ITCA950007A1 - Kit diagnostico per l'isolamento e la conta batterica delle urinocoltu re e suo impiego per la realizzazione di tale processo. - Google Patents

Abstract

E' descritto un processo per l'isolamento e la conta batterica delle urinocolture, inoltre un kit diagnostico e un contenitore per la realizzazione di tale processo. Tale processo per l'esecuzione delle urinocolture consente di eseguire contemporaneamente la conta e l'isolamento dei microrganismi su terreni selettivi.

Description

Descrizione dell'Invenzione Industriale dal titolo :

"Kit diagnostico per 1'isolamento e la conta batterica delle urinocolture e suo impiego la realizzazione di tale processo"

1. Campo del trovato

La presente invenzione si riferisce a un kit diagnostico per 1'isolamento e la conta batterica delle urinocolture che consente di eseguire contemporaneamente la conta e l'isolamento dei microorganismi su terreni selettivi e al suo impiego per la realizzazione di tale processo.

2. Stato dell'arte

Le infezioni del tratto urinario, sostenute da batteri, possono essere evidenziate in maniera precisa solo per mezzo dell’esame colturale di un campione di urina.

L'isolamento e l'identificazione presuntiva degli agenti eziologici consentono al laboratorio di analisi di fornire al clinico una prima informazione circa la specie batterica prevalente in modo da poter attuare una terapia antibiotica specifica.

Le urinocolture costituiscono generalmente quasi la metà dei campioni patologici che giornalmente affluiscono ai laboratori di microbiologia clinica. Esistono attualmente diversi sistemi per eseguire questa analisi.

Alcuni sono complessi ma più precisi, altri sono semplici ma dotati di un margine di errore elevato. Riportiamo qui di seguito alcuni esempi.

a) Metodo classico dell'agar germi con terreno plate-count (triptic glucose yeast agar)

Questo metodo prevede una diluizione delle urine fino a 10<-3>,10<-4>. Aliquote di queste diluizioni vengono incluse in agar plate-count mantenuto a 45-50°C e quindi distribuite su piastra. Contemporaneamente si esegue la coltura delle urine su altre piastre con terreni comuni o selettivi.

Questo sistema è preciso, ma anche molto lungo e costoso, inoltre è poco pratico quando si devono seminare molte decine di campioni al giorno.

b) Metodo dello slide

E' costituito da una sbarretta di materiale plastico in cui sono disposti 2 o 3 terreni di coltura che viene immersa nel campione di urine da analizzare. Quindi si lascia sgocciolare l’eccesso di urina presente e si pone ad incubare dopo averla riportata in un apposito contenitore.

Questo metodo è uno dei più impiegati soprattutto nei laboratori privati perché molto semplice e rapido nell'esecuzione. Presenta però l'inconveniente di una notevole imprecisione della lettura e della difficoltà di ottenere colonie isolate quando la carica batterica è elevata.

c) Sistema mediante valutazione nefelometrica della positività delle urine.

Questo metodo consiste in una valutazione della torbidità urinaria che viene letta automaticamente da un nefelometro. Supponendo che la torbidità delle urine sia proporzionale al numero dei batteri presenti, è possibile stabilire un valore indicativo della positività del campione.

In questo modo è possibile separare urine positive, che vengono seminate su diverse piastre, o negative, che non vengono seminate o sono coltivate su una sola piastra.

Questo metodo presenta l'inconveniente di indurre facilmente all'errore poiché la torbidità delle urine può essere causata da altri fattori, diversi dai batteri, quali cellule infiammatorie, muco, pus, sali, ecc. Ciò provoca un notevole numero di falsi positivi e falsi negativi.

Inoltre, è necessario l'uso di nefelometro, che comporta un aggravio di costi per il laboratorio.

d) Sistema Uroplate {commercializzato da Sciavo diagnostici) E' costituito da un contenitore in polistirolo cristallo con 6 pozzetti di dimensione 3 x 3 cm ciascuno.

La metodica prevede l'esecuzione della conta batterica mediante 4 singole strisciate in ogni pozzetto.

La valutazione della carica microbica viene effettuata in base alla distribuzione delle colonie nelle diverse strisciate.

In particolare vengono utilizzati per la conta dei gram negativi 2 pozzetti contenenti agar McConkey e sono previste 8 strisciate; per gli enterococchi terreno agar enterococcus 4 strisciate; per gli stafilococchi agar sale mannite 4 strisciate; per conferma agar CLED 4 strisciate; per lo pseudomonas agar pseudomonas che non prevede la conta ma solo l'isolamento.

Questo metodo risulta molto lungo ed indaginoso considerando, in particolare, il fatto che per ogni campione di urina devono essere eseguite ben 20 singole strisciate.

E' pertanto sentita la necessità di un metodo rapido e pratico e che permetta il superamento di alcuni dei problemi sopra citati.

3. Sommario dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce ad un kit diagnostico che permette di realizzare un processo integrato per l'esecuzione di urinocolture in modo rapido e pratico e che consente di eseguire contemporaneamente la conta batterica lineare e 1'isolamento dei microorganismi su terreni selettivi e al suo impiego per la realizzazione di tale processo.

La presente invenzione si riferisce inoltre a un particolare nuovo contenitore per la realizzazione di detto kit diagnostico, detto contenitore presenta una scanalatura più lunga per la conta batterica lineare e una pluralità di scanalature più corte contenenti i terreni di coltura selettivi per l'isolamento degli agenti patogeni più comuni.

Il presente metodo risulta molto efficiente e preciso presentando solo lo 0,5% di falsi negativi.

4. Elenco delle figure

Le Figure 1A e 1B mostrano due esempi di un contenitore che permette la semina delle urine e la conta batterica lineare.

La Figura 1A mostra la piastra di un contenitore comprendente la scanalatura più lunga e quattro scanalature più corte di forma rettangolare.

La Figura 1B mostra la piastra di un contenitore comprendente la scanalatura più lunga e due scanalature più corte di forma rettangolare.

5. Descrizione dettagliata dell'invenzione

L’invenzione si riferisce ad un kit diagnostico che permette di realizzare un processo integrato per l'esecuzione delle urinocolture , tale processo consente di eseguire contemporaneamente la conta batterica lineare e l'isolamento dei microorganismi su terreni selettivi.

Il kit diagnostico secondo la presente invenzione, comprende in un'unica piastra una scanalatura più lunga atta a contenere un terreno di coltura che consente la semina e la conta batterica lineare delle urino colture e un numero variabile di scanalature più corte atte a contenere terreni selettivi per la conta e 1'isolamento dei più comuni agenti patogeni urinari e comprende gli adatti terreni di coltura.

Il processo integrato per l'esecuzione di urinocolture, realizzabile utilizzando il kit sopra descritto, in linea generale comprende le seguenti fasi:

i) immergere un'ansa nel campione di urina da esaminare;

ii) poggiare detta ansa all'inizio della scanalatura più lunga per la conta batterica lineare e strisciare detta ansa sul terreno in senso lineare fino al limite di detta scanalatura senza mai sollevarla;

iii) immergere di nuovo l'ansa nel campione di urina una volta per ogni scanalatura più corta contenente i terreni selettivi e strisciare detta ansa sui terreni in senso lineare da sinistra verso destra sino al limite di dette scanalature;

iv) incubare;

v) effettuare la conta batterica lineare e la identificazione dei microorganismi .

Preferibilmente l'ansa da utilizzare deve essere monouso e con un occhiello calibrato per 10 μΐ.

La conta batterica lineare, secondo detto processo, risulta basata su un sistema semplice e funzionale di valutazione quantitativa delle colonie batteriche cresciute su una striscia di terreno seminata mediante una unica strisciatura lineare.

Se la crescita supera una certa misura di soglia espressa in millimetri, le urine sono considerate positive, altrimenti sono considerate negative.

Secondo una particolare realizzazione dell'invenzione, la lettura dei risultati risulta facilitata dalla presenza di una scala millimetrica che al momento della lettura della conta batterica, dà immediatamente la valutazione di positività o negatività del campione e inoltre l'indicazione del numero di microorganismi presenti nelle urine.

Per la realizzazione del kit viene utilizzato un contenitore particolare, il quale rappresenta una caratteristica dell'invenzione, costituito da una scanalatura più lunga, preferibilmente di forma rettangolare, atto a contenere il terreno per la conta lineare e due o più scanalature più corte, preferibilmente anch’esse di forma rettangolare, atte a contenere i terreni di coltura selettivi per l'isolamento dei più comuni agenti patogeni urinari.

Il contenitore secondo l'invenzione, può essere costruito con i materiali tradizionali utilizzati a questo scopo, ad esempio un termoformato in PTE o in PVC trasparente ma può essere anche realizzato in polistirolo cristallo o con altri materiali plastici trasparenti.

Le dimensioni di detto contenitore possono essere variabili, come pure la forma.

Per esempio, si sono ottenuti ottimi risultati con contenitori di lunghezza tra 15 e 20 cm, preferibilmente 18 cm.

Il contenitore è costituito da un unico fondo o piastra e può essere munito di un coperchio che si adatti perfettamente a detta piastra.

La piastra del contenitore presenta la scanalatura più lunga atta a contenere il terreno per la semina e la conta batterica lineare. La larghezza di detta scanalatura è preferibilmente di 1-2 cm e la lunghezza potrà variare tra 12 e 18 cm, preferibilmente 15· La profondità della scanalatura, in genere, può essere compresa tra 5 e 15 mm.

Possono essere utilizzati per essere posti in detta scanalatura i diversi terreni normalmente impiegati in applicazioni di questo tipo. Tra questi in particolare agar plate-count, agar McConkey, CLED, agar triptosio. Il CLED risulta essere il preferito.

Detto contenitore comprenderà inoltre due o più scanalature più corte nelle quali possono essere inseriti diversi terreni colturali selettivi, tra cui il terreno selettivo per gli enterobatteri McConkey, il terreno per miceti Sabouraud, un terreno per enterococchi, il terreno per stafilococchi

sale-mannite e il terreno agar sangue columbia.

Due esempi di realizzazione del contenitore secondo l'invenzione sono riportati nelle Figure 1A e 1B, presentanti una scanalatura più lunga contenete il terreno per la conta batterica lineare e rispettivamente quattro e due scanalature più corte contenenti i terreni di coltura selettivi.

Il kit diagnostico secondo l'invenzione comprende il contenitore sopra descritto, i terreni sopra citati e inoltre può comprendere un'ansa di plastica per la semina, preferibilmente monouso con un occhiello calibrato per 10 μl.

Il kit diagnostico secondo la presente invenzione risulta essere di facile utilizzazione, pratico e maneggevole.

Inoltre il suo costo, rispetto ai metodi descritti nello stato dell’arte, è certamente inferiore ai metodi a) e c) prima menzionati ed è equivalente al metodo b).

La conta batterica lineare del campione di urina, utilizzando il kit secondo l'invenzione avviene effettuando una unica strisciatura lineare.

L'ansa viene immersa nel campione di urina e quindi poggiata all'inizio (a sinistra) della scanalatura più lunga contenente il terreno per la conta.

L’ansa viene quindi strisciata in senso lineare (verso destra) fino al limite della scanalatura, senza mai essere sollevata.

La coltura nelle scanalature più corte contenenti i terreni selettivi avviene sempre mediante una unica strisciatura lineare utilizzando altre frazioni del campione di urina da esaminare, in particolare una frazione da 10 μΐ per ogni scanalatura.

I risultati della conta batterica vengono letti con l'uso di una scala, preferibilmente millimetrata, direttamente visibile sul bordo della scanalatura più lunga, ad esempio stampata sul bordo di detta scanalatura, come indicato nella Figura 1A.

Questa scala presenta dei segni in corrispondenza di particolari misure espresse in millimetri alle quali corrispondono determinati valori di conta microbica dei campioni seminati .

Secondo una particolare realizzazione e riferendoci alle figure viene meglio descritto qui di seguito l’uso del kit secondo l'invenzione per eseguire la conta batterica lineare.

Dopo avere seminato il kit secondo la presente invenzione secondo il procedimento descritto in precedenza, una crescita microbica che non supera la tacca della scala, posta sul bordo della scanalatura più lunga, in corrispondenza dei 25 mm indica un valore di conta batterica inferiore o uguale a 10^ microorganismi/ml di urina; una crescita microbica che non supera la tacca dei 40 mm indica un valore inferiore o uguale a 10^ microorganismi/ml di urina; quando la crescita microbica supera la tacca dei 40 mm i campioni sono ritenuti positivi in quanto questo valore è indicativo di un numero di batteri superiore a 10^ microorganismi/ml di urina; la tacca dei 70 mm corrisponde a una carica microbica di 10 microorganismi/ml di urina o più e così di seguito.

La crescita microbica eventualmente presente in uno o più dei terreni selettivi contenuti nelle scanalature più corte, consente contemporaneamente il riconoscimento e 1'isolamento delle colonie batteriche le quali possono essere utilizzate per ulteriori prove, ad esempio per antibiogrammi , o prove biochimiche o seriologiche.

I risultati ottenuti impiegando il kit secondo 1'invenzione per 1'esecuzione del processo della conta batterica lineare sopra descritto sono stati confrontati con quelli ottenuti con i sistemi a) metodo classico e b) metodo dello slide, descritti nello stato dell'arte.

Il sistema classico è stato usato come riferimento essendo il più preciso ed elaborato.

Rispetto ad esso il metodo della conta lineare secondo la presente invenzione ha dimostrato di possedere un ottimo potere discriminante tra urine positive e negative: 2 soli campioni su 396 (lo 0,5%) hanno dato un risultato interpretabile come un falso negativo.

I falsi positivi sono stati 21 {il 5%) che corrispondono a quelli ottenuti con il sistema dello slide. Il metodo dello slide però era causa di circa il 6% di falsi negativi.

Tenuto conto che un falso positivo comporta soltanto l'identificazione di una urina come positiva quando contiene un titolo batterico tra 10 e 10<5>, esso può essere considerato un errore tollerabile in quanto non comporta danno al paziente.

I falsi negativi, che sono più importanti in quanto non consentono di determinare una infezione urinaria presente, sono in numero estremamente modesto e non significativo.

In conclusione, il sistema integrato per urinocolture secondo la presente invenzione, risulta semplice e pratico da utilizzare; è affidabile e rapido nella valutazione dei risultati ed è economico.

L'insieme di queste considerazioni rendono detto sistema di elevata potenzialità commerciale.

Claims (2)

1. RIVENDICAZIONI 1. Kit diagnostico per l'isolamento e la conta degli agenti patogeni presenti nell'urina, comprendente un contenitore costituito da una unica piastra che presenta una scanalatura più lunga atta a contenere il terreno per la conta lineare e due o più scanalature più corte atte a contenere i terreni di coltura selettivi e comprendente i terreni adeguati.
2. 2. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il contenitore ha una lunghezza compresa tra 15 e 20 cm. 3- Kit diagnostico secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che il contenitore ha una lunghezza di 18 cm. k. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere un'ansa di plastica per la semina, preferibilmente monouso con un occhiello calibrato per 10 μΐ. 5- Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere un coperchio che si adatti perfettamente a detta piastra. 6. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la scanalatura più lunga ha una larghezza compresa fra 1 e 2 cm, una lunghezza compresa fra 12 e 18 cm e una profondità compresa tra 5 e 15 mm. 7. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 6, caratterizzato dal fatto che la scanalatura più lunga ha una lunghezza di 15 cm. 8. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la piastra presenta una scala millimetrica sul bordo della scanalatura più lunga. 9- Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la scanalatura più lunga contiene almeno uno dei terreni scelti fra agar plate-count, agar McConkey, CLED, agar triptosio. 10 . Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che le scanalature più corte contengono uno dei terreni scelti tra il terreno selettivo per gli enterobatteri McConkey, il terreno per miceti Sabouraud, un terreno per enterococchi, il terreno per Stafilococchi sale-mannite e il terreno agar sangue columbia. 11. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere una scanalatura più lunga e quattro scanalature più corte. 12. Kit diagnostico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di comprendere una scanalatura più lunga e due scanalature più corte. 13· Processo per l'esecuzione di urinocolture che consente di eseguire contemporaneamente la conta e l'isolamento dei microorganismi su terreni selettivi utilizzando il kit diagnostico secondo le rivendicazioni da 1 a 12, comprendente le seguenti fasi: i) immergere un'ansa nel campione di urina da esaminare; ii) poggiare detta ansa all'inizio della scanalatura più lunga e strisciare detta ansa sul terreno in senso lineare fino al limite di detta scanalatura senza mai sollevarla; iii) immergere di nuovo l'ansa nel campione di urina una volta per ogni scanalatura più corta contenente i terreni selettivi e strisciare detta ansa sui terreni in senso lineare da sinistra verso destra sino al limite di dette scanalature; iv) incubare; v) effettuare la conta batterica lineare e la identificazione dei microorganismi .