HUT67838A - Controlling of male fertility using external, inducible promoter sequences - Google Patents

Description

A találmány tárgya mikrosporogenezis gének és indukálható promoterek alkalmazása hibrid magvak előállításában, nevezetesen, az ilyen magvak hím-sterilitásának — a flavonol termelést befolyásoló nukleinsav-szekvenciák kontrollálásával történő — szabályozása.

A növénynemesítés célja, hogy a szülői vonalak különféle kívánatos tulajdonságait egy változatban vagy hibridben lehessen egyesíteni. A szántóföldi terménynövények esetében ezen tulajdonságok közé tartozhat a betegségek és rovarok elleni rezisztencia, a hő- és szárazságtűrés, a csökkent termés érési idő, a nagyobb hozam és a jobb mezőgazdasági minőség. Sok terménynövény esetében a gépesített betakarítás miatt fontos a növények jellemzőinek — mint a csírázás, a növekedés mértéke, az érés és a termés (gyümölcs) mérete — egyformasága.

A szántóföldi terménynövényeket a növény beporzási módjának figyelembevételével szaporítják. Egy növény önbeporzó, ha az egyik virágból származó pollen ugyanazt, vagy ugyanazon a növényen lévő másik virágot porozza be. A növény idegen beporzású, ha a növény virágját beporzó pollen egy másik növény virágjáról származik.

A növények, melyeket önbeporzással termékenyítettek meg, s több generáción keresztül bizonyos tulajdonságra szelektáltak, majdnem minden génlókuszon homozigóták lesznek, s fajtaazonos utódok egységes populációját hozzák • · ·

- 3 létre. Két homozigóta vonal közötti keresztezés hibrid növények egységes populációját eredményezi, mely növények sok génlókuszra nézve homozigóták lehetnek. Két, számos génlókuszon homozigóta növény keresztezése genetikailag egymástól eltérő növények populációját eredményezi.

A kukoricanövények (Zea mays L.) önbeporzásos és idegen beporzásos eljárásokkal egyaránt szaporíthatok. A kukorica hímivarú virágai a címerben, nőivarú virágai pedig — ugyanazon a növényen — a kukoricáésövön helyezkednek el. A természetes beporzás úgy történik, hogy a polleneket a szél a címerből a csövek végéből kilógó kukoricahajra (bibére) fújja.

Kukoricahibridek kifejlesztéséhez homozigóta beltenyésztett vonalak kialakítására, ezen vonalak keresztezésére, és a keresztezések kiértékelésére van szükség. A populációkból beltenyésztett vonalak kitenyésztésének módszerei közül kettő a törzs- (pedigré) tenyésztés és az időszakonként ismétlődő szelekció. A nemesítési programok két vagy több beltenyésztett vonalból vagy különféle, széleskörű forrásokból származó kívánatos tulajdonságokat egyesítenek nemesítési gyűjteményekbe, melyekből önbeporzással és a kívánt fenotípusok szelektálásával új beltenyésztett vonalak alakíthatók ki. Az új beltenyésztett vonalakat egyéb beltenyésztett vonalakkal keresztezik, s az ezekből származó hibrideket értékelik ki annak meghatározása érdekében, hogy melyik rendelkezik kereskedelmi tulajdonságokkal.

• ·

- 4 A törzstenyésztés két genotípus keresztezésével kezdődik, mely genotípusok mindegyike egy vagy több, a másikból hiányzó — vagy a másikat kiegészítő — kívánatos tulajdonsággal rendelkezik. Ha a két eredeti szülő nem biztosítja valamennyi kívánt tulajdonságot, a tenyésztési populációba egyéb források is bevonhatók. A pedigré módszerben a kitűnő tulajdonságokkal rendelkező növényeket szaporítják tovább önbeporzással, s szelektálják az egymásra következő generációkban. Az egymást követő generációkban a heterozigóta állapot az önbeporzás és a szelekció eredményeként lehetőséget ad homogén vonalak kifejlődésének.

A pedigré módszerben jellemzően öt vagy több generáción keresztül végzik az önbeporzást és a szelektálást (Fi —» F2; Fs —> F3; F3 —* F4; F4 —* Fs, stb.).

A hibrid kukoricaváltozat két beltenyésztett vonal keresztezése, melyek mindegyike rendelkezik egy vagy több olyan kívánatos tulajdonsággal, amely hiányzik a másikból, vagy kiegészíti azt. Az első generációs hibrid utódokat Fi-gyel jelöljük. A hibridek kifejlesztéséhez csak az Fi hibrid növényeket keresik. Az Fi hibrid életerősebb, mint beltenyésztett szülei. Ez az ún. hibridvigor (vagy heterózis), ami sokféleképpen manifesztálható, beleértve a megnövelt vegetatív fejlődést és a megnövelt terméshozamot.

Hibrid kukoricaváltozat kifejlesztése három lépésből áll: (1) a kitűnő tulajdonságú növények különböző csíraplazma készletekből végzett szelektálása;

(2) a kitűnő tulajdonságokkal rendelkező növények több generáción keresztül végzett önbeporzása beltenyésztett vonalak előállítása érdekében (melyek annak ellenére, hogy különböznek egymástól, fajtaazonosak és messzemenően egységesek);

(3) a kiválasztott beltenyésztett vonalak keresztezése hibrid utódok (Fi) előállítása érdekében.

A beltenyésztés folyamata alatt a vonalak életerőssége (vigor) csökken. Az életerősség oly módon állítható vissza, hogy a hibrid utódok (Fi) előállítása érdekében két, egymással nem rokon beltenyésztett vonalat keresztezünk. A beltenyésztett vonalak homozigótaságának és homogenitásának bizonyítéka, hogy bármely két beltenyésztett növény hibridjei minden esetben azonosak. Ha azonosítottuk a legjobb hibridet szolgáltató beltenyészeteket, a hibrid magvak annyi ideig szaporíthatok, amíg a beltenyésztett szülők homogenitása fennmarad.

Ha az Fi utódok előállításához két beltenyésztett vonalat keresztezünk, egyszeres keresztezésű hibrid keletkezik. Ha négy beltenyésztett vonalat keresztezünk páronként (A x B és C x D), majd a két Fi hibridet ismét keresztezzük (A x B) x (C x D), kétszeres keresztezésű hibrid állítható elő. Az Fi hibridek által mutatott hibridvigor nagy része a következő generációban (Fs) elvész. Ennek megfelelően, a hibridváltozatokból származó magvak vetőmagként nem használatosak. A hibrid magvak termelésében nagyon fontos az önbeporzás elkerülése, és hogy a beltenyésztett magvak ne • · ·

- 6 kerüljenek a végső felhasználókhoz.

Hibrid kukoricamagvak kézi cimerezés alkalmazásával állíthatók elő. Két beltenyésztett kukoricaváltozatból felváltva sorokat ültetünk ki, s az egyik beltenyésztett változatról eltávolítjuk a címereket (ezek lesznek a nőivarú szülők). Feltéve, hogy a terület idegen kukoricapollen forrásoktól megfelelően el van különítve, a címerezett beltenyésztett kukoricák csöveit csak a másik (hím) beltenyészetből származó pollen fogja megtermékenyíteni, s a kapott magvak hibrid magvak lesznek, s belőlük hibrid növények fejlődnek. A kézi cimerezés azonban nem teljesen megbízható. A nőivarú növényeket alkalmanként ledöntheti egy vihar, s így azok címerei a növényen maradnak, vagy a címerezők nem távolítják el teljesen a címereket. Mindkét esetben a nőivarú növények önbeporzással termékenyülnek meg, ami azt eredményezi, hogy a beltenyésztett nőivarú növények magvai a szabályosan előállított hibrid magvakkal együtt kerülnek betakarításra.

Más lehetőség szerint, a nőivarú beltenyésztett növények gépi eljárással is címerezhetők. A gépi cimerezés hozzávetőleg ugyanolyan megbízható, mint a kézi cimerezés, de gyorsabb és olcsóbb. A címerezőgépek azonban több kárt tesznek a növényekben, mint a kézi cimerezés. Ilyenformán, a cimerezés egyik formája sem teljesen kielégítő, s szükség van olyan megoldásokra, amelyek tovább csökkentik a termelési költségeket, és kiküszöbölik az önbeporzást.

A fáradságos címerezési eljárás elkerülhető citoplazmikus hím-steril (CMS) beltenyésztett növények alkalmazásával. A CMS beltenyésztett növények mag genom helyett a citoplama genomból származó citoplazmikus faktorok eredményeképpen hím-sterilek. Ilyenformán, ez a tulajdonság kizárólag a nőivarú szülőn keresztül öröklődik, mivel csak a nőivárü növények adják a citoplazmát a megtermékenyített magvaknak. A CMS növények egy másik, nem hím-steril beltenyészetből származó pollenekkel termékenyülnek meg. A második beltenyésztett vonalból származó pollenek vagy bevisznek olyan géneket, amelyek a hibrid növényeket hím-fértilissé teszik, vagy nem. Rendszerint, a címerezett hagyományos kukoricából és a CMS kukoricából származó magvakat össze kell keverni egymással, hogy a hibrid növények nevelésekor a megtermékenyítéshez megfelelő pollenkészlet álljon rendelkezésre.

A CMS beltenyészetnek egyéb hátrányai is lehetnek. Az egyik egy specifikus CMS változat régóta tapasztalt érzékenysége bizonyos terménybetegségekre. Ez a probléma — a hibridkukorica előállítását illetően — e CMS változat mellőzéséhez vezetett. Ráadásul, a CMS növények néha előnytelen tualjdonságokat mutatnak, különösen a szár minőségét, a fiatal csíranövény életképességét és a terméshozamot illetően. A CMS növények bizonyos körülmények között hajlamosak a sterilitás megszűnésére, ami a CMS vonalakat alkalmatlanná teszi a hibrid magvak előállítására.

A sterilitás egy másik formáját, a génekkel kapcsolatos hímsterilitást a 4 654 465 és a 4 727 219 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalomban írták le. A genetikai hím-sterilitás e formája a genomon belül több mutáns gén elkülönített elhelyezkedésének fenntartását, a gének nyomonkövetéséhez alkalmas komplex marker-rendszert, valamint a megfelelő rendszer alkalmazását igényli.

Az önbeporzású fajokban — mint a szójabab és a gyapot — a hím és nő ivarszervek anatómiailag egymás közelében helyezkednek el. A természetes beporzás során egy adott virág hím reproduktív szerveiből származó pollen porozza be ugyanazon virág nőivarú reproduktív szerveit. Ez éppen ellenkezően történik az idegen beporzású fajok, mint pl. a kukorica esetében, ahol az egyik növény címeréből származó pollenek a széllel történő elterjedéssel rendszerint egy másik növény bibéit (kukoricahaj) porozzák be. Ez a hím- és nőivarú reproduktív szervek elkülönült elhelyezkedése miatt könnyen megvalósulhat. Az önbeporzó növények közötti hibridtermelés a hím- és nőivarú reproduktív szervek közeli elhelyezkedése miatt nehézségekbe ütközik. E gyakorlati nehézségen kívül a hibrid által mutatott heterózis mértéke gyakran túl alacsony ahhoz, hogy igazolja a hibrid magvak előállításához igényelt többlet költséget. A hímsterilitás megbízható formája lehetőséget biztosítana a fokozott hibridnövény termesztésre és ezen fajok megnövelt terméshozamát tenné lehetővé.

A kutatók arra törekednek, hogy a kukorica és más növények esetében pontosan megértsék a pollen kifejlődését és a megtermékenyítés folyamatát. A megtermékenyítés az érett pollen bibefelületen történő csírázásával, illetve a pollentömlő kifejlődésével kezdődik, majd a pollentömlő áthatol a bibeszál szövetén. A zárvatermők esetében a növekvő pollentömlő a két spermasejt csatornájaként szolgál, amelyen keresztül az embriózsákba jutnak, ahol az egyik a petesejttel, a másik a vegetatív központi maggal egyesül, létrehozva a zigótát, illetve az endospermiumot (E.G. Cutter, Plánt Anatomy, 1. rész, Experimentation and Interpretation, 6. fejezet, szerk.: E. Arnold; Addison Wesley, London, 1978). A pollen a portokban fejlődik, s érett állapotban mindegyik pollenszemcse egy többsejtű spóra, amely a portok falának belső rétegéből (tapétum) származó sporofita génexpressziós termékeket, és a pollenszemcséken belüli vegetatív sejtből származó haploid génexpresszió termékeit egyaránt tartalmazza (J.P. Mascarenhas, Annu. Rév. Plánt Physiol. Plánt Mól. Bioi., 41. 317, 1990; J. P. Mascarenhas, Plánt Cell, JL, 657, 1989). Bár a mikrosporogenezis folyamatát szövettanilag jól leírták, a szétszóródás utáni pollenműködés molekuláris és biokémiai faktorairól keveset tudunk.

A flavonoidok a kis molekulatömegű (-300), növényspecifikus metabolitok gazdag csoportját képezik, s 15 szénatomos vázszerkezettel rendelkeznek. Az alapszerkezet módosítása a vegyületek széleskörű csoportját eredményezi, amelyek a molekulákat alkotó egyes gyűrűk oxidációs állapota és szübsztitúciős viszonyai alapján osztályozhatók. Néhány csoportot pigmentek alkotják (pl. az antocianinok, a kalconok, s különösen a flavonolok és a fiavonok), míg az egyéb csoportokba színtelen, ultraibolya-abszorbeáló vegyületek tartoznak. Az antocianinok - különösen a pelargonin, a cianidin és a delfinidin - felelősek a növények piros, kék és ibolya színéért. Az egyéb, színes flavonoidok, a kalconok és néhány flavonol és fiavon, sárgák, s jelentős mértékben járulnak hozzá a virágok sárga, csont- és krémszínéhez. A pollen-flavonoidokat jó néhány fajban azonosították, melyekben jellegzetes sárga színt kölcsönöznek a polleneknek, s a száraztömeg jelentős hányadát (3-5 %) teszik ki (R. Zerbak, M. Bokel, H. Geiger, D. Hess, Phytochemistry, 28. 897, 1989; R. Wierinann és K. Vieth, Protoplasma, 118. 230, 1983). Bizonyított, hogy a pollenszemcse speciális környezetet biztosít a flavonoid bioszintézishez és/vagy felhalmozódáshoz, minthogy jó néhány növényfaj pollenében egyedi típusú flavonoidokat tartalmaz (0. Ceska és E.D. Styles, Phytochemistry, 20, 1822, 1984).

A módosított flavonoid pigmentekkel rendelkező növényeket már korábban leírták. Például, nem működő, sárga színű helyett fehér pollent termelő kukorica mutánst izoláltak és írtak le (Coe E.H., McCormick, S.M. és Modena, S.A., White Pollen in Maize, J. Hered, 72. 318-320, 1981). A fehér pollenes mutáns normális mennyiségű, pigment nélküli pollent bocsát ki, amelyek ''kicsíráznak a bibén (kukoricahaj), de a legtöbb beporzás után körülményeit sporofiton szintáz (CHS) génje mutációinak expressziója beszámoltak beltenyésztett petúnia közvetett beviteléről,

nem fejlődnek ki magvak. Ennek szinten (C2 és alapján

CHS törzsbe amely a a kukorica két kalconWhp) stabil, recessziv határozták meg. Az utóbbi transzgén pigmentált, történő, Agrobacteriumvirág pártájának teljes flavonoid pigmentáció hiányát eredményezte (Napoli, C., Lemieux, C. és Jorgensen, R. , Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene Intő Petúnia Results in Reversible

Co-repression of Homologous Genes in Trans, Plánt Cell, 2,

279-289, 1990). A CHS transzgént szuppresszálták is ezekben a növényekben, s a ko-represszió (co-repression) kifejezést e folyamat leírására használták (Jorgensen R., Altered Gene Expression in Plánt Due to Trans Interactions Between Homologous Genes, Trends Biotech., fi, 340-344, 1990). Az integrált transzgén az endogén CHS gén(ek) kötetlen domináns inhibitoraként működik, s a látható flavonoid pigmentek termelésének teljes blokkolását eredményezi, nemcsak a szirmokban, hanem a reproduktív szervekben is.

A CHS génexpresszió gátlása nemcsak a flavonoid pigmentáció hiányosságait okozza, hanem terméketlen növények kialakulását is (Coe és mtsi, 1981; Taylor és mtsi, Conditional Male Fertility in Chalcone Synthase Deficient Petúnia, J. Hered., 83. 11-17, 1992). Különösen kívánatos lenne a fertilitás olyan módszerrel való szabályozása, amellyel a növények tetszés szerint hím-sterillé vagy • · ·

- 12 -fertilissé tehetők.

A találmány növények kontrollálható módon hím-sterillé történő alakítására vonatkozik, melynek során a hím-fertilitás szempontjából kritikus jelentőségű gén expressziójának szabályozásához indukálható promotert alkalmazunk, oly módon, hogy a gén alaphelyzetben kikapcsolt állapotban van, miáltal a növény hím-steril. A promoter indukálásával a növény fertilissé válik. Közelebbről, a találmány tárgya a flavonol-termelést befolyásoló gén szabályozása növényekben.

Azt találtuk, hogy a növények, melyekben a flavonon-3-hidroxiláz (F3H) aktivitást oly módon károsítjuk, hogy az flavonol-deficienciát okoz, feltételesen hím-fertilisek (CMF; conditionally male fertile) lesznek, s a hím-fertilitás fenntartható vagy helyreállítható, ha olyan körülményeket biztosítunk, melyek között a növények pollenje érintkezésbe kerül a fertilitást helyreállító flavonolokkal. Az F3H-aktivitás közvetlenül vagy közvetetten károsítható, pl. a növények F3H-termelésének gátlásával, a növényekben természetesen termelődő F3H inaktiválásával, vagy a flavonol bioszintetikus útjának prekurzor enzime - mint a kalconszintáz (CHS) - aktivitásának károsításával. Annak ellenére, hogy az F3H-deficiens növények termelnek pollent, a pollen csírázása és a pollentömlő kifejlődése ín vivő és in vitro egyaránt szigorúan mérsékelt, ami önsteril növényeket eredményez. Ha azonban olyan körülményeket biztosítunk, • ·

♦· · «. · • · · ♦ · • · · · · »· • · · · · ·

- 13 melyek között a növény pollenjei fertilitást helyreállító faktorokkal kerülhetnek érintkezésbe, teljes pollencsírázás és pollentömlő fejlődés helyreállítható. A fertilitás visszaállításához alkalmas körülmények azok, amelyek lehetővé teszik, hogy a kívánt flavonoidok hozzáférhetőek legyenek a növények pollenjei számára;

például, az F3H-t károsító feltételek megszüntetése, a növények

F3H termelésének visszaállítása és hasonlók. Más lehetőség szerint, a növények fertilitása úgy is fenntartható vagy helyreállítható, hogy a növények pollenjeit a fertilitást helyreállító flavonolok pollen csírázásának és a pollentömlő fejlődésének elősegítéséhez - hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe.

Az alkalmas, fertilitást helyreállító flavonolok közé az (I) képlet szerinti (melyben Rí, R2, R3, R4, R5, R7 és Rs jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport) vegyületek tartoznak. Az előnyben részesített flavonolok közé tartozik a galangin, a kaempferol, az

Ao-ramnetin, a kvercetin és a morin.

Az ábrák rövid leírása

A találmány eddig leírt tárgyai és a találmány velejáró előnyeinek nagy része a következő, részletes leírás, és a hozzákapcsolódó ábrák alapján könnyebben értékelhetők és érthetők lesznek.

Az 1. ábra sematikusan ábrázolja a kalcon-szintáz (CHS) • · · * V · • · •· · •· ·♦·· • · ♦ * ♦· • ·· • · ·:

• 4 heterozigóta növényekben fejlődő mikrospórákra gyakorolt sporofiton hatást (ferde vonalak). A sporofiton nemzedékben a CHS működésének hiányát fehér háttérrel (1/A ábra), a CHS működés Jelenlétét fekete háttérrel jelöljük (1/B ábra).

A 2/A és 2/B ábrán a V26 beltenyésztett petúniavonalból (2/A ábra) és a 02425.1 CHS-deficiens növényből származó in vitro csíráztatott pollenek fényképei láthatók. A frissen felrepedt portokokból származó polleneket folyékony tápközegben szuszpendáltuk, s 6 órás, szobahőmérsékleten végzett nevelés után fényképeztük. A 2/A ábrán a fekete vonal 25 /m-nek felel meg. A 2/B ábrán lévő nyilak a kibújni készülő pollentömlőket Jelölik.

A 3. ábrán a V26 beltenyésztett petúniavonalból (bal oldali oszlop) és a 02425.1 CHS-deficiens növényből (Jobb oldali oszlop) származó, fejlődéstanilag azonos portokok (melyeket a 3. példában leírtak szerint összegyűjtöttük, rögzítettük, beágyaztuk, keresztirányban átmetszettük és toluidin-kékkel festettük) keresztmetszeteinek fényképei láthatók. A 3/A ábrán teljes portok metszet látható, melyet közvetlenül a portok felrepedése előtt készítettünk, mikor a CHS-deficiens portokok rozsdabarnák és zsugorodottak. A 3/A ábrán látható vonal 200 pm-nek felel meg. A 3/B ábrán a portok felpattanása előtt 48 órával (amikor a transzgén portokok még duzzadtak és fehérek) készített metszet látható. A 3/C ábrán a 3/A ábrán látható portok metszeteket a 3/B ábra szerinti nagyítással mutatjuk be. A 3/C ábrán • · · * látható vonal 50 /.an-nek felel meg. A 3/D ábrán a kiszóródó, érett pollenek láthatók. A 3. ábrán látható betűjelek: P = pollen; E = endotécium; S = sztóma; C = epidermisz.

A 4. ábrán fényképpel mutatjuk be a a CHS-deficiens petúnia pollen csírázásának és tömlőfejlődésének fertilitást helyreállító flavonollal, a kaempferollal végzett helyreállítását. A polleneket feltételesen hím-fertilis portokokból gyűjtöttük össze, csíráztató tápközegben szuszpendáltuk, majd 1 pM végkoncentrációban kaempferolt (K+, 4/C ábra) vagy DMSO-t (K-, 4/B ábra) adtunk hozzá. A pollenek reprezentatív területeit 4 órás inkubálás után fényképeztük le. A kaempferollal kezelt CMF pollenek (K+, 4/C ábra), illetve a csak DMSO-val kezelt vad típusú V26 kontroll (C, 4/A ábra) csírázása és tömlőfejlődése egymástól megkülönböztethetetlen. A kezeletlen pollenek (K-, 4/B ábra) közül néhány a csíranyílásnál megduzzadt, de pollentömlő egyiknél sem bújt elő.

Az 5. ábrán a vad típusú V26 bibék (5/A ábra) és a CMF bibék

(5/B ábra) metanolos	kivonatainak HPLC diagramját mutatjuk
be, melyeken a 150	bibéből készített, reverz fázisú Cis
oszlopon metanol-víz	gradienssel frakcionált kivonatok 100
/;l-nyi alikvot j ainak	360 nm-nél mért abszorpciója látható.

Az 5/A ábra részlete a 33,17 percnél tapasztalt csúcs

UV/látható fény spektrumát ábrázolja, amely azonos a valódi kaempferol standarddal készítettel. A savval hidrolizált V26 bibekivonat HPLC-diagramja és UV/látható fény spektruma azt jelzi, hogy a 7,43, 10,10, 13,46 és 16,65 perces retencióidőnél látható fő csúcsok a kaempferol és a kvercetin glikozidjai.

A 6. ábrán a növekvő flavonol-aglikon koncentráció pollencsirázási gyakoriságra mutatott hatását mutatjuk be. A kísérletek során a csíráztató tápközeghez (GM) a feltüntetett koncentrációkban kaempferolt (világos körök), morint (sötét körök), miricetint (világos háromszögek) és

3-hidroxi-flavont (sötét háromszögek) adtunk, s a csírázást négy órás inkubálás után értékeltük. A három, egymástól független kísérletben mért átlagos csírázási gyakoriságot a középérték szórásával (standard hiba; SEM) együtt ábrázoltuk. Az 1,4-nél kisebb SEM .értékeket nem ábrázoltuk.

A vad típusú kontroll V26 pollen csírázási gyakorisága jellemzően 75 %, míg a DMSO-val kezelt, helyreállítatlan fertilitású CMF pollenek 1-2 %-os beporzást eredményeznek.

A találmányban szereplő valamennyi hivatkozást referenciaként közöljük.

A találmány a növénytermesztésben és a magvak termelésében alkalmazott hagyományos hím-sterilezési eljárásoktól különböző eljárásra vonatkozik, melyben a mikrosporogenezisben (azaz a pollenek kialakulásában) kritikus fontosságúként ismert gének expressziójának szabályozásához indukálható promotert alkalmazunk. Ennek megfelelően, a találmány gyakorlati megvalósításának első lépéseként kiválasztjuk az a gént. amely döntően befolyásolja a mikrosporogenezist. A mikrosporogenezist illetően kritikus fontosságúnak mutatkozó gének egyik csoportját a flavonoltermelésre ható gének alkotják.

A kiválasztott gént klónozzuk, s a módosított gént külső kontrollra érzékeny, indukálható promoterrel együtt expressziós szekvenciába inszertáljuk. Előnyösen olyan promotert alkalmazunk, amely a növénynek adott, nem fitotoxikus vegyszerre érzékenyen reagál.

Transzformáció és génszubsztitúció alkalmazásával a kritikus fontosságú gént inaktiváljuk a növény genomjában, s az indukálható promoterrel együtt expressziós szekvenciába inszertált, génsebészeti eljárással kezelt génnel helyettesítjük.

A találmány egyedülálló abból a szempontból, hogy az indukálható promotert a fertilitás, s nem a sterilitás indukálásához használjuk. A találmányban a kiválasztott gén promoter szekvenciáit eltávolítjuk, s így a gén nem íródik át, miáltal a növény hím-steril lesz. Ha szaporítani akarjuk a hím-steril növényt, a kritikus gén expressziójának indukálásával helyreállítjuk a hím-fértilitást. A találmány előnyben részesített megvalósítási módjában ezt úgy hajtjuk végre, hogy a hím-steril növényt specifikus, nem fitotoxikus vegyszer jelenlétében neveljük.

···· ·· • · · . · ···

- 18 Érthető lesz, hogy a hím-sterilitás oly módon biztosítható, hogy a kritikus gén kikapcsolt állapotban van, s az exprtessziójához az említett vegyszerre van szükség, vagy más módon, a kritikus gén bekapcsolt állapotban van, s a vegyszeres kezelés a sterilitás biztosításához szükséges. Az utóbbi eljárást a W089/10396 számú PCT közrebocsátási iratban (a PCT/EP89/00495 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés alapján) Mariani és mtsi. írták le.

Az indukálható promoter vegyszeres kezeléssel történő indukálása magával a vegyszeres kezeléssel kapcsolatos különböző tényezőktől, s a kezelés idején fennálló különböző környezeti feltételektől függ. Ha a kritikus gén alaphelyzetben bekapcsolt állapotban volt, s az inaktiváláshoz vegyszeres kezelést igényel, a kezelés sikertelensége önbeporzást, s ezáltal hibrid magvak helyett beltenyésztett magvak termelését forgalmazását eredményezi.

A hibridmagvak forgalmazását szabályozó törvények a magvak nagyfokú tisztaságát követelik meg, oly módon. hogy hibrid meghatározásnak meg nem felelő magvak arányát nagyon alacsony szinten kell tartani. Mivel egy kukoricanövény több, mint hatmillió pollent képes termelni, a kezelés kis hibája is nagy százalékban okozhat önbeporzást. Emiatt a találmányt a gyakorlatban oly módon valósítjuk meg, hogy a gén alaphelyzetben kikapcsolt állapotban van, s a megfelelő tulajdonság nem expreszszálódik, s ilyenformán normális körülmények között önbeporzás nem történhet. Ráadásul, azáltal, hogy a kritikus gén

_ f * * · ·· · · · • · · · · _* · · ···· ··· <· · alaphelyzetben kikapcsolt állapotban van, a hibrid magvak nagy mennyiségben való termeléséhez nincs szükség vegyszeres kezelésre, s így a vegyszer felhasználás (és az ezzel összefüggő költség) csökken, s a kezelés sikertelenségének kockázata csak a szülői magvak kisebb mennyiségben végzett, gondosan ellenőrzött előállításakor áll fenn, amikor szükség van az önbeporzásra. Mivel ilyen esetben a kezelés sikertelensége a pollenek csökkent termelését eredményezi, s a pollenek normális esetben jelentősen túltermelödnek, a találmány szerinti eljárás a szülői magvak előállítására 7080 %-os arányban tolerálja a kezelés sikertelenségét, miközben a szülői magvak hozamára minimális hatást gyakorol.

A hím-fertilitás szempontjából kritikus jelentőségű gének azonosítása

A hím-steril gén azonosításának és klónozásának eljárásai megegyeznek a tudományban ismert, egyéb génekhez alkalmazott módszerekkel. Az előnyben részesített eljárás a transzpozonos (áthelyezhető, mozgékony genetikai elem) jelölés, mivel legtöbb esetben a kukorica genetikai hímsterilitása recesszív génmutációk eredménye. Hímsteril gén transzlációs terméke protein-szekvenciájának ismeretét igénylő klónozási technikák jelenleg nem alkalmazhatók, mivel a hím-steril gének termékeit még nem ismerjük.

A kukoricagének áthelyezhető genetikai elemekkel történő jelölésének eljárása ismert (H.P. Doring, Tagging Genes • · « 4

- 20 with Maize Transposable Elements. An Overview, Maydica, 34, 73-88, 1989; Federoff, Transposable Elements and Process fór Using Same című 4 732 856 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalom).

Az egyik eljárás szerint, mellyel a transzpozonos jelölés végrehajtható, aktív, áthelyezhető elemeket, s a célgén domináns, a mikrosporogenezisben szerepet játszó alléljét hordozó kukoricatörzset áthelyezhető elemeket nem hordozó, normális kukoricatörzzsel keresztezzük. A specifikus génjelölés hatékonysága növelhető, ha a transzpozont a célgén lókusz közelébe helyezzük. A keresztezésekkel nyert utódokat önmegtermékenyítéssel szaporítjuk, s kiválasztjuk a leghasznosabb mutációkat. Az előnyben részesített fenotípusokat azok a növények képviselik, amelyek nem fejlesztenek portokot, s amelyek nem termelnek polleneket. A legelőnyösebb fenotípusok azok, amelyek nem fejlesztenek portokot, mivel ezek a beporzási idő előtt vizuálisan könnyen kiválaszthatók. Ezek a hím-steril növények olyan eseteket képviselnek, melyekben a transzpozcnok kivágódtak eredeti helyükről, s a pollen kifejlődésében esszenciális gént hordozó lókuszra helyeződtek át. Ha a transzpozon egy ilyen lókuszra helyeződik át, a gén inaktiválódik, s a továbbiakban recesszív génként viselkedik, miáltal hímsterilitást okoz. Ezek a mutáns törzsek a transzpozonok teszteléséhez alkalmas teszt-törzsekkel keresztezhetők, miáltal bebizonyítható, hogy a transzpozon jelen van-e.

• · ·

- 21 Miután megállapítottuk, hogy a transzpozon a célgénbe helyeződött át, a transzpozonnal hibridizáló genom kiónok hozhatók létre. A transzpozonok kiónnal szomszédos szekvenciáit ezután a mutáns alléit, a revertáns alléit és a vad típusú alléit hordozó törzsekből származó genom DNSekkel végzett Southern hibridizációban próbaként alkalmazzuk. A várt méretbeli különbségeket (amelyek a transzpozon jelenlétét vagy hiányát tükrözik) mutató rDNS hordozza a kívánt, módosított célgént.

A gyakorlatban, egy adott lókusz transzpozonnal végzett jelölésének gyakorisága rendszerint 10~⁵-10^-6. 100 000 kukoricanövény azonban 4 hektárnál nem nagyobb területen is könnyen felnevelhető. Ráadásul, bizonyos körülmények között a transzpozon által indukált mutációk gyakorisága is növelhető. Egy adott, a génjelöléshez alkalmazandó transzpozon hozzákapcsolható a transzpozonnal jelölni kívánt génhez. Két különböző transzpozon-rendszert illetően (Ac és Spm/En), a transzpozonok áthelyezése elsősorban a kromoszóma azon helyeire történik, ahol a transzpozon az áthelyeződés előtt elhelyezkedett. Más módon, a különböző transzpozonok különböző gyakoriságban indukálnak mutációt. Például, a Mutator (Mu) elnevezésű transzpozon a kontroll növények esetében tapasztalható gyakoriságnál 30-50-szer nagyobb gyakorisággal indukál új mutációkat. Ráadásul, a mutáció indukálásának gyakoriságát a transzpozont hordozó szülő neme is befolyásolja. Míg lehetetlen előre meghatározni, hogy melyik reciprok keresztezés adja a nagyobb mutációs

gyakoriságot, a transzpozonos jelölés könnyen elvégezhető.

Mostanáig legalább hét különböző kukorica transzpozont klónoztak. Ezek az Ac, az Spm/En, az Nu, a Tz86, a Bsl, az rDt és az Mpil. Ezek közül bármelyik alkalmazható transzpozonokat tartalmazó gének klónozásához.

A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a transzpozonos jelölés csak egy az ilyen gének jelölési módjai közül, s egyéb módszerek is ismertek.

Szintén ismert a mutáns gének egyik csoportja, melyet

Albertsen és mtsi. írtak le (Developmental Cytology of 13

Genetic Male

Loci in Maize, Can. J. Génét. Cytol.,

23, 195-208,

1981).

Ezek hím-sterilitás (ms) génekként

Ezek gének csak a pollenek kifejlődésére hatnak, női szaporító szervekre nem.

hím-sterillé teszik a növényeket.

Mivel a mutáns gént valamennyi korábbi forrásból izoláltuk, ezt használtuk próbaként a vad típusú alléi klónozásához. Ez amiatt lehetséges, hogy a mutált gén nagyon közeli hasonlóságban áll a vad típusú alléllel, s ilyenformán hibridizál vele. A normális gén azonosításával és klónozásával ismertté vált a gén promoter régióként ismert régiója. Ezt a régiót alkalmaztuk a gén transzkripciójának e1indításához.

A pollen fejlődésében esszenciális gének mutációk közvetett alkalmazása nélkül, pollen kifejlődése idején kizárólagosan jelen lévő mRNS izolálásával, valamint a megfelő gén próbájaként genom könyvtár screeneléséhez alkalmazható cDNS kialakításával is azonosíthatók.

Felfedeztük azt is, hogy a flavonol, s általában bizonyos flavonolok pollenek működését illetően kritikus fontosságúak, s termelődésük vagy hiányuk szabályozhatja a fertilitást és a sterilitást.

Flavonoid-hiányos, feltételesen him-fertilis (CMF) növény fert.ilitása oly módon állítható helyre, hogy a növény pollenjeit a pollenek csírázásának és a pollentömlők növekedésének serkentéséhez hatásos, fertilitást helyreállító flavonolokkal hozzuk érintkezésbe. Egy szemléltető példával: a megfelelő körülmények úgy biztosíthatók, hogy a növény pollenjeit fertilitást helyreállító flavonol a pollenek csírázásának es a pollentömlők növekedésének serkentéséhez hatásos mennyiségével hozzuk érintkezésbe. Az említett flavonoid hiányos, feltételesen him-fertilis (CMF) növény kifejezés olyan növényekre vonatkozik, melyekben a kalcon-szintáz (CHS) vagy a flavonon-3-hidroxiláz (F3H) aktivitás - akár természetesen, akár transzgenetikusan - károsított, gátolva ezzel növény természetes flavonoid termelését.

Következésképpen, a flavonoid-hiányos, feltételesen hím fertilis (CMF) növény jellemzően pigmenthiányos (ami fehér • · · ·

- 24 vagy halvány színt eredményez) és ön-steril lesz. Bár a találmányt a továbbiakban CMF petúniákkal és kukoricával kapcsolatban jellemezzük részletesen, a találmány gyakorlati megvalósításában egyéb CMF növények is hasonlóan alkalmazhatók.

A flavonol természetes bioszintetikus útjában a kalcon-szintáz (CHS) három malonil-koenzimA molekulát és egy p^kumaroil molekulát kondenzál, miáltal kalcon-naringenin képződik, amely spontán (kis százalékban), illetve kalconflavanon-izomeráz (CHI) hatására naringeninné alakul át. A reakcióút. utolsó lépésében az F3H a karbongyúrű 3-as szénatomjához hidroxilcsoport addicióját katalizálja, miáltal egy flavonol képződik, amely a találmány szerinti fertilitást helyreállító aktivitáshoz szükséges. Az általános reakcióutat az 1. reakcióvázlatban mutatjuk be.

A flavonolok előállításában az F3H a termékképződést korlátozó enzim. Az F3H-t korábban Antirrhinum majus-Aoól klónozták (Martin, C., Prescott, A., Mackay, S., Bartlett, J. és Vrijlandt, E., Controll of Biosynthesis in Flowers of Antirrhimim május, The Plánt J. , 1, 37-39, 1991). Mivel a flavonol-aglikon vegyületek szükségesek a hím-fertilitáshoz (amint a találmányban leírjuk), a találmány gyakorlati megvalósításában az F3H hidroxilálási aktivitását szabályozó indukálható promoter alkalmazható.

A CHS, CHI vagy F3H működés hiánya miatt flavonoidokat

nélkülöző növényekben a hím ivarmüködés károsítása a portok felrepedéséig - amikor a portok színben, alakban és méretben eltér a normális morfológiától - nem okoz nagyobb abnormalitásokat a pollen kifejlődésében. A portok felrepedésekor a pollenek egy csomóban maradnak a portokban, s a pollenzsákot mikroszkóppal vizsgálva a pollenszemcsék jelentős hányada zsugorodottabbnak mutatkozik, mint a normális pollenek. Annak ellenére, hogy életképes pollenek termelődnek és hullanak ki, a pollenek csírázása és a pollentömlők növekedése in vivő és in vitro egyaránt károsodik. A funkcionális hím-sterilitáson felül a flavonoldeficiens növények az ön-inkompatibilitás bizonyos jellemzőit mutatják, amit az bizonyít, hogy polleneik a vad típusú növények bibéin megtapadnak, a flavonol-deficiens növények bibéin azonban nem. Bár mind a hím-sterilitás, mind az ön-inkompatibilitás elemei nyilvánvalóak, a flavonoldeficiens növényekből származó pollenek olyan egyedi sajátságot mutatnak, amelyet a találmányban feltételes hímfertilitásként (CMF) említünk.

Azon növények, melyekből hiányzik a CHS (s amelyekből ilyenformán hiányzanak a flavonoidok is) két sajátosságot kivéve normálisnak mutatkoznak. E két jellemző: a falvonoid pigmentáció hiánya és a károsított pollenek termelése, amelyek működése teljes mértékben a vad típusú termőktől (bibe + bibeszál) függ.

Miközben a CHS-deficiens növényekből hiányzik a flavonoid • · · · ·« pigmentáció, és a pollenműködés károsult, a különböző növényfajok között nyilvánvalóak bizonyos különbségek. A kukorica fehér pollenjei kicsíráznak a kukoricahajon, s pollentömlőt fejlesztenek, amelynek növekedése megáll a bibeszálban. Ráadásul, a kukorica mutáns pollenje in vitro kicsírázik, s majdnem olyan hosszú pollentömlőt fejleszt, mint a vad típusú pollen. Ezzel szemben, a CHS-deficiens petúniából származó pollen nem tapad meg a bibén, és sem in vivő, sem in vitro nem fejleszt pollentömlőt. A kukorica és a petúnia közötti különbség a háromsejtes (kukorica) és kétsejtes (petúnia) pollen közötti fiziológiai különbségekkel magyarázható. A kétsejtes pollenek respirációs sebessége a kiszabaduláskor alacsony, a második spermasejtet a kiszabadulás után - valószínűleg a csírázás előtt néhány órával - a bibén hozzák létre, s pollentömlőjük kezdeti növekedési sebessége alacsony, összehasonlításul; a háromsejtes pollenek a második mitotikus osztódáson az antézis előtt mennek keresztül, a kiszabaduláskor magas respirációs sebességgel rendelkeznek, a bibe felületével való érintkezés után perceken belül kicsíráznak, s pollentömlőjük kezdeti növekedési sebessége magas. Mivel a háromsejtes pollenek a portokból való kiszabadulás után gyorsan fejlődésnek indulnak, a fehér kukorica pollenek tömlői jelentős hosszúságúra növekednek, mielőtt bármilyen, a pollen növekedését leállító mechanizmus hatásos lenne.

A nemzedékváltakozásos virágos növényekben a diploid sporofiton haploid spórákat hoz létre, amely fejlődve és « · ·

mitótikusan osztódva a gametofitont hozza létre. A gametofiton életciklus egy része akkor zajlik le, amikor a fejlődő spóra közvetlen kapcsolatban áll az őt körülvevő sporofita szövettel. Ez az elhelyezkedés lehetőséget ad a diploid-haploid interakcióra. A heterozigóta növényekben ez az interakció magában foglalhatja a két gametofiton típus közötti haploid-haplcid érintkezést is (ld. 1. ábra). Az a tény, hogy a petúnia találmányban leírt flavonoid-deficiens hím-sterilitása genetikailag recesszív tulajdonság, annak megítélését igényli, hogy a gametofiton vagy a sporofiton felelős-e ezért a hatásért. A kukorica esetében a hímsterilitás csak a mindkét CHS génre (c2 és Whp) homozigóta recesszív növényekben expresszálódik. A C2 vagy a Whp egy funkcionális másolatával rendelkező heterozigóták 100 %-ban sárga, fertilis pollenszemeket termelnek (Coe és mtsi, 1981). Ilyenformán, heterozigóta növényben a CHS-pozitív sporofiton és az 50 % CHS-pozitív gametofiton egyaránt befolyásolja a CHS-negatív gametofitonok fertilitásának expresszálódását. Transzgén petúniában a hímsterilitás domináns jelleggel áll kapcsolatban, és a· heterozigóta növények által termelt pollenek 100 %-ban hím-sterilek.

Ebben az esetben a sterilitást a CHS-pozitív gametofitonok CHS-gátolt gametofitonok által okozott gátlása, vagy a transzgén sporofiton CHS-deficienciája okozza (1. ábra). Úgy tűnik, a hím-sterilitást eredményező CHS-deficienciák fiziológiai alapja a kukoricában és a petúniában azonos, és mindkét faj esetében inkább a sporofiton okozza a hímsterilitást, mint a gametofiton. Ilyenformán, a CHS28 deficienciával kapcsolatos feltételes hím-fertilitás fiziológiai alapja a kukorica és a petúnia esetében azonos.

A fertilitás flavonol-termelés szabályozásával történő kontrollálásának bizonyítékaként azt találtuk, hogy lehetőség van arra, hogy a CHS-deficiens növényekből származó feltételes hím-fertilis pollenek termelését használjuk fel a pollen in vitro helyreállítási módszere alapjának kialakításához. A transzgén pollen tisztított flavonoidokkal vagy növénykivonatokkal kiegészített csíráztató oldatban történő inkubálásával, és a fokozott csírázási gyakoriság és pollentömlő növekedés vizsgálatával azonosíthatók a pollen működéséhez szükséges specifikus vegyületek. Ezzel a módszerrel meghatároztuk, hogy a flavonoid vegyületek nagy családjának tagjai nem egyformán hatásosak a CMF növények fértilitásának helyreállításában, a fertilitást helyreállító flavonol-aglikonok egy specifikus csoportja azonban annál inkább hatásos.

A találmány gyakorlatában a CMF növény pollen csírázásának elősegítésében hatásos bármely flavonol alkalmazható. Azt találtuk azonban, hogy e célból a flavonoidok viszonylag nagy családjának legtöbb tagja hatástalan. A különösen hatásos, fertilitást helyreállító flavonolok azonosíthatók, s felhasználhatók a CMF ön-steril növények fertilitásának helyreállításában. A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási módjában fertilitást helyreállító flavonolként az (I) képlet szerinti vegyületet (melyben Rí, R2, R3, R4,

Re - Rt és Rs jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport) alkalmazzuk. Elsősorban olyan flavonolokat alkalmazunk, melyekben az Ri-Rs csoportok közül nem több, mint kettő Jelöl hidroxil- vagy metoxicsoport, miközben a többi Ri-Re csoport jelentése hidrogénatom, illetve Rt és Re jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy metoxicsoport. Jelenleg a találmány különösen előnyös és tipikus, fertilitást helyreállító flavonol vegyületei közé tartozik a galangin, a kaempferol, az ízo-ramnetin, a kvercetin és a morin, amelyek az (I) képlet szerinti általános kémiai szerkezettel - az 1. táblázatban felsorolt szubsztituensekkel - rendelkeznek.

1. TÁBLÁZAT

Flavono1	Rí	Rz	Rs	r4	Re	Re	Rt
Galangin	H	H	H	H	H	OH	H
Kaempferol	H	H	OH	H	H	OH	H
Izo-ramnetin	H	OCHs	OH	H	H	OH	H
Kvercetin	H	OH	OH	H	H	OH	H
Morin	OH	H	OH	H	H	OH	H

A találmány gyakorlatában alkalmazható egyéb flavonolok az in vitro pollenműködés helyreállításának vizsgálati módszerei felhasználásával könnyen meghatározhatók.

A találmány a következő példák segítségével jobban érthető lesz, . amelyeket jellemzésként, s nem korlátozásként írunk le.

1. példa: Kalcon-szintáz-deficiens petúniák fertilitása

Transzgén és beltenyésztett V26 petúniákat 300-600 /.mól-m^-2 perc^-1 intenzitású fém-halogenid fénnyel kiegészítve 16/8 órás megvilágítási periódussal melegházban tartottunk. A beltenyésztett V26 törzs a Petúnia hybrids pigmentált vonala, amely legtöbb szövetében, beleértve a pollent, a portokot és a porzószálat, valamint a termőt (bibe + bibeszál), képes a flavonoidok termelésére, s teljes mértékben ön-kompatibilis (Önbeporzásra alkalmas). Az analizált transzgén anyag a két független, 218.38 és 218.41 számú transzformált regeneránsból (Napoli, C., Lemieux, C. és Jorgensen, R., Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene Intő Petúnia Results in Reversible Corepression of Homolcgous Genes In Trans, Plánt Cell, 2, 279-289, 1990) és a szülői V26 vonallal (2425-2435. populációk) visszakeresztezett második generációból (BC2) származó egyedekből áll. Ezekben a transzformánsokban a ΤΌΝΕ inszerció - szelektálható marker génként - neomicinfoszfotranszferáz II génhez (Napoli és mtsi, 1990) kapcsolt vírus promoterhez fuzionált CHS cDNS-szekvenciákat tartalmaz. A keresztezéseket a virágok - a beporzás előtt 24 órával végzett - him-sterilizásával végeztük. A keresztezésekhez használt transzgén virágok közül egyiken sem voltak láthatók a pigmentáció jelei. A pollen-donorokat a két-három felrepedt portokkal rendelkező növényekből választottuk ki, vagy a duzzadt, még fel nem repedt portokokból kivettük a polleneket.

A 218.38 és 218.41 transzgén petúnianövények a CHS gén egy további másolatának bevitele után tiszta fehér virággal rendelkeztek. Ha a transzgén növények szirmaiban CHS expresszióját vizsgáltuk, mind az endogén, mind a bevitt génekben a transzformálatlan V26 szülői vonalhoz és a szomatikus revertánsokhoz képest ötvenszeres mRNS indukciót tapasztaltunk.

A V26 beltenyésztett vonalba tartozó növények a levelekben, hajtásokban, kocsányokban, bibeszálakban és porzószálakban bíborvörös antocianin pigmenteket, a fejlődő portokokban pedig fehér kalcont termelnek. összehasonlításul; a transzformált növények a felsorolt szövetek egyikében sem mutatnak látható pigmentációt. A látható pigmentek hiányát metanolos kivonatok HPLC-analízisével bizonyítottuk (ld. 6. példa). Normális esetben az érett pollenekkel teli portokok, közvetlenül a felrepedés előtt kiszáradmak. Felrepedéskor, amikor a portok a sztómium mentén hosszanti irányban megreped, a szövet vízvesztése azt eredményezi, hogy a portokfél két éle visszacsavarodik, s kihullanak a pollenek.

A nem pigmentált transzgén növények közelebbi vizsgálata azt mutatta, hogy a felrepedést megelőző 48 órában a portok átlagosan, hosszát tekintve 40 %-ban zsugorodik össze, s színe a krémfehérről vörösesbarnára változik, összehasonlításul; a transzformálatlan V26 szülői vonal csak 15 %-ös zsugorodást mutat, és sárga színe változatlan marad. A felrepedt portokok előfordulási gyakorisága 0 %-tól 100 %-ig terjed; a nagyobb gyakoriság csökkent relatív nedvességtartalommal kapcsolatos. Bár a CHS-deficiens portokok felrepedése némiképp késhet a V26 szülői vonalhoz képest, a portokok mégis felnyílnak, hogy normális mennyiségű pollent bocsássanak ki, melyek azonban nem olyan könnyűek, és nem porlanak úgy, mint a V26 pollenek, s összetapadva maradnak a portokon belül.

A 218.41-es törzs flavonoid-deficiens utódainak önbeporzására tett számos kísérlet közül, melyek során akár az összezsugorodott, vörösesbarna, felrepedt portokokból származó, akár a duzzadt, fehér, felrepedés előtt álló portokokból kiemelt polleneket használtuk (ld. 2. táblázat, 5. oszlop, Transzgén önkeresztezés, 0 mag/toktermés) egyik sem eredményezett magvakat. A V26 szülői vonal önkeresztezése hüvelyenként átlagosan 225 magot eredményez. Ezzel a vizsgált 75 transzgén petúnia önkeresztezés során hozzávetőleg 17000 magot alakítunk át. A 2. táblázatban szereplő valamennyi növényt női fertilitásra teszteltük, melynek során a bibéket a V26 beltenyésztett vonalból származó pollenekkel poroztuk meg. Mindegyik esetben teljes magmennyiséget tartalmazó toktermések képződtek, ami azt bizonyítja, hogy a CHS-deficiens növények a női ivarműködést • · ··· ·· e · · • ··· tekintve fertilisek. A reciprok keresztezések, melyek során a V26 bibéket transzgén, flavonoid-deficiens pollenekkel poroztuk meg, különböző mennyiségű magvak termelődését eredményezték (ld. 2. táblázat).

2. TÁBLÁZAT

Transzgén pollenekkel végzett keresztezésekből száramazó magvak

Pollen forrása	Megporzások száma
V26 X transzgén pollen	Transzgén önkeresztezés 0 mag/tok
0 mag/tok	1-150 mag/tok	>150 mag/tok
02425.1*	0	2	0	8
02430.5	0	5	3	6
02430.6	o	1	0	6
02430.8	-	-	-	6
02432.2	-	-	-	6
02435.1	0	1	1	6
02435.2	1	4	1	8
02435.3	0	1	1	7
J2425.1*	0	1	0	1
J2428.1	-	-	-	A,
J2431.2	2	3	0	6
J2432.3*	3	0	0	7
J2430.5*	3	2	0

* E növény másik hajtásán lévő virágok a pártán némi bíborvörös pigmentációt mutattak.

* Mindegyik felsorolt növényen legalább négy virágot poroztunk meg a V26 pollenekkel, s valamennyi magvakkal teli toktermést hozott.

A magvak toktermésenkénti átlagos száma 225.

különböző transzgén növényt (nőivarú szülőként) felölelő 37 keresztezésből 11 nem adott toktermést, 20 kevesebb, mint 150 magot tartalmazó tokot, míg 6 több, mint 150 magot tartalmazó tokot adott. Ez toktermésenként átlagosan kb. 60 magot, vagy a magkészlet 70 %-os csökkenését jelenti. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy míg a flavonoid-deficiens növényekből származó) pollenek a flavonoid-deficiens növények bibéin működésképtelenek, a vad típusú növények bibéin részlegesen működőképesek. Ezt a jelenséget neveztük el feltételes hím-fertilitásnak (CMF). A keresztezések során a magok megporzásonkénti számának nagy különbségei valószínűleg a környezeti és/vagy fejlődési faktoroknak köszönhetők.

Valószínűtlen. hogy a feltételes hím-fertilitás a T-DNS hím-fertilitáshoz szükséges génbe történő inszerciójának lenne köszönhető, mivel két független transzformáns, a 219.38 és a 218.41 ugyanazon sajátságokkal rendelkezik; mindkettőből teljes mértékben hiányzik a flavonoid pigmentáció, s mindkettő azonos domináns hím

steril fenotípussal rendelkezik. E következtetés további bizonyítékát Napoli és mtsi. (1990) megfigyelései szolgáltatják, miszerint a transzformált regeneránsok időnként szomatikusán erősen pigmentált növényekké fejlődnek vissza, de megőrzik a transzgént, jelezve, hogy a transzgén jelenléte egyedül nem gátolja a CHS-expressziót.

A kukorica fehér pollenjével mutatott hasonlóság miatt úgy tűnik, hogy a petúnia feltételes hím-sterilitását a flavonoidok hiánya okozza, amit végső soron a CHS vagy F3H gén expressziójának gátlása eredményez.

2. példa: Pollencsírázás és a pollentömlő növekedése

A pollenek	in vitro csíráztatását frissen gyűjtött
pollenekkel	egyszerűsített Brewbakers-féle tápközegben
Mulcahy GB.	és Mulcahy DL. (The Effect of Supplemented
Media on The	Growth in vitro of Bi- and Trinucleate Pollen,

Plánt Science, 33, 213-216, 1988) leírása alapján végeztük. (A tápközeget gyakran csíráztató tápközegként említjük.) Az egy portokból származó polleneket 50 μΐ tápközeggel együtt mikrotiter zsebbe helyeztük, szobahőmérsékleten 6-8 órán keresztül ráztuk, majd Kodak technikai pan filmre felvételeket készítettünk.

Az in vivő pollentömlő növekedést a megporzás után 48 órával mértük, Herrero M. és Dickinson H.G. leírása szerint (Pollen-pistil Incompability in Petúnia hibridé: Changes in

the Pistils Following Compatible and Incompatible Intraspecific Crosses, J. Cell Sci., 36. 1-18, 1979). A kallóz lerakódásokat Leitz Aristoplan alkalmazásával 355-425 nm-es (D köb) gerjesztési hullámhosszal és 460 nm-es kioltási (suppressing) hullámhosszal végzett epifluoreszcencia vizsgálattal tettük láthatóvá A mintákat Ektachrome T 160 filmre fényképeztük, s az internegatívokról lenyomatokat készítettünk.

A pollenek életképességét fluorokromatikus eljárással (FCR) határoztuk meg (Heslop-Harrison J., Heslop-Harrison Y., Evaluation of Pollen Viability by Enzymatically Induced Fluorescence; Intracellular Hydrolysis of Fluorescein Diacetate, Stain Technoi., 45. 115-120, 1970), melynek során a frissen kiszabadult pollent karboxi-fluoreszceinacetát csíráztató tapkczegben készített 1 mM oldatában inkubáltuk. Az epifluoreszcenciát a fenti módon tettük láthatóvá.

Kallóz termelés

A petúnia pollentömlői normális esetben körülbelül egy órával a pollen kicsírázása után hatolnak be a bibébe (Herrero és Dickinson, 1980), s a bibeszál szövetében lefelé nőnek, hogy a két spermasejtet bejuttassák az embriózsákba.

A kallóz egy β-l,3-glikozidos kötésű poliszacharid, és normális esetben e vegyület lerakódásai egymástól szabályos távolságokban helyezkednek el a növekvő pollentömlőben. A • · · • · · · · ··· • · · · · · · · kallózt színtelenitett anilin-kékkel (Currier, 1957; Eschrich és Currier, 1964) végzett festés után jellegzetes fluoreszcenciája alapján tettük láthatóvá. A CHS-deficiens virágok önkeresztezéseiben és ugyanezen növények V26 pollennel végzett visszakeresztezéseiben vizsgáltuk a pollenek csírázását és a pollentömlők növekedését. A termőket a megporzás után 48 órával gyűjtöttük be, majd színtelenitett. anilin-kékkel festettük, s fluoreszcencencia mikroszkóppal vizsgáltuk. A V26 pollenekkel megporzott, préselt flavonoid-deficiens termőkben a bibeszálban végig szabályos kallóz lerakódásokat tapasztaltunk. Az önbeporzott petúniák termőiben azonban nem találtunk kallózt, pedig a bibén bőséges mennyiségű pollen volt.

Pollenmorfológia és csírázás

Az 1. példa szerinti flavonoid-deficiens növényekből származó, frissen kihullott polleneket mikroszkóppal vizsgáltuk, és nem tapasztaltunk nagyobb mértékű rendellenességet. A petúnia pollen egyszerű folyékony tápközegben inkubálva könnyen csírázik és fejleszt tömlőt. Valamennyi BC2 családból (2425-2435) származó kicsírázott polleneket in vitro összehasonlítottuk a V26 pollenekkel. A 2. ábrán egy jellemző összehasonlítást mutatunk be. Amint látható, hat órás nevelés után sok mutáns pollenszemcse próbált kicsírázni, amit a pórusok valamelyike körül látható jellegzetes duzzadás jelez (2. ábra, nyilak), de a CHS-deficiens növényekből származó pollenszemcsék legfeljebb

%-a fejleszt tömlőt. A pollenszemcsék esetében, amelyek egyáltalán fejlesztenek mérhető hosszúságú tömlőt, a pollentömlő hosszúsága kisebb, mint az azonos körülmények között nevelt V26 pollenek tömlői hosszának 20 százaléka.

Annak meghatározása érdekében, hogy a flavonoid-deficiens növények által termelt és kiszórt pollenek életképesek-e, s ennélfogva képesek-e a csírázásra és pollentömlő képzésére, a frissen kihullott transzgén és V26 polleneken fluorokromatográfiás (FCR) életképesség analízist végeztünk. Ennek a tesztnek az az alapja, hogy a pollenszemcsék fluoreszcein-diacetát vegyületet vesznek fel, és azt sejten belüli enzimekkel fluoreszceinné alakítják át. A fluoreszcein igen poláris vegyület, s legnagyobb valószínűséggel a vegetatív sejt citoplazmájában különül el, ahol fluoreszcencia mikroszkópos vizsgálattal tesszük láthatóvá. A beltenyésztett V26 pollenek között sok (max. 40 %) abnormálisán kicsi, FCR-negatív pollenszemcse található, amelyekből mindenféle belső sajátosság hiányzik. A 2/A ábrán több e típusba tartozó szemcse látható, köztük a fénykép közepén lévő kettő. Ezek a pollenek sohasem csíráznak, s minden valószínűség szerint éretlenek. A többi szemcse közül (60 %) majdnem valamennyi pozitív FCR tesztet mutatott, ami intakt plazmamembrán és aktív citoplazmatikus észterázok jelenlétét bizonyítja. A mutáns portokokból származó pollenek között nagy százalékban vannak zsugorodott, éretlen szemcsék. A maradék normális megjelenésű szemcsék közül több, mint 90 % volt FCR-pozitív. Az a tény, hogy a • · · · flavonoid-deficiens növények által termelt pollenek nagy része életképes volt, 3 aktív anyagcserével rendelkezett, azt jelzi, hogy a flavonoid-aktivitás néhány szempontja szükséges a normális pollen csírázáshoz és a pollentömlő növekedéshez.

3. példa: A portok fejlődésének mikroszkópos vizsgálata

Hogy meghatározzuk, va.j on a mikrosporogenezis során a flavonoid működés pollenszemcsék vagy a portok szövetének szerkezetét, a V26 és

02425.1 flavonoid-deficiens növényekben összehasonlítottuk a pollenek fejlődését. Petúnia bimbók fejlődési sorozatából (0.1-6 cm hosszúságú bimbók) portokokat gyűjtöttünk, amelyeket 2 % para-formaldehidet és 1,25 % glutáraldehídet tartalmazó Pipes-oldatban (pH = 7,2) fixáltuk, Spurrs gyantába ágyaztuk, s 1 um-os metszeteket készítettünk, amelyeket tcluidin-kékkel festettünk. Kodak technikai pan filmmel mikrofényképeket készítettünk. Ezek szövettanilag reprezentálják a mikrosporogenezis valamennyi stádiumát, az archesporium differenciálódásának legkorábbi bizonyítékaitól az érett polleneket tartalmazó, felrepedés előtt álló portokokig. Hasonló figyelmet fordítottunk a tapétum fejlődésére és az azt követő feloldódására, mivel úgy gondoljuk, hogy ez a szövet a forrása a pollenflavonoidoknak. A transzgén portok és a fejlődő mikrospórák a V26 vonalból származókkal összehasonlítva egyik stádiumban sem mutattak látható szövettani különbségeket. A flavonoid *

deficiens portokokból a duzzadt, fehér színű állapotból a zsugorodott, vörösesbarna állapotba való átmenet során további metszeteket készítettünk, melyeket a V26 portokok hasonló stádiumokban készített metszeteivel hasonlítottunk össze (3. ábra). Felrepedés előtt az endotél réteg sejtjei normális esetben radiálisán terjeszkednek, vastagodnak, s bennük olyan anyag rakódik le, amelyről úgy gondoljuk, szerepe van a portok felrepedésének mechanizmusában (Cutter, E.G., Plánt Anatomy: Experimentation and Interpretation, Part I, Cells and Tissues, 2. kiadás, Landon: Arnold, 1978). Az endotél réteg nem folytonos; a sztómiumot körülvevő területen hiányzik. A zsugorodott, vörösesbarna portokok metszetei az endotél réteget, a sztómiumot vagy a portokot körülvevő epidermiszt illetően nem mutattak látható abnormálitásokat.

A V26 pollenekkel (3. ábra, V26 oszlop) összehasonlítva azonban a transzgén növények pollenzsákj aiban nagyobb arányban voltak jelen olyan zsugorodott szemcsék, amelyekből hiányoztak a belső sajátosságok. s a nagyobb szemcsék a méretet, alakot és festődési reakciókat illetően heterogénebbek voltak (3/C és 3/D ábra). A 3/C és 3/D ábrán látható heterogenitás azzal magyarázható, hogy a pollen normális esetben nagyon vízhiányos állapotban hullik ki a portokból, s a bibén gyorsan újra felveszi a hiányzó vízmennyiséget. A flavonoiddeficiens növények pollenjei sokkal vízhiányosabb állapotban hullanak ki, mint a normális pollenek, s folyékony csíráztató tápközegbe helyezve a normális állapotnak megfelelő mértékben vesznek fel vizet..

4. példa: Petúnia flavonoid-kivonatok

A petúnia pollen-kivonatok analízisével a fő flavonoidokat a kvercetin, a kaempferol, a 4,2',4',6'-tetrahidroxi-kalcon és egy dihidro-flavonol, a taxifolin 3-O-glikozidjaiként azonosították (Eerback, R. , Bokel, Μ. , Geiger, H. és Hess, D. , Phytochemistry, 20, 897-899, 1989; Zerback, R. ,

Dressler, K. és Hess, D. , Plánt Science, 62, 83-91, 1989; De Vlaming, P. és Koh, K.F.F., Phytochemistry, 15, 348-349). A kukoricapollen a kaempferol, a kvercetin és az izoramnetin legalább 10 glikozidját tartalmazza (Ceska, 0. és Styles, E.

D., Phytochemistry, 20, 1822-1823). A vad típusú és a V26 beltenyésztett petúnia vonalból a bibék csipesszel végzett roncsolásával vagy a pollenszuszpenzió PEG 4000 tápközegben (melyet a továbbiakban csíráztató tápközegként említünk) (W. Jahnen, W. M. Lush, A.E. Clarké, Plánt Cell, 1, 501, 1989) végzett vortexezésével vizes kivonatokat állítottunk elő, majd ezeket 5 percig centrifugáltuk, s a felülúszó alikvotjait 96 zsebes mikrotiter lemezen közvetlenül csíráztató tápközegben készített CMF pollenszuszpenzióhoz adtuk. A netanolos extrakciót hasonló módon végeztük, azzal a különbséggel, hogy a kivonatot vákuum alatt szárítottuk, és mielőtt hozzáadtuk volna a pollenszuszpenzióhoz, csíráztató tápközegben reszuszpendáltuk. A pollenműködés helyreállítására végzett kezdeti kísérlet, melynek során tíz V26 bibéből készített vizes kivonat 20 μΐ-ét (a teljes térfogat ^T/5 része) alkalmaztuk, 33 %-os csírázási arányt eredményezett. Kontrollként a CMF növények bibéiből és

pollenéiből hasonló módon készítettünk kivonatokat. A pollencsírázási vizsgálatokban csak a V26 bibékből és pollenekből készített kivonatok voltak képesek helyreállítani a flavonoid-deficiens pollen csírázását és tömlőjének növekedését.

A vad típusú és a feltételes hím-fertilis és bibéket az alábbiak szerint analizáltuk.

(CMF) polleneket

A bibéket vagy a polleneket először 50 %-os, majd

100 %-os metanollal extraháltuk, s az extraktumokat összegyűjtöttük és bekoncentráltuk.

Az aglikonokat savas hidrolízissel állítottuk elő:

kevertük össze.

a kivonatokat egyenlő térfogatú 4N HCl-dal ml-es ampullába zártuk, s forró vízben 40 percig hidrolizáltuk. P.everz fázisú 018 oszlopra (Phenomenex Sphericorb 5 ODS 2, 250 x 4,6 mm) injektálással ismételt mintákat vittünk. Az A oldószer 5 %-os ecetsav volt, a B oldószer 80 %-os acetonitrilben készített 5 %-os ecetsavból állt. Valamennyi futtatást 6 percig állandó koncentrációval (20 % B), majd 20 percig lineáris gradienssel (90 %-ig), s végül állandó koncentrációval (95 % B) 14 percig végeztük. Az oldószer átfolyási sebessége szobahőmérsékleten 0,5 ml/perc volt. A detektálást 360 nm-nél Hewlett Packard Model

1040A fotodiódás	osztályozó detektorral végeztük. A
kaempferolt a vad	típusú bibe-kivonatokban 60ng szigmánál
detektáltuk, míg	a kvercetint lényegesen alacsonyabb

szinteken. 150 CMF bibéből vagy 500 CMF portokból azonos módon készített kivonatok nem eredményeztek tipikus flavonol spektrumot adó csúcsokat.

·· · · · ··♦ • · · ····· ·· ··· ·· ·

A vad típusú bibekivonatokat protein-emésztő enzimekkel kezelve, melegítve és méret szerinti molekulaszűrőn áteresztve azt tapasztaltuk, hogy az aktív vegyület kis méretű, nem protein jellegű molekula volt. Az aktív vegyület molekulatömegét úgy határoztuk meg, hogy a kivonatot 3000 dalton molekulatömegig átengedő filteren (Centricon-30 filter, Amicon) szűrtük, s megállapítottuk, hogy a filteren átjutott-e a pollenműködést megőrző aktivitás. A V26 bibék és pollenek vizes kivonatait 100 pl reakciótérfogatban, 37 °C-on, 30 percig 0,025 egység papainnal kezeltük. Az enzimaktivitást azonos körülmények között BSA-val (0,5 mg/ml) végzett kezeléssel, és az emésztési termékek SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) végzett vizsgálatával bizonyítottuk. Sem a proteázos kezelés, sem a hőkezelés (100 ’C, 5 perc) nem gátolta a kivonatok azon képességét, hogy helyreállítsák a feltételes him-fertilis (CMF) pollenek csírázását és tömlőnövekedését.

Ezen eredmények együttesen azt jelzik, hogy a vad típusú pollenben jelenlévő flavonoidok közreműködnek a pollen csírázásában, s hogy a vad típusú bibe hasonló vegyületeket tartalmaz, amelyek a GMF pollenekben képesek kompenzálni a flavonoidok hiányát.

• · · ♦

5. példa: A flavonol feltételes hím-fertilitást helyreállító hatása

Az 1. példa szerinti flavonoid-deficiens pollenek biokémiai kiegészítését úgy végeztük, hogy csíráztató tápközegben CMF pollenek szuszpenziójához alacsony koncentrációjú (1 μΜ) kaempferolt (amely egy flavonol-aglikon) adtunk. Amint a 4. ábrán látható, a 12 órás növekedési idő alatt végzett egymás melletti összehasonlítások megerősítették, hogy a hlyreállított. működésű feltételes him-fertilitású pollenek (K+) esetében a csírázás egyszerre indult meg, s a pollentömlő növekedése azonos sebességű s mértékű volt a vad típusú, flavonol kiegészítéssel nem kezelt V26 pollenekhez viszonyítva. A pollenműködés helyreállítása majdnem teljes volt: a flavonoiddal kiegészített pollenek a V26 pollenekhez viszonyítva 80 %-os csírázási gyakoriságot mutattak. Azok a CMF pollenek, amelyekhez csak a DMSO oldószert adtuk (K-), nem mutattak jelentős csírázást (1-2 %), s a pollentömlők ha kihajtottak egyáltalán - sosem nőttek kétszeres pollenszemcse átmérőnél nagyobbra.

Annak igazolása érdekében, hogy a pollen csírázásának és a pollentömlő növekedésének helyreállítására képes vad típusú bibekivonatok kaempferolt tartalmaznak. a hidrolizálatlan kivonatokat HPLC-vel frakcionáltuk, és UV/látható fény abszorpciós spektroszkópiával analizáltuk. A V2 bibekivonatban retencióidővel és tipikus flavonolspektrummal (abszorpciós maximum 260 nm és 360 nm körül) •··· ·· · ·· · ·· · · · · ·· • ··· ·· · · · • · · · · ···«· • · ·· ··· ·· · rendelkező csúcsot detektáltunk (5. ábra és részlete). Ezt a feltételezett kaempferol csúcsot összegyűjtöttük, szárazra pároltuk, DMSO-ban reszuszpendáltuk, s az in vitro csíráztató tápközeghez adtuk, ahol teljes csírázási és pollentömlő növekedési reakciót váltott ki a CMF pollenből. Ezen aktív frakció eredeti kaempferol standarddal végzett újabb kromatografálása igazolta tisztaságát és azonosságát. A 150 bibével végzett analízis alapján az egy V26 bibében lévő kaempferol mennyiségét 60 ng-nak számítottuk. Feltételezve, hogy a bibe térfogata 34 μΐ (térfogatkiszorítás alapján), a V26 bibében a flavonolkoncentráció 6 /M-nak adódik, amely erős csírázási reakciót képes kiváltani. 150 CMF bibéből vagy 500 CMF portokból készített kivonatokkal végzett azonos vizsgálat nem eredményezett tipikus flavonoid spektrumot adó csúcsokat (ld. 5/B ábra). A V26 pollenekből és pcrtokokból készített kivonatok az 5. ábrán láthatóhoz hasonló, a kaempferolra utaló eluens csúccsal és retencióidövel rendelkező kromatogramot eredményezett, és csíráztató tápközegben CMF pollenekhez adva teljes mértékben stimulálta a pollenek csírázását. Ez az analízis azt bizonyítja, hogy a kaempferol jelen van a vad típusú pollenekben és portokokban.

A pollenműködést helyreállító aktivitáshoz szükséges szerkezeti jellemzők

A vad típusú petúniából származó pollen- és bibekivonatok a kaempferolon kívül tartalmaznak egyéb olyan vegyületeket is, • · · · • · * amelyek stimulálják a pollen csírázását és a pollentömlö növekedését (ld. 5/A ábra). Ennélfogva, a flavonoidok valamennyi fő osztályából (fiavonok, flavononok, flavonolok, izoflavonoidok, kalconok, anticianinok és katechinek) jellemző vegyületeket vizsgáltunk a pollenműködést helyreállító aktivitásra. A vizsgálatot a következők szerint végeztük. A petúnia pollenszemcséket PEG 4000 csíráztató tápközegben 1-2 x 10⁴/ml sűrűségűre szuszpendáltuk, s a szuszpenzió 100 pl-es alikvotjait 96 zsebes mikrotiter lemez zsebeibe helyeztük, s 150 percenkénti fordulattal végzett rázással szobahőmérsékleten inkubáltuk. A kiegészítő anyagokat a pollen hozzáadása előtt közvetlenül a csíráztató tápközeghez adtuk. A flavonoidok és egyéb vegyületek törzsoldatait közvetlenül dimetil-szulfoxidban (DMSO) készítettük, s ezeket valamennyi zsebhez a 4. táblázatban feltüntetett koncentrációkban adtuk. A DMSO koncentrációját valamennyi vizsgálatban állandó szinten (1 %) tartottuk. A polleneket csírázáskor értékeltük, amikor a pollentömlő hossza meghaladta a pollenszemcse átmérőjét. Gyakorlatilag valamennyi szemcse, amely kicsírázik, ötszörös pollenszemcse átmérőnél hosszabb tömlőt hajt. A V26 petúnia, amint az 1. példában leírtuk, kétféle. érett pollent termel: a pollenszemcsék kb. 25 %-a kicsi, nem mutat belső sajátságokat, és in vit.ro sohasem csírázik. Ilyenformán, a V26 pollenek teljes mértékű csírázásáról akkor beszélhetünk, ha a pollenszemcsék teljes mennyiségének 75 %-a kicsírázik. Az 1. példa szerinti CMF petúnia pollen ugyanezzel az aránnyal rendelkezik. A legtöbb pollenműködést helyreállító * « • · · • ···· kísérletben a maximális csirázási gyakoriság az életképes szemcsékre vonatkoztatva 89 % volt. Négy órás inkubálást követően minden vizsgálatban legalább 1000 pollenszemcsét értékeltünk. A tesztelt vegyületek legkisebb koncentrációit, amelyek szükségesek a csirázási reakció kiváltásához, a 3.

táblázatban soroljuk fel,

nincs reakció.	Azokat	a
koncentrációnál	20 %-	nál
eredményeznek,	>100	Mi'

táblázatban felsorolt.

melyben NR azt Jelenti, hogy vegyületeket., amelyek 100 4±í kisebb csirázási gyakoriságot jelzéssel Jelöljük. A 3.

kívül a nem flavonoid pvegyületeken kuinarinsavat, szalicilsavat, hidrokinont, klórossavat, dihidro-aszkorbinsavat., naftil-ftálsavat (NPA), 1-naftalin ecetsavat (NAA), indol-3-ecetsavat (IAA) és gibberellinsavat (GA3) is teszteltük, de ezek nem váltottak ki reakciót.

• · • · · * • · ···· • · «

3. TÁBLÁZAT

Vegyület	Reakcióhoz szükséges koncentráció (/±1)
Flavonolok
Galangin	1
Kaempferői	1
Zzo-ramnetin	1
Kvercetin	10
Mór in	10
Miricetin	100
Fiszetin	100
3-hidroxi-fiavon	>100
Dihidroxi-flavonol
Taxifölin	>100
Fiavonok
Fiavon	NR
7-hidroxi-flavon	NR
Apigenin	NR
Luteolin	NR
Flavononok
Flavonon	NR
Naringenin	NR
Eriodiktiol	NR

Amint a 3. táblázatból látható, az aglikon-flavonolok sikeresen állították helyre a CMF pollenek maximális csírázási gyakoriságát és tömlőnövekedési képességét, ···· ·· · ·4 · • · · · · « «« • ··· «···· * · · · · · ·>·« • · · · ·*· ·· « flavonoidok egyéb csoportjai közül azonban csak a közeli rokon dihidro-flavonol, a taxifolin váltott ki csekély mértékű (kb. 18 %) reakciót (100 koncentrációnál; 4. ábra). Jó néhány nem flavonoid vegyületcsoportot is teszteltünk, köztük fenolsavakat, antioxidánsokat és növényi növekedési hormonokat, de egyik sem volt képes a pollenek csírázását helyreállítani. Ebből eredően úgy tűnik, a pollenműködést - fiziológiailag megfelelő koncentrációknál helyreállító képesség a flavonolok sajátja.

A tesztelt flavonoidok csoportjai alapján a pollencsírázást a tömlőnövekedést illetően öt általános kívánalmat.

azonosítottunk. Mindenképpen szükséges a C” gyűrű 3-as szénatomján egy szubsztituálatlan hidroxilcsoport, illetve a Ο gyűrű 4-es helyzetében egy ketocsoport jelenléte. A maximális reakciói a C gyűrű 2-es és 3-as szénatomja közötti telítetlen kötés meglététől, illetve az A és B gyűrűkön lévő hidroxilcsoportok számától függ. Nagyon érdekes, hogy a 3-as helyzetű hidroxilcsoporton keresztül inaktívak.

miközben a növényi szövetekben, köztük a petúnia pollenjében és bibéjében megtalálható közül messze a leggyakoribbak. A kvercetin-3-0-glikozid és a rutin (kvercetin-3-0-ramnoglikozid) 100 koncentrációig végzett tesztelése nem eredményezett pollencsírázást. A C gyűrű 4-es helyzetében a ketocsoport szükségességét az a tény bizonyítja, hogy a katechin, melyben nincs ketocsoport, nem mutat aktivitást. A taxifolin es a kvercetin relatív hatékonyságának ···· ·· • ··♦ · · · · « • · * · ♦ • · V» ··· ·· «

- 50 összehasonlítása (kb. 18 % 100 μΜ-nál, illetve kb. 50 % 10 μΜ-nál) azt mutatja, hogy a ”C gyűrű 2-es és 3-as szénatomja közötti kettős kötés jelenléte a reakciót kb. harmincszorosára növeli. A kvercetin fiszetinnel vagy vagy

3-hidroxi-flavonnal végzett összehasonlítása azt mutatja, hogy az A gyűrű 5-ös vagy 7-es helyzetében minden további hidroxilcsoport hozzávetőleg tízszeresére növeli a reakciót.

Ez a növekedés nagymértékben függ a ”C gyűrű

5-hidroxilcscportja és szomszédos ketocsoportja közötti interakció stabilizáló hatásától. Végül, a B gyűrű hidroxil szubsztituensei nem szükségesek a teljes aktivitáshoz, sőt, a hidroxilcsoportok számának növekedése valójában az aktivitás csökkenését eredményezi (kaempferol, összehasonlítva a kvercetinnel és a muricetinnel). Ez a különbség a gyenge felvételnek vagy a több hidroxilcsoporttal rendelkező flavonolok polárisabb természete által okozott fokozott, nem specifikus kötődésnek köszönhető.

Néhány, nem aktív flavonoidról leírták, hogy a Rhizobium hüvelytermés rendszerben gátolják a szárcsomósodási gének aktív flavonoid-indukcióját (Djordjevic, M.A., Redmond, 3.VJ., Batley, M. és Long, S.K., Plánt Physiology, 88. 396-400, 1988). A pollenműködés helyreállítását, illetően nem aktív vegyületeket azon képességükre teszteltük, hogy képesek-e gátolni a flavonol-aglikonok működését. Az 1. példa szerinti feltételes hím-fertilitásű (CMF) polleneket csíráztató tápközegben - a kaempferol (1 jM) hozzáadása ···· ·· ·* *· · • · · ·· * · · • ··· · a 4 · · • · · · · · ·· ·· ··» »· · előtt - 30 percig 1-10 /dl koncentrációjú inaktív vegyülettel kezeltük.

A kísérletet úgy is elvégeztük, hogy az inaktív vegyületet a kaempferolt egyszerre,

1:1 vagy 10:1 arányban adtuk a pollenszuszpenzióhoz. A pollencsírázási gyakoriságot 4 órás inkubálás után értékeltük, s egyik tesztelt kombináció esetében sem tapasztaltunk gátló hatást.

Az alábbi inaktív vegyűleteket teszteltük: apigenin, kalcon.

eriodiktiol, fiavon, flavanon, luteolin, naringenin, katechin, klórossav, p-kumarinsav, hidrokinon és szalicilsav.

6. példa: UV hatások

Részben UV fényt abszorbeáló tulajdonságuk miatt úgy tartják, hogy a flavonoidok a növényekben UV-szűrőként funkcionálnak (W. Jahnen és K. Hahlbroch, Planta, 173. 453, 1983; valamint az abban felsorolt hivatkozások). Hogy meghatározzuk, vajon a flavonoid-deficiens pollen csírázásának hiánya az UV hatásoknak köszönhető-e, három változatban megvilágítás nélküli csírázási kísérletet végeztünk. A polleneket egyrészt összegyűjtött és 24 óráig teljes sötétségben vízben tartott· virágokból, másrészt frissen levett virágokról gyűjtöttük be. E két forrásból sötét· szobában vörös fény mellett, csíráztató tápközegben, flavonolokkal vagy azok nélkül pollenszuszpenziókat készítettünk. Harmadik variációként a frissen levágott virágokból származó pollenekből világosban készítettünk szuszpenziót, de a flavonolok oldatát sötétben adtuk hozzá.

A mintákat	lefóliáztuk és az 5. példában leírtak szerint
inkubáltuk.	A világítás a csírázási gyakoriságra flavonolok
hozzáadása,	illetve hiánya esetén nem gyakorolt kimutatható

hatást sem a V26 kontroll, sem a flavonoid-deficiens pollenek esetében. Hogy meghatározzuk, vajon az UV fény befolyásolja-e az önmegtermékenyítő képességet, érett petúnianövényeket több héten át 610 nm-es fényszúrő alatt neveltünk (L.P. Taylor és W.R. Briggs, Plánt. Cell, 2, 115, 1990). A petúnia bimbók kialakulása és megérése körülbelül két hetet vesz igénybe, így csak azokat a bimbókat teszteltük, amelyek azután alakultak ki, hogy a növényeket a fényszúrő alá helyeztük, s így az önmegermékenyítés idején nem érte őket 610 nm-nél kisebb hullámhosszú fény. A 910 kísérletből egy keresztezés sem eredményezett magvakat, de valamennyi V26 kontroll azonos körülmények között végzett, önkeresztezése telt tokterméseket adott.

7. példa: A flavonolos kezelési idő hatása

A teljes csírázáshoz és a maximális tömlőnövekedéshez szükséges flavonoidos kezelési időt úgy határoztuk meg, hogy variáltuk a csírázó pollen és a flavonol érintkezésének időtartamát. Flavonoid-deficiens pollen csíráztató tápközegben készített szuszpenzióját tartalmazó 60 x 15 mmes petricsészéhez a maximális hatás eléréséhez közelinek számított koncentrációjú kaempferolt adtunk (amely mosással még könnyen eltávolítható) (0,5 μΜ végkoncentráció), s a kapott szuszpenziót folyamatosan 150 percenkénti fordulattal • · · . ·_β ........

·· ·♦ ··· ·· · *· · kevertük. A 4. táblázatban feltüntetett időpontokban 400 ülés alikvotokat vettünk, ezeket centrifgugáltuk, a kaempferol eltávolítása érdekében 1 ml csíráztató tápközeggel mostuk, újra centrifugáltuk, 400 μΐ csíráztató tápközegben reszuszpendáltuk, és két részre osztottuk. Az egyik 100 μΐes alikvotot, ismételten 0,5 μΜ kaempferollal egészítettük ki (kontroll), de a másik adagot további flavonolos kezelés nélkül hagytuk tovább fejlődni (kezelt minta). A fejlődést az eredeti szuszpenzió elkészítésétől számítva 4 óráig

hagytuk folytatódni, majd a kezelt és a kontroll mintákban
egyaránt pollentömlő mutatjuk be	értékeltük a hosszát.· Az 4.	csírázási eredményeket TÁBLÁZAT	gyakoriságot és a a 4. táblázatban
	Kezelt pollen		Kontroll
Kezelési	Csírázás	Tömlő	Csírázás
idő (perc)	(%)*	hossza**	(%) *
0	3,7 + 1.5	2x	43,3 ± 2,5
10	6,6 ± 2,7	2x	55,5 ± 8,6
20	15,7 + 9,2	2-3x	47,9 ± 7,0
30	13,8 ± 1,7	2-3x	44,4 ± 3,7
60	38.9 ± 2.9	3x	48,4 ± 1.3
120	47,3 ± 3,6	>5x	47,7 + 2,2

* átlag + középérték szórása, n = 3 ** a pollenszemcse átmérőjéhez viszonyítva.

• β · · ··· · · ··· • · · ····· •· ·· · ·· ·

Amint a 4. táblázatban látható, csupán 10 perces kezelési idővel is a csírázási gyakoriság mérhető növekedését értük el. A maximális csírázási gyakoriság és tömlőnövekedés eléréséhez egy és két óra közötti kezelési idő szükséges.

8. példa: In vivő fertilitás helyreállítási vizsgálat.

A flavonol-aglikonok azon képességét, hogy a megporzás idején a pollenekhez adva helyreállítják a CMF petúniák önmegtermékenyítési képességét, oly módon teszteltük, hogy értékeltük a CMF petúniák hozzáadott flavonolok jelenlétében végzett önkeresztezéseiből származó sikeres megtermékenyítéseket. Az önbeporzás előtt a flavonolaglikonokat vagy közvetlenül a bibére vittük, vagy a frissen begyűjtött pollenekkel kevertük össze. A kapott magvak mennyisége alapján úgy tartjuk, az eljárás legeredményesebben akkor hajtható végre, ha a flavonolt az önbeporzást megelőzően 12-16 órával visszük a bibére. Kaempferol vagy kvercetin hozzáadásával 47 önkeresztezést végeztünk, s ezek majdnem 60 %-a termelt magvakat tartalmazó tokterméseket (47-ből 27). A magvak hüvelyenként! száma •31-től 287-ig terjedt, s a csírázási tesztekben az egyes toktermésekben a magvak több, mint 90 %-a volt életképes. A flavonolok hozzáadása nélkül végzett önkeresztezések (több, mint 30 kísérlet) egyike sem eredményezett magvakat.

A flavonoid-deficiens petúniák által mutatott domináns CMF sajátság szorosan kapcsolódik egy második, kanamicin-

rezisztenciára (KAN) vonatkozó domináns génhez (Napoli, C., Lemieux, C. és Jorgensen, R., Introduction to a Chimeric Chalcone Synthase Gene Intő Petúnia Results in Reversible Co-repression of Homologous Genes in Trans, Plánt Cell, 2, 279-289, 1990). A KAN markert a flavonoid-deficiens növények hozzáadott flavonol jelenlétében végzett önkeresztezésével előállított magvakban a CMF sajátság szegregálódásának tesztelésére használtuk. A frissen begyűjtött magvak felületét 20 %-os fehérítőszerrel sterilizáltuk, steril vízzel mostuk, s 30 percig 100 ppm GA3 oldatban áztattuk, majd 100 /.;g/ml kanamicint tartalmazó csíráztató csészében (1 x ΜΞ, 3 mM MES [pH = 5,6], 1 x Bs vitamin-elegy, 3 % szacharóz, 0,2 % szilárdító ágens) elvetettük. 23 °C-on 16/8 órás fényperiódussal végzett nevelés után a kanamicinrezisztenciát a kanamicinre érzékeny csíranövények vizsgálatával értékeltük. Az 5. táblázatban a P érték az egy szabadsági fokos khi-négyzet illeszkedési teszt tapasztalt szignifikancia-szintjét jelenti.

Csiranövények

Tok	összes	KAN	KAN	P (3:1)
1	75	58	17	0.74
9	65	50	15	0,83
3	81	59	or —	0,75
A 100	jUg/ml kanamicin	jelenlétében	csíráz	itatott magvak

kanamicinre vonatkozó rezisztenciát és érzékenységet illetően 3:1 arányban szeggregáltak, amint azt a heterozigóta domináns sajátságtól elvártuk.

9. példa: Szántóföldi kísérlet

A szántóföldi kísérletet a természetben előforduló, flavonoid-deficiens, hibás flavonoid működésű kukorica mutáns, az ún. fehér pollen mutáns alkalmazásával végeztük, amely fehér, működésképtelen polleneket termel, s önsteril (E.H. Coe, S.M. McCornick, S.A. Modena, J. Hered., 72, 318, 1981). Hozzáadott flavonoidok jelenlétében 45 önkeresztezést végeztünk, melyek mindegyike (100 %) teljesen telt kukoricacsöveket eredményezett, miközben a hozzáadott flavonoidok nélkül végzett önkeresztezések a normális magkészlet kevesebb, mint 1 %-át adták. Az alkalmazott fehér pollenű kukoricanövények a C2 és Whp génekben - a W23 beltenyésztett genetikai háttérbe bejuttatva - stabil recesszív mutációkat tartalmaznak. A fehér pollenű növényeket (o2,'c2 whp/whp; a CHS egy funkcionális másolatát ( C2/c2 whp/whp} hordozó izogén növényből származó pollenekkel keresztezve tartottuk fenn. A növények az önkeresztezésekben és a testvérkeresztezésekben hím-sterilek voltak, s egyik szövetben sem (beleértve a polleneket és a magvakat) állítottak elő látható flavonoid pigmenteket. Standard genetikai eljárásokat alkalmaztunk a földeken, annak biztosítása érdekében, hogy a fehér pollenű növények bibéire ne kerüljenek szennyező pollenek. A fehér pollenű növényekkel beültetett területet ráadásul pigmentált magvakat termelő változattal vettük körül, hogy a szennyező magvakat azonnal felismerhessük. 50-100 növény címeréből összegyűjtöttük a fehér polleneket, s a készletet két részre osztottuk. Az egyik részletet kezelés nélkül használtuk a keresztezésekhez, míg a másikat hozzávetőleg 20:1 arányban száraz flavonoidokkal (kvercetinnel, kaempferollal, vagy a kettő 50-50 %-os keverékével) kevertük össze. A fehér pollenű kukorica bibéit a kezeletlen, illetve a flavonoiddal kezelt pollenekkel poroztuk meg, majd a csöveket azonnal becsomagoltuk. Az érett csöveket, a megporzás után 45 nappal szedtük le. A fehér pollenű mutáns keresztezései általában kb. 200 magvat (szemet) ereményeznek csövenként, s rendszerint ezt a mennyiséget kaptuk a biokémiai kiegészítéssel végzett önkeresztezések során is. Hozzáadott flavonolok jelenlétében összesen 45 önkeresztezést végeztünk, melyek közül valamennyi (100 %) telített csöveket eredményezett, miközben a hozzáadott flavonolok nélkül végzett önkeresztezések (45 kísérlet) a normális magkészlet

kevesebb,	mint 1 %-át	eredményezték.
A leírt	kísérletek	azt bizonyítják, hogy a flavonoidok az
alábbiak	értelmében	szükségesek a pollenműködéshez: (i) a

vad típusú bibék és pollenek metanolos és vizes kivonatai képesek teljes mértékben helyreállítani a flavonoiddeficiens pollenek csírázását és tömlőnövekedését; (ii) az említett kivonatok ugyanazon flavonolokat tartalmazzák, mint amelyek a találmányban leírt in vitro fertilitást helyreállító vizsgálatok során aktivitást mutattak;

• · t

Cili) a pollencsírázást helyreállító, a tömlőnövekedést in vitro helyreállító, és az in vivő teljes számú magvakat biztosító képesség a flavonoidok csak egy specifikus csoportjára, a flavonol-aglikonokra korlátozódik;

(ív) a flavonol hatásos koncentrációja szerkezeti sajátságoktól függően változik, de jó néhány vegyület 10 uM-nál kisebb (ezen vegyületek fiziológiai koncentrációinál jóval kisebb) koncentrációban is határozott hatást mutat.

A falvonoidok gyakorlatilag valamennyi növény osztályban termelődnek, a moháktól és a harasztoktól kezdve a nyitvaés zárvatermőkig. Régebben a flavonoidok vizsgálatához gyakran növénygyűjteményekből származó szárított levél és gyökér mintákat használtak; ennek megfelelően, nincs megfelelő információnk arra vonatkozólag, hogy a pollen flavonoidok elterjedése mennyire széles körű. A flavonoidok különféle növényi szövetekben való általános jelenléte, s az a tény, hogy jó néhány, egymástól igen eltérő fajból származó pollenkivonatban is kimutatták, bizonyíthatja, hogy a flavonoidok a pollenek általános összetevői. A legtöbb növényi flavonol 3-0-glikozilált változatban fordul elő (J.

B. Harbome és C. A. Williams, The Flavonoids, Advanoes in

Research Sincs 1980, szerk.: J. B. Harbome; Chapman and

Hail, London. 7. és 8. fejezet, 1988), s ez az uralkodó forma a petúnia pollenjében is (0. Ceska és E.D. Soyles,

Phytochemistry, 23. 1822, 1984). Csak az ágiikon alak képes helyreállítani a pollen működését, ami azt sugallja, hogy vagy eredetileg jelen van az ágiikon (detektálatlan

alacsony szinten), vagy glikozidáz aktivitás szükséges a megtermékenyítéshez nélkülözhetetlen aglikonok előállításához.

A megtermékenyítési folyamat befolyásolásának természetes kiindulási pontját a pollen képezi. A flavonoid-expresszió megszűnése, ami feltételesen hím-fertilis (CMF) növényeket eredményez, természetes (az ivarsejteket passzív állapotban tartó) gametosztátként-, s nem gametocidként hat. A teljes hím ivarműködés a flavonoid-deficiens pollenhez külsőleg adott flavonolokkal állítható helyre. A magasabbrendű növények megtermékenyítés! folyamataiban szereplő faktor azonosításán kívül jelentős előny származik abból is, hogy hibrid magvak előállításához reverzibilis hím-steril rendszert fejlesztünk ki.

Ha a találmány szerint egy, a flavonol-termelést befolyásoló gént indukálható promoterrel kapcsolunk össze, a sterilitás szabályozhatóvá válik. Egy ilyen, már ismert gén a c2 és Whp CHS géneket foglalja magában (Coe és mtsi., Id. fentebb). Más lehetőség szerint. a leírt Antírrhinum F3H szekvencia alapján PCR oligonukleotid primerek (Saiki, R.K. 1990, Id. fentebb) alkalmazásával hibridizációs próba készítésével izolálható az F3H gén.

Ilyenformán. a flavcnolok termelését szabályozó gén alkalmazásával szabályozhatjuk a sterilitást.

*·* · · · » • · · · ·♦*»

A találmány értelmében, a flavonol-termelést szabályozó gént általában egy indukálható promoterrel együtt visszük be a növénybe. A növény steril lesz, mivel a kritikus flavonolok nem termelődnek, de a promoter indukálásával a növény fertilissé tehető. A normális, fertilis növényben található gén, amely a flavonol termeléséért felelős, az alábbiakban leirt módszerek bármelyikével inaktiválható, mint például visszakeresztezéssel vagy homológ rekombinációval.

Indukálható promoterek

A találmány gyakorlati megvalósításában a hím-fertilitásért felelős klónozott génről eltávolítjuk a promoter régiót, s olyan promoterrel helyettesítjük, amely csak specifikus, külső ingerre reagál, miáltal a gén csak a külső inger hatására fog átíródni. Amíg a gén nem íródik át, génterméke amely szükséges a pollen teljes kifejlődéséhez - nem termelődik. Ez a pollenfejlődés egy vagy több biokémiai.'fiziológiai útjának gátlását okozza, ami hímsterilitást eredményez. A növény csak a kiválasztott promotert aktiváló specifikus inger hatására tehető fertilissé.

A találmány gyakorlatában alkalmazható érzékeny promoter-rendszerre példa a kukorica glutation-S-transzferáz (GST) rendszere. A GST-k egy olyan enzimcsaládot alkotnak, melynek tagjai számos, gyakran kikelés előtti herbicidként használt hidrofób, elektrofil vegyület lebontására képesek • · ·

(Wiegand és mtsi, Messenger RNA Encoding a Glutathione-STransferase Responsible fór Herbicide Tolerance in Maize is Induced in Response to Safener Treatment, Plánt Molecular Biology, Z, 235-243, 1986). Felfedezték, hogy a kukoricamagvakat GST-kel kezelve növelhető a kukorica herbicid-toleranciája. Vizsgálatokkal kimutatták, hogy a GST-k közvetlenül szerepet játszanak a megnövelt tolerancia kiváltásában. Ezt a működést elsődlegesen egy specifikus, 1,1 kb-os mRNS transzkripciós termék közvetíti. Röviden; a kukoricának van egy eredendően jelenlevő, természetes állapotban néma génje, amely képes reagálni a GST-re, s amely géntermék előállítására indukálható. Ilyenformán, a találmány egyik megvalósítási módja értelmében, a GST-re érzékeny génről eltávolítjuk a promotert, s a hím-fertilitás génhez kapcsoljuk, amelyről már korábban eltávolítottuk a természetes promoterét. Ez a génsebészetileg kezelt gén a külső vegyszeres ingerre reagáló promoter és a fertilis pollen sikeres kifejlődéséért felelős gén kombinációjából áll.

Génbevitel

A tudományban klónozott DNS kukoricába történő bevitelére számos módszer ismeretes. Ezek közé tartozik a kukorica protoplasztok elektroporációval elősegített DNS felvétele (Rhodes és mts, Genetically Transformed Maize Plants from Protoplasts, Science, 240. E1988. 04. 08.]); a kukorica protoplasztok polietilén-glikolos kezelése (Lyznik és mtsi,

- 62 Stable Co-Transformation of Maize Protoplasts with Gus A and Neo Genes, Plánt Molecular Biology, 13, 151-161, 1989), és a kukoricasejtek DNS-t hordozó mikrolövedékekkel végzett bombázása (Kiéin és mtsi, Genetic Transformation of Maize Cells by Partiele Bombardment, Plánt Physiol., 21, 440-444, 1989; Kiéin és mtsi, Factors Influencing Gene Delivery intő Zea Mays Cells by High-Velocity Microprojectiles. Bio/Technology, fi, 1988. május). Valamennyi forrást hivatkozásul közöljük.

A fenti technikák mindegyikének vannak előnyei és hátrányai. Mindegyikben egy plazmidból származó DNS-t kezelnek génsebészeti eljárásokkal, oly módon, hogy a DNS ne csak a szóban forgó gént, hanem szelektálható vagy screenelhető marker géneket is tartalmazzon. A szelektálható marker gén csak azon sejtek kiszelektálására alkalmas, amelyek a plazmid teljes másolatait tartalmazzák (a konstrukció olyan, hogy a szóban forgó gén és a szelektálható vagy marker gén egy egységként vivődik át). A screenelhető gén csak azon sejtek sikeres tenyésztésének ellenőrzésére nyújt lehetőséget, amelyek hordozzák a kérdéses gént. A neomicinfoszfotranszferáz II (NPT II) egy általánosan használt szelektálható marker gén. Ez a gén rezisztenciát biztosít a kanamicinre, amely közvetlenül adható a tápközeghez, amelyen a sejtek fejlődnek. A növényi sejtek normális esetben érzékenyek a kanamicinre, s ennek eredményeként elpusztulnak. Az NPT II gén jelenléte elhárítja a kanamicin hatását, s valamennyi, ezzel a génnel rendelkező sejt ·· • · · • ♦·· életképes marad. A találmány gyakorlati megvalósításában alkalmazható másik szelektálható marker gén a glüfozinát (Easta) herbicid elleni rezisztenciát biztosító gén. Egy általánosan használt screenelhető gén a β-glükuronidáz gén (GUS), amelynek jelenléte hisztokémiai reakcióval karakterizálható, melynek során a feltételezett transzformált sejteket GUS vizsgálati oldattal kezeljük. Megfelelő inkubálás után a GUS gént tartalmazó sejtek megkékülnek. Egy másik screenelhető gén az antocianinbioszintézis transzkripciós aktivátora, amit Bowen és mtsi. az 1989. augusztus 1-én benyújtott, U.S.S.N. 387 739 számú, elbírálás alatt álló szabadalmi bejelentésben írtak le. Ez a gén az antocianin pigment szintézisét eredményezi. Az ezt a gént tartalmazói plazmiddal transzformált sejtek pirossá válnak. Előnyösen, a plazmid szelektálható és screenelhető marker gént egyaránt tartalmaz,

A fenti gének közül egyet vagy többet tartalmazó plazmidot a korábban említett technikák valamelyikével kukorica protoplasztokba vagy kalluszsejbekbe visszük. Ha a marker gén szelektálható gén, úgy a megfelelő fitotoxikus szerrel végzett szelekció után csak azok a sejtek fognak életben maradni, amelyek tartalmazzák a bevitt DNS konstrukciót. Ha azonosítottuk és szaporítottuk a megfelelő sejteket, regeneráljuk a növényeket. A transzformált növények utódait tesztelni kell, hogy megbizonyosodjunk a DNS konstrukció növényi genomba való sikeres beépüléséről.

··

A szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a leírt eljárásokkal működésképtelenné tesszük a természetes fertilitás gént, s azt homológ rekombinációval helyettesítjük. Az eredeti gén inaktiválásának másik módja a jól ismert visszakeresztezés, amelynek egyik példáját a 9. példában írtuk le.

Egy specifikus lehetőség szerint az F3II-t, CHI-t vagy CHS-t kódoló gén eltávolítható a növényből, gátolható vagy más módon károsítható, annak érdekében, hogy a növényben megakadályozzuk az F3H enzim expresszálódását. Nyilvánvaló az is, hogy az F3H-aktivitás az F3II in vivő szintézisének gátlásán felül az F3H-val közvetlenül reagáló részecskékkel is gátolható, melyek inaktiválják vagy károsítják az F3H hidroxiláz működését. A flavonolok termelése a fentieken kívül a CHI-aktivitás gátlásával is károsítható; ez a

lehetőség azonban	kevésbé előnyös, mivel CHI hiányában a
kalcon-naringenin	naringeninné történő átalakulása kis
mértékben spontán	is végbemegy. Ez csak egy a találmány

tárgyába tartozó megvalósítási módok változatai közül.

Sterilitás-szelekció és a fertilitás helyreállítása

Miután a gént bevittük a növénybe, kiválasztjuk a megfelelő, azaz hím-steril növényeket. Ezek a növények amiatt hímsterilek, hogy az izolált és klónozott hím-fertilitás gén nem rendelkezik a természetes promoterével, s ezáltal nem termeli a sikeres pollenfejlődéshez kulcsfontosságú

• · · · · · · ··♦

géntermékét.	Ilyenformán, a génsebészetileg kezelt gén a
természetes	gén recesszív mutáns alléljeként működik. A
hagyományos	növényi biotechnológiában a kívánt genotípus
azonosítása,	és az azt követő transzformálás és regenerálás

után a növényeket a kívánt genotípus visszanyerése érdekében önbeporzással szaporítják tovább. A találmány gyakorlati megvalósításában azonban a kívánt genotípus az első generációban nem szaporítható önbeporzással, mivel az első generációs növények hím-sterilek. Hogy utódokat nyerjünk, a fertilitást a növények olyan vegyülettel végzett permetezésével kell indukálni, amely a megváltoztatott promot.er aktiválásával indukálja a gén transzkripcióját. A GST promoterek esetében ez a vegyület előnyösen GST-indukáló vegyület, mint például az N,M-diallil-2,2-diklór-acetamid. A hím-fértilitás génhez kapcsolódott promoter reagál erre a vegyületre, s a gén transzkripciójának beindulását okozza.

Amint ez	bekövetkezik. a gén normális géntermékét hozza
létre, s	bizonyos mértékű hím-fértilitás indukálódik. Az e
növényből	származó polleneket az eredetileg kiválasztott

genotípus megporzásához alkalmazzuk.

A kívánt genotípus kezdeti izolálása és szaporítása után az eljárás egyszerűbb. Csak a hibrid keresztezésekekben nőivarú szüleként alkalmazott. beltenyésztett egyedeket transzformáltuk a hím-steril variánsokba. Transzformálásuk után a him-steril/női fertilis magvak mennyiségét növelni kell. Ezt úgy valóűsítjuk meg, hogy a transzformánsokat más kukoricapollen forrásoktól elkülönített területre ültetjük, s olyan vegyülettel permetezzük, amelyre a promoter reagál. A permetezéssel indukáljuk a génhez kapcsolódó promotert, hogy beindítsa a gén transzkripcióját. Ez bizonyos mértékű fertilitást eredményez. E rendszer rendkívüli előnyét egyéb rendszerekkel összehasonlítva (mint például a PCT/EP89/00495 számú nemzetközi szabadalmi bejelentésen alapuló W089/10396 számú PCT közrebocsátái iratban [Mariani és mtsi] leírt rendszer), melyekben a sterilitást indukálják, az jelenti, hogy a kezelésnek nem szükséges 100 %-ban hatásosnak lenni, mivel normális esetben a kukoricanövény sokkal több pollent termel, mint amennyi ténylegesen szükséges a rendelkezésre álló bibék megtermékenyítéséhez. Ezáltal még a fertilitás alacsony százalékú helyreállítása is hatásos a magvak mennyiségének megfelelő szintű növeléséhez, miközben a hibrid magvak termelésekor nem következik be önbeporzás, mivel a találmány szerinti növények eredetileg hím-sterilek, s fertilissé tételükhöz van szükség a kezelésre. Azokban a rendeszerekben, amelyekben a sterilitást indukálják, a sterilitás indukálásának 100 %-ban hatásosnak kell lennie ahhoz, hogy a hibrid magvak előállításakor· elkerüljék az önbeporzást.

Valamennyi betakarított mag homozigóta és hím-steril lesz.

mivel a fertilitást a fertilitást. indukált vegyszerrel csak a szülői generációban állítottuk helyre. Ezeket a magvakat azután nőivarú szülőkként hibrid magvak előállításához használjuk. Mivel a növények hím-sterilek, címerezésre nincs szükség. Az ilyen magvakból származó hibrid növények

- 67 hím-fertilisek, mivel az utódok a nőivarú szülőtől egy módosított gént, a hímivarú szülőtől egy normális gént örököltek. A hibrid növények pcllentermelése normális.

Miközben az eddigi leírással a találmány előnyben részesített megvalósításí módjait jellemeztük, nyilvánvaló, hogy különböző módosítások hajthatók végre anélkül, hogy eltérnénk a találmány tárgyától és jellegétől.

Claims (15)

1. Eljárás öröklődő, külsőleg kontrollálható himsterilitás létrehozására növényekben, azzal jellemezve, hogy

a) kiválasztunk egy, a növényben a flavonol-termelést befolyásoló gént;

b) a kiválasztott gént klónozzuk;

c) a klónozott gént expressziós szekvenciában külső szabályozásra érzékeny promoterrel kapcsoljuk össze;

d) az expressziós szekvenciát a növény mag genomjába inszertáljuk; és

e) inaktiváljuk azt a gént·, amely a növény eredeti mag genomjából klónozott gén termékét kódolja.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képlet szerinti flavonol - melyben Rí, R2, R3, R<, Re, Rt és Rs jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport - termelését befolyásoló gént alkalmazunk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan flavonol termelését befolyásoló gént alkalmazunk, melyben az Rí. Rs. Rs, E4 és Re csoportok közül nem több, mint kettő jelöl hidroxilcsoportot vagy metoxicsoportot, míg a többi jelentése hidrogénatom, továbbá Rt és Rs jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy metoxicsoport.

• · · · • · «

• ··

4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fertilitást helyreállító flavonolt a galangin, a kaempferol, az izo-ramnetin a kvercetin és a morin közül választjuk ki.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy flavonon-3-hidroxiláz termelését befolyásoló gént alkalmazunk.

6. Eljárás öröklődő, külsőleg szabályozható hímsterilitással rendelkező növény szaporítására, melyben a hím-sterilitást úgy alakítjuk ki, hogy a növényben a flavonol-termelést befolyásoló gént ugyanazon génterméket kódoló, de expressziós szekvenciában egy külső szabályozásra érzékeny promoterhez kapcsolt génnel helyettesítjük, azzal jellemezve, hogy

a) elvetjük a növény magjait, hogy fejlődő, hím-steril növényeket neveljünk;

b) a növényeket olyan körülmények között nevelve, amelyek indukálják a promotert, előidézve ezzel a gén expresszióját, amely a növényben flavonol-termelést eredményez, a fejlődő növények him-fertilissé való átalakulását indukáljuk;

c) a fejlődő növényekez magvak termelése érdekében elkülönítve megporozzuk; és

d) betakarítjuk a magvakat.

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (I) képlet szerinti flavonol - melyben Rí, R2, Rs, ·« · ·♦ • w • « * • ···«

R4, Re, Rt és Re jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport - termelését befolyásoló gént alkalmazunk.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan flavonol termelését befolyásoló gént alkalmazunk, melyben az Rí, Rz, Rs, R4 és Re csoportok közül nem több, mint kettő jelöl hidroxilcsoportot vagy metoxicsoportot, míg a többi jelentése hidrogénatom, továbbá Rt és Rs jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy metoxicsoport.

9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fertilitást helyreállító flavonolt a galangin, a kaempferol, az zzc-ramnetin a kvercetin és a morin közül választjuk ki.

10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy flavonon-3-hidroxiláz termelését befolyásoló gént alkalmazunk.

11. Eljárás hibrid magvak termelésére, azzal jellemezve, hogy

a) keresztezés! megporzásnak megfelelően egy szelektált, hím-fertilis hím szülői vonalból származó első magot és egy második magot ültetünk egymás mellé, mely utóbbi szelektált nőivarú vonalból származik, amely annak következtében, hogy a flavonol-termelést befolyásoló gént egy flavcnol-termelést befolyásoló, expressziós szekvenciában külső szabályozásra ·»♦· «4

- 71 érzékeny, indukálható promoterrel összekapcsolt génnel helyettesítettük, hím-steril;

b) a magot a gén expresszióját nem indukáló körülmények között érett növénnyé neveljük;

c) a hím-steril nőivarú növényt a hím-fertilis hímivarú növénnyel megporozva keresztezzük; és

d) a hím-steril nőivarú növényekről betakarítjuk a hibrid magvakat.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy az (I) képlet szerinti flavonol - melyben Rí, R2, R3, P.4, Rs. Rt és Rs jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport - termelését befolyásoló gént, alkalmazunk.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan flavonol termelését befolyásoló gént alkalmazunk, melyben az Rí, R2, Rs, R4 és Re- csoportok közül nem több, mint kettő jelöl hidroxilcsoportot vagy metoxicsoportot, míg a többi jelentése hidrogénatom, továbbá Rt és Ra jelentése hidrogénatom, hidroxil- vagy metoxicsoport.

14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fertilitást helyreállító flavonolt a galangin, a kaempferol. az ízc-ramnetin a kvercetin és a morin közül választjuk ki.

15. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy flavonon-3-hidroxiláz termelését befolyásoló gént alkalmazunk.

A meghatalmazott: DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft. z 8. l \..... i / 1 ' f \ 7 1 i - A ^: VŐ ; ' '. v/^r