HUT73395A - Process for preparing glyoxylic acid/dialkyl aminomethylphosphonate mixtures - Google Patents
Process for preparing glyoxylic acid/dialkyl aminomethylphosphonate mixtures Download PDFInfo
- Publication number
- HUT73395A HUT73395A HU9503389A HU9503389A HUT73395A HU T73395 A HUT73395 A HU T73395A HU 9503389 A HU9503389 A HU 9503389A HU 9503389 A HU9503389 A HU 9503389A HU T73395 A HUT73395 A HU T73395A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- catalase
- acid
- glycolate
- glycolate oxidase
- reaction
- Prior art date
Links
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 119
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 24
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N (aminomethyl)phosphonic acid Chemical compound NCP(O)(O)=O MGRVRXRGTBOSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title description 43
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 87
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 87
- 108010062584 glycollate oxidase Proteins 0.000 claims description 71
- 102100038837 2-Hydroxyacid oxidase 1 Human genes 0.000 claims description 65
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 26
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M Glycolate Chemical compound OCC([O-])=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 23
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 20
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 19
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 18
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 claims description 17
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 8
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 4
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 46
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 42
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 41
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- UIBCDEFKKLRXHR-UHFFFAOYSA-N diethoxyphosphorylmethanamine Chemical compound CCOP(=O)(CN)OCC UIBCDEFKKLRXHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N flavin mononucleotide Chemical compound OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 27
- 229940013640 flavin mononucleotide Drugs 0.000 description 27
- FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N flavin mononucleotide Natural products OP(=O)(O)OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O FVTCRASFADXXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000011768 flavin mononucleotide Substances 0.000 description 27
- 235000019231 riboflavin-5'-phosphate Nutrition 0.000 description 27
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 22
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N isobutyric acid Chemical compound CC(C)C(O)=O KQNPFQTWMSNSAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 13
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 13
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 241000219315 Spinacia Species 0.000 description 11
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 11
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 11
- -1 ethylenediamine Chemical class 0.000 description 11
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 10
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 9
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910001882 dioxygen Inorganic materials 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 4
- 238000005984 hydrogenation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108030001056 (S)-2-hydroxy-acid oxidases Proteins 0.000 description 3
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 description 3
- FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N N-3,5-dichloro-4-hydroxyphenyl-1,4-benzoquinone imine Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=C(Cl)C=C1N=C1C=CC(=O)C=C1 FBWADIKARMIWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100190845 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pmp-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 3
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 3
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 3
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 231100000208 phytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 102100038838 2-Hydroxyacid oxidase 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000698 Formate Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000564 Raney nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MWDNZMWVENFVHT-UHFFFAOYSA-L (2-decoxy-2-oxoethyl)-[2-[2-[(2-decoxy-2-oxoethyl)-dimethylazaniumyl]ethylsulfanyl]ethyl]-dimethylazanium;dichloride Chemical class [Cl-].[Cl-].CCCCCCCCCCOC(=O)C[N+](C)(C)CCSCC[N+](C)(C)CC(=O)OCCCCCCCCCC MWDNZMWVENFVHT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- UBUHDVBNVFCACG-UHFFFAOYSA-N 2-(diethoxyphosphorylmethylamino)acetic acid Chemical compound CCOP(=O)(OCC)CNCC(O)=O UBUHDVBNVFCACG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OORRCVPWRPVJEK-UHFFFAOYSA-N 2-oxidanylethanoic acid Chemical compound OCC(O)=O.OCC(O)=O OORRCVPWRPVJEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108030002649 Glyoxylate oxidases Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 239000007868 Raney catalyst Substances 0.000 description 1
- NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N Raney nickel Chemical compound [Al].[Ni] NPXOKRUENSOPAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N Ruthenium Chemical compound [Ru] KJTLSVCANCCWHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001464837 Viridiplantae Species 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DSVGQVZAZSZEEX-UHFFFAOYSA-N [C].[Pt] Chemical compound [C].[Pt] DSVGQVZAZSZEEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000008044 alkali metal hydroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000021336 beef liver Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- SXDBWCPKPHAZSM-UHFFFAOYSA-N bromic acid Chemical compound OBr(=O)=O SXDBWCPKPHAZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000009903 catalytic hydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- FMQXRRZIHURSLR-UHFFFAOYSA-N dioxido(oxo)silane;nickel(2+) Chemical compound [Ni+2].[O-][Si]([O-])=O FMQXRRZIHURSLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 150000002373 hemiacetals Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 description 1
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000005605 isobutyric acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- MUMZUERVLWJKNR-UHFFFAOYSA-N oxoplatinum Chemical compound [Pt]=O MUMZUERVLWJKNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O phosphonium Chemical class [PH4+] XYFCBTPGUUZFHI-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 150000004714 phosphonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000005648 plant growth regulator Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003446 platinum oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052707 ruthenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/3804—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)] not used, see subgroups
- C07F9/3808—Acyclic saturated acids which can have further substituents on alkyl
- C07F9/3813—N-Phosphonomethylglycine; Salts or complexes thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
ELJÁRÁS GLIOXILSAV ÉS DIALKIL-AMINO-METIL-FOSZFONÁT
ELEGYÉNEK ELŐÁLLÍTÁSÁRA
A találmány glioxilsav és dialkil-amino-metil-foszfonát elegyeinek előállítására szolgáló eljárásra vonatkozik, melynek során glioxilsavat vizes oldatban oxigénnel reagáltatunk dialkil-amino-metil-szulfonát jelenlétében, katalizátorként glikolát-oxidáz [ (S)-2-hidroxisav-oxidáz, EC 1.1.3.15] és kataláz (EC 1.11.1.6) enzimeket alkalmazunk. Az így keletkező glioxilsav és dialkil-amino-metil-foszfonát elegyek megfelelő intermedierek a széles spektrumú, posztemergens fitotoxikus és herbicid hatású, sokfajta növény növekedésének szabályozására eredményesen alkalmazható N-(foszfono-metil)-glicin előállításában.
A leveles zöld növényekben, valamint az emlős sejtekben általánosan előforduló glikolát-oxidáz enzim a glikolsav glioxilsavvá történő oxidációját katalizálja, melynek során hidrogén-peroxid keletkezik:
HOCH2COOH + 02 -----> OCHCOOH + H2O2
N. E. Tolbert és munkatársai [J. Bioi. Chem., 181, 905-914 (1949)] tudósítottak először olyan enzimről, melyet dohánylevélből extraháltak, és a glikolsav hangyasavvá és szén-dioxiddá történő oxidációját katalizálta, glioxilsav intermedieren keresztül. Bizonyos vegyületek, például etilén-diamin hozzáadásával a glioxilsav intermedier továbboxidálódása kor82597-7340-GI látozható volt. Az oxidációt 8 körüli pH értéken, általában 3 - 40 mM glikolsav koncentráció alkalmazásával végezték. A glikolát oxidációja szempontjából optimális pH értéknek 8,9 adódott. Említést tettek arról is, hogy az oxálsav (100 mM) gátolja a glikolát-oxidáz emzim működését. Hasonlóképpen K. E. Richardson és N. E. Tolbert [J. Bioi. Chem., 236, 12801284 (1961)] arról számoltak be, hogy a trisz (hidroxi-metil)-amino-metánt (TRIS) tartalmazó pufferek gátolták a~ oxálsav képződését a glikolsav glikolát-oxidáz katalizálta cxidációja során. C. 0. Clagett, N. E. Tolbert és R. H. Burris [J. Bioi. Chem., 178, 977-987 (1949)] vizsgálatai szerint a glikolsav oxigénnel történő, glikolát-oxidáz által katalizál- reakciójának pH optimuma a 7,8 és 8,6 közötti, az optimális hőmérséklet pedig a 35 és 40 °C közötti tartományban van.
I. Zelitch és S. Ochoa [J. Bioi. Chem., 201, 707-718 (1953)], valamint J. C. Robinson és munkatársai [J. Bioi. Chem., 237, 2001-2009 (1962)] arról tudósítottak, hogy a hangyasav és a széndioxid képződését a spenótból származó glikolát-oxidáz katalizálta glikolsav-oxidáció során a hídrogén-peroxid és a glioxilsav nem-enzimatikus reakciója eredményezi. Azt is megfigyelték, hogy a hidrogén-peroxid bomlását elősegítő kataláz enzim hozzáadása a hangyasav és széndioxid képződésének visszaszorításával, jelentős mértékben fokozta az elérhető glioxilsav-hozamot. Azt tapasztalták, hogy FMN (flavin-mononukleotid) hozzáadása nagymértékben stabilizálta a glikolát-oxidáz enzimet.
• *
N. A. Frigerio és H. A. Harbury [J. Bioi. Chem., 231, 135-157 (1958)] a spenótból származó glikolát-oxidáz enzim előállítását és tulajdonságait vizsgálták. A tisztított enzim oldatban meglehetősen instabilnak mutatkozott, amit egyrészt azzal magyaráztak, hogy a flavin-mononukleotid (FMN) viszonylag gyengén kötődik az enzim aktív centrumához, másrészt pedig azzal, hogy az enzimatikus aktivitással rendelkező tetramer és/vagy oktamer emzimmolekulák hajlamosak inaktív dimerré vagy monomerré disszociálni, melyek azután irreverzibilisen aggregálódnak és kicsapódnak. FMN (flavin-mononukleotid) hozzáadása az enzimoldathoz jelentős mértékben növelte annak stabilitását, a magas fehérjekoncentráció és a nagy ionerősség pedig az enzimet segített oktamer vagy tetramer állapotban tartani.
Glioxilsav és amino-metil-foszfonsav (AMPA) keverékek előállítására szolgáló eljárást ismertet az US 5135860 számú szabadalmi leírás. Glikolsavat és oxigént vizes oldatban reagáltatnak AMPA, valamint két enzim, a glikolát-oxidáz és a kataláz jelenlétében. Az eljárásban kimutatják a kataláz (a hangyasav képződéséért felelős hidrogén-peroxid melléktermék lebontását végző enzim), valamint a glioxiláttal a további oxidációval szemben ellenálló N-szubsztituált hemiamin és/vagy imin komplex kialakítására képes amin adalék, az AMPA szinergetikus hatását. A leírás szerint ilyen módon 92 %-os glioxilsav-hozam érhető el, és a kapott glioxilsav és AMPA elegy felhasználható a posztemergens fitotoxikus és herbicid il hatású Ν-(foszfono-metil)-glicin előállítására.
A jelen találmány glioxilsav és dialkil-amino-metilfoszfonát elegyek előállítására vonatkozik, melynek során glioxilsavat vizes oldatban oxigénnel reagáltatunk dialkil-amino-metil-szulfonát és két enzim, glikolát-oxidáz [(S)—2— -hidroxisav-oxidáz, EC 1.1.3.15] és kataláz (EC 1.11.1.6) enzimek jelenlétében. A korábban erre a célra alkalmazott amino-metil-foszfonsav (AMPA) dialkil-amino-foszfonátra történő cseréje meglepő módon fokozza a glioxilsav-hozamot olyan esetekben, midőn az AMPA gátolja a kataláz aktivitást. Az így keletkező glioxilsav és dialkil-amino-metil-foszfonát elegyek megfelelő intermedierek a posztemergens fitotoxikus és herbicid hatású N-(foszfono-metil)-glicin előállítására.
Az US-5135860 számú szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, amelynek során a glioxilsav és amino-metil-foszfonsav (AMPA) elegyek előállítása spenótból származó glikolát-oxidáz, valamint egy vízoldható kataláz (pl. Aspergillus niger mikroorganizmusból származó vízoldható kataláz) enzimek segítségével történik. Az US-5180846 számú szabadalmi leírás olyan eljárást ismertet, melynek értelmében hidrogénezéssel állítanak elő N-(foszfono-metil)-glicint. Az US 07/951497 számú szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárás szerint a glioxilsav/AMPA elegyek előállítása során olyan, genetikailag módosított mikroorganizmust használnak katalizátorként, melyben az endogén kataláz mellett a spenót glioxilát-oxidáz enzim is kifejeződik. Megfigyelték, hogy az AMPA reverzibi·· «·♦· l'*t 1, :··. ·’ : ·· ·· · ..· ·..· lisen gátolja a Hansenula polymorpha vagy a Pichia pastoris transzformánsok endogén kataláz enzimjét a hidrogén-peroxid vízzé és oxigénné alakításában, ami jelentős mennyiségű hangyasav (a glioxilát hidrogén-peroxidos oxidációjának terméke) képződéséhez vezet. Másodlagos kataláz aktivitás (pl. Aspergillus niger eredetű vízoldható kataláz) bevitele a reakcióelegybe jelentősen növelte a glioxilsav hozamot akár Hansenula polymorpha, akár Pichia pastoris transzformánst alkalmaztak biokatalizátorként.
Az Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris mikroorganizmusokból, valamint a marhamájból származó kataláz enzimeket vizsgáltuk a glikolát/AMPA elegyek oxidációjakor keletkező hidrogén-peroxid bomlását elősegítő katalizátorként, és úgy találtuk — amit eddig még nem ismertetett senki —, hogy az AMPA reverzibilisen gátolja a Hansenula polymorpha, Pichia pastoris mikroorganizmusokból, valamint a marhamájból származó kataláz enzimeket. Ez a gátló hatás attól függtelenül érvényesült, hogy vízoldható kataláz, immobilizált kataláz vagy kataláz tartalmú sejt volt az alkalmazott katalizátor. Azon megoldás mellett, miszerint másodlagos, inhibíció-rezisztens kataláz aktivitást juttatunk a glikolát/AMPA reakcióelegybe, amely katalizátorként AMPA inhibícióra érzékeny katalázforrást (pl. H. polymorpha vagy P. pastoris transzformánsokat) tartalmaz, egy másik megoldás értelmében amin adalékként AMPA helyett dialkil-amino-metil’··· »·
-foszfonátot alkalmazunk, ami azzal a meglepő következménnyel jár, hogy az egyébként azonos reakciók során teljesen megszűnik vagy jelentősen mérséklődik bizonyos katalázok inhibiciója, ami amin-adalékként alkalmazott AMPA esetén normálisan megfigyelhető.
Összehasonlítottuk az AMPA, illetve a dietil-amino-metil-foszfonát (DEAMPA) amin adalékokat a glikolsav oxidációja során, melyet vízoldható glikolát oxidáz, valamint A. niger eredetű vízoldható kataláz (AMPA nem gátolja) , illetve vízoldható H. polymorpha kataláz (AMPA gátolja) katalizátorok alkalmazásával hajtottunk végre. A glioxilsav-képződés szempontjából optimális (a későbbi példákban ismertetett) körülmények között elvégzett reakciókban az alábbi táblázatban szereplő eredményeket kaptuk a glioxilsav- és a hangyasav-hozamra.
| Amin | Kataláz eredete | Kataláz aktivitás (IU/ml) | Glioxilát (%) | Formiát (%) | |
| AMPA | A. | niger | 1400 | 70 | 20 |
| AMPA | A. | niger | 14000 | 92 | 2 |
| DEAMPA | A. | niger | 1400 | 95 | 4 |
| DEAMPA | A. | niger | 14000 | 97 | 1 |
| AMPA | H. | polymorpha | 5600 | 43 | 45 |
| AMPA | H. | polymorpha | 14000 | 64 | 24 |
| AMPA | H. | polymorpha | 56000 | 68 | 6 |
| DEAMPA | H. | polymorpha | 1400 | 84 | 12 |
| DEAMPA | H. | polymorpha | 14000 | 98 | 1 |
V ·
A DEAMPA alkalmazásakor kapott glioxilsav-hozamok felülmúlják az AMPA alkalmazásakor kapottakat mind az A. niger, mind pedig a H. polymorpha eredetű vízoldható katalázok esetében. Az A. niger eredetű kataláz alacsonyabb aktivitásánál mért magasabb glioxilát hozam annak tudható be, hogy a protonált amin pKa értéke alacsonyabb a DEAMPA esetében (pKa kb. 6,4), mint az AMPA esetében (pKa kb. 10,8). A DEAMPA alacsonyabb pKa értéke elősegíti a glioxilsav és a protonálatlan DEAMPA közötti, oxidációnak ellenálló hemiamin vagy imin komplexeinek kialakulását a reakció pH értékén (8,3 - 8,5) .
A glioxilát-hozam és a formiát-képződés összehasonlítása a DEAMPA, illetve az AMPA alkalmazásakor, H. polymorpha eredetű vízoldható kataláz esetén, jól szemlélteti a glioxiát-hozam meglepő, markáns emelkedését és a formiát-képződés csökkenését DEAMPA amin-adalék használatakor. Jelentősen alacsonyabb H. polymorpha eredetű vizoldható kataláz aktivitással is magas glioxilát-hozam érhető el DEAMPA használata mellett. AMPA alkalmazása esetén még akkor sem sikerült ezeket az értékeket elérni, ha növeltük a kataláz aktivitást. Hasonló javulás tapasztalható mind a glioxilát-hozam, mind pedig a formiát-képződés csökkenése tekintetében akár a H. polymorpha, akár a P. pastoris transzformáns biokatalizátorok esetén, amennyiben AMPA helyett DEAMPA amin-adalékot használunk (lásd példákat).
A glikolsav katalitikus oxidációját úgy végezzük, hogy »·· ·«««·««· • •e ·* ·· · %·’ : %:··./
Il a glikolsavat molekuláris oxigénnel hozzuk érintkezésbe olyan enzim jelenlétében, mely a glikolsav és a molekuláris oxigén glioxilsavat eredményező reakcióját katalizálja. Ilyen enzim például a glikolsav-oxidáz néven is ismert glikolát-oxidáz (EC 1.1.3.15). A glikolát-oxidáz számos forrásból izolálható, amint az közismert. A reakció során a glikolát-oxidáz megfelelő koncentrációban kell, hogy jelen legyen, általában 0,01 és 1000 IU/ml, előnyösen 0,1 és 10 IU/ml közötti aktivitás tartományban. IU (Nemzetközi Egység) a definíció szerint az az enzimmennyiség, amely egy mikromól szubsztrátum átalakulását képes katalizálni percenként. Az enzimaktivitás meghatározására szolgáló módszert Zelitch és Ochoa [J. Bioi. Chem., 201, 707-718 (1953)] ismerteti. Az általuk leírt módszer a visszanyert, illetve újrahasznosított glikolát-oxidáz aktivitásának meghatározására is alkalmas.
A glikolsav glioxilsawá történő oxidatív átalakítása glikolát-oxidáz katalizátorral akkor végezhető optimális hatékonysággal, ha gondoskodunk róla, hogy legyen a reakcióelegyben a keletkező hidrogén-peroxid elbontására alkalmas katalizátor. Ilyen peroxidbontó, a glikolát-oxidázzal hatékony együttműködésre képes enzim a kataláz (EC 1.11.1.6). A kataláz a hidrogén-proxid vízzé és oxigénné való bomlását katalizálja, és a jelen eljárásban a glioxilát hozamot növelő hatását annak tulajdonítjuk, hogy a glikolsav és a molekuláris oxigén glikolát-oxidáz katalizálta reakciójának melléktermékeként képződő hidrogén-peroxid bomlását meggyorsítja. A il kataláz koncentrációja 50 és 50000 IU/ml, előnyösen 2000 és 15000 IU/ml közötti tartományban kell, hogy legyen. Nagyon előnyös, ha a kataláz és a glikolát-oxidáz enzimek aktivitását a fentiekben megadott tartományokon belül úgy állítjuk be, hogy a kataláz/glikolát-oxidáz arány (mindengyik a saját aktivitási egységében mérve) legalább 250 : 1 legyen.
Katalizátorként vízoldható enzimek mellett transzformáns mikroorganizmusokat állítottunk elő, melyekben az endogén kataláz aktivitás mellett glikolát-oxidáz aktivitás is kifejeződik. A jelen találmányban az ilyen mikrobiális katalizátorok használatát is bemutatjuk. A találmány szerinti megoldásban katalizátorként alkalmazott mikrobasejt Hansenula polymorpha (metilotróf élesztő) transzformáns. Számos, megfelelő glikolát-oxidáz aktivitással rendelkező H. polymorpha transzformánst hoztunk létre úgy, hogy a glikolát-oxidázt kódoló DNS szakaszt formát-dehidrogenáz (FMD) promotert tartalmazó expressziós vektorba építettük be. Ezzel a vektorral H. polymorpha sejteket transzformáltunk, majd a legjobb glikolát-oxidáz termelő képességű izolátumot kiválasztottuk, és a H. polymorpha GOI elnevezést adtuk neki.
A H. polymorpha sejtkatalizátor előállításának első lépéseként 500 ml YPD (Difco) pH 4,4 tápoldatban oltótenyészetet készítünk. Ezzel a tenyészettel 10 liter tápoldatot [Yeast Nitrogén Base (YNB, Difco) aminosavmentes (14 g) , ammónium-szulfát (50 g), és metanol (100 g), pH=5,0] tartalmazó fermentort oltunk be. A tenyésztést 37 ’C-on 42,5 órán ii át végezzük 400 1/perc fordulatszámú keverést, és 1 bar levegőnyomást biztosítva. A tenyészet pH-ját 5,0 értéken, az oldott oxigén koncentrációját a telítési érték 40 %-án tartjuk. A fermentáció végeztével 1,0 kg glicerint adunk a tenyészethez, a sejteket centrifugálással kinyerjük, folyékony nitrogénben fagyasztjuk, és felhasználásig -80 ’C-on tároljuk.
A találmány szerinti megoldásban katalizátorként felhasznált másik mikrobasejt olyan Pichia pastoris (metilotróf élesztő) transzformáns, melyben az endogén kataláz mellett a spenótból származó glikolát-oxidáz enzim is kifejeződik. Számos, megfelelő glikolát-oxidáz aktivitással rendelkező H. polymorpha transzformánst hoztunk létre úgy, hogy a spenót glikolát-oxidázt kódoló gént a metanollal indukálható alkohol-oxidáz I promotert tartalmazó P. pastoris expressziós vektorba (pHIL-D4) építettük be, létrehozva így a pMPl plazmidot. A pMPl plazmiddal P. pastoris GTS115 (NRRL Y-15851) sejteket transzformáltunk, és a szelekciót úgy végeztük, hogy lehetőséget adtunk a linearizált pMPl plazmid beépülésére a kromoszómába, a kromoszomális alkohol-oxidáz I helyére, felcserélve így az alkohol-oxidáz gént a glikolát-oxidáz génnel. Az ilyen tulajdonságot hordozó transzformánsokat ezt követően a maximális számú integrálódott expressziós kazetta kópiák szerint szelektáltuk. Az így izolált, magas kópiaszámú P. pastoris GS115-MSP10 jelű törzset 1992. szeptember 24-én letétbe helyeztük az NRRL törzsgyűjteményben (Peoria, il
Illinois, USA), ahol az NRRL Y-21001 nyilvántartási számot kapta.
A P. pastoris sejtek előállítására 100 ml 1 % glicerintartalmú YNB tápoldatban oltótenyészetet készítünk. A tenyészetet 48 órán át 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd átoltjuk 10 liter tápoldatot [Yeast Nitrogén Base (YNB, Difco) aminosavmentes (134 g), glicerin (100 g) , és biotin (20 mg)] tartalmazó fermentorba. A tenyésztést 30 °C-on végezzük 200 1/perc fordulatszámú keverést, 5 liter/perc levegőztetést és 0,35 bar levegőnyomást biztosítva. A tenyészet pH-ját ammónium-hidroxiddal 5,0 értéken, az oldott oxigén koncentrációját a telítési érték legalább 50 %-án tartjuk. A glicerin elfogyását követően a sejtek glikolát-oxidáz expresszióját 50 g metanol hozzáadásával indukáljuk. Az indukció során a glikolát-oxidáz aktivitást enzim meghatározással követjük nyomon. 24 órán át tartó indukció után 1,0 kg glicerint adunk a tenyészethez, a sejteket centrifugálással kinyerjük, folyékony nitrogénben fagyasztjuk, és felhasználásig -80 °C-on tároljuk.
A H. polymorpha és P. pastoris transzformáns sejteket permeabilizálni kell ahhoz, hogy katalizátorként használhassuk őket a glikolsav glioxilsavvá történő oxidációja során. Számos ismert módszer alkalmas megfelelő glikolát-oxidáz aktivitású sejtek előállítására [Félix, H., Arial. Biochemistry, 120, 211-234 (1982)]. Eljárhatunk például úgy, hogy 10 tömeg% nedves sejtet tartalmazó, 20 mM foszfát12 pufferben (pH 7,0) 0,1 % (tf/tf) Triton X-100 detergenst tartalmazó oldattal készített sejtszuszpenziót 15 percen át keverünk, majd folyékony nitrogénben fagyasztunk, felengedtetünk, és 0,1 mM FMN tartalmú 20 mM foszfátpufferrel (pH 7,0) mosunk. A permeabilizálást úgy is végezhetjük, hogy 10 tömeg% nedves sejtet tartalmazó, 20 mM foszfátpufferben (pH 7,0) 0,2 % (tömeg/térfogat) benzalkónium-kloridot tartalmazó oldattal készített sejtszuszpenziót 60 percen át keverünk, majd a permeabilizált sejteket 0,1 mM FMN tartalmú 20 mM foszfátpufferrel (pH 7,0) mossuk. A már permeabilizált teljes sejtek mennyiségét katalizátorként történő alkalmazáskor oly módon válsztjuk meg, hogy glikolát-oxidáz és kataláz aktivitásuk megegyezzen a megfelelő, vízoldható enzimre a korábbiakban megadott értékekkel. A visszanyert glikolát-oxidáz és kataláz aktivitás kezdetinél magasabb (több, mint 100 %) értéke annak a következménye, hogy a reakció folyamán a teljes sejt katalizátor permeabilitása megnövekszik.
A transzformáns mikrobasejtek glikolát-oxidáz aktivitásának meghatározására kb. 5 - 10 mg nedves sejtet, a fölösleges nedvességet szűrőpapírral felitatva, mágneses keverővei ellátott 3 ml térfogatú kvarcküvettába pontosan bemérünk. A küvettába 2,0 ml térfogatú, 0,12 mM koncentrációjú, 80 mM TRIS pufferrel (pH 8,3) készített diklór-fenol-indofenol (DCIP) oldatot adunk, és az elegyet 5 percen át nitrogéngázzal átbuborékoltatva oxigénmentesítjük, majd a küvettát gumidugóval lezárjuk. A küvettába ezután 1,0 M TRIS pufferrel
I (pH 8,3) készített 1,0 M koncentrációjú glikolsav oldat 40 mikroliterjét injektáljuk, azután keverés közben mérjük az elegy abszorbanciájának változását az időben, 605 nm hullámhosszon (ε=22000) .
A kataláz aktivitás mérésére kb. 2-5 mg nedves sejtet, a fölösleges nedvességet szűrőpapírral felitatva, mágneses keverővei ellátott, 2,0 ml desztillált vizet tartalmazó, 3 ml térfogatú kvarcküvettába pontosan bemérünk. A küvettába ezután 1,0 ml térfogatú, 50 mM foszf átpuf f errel (pH 7,0) készített 59 mM koncentrációjú hidrogén-peroxid oldatot adunk, azután mérjük az elegy abszorbanciájának változását az időben, 240 nm hullámhosszon (ε=39,4). A különböző tápközegben tenyésztett H. polymorpha és P. pastoris nedves (permeabilizált) sejtekben mérhető glikolát-oxidáz, illetve kataláz aktivitás 20-120 DCIP IU/gramm, illetve 30000-200000 IU/gram közötti érték.
Adott esetben kedvező hatású lehet flavin-mononukleotid (FMN) hozzáadása a reakcióelegyhez, melyet általában legfeljebb 2,0 mM, előnyösen 0,01 és 0,2 mM közötti koncentrációban alkalmazhatunk. Feltételezhető, hogy az FMN fokozza a glikolát-oxidáz produktivitását, ami azt jelenti, hogy egységnyi enzim több glikolsavat képes glioxilsavvá alakítani. A megadott FMN koncentráció az enzimkészítményben lévő FMN-tartalmon felül értendő, mivel az enzim készítése során gyakran eleve hozzáadnak valamennyit. Az FMN szerkezetére, valamint analitikájának módszerére vonatkozó információ megtalálható
K. Yagai közleményében [Methods of Biochemical Analysis, X.
kötet, 319-355. oldal, Interscience Publishers, New York, 1962].
A glikolsav glioxilsavvá történő átalakítását előnyösen vizes közegben végezzük. A kereskedelemben beszerezhető glikolsav (2-hidroxi-ecetsav) kezdeti koncentrációja az adott reakcióban 0,10 - 2,0 M, előnyösen 0,25 - 1,0 M közötti.
Alkalmazható eredeti formájában vagy alkalmas sójaként, mely utóbbival szemben követelmény, hogy vízoldható legyen, és kationja ne zavarja sem a glikolsav átalakítását glioxilsavvá, sem pedig utóbb a glioxilsav és a dialkil-amino-metil-foszfonát reakcióját N- (foszfono-metil)-glicinné. Az ilyen megfelelő és alkalmas sóképző kationokat kísérletesen kell meghatározni. Példaként szolgálnak ezekre az alkálifém-, alkáliföldfém-, ammónium-, helyettesített ammónium-, foszfónium- és helyettesített foszfóniumsók.
A találmány szerinti dialkil-metil-foszfonátok az (I) általános képlettel szemléltethetők
OY (I) ahol X és Y jelentése egymástól függetlenül alkil-csoport, például metil-, etil-, propil-, izopropilcsoport stb., azzal a korlátozással, hogy a szóbanforgó dialkil-amino-metilfoszfonát részlegesen vagy teljesen oldható legyen a vizes reakcióelegyben. A dialkil-amino-metil-foszfonátot olyan mennyiségben alkalmazzuk, hogy a kezdeti dialkil-amino-metil • · ·
-foszfonát/glikolsav mólarány a 0,01 és 3,0 közötti, előnyösen pedig a 0,25 és 1,05 közötti tartományba essen. Miután összehoztuk a dialkil-amino-metil-foszfonátot és a glikolsavat a vizes közegben, a keletkező elegy pH-ját 6 és 10 közötti, előnyösen 7,0 és 9,0 közötti értékre állítjuk be. Ebben a pH tartományban a kívánt pH pontos értéke beállítható bármely alkalmas, a reakciót nem zavaró bázissal, így például alkálifém-hidroxidokkal, -karbonátokkal, -hidrogén-karbonátokkal és -foszfátokkal. A reakció folyamán a pH enyhén csökken, ezért célszerű a reakciót a maximális enzimaktivitást biztosító pH tartomány felső határán (9,0 - 8,5 körüli értéken) indítani, és hagyni csökkenését a reakció során. Adott esetben a pH tartása érdekében zavaró hatással nem rendelkező szerves, vagy szervetlen bázisokat adagolhatunk, minthogy a pH-val az enzimaktivitás is változik.
Ismeretes, hogy a glikolsav és a glioxilsav erősen disszociált állapotban vannak jelen a vízben, méghozzá a 7 és 10 közötti pH tartományban zömmel vagy teljesen glikolát, illetve glioxilát ionok formájában. A szakmában jártasak előtt az is nyilvánvaló, hogy a glioxilsav (és konjugált bázisa, a glioxilát anion) hidratált alakban — pl. (OH)2CHCOOH) és/vagy hemiacetálként (HOOCCH(OH)OCH(OH)COOH) is előfordulhat, melyek anionpárjaikkal együtt a glioxilsavval és anionjával egyenértékű reakciópartnerek az N- (foszfono-metil) -glicin képződésénél. Hasonlóképp, a dialkil-amino-metil-foszfonát részben, vagy teljesen protonált amin-ka* · ί
tion formában is előfordulhat, melynek ellenionjaként egy vagy több, bármely, a reakcióelegyben jelenlévő anion szóbajöhet.
A molekuláris oxigén (O2), mely a glikolsav glioxilsavvá történő átalakítása során oxidálószerként szerepel, a reakcióelegybe juttatható gáz állapotban, a folyadék keverésével, a gáz/folyadék határfelületen keresztül vagy oxigén-áteresztő membrán használatával. Nagyon valószínű, hogy az általánosan alkalmazott reakciókörülmények között, a reakciósebességet legalábbis részben - az oxigénnek a vizes rendszerbe való beoldódási sebessége határozza meg. Emiatt, bár az oxigén a reakcióelegy egyszerű levegőztetésével is adagolható, előnyösebb viszonylag tiszta állapotú oxigént használni, sőt adott esetben magasabb nyomást alkalmazni. Jóllehet az oxigén nyomásának nem ismeretes felső korlátja, és akár 50 bar gáznyomás is használható, előnyösen legfeljebb 15 bar nyomáson alkalmazzuk az oxigént. A keverés nagyon fontos a oxigénbeoldódás nagy sebességének (és így a reakciósebességnek) a fenntartása szempontjából. A keverés bármely szokásos módszerrel biztosítható, ám - amint az az enzimes technológiákban jártasak számára nyilvánvaló - a nagy nyírással, vagy habképződéssel járó keverés csökkentheti az oldott enzim(ek) aktivitását, és kerülendő, amennyiben katalizátorként vízoldható enzimeket használunk.
A hőmérséklet fontos paraméter, mivel hatással van a reakció sebességére és az enzimek stabilitására egyaránt. A • · • · il reakciót 0 és 40 ’C közötti, előnyösen 5 és 15 °C közötti hőmérsékleten hajtjuk végre. Ebben a hőmérséklet tartományban biztosítható a maximális enzimaktivitás visszanyerése a reakció végén. Nem alkalmazható olyan alacsony hőmérséklet, hogy a vizes oldat befagyjon. A hőmérséklet szabályozása bármely ismert módon megvalósítható, így például - de nem kizárólag kettősfalú reakcióedény alkalmazásával, melynek köpenyében megfelelő hőfokú folyadékot keringtetünk. A reakcióedény bármely olyan szerkezeti anyagból készülhet, amely nem lép reakcióba a reakcióelegy egyetlen komponensével sem.
A reakció befejeztével a vízoldható enzimek szűréssel vagy centrifugálással eltávolíthatók és újra felhasználhatók. Úgy is eljárhatunk azonban, hogy az enzimeket melegítéssel (pl. 5 percen át 70 °C-on tartva) történő denaturálással kicsapjuk és/vagy a reakcióelegyben hagyjuk, amennyiben jelenlétük az N-(foszfono-metil)-glicin előállítása és a reakcióelegyből való kinyerése során nem zavaró. A transzformáns mikrobasejtek az újrahasznosításhoz szűréssel vagy cetrifugálással nyerhetők vissza. Miután a reakcióelegy oxigénezését megszüntettük, és - előnyösen - az oldott enzimeket, illetve a katalizátorként használt sejteket eltávolítottuk, adott esetben a flavin-mononukleotid (FMN) is eltávolítható aktívszenes derítéssel.
A fentiek szerint előállított glioxilsav és dialkil-amino-metil-foszfonát elegyet (mely feltételezhetően egyensúlyi arányban tartalmaz hemiamint és imint) az N-(foszfonoI • ·
-metil)-glicin előállítására szolgáló ismert módszerek bármelyike szerint kezelhetjük. A glioxilsav és dialkil-amino-metil-foszfonát elegy katalitikus hidrogénezése, majd a keletkező N-(dialkoxi-foszfinil-metil)-glicin hidrolízise például előnyös módszer N-(foszfono-metil)-glicin előállítására glioxilsav/dialkil-amino-metil-foszfonát elegyekből. E célra a hidrogénezéshez megfelelő katalizátorok például (de nem kizárólag) a különböző platinacsoportbeli fémek, így az irídium, ozmium, ródium, ruténium, platina és palládium; valamint a különféle egyéb átmeneti fémek, így a kobalt, réz, nikkel és cink. A katalizátor alkalmazható szabad állapotban (pl. Raney nikkel, platina-oxid) vagy valamilyen hordozón rögzítve (platina szénen, palládium alumínium-oxidon, nikkel szilikáton). Előnyösen szénen rögzített palládium, szilikáton rögzített nikkel, vagy Raney nikkel katalizátort használunk. A hidrogénezést 4 és 11 közötti, előnyösen 5 és 10 közötti pH értéken hajtjuk végre. A hidrogénezés során alkalmazott hőmérséklet és nyomás széles határok között lehet. A hőmérsékletet általában a 0 és 150 °C közötti tartományban, előnyösen 20 és 90 °C között, a H2 nyomást pedig általában az atmoszférikus nyomás és 100 bar közötti tartományban, előnyösen 1 és 10 bar között választjuk meg.
A glioxilsav/dialkil-amino-metil-foszfonát elegyek hidrogénezése során keletkező N-(dialkoxi-foszfinil-metil)-glicinből hidrolízissel N-(foszfono-metil)-glicin állítható elő, melyet a hidrogénezési lépés után a vizes reakcióelegyhez * · • ·
adott fölös mennyiségű sósavval vagy brómsavval végzünk, melegítés közben. Az ennek befejeztével kapott elegyből a posztemergens herbicid hatású N-(foszfono-metil)-glicin kinyerése tetszőleges, ismert módon történhet.
A következő, a találmány jobb megértését szolgáló példákban a glioxilát, formiát és oxalát, valamint a visszanyert glikolsav hozamokat a reakció kezdetén jelenlévő glikolsav teljes mennyiségére vonatkoztatva, százalékos értékben adjuk meg. A reakcióelegyek analízisét nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) módszerrel, Bio-Rad HPX-87H szerves sav analitikai oszlop alkalmazásával végeztük.
1. példa
100 ml térfogatú Fischer-Porter aeroszol üveg reakcióedénybe mágneses keverőt helyezünk, majd 10 ml térfogatú, glikolsavat (0,25 Μ) , amino-metil-foszfonsavat (AMPA, 0,263 Μ) , flavin-mononukleotidot (FMN, 0,01 mM), propionsavat (HPLC belső standard, 0,125 Μ) , spenót glikolát-oxidázt (1,0 IU/ml), és vízoldható Aspergillus niger katalázt (1400 IU/ml) tartalmazó vizes oldatot (pH 8,5) mérünk bele. A reakcióedényt lezárjuk, és a reakcióelegyet 15 °C-ra hűtjük, majd oxigénnel öblítjük oly módon, hogy keverés közben ötször egymás után oxigéngáz bevezetésével a nyomást 5 bar értékig növeljük, azután atmoszférikusra csökkentjük. A nyomást végül bar értékre beállítva az elegyet 15
Alkalmas mintavevőn keresztül injekciós reakcióedény nyomáscsökkenését elkerülendő) °C-on keverjük.
fecskendővel (a alikvot mintákat
(0,01 ml) veszünk, hogy a reakció előrehaladását HPLC analízissel nyomonkövessük. Öt óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 70,4 %, formiát 19,6 %, oxalát 2,2 %, visszamaradt glikolát 5,3 %. A glikolát-oxidáz és kataláz enzimek maradék aktivitásaként a kezdeti érték 27, illetve 100 %-a mérhető.
2. példa
Az 1. példa szerinti módon járunk el, glikolsav (0,500 Μ) , AMPA (0,500 Μ) , FMN (0,01 mM) , izovajsav (HPLC belső standard, 0,100 Μ), spenót glikolát-oxidáz (1,0 IU/ml), valamint vizoldható Aspergillus niger kataláz (14000 IU/ml) tartalmú vizes oldatot (pH 8,5) alkalmazva. A reakciót 5 ’Con végezve 21 óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 85,2 %, formiát 1,5 %, oxalát 3,3 %, visszamaradt glikolát 5,5 %. A glikolát-oxidáz és kataláz enzimek maradék aktivitásaként a kezdeti érték 49, illetve 93 %-a mérhető.
3. példa
Az 1. példa szerinti módon járunk el, glikolsav (0,500 Μ) , AMPA (0, 375 Μ) , FMN (0,01 mM) , izovajsav (HPLC belső standard, 0,100 Μ) , spenót glikolát-oxidáz (1,0 IU/ml), valamint vizoldható Aspergillus niger, Saccharomyces cerevisiae, marhamáj, illetve Hansenula polymorpha kataláz (14000 IU/ml) tartalmú vizes oldatot (pH 8,5) alkalmazva. A reakciót 5 ’C-on végezve a reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, ··· formiát, oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblázatban láthatók:
| Vizoldható kataláz | Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (¾) | Glioxilsav (%) | Hangyasav (?) | Oxálsav (%) | Glikolsav (%) |
| A. niger | 19 | 81 | 39 | 92,1 | 1,9 | 4,7 | 1,8 |
| S. cerev. | 18 | 59 | 37 | 94,2 | 2,6 | 0 | 3, 0 |
| Marhamáj | 18 | 34 | 27 | 40, 0 | 51,4 | 2,5 | 5, 3 |
| H. polym. | 19 | 75 | 46 | 64, 3 | 23, 7 | 4,0 | 2,7 |
4. példa
A 3. példa szerinti módon járunk el, a reakciót 15 °Con végezve, 14000 IU/ml Aspergillus niger, illetve Hansenula polymorpha vízoldható kataláz alkalmazásával. A reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, formiát, oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblázatban láthatók:
| Vizoldhatc kataláz | > Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (%) | Glioxilsav (%) | Hangyasav (%) | Oxálsav (%) | Glikolsav (%) |
| A. niger | 20 | 84 | 12 | 87, 3 | 1,8 | 2,7 | 8,2 |
| H. polym. | 20 | 64 | 17 | 62, 0 | 27,9 | 2,9 | 4,7 |
| 5. | példa | ||||||
| A | 3. példa | szerinti módon | j árunk | el, | 5600, | illetve |
56000 IU/ml Hansenula polymorpha vízoldható kataláz alkalmazásával is. A reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, formiát,
oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblá zatban láthatók:
| Kataláz (IU/ml) | Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (%) | Glioxilsav (%) | Hangyasav (%) | Oxálsav (%) | Glikolsav (%) |
| 5600 | 22 | 48 | 25 | 42,9 | 44,5 | 0 | 1/6 |
| 14000 | 20 | 64 | 17 | 62, 0 | 27, 9 | 2,9 | 4,7 |
| 56000 | 22 | 12 | 14 | 68,4 | 6, 3 | 2,4 | 6, 5 |
6. példa
Az 1. példa szerinti módon járunk el, glikolsav (0,500 Μ) , dietil-amino-metil-foszfonát (DEAMPA, 0, 398 Μ) , FMN (0,01 mM) , izovajsav (HPLC belső standard, 0,10 Μ) , spenót glikolát-oxidáz (1,0 IU/ml), valamint vízoldható Aspergillus niger kataláz (14000 IU/ml) tartalmú vizes oldatot (pH 8,3) alkalmazva. A reakciót 5 °C-on végezve 20 óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 97,4 %, formiát 0,8 %, oxalát 1,8 %, glikolát nem maradt vissza. A glikolát-oxidáz és kataláz enzimek maradék aktivitásaként a kezdeti érték 10, illetve 95 %-a mérhető.
7. példa
A 6. példa szerinti módon járunk el, glikolsav (0,50 Μ) , DEAMPA (0,525 Μ) , FMN (0,01 mM) , izovajsav (HPLC belső standard, 0,10 Μ) , spenót glikolát-oxidáz (1,0 IU/ml), valamint vízoldható Aspergillus niger kataláz (1400 IU/ml) tartalmú vizes oldatot (pH 8,3) alkalmazva. 23 óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 95,3 %, ··* :
il formiát 3,9 %, oxalát 1,5 %, glikolát nem maradt vissza. A glikolát-oxidáz és kataláz enzimek maradék aktivitásaként a kezdeti érték 12, illetve 100 %-a mérhető.
8. példa
A 7. példa szerinti módon járunk el, DEAMPA (0, 525 Μ) , valamint 1400, illetve 14000 IU/ml vízoldható Hansenula polymorpha kataláz alkalmazásával. A reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, formiát, oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblázatban láthatók:
| Kataláz (IU/ml) | Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (%) | Glioxilsav (%) | Hangyasav (%) | Oxálsav (%) | Glikolsav (8) |
| 1400 | 10 | 76 | 31 | 84,2 | 11,5 | 0, 6 | 2, 3 |
| 14000 | 10 | 79 | 38 | 98,2 | 1,3 | 0,4 | 2,8 |
9. példa
100 ml térfogatú Fischer-Porter aeroszol üveg reakcióedénybe mágneses keverőt helyezünk, majd 10 ml térfogatú, glikolsavat (0, 500 Μ) , amino-metil-foszfonsavat (0, 375 Μ) , izovaj savat nukleotidot (HPLC belső standard, 0,100 M) és flavin-mono (FMN, 0,01 mM) tartalmazó 8,5 pH értékű (50 %-os
NaOH oldattal beállítva) vizes oldatot mérünk bele, melyet 5 ’C-ra hútünk. Ezután a reakcióedénybe bemérünk 0,47 g Hansenula polymorpha G01 transzformáns sejtet (10 IU glikolát-oxidáz és 22100 IU kataláz aktivitás), melyet előzőleg 0,1 %
Triton X-100/1 detergenssel fagyasztva és felengedtetve per24 il • · ·
meabilizáltunk. A reakcióedényt lezárjuk, és a reakcióelegyet 5 °C-ra hűtjük, majd oxigénnel öblítjük oly módon, hogy keverés közben ötször egymás után oxigéngáz bevezetésével a nyomást 5 bar értékig növeljük, azután atmoszférikusra csökkentjük. A nyomást végül 5 bar értékre beállítva az elegyet 5 ’C-on keverjük. Alkalmas mintavevőn keresztül injekciós fecskendővel (a reakcióedény nyomáscsökkenését elkerülendő) alikvot mintákat (0,10 ml) veszünk szabályos időközönként, hogy a reakció előrehaladását HPLC analízissel nyomonkövessük. 16 óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 57,6 *, formiát 32,5 %, oxalát 2,6 %, visszamaradt glikolát 8,9 ?. A permeabilizált sejt maradék glikolát-oxidáz és kataláz enzimaktivitásaként a kezdeti érték 60, illetve 378 %-a mérhető.
10. példa
A 9. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy 14000 IU/ml vízoldható Aspergillus niger katalázt is a reakcióelegyhez adunk. 16 óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 90,1 %, formiát 1,3 %, oxalát 5,9 %, visszamaradt glikolát 3,0 %. A permeabilizált sejt maradék glikolát-oxidáz és kataláz enzimaktivitásaként a kezdeti érték 86, illetve 136 %-a mérhető.
11. példa
A 9. példa szerinti módon járunk el, azzal az eltéréssel, hogy Hansenula polymorpha transzformáns helyett 0,75 g Pichia pastoris MSP10 transzformáns sejtet (13,2 IU glikolát,·· «... ,, t 25 oxidáz és 21200 IU kataláz aktivitás), melyet előzőleg 0,1 % Triton X-100/1 detergenssel fagyasztva és felengedtetve permeabilizáltunk. 16 óra múltán a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 30,5 %, formiát 59,2 %, oxalát 10,7 %, visszamaradt glikolát 0,8 %.
12. példa
100 ml térfogatú Fischer-Porter aeroszol üveg reakcióedénybe mágneses keverőt helyezünk, majd 10 ml térfogatú, glikolsavat (0, 500 Μ) , dietil-amino-metil-foszfonátot (DEAMPA, 0, 525 Μ) , izovajsavat (0,100 M, HPLC belső standard) és f lavin-mononukleotidot (FMN, 0,01 mM) tartalmazó 8,3 pH értékű (50 %-os NaOH oldattal beállítva) vizes oldatot mérünk bele, melyet 5 °C-ra hűtünk. Ezután a reakcióedénybe bemérünk 1,5 g Hansenula polymorpha G01 transzformáns sejtet (8,0 IU glikolát-oxidáz és 38000 IU kataláz aktivitás), melyet előzőleg 0,1 % Triton X-100/1 detergenssel fagyasztva és felengedtetve permeabilizáltunk. A reakcióedényt lezárjuk, és a reakcióelegyet 5 ’C-ra hűtjük, majd oxigénnel öblítjük oly módon, hogy keverés közben ötször egymás után oxigéngáz bevezetésével a nyomást 5 bar értékig növeljük, azután atmoszférikusra csökkentjük. A nyomást végül 5 bar értékre beállítva az elegyet 5 °C-on keverjük. Alkalmas mintavevőn keresztül injekciós fecskendővel (a reakcióedény nyomáscsökkenését elkerülendő) alikvot mintákat (0,10 ml) veszünk szabályos időközönként, hogy a reakció előrehaladását HPLC analízissel nyomonkövessük. 9 óra múltán a HPLC módszerrel • · ν *· · ••1 mért hozamok a következők: glioxilát 98,4 %, formiát 0 %, oxalát 2,0 %, glikolát nem maradt vissza. A permeabilizált sejt maradék glikolát-oxidáz és kataláz enzimaktivitásaként a kezdeti érték 63, illetve 250 %-a mérhető.
13. példa
A 12. példa szerinti módon járunk el, glikolsavat (0, 500 M) , amino-metil-foszfonsavat (AMPA, 0,525 M) , izovajsavat (0,100 M,
HPLC belső standard), flavin-mononukleotidot (0,01 mM) és 0,72 g
0,2 % benzalkónium-kloriddal (Lonza Barquat OJ-50) transzformáns sejtet permeabilizált Hansenula polymorpha G01 (43,0 IU glikolát-oxidáz és 39880 IU kataláz aktivitás) tartalmazó, 8,3 pH értékű (50 %-os NaOH oldattal beállítva) reakcióelegyet alkalmazva. A reakciót 5 °C-on végezve 1 óra elteltével a HPLC módszerrel mért hozamok a következők: glioxilát 50,2 %, formiát 47,4 %, oxalát 1,1 %, a visszamaradó glikolát 2,2 %. A permeabilizált sejt maradék glikolát-oxidáz és kataláz enzimaktivitásaként a kezdeti érték 95, illetve 105 %-a mérhető.
14. példa
A 13. példa szerinti módon járunk el, amin adalékként amino-metil-foszfonsavat (AMPA, 0, 375 M) , illetve dietil-amino-metil-foszfonátot (DEAMPA, 0,375 M) alkalmazva. A reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, formiát, oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblázatban láthatók:
| Amin adalék | Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (%) | Glioxil- sav (%) | Hangyasav (%) | Oxálsav (%) | Glikolsav »·) |
| AMPA | 5 | 99 | 54 | 42,7 | 47,3 | 10, 7 | 4,7 |
| DEAMPA | 1 | 122 | 108 | 83,5 | 15, 5 | 5, 6 | 0 |
15. példa
A 12. példa szerinti módon járunk el, glikolsavat (0, 500 Μ), amino-metil-foszfonsavat (AMPA, 0, 375 Μ) , illetve dietil-amino-metil-foszfonátot (DEAMPA, 0,375 Μ), valamint izovajsavat (0,100 M, HPLC belső standard), flavin-mononukleotidot (0,01 mM) és 0,23 g 0,2 % benzalkónium-kloriddal (Lonza Barquat OJ-50) permeabilizált Pichia pastoris GS115MSP10 transzformáns sejtet (43,0 IU glikolát-oxidáz és 39880 IU kataláz aktivitás) tartalmazó, 8,3 pH értékű (50 »-os NaOH oldattal beállítva) reakcióelegyet alkalmazva. A reakciót 5 °C-on végezve a reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, formiát, oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblázatban láthatók:
| Amin adalék | Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (%) | Glioxilsav (%) | Hangyasav (%) | Oxálsav (%) | Glikolsav (%) |
| AMPA | 4 | 130 | 214 | 59, 7 | 36, 2 | 4,3 | 1,5 |
| DEAMPA | 1 | 124 | 268 | 92,9 | 3, 6 | 3,9 | 0 |
16. példa
A 15. példa szerinti módon járunk el, amin adalékként
amino-metil-foszfonsavat (AMPA, 0, 525 M), illetve dietil-amino-metil-foszfonátot (DEAMPA, 0,525 M) alkalmazva. A reakcióidők, a visszanyert kataláz és glikolát-oxidáz aktivitások, valamint a mért glioxilát, formiát, oxalát és visszamaradt glikolát hozamok a következő táblázatban láthatók:
| Amin adalék | Reakcióidő (óra) | Kataláz (%) | Glikolát-oxidáz (%) | Glioxilsav (%) | Hangyasav (%) | Oxálsav (%) | Glikolsav (%) |
| AMPA | 4 | 130 | 246 | 58,2 | 34, 6 | 3, 6 | 1,9 |
| DEAMPA | 1 | 118 | 276 | 95, 1 | 1, 6 | 3,3 | 0 |
17. példa
A glikolsav (0,50 M) és DEAMPA (0,525 M) elegyéből transzformáns mikroorganizmus katalizátor alkalmazásával, a
12. példa szerinti módon előállított glioxilsav (0,49 M) és DEAMPA (0,525 M) elegyet Amicon Centriprep 10 koncentrátoron (pórusméret 10000 dalton) szűrjük a vízoldható fehérjék eltávolítása érdekében. A szűrletet 0,10 g aktívszénnel derítve, majd szűrve eltávolítjuk a flavin-mononukleotidot, és az így kapott második szűrletet mágneses keverővei ellátott 100 ml térfogatú Fischer-Porter edénybe töltjük. Az üvegbe ezután 0,100b 10 %-os Pd/C katalizátort mérünk, lezárjuk, és nitrogéngázzal öblítjük. Az edényben a nyomást 25 °C-on történő folyamatos keverés közben hidrogéngáz bevezetésével 3,5 bar értéken tartjuk. Timikor az edényben a hidrogén nyomása stabilan állandó marad, a reakciót a nyomás megszüntetésével, és nitrogénes öblítéssel leállítjuk. Az így kapott, N-(di etoxi-foszfinil-metil)-glicint tartalmazó vizes oldathoz fölös mennyiségű koncentrált sósavat adva, és felforralva a dialkil-foszfonát-észtert elhidrolizáljuk. A keletkező elegyet betöményítjük, és az N-(foszfono-metil)-glicint kristályosítással kinyerjük.
Claims (6)
1. Eljárás glioxilát és dialkil-amino-metil-foszfonát il
Szabadalmi igénypontok elegyének előállítására, azzal jellemezve, hogy glikolátot vizes közegben, dialkil-amino-metil-foszfonát, valamint glikolát-oxidáz és kataláz enzimek jelenlétében oxigénnel oxidálunk.
2. Eljárás
N- (foszfono-metil) -glicin előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) glikolátot vizes közegben dialkil-amino-metilfoszfonát, valamint glikolát-oxidáz és kataláz enzimek jelenlétében oxigénnel oxidálunk, (ii) a kapott glioxiát és dialkil-amino-metil-foszfonát elegyet redukáljuk, és kapott N- (dialkoxi-foszfinil-metil)-glicint hidrolizáljuk.
3. Az 1.
igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kataláz enzimként
Aspergillus niger,
Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris vagy marhamáj eredetű enzimet alkalmazunk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve.
hogy kataláz enzimként Aspergillus niger,
Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha,
Pichia pastoris vagy marhamáj eredetű enzimet alkalmazunk.
hogy a katalázt és glikolát-oxidázt Hansenula polymorpha vagy
5. Az 1.
igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,
Pichia pastoris teljes mikrobasejt katalizátor alakjában alkalmazzuk.
6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a katalázt és glikolát-oxidázt Hansenula polymorpha vagy Pichia pastoris teljes mikrobasejt katalizátor alakjában alkalmazzuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6725093A | 1993-05-28 | 1993-05-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9503389D0 HU9503389D0 (en) | 1996-01-29 |
| HUT73395A true HUT73395A (en) | 1996-07-29 |
Family
ID=22074742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9503389A HUT73395A (en) | 1993-05-28 | 1994-05-20 | Process for preparing glyoxylic acid/dialkyl aminomethylphosphonate mixtures |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5559020A (hu) |
| EP (1) | EP0701622A1 (hu) |
| JP (1) | JP3937445B2 (hu) |
| CN (1) | CN1124981A (hu) |
| AU (1) | AU6831894A (hu) |
| BR (1) | BR9406888A (hu) |
| CA (1) | CA2163515A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ301395A3 (hu) |
| HU (1) | HUT73395A (hu) |
| WO (1) | WO1994028155A1 (hu) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080050519A1 (en) * | 2006-08-25 | 2008-02-28 | Eugene Hubbuch | Latex composition, latex foam, latex foam products and methods of making same |
| US20080184642A1 (en) * | 2007-02-05 | 2008-08-07 | Laura Sebastian | Latex foam insulation and method of making and using same |
| EP3354742A1 (en) | 2017-01-26 | 2018-08-01 | Metabolic Explorer | Methods and microorganisms for the production of glycolic acid and/or glyoxylic acid |
| CN110343677B (zh) * | 2019-07-26 | 2021-04-13 | 中农新科(苏州)有机循环研究院有限公司 | 提高毕赤酵母过氧化氢酶表达量的方法 |
| CN113827992A (zh) * | 2021-10-20 | 2021-12-24 | 镇江江南化工有限公司 | 草甘膦生产过程碱母液精馏塔顶馏分水回收利用方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7514315A (nl) * | 1974-12-11 | 1976-06-15 | Monsanto Co | Werkwijze voor de bereiding van carbonylaldimino- methaanfosfonaten. |
| SE8000552L (sv) * | 1980-01-23 | 1981-07-24 | Mecman Ab | Tetningsanordning for ventilhus |
| JPS60148704A (ja) * | 1984-01-13 | 1985-08-06 | Overseas Data Service:Kk | 自動車用予備空気圧供給方法およびその装置 |
| US4729620A (en) * | 1984-05-25 | 1988-03-08 | Litton Systems, Inc. | Fiber optic frequency shifter |
| HUT41415A (en) * | 1984-12-28 | 1987-04-28 | Monsanto Co | Process for preparing n-phosphono-methyl-glycine derivatives |
| US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
| CA1339101C (en) * | 1986-06-03 | 1997-07-29 | Nicolaas Overbeeke | Production of guar alpha-galactosidase and immunologically related alpha-galactosidases by host organisms transformed with recombinant dna methods |
| DE3733157A1 (de) * | 1987-10-01 | 1989-04-27 | Basf Ag | Verfahren zur herstellung von brenztraubensaeure |
| DE69003247T2 (de) * | 1989-10-16 | 1994-04-07 | Du Pont | Verfahren zur herstellung von glyoxylsäure durch enzymatische oxydation von glykolsäure. |
| US5180896A (en) * | 1990-10-11 | 1993-01-19 | University Of Florida | System and method for in-line heating of medical fluid |
| US5135860A (en) * | 1991-11-06 | 1992-08-04 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for preparing glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures |
| US5180846A (en) * | 1991-11-06 | 1993-01-19 | E. I. Du Pont De Nemours & Company | Hydrogenation of enzymatically-produced glycolic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures |
| CZ111494A3 (en) * | 1991-11-06 | 1994-12-15 | Du Pont | Process for preparing an intermediate for the preparation of n-(phosphonomethyl)glycine |
-
1994
- 1994-05-20 CA CA002163515A patent/CA2163515A1/en not_active Abandoned
- 1994-05-20 BR BR9406888A patent/BR9406888A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-05-20 EP EP94916747A patent/EP0701622A1/en not_active Ceased
- 1994-05-20 AU AU68318/94A patent/AU6831894A/en not_active Abandoned
- 1994-05-20 JP JP50069595A patent/JP3937445B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-20 CZ CZ953013A patent/CZ301395A3/cs unknown
- 1994-05-20 WO PCT/US1994/005272 patent/WO1994028155A1/en not_active Application Discontinuation
- 1994-05-20 CN CN94192283A patent/CN1124981A/zh active Pending
- 1994-05-20 HU HU9503389A patent/HUT73395A/hu unknown
-
1995
- 1995-02-08 US US08/385,260 patent/US5559020A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5559020A (en) | 1996-09-24 |
| CZ301395A3 (en) | 1996-03-13 |
| JP3937445B2 (ja) | 2007-06-27 |
| CA2163515A1 (en) | 1994-12-08 |
| BR9406888A (pt) | 1996-03-26 |
| CN1124981A (zh) | 1996-06-19 |
| AU6831894A (en) | 1994-12-20 |
| JPH08510644A (ja) | 1996-11-12 |
| WO1994028155A1 (en) | 1994-12-08 |
| EP0701622A1 (en) | 1996-03-20 |
| HU9503389D0 (en) | 1996-01-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0705345B1 (en) | Process for the preparation of pyruvic acid | |
| HUT73395A (en) | Process for preparing glyoxylic acid/dialkyl aminomethylphosphonate mixtures | |
| CA2127094C (en) | Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst | |
| US5135860A (en) | Process for preparing glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures | |
| EP0545553B1 (en) | Enzymatic preparation of N-(phosphonomethyl)glycine | |
| US5541094A (en) | Glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures prepared using a microbial transformant | |
| EP0706577B1 (en) | An improved method of preparing glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures using a microbial double-transformant | |
| WO1996000793A1 (en) | Glyoxylic acid/aminomethylphosphonic acid mixtures prepared using a microbial transformant | |
| CN1153532A (zh) | 用微生物转化体制备的乙醛酸和氨甲基膦酸混合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary prot. cancelled due to non-payment of fee |