IT202000004528A1 - Peptidi auto-assemblanti - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE
Della Domanda di Brevetto per Invenzione Industriale dal Titolo:
?Peptidi auto-assemblanti?
Settore tecnico
? stato dimostrato che gli idrogel a base di peptidi sono materiali biomedici preminenti a causa del loro elevato contenuto di acqua, stabilit? meccanica modulabile, ottima biocompatibilit? ed eccellente iniettabilit?. La capacit? degli idrogel a base di peptidi di fornire ambienti che imitano la matrice extracellulare apre opportunit? per le loro applicazioni biomediche quali ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa, somministrazione di farmaci, coltura tridimensionale di tessuti ed emostasi.
I peptidi autoassemblanti (SAP) sono peptidi corti (di solito 8-16 residui) che si auto-organizzano spontaneamente in nanofibre intrecciate con diametri di 10-20 nm (Pugliese, R., Gelain, F. Peptidic biomaterials: from selfassembling to regenerative medicine. Trends Biotechnol. 2017; 35,145-158). Questo processo guidato dall'energia libera pu? essere regolato dalla chimica molecolare (ad es. molecole di co-assemblaggio), condizioni di assemblaggio (pH, temperatura o elettroliti) e cinetica di assemblaggio. La versatilit? di progettazione dei blocchi peptidici, in combinazione con la loro capacit? di adottare specifiche strutture secondarie (di solito strutture a foglio ?), offre una strategia adatta per progettare nanomateriali con caratteristiche strutturali controllate a livello di nanoscala. Inoltre, i SAP sono biomateriali bioassorbibili e non tossici.
Esempi di tali SAP includono peptidi a foglio ? con residui di amminoacidi idrofili e idrofobici carichi alternati. RADA16 (cio? Ac-RADARADARADARADA-CONH2, SEQ ID NO: 18) ? un peptide ionico autocomplementare ben noto, che d? idrogel a base SAP ben caratterizzati (Zhang, S. et al. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90,3334-3338). Tuttavia, RADA16 e altri SAP noti hanno limitazioni pratiche. Ad esempio, RADA16 deve essere formulato a pH acido per essere solubilizzato, il che pu? causare danni alle cellule e / o ai tessuti. I peptidi sono entit? chimiche che sono onnipresenti in natura e il loro uso ? sfruttato per molte applicazioni in diversi campi; vale a dire materiale peptidico, chimica dei medicinali, nutraceutica e agricoltura. Anche se il concetto di peptide come materiale ? accettato fin dagli anni '90, le miscele di peptidi di origine alimentare, come le proteine di legumi, come sistemi di giacimento di nuovo materiale peptidico sono completamente sconosciute e poco investigate.
Le proteine dei legumi dovrebbero essere frazionate con solubilit? differenziale in albumine, globuline, prolamine e gluteline. Le globuline di legume, che funzionano principalmente come proteine di conservazione, possono essere ulteriormente separate mediante ultracentrifugazione o cromatografia in due componenti principali: legumine (11S) e viciline (7S) e alcune altre frazioni minori. Nella soia, le legumine (indicate anche come glicinina) derivano da un precursore proteico, e sono suddivise in un polipeptide acido (catena) A (pI ? 5) e un polipeptide basico (catena) B (pI ? 8.2). Questi due peptidi sono collegati da un ponte disolfuro e sono considerati subunit?. Esiste una forte omologia tra i legumi di diverse specie di legumi e il sito di scissione del polipeptide A / B ? altamente conservato, sebbene le regioni variabili si trovino principalmente nel peptide A (Arnoldi, A. et al. The Role of Grain Legumes in the Prevention of Hypercholesterolemia and Hypertension. Crit Rev Plant Sci 2015; 34.144-168).
Pertanto, rimane la necessit? di migliorare i peptidi autoassemblanti che possono essere utilizzati per applicazioni che si occupano di cellule e / o tessuti.
Descrizione
La presente divulgazione si basa, almeno in parte, sullo sviluppo di peptidi ionici autoassemblanti aventi combinazioni specifiche di amminoacidi polari ionici, amminoacidi idrofobici e amminoacidi polari non ionici. I SAP secondo la presente invenzione sono usati per produrre idrogel migliorati con vantaggiose caratteristiche fisiche in condizioni fisiologiche. Ad esempio, possono essere prodotte soluzioni acquose dei SAP che rimangono stabili, fluide e iniettabili in condizioni fisiologiche. Al momento della gelificazione, i SAP secondo la presente invenzione presentano sorprendenti parametri viscoelastici e formano spontaneamente nanofibre lunghe e raggruppate, propriet? utili in applicazioni cliniche, industriali e / o di ricerca.
Descrizione delle figure
Figura 1: (A) struttura cristallina della glicinina G1 e il ?strand compreso nello stesso peptide; (B) indice di idropatia; (C) propensione a formare strutture ?-sheet stabili al di fuori dell'ambiente proteico in cui si trova; (D) residui accessibili ai solventi.
Figura 2: Propriet? biomeccaniche di (A) RIES12; (B) RIES16; (C) Scaffold peptidici assemblati SEIR12 all'1% (p / v).
Figura 3: Propriet? biomeccaniche di RIES12 a diversa concentrazione. Figura 4: valutazione di iniettabilit? del peptide RIES12.
Figura 5: Organizzazione supramolecolare dell'idrogel peptidico RIES12 all'1% (p / v). (A) L'idrogel RIES12 presenta un modello CD comprendente un picco negativo vicino a 218 nm e un picco positivo a 195 nm caratteristici della conformazione del ?-sheet; (B) Il test ThT ha mostrato un tipico segnale di emissione legante l'amiloide (picco a ~ 490 nm) confermando la natura ricca di ? dell'idrogel RIES12.
Figura 6: Immagini della microscopia a forza atomica (AFM) di (A) RIES12; (B) SEIR12; (C, scopi comparativi) RIES16; e (D, scopi comparativi) idrogel peptidico HydroMatrix all'1% (p / v).
Figura 7: stabilit? termo-meccanica del peptide RIES12 lungo una rampa di temperatura di 25-37 ? C.
Figura 8: vitalit? cellulare delle cellule (A) Caco-2 e (B) HepG2 su HydroMatrix, RIES12 0,5% o RIES121% (p / v) (bar 100 ?m).
In una prima forma di realizzazione, gli autori descrivono sorprendentemente l'uso di peptidi estratti da prodotti naturali, preferibilmente da legumi, ancor pi? preferibilmente da globuline di legumi, nell'ottenimento di un nuovo materiale.
Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente dimostrato la propensione del peptide RIES, appartenente alla glicinina G1, una proteina di soia, all'autoassemblaggio spontaneo.
Da detta sorprendente osservazione, in alcuni aspetti, la divulgazione fornisce peptidi autoassemblanti (SAP), in cui i SAP comprendono una sequenza di residui di amminoacidi naturali e / o sintetici, amminoacidi modificati chimicamente e composti di sintesi che hanno propriet? note nell'arte per essere caratteristiche di un amminoacido, in cui detta sequenza ? come indicato nella Formula I:
[XYZSer]n[SerZYX]m[XYZSer]o[SerZYX]p Formula I,
in cui ogni (X) ? indipendentemente un amminoacido carico positivamente, in cui ogni (Y) ? indipendentemente un amminoacido non polare con catene laterali idrofobiche, in cui ogni (Z) ? indipendentemente un amminoacido carico negativamente, in cui n = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4, m = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4, o = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4, p = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4, in cui m n o p ? un numero intero di 2, 3 o 4.
In una forma di realizzazione, i residui di amminoacidi sono naturali e in detta Formula I ciascuna (X) ? indipendentemente un amminoacido carico positivamente, ogni (Y) ? indipendentemente un amminoacido non polare con catene laterali idrofobiche, ciascuna (Z) ? indipendentemente un amminoacido carico negativamente.
In una forma di realizzazione preferita, in detta Formula I ciascuna (X) ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Arg, Lys e His, ciascuna (Y) ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Ile, Leu, Val e Ala ciascuna (Z) ? selezionato indipendentemente dal gruppo costituito da Asp e Glu.
In alcune forme di realizzazione, il peptide autoassemblante comprende un gruppo funzionale N-terminale, un gruppo funzionale C-terminale o entrambi.
In alcune forme di realizzazione, il gruppo funzionale N-terminale ? un acetile, un formile, piroglutamil (pGlu), biotina, polietilenglicole (PEG), urea, alchilammina, carbammato, sulfonammide, dansile, 2,4-dinitrofenile, fluoresceina, Acido acetico 7-metossi-cumarina, 9-fluorenilmetilossicarbonile, acido palmitico, succinil, cloroacetile, maleimide, benzilossicarbonil, bromoacetil, nitrilotriacetile, acido terzbossossicarbonile, acido 4-idrossifenilpropico, acido glicil-triclico, acido butil-triclico, acido di butil-butile, tril-butile, acido di butil-tricile, acido di butil-butile, tril-butil, In alcune forme di realizzazione, il gruppo funzionale C-terminale ? o un'ammide, una N-alchil ammide, un'aldeide, un estere, un alcool, para-nitroanilide (pNA), 7-amino-4-metilcoumarina (Amc), un'idrazide , acido idrossamico, clorometilchetone, pnitroanilina, para-nitrofenolo, idrossisucinimide estere, fluorometilchetone, cisteamide, estere 9-fluorenemetil (Fm), estere allilico, 2,4-dimetossibenzil estere, estere 2-fenilisopropilico, estere p-nitrobenzile, estere Estere 2-clorotritilico.
In alcune forme di realizzazione, il gruppo funzionale N-terminale ? un acetile. In alcune forme di realizzazione, il gruppo funzionale C-terminale ? un'ammide. In alcune forme di realizzazione, il gruppo funzionale N-terminale ? un acetile e il gruppo funzionale C-terminale ? un'ammide.
In alcune forme di realizzazione, il SAP comprende almeno un motivo peptidico biologicamente attivo (ad esempio uno, due, tre, quattro o pi?). In alcune forme di realizzazione, almeno un motivo peptidico biologicamente attivo ? presente all'estremit? N-terminale del SAP. In alcune forme di realizzazione, almeno un motivo peptidico biologicamente attivo ? presente all'estremit? C-terminale del SAP. In alcune forme di realizzazione, almeno un motivo peptidico biologicamente attivo deriva da laminina-1, collagene IV, fibronectina, elastina, peptide homing 1 del midollo osseo, peptide homing 2 del midollo osseo o mielopeptide.
Salvo quanto diversamente definito nel presente documento, i termini scientifici e tecnici utilizzati nella presente divulgazione avranno i significati che sono comunemente compresi da quelli di ordinaria esperienza nella tecnica.
I metodi e le tecniche della presente divulgazione vengono generalmente eseguiti, se non diversamente indicato, secondo i metodi convenzionali ben noti nella tecnica e come descritti in vari riferimenti generali e pi? specifici che sono citati e discussi in questa descrizione. I termini di chimica qui usati sono usati secondo l'uso convenzionale nell'arte, come esemplificato dal ?The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms", Parker S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco, C.A. (1985).
Il termine "autoassemblaggio", come usato nel presente documento, si riferisce alla capacit? di alcuni peptidi di auto-associarsi spontaneamente a strutture di ordine superiore (ad esempio ?-sheet). In alcune forme di realizzazione, l'interazione tra i singoli peptidi autoassemblanti ? reversibile, in modo tale che la composizione possa passare in modo reversibile tra uno stato di gel e uno stato di soluzione. Le interazioni tra i singoli peptidi autoassemblanti possono essere interazioni non covalenti tra cui legami a idrogeno, interazioni ioniche, interazioni elettrostatiche, forze di van der Waals e interazioni idrofobiche. In varie forme di realizzazione, la nanostruttura peptidica autoassemblata comprende peptidi in ?-sheet. La nanostruttura pu? essere una nanofibra o una rete di nanofibre.
Come qui usato, il termine "residuo di amminoacidi" o "amminoacidi" include residui di amminoacidi naturali e sintetici inclusi gli amminoacidi D e L; amminoacidi alfa, beta e gamma; aminoacidi modificati chimicamente; e composti sintetizzati chimicamente che hanno propriet? note nell'arte come caratteristiche di un amminoacido.
Come qui usato, il termine "idrogel" si riferisce a una composizione comprendente una rete tridimensionale di peptidi autoassemblanti. Il termine idrogel pu? essere usato per indicare una rete di peptidi autoassemblanti allo stato secco (xerogel) o allo stato umido. Allo stato umido, l'idrogel pu? includere un elevato contenuto di acqua (ad esempio, tra circa il 90% e circa il 99,9% di acqua). Gli idrogel hanno molte propriet? desiderabili per le applicazioni biomediche. Ad esempio, gli idrogel possono essere fabbricati in modo tale che non siano tossici e compatibili con i tessuti. Inoltre, gli idrogel sono generalmente altamente permeabili all'acqua, agli ioni, agli elettroliti e alle piccole molecole.
Come qui utilizzato, il termine "isolato" in riferimento alle cellule si riferisce a una cellula che ? stata separata meccanicamente dall'ambiente da cui si trova in natura.
Come qui usato, i termini "proteine" e "peptidi" sono usati in modo intercambiabile per riferirsi a un polimero di residui di amminoacidi collegati all'altro mediante legami peptidici tra i gruppi alfa-amino e carbossilici di residui adiacenti. I termini "proteina" e "peptide" includono polimeri con residui di amminoacidi modificati (ad esempio residui di amminoacidi fosforilati, ammidati o glicati) e analoghi degli amminoacidi.
In un aspetto, la divulgazione fornisce SAP e composizioni comprendenti almeno un SAP qui descritto. I SAP si assemblano spontaneamente in strutture di ordine superiore tramite interazioni elettrostatiche intermolecolari e intramolecolari quando presenti in una soluzione acquosa. Queste strutture di ordine superiore includono ?-sheet, strutture di nanofibre e strutture tridimensionali di rete o mesh. Queste strutture di ordine superiore in soluzioni acquose possono diventare idrogel aventi una variet? di propriet? desiderabili.
Oltre ai SAP, le composizioni possono includere anche altri additivi come agenti di tonicit?, tamponi, biomolecole e cellule. Sebbene i SAP e le strutture di ordine superiore (ad es. scaffold) costituiti dallo stesso possano essere biodegradabili, queste strutture di ordine superiore mantengono preferibilmente la loro integrit? strutturale per un periodo di tempo necessario per l'uso previsto.
In alcune forme di realizzazione, il SAP comprende una sequenza di amminoacidi come indicato in:
[XYZSer]n[SerZYX]m[XYZSer]o[SerZYX]p Formula I,
in cui ogni (X) ? indipendentemente un amminoacido carico positivo selezionato dal gruppo costituito da Arg, Lys e His, in cui ogni (Y) ? indipendentemente un amminoacido non polare selezionato dal gruppo costituito da Ile, Leu, Val e Ala in cui ciascuna (Z) ? indipendentemente un amminoacido carico negativo selezionato dal gruppo costituito da Asp e Glu, in cui n = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4, m = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4 in cui o = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4; p = 0 o un numero intero di 1, 2, 3 o 4; m n o p ? un numero intero di 2, 3 o 4.
In alcune forme di realizzazione, detta X ? Arg, detta Y ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Ile, Leu, Val e Ala e detta Z ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Asp, Glu.
In alcune forme di realizzazione, detta Y ? Ile, detta X ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Arg, Lys, His e detta Z ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Asp, Glu.
In alcune forme di realizzazione, detta Z ? Glu, detta X ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Arg, Lys, His e detta Y ? selezionata indipendentemente dal gruppo costituito da Ile, Leu, Val e Ala. In alcune forme di realizzazione, detta X ? Arg, detta Y ? Ile e detta Z ? Glu. In una forma di realizzazione preferita, m n o p = 3. In alcune forme di realizzazione, detto n = 1, detti m = 2, o = 0, p = 0, o detto n = 2, detti m = 1, o = 0, p = 0. In un altro aspetto, detto n = 3 e detti m, o, p = 0. In un altro aspetto, detti n, o, p = 0 e detto m = 3.
In alcune forme di realizzazione, il SAP comprende o ? costituito da una sequenza di amminoacidi come indicato in SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.
SAP esemplificativi sono forniti nella Tabella 1 di seguito.
Tabella 1:
SEQ ID NO: Sequenza peptidica
1 AcN-RIESRIES-CONH2
2 AcN-RIESRIESRIES-CONH2
3 AcN-RIESRIESRIESRIES-CONH2
7 AcN-SEIRSEIRSEIR-CONH2
8 AcN-RIESSEIRSEIR-CONH2
9 AcN-RLESRLESRVDS-CONH2
10 AcN-KIESKIESRVDS-CONH2
11 AcN-HIESHIESHIES-CONH2
12 AcN-HVDSRIDSKLDS-CONH2
13 AcN-KLESHLDSRLDS-CONH2
14 AcN- KLDSHLDSRIDS -CONH2
15 AcN-SDLKSEIRSEIR-CONH2
16 AcN-KLDSSELHSDIR-CONH2
17 AcN-RIESRIESSEIR-CONH2
In un'ulteriore forma di realizzazione, viene qui descritta una composizione comprendente almeno un SAP secondo la presente invenzione.
In una forma di realizzazione preferita, detto almeno un SAP ? presente in detta composizione in una concentrazione compresa tra 0,1 e 10% (p / v) o tra 0,5 e 5% (p / v).
In una forma di realizzazione, in detta composizione almeno circa il 95% o almeno circa il 99% di detti SAP sono identici per lunghezza e sequenza. In una forma di realizzazione, detta composizione ? una soluzione acquosa. In una forma di realizzazione, l'uso di detti SAP ? in vitro, cio? per esperimenti di coltura cellulare.
I seguenti esempi non intendono limitare l'invenzione, dove l'invenzione ? intesa come definita nelle rivendicazioni che seguono.
Esempio 1: caratterizzazione delle proteine di soia
Le proteine totali della soia, dopo l'estrazione, sono state digerite usando la pepsina e l'idrolizzato totale ? stato caratterizzato con HPLC-MS / MS (Lammi et al. Soybean Peptides Exert Multifunctional Bioactivity Modulating 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Reductase and Dipeptidyl Peptidase-IV Targets in Vitro J. Funct. Foods 2019; 55,135-145). Complessivamente, sono state identificate pi? di 70 sequenze di peptidi e le corrispondenti proteine madri e, tra queste, il peptide LKPDNRIESEGGL (SEQ ID NO: 19), che appartiene alla glicinina G1 (PDB ID 1UCX), evidenziato perch? nell'intero peptide, un ?-strand, corrispondente alla sequenza RIES, ? compreso (Figura 1A). Mediante risorse bioinformatiche (ovvero GRAVY ed ExPASy) sono state analizzate le propriet? fisiche e chimiche del peptide RIES. Usando i metodi GRAVY e Hphob. / Kyte & Doolittle, l'indice di idropatia ? stato stimato pari a -1,075 (Figura 1B). Inoltre, usando il metodo ?-sheet / Chou & Fasman ? stato stimato che il peptide possiede una buona propensione a formare strutture ?-sheet stabili al di fuori dell'ambiente proteico in cui si trova (Figura 1C). Infine, ? stato dimostrato che gli amminoacidi del peptide RIES hanno una buona accessibilit? ai solventi che possono garantire l'avvio del processo di autoassemblaggio (Figura 1D). I dati hanno sorprendentemente dimostrato la propensione del peptide RIES all'autoassemblaggio spontaneo a causa della sua struttura secondaria e del suo comportamento chimico fisico.
Esempio 2: sintesi di peptidi
I peptidi secondo una forma di realizzazione della presente invenzione sono stati sintetizzati secondo un metodo di sintesi in fase solida Fmoc. I peptidi sono stati sintetizzati sulla resina 4-metil-benzidrilammina ammina di Rink (sostituzione 0,5 mmol ? g<-1>) usando un sintetizzatore automatizzato a microonde. Gli amminoacidi protetti con Fmoc sono stati sciolti a 0,2 M in DMF e la soluzione di deprotezione utilizzata per la rimozione dei gruppi Fmoc era una soluzione al 20% v / v di 4-metilpiperidina in DMF. HBTU 0,5 M in DMF e DIEA 2 M in NMP sono state utilizzate rispettivamente come attivatore e soluzione di base attivatore. La rimozione e la scissione delle catene laterali dei peptidi ? stata eseguita con acido trifluoroacetico al 95% (TFA), 2,5% di acqua e 2,5% di triisopropilsilano. Il C terminale dei peptidi ? stato ammidato dopo la scissione della sequenza peptidica e il terminale N ? stato acetilato usando una soluzione al 20% v / v di Ac2O in DMF. I peptidi spaccati sono stati fatti precipitare, lavati tre volte con dietil etere freddo e sciolti nel 25% di soluzione di acetonitrile prima di essere liofilizzati e conservati a -20 ?C. Il peptide grezzo risultante ? stato purificato da un HPLC binario (> 95%) su una colonna Prep C18, usando un gradiente di acetonitrile in H2O con TFA dello 0,1% in 20 minuti. Il peso molecolare del peptide purificato ? stato identificato tramite spettroscopia MALDI-TOF (4800 Applied Biosystems). La polvere di peptide purificata ? stata successivamente sciolta in una soluzione di HCl 0,1 M per rimuovere la presenza di possibili sali di TFA.
Esempio 3: formazione di idrogel peptidici
I peptidi ottenuti secondo l'esempio 1 sono stati sciolti in acqua deionizzata ad una concentrazione finale dello 0,5%, 1%, 3% e 5% (p / v) mediante sonicazione per 30 minuti. La formazione di idrogel di peptidi ? stata ottenuta mediante innesco di DPBS, HBSS e DMEM. I risultati sono riportati nella Tabella 2.
Tabella 2: Propriet? fisico-chimiche e strutturali dei peptidi, in cui i composti SEQ ID NO: 1, 2, 3 e 7 sono secondo l'invenzione e i composti SEQ ID NO: 4, 5 e 6 sono a scopo comparativo.
Formazione
SEQ Solubilit? del gel in
ID Sequenza peptidica ID in acqua DPBS, PM (g Carica netta a NO: 1% (w/v) HBSS, mol-1) pH 7
DMEM
1 AcN-RIESRIES-CONH2 RIES8 - 1030.1
4 0 2 AcN-RIESRIESRIES- RIES12 1515.6
CONH2 7 0
AcN-3 RIESRIESRIESRIES- RIES16 /- 2001.2
CONH 1 0
2
4 AcN-SIERSIERSIER-
CONH SIER12 - 1515.6
2 7 0
5 AcN-IRSEIRSEIRSE-
CONH IRSE12 - 1515.6
2 7 0
6 AcN-SERISERISERI- 515.6
CONH SERI12 - - 1
2 7 0
7 AcN-SEIRSEIRSEIR-
CONH SEIR12 1515.6
2 7 0
Esempio 4: test reologici
Le propriet? reologiche dei peptidi della presente invenzione sono state studiate con un reometro AR-2000ex (TA Instruments). ? stata utilizzata una geometria troncoconica (diametro troncato acrilico 20 mm; troncamento 34 ?m; angolo 1%). Tutte le misurazioni sono state ottenute a 25 ?C utilizzando una cella Peltier come piastra inferiore dello strumento per controllare la temperatura durante ciascuna prova.
I moduli di memoria (G') e perdita (G") sono stati registrati come una frequenza angolare di funzione (0,1-1000 Hz) con una deformazione fissa dell'1%. L'assemblaggio di tutti i peptidi ? stato attivato aggiungendo DMEM lateralmente alla soluzione peptidica posizionata nello spazio di troncamento della piastra conica da 34 ?m. I risultati ottenuti sono riportati nella Tabella 3. Tabella 3: parametri viscoelastici dei peptidi all'1% (p / v), in cui i composti SEQ ID NO: 1, 2, 3 e 7 sono secondo l'invenzione e i composti SEQ ID NO: 4, 5 e 6 sono per scopo comparativo.
SEQ ID NO: Sequenza peptidica ID G? (Pa) G? (Pa)
1 AcN-RIESRIES-CONH2 RIES8 NA NA
2 AcN-RIESRIESRIES-CONH2 RIES12 1285 182
3 AcN-RIESRIESRIESRIES-CONH2 RIES16 150 34
4 AcN-SIERSIERSIER-CONH2 SIER12 NA NA
5 AcN-IRSEIRSEIRSE-CONH2 IRSE12 NA NA
6 AcN-SERISERISERI-CONH2 SERI12 NA NA
7 AcN-SEIRSEIRSEIR-CONH2 SEIR12 2495 323
Un confronto tra G 'e G'' per alcuni composti esemplificativi, RIES12, RIES16 e SEIR12, ? riportato nella Figura 2. Gli esperimenti di sweep di frequenza di idrogel sono stati registrati in funzione della frequenza angolare (0,1-100 Hz) a uno sforzo fisso di 1 %. In ciascun peptide assemblato, le tendenze dei moduli elastici (G', cerchi neri) e di perdita (G", cerchi bianchi) hanno mostrato profili tipici di idrogel, caratterizzati da un comportamento prevalentemente elastico solido (G') rispetto al componente viscoso (G"). In effetti, i valori di G? erano generalmente di un ordine di grandezza maggiore di G ".
La Figura 3, pannello A e B, mostra che l'aumento della concentrazione di RIES12 (dallo 0,5%, quadrato, al 5%, diamante) aumenta il valore di G', indicando la modularit? del peptide per le diverse esigenze di applicazione. Per testare l'iniettabilit? delle soluzioni peptidiche, i test di assottigliamento al taglio sono stati eseguiti con una serie di test di mantenimento del picco in cui le velocit? di taglio sono state mantenute costanti. Innanzitutto, ? stata applicata una velocit? di taglio di 0,01 s<-1 >per 60 s, quindi ? stata applicata una velocit? di taglio di 5,3 s<-1 >per 20 s, per simulare la velocit? di taglio all'interno del cilindro della siringa. Successivamente, ? stata applicata un'alta velocit? di taglio di 1000 s<-1 >per 20 s per simulare l'iniezione di spurgo della soluzione. Successivamente ? stata nuovamente applicata una velocit? di taglio di 5,3 s<-1 >(20 s), imitando cos? il flusso della soluzione peptidica fuori dall'ago. Infine, ? stata eseguita una velocit? di taglio di 0,01 s<-1 >per simulare la bassa condizione di taglio della soluzione durante l'iniezione.
Un risultato esemplificativo ? mostrato nella Figura 4, in cui il test tixotropico suggerisce un comportamento di assottigliamento del RIES12 grazie al rapido recupero della viscosit? iniziale dopo l'iniezione simulata.
Esempio 5: dicroismo circolare (CD) e saggio di spettroscopia tioflavina T (ThT)
Gli spettri CD di peptidi secondo la presente invenzione sono stati registrati in modalit? di scansione continua (190-300 nm) a 25 ?C usando lo spettropolarimetro Jasco J-810 (Jasco Corp., Tokyo, Giappone). I campioni sono stati preparati diluendo le soluzioni stock di peptidi in acqua distillata (1%) a una concentrazione di lavoro dello 0,001%. Tutti gli spettri sono stati raccolti utilizzando una cella di quarzo a lunghezza di percorso di 1 mm e mediata su tre accumuli (velocit?: 10 nm ? min<-1>). Lo spettro di riferimento dell'acqua distillata ? stato registrato e sottratto da ogni spettro. La stima della struttura secondaria del peptide ? stata ottenuta utilizzando un metodo Russeau.
La Figura 5, pannello A, mostra un risultato esemplificativo osservato con RIES12. Il modello RIES12 CD comprende un picco negativo vicino a 218 nm e un picco positivo a 195 nm, caratteristico della conformazione del ?sheet.
L'analisi ThT dei peptidi ? stata quindi eseguita per valutare la presenza di strutture fibrille ?-fsheet. La soluzione madre ThT (Sigma-Aldrich, T3516) ? stata preparata aggiungendo 8 mg di ThT a 10 ml di tampone fosfato (10 mM di fosfato, 150 mM di NaCl, pH 7) e filtrata attraverso un filtro per siringa da 0,2 ?m. Poco prima dell'analisi, 1 ml di soluzione madre di ThT ? stato diluito in 50 ml di tampone fosfato (soluzione di lavoro). I peptidi (1% p / v) sono stati miscelati con la soluzione di lavoro (1: 0,5 v / v) e agitati per 4 minuti. L'intensit? di fluorescenza ThT ? stata registrata utilizzando un lettore di lastre Infinite M200 PRO (Tecan) con kex = 440 nm (passa banda da 5 nm) e kem = 482 nm (passa banda da 10 nm), oltre 60 secondi a 25 ?C. I risultati esemplificativi ottenuti con RIES12 sono riportati nella Figura 5, pannello B, che mostra il tipico segnale di emissione legante l'amiloide (picco a circa 490 nm), a testimonianza della natura ricca di ? dell'idrogel RIES12.
Dai test CD e ThT, la struttura secondaria di SEQ ID NO: 2 ? stata stimata e i risultati sono riportati nella tabella 5.
Tabella 5:
SEQ ID NO: Sequenza peptidica ID ?-sheet ?-turn Random coil
2 AcN- RIESRIESRIES-CONH2 RIES12 70% 12% 18%
Esempio 6: microscopia a forza atomica
Le immagini AFM sono state acquisite in modalit? intercettazione, utilizzando sonde a sbalzo al silicio a raggio singolo (Veeco RFESP MPP-21100?10, cantilever f0, 59-69 kHz; forza costante: 3 N ? m<-1>). I peptidi da soluzioni madre (1% p / v) sono stati diluiti a una concentrazione di lavoro dello 0,01% (p / v) e depositati su una superficie di mica appena spaccata. 2 microlitri di ciascuna soluzione sono stati mantenuti sulla mica per 4 minuti a temperatura ambiente. I campioni sono stati successivamente sciacquati con acqua distillata per rimuovere i peptidi legati in modo lasco, quindi essiccati a temperatura ambiente per 30 minuti. Sono stati misurate e caratterizzate 100 diverse nanofibre di circa 10 campi indipendenti per campione.
Le immagini esemplificative di AFM sono riportate nella Figura 6, pannello A, RIES12; pannello B, SEIR12; pannello C, RIES16 (comparativo) e pannello D HydroMatrix peptide idrogel (comparativo) all'1% (p / v). Nei grafici, viene riportata la distribuzione della larghezza derivata dalla valutazione di tre diversi campi per ciascun campione. I risultati ottenuti usando i peptidi secondo la presente invenzione mostrano chiaramente nanofibre lunghe e strette con larghezza di 5-12 nm e altezza di 2-6 nm. Quando si utilizzano SAP dell?arte nota come RIES16 o HydroMatrix si osservano nanofibre pi? corte con 1-6 nm di larghezza e circa 1 nm di altezza. Inoltre, come mostrato nei grafici A e B rispetto ai grafici C e D, la distribuzione della larghezza ? bimodale quando si usano i peptidi secondo la presente invenzione, in cui si osserva una distribuzione gaussiana con i peptidi dell?arte nota.
Esempio 7: test di stabilit? termica
I SAP liofilizzati della presente invenzione sono stati sciolti in acqua distillata per raggiungere una concentrazione dell'1% p / v, secondo l'esempio 2. Quindi i peptidi sono stati mantenuti a 4 ?C e la loro stabilit? termomeccanica ? stata valutata immediatamente dopo la solubilizzazione del peptide, dopo 1 settimana e 2 settimane dopo la solubilizzazione. Per testare la stabilit? termo-meccanica, ? stato registrato un gradiente di temperatura controllato in funzione di G '(Trate = 5 ? C min<-1>, deformazione dell'1%, ? = 1 Hz). I risultati esemplificativi ottenuti con RIES12 sono riportati nella Figura 7, che mostra il mantenimento del modulo G? nel tempo. Lo stesso esperimento, se ripetuto con altri peptidi secondo la presente invenzione, ha dato gli stessi risultati (dati non mostrati).
Esempio 8: saggio di vitalit? cellulare (MTT).
Il saggio MTT del peptide RIES12 ? stato eseguito al fine di valutare il suo potenziale effetto citotossico sulle cellule Caco-2 intestinali umane e HepG2 epatiche umane, rispettivamente. Per la coltura cellulare 2D su idrogel RIES12 (0,5-1% p / v), le cellule Caco-2 e HepG2 alla densit? di 5 ? 10<4 >/ pozzetto sono state seminate sulla superficie dell'idrogel RIES12 in piastre trasparenti da 96 pozzetti e incubate per 5- e 3 giorni, rispettivamente, a 37 ? C con atmosfera al 5% di CO2. HydroMatrix (Sigma A6982) ? stato usato come controllo. Successivamente, il mezzo esaurito ? stato rimosso e sono stati aggiunti 100 ?l / pozzetto di 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT). Dopo 2 ore di incubazione a 37 ?C in atmosfera di CO2 al 5%, sono stati aspirati 0,5 mg / mL di soluzione e aggiunti 100 ?L / pozzetto del tampone di lisi (8 mM di HCl 0,5% NP-40 in DMSO). Dopo 5 minuti di agitazione lenta, l'assorbanza a 575 nm ? stata letta utilizzando il lettore di lastre a fluorescenza Synergy H1 (Biotek, Bad Friedrichshall, Germania). I dati riportati nella Figura 8 indicano che i peptidi secondo la presente invenzione sono sicuri ed efficaci. HydroMatrix (Sigma A6982), un idrogel all'avanguardia, ? incluso a scopo comparativo. L'idrogel RIES12 ? sicuro sia per le cellule Caco-2 intestinali umane (pannello A) che per le cellule epatiche umane HepG2 (pannello B), rispettivamente. Entrambe le linee cellulari possono facilmente crescere sopra l'idrogel. Rispetto a HydroMatrix 1% p / v, i risultati ottenuti usando i peptidi secondo la presente invenzione suggeriscono che le cellule Caco-2 e HepG2 possono essere coltivate su idrogel RIES12, senza comprometterne la biodisponibilit?. Pi? in dettaglio, per le cellule Caco-2, sono stati osservati eventuali effetti citotossici e variazioni morfologiche dopo 5 giorni di coltura su 0,5% e 1% (p / v) di RIES12 vs HydroMatrix 1% (p / v) di idrogel, rispettivamente. Inoltre, quando le cellule Caco-2 sono cresciute al di sopra del RIES120,5% (p / v) ? stato osservato un miglioramento significativo della loro vitalit? del 29,7% e il 21,2% rispetto a HydroMatrix e RIES12 all'1% (p / v), rispettivamente ( p <0,5), suggerendo che in base alla propriet? biomeccanica del sistema cellulare intestinale, un bio-materiale pi? rigido pu? influenzarne la crescita. Per le cellule HepG2 sono stati osservati effetti citotossici e variazioni morfologiche anche dopo 3 giorni di coltura su idrogel RIES12 (1% p / v). Quando le cellule epatiche umane sono coltivate su idrogel RIES12 (1% p / v) ? stato osservato un aumento significativo della loro vitalit? del 56,4% rispetto a HydroMatrix (1% p / v) (p <0,001). (bar 100 micron).
Claims (11)
- RIVENDICAZIONI 1. Un peptide autoassemblante (SAP) comprendente una sequenza di residui di amminoacidi naturali e/o sintetici, amminoacidi modificati chimicamente e/o composti sintetizzati chimicamente che hanno propriet? note nell'arte come caratteristiche di un amminoacido, in cui detta sequenza ? come indicato nella Formula I: [XYZSer]n[SerZYX]m[XYZSer]o[SerZYX]p Formula I, dove ogni (X) ? indipendentemente un amminoacido carico positivamente; ogni (Y) ? indipendentemente un amminoacido non polare con catene laterali idrofobiche; ogni (Z) ? indipendentemente un amminoacido carico negativamente; n = 0 o un numero intero pari a 1, 2, 3 o 4; m = 0 o un numero intero pari a 1, 2, 3 o 4; o = 0 o un numero intero pari a 1, 2, 3 o 4; p = 0 o un numero intero pari a 1, 2, 3 o 4; m n o p ? un numero intero pari a 2, 3 o 4.
- 2. Peptide autoassemblante (SAP) secondo la rivendicazione 1, in cui ogni (X) ? indipendentemente un amminoacido carico positivamente selezionato nel gruppo che consiste in Arg, Lys e His; ogni (Y) ? indipendentemente un amminoacido non polare selezionato nel gruppo che consiste in Ile, Leu, Val e Ala; ogni (Z) ? indipendentemente un amminoacido carico negativamente selezionato dal gruppo che consiste in Asp e Glu.
- 3. Un peptide autoassemblante (SAP) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto (X) ? Arg, detto (Y) ? selezionato indipendentemente dal gruppo che consiste in Ile, Leu, Val e Ala e detto (Z) ? selezionato indipendentemente dal gruppo che consiste in Asp, Glu.
- 4. Peptide autoassemblante (SAP) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto (Y) ? Ile, detto (X) ? selezionato indipendentemente dal gruppo che consiste in Arg, Lys, His e detto (Z) ? indipendentemente selezionato dal gruppo che consiste in Asp, Glu.
- 5. Peptide autoassemblante (SAP) secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui (Z) ? Glu, detto (X) ? selezionato indipendentemente dal gruppo che consiste in Arg, Lys, His e detto (Y) ? indipendentemente selezionato da il gruppo che consiste in Ile, Leu, Val e Ala.
- 6. Un SAP secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui m n o p = 3, oppure n = 1, m = 2, o = 0, p = 0 oppure n = 2, m = 1, o = 0, p = 0, oppure n = 3 e m, o, p = 0 oppure m = 3 e n, o, p = 0.
- 7. Un SAP secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, il peptide autoassemblante comprendente un gruppo funzionale N-terminale, un gruppo funzionale C-terminale o entrambi.
- 8. Un SAP secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-7, che comprende o consiste in una sequenza di amminoacidi come indicato nelle SEQ ID NO: 1, 2, 3, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.
- 9. Una composizione comprendente almeno un SAP secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1-8.
- 10. Composizione secondo la rivendicazione 9, in cui detti peptidi sono in una concentrazione compresa tra 0,1 e 10% (p/V) o tra 0,5 e 5% (p/V).
- 11. Utilizzo di peptidi estratti da prodotti naturali, preferibilmente da legumi, per l'ottenimento di una nuova classe di nano materiali bioispirati.
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- 2020-03-04 IT IT102020000004528A patent/IT202000004528A1/it unknown
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