igy például glicint, szerint, treonint, ciszteint, tirozint, aszparagint vagy glutamint vagy ezek sóit, továbbá tartalmazhatják töltéssel rendelkező és töltéssel nem rendelkező poláros aminosavak keverékét is, igy például glicin, cisztein és lizin vagy ezek sóinak keverékét.

Az optimális pH értéket úgy határozzuk meg, hogy megállapítjuk a minta pH-gradiensét a megfelelő sav vagy bázis keverékkel, a mitához különböző pH-beállitott polimereket vagy pedig a különböző pH értékekre beállított minta alikvot részéhez polimereket adagolva, majd analizáljuk a kapott felülúszót vagy csapadékot ismert módszerekkel, igy például gél elektroforézissel, immunobiot analízissel vagy enzim-kapcsolá

-19sos immunoszorbens vizsgálattal (ELISA) és igy meghatározzuk azt a pH értéket, amely a legnagyobb mennyiségű biomolekulát eredményezi a legnagyobb tisztasággal.

A polimer aránya a mintához

A biológiai mintához megfelelő mennyiségű polimert adagolunk vagy a kívánt biomolekula kicsapására, vagy a zavaró biomolekula és más egyéb anyagok kicsapására, ekkor a kívánt biomolekula a felülúszóban marad. Legkedvezőbb elválasztást biztosíthatunk, ha a polimer térfogataránya a mintához 1:1 és 20:1 közötti érték, előnyösen ez az arány 2:1.

A szükséges po'limer mennyisége függ a mintában lévő viz mennyiségétől. Nagy mennyiségű vizet tartalmazó minták, igy például vizelet esetén több polimer szükséges mint koncentrált mintáknál, igy például vérszérum esetén.

Proteinek elválasztása

Úgy gondoljuk, hogy a PVP és PEG kombinációja eredményesen képes a proteineket elválasztani oly módon, hogy a mintából a vizet két különböző mechanizmus szerint abszorbeálja. A PVP a vizet peptid kötésén keresztül köti meg, mig a PEG esetén a vizmegkötés a hidroxilcsoportokon keresztül megy végbe. Úgy gondoljuk, hogy ez a kombinált abszorpciós mechanizmus a proteinek igen tiszta elválasztását biztosítja, amely a jelenleg ismert protein tisztítási és elválasztási módszereknél nem ismert.

Immunoglobulinok elválasztása

Az itt leirt módszert például egy vagy több következő protein elválasztására alkalmazzuk: immunoglobulint izolálunk humán vérszérum mintából PVP és PEG polimerek vizes keverékének • ·

-20alkaImazásával, a PEG molekulatömege 200 és 35000 közötti érték, a PVP molekulatömege 40000 és az előnyös PEG molekulatömeg 3500. Előnyösen úgy járunk el, hogy a PVP-t vizben oldjuk, majd a kapott vizes oldathoz adagoljuk a PEG-et. A polimerek koncentréciója előnyösen 1-30 g/100 ml, különösen előnyösen 20 g/100 ml, vagy pedig 20% 3500 molekulatömegü PEG esetén. A PVP-t és a PEG-t előnyösen a legkedvezőbb protein elválasztás érdekében azonos koncentrációban alkalmazzuk.

A polimer oldat pH-ját semleges értékre 6,8 és 7,2 közötti értékre állítjuk be sav vagy bázis oldat alkalmazásával a polimerek adagolását megelőzően. A polimer oldat pH-ját előnyösen kb. 2% 6-amino-kapronsavat és 2 mg/ml imidazolt tartalmazó oldattal állítjuk be. A pH beállításához alkalmazhatunk továbbá kb. 1,2 mg/ml koncentrációjú aszkorbinsav oldatot, kb. 1,5 mg/ml hisztidint és kb. 1,5 mg/ml lizint tartalmazó oldatot is.

Kb. 2 térfogat mennyiségű pH-beállitott PVP/PEG polimer keveréket adagolunk 1 térfogat mennyiségű vérszérumhoz a csapadék képzésre. Előnyösen 1 ml polimert adagolunk 0,5 ml szérumhoz. Előnyösen a vérhez adagolt polimer keverék viszkózus. A viszkozitást úgy tudjuk biztosítani, hogy a polimer keveréket a polimer fagyáspontja feletti értéken, de szobahőmérséklet alatti értéken tartjuk. A polimer keveréket és a vérmintát előnyösen zavartalan körülmények között elegendő ideig hagyjuk állni, hogy biztosítsuk a vérben jelenlévő proteinek teljes kicsapását. Különösen előnyösen a polimer keveréket 4°C hőmérsékleten tartjuk és a polimer keverék és a vér elkeverésével a kicsapást kb. 20 percen át 20°C hőmérsékle• · • 4 ·«444 • · «4 • 4 4 «4 ·*·«· ·· « • ··44

-21ten végezzük.

A felülúszóban marad az albumin frakció, mig a csapadék az immunoglobulin frakciót tartalmazza.

A felülúszóból az albumint elegendő mennyiségű cinkvegyület, különösen előnyösen cink-szulfát-heptahidrát adagolásával csapjuk ki.

Immunovizsgálat

Szakember számára nyilvánvaló, hogy a fentiekben leirt biomolekulák elválasztására szolgáló eljárás alkalmazható immunovizsgálatoknál is biológiai mintákban jelenlévő specifuikus antitestek detektálására. Az antigént elkeverjük az antigénre specifikus antitestet tartalmazó biológiai mintával és a kapott keveréket annyi ideig inkubáljuk, hogy az antitest-antigén konjugátumok létrejöjjenek. A kapott antitest-antigén konjugátumok elválasztását a szabad antigéntől a fentiekben leirt immunoglobulin izolációs módszer szerint végezzük.

Biológiai folyadékok

A szakember számára nyilvánvaló, hogy az itt leirt módszerek alkalmasak vérszérumtól eltérő biológiai folyadékokból is a biomolekulák elválasztására, igy például a következő esetekben: vérplazma, vizelet, gerincfolyadék, fermentációs folyadék, lymph folyadék szövettenyészet folyadék és ascites folyadék.

Proteinek elválasztása vizeletből és gerincfolyadékból

Egy másik, előnyös módszernél a proteineket a vizeletből vagy gerincfolyadékból oldható lineáris polimereket tartalmazó oldattal csapjuk ki, amely polimer oldatnak a pH-ját előre meghatározott értékre glicinnel állítjuk be. Különösen

-22• «· ··*««·«· • · · · · ·· · · β ··« ··«·« ·· · · • ·« ·· ··« előnyösen úgy járunk el, hogy a poli(vinil-pirrolidon) és polietlénglikol keverékét cink-glicinát oldattal egyesitjük és az igy kapott oldatot adagoljuk a vizelethez vagy a gerincfolyadékhoz, amikoris a proteineket kicsapjuk.

Biomolekulák izolálására szolgáló kit

A biológiai mintákból történő biomolekula elválasztásra szolgáló kit egy oldható, lineáris polimert vagy polimerek keverékét tartalmazza. A polimer előnyösen poli(vinil-pirrolidon) és polietilénglikol keveréke, amelyet proteinek, különösen előnyösen immunoglobulinok valamely biológiai mintából, igy például humán vérszérumból való elválasztására alkalmazunk. A polimer pH-ját előnyösen olyan értékre állítjuk be előzőleg, amely a kívánt biomolekula optimális elválasztását biztosítja a mintában lévő más komponensektől.

Ha a kívánt biomolekulát a polimerrel képzett csapadékból kívánjuk elválasztani, akkor a kit tartalmazhat még a csapadék újraoldásához szükséges reszuszpenziós oldatot is. Ez a reszuszpenziós oldat egy alkálikus oldat, amely a csapadék stabil reszuszpendálására alkalmas.

A következőkben a találmány szerinti protein elválasztási módszereket ismertetjük részletesen a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa

A pH hatása humán szérumból, PVP-ből és PEG-ből álló keverékkel történő immunoglobulin elválasztásra

Az immunoglobulinok elválasztását humán szérumból, PVP-ből (molekulatömeg, továbbiakban MW=40000) és PEG-ből (MW=3500) álló polimer keverékkel végezzük. Mindkét polimerből, amelyet a

-23• *♦ ··««··«· V * · «· • ♦ · · ·· ·« *·*·* · « 4· · · «··«·

Sigma (St. Louis MO) cégtol szereztünk be, 20%-os oldatot készítünk úgy, hogy 20 g polimert feloldunk vagy lOx foszfát puffer sóoldatban (PBS) vagy lx PBS-ben vagy desztillált vízben.

Mindegyik 20%-os polimer oldat pH-ját ezután kb. 7 értékre beállítjuk 1,1 g/ml glicin-hidrokloridot, 1,21 g/ml ciszteint és 1,46 g/ml lizint tartalmazó vizes aminosav oldattal. Az aminosavakat a Sigma cégtől (St. Louis MO) szereztük be. Az aminosavak végső koncentrációja a polimer oldatban 10 mmól.

ml igy kapott pH-beállitott polimer oldatot ezután 1,25 ml humán szérumhoz adagolunk, a vizes PVP vagy PEG oldatok térfogatát a következő I. táblázatban foglaljuk össze.

I. táblázat

A protrein mintákhoz adagolt PVP és PEG oldatok mennyisége

Minta	20% PVP vízben	20% PEG vízben
1	5 ml	5 ml
2	10 ml	0 ml
3	9 ml	1 ml
4	8 ml	2 ml
5	7 ml	3 ml
6	6 ml	4 ml
7	5 ml	5 ml
8	4 ml	6 ml
9	3 ml	7 ml
10	2 ml	8 ml
11	1 ml	9 ml
12	0 ml	10 ml

A polimerek térfogatát, amelyet vagy lOx PBS-ben vagy lx PBS-ben vagy vízben oldottunk, a következő II. táblázatban foglaljuk össze.

-24Az oldatban oldott polimertek térfogata

II. táblázat

Minta	Polimer lOx PBS-ben	Polimer lx PBS-ben	Polimer vízben
A	10,0 ml	0,0 ml	0,0 ml
B	5,0 ml	5,0 ml	0,0 ml
C	2,5 ml	7,5 ml	0,0 ml
D	1,0 ml	9,0 ml	0,0 ml
E	0,0 ml	5,0 ml	5,0 ml
F	0,0 ml	2,5 ml	7,5 ml
G	0,0 ml	1,0 ml	9,0 ml
H	0,0 ml	0,0 ml	10,0 ml

Mindegyik minta sorozatot 4°C hőmérsékleten 18 órán át inkubáljuk, amikoris csapadék képződik. A felülúszót a csapadékról dekantálással elválasztjuk, a csapadékot foszfát pufferolt sóoldatban ismételten oldjuk, majd mind a csapadékot, mind a felülúszót egy két dimenziós agaróz elektroforetikus gélen 18 órán át futtatjuk. Az elektroforetikus gél jól elválasztja a globulint és az albumint.

Az ujraoldott csapadék mintákból 3 μΐ-es alikvot részt veszünk ki és ezt lyukakba adagoljuk és a gél baloldali részére migráljuk. Ezután a minták felülúszó részéből veszünk ki 3 μΐes alikvot részeket és a lyukakba helyezzük és a gél jobboldali részén migráljuk. A szérum proteineket egy teljes molekula anti-humán szérum antitesten végzett kicsapással detektáljuk (Sigma, St. Louis MO). Az immunoglobulinokat anti-humán teljes IgG antitesttel (Sigma, St. Louis MO) kicsapással detektáljuk. A csapadékokat Coomassie Blue protein vizsgálati reagenssel (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) megfestjük.

A globulin mennyisége a csapadékokban maximális volt a 9-12, G és H mintákban. Ezen mintákban, különösen a 9-10.

-25mintákban szemmel láthatóan nem volt globulin a felülúszóban.

2. példa

Proteinek kicsapása humán vizeletből PVP-ből és PEG-ből álló polimer keverékkel cink-glicináttal

Kísérleteket végeztünk különböző oldatoknak protein-kicsapási képességére vonatkozóan humán vizeletből vagy gerinc folyadékból. A kísérletnél a következő oldatokat alkalmaztuk: poli(vinil-pirrolidon) (PVP 40000 MW) , polietilénglikol (PEG, 3350 MW) és cink-glicinát, továbbá ionmentesitett vizet és cink-glicinátot tartalmazó oldat.

2A kísérlet

28%-os oldatot készítettünk mindegyik polimerből úgy, hogy g polimert (Sigma, St. Louis MO) adagoltunk 100 ml desztillált vízhez. Azonos térfogatot mindegyik polmierből elkeverve kaptuk a PVP/PEG keveréket. A PVP/PEG keverék pH-ja

3,6.

Cink-glicinát oldatot készítettünk 1 mól glicint, 0,4 mól cink-oxiddal elkeverve ionmentesitett vízben.

Egy térfogat fenti cink-glicinát oldatot elkevertünk 9 térfogat PVP/PEG keverékkel. Kontrollként 1 térfogat cink-glicinát oldatot 9 térfogat ionmentesitett vízzel kevertünk el, igy 1:10 arányú hígítást készítettünk.

Mint az a következő III. táblázatban látható, különböző alikvot részeket vettünk a PVP/PEG és cink-glicinát keverékből (PVP/PEG/ZnGly) vagy a kontroll keverékből (dH2O/ZnGly) és ezeket 1 ml mennyiségű humán vizelethez adagoltuk és vizuálisan meghatároztuk a csövekben kapott csapadék mennyiségét.

III. táblázat

A PVP/PEG/ZnGly (pH=3,6) vagy dH₂O/ZnGly térfogatának hatása a vizeletből való protein kicsapásra

Adagolt	térfogat	Képződött csapadék
PVP/PEG/ZnGly	dH2O/ZnGly
100	μΐ	2,0 X	1,0	X
200	μΐ	4,0 X	1,0	X
300	μΐ	4,5 X	1,5	X
400	μΐ	5,0 X	2,5	X
500	μΐ	5,5 X	2,5	X
600	μΐ	6,0 X	2,5	X
700	μΐ	6,0 X	2,5	X
800	μΐ	6,0 X	2,5	X
900	μΐ	6,0 X	2,5	X
1000	μΐ	6,0 X	2,5	X

A kapott eredmények azt mutatják, hogy a protein csapadék mennyisége a vizeletben nagyobb a PVP/PEG/cink-glicinát oldatban, mint az azonos térfogatban adagolt dH20/cink-glicinát oldat esetén.

2B kísérlet

Az előző 2A kísérletnél leírtak szerint PVP/PEG/cink-glicinát és dH20/cink-glicinát oldatokat készítünk, mindegyik oldat pH-ját semleges értékre beállítjuk a glicin-hidroklorid oldattal (500 mg glicin.HCl 10 ml ionmentesitett vízben). 1,2 ml alikvotot adagolunk a glicin-hidrokloridból a PVP/PEG/cink-glicinát oldathoz, igy a pH értéke 6,2-re növekszik. 2,2 ml alikvot glicin-hidroklorid oldatot adagolunk a d^O/cink-glicinát oldathoz, igy a pH értéke 6,4 értékre nő.

Mint az a következő IV. táblázatból látható, különböző alikvot mennyiségű PVP/PEG/cink-glicinát keveréket (PVP/PEG/ZnGly) vagy kontroll keveréket (dH₂O/ZnGly) adagoltunk 1 ml humán vizelethez és a kapott csapadékok mennyiségét

-27vizuálisan értékeltük.

IV. táblázat

PVP/PEG/ZnGly (pH 6,2) vagy dH₂O/ZnGly (pH=6,4) térfogatának hatása a protein kicsapásra vizeletben

Képződött csapadék

Adagolt térfogat dH₂O/ZnGly

PVP/PEG/ZnGly

200	μΐ	3,0	X	ι,ο
400	μΐ	5,0	X	2,0
600	μΐ	6,0	X	4,0
800	μΐ	8,0	X	8,0
1000	μΐ	8,0	X	8,0

A kapott eredményekből látható, hogy a vizeletből kicsapott protein mennyisége PVP/PEG/cink-glicinát oldat esetén nagyobb, mint azonmos térfogatban adagolt d^O/cink-glicinát oldat esetén, ha az adagolt térfogat kevesebb, mint 800 μΐ. Továbbá, a pH 6,2 értékre való beállítása növeli a kiváló csapadékot PVP/PEG/cink-glicinát adagolása esetén, ha az adagolt térfogat nagyobb.

2C kísérlet

PVP/PEG/cink-glicinát összetételű és d^O/cink-glicinát összetételű oldatokat készítünk és a pH értékét az előző 2B kisérltenél leírtak szerint beállítjuk.

Mint az a következő táblázatból látható, különböző mennyiségű PVP/PEG/cink-glicinát keveréket (PVP/PEG/ZnGly) vagy 500 μΐ kontroll keveréket (d^O/ZnGly) adagolunk 1 ml humán cerebrális gerincfolyadékhoz, a kapott keveréket 20°-on 30 percen át inkubáljuk, majd az egyes csövekben a csapadék mennyiségét vizuálisan értékeljük.

V. táblázat

A PVP/PEG/ZnGly térfogatának hatása a protein kicsapódásra gerincfolyadékban

Adagolt térfogat

Képződött csapadék

100 μΐ

200 μΐ

300 μΐ

400 μΐ

500 μΐ

0,3 X

1,0 X

2,0 X

3,0 X

5,0 X

0,0 X kontroll

A kapott eredmények azt mutatják, hogy növekvő mennyiségű protein csapódik ki a gerincfolyadékból, növekvő mennyiségű PVP/PEG/cink-glicin'át oldat hatására. Ezzel szemben a dH20/Cink-glicinát oldat esetén látható protein csapadék nem képződik.

3. példa

Gamma globulinok kicsapása egér ascites folyadékból 4°C hőmérsékleten

A következő kísérletet végeztük annak meghatározására, hogy a hőmérséklet hogyan befolyásolja a gamma globulinok kicsapódását egér ascites folyadékból, a kicsapáshoz poli(vinil-pirrolidon) (PVP 40000 MW) , polietilénglikol (PEG 3350 MW) tartalmú oldatot alkalmazva.

28%-os oldatot készítünk mindegyik polimerből úgy, hogy 28 g polimert (Sigma, St. Louis MO) adagolunk 100 ml 0,1 mólos nátrium-acetáthoz. Mindegyik polimer oldatból azonos térfogatot egyesitünk a PVP/PEG keverék előállításához. Az igy kapott PVP/PEG keverék pH-ját jégecettel 5,8 értékre állítjuk be.

0,5 ml egér ascites folyadékot 2 ml PVP/PEG keverékkel keverünk el a következő reakciókörülmények között:

- 1. reakció: a kicsapási reakciót 20°-on végezzük, majd a kicsapás után a keveréket azonnal centrifugáljuk.

- 2. reakció: a kicsapási reakciót 4°-on végezzük, majd a kicsapás után a keveréket azonnal centrifugáljuk.

- 3. reakció: a kicsapási reakciót 20°-on végezzük, majd a kicsapás után a keveréket hagyjuk 30 percen át 20°-on állni, majd ezután centrifugáljuk.

- 4. reakció: a kicsapási reakciót 4°-on végezzük, majd a kicsapás után a keveréket hagyjuk 30 percen át 4°-on állni, majd ezután centrifugáljuk.

A centrifugálást 20°C hőmérsékleten 30 percen át 4500 fordulat/perc értéknél végeztük. A felülúszót dekantálással elválasztjuk, a csapadékot reszuszpenziós puffer oldatban reszuszpendáljuk. A kapott eredményeket a következő 6. táblázatban foglaljuk össze.

VI. táblázat

A hőmérsékleten hatása a protein kicsapódásra ascites folyadékból

Reakció szám	Csapadék	Felülúszó tisztasága
szín	térfogat
1	szürkés-fehér	1,0 X	zavaros
2	barna	1,5 X	tiszta
3	szürkés-fehér	1,0 X	tiszta
4	barna	2,0 X	tiszta

Mindegyik reakcióból származó újraoldott csapadékból 3 μ,Ι alikvot részt kiveszünk, lyukakba töltjük és agarőz elektroforetikus gélen migráljuk. A felülúszókból is kiveszünk 3 μ,Ι alikvot részt és ezt lyukakba helyezve egy második agaróz

-30elektroforetikus gélen migráljuk. A gammaglobulint kicsapással mutatju ki, amelyhez anti-egér teljes IgG antitestet (Sigma St. Louis MO) alkalmazunk. A csapadékokat Coomassie Blue (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) protrein vizsgáló reagenssel megfestjük.

Az elektroforetikus gélek vizsgálata azt mutatja, hogy a

2. és 4. reakciók esetén a csapadék több gammaglobulint tartalmaz, mint az 1. és 2. reakciók esetén. A 2. és 4. reakciók esetén a felülúszó kevesebb gammaglobulin tartalmaz, mint az

1. és 3. reakciók esetén. A 4. reakció esetén mértük a legnagyobb gammaglobulint a csapadékban és a legkevesebbet a felülúszóban. Az egyéb proteinek mennyisége a felülúszókban mind a négy reakció esetén sokkal nagyobb volt, mint azok mennyisége a csapadékban.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy nagyobb viszkozitású polimer keveréknek nagyobb képességgé van a csapadékban a gammaglobulion elválasztására. A PVP/PEG polimer keverék viszkozitása 4°C hőmérsékleten nagyobb mint 20°C hőmérsékleten.

4. példa

Proteinek kicsapása vérből a PVP/PEG oldat pH-jának imidazollal és 6-amino-kapronsawal való beállítása után A következő kiséreleteket végeztük az imidazolt és 6-amino-kapronsavat tartalmazó PVP/PEG oldat pH stabilitásának meghatározására.

4Ά kísérlet

A 3. példában leírtak szerint 14%-os PVP és PEG oldatokat készítünk, a pH értékét 6-amino-kapronsavval és imidazollal

7,2-re beállítjuk. A végső oldat (50 ml PVP/PEG) 2,5% 6-amino<

♦ ♦

-31-kapronsavat és 100 mg imidazolt tartalmaz.

0,5 ml kecske szérumot lehütünk 2°C-ra és 2, 3, 4 és 5 ml PVP/PEG polimer oldattal reagáltatjuk, pH=7,2, rövid forgatás közben, majd hagyjuk a keveréket 2°C hőmérsékleten 20 percen át állni. A keverékeket ezután 20°-on 30 percen át 4500 fordulat/perc-nél centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadék mennyiségét vizuálisan értékeljük és a csapadékot 2 ml reszuszpenziós pufferben reszuszpendáljuk. A kapott eredmények a következők: ha a PVP/PEG polimer oldat szérumhoz adagolt térfogatát növeljük, a csapadék mennyisége is nő. Továbbá, a PVP/PEG polimer oldat pH-ja a reakció idő alatt konstans marad.

4B kísérlet

14-14% PVP és PEG tartalmú polimer oldat pH-ját a fentiekben leírtak szerint beállítjuk.

ml kecske szérumot lehütünk 4°-ra, majd 20 és 40 ml PVP/PEG polimer oldattal, pH=7,2, reagáltatjuk rövid forgatással, majd hagyjuk a keveréket 4°-on 20 percen át állni. A keverékeket ezután 20°-on 30 percen át 4500 fordulat/perc értéknél centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk és a csapadékokat vizuálisan értékeljük. A felülúszó tisztának tűnik. A 40 ml PVP/PEG polimer oldattal végzett kicsapásnál a keverék valamivel több csapadékot tartalmaz, mint a 20 ml PVP/PEG oldat esetén.

Mindkét csapadékot 1 ml 4°C-ra hütött nátrium-hidrogén-karbonát oldattal reszuszpendáljuk.

Egy második kicsapást végzünk úgy, hogy a reszuszpendált csapadékhoz 2 ml 2°C hőmérsékletre lehűtött PVP/PEG polimer oldatot adagolunk, amelynek a pH-ját 6-amino-kapronsavval 6,2

-32-re beállítottuk. A keveréket rövid ideig forgatjuk, majd 2°C hőmérsékleten 30 percen át állni hagyjuk. A centrifugálást és a dekantálást a fentiek szerint végezzük. Mindkét felülúszó tisztának tűnik. Mindkét csapadék esetében egyharmadnyival kevesebb az ismételt csapadék mennyisége és a színe világosabb, mint az elsőé.

5. példa

Tween-20™ hatása a proteinek kicsapására ascites folyadékban

A következő kísérletet végeztük el annak demonstrálására, hogy a PVP/PEG olda't adagolását megelőzően adagolt poli(etilén-oxi)-szorbitán-Tween-20™ milyen hatással van az ascites folyadékokban történő kicsapásra.

21% poimert tartalmazó PVP/PEG polimer oldatot készítünk a

3. példában leírtak szerint, az oldat pH-ját imidazollal pH=7re beállítjuk.

4,7% Tween-2 0™ (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) oldatot készítünk ionmentesitett vízzel úgy, hogy 0,5 ml Tween-20™-et feloldunk ionmentesitett vízben, majd az igy kapott 4,7%-os oldatot tovább hígítjuk ionmentesitett vízzel 0,94, 1,88, 2,82 és 3,76% koncentrációkra.

A fenti Tween-20™ oldatokból 1-1 ml-t elkeverünk 1 ml egér ascites folyadékkal. Kontrollként 1 ml ionmentesitett vizet adagolunk 1 ml ascites folyadékhoz. Mindegyik mintát jól elkeverjük és 15 percen át 20°C hőmérsékleten állni hagyjuk.

A fentiek szerint nyert mintákhoz forgatás közben 2-2 ml PVP/PEG polimer oldatot adagolunk, és a mintákat 15 percen át 20°C hőmérsékleten keverjük. A keverékeket ezután 20°-on 30

-33percen át 4500 fordulat/perc értéken centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadékot 1 ml nátrium-hidrogén

-karbonát pufferban reszuszpendáljuk.

ml PVP/PEG polimer oldatot adagolunk a reszuszpendált csapadékhoz forgatás közben. A mintákat ezután 15 percig 20°-on keverjük, majd centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadékot a fentiek szerint reszuszpendáljuk.

Mindegyik mintát agaróz gélen átengedjük, és elektroforé zist végzünk. Ezután mindegyik mintában mind a négy frakcióban meghatározzuk a gammaglobulin százalékos mennyiségét. A kapott eredményeket a következő VII. táblázatban foglaljuk össze.

VII. táblázat

Detergens koncentráció hatása a protein kicsapódásra ascites folyadékok esetén

Reakció Tween-2 0™ Gammaglobulin

száma	%-os menny.	%-OS	mennyiség a	frakciókban
1	0	1 6,7	2 63,0	3 19,5	4 10,8
2	0,94	3,6	70,1	17,9	8,4
3	1,88	2,7	74,8	15,7	6,8
4	2,82	1,6	78,7	13,7	6,0
5	3,76	2,1	78,0	13,9	6,0

A kapott eredmények azt mutatják, hogy ha a Tween-20™ százalékos mennyiségét növeljük, nő a gammaglobulin mennyisége a csapadékban. A 3., 4., és 5. kísérletnél albumint nem mutattunk ki, ezek 1,88, 2,82, illetve 3,76% Tween-20™-et tartalmaztak. Ily módon, ha a Tween-20™-et a mintához a PVP/PEG oldattal végzett kicsapást megelőzően adagoljuk, a protein komplexek a mintában diszpergálódnak, és igy lehetővé teszik tisztább gammaglobulin frakció kicsapását a polimer

-34oldattal.

6. példa

Brij 35™-el és Triton X-102™-el végzett előinkubálás hatása a proteinek kicsapódására humán plazma esetén

A következő kísérletet annak érdekében végeztük, hogy demonstráljuk a Brij 35™ és Triton X-102™ poli (etilén-oxi)-éterek (mindkettő kereskedelmi forgalomban beszerezhető biológiai detergens) hatását humán plazma esetén, ha a két különböző PVP/PEG oldatokkal végzett kicsapást megelőzően adagoljuk őket.

A PVP/PEG polimer oldatot (20% mindegyik polimerrel nézve) a 3. példában leírtak szerint állítjuk elő. A polimer oldat pH-ját ezután 6-amino-kapronsavval és imidazollal pH=5,8-ra beállítjuk, majd egy második PVP/PEG polimer oldatot is készítünk, amely mindegyik polimerből 6,6%-ot és 33% etanolt tartalmaz. Az etanolt rutinszerűen adagoljuk a vérmintához a szennyező vírusok inaktiválása céljából.

Ionmentesitett viz felhasználásával 1%-os Triton X-102™ oldatot és 15%-os Brij 35™ oldatot (mindkét anyag a Sigma Chemical Company, St. Louis MO gyármtánya) készítünk, majd a Brij 35™ oldatot tovább hígítjuk az 1%-os Triton X-102™ oldattal és igy 15%, 7,5%, 3,75%, 1,9%, 0,9% és 0,5%-os Brij 3 5™ oldatot nyerünk.

A fenti Triton X-102™/Brij 35™ oldatok 1-1 ml-éhez 1 ml humán plazmát adagolunk, jól elkeverjük és 35 percen át 20°C hőmérsékleten állni hagyjuk.

Ezután 2 ml 20%-os PVP/PEG polimer oldatot adagolunk mindegyik mintához forgatás közben. A mintákat ezután további

-35• · · ♦ · • · ·« « ··* ····· ·· · · percen át 20°C hőmérsékleten keverjük, majd 20°-on 30 percen át 3600 fordulat/percnél centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadékokat 1 ml ionmentesitett vízben reszuszpendáljuk, majd 200 ml alikvot részt veszünk ki analízis céljából a reszuszpendált csapadékból.

A visszamaradó 800 μΐ mintából 400 μΐ alikvot részt tiszta centrifugacsőbe helyezünk, ezeket a mintákat I csoportként említjük. A visszamaradó 400 μΐ mennyiségű mintát II csoportként nevezzük el. Ezután az I csoport mintáihoz 1,2 ml mennyiségű, 6,6%-os PVP/PEG oldatot (etanoltartalmu) és a II csoport mintáihoz 0', 4 ml 20%-os PVP/PEG oldatot adagolunk. Mindkét csoport csöveit ezután 30 percen át 20°C hőmérsékleten keverjük, majd a fentiek szerint centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadékokat 0,4 ml nátrium-hidrogén-karbonát pufferban reszuszpendáljuk.

Mindegyik mintát proteinra vizsgáljuk cellulóz-acetát elektroforézissel. A csoportoban, ha a Brij 35™ százalékos mennyisége csökkent, csökkent az albumin a béta- és alfaglobulinok mennyisége. Ugyanakkor, a gammaglobulin mennyisége a reszuszpendált csapadékban nő.

Mindegyik mintát vizsgáltuk továbbá fibrinogén jelenlétére is, ennél a vizsgálatnál 25 μΐ visszaállított trombint adagoltunk 200 μΐ mennyiségű reszuszpendált I és II csoporthoz tartozó csapadékokhoz. A kapott eredményeket a következő VIII. táblázatban foglaljuk Össze.

VIII. táblázat

A Brij 35™ koncentrációjának hatása humán plazmából kicsapott gammaglobulin fibrinogén szennyeződésére

Reakció száma I csoport	Brij 35™ százalék	Fibrinogén koncentráció
Kontroll	0	+++++
1	15,0 %	+++++
2	7,5 %	+++
3	3,75 %	++
4	1,9 %	+ (nyomokban)
5	0,9 %	-
6	0,5 %	-

II csoport

A kapott eredmények azt mutatják, hogy ha a PVP/PEG polimer oldatot etanollal együtt alkalmazzuk a vírusok inaktiválására, a Brij 35™ mennyisége nem lehet több, mint 1% hogy megakadályozzuk a gammaglobulin csapadék fibrinogénnel való szennyződését.

7. példa

Nátrium-dodecil-szulfát hatása a proteinek kicsapására ascites folyadékok esetén

A következő kísérletet annak érdekében végeztük, hogy vizsgáljuk a nátrium-dodecil-szulfát (SDS) detergens hatását a gammaglobulinok PVP/PEG oldattal végzett kicsapására ascites folyadékok esetén.

PVP/PEG polimer oldatot készítünk (mindegyik polimer mennyisége 21%) a 3. példában leírtak szerint, majd a pH értékét imidazollal 6,5-re állítjuk. A PVP/PEG oldatot tartalmazó csövekhez SDS-t adagolunk különböző koncentrációkban, ezek a koncentrációk 1-0% közötti értékűek voltak.

-370,5 ml 2%-os Triton X-100™ (Sigma Chemical Company, ST. Louis MO) oldatot adagolunk 0,5 ml egér ascites folyadékhoz, jól elkeverjük, majd 30 percen át 20°C hőmérsékleten állni hagyjuk.

Ezután mindegyik mitához forgatás közben 1 ml PVP/PEG/SDS oldatot adagolunk, a keveréket 30 percen át 20°-on keverjük, majd 3600 fordulatnál 20°-on 30 percig centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadékot 0,5 ml ionmentesitett vízben reszuszpendáljuk.

Ezután 0,5 ml PVP/PEG oldatot adagolunk SDS nélkül mindegyik reszuszpéndált csapadékhoz forgatás közben, majd 30 percen át 20°-on keverjük, centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, és a csapadékot 0,5 ml nátrium-hidrogén-karbonát pufferban reszuszpendáljuk.

A reszuszpendált csapadékokat ezután elektroforézissel vizsgáljuk. Az eredmények azt mutatják, ha az SDS mennyiségét a PVP/PEG polimer oldatban növeljük, csökken az ossz protein mennyisége a végső csapadékban, de a gammaglobulin mennyisége konstans marad, jelezve, hogy az SDS jelenléte növeli a kicsapott gammaglobulin tisztaságát, mivel kevesebb volt az alfa- és bétaglobulin szennyeződés.

8. példa

Összehasonlító vizsgálat PEG és PVP/PEG polimer keverékekkel ascites folyadékból monoklón antitestek kicsapására

A kiséreletet annak érdekében végeztük, hogy összehasonlítsuk az egér ascites folyadékból PEG polimer oldattal vagy PVP/PEG polimer keverékkel kicsapott monoklón antitestek • _#··_t *··; ;··· * · ·· · ··· • ··* · · · » * • · · ·· *«*

-38mennyiségét és tisztaságát.

A PVP/PEG polimer oldatot (20% mindegyik polimerre vonatkozóan) a 3. példában leírtak szerint állítjuk elő. A 20%-os PEG (MW=8000) polimer oldatot hasonlóképpen állítottuk elő. A polimer oldatok pH-ját imidazollal pH=6,6 értékre állítottuk be.

ml ascites folyadékot előinkubálunk 1 ml ionmentesitett vízzel (1. rekació) , 1 ml 2%-os Triton X-102™-vel (2. reakció) vagy 1 ml 1,8% Triton X-102™/3% Brij 35™-el (3. reakció) mind a három reakciónál a komponenseket jól elkeverjük és hagyjuk 20°C hőmérsékleten '15 percen át állni.

Ezután mindegyik előinkubált keverékhez vagy 2 ml PVP/PEG oldatot (I csoport) vagy PEG oldatot (II csoport) adagolunk. Mindegyik mintát 30 percen át 20°C hőmérsékleten keverjük, majd 4000 fordulat/perc mellett 30 percen át 20°C hőmérsékleten centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, a csapadékot 1 ml ionmentesitett vízben reszuszpendáljuk.

A I csoport 2. és 3. reakció szerinti mintáihoz 1 ml

PVP/PEG oldatot adagoljunk forgatás közben (az 1. reakció szerinti mintát nem centrifugáljuk). A II csoport 1-3. reakció szerinti mintáihoz 1 ml oldatot adagolunk forgatás közben. Mindegyik csoport mintáit ezután 30 percen át 30°C hőmérsékleten keverjük, a fentiek szerint cetrifugáljuk, a felülúszókat dekantáljuk és a csapadékokat 1 ml nátrium-hidrogén-karbonátban reszuszpendáljuk.

A követekző észrevételeket tétjük. A II csoportba tartozó minták (PEG-el való kicsapás) esetén az első csapadék mennyisége nagyobb a I csoport megfelelő reakció mintáihoz * · » · · * · 4 · 4 ····· ·· · · • ·· ·· ···

-39viszonyitva (PVP/PEG eleggyel végezve a kicsapást). A II csoport mintáinál (PEG) a felülúszó zavaros, jelezve, hogy nem minden protein volt képes a centrifugálásnál a cső aljára ülepedni. Az I csoport 2. és 3. reakcióinál (PVP/PEG) a felülúszó tiszta, mig ugyanez a minta II csoportnál igen zavaros.

A mintákat agaróz gél protein elektroforézissel analizáltuk. A kapott eredmények szerint a II csoportba tartozó mintáknál (PEG) több az albumin, a bétaglobulin és más szennyező protein az első csapadékokban, mint az I csoportnál (PVP/PEG) kapott első csapadékok esetén.

9. példa

A pH hatása a PVP/PEG polimer oldattal szérumokból kicsapott gammaglobulin oldhatóságára

A következő kísérletet annak érdekében végeztük, hogy megállapítsuk hogy a reszuszpenziós oldat pH-ja milyen hatással van a szérumokból PVP/PEG polimer oldatokkal kicsapott gammaglobulin oldhatóságára és stabilitására.

9A kísérlet ml kecske szérumot vagy nyúl szérumot (Sigma Chemical Company, St. Louis MO) elkeverünk 1 ml 2%-os Triton X-102™vel (Sigma), majd állni hagyjuk 15 percen át 20°C hőmérsékleten .

PVP/PEG polimer oldatot készítünk (20% mindegyik polimerre nézve) a 3. példában leírtak szerint, majd a pH értéket mindegyik polimer oldat esetében 6,6 értékre beállítjuk.

Mindegyik előinkubált mintához forgatás közben 2 ml • «

-40PVP/PEG oldatot adagolunk, 30 percen át 20°C-on keverjük, majd centrifugáljuk 3600 fordulat/percnél 30 percen át 20°-on.

Ezután a felülúszót dekantálással elválasztjuk, a csapadékot 1 ml oldatban reszuszpendáljuk, amely 5 ml 0,5 mólos imidazolból és 5 ml glicerinből áll ionmentesitett vízben, pH=9,4 (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI). A reszuszpendált csapadékot 10 percen át 20°C hőmérsékleten állni hagyjuk.

Mindegyik csőbe 1 ml PVP/PEG polimer oldatot adagolunk forgatás közben, majd a csöveket keverjük, centrifugáljuk és a felülúszót dekantálással elválasztjuk. A csapadékokat 1 ml ionmentesitett vízben reszuszpendáljuk és a 2. kicsapási lépést megismételjük. A kapott csapadékokat 250 μΐ, 500 μΐ, 750 μΐ vagy 1000 μΐ 50/50 arányú glicerin és 0,06 mólos nátriumhidrogén-karbonát oldatban (pH=8,2) reszuszpendaljuk.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy ha a kecske vagy nyúl gammaglobulin csapadékokat alkálikus oldatban reszuszpendáljuk, a csapadékok könnyen oldódnak és tisztábbak, mintha a reszuszpendálást semleges vagy savas oldatban végezzük.

9B kísérlet

0,5 ml humán plazmát tartalmazó 10 db. vizsgáló csövet 15 percen át 2% TRiton X-102^^M-vel inkubálunk ionmentesitett vízben. Az inkubálást követően 1 ml PVP/PEG polimer oldatot (mindegyik 20%) adagolunk az előinkubált mintákhoz forgatás közben, majd 30 percen.át 20°C hőmérsékleten keverjük, 2500 fordulat/percnél 30 percen át 20°-on centrifugáljuk, a felülúszót dekantálással elválasztjuk és a protein csapadékot 0,5 ml 0,5 mólos imidazol oldatban reszuszpendáljuk a • ·· ♦·«·»··· • · · · · * · ·· · ··· • · · · · · · · · • *· · · «··

-41következő pH értékeknél (a pH értéket jégecettel állítjuk be):

IX. táblázat

Imidazol reszuszpenziós oldat pH-ja

Reakció száma pH

110,4

29,2

38,5

48,0

57,0

66,4

75,8

85,0

94,4

A pH gradiens nyilvánvaló összefüggést mutat a pH érték és a reszuszpendált gammaglobulin tisztasága között. A pH értékének csökkenésével növekszik a minta zavarossága. Az 1. minta pH=10,4-nél tiszta volt. A minta tiszta maradt, a pH csökkenését a zavarosság növekedése kiséri, egészen az 5. mintáig pH=7 értékig. pH=6,4-nél a minta opakká válik. A 8. és

9. mintában a gammaglobulin az oldatból kicsapódik.

9C kísérlet ml humán plazmát tartalmazó 10 vizsgálati csövet 15 percen át inkubálunk ionmentesitett vízzel készült 2%-os Triton X-102™ oldattal. Az inkubálást követően mindegyik mintához 2 ml PVP/PEG polimer oldatot (mindegyik 20%) adagolunk forgatás közben, majd 30 percen át keverjük 20°C hőmérsékleten, majd 3600 fordulat/percnél centrifugáljuk 30 percen át 20°-on, majd a felülúszót dekantáljuk, a protein csapadékot 1 ml Trizma™ bázis oldatban reszuszpendáljuk a következőképpen.

0,1 mólos Trizma™ oldatot (Sigma Chemical Company, St.

• ·« ···♦«··« • · · · · ♦ · ·· · ··· *···· · · · · • ·« ·· ···

-42Louis MO) állítunk elő. A pH gradienst a Tris™ oldat koncentrált jégecettl való elkeveréséből állítjuk elő. A következő pH értékeknél vizsgáltuk az oldatok azon képességét, hogy a gammaglobulint tartalmazó protein csapadékokat hogyan képesek reszuszpendálni.

X. táblázat

A Tris™ reszuszpenziós oldat pH-ja

Reakció száma pH

110.4

29,4

38,5 ’8,0

57,4

67,0

76,5

85,9 ·4,2

Mint az az előző imidazolos kísérletnél (9B kísérlet) látható volt, a pH gradiens nyilvánvaló összefüggést mutat a pH értéke és a protein szuszpenzió tisztasága között. A tisztaság nagyobb volt alkalikus pH értékekénél és minden pH csökkenés hatására romlott. Az imidazol oldatokban reszuszpendált minták (9B kísérlet) általában tisztábbak voltak, mint a Tris™ oldatokban reszuszpendált minták. A pH=10,4-nél reszuszpendált csapadék igen tiszta volt, de a tisztaság zavarossá változott pH=8 értéknél. A pH=7 mintánál már csapadékképződés volt megfigyelhető. A 8. és 9. minták protein csapadékait nem lehetett reszuszpendálni. 1 éjszkán 4°C hőmérsékleten való tárolás után minden mintában csapadékképződés volt megfigyelhető, amelyeknél a reszuszpendálást pH=7,4-nél alacsonyabb pH-ju oldattal « « ♦ · ·· · ··· ····· ·· · · • ·· ·· ···

-43végeztük.

A kapott eredmények jelzik, hogy a protein reszuszpenziós oldatnak alkálikusnak kell lenni, hogy a polimer oldattal kicsapott proteinek reszuszpendálása stabil és komplett legyen.

A jelen találmány szerinti biomolekula izolálási eljárásnál bármilyen módosítás vagy változtatás, amely szakember számára nyilvánvaló, szintén a találmány oltalmi körébe tartozik.

Claims (18)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás biológiai mintákból egy vagy több biomolekula elválasztására, azzal jellemezve, hogy

   a) a biológiai oldatmintához elegendő mennyiségű oldható lineáris polimert adagolunk, hogy csapadékot képezzünk, mimellett az oldat pH-ját egy előre meghatározott értékre állítjuk be, és

   b) a kapott oldatot két frakcióra, egy felülúszóra és egy csapadékra választjuk szét, a biomolekula vagy a felülúszóban vagy a csapadékban 'található.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH értéket kis molekulatömegü, amino- vagy karboxilcsoportot tartalmazó anyaggal állítjuk be.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kicsapáshoz valamely következő polimert alkalmazzuk: polietilénglikol, dextrán, nonilfenol-etoxilátok, poli(vinil-alkohol) , poli(vinil-pirrolidon) vagy ezek keveréke.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kis molekulatömegü vegyületként imidazolt, amino-kapronsavat, egy aminosavat vagy ezek keverékét alkalmazzuk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polimerként poli(vinil-pirrolidon) és polietilénglikol keverékét alkalmazzuk és a polimer keveréket a mintához adagoljuk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kb. 40000 molekulatömegü poli(vinil-pirrolidont) és kb. 3500 molekulatömegü poli(etilén-glikolt) alkalmazunk.

   • · « * · • · ·4> · «·· *···· ·· « · * ·· ·· ·«·
7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy valamely következő biomolekulát választjuk el: protein, szénhidrát, nem-protein hormon vagy nukleinsav.
8. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy proteinként immunoglobulint választunk el.
9. 9. Vizsgálati eljárás plazmában az albumin/globulin arány meghatározására, azzal jellemezve, hogy

   a) a plazmához elegendő mennyiségű poli(vinil-pirrolidont) és polietilénglikolt tartalmazó polimer oldatot adagolunk a globulin kicsapására, az albumint a felülúszóban tartjuk, és a plazma pH értékét közel semleges pH-ra állítjuk be,

   b) a csapadékot a felülúszótól elválasztjuk,

   c) meghatározzuk a globulin és albumin koncentrációját, és

   d) kiszámítjuk az albumin/globulin arányt.
10. 10. Készítmény biológiai mintákból proteinek elválasztásához, azzal jellemezve, hogy poli(vinil-pirrolidon) és polietilénglikol keverékét tartalmazza.
11. 11. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy kb. 40000 molekulatömegü poli(vinil-pirrolidont) és kb. 3500 molekulatömegü poli(etilén-glikolt) tartalmaz.
12. 12. A 10. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy még cink-glicinátot is tartalmaz.
13. 13. Eljárás szérum proteinekben a hatóanyag diszpozíció meghatározására, azzal jellemezve, hogy

    a) a szérumhoz a globulin kicsapása érdekében elegendő mennyiségű vizes poli(vinil-pirrolidon) és polietilénglikol oldatot adagolunk és a szérum pH értékét előre meghatározott értékre állítjuk be, • 4 ·»♦

    b) az oldatot két frakcióra választjuk szét, egy felülúszó és egy csapadék frakcióra, amikoris a globulinhoz kötött hatóanyag az egyik frakcióban és az albuminhoz kötött hatóanyag a másik frakcióban van, és

    c) analizáljuk a csapadékot és a felülúszót a hatóanyag kimutatására.
14. 14. Eljárás biológiai mintákban oldható, lineáris polimerekkel kicsapott proteinek oldására, stabil oldat előállítására, azzal jellemezve, hogy a kicsapott proteint vizes, alkálikus oldatban oldjuk.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vizes alkálikus oldatként glicerint, nátrium-hidrogén-karbonátot, imidazolt, egy alkálikus sót, trisz(hidroxi-metil)-amino-metánt vagy ezek keverékét tartalmazó oldatot alkalamzunk.
16. 16. Kit, biológiai mintákból egy vagy több biomolekula elválasztására, azzal jellemezve, hogy a következőket tartalmazza:

    a) egy oldható, lineáris polimer, amelynek pH értéke előre meghatározott pH értékre van beállítva, a biológiai mintából a biomolekula kicsapására, és

    b) a csapadék stabil reszuszpenzálására alkalmas oldat.
17. 17. A 16. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy polimerként valamely következő polimert tartalmazza:

    poli(etilén-glikol), dextrán, nonilfenol-etoxilát, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon) vagy ezek keveréke.

    -47» * ···
18. 18. A 16. igénypont szerinti kit, azzal jellemezve, hogy az oldat alkálikus oldat.