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JP2000106875A - 目的遺伝子の発現を改善するためのアデノウイルスｅ４リ―ディングフレ―ムの使用 - Google Patents

目的遺伝子の発現を改善するためのアデノウイルスｅ４リ―ディングフレ―ムの使用

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JP2000106875A
JP2000106875A JP11227880A JP22788099A JP2000106875A JP 2000106875 A JP2000106875 A JP 2000106875A JP 11227880 A JP11227880 A JP 11227880A JP 22788099 A JP22788099 A JP 22788099A JP 2000106875 A JP2000106875 A JP 2000106875A
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JP
Japan
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vector
adenovirus
orf3
expression
gene
Prior art date
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JP11227880A
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English (en)
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Majid Mehtali
メータリ マジド
Monika Lusky
ルスキー モニカ
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Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 E4欠失アデノウイルスベクターで見られた導
入遺伝子発現の不安定性を示さない発現ベクター、およ
び細胞中で導入遺伝子の長期発現を得ることができる手
段を提供する。 【解決手段】 目的遺伝子の発現および／または発現の
持続性を改善するのに十分なE4配列を保持するアデノウ
イルスベクターが使用される。また、調節要素に機能可
能に結合し、かつ発現ベクターに挿入された目的遺伝子
の発現および／または発現の持続性を改善するために、
ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6/7、ORF6および
ORF7からなる群から個々にまたは組み合わせて選択され
た、アデノウイルスのE4領域の１つ以上のオープンリー
ディングフレーム（ORF）を含むポリヌクレオチドが使
用される。さらに、宿主細胞、組成物、上記のポリヌク
レオチドまたはアデノウイルスベクターを含む感染性ウ
イルス粒子、ウイルス粒子の調製方法、および、それら
の知治療用途が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｅ１領域の全てま
たは部分およびＥ４領域の一部を欠失するが、宿主細胞
または生物体中の組換え遺伝子の発現および／または発
現の持続性を改善するのに十分なＥ４配列を保持する組
換えアデノウイルスベクターに関する。さらに、発現ベ
クターに挿入された組換え遺伝子の発現または発現の持
続性を改善するための、アデノウイルスＥ４オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の使用に関する。さら
に、本発明は、ウイルス粒子、細胞、このようなベクタ
ーを含む医薬組成物の調製方法、およびそれらの治療ま
たは予防の用途に関する。本発明は、遺伝子治療、特に
ヒトの遺伝子治療の見通しに関して、非常に特別な重要
性をもつものである。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子治療とは、遺伝的疾患または後天
的疾患の治療または阻止のために、細胞または生物体へ
遺伝物質を導入することと定義できる。遺伝子治療によ
りヒト疾患を治療する可能性は、この数年間に理論的考
察の段階から臨床応用へと変化している。ヒトへ適用し
た最初のプロトコールは、アデニンデアミナーゼ（ＡＤ
Ａ）をコードする遺伝子に影響を及ぼす変異の結果とし
て遺伝的に免疫不全である患者に対して、１９９０年９
月に米国にて始められた。この最初の実験が比較的に成
功したことにより、種々の遺伝的疾患または後天的疾患
に対して、この技術の開発が促進された。現行のプロト
コールの大部分は、治療されるべき細胞へ治療遺伝子を
運ぶベクターを使用する。多くのウイルス性ベクターま
たは合成ベクターが、この近年の間に開発されている。
それらの構造、構成および生物学は、当業者が入手し得
る文献に記載されている。多くの動物種に検出されてい
るアデノウイルスは、非組込み性であり、あまり病原性
でない。これらは種々の細胞型の分裂細胞ならびに静止
細胞に感染することができる。これらは気道上皮に対し
て天然親和性を有する。さらに、これらは、長年、極め
て安全なプロフィールを有する生腸ワクチンとして使用
されている。さらには、これらは容易に増殖し、また大
量に精製され得る。これらの特徴から、アデノウイルス
は、治療およびワクチンの目的で、遺伝子治療ベクター
として使用するのに特に適したものになっている。これ
らのゲノムはウイルスサイクルを完成するに必要な約３
０以上の遺伝子を保持する、約３６ｋｂの線状２本鎖Ｄ
ＮＡ分子からなる。初期遺伝子は、それ自身のプロモー
ターによって働く６つの転写単位を含むアデノウイルス
ゲノムに分散された４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分類さ
れる。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４の領域は、ウイルス複製に
は必須であるが、Ｅ３領域は、抗ウイルス性宿主免疫応
答を調節するものと考えられ、インビトロでのウイルス
増殖にとって不必要である。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５）
はその多くがウイルスキャプシドを構成する構造タンパ
クをコードする。これらは少なくとも部分的に初期転写
単位と重複し、ユニークプロモーター（主要後期プロモ
ーター、ＭＬＰ）から転写される。さらに、アデノウイ
ルスゲノムはＤＮＡ複製に必須であるシス作用(cis-act
ing)領域を両端に有する。これらは５’および３’ＩＴ
Ｒ（逆方向末端反復）および５’ＩＴＲに続くパッケー
ジング配列である。
【０００３】Ｅ４領域は、ウイルスＤＮＡ複製、後期ｍ
ＲＮＡ合成、ウイルス組立て、および宿主タンパク合成
の遮断に関与すると考えられている。これは種々のポリ
ペプチドをコードする複合転写単位である。オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）６および７によりコード
されるものは、Ｅ２Ｆ転写因子への結合において細胞性
ＲＢタンパクと競合し、トランスアクチベーターの機能
を与えると推定される。ＯＲＦ４の発現産物は、細胞性
ホスファターゼ２Ａを結合および制御でき、ウイルス
（Ｅ１Ａ）および細胞性転写因子の活性を調節する。Ｏ
ＲＦ３および６によってコードされるポリペプチドは、
アデノウイルスゲノム由来の２８ｋｂの一次転写物を成
熟させる能力または細胞質への輸送ゆえに、ウイルス増
殖に必須である。これらの欠如は、ウイルス増殖を可能
とするためにイントランス(in trans)で相補できる。さ
らに、ＯＲＦ６ポリペプチドは、Ｅ１Ｂにコードされる
５５Ｋポリペプチドと相互作用して、細胞性ｍＲＮＡを
犠牲にして後期メッセンジャーの細胞質蓄積を容易とす
る複合体を形成する。
【０００４】遺伝子治療プロトコールに、現在、使用さ
れているアデノウイルスベクターは、その環境および宿
主体内での播種を避けるために、Ｅ１領域のほとんどを
欠如している。Ｅ３領域のさらなる欠失はクローニング
能力を増加させる。目的遺伝子は、欠失した領域の代わ
りにウイルスＤＮＡ中に導入される。「第一世代」と呼
ばれる、これらのベクター使用する遺伝子導入の可能性
は、多くの事例で証明されている。しかしながら、その
安全性の問題はなおも評価中である。事実、従来の相補
細胞系での増殖中に複製能力のあるウイルスを生成する
可能性は無視できない。さらに、ウイルスバックボーン
によりなお発現されるウイルスタンパク質の潜在的免疫
原性は、形質導入された細胞の持続性および組換え導入
遺伝子の長期発現を減少させ、さらに炎症の発生を伴う
であろう。
【０００５】これらの大きな欠点は、ウイルス複製に必
要なシス(cis) 領域（ＩＴＲおよびパッケージング配
列）を保持し、また炎症性応答の刺激に対して反応する
と仮定されている、ウイルス抗原の残余の合成を完全に
破壊することを目的とする実質的な遺伝子修飾を含む第
二世代のベクターの構築につながっている（例えば、Ｅ
４相補を必要としない、ＯＲＦ３またはＯＲＦ６／７を
除いて、Ｅ４配列を部分的に欠失したアデノウイルスベ
クターを開示する国際公開第ＷＯ９４／２８１５２号ま
たは米国特許第５，６７０，４８８号参照）。アデノウ
イルスの機能全体を欠く最小ベクターもまた考慮され得
る。
【０００６】導入遺伝子発現の持続性は、ヒト遺伝子治
療プロトコール、特に慢性疾患または遺伝的疾患の治療
のために、アデノウイルスベクターを一般的に使用する
ことを考える上の前提である。しかし、最近、Ｅ４領域
の欠失により、異種プロモーター（すなわちＣＭＶプロ
モーター、ＲＳＶのＬＴＲ）による導入遺伝子の発現が
変化することが示されている。共感染の研究では、Ｅ４
産物は安定な導入遺伝子発現をもとに戻すためにイント
ランスで供給され得ると示されている（アーメンタノ(A
rmentano)ら、J.Virol. 71(1997), 2408-2416; ブロー
(Brough)ら、J.Virol. 71(1997), 9206-9213）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このように、本発明の
技術的課題は、Ｅ４欠失アデノウイルスベクターに見ら
れるような導入遺伝子発現の不安定性を示さない発現ベ
クターの提供、および細胞中の導入遺伝子の長期発現を
得ることを可能にする手段の提供にある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】この課題は、請求の範囲
で特徴づけられる態様の提供によって解決される。した
がって、本発明はＥ１領域の少なくとも全てまたは部分
が欠失しているかまたは非機能性であり、かつ、Ｅ４領
域の一部は欠失しているアデノウイルスゲノム由来の、
調節要素に機能可能に連結された目的遺伝子を含む組換
えアデノウイルスベクターであって、宿主細胞または生
物体で目的遺伝子の発現および／または発現の持続性を
改善するのに十分なＥ４配列を保持するアデノウイルス
ベクターに関する。好ましくは、保持されたＥ４配列
は、（ｉ） ＯＲＦ３およびＯＲＦ６＋ＯＲＦ７、（i
i） ＯＲＦ３およびＯＲＦ７、（iii) ＯＲＦ３およ
びＯＲＦ６、（iv） ＯＲＦ３およびＯＲＦ６／７、
（ｖ） ＯＲＦ３およびＯＲＦ４、または（vi） ＯＲ
Ｆ１、２、３および４からなる。
【０００９】驚くべきことに、Ｅ４欠失アデノウイルス
ベクターの損なわれた導入遺伝子発現は、あるＥ４ＯＲ
Ｆ、特に上記したＥ４ＯＲＦの存在および発現によって
完全に回復することが見出された。
【００１０】Ｅ４領域は種々のアデノウイルス株の間で
異なるであろうが、それは種々のソース（刊行物または
データバンク）において入手可能なヌクレオチド配列を
基にして、または十分に特徴づけられているＡｄ５Ｅ４
領域との相同性から同定され得る。示されているよう
に、Ｅ４領域はアデノウイルスゲノムの右端に位置する
が、Ｅ４プロモーターはＩＴＲの５’から３’に位置す
る。転写はアデノウイルスマップの右から左へ生じる。
Ｅ４領域は７つのオープンリーディングフレームを有す
るが、そのうち６つはＡＵＧ開始コドン（ＯＲＦ１、
２、３、４、６および７）を含み、配列解析で確認され
得る少なくとも６つのポリペプチド（ＯＲＦ７にコード
されるタンパク質はまだ同定されていない）をコードす
る。また、ｍＲＮＡマッピングの研究によって、ｍＲＮ
Ａスプライシング事象により生成する２つの新規なＯＲ
Ｆ、すなわちＯＲＦ３／４およびＯＲＦ６／７が確認さ
れている。特に、Ａｄ５ゲノム中で、ＯＲＦ６はｎｔ３
４０７４から３３１９２、ＯＲＦ７はｎｔ３３１１１か
ら３２９１３、並びにＯＲＦ６／７はｎｔ３４０７４か
ら３３９０１（スプライスドナー）および３３１８９
（スプライスアクセプター）から３２９１３にわたる
（カット(Cutt)ら、J. Virol. 61(1987), 543-552;フレ
イヤー(Freyer)ら、Nucl. Acids Res. 12(1984), 3503
-3519）; バータネン(Virtanen)ら、J. Virol. 51(198
4), 822-831参照）。このように、本発明の組換えアデ
ノウイルスベクターは、とりわけ、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７
および／またはＯＲＦ６／７を保持する。ＯＲＦ６、Ｏ
ＲＦ７およびＯＴＦ６／７を保持する構築物は、ＯＲＦ
６およびＯＲＦ７の両方を保持し、対応するｍＲＮＡと
スプライス産物であるＯＲＦ６／７とを生産することが
可能となる。このような配列を本発明の範囲内では、Ｏ
ＲＦ６＋７と呼ぶ。さらに、本発明の組換えアデノウイ
ルスベクターはＯＲＦ３およびＯＲＦ４も含むことがで
き、これはＯＲＦ３およびＯＲＦ３／４、ＯＲＦ３／４
およびＯＲＦ４、ＯＲＦ３およびＯＲＦ４、または、Ｏ
ＲＦ３／４のみを含む。当業者は、上記ＯＲＦを保持
し、かつ、残りの配列を欠くＥ４領域を得るために、慣
用の分子生物学技術によって、アデノウイルスゲノムの
前記Ｅ４領域を変更することができる。特に、アデノウ
イルスＥ４領域から特定のＤＮＡ部分を、たとえば適当
な制限またはエンドヌクレアーゼ消化および再結合によ
って、欠失させることは十分に当業者の技術範囲内にあ
る。他の可能性は、ＰＣＲにより、保持Ｅ４配列を単離
することである。
【００１１】たとえばＥ４領域から、これらのＯＲＦを
欠失させ、それらが導入遺伝子発現に影響を与えるかど
うかを測定することによって、導入遺伝子発現にポジテ
ィブな効果をもたらす、Ｅ４領域に存在するこれらのＯ
ＲＦを決定することは当業者には可能である。さらに、
導入遺伝子を保持するＥ４欠失ベクターへ、インシス(i
n cis)またはイントランス(in trans)にてＥ４ＯＲＦを
提供し、導入遺伝子発現への影響を測定することによっ
て、Ｅ４ＯＲＦの効果を試すことが可能である。このよ
うな方法は実施例にて示される。アデノウイルスベクタ
ーに保持されたＥ４ＯＲＦは単独で、または組み合わせ
で、直接にまたは他の細胞性またはウイルス性因子を介
して、アデノウイルスベクターに挿入された目的遺伝子
の発現を改善することが可能である。導入遺伝子発現に
おける、このポジティブな効果は、種々の段階、すなわ
ち、転写、伸長、輸送、導入遺伝子ｍＲＮＡの安定性ま
たは翻訳にて発揮されるであろう。この改善は、インビ
ボまたはインビトロ実験における導入遺伝子発現産物ま
たは発現の持続持性の評価により測定される。
【００１２】本発明のアデノウイルスベクターは、完全
なＥ４領域を含むベクターと比較して、肝毒性の減少を
示すであろう。
【００１３】好ましくは、組換えアデノウイルスベクタ
ーは、開始点ＡＴＧから停止コドンに至る上記Ｅ４ＯＲ
Ｆの一つ以上の全コード配列を保持する。しかしなが
ら、プロモーター制御能力を有する機能性変異体を使用
することも可能である。このような変異体は天然ＯＲＦ
配列の突然変異または末端削除によって得られるであろ
う。この態様を説明するために、最初のＡＴＧコドンと
第２のＡＴＧコドンの間に含まれる配列を欠失したＥ４
ＯＲＦ６変異体を挙げる。さらに好ましくは、アデノウ
イルスベクターに保持されたＥ４ＯＲＦは、その発現を
可能とする調節要素、より好ましくはその天然調節要
素、特にＥ４プロモーターを含む。あるいは、それらは
異種プロモーターに機能可能に結合(operably linked)
し得る。Ｅ４ＯＲＦの発現を安定化するために、Ｅ４Ｏ
ＲＦはスプライシング配列を保持または含むことが有利
であろう。これらは同種（Ｅ４配列と）または異種（す
なわち、真核遺伝子由来または合成）であろう。基本的
には、先行技術に記載されたスプライシング配列全て、
たとえばαまたはβグロビン、アポリポタンパク質、免
疫グロブリン、第IX因子、第VIII因子、ＣＦＴＲをコー
ドする遺伝子のもの、またはｐＣＩベクター（プロメガ
(Promega））のものなどが好適である。本発明のアデノ
ウイルスベクターに保持されるＥ４ＯＲＦは、このよう
なベクター中に自然に存在するものでよい。特に、これ
らは天然の位置に残存してもよい。しかしながら、Ｅ４
配列全て、特にＥ４ＯＲＦの全てを欠失させ、そしてＥ
４領域が通常に存在する位置または異なる位置で、たと
えば欠失したＥ１またはＥ３領域に代えて、アデノウイ
ルスベクターに、同じまたは他のアデノウイルスバック
ボーンから得たＥ４ＯＲＦを挿入することによっても、
このベクターを構築することが可能である。このＯＲＦ
は、野性型Ｅ４領域の転写方向に関して、センスまたは
アンチセンスの方向に配向し得る。
【００１４】本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ１
領域の少なくとも全てまたは部分が欠失しているかまた
は非機能性であるアデノウイルスベクターである。この
ようなベクターは、Ｅ１領域の少なくとも全てまたは部
分が欠失したアデノウイルスゲノムから誘導され得る。
それはそのゲノムが修飾された親アデノウイルスから得
られ得る。この修飾は多様であり（１以上のヌクレオチ
ドの欠失、変異および／または付加）、また、いかなる
ウイルス配列にも関する。さらに、これらはウイルスゲ
ノムのコード配列中、またはこれらの配列の外に、たと
えばプロモーターなどの調節要素の中に位置する。１つ
の指針としては、いくつかのウイルス配列は欠失され、
非機能性となるか、または異種ヌクレオチド配列と置換
され、特にその発現を宿主細胞に求める遺伝子（１つ以
上の目的遺伝子）と置換され得る。
【００１５】好ましくは、本発明のベクターは、対応す
る領域の全体または部分欠失によって、Ｅ１機能性を欠
く。この欠失は少なくともＥ１ａ配列を包含し、またＥ
１ｂ転写単位まで伸びてもよい。好ましくは、ｐＩＸ遺
伝子と重複するＥ１ｂ配列は欠失していない。このよう
なＥ１欠失は文献にて発表された従来技術のベクター中
に含まれている。本発明のベクターのアデノウイルスバ
ックボーンは、１つ以上のウイルス遺伝子中の欠失、挿
入または変異などのさらなる修飾を含む。有利な態様と
して、それは、Ｅ２および／またはＬ１〜Ｌ５領域の１
つ以上のウイルス遺伝子が非機能性であるアデノウイル
スゲノムから誘導される。非機能性は、１つ以上の列挙
した領域の部分的または完全な欠失によって、または変
異によって得られるであろう。たとえば、Ｅ２ａ領域
（エンシンジャー(Ensinger)ら、J.Virol. 10(1972), 3
28-339）の遺伝子をコードするＤＢＰ（ＤＮＡ結合タン
パク質）に位置する熱感受性変異が挙げられる。全ての
初期および後期領域において欠失した欠損アデノウイル
スベクターもまた、意図されるであろう。
【００１６】さらに好ましい態様では、ベクターはＥ３
領域の全てまたは部分を欠失する。この点においては、
宿主免疫システムを逃れる得るポリペプチドをコードす
るＥ３配列、特にｇｐ１９ｋグリコプロテイン（グーデ
ィング(Gooding)ら、Critical Review of Immunology 1
0(1990), 53-71)をコードするものを保持することは興
味深いものである。
【００１７】本発明のアデノウイルスベクターは、ヒト
または動物のアデノウイルスゲノム、特にイヌ、トリ、
ウシ、マウス、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサル起源また
はこれらのハイブリッドに由来し得る。いかなる血清
型、特にマウスアデノウイルスＭａｖ１（ベアード(Bea
rd)ら、Virology 175(1990), 81-90）、イヌＣＡＶ−１
若しくはＣＡＶ−２（スピベイ(Spibey)およびカバナウ
(Cavanagh), J. Gen.Virol. 70(1989), 165-172; ライ
ネ(Linne), Virus Research 23(1992), 119-133;シバ
タ(Shibata)ら、Virol. 172(1989), 460-467;ジャーベ
ン(Jouvenne)ら、Gene 60(1987), 21-28）、トリＤＡＶ
（ザハールチュク(Zakharchuk)ら、Arch.Virol. 128(19
93), 171-176）、またはウシＢＡＶ３（ミッタル(Mitta
l)ら、J.Gen. Virol. 76(1995), 93-102)も使用し得
る。しかし、サブグループＣのヒトアデノウイルス、特
にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好
ましい。
【００１８】一般的に言えば、上記したウイルスはＡＴ
ＣＣなどの保存機関から入手可能であり、また、その配
列、構成および生物学を記述する多くの刊行物の対象と
なっており、当業者はそれらを実施することができる。
たとえば、ヒトアデノウイルス５型の配列は、参照番号
Ｍ７３２６０としてジーンバンク(Genebank)のデータベ
ースに開示されており、本明細書中に参照により含め
る。
【００１９】前記したように、Ｅ４領域のあるＯＲＦ
が、アデノウイルスベクターに挿入された目的遺伝子の
発現をポジティブに制御可能であることが見出された。
「遺伝子」の語は、全ての起源（原核性、真核性、ウイ
ルス性等）のものであり得る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまた
は他のポリヌクレオチド誘導体）をいう。目的遺伝子
は、たとえばアンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは目
的タンパクへ翻訳されるメッセンジャー（ｍＲＮＡ）を
コードし得る。それは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは
混合型（ミニ遺伝子）を含む。それは、成熟ポリペプチ
ド、前駆体（すなわち分泌されることを意図し、シグナ
ル配列を含む前駆体、タンパク分解によって成熟される
ことを意図する前駆体）、タンパク質断片（末端切断(t
runcated)タンパク質）、種々の配列の融合により得た
キメラポリペプチドまたは改善および／または修飾され
た生物学的性質を示す変異ポリペチドをコードしてい
る。この遺伝子は、分子生物学の慣用技術（ＰＣＲ、適
当なプローブによるクローニング、化学合成）によっ
て、全ての生物体または細胞から単離され、また、もし
必要であれば、その配列は突然変異誘発、ＰＣＲまたは
他のプロトコールによって修飾され得る。
【００２０】下記の目的遺伝子は、特に重要なものであ
る。これらはサイトカイン（α、βまたはγインターフ
ェロン、インターロイキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳ
Ｆ、Ｍ−ＣＳＦ等）、細胞または核受容体、受容体リガ
ンド（ｆａｓリガンド）、凝固因子（ＦVIII、ＦIX
等）、増殖因子（繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管
内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））、酵素（ウレアーゼ、レニ
ン、トロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒素合成
酵素（ＮＯＳ）、ＳＯＤ、カタラーゼ等）、酵素阻害剤
（α１−アンチトリプシン、アンチトロンビンIII、ウ
イルスプロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン活性化因
子阻害剤であるＰＡＩ−１）、ＣＦＴＲタンパク質、イ
ンシュリン、ジストロフィン、Ｉ型またはＩＩ型のＭＨ
Ｃ抗原（主要組織適合複合体）または対応する遺伝子の
発現を調整／制御できるポリペプチド、細菌、寄生体ま
たはウイルスの感染を阻止することが可能なポリペプチ
ドまたはその派生物（抗原性ポリペプチド、抗原性エピ
トープ、競合によって天然タンパク質の作用を阻害する
トランスドミナント(transdominant)変異体等）、アポ
トーシスの誘導物質または阻害剤（Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、
ＢｃｌＸ等）、細胞分裂停止剤（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ
等）、アポリポタンパク質（ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩ
Ｖ、ＡｐｏＥ等）、血管新生阻害剤（アンジオスタチ
ン、エンドスタチン等）、酸素遊離基補足剤、抗腫瘍効
果を有するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素、およ
び、マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ
等）をコードするか、あるいは臨床状態を治療または阻
止するのに有用であると本技術分野で認められている他
の目的遺伝子である。
【００２１】たとえば遺伝性機能障害の治療のために
は、欠損遺伝子の機能的複製物を使用し得る。たとえ
ば、血友病ＡまたはＢには第ＶIII因子または第ＩＸ因
子、筋障害にはジストロフィン（またはミニジストロフ
ィン）、糖尿病にはインシュリン、嚢胞性線維症にはＣ
ＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質）をコード
する遺伝子を使用する。腫瘍または癌増殖を遅延または
阻止する好適な目的遺伝子としては、アンチセンスＲＮ
Ａ、リボザイム、ヘルペス−１単純疱疹ウイルス（ＴＫ
−ＨＳＶ−１）のチミジンキナーゼなどの細胞毒性産
物、リシン、細菌毒、ＵＰＲＴａｓｅ（ウラシルホスホ
リボシルトランスフェラーゼ）およびＣＤａｓｅ（シト
シンデサミナーゼ）活性を有する酵母遺伝子ＦＣＹ１お
よび／またはＦＵＲ１の発現産物、抗体、細胞分裂また
は形質導入のシグナルを阻止するポリペプチド、腫瘍抑
制遺伝子（ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３等）、宿主免疫システ
ムを活性化するポリペプチド、腫瘍関連抗原（ＭＵＣ−
１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶ初期または後期抗原（Ｅ６、
Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２等）等）をコードする遺伝子が挙げら
れ、任意にサイトカイン遺伝子と組み合わせるが、これ
らに限定されない。さらに、抗ＨＩＶ治療には、免疫保
護ポリペプチド、抗原エピトープ、抗体（２Ｆ５；ブケ
イチャー(Buchacher)ら、Vaccines 92(1992), 191-19
5）、ＣＤ４の細胞外ドメイン（ｓＣＤ４；トラウネッ
カー(Traunecker)ら、Nature 331(1988), 84-86）、イ
ムノアドヒシン（すなわちＣＤ４−ＩｇＧハイブリッ
ド、ＣＤ４−２Ｆ５融合物；カポン(Capon)ら、Nature
337(1989), 525-531;バイルン(Byrn)ら、Nature 344(19
90), 667-670）、免疫毒素（すなわちアンギオゲニンと
２Ｆ５またはＣＤ４−２Ｆ５との融合から生じる；クラ
チ(Kurachi)ら、Biochemistry 24(1985), 5494-549
9）、トランスドミナント変異体（ＥＰ０６１４９８
０、ＷＯ９５／１６７８０）、細胞毒性産物（上記参
照）またはＩＦＮαまたはβをコードする遺伝子を使用
してもよい。
【００２２】さらに、目的遺伝子はまた、トランスフェ
クトまたは形質導入された細胞の選択を可能とする選択
遺伝子を含んでもよい。このような遺伝子としては、Ｇ
４１８に対して耐性を与えるｎｅｏ遺伝子（ネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼをコードする）、ｄｈｆｒ
（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）、ＣＡＴ（クロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ｐａｃ（ピュ
ーロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）およびｇｐ
ｔ（キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。選択遺
伝子は本技術分野で公知である。
【００２３】目的遺伝子は、適当なプロモーターを含め
て、機能的発現カセットとして操作し得る。それは、ウ
イルス性、細菌性または真核性のいかなる遺伝子からも
（目的遺伝子からも）得られ、構成的でも調節可能でも
よい。任意に、その転写活性を改善し、ネガティブ配列
を欠失させ、その調節を変更し、適当な制限部位を導入
するなどのために修飾してもよい。適当なプロモーター
としては、下記のものが挙げられるが、これらに限定さ
れない。アデノウイルスＥ１ａ、ＭＬＰ、ＰＧＫ（ホス
ホグリセリン酸キナーゼ）、ＭＴ（メタロチオネイン；
マックアイボール(Mc Ivor) ら、Mol. Cell Biol. 7(19
87), 838-848）、α−１アンチトリプシン、ＣＦＴＲ、
界面活性剤、免疫グロブリン、β−アクチン（タビン(T
abin) ら、Mol. Cell Biol. 2(1982), 426-436) 、ＳＲ
α（タケベ(Takebe)ら、Mol. Cell Biol. 8(1988), 466
-472）、初期ＳＶ４０（シミアンウイルス）、ＲＳＶ
（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ、ＴＫ−ＨＳＶ−１、Ｓ
Ｍ２２（ＷＯ９７／３８９７４）、デスミン（ＷＯ９６
／２６２８４）および初期ＣＭＶ（サイトメガロウイル
ス）。また、プロモーターは腫瘍または癌細胞中で刺激
されてもよい。一例として、乳癌および前立腺癌で過剰
発現したＭＵＣ−１遺伝子（チェン(Chen)ら、J. Clin.
Invest. 96(1995), 2775-2782）、結腸癌で過剰発現し
たＣＥＡ（ガン胎児性抗原）(シュルベ(Schrewe) ら、M
ol. Cell Biol. 10(1990), 2738-2748)、メラノーマで
過剰発現したチロシノース(tyrosinose)（バイル(Vile)
ら、Cancer Res. 53(1993), 3860-3864）、乳癌および
膵臓癌で過剰発現したＥＲＢ−２（ハリス(Harris)ら、
Gene Therapy 1(1994), 170-175）および肝臓癌で過剰
発現したα−フェトプロテイン（カナイ(Kanai) ら、Ca
ncer Res. 57(1997), 461-465）から単離されたプロモ
ーターを使用してもよい。本発明では、初期ＣＭＶプロ
モーターが好ましい。
【００２４】調節要素はさらに、イントロン、分泌シグ
ナル、核局在化シグナル、ＩＲＥＳ、ポリＡ転写終結配
列、三部分(tripartite)リーダー配列および複製起点な
どの別な要素を含んでいてもよい。
【００２５】本発明のアデノウイルスベクターは、１以
上の目的遺伝子を含み得る。異なった遺伝子を同じカセ
ットまたは異なったカセットに含めてもよく、したがっ
て、別な調節要素で調節されてもよい。このカセットは
ベクター内の種々の部位に、同じ方向または反対方向に
挿入されていてもよい。
【００２６】他の態様では、本発明は、発現ベクターに
含まれ、かつ、調節要素に機能可能に結合した目的遺伝
子の発現および／または発現の持続性を改善するため
の、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ
３／４、ＯＲＦ６／７、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７からな
る群から選択される、アデノウイルスのＥ４領域の１つ
以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を単独
で、または組み合わせて含むポリヌクレオチドの使用に
関する。
【００２７】アデノウイルスＥ４領域の一定のＯＲＦの
存在が導入遺伝子の安定な発現には有利であるとの発見
は、アデノウイルスベクター以外の発現ベクターでの導
入遺伝子の安定な発現を得るためにも重要である。すな
わち、アデノウイルスＥ４領域の上記ＯＲＦは、一般的
に、発現系で導入遺伝子の安定な発現を達成するために
使用され得る。この点において、インシス(in cis)また
はイントランス(in trans)のいずれかにてＯＲＦを提供
することによって、導入遺伝子の改善された発現、すな
わち良好な発現または安定な長期間発現を達成すること
が可能である。
【００２８】本発明のアデノウイルスベクターに関連し
て、上記したように、Ｅ４領域は種々のアデノウイルス
株の間で異なる。しかし、アデノウイルスのＥ４領域お
よびそれに含まれるＯＲＦを同定することは、十分に当
業者の技術範囲内のことである。したがって、当業者に
は、本発明に従って、それらを使用するために、アデノ
ウイルスゲノムから上記したＯＲＦを単離することは可
能である。
【００２９】本発明の範囲内で使用されるＥ４ＯＲＦ
は、いかなるアデノウイルス起源（動物またはヒト）か
らも得られるであろう。好ましくは、それらはサブグル
ープＣのヒトアデノウイルス、特に好ましくはＡｄ２ま
たはＡｄ５に由来する。
【００３０】Ｅ４ＯＲＦは、単独でまたは組み合わせ
で、直接に、または他の細胞性またはウイルス性因子を
介して、発現ベクターに挿入された目的遺伝子の発現を
改善することができる。この導入遺伝子発現におけるポ
ジティブな効果は、種々の過程、すなわち、転写、伸
長、輸送、導入遺伝子ｍＲＮＡの安定性または翻訳で発
揮されるであろう。その改善は、インビボまたはインビ
トロ実験における導入遺伝子発現産物またはその発現の
持続性を評価して決定される。それを実施する１つの方
法は、その産物が容易に検出可能である遺伝子（Ｌａｃ
Ｚ、ルシフェラーゼ、α１−アンチトリプシン、第ＩＸ
因子、ＣＦＴＲ等）の発現カセットとともに前記Ｅ４Ｏ
ＲＦを保持するベクターを注入し、Ｅ４アデノウイルス
配列を欠いている対照物と比べて、経時的に導入遺伝子
産物のレベルを測定することである。この改善は、導入
遺伝子産物の量から（少なくとも２倍）または発現の持
続性（より長時間の安定性）から判断され得る。
【００３１】本発明による好ましい態様では、アデノウ
イルスＥ４領域の（ｉ） ＯＲＦ１、２、３および４、
（ii） ＯＲＦ３、６＋７、（iii) ＯＲＦ３および
７、（iv） ＯＲＦ３および６、（ｖ） ＯＲＦ３およ
びＯＲＦ６／７、（vi） ＯＲＦ３および４、または
（vii) ＯＲＦ３／４を含むポリヌクレオチドが使用さ
れる。
【００３２】好ましくは、このようなＯＲＦは完全コー
ド配列、すなわち開始点ＡＴＧから停止コドンまでを含
む。しかし、このようなＯＲＦの機能的変異体、たとえ
ば欠失、変異または末端切断(truncation)により得ら
れ、機能性ポリペプチドをなおもコードする変異体を使
用することも可能である。変異体は、天然の等価物と高
い相同性、特に少なくとも７０％、より好ましくは少な
くとも８０％およびさらに好ましくは少なくとも９０％
の配列同一性を有する、このようなＯＲＦを特に含む。
特に好ましいものは、完全な同一性を有するものであ
る。
【００３３】本発明に使用するポリヌクレオチドは調節
要素に機能可能に結合して、宿主細胞または生物体中で
その発現が可能である。このような要素は、真核起源ま
たはウイルス起源の遺伝子から単離されたプロモーター
を含む。ポリヌクレオチドがいくつかのＥ４ＯＲＦを含
む場合、これらはユニークプロモーターまたは独立した
プロモーターから発現され得る。この場合、種々のＥ４
カセットは同方向または反対方向でよく、また１つ以上
のベクター内で同じまたは異なった位置に存在する。し
かし、選択されたＥ４配列の転写をおこなうユニークプ
ロモーターを使用することが好ましい。第１の可能性
は、それらを同種Ｅ４プロモーターの制御下に置くこと
である。他のものとしては、異種プロモーターを使用す
ることである。このような異種プロモーターは構成的で
あることが好ましく、下記に列記したものから選択でき
る。当業者は、ポリヌクレオチドを機能可能な方法にて
適当なプロモーターに結合させることができる。発現を
安定化するには、Ｅ４ＯＲＦがスプライシング配列を保
持または含有することが有利であろう。それらは同種
（Ｅ４配列由来）または異種（全ての真核遺伝子または
合成起源由来）であってもよい。先行技術に記述される
多種のスプライシング配列は、本発明において好適であ
る。特に、α若しくはβグロビン、アポリポタンパク
質、免疫グロブリン、第ＩＸ因子、第ＶIII 因子、ＣＦ
ＴＲをコードする遺伝子またはｐＣＩベクター（プロメ
ガ)から単離されたものが挙げられる。
【００３４】有利には、ポリヌクレオチド配列は発現ベ
クターに挿入される。本発明では、それはプラスミド、
合成またはウイルス性ベクターであり得る。プラスミド
とは所与の細胞中で自律複製可能な染色体外環状ＤＮＡ
を意味する。プラスミドの選択は非常に広い。好ましく
は細菌中で増幅し、真核宿主細胞中で発現するように設
計される。このようなプラスミドは様々な製造者から購
入することができる。好適なプラスミドとしては、ｐＢ
Ｒ３２２ (Gibco BRL)、ｐＵＣ (Gibco BRL)、pBluescr
ipt (Stratagene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitroge
ne)、ｐＣＩ (Promega)およびｐＰｏｌｙ（レイス(Lath
e) ら、Gene 57(1987), 193-201）由来のものが挙げら
れるが、これらに限定されない。分子生物学技術（サン
ブルック(Sambrook)ら、Laboratory Manual, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (19
89), NY）によって、このようなプラスミドを操作する
ことも可能である。プラスミドは、また、トランスフェ
クトされた細胞を（細胞栄養要求性の相補、抗生物質耐
性によって）選択または同定するための選択遺伝子、安
定化要素（すなわちｃｅｒ配列；サマーズ(Summners)お
よびシェラート(Sherrat), Cell 36 (1984), 1097-110
3）または組込み要素（ＬＴＲウイルス配列）を含んで
もよい。
【００３５】発現ベクターは、ウイルス起源から得られ
てもよく、またヘルペスウイルス、サイトメガロウイル
ス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス
（カナリア痘、鶏痘、ワクシニアウイルス、ＭＶＡ）お
よびレトロウイルスなどの種々のウイルスに由来しても
よい。
【００３６】好ましい態様では、ポリヌクレオチドおよ
び目的遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。これらを
同じ位置（すなわち、Ｅ１アデノウイルスベクターの欠
失Ｅ１配列に代えて）または異なる位置（たとえば、欠
失Ｅ１配列に代えて目的遺伝子および天然Ｅ４領域に代
えてポリヌクレオチド）に挿入してもよい。ポリヌクレ
オチドおよび目的遺伝子をそれぞれが保持する２つの独
立した発現ベクターを使用することも可能である。この
場合、両ベクターをともに宿主細胞へ（コトランスフェ
クションまたは共感染）または別個に導入してもよい。
【００３７】特に好ましい態様では、Ｅ４ＯＲＦを含む
ポリヌクレオチドが挿入されたベクターは、アデノウイ
ルスベクター、好ましくはＥ４領域が欠失したものであ
る。
【００３８】アデノウイルスベクターの性質および構
造、挿入Ｅ４ＯＲＦの位置、目的遺伝子の性質および制
御領域については、本発明のアデノウイルスベクターに
関連して既に説明したことが適用される。
【００３９】さらに、本発明は、調節要素に機能可能に
結合した目的遺伝子を含み、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲ
Ｆ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６／７、ＯＲＦ
６およびＯＲＦ７からなる群から選択され、調節要素に
機能可能に結合した、アデノウイルスのＥ４領域の１つ
以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を独立
して、または組み合わせて含む非アデノウイルスベクタ
ーに関する。
【００４０】ＯＲＦの組合せおよび特徴、ならびに目的
遺伝子の性質については、本発明のポリヌクレオチドの
使用に関して上記に説明したことが適用される。
【００４１】本発明はまた、本発明のアデノウイルスベ
クターを含む感染性ウイルス粒子または本発明の使用法
に関連して説明したＥ４ＯＲＦを含む発現ベクターに関
する。これは本技術分野の慣用方法によって調製しても
よい。アデノウイルスベクターの場合、２９３細胞系な
どの細胞系中で適当なアデノウイルス断片の共感染によ
って実施してもよい（グラハム(Graham)およびプレベク
ト(Prevect), Methodsin Molecular Biology, Vol.7(19
91), Gene Transfer and Expression Protocols; Ed E.
J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJに記載
されるように)。その細胞系をトランスフェクトさせる
前に、連結または同種組換え（ＷＯ９６／１７０７０に
記載されるように）によって大腸菌中でベクターを再構
築することも可能である。さらに、ビリオンは、臨床用
製品の調製に使用できる高力価ウイルス保存物を生成す
るために、許容細胞での継代により増幅される。それは
欠失／変異ウイルス機能をイントランスで与える相補細
胞系中で増殖されるであろう。ヒト胎児腎臓細胞から樹
立した２９３細胞系（グラハム(Graham)ら、J. Gen. Vi
rol. 36(1977), 59-72) は、一般にＥ１機能を相補する
ために使用される。他の細胞系は、イエー(Yeh) ら(J.
Virol. 70(1996), 559-565)、クロリアク(Krougliak)
およびグラハム(Graham)(Human Gene Therapy 6(1995),
1575-1586)、ワン(Wang)ら(Gene Therapy 2(1995), 77
5-783) 、ラスキー(Lusky) ら(J. Virol. 72(1998), 20
22-2033) および国際出願ＷＯ９４／２８１５２および
ＷＯ９７／０４１１９に記載されるものなどの二重欠損
ベクター（Ｅ１°Ｅ４°またはＥ１°Ｅ２°）を相補す
るために作られている。また、ウイルス欠損の少なくと
も一部をイントランスに供給するヘルパーウイルスもま
た使用可能である。
【００４２】本発明はまた、下記工程を有する本発明の
感染性ウイルス粒子の調製方法に関する。 （ｉ） 本発明のアデノウイルスベクターまたは本発明
の使用法に関連して記載したＥ４ＯＲＦを含む発現ベク
ターを、前記ベクターをイントランスで相補することが
可能である相補細胞中に導入して、トランスフェクトさ
れた相補細胞を得、（ii） トランスフェクトされた相
補細胞を、前記感染性ウイルス粒子の生産を可能とする
適当な条件下に培養し、そして（iii) 感染性ウイルス
粒子を細胞培養物から回収する。
【００４３】ベクターは本技術分野で公知である種々の
方法のいずれかによって、細胞系中に導入し得る。リポ
フェクション、電気穿孔および感染によって、ベクター
またはその断片のトランスフェクションを行ってもよ
い。感染性ウイルス粒子を培養物上清から回収してもよ
いが、たとえば一連の解凍／凍結サイクルを繰り返して
溶菌され得る細胞から回収してもよい。任意に、ビリオ
ンを増幅し、標準的方法（クロマトグラフィー、たとえ
ば塩化セシウム勾配による超遠心等）によって精製して
もよい。
【００４４】さらに、本発明は、本発明のアデノウイル
スベクターまたは本発明の使用に関連して記載されたポ
リヌクレオチドおよび発現ベクターを含むか、または、
本発明の感染性ウイルス粒子により感染された宿主細胞
に関する。好ましくは、このような細胞は哺乳動物起源
由来であり、特にヒト起源由来である。ベクターは細胞
性ゲノムに挿入しても、そうでなくともよい（エピソー
ム）。好適な細胞はとしては、造血（全能幹細胞、白血
球、リンパ球、単核球、マクロファージ等）、筋（衛星
細胞、筋細胞(myocyte)、筋原細胞(myoblaste)、平滑筋
細胞等）、心臓、肺、気管、肝臓、血管、上皮、線維芽
または内皮の起源由来の一次または腫瘍性細胞が挙げら
れるが、これらに限定されない。
【００４５】本発明はまた、薬剤として、本発明のアデ
ノウイルスベクター、本発明の使用に関連して記載され
たポリヌクレオチドおよび発現ベクター、本発明によ
る、または本発明方法によって調製された宿主細胞また
は感染性ウイルス粒子を含む組成物、好ましくは医薬組
成物に関する。本発明の組成物は、特に、遺伝疾患（血
友病、糖尿病、嚢胞性線維症、デュシェーヌまたはベッ
カー筋疾患、自己免疫疾患）などの障害または後天性障
害（癌、腫瘍、心臓血管性疾患、ＡＩＤＳまたはＢ型ま
たはＣ型肝炎などのウイルス性疾患等）の予防または治
療処置を特に意図する。
【００４６】本発明の組成物は、局所、全身または経口
投与のための慣用法で製造すればよい。アエロゾル、点
滴液または注射剤が考えられるであろう。好適な投与経
路としては、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、動
脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻腔内、肺内、気管内経路が挙
げられる。投与は１回用量で、またはある時間間隔後に
１回または数回、繰り返す用量で行う。適当な投与経路
および用量は種々のパラメーター、たとえば個人、治療
される障害または導入する目的遺伝子によって異なる。
本発明のウイルス粒子は、１０4〜１０14ｉｕ（感染単
位）、有利には１０5〜１０13ｉｕおよび好ましくは１
０6〜１０12ｉｕの用量の形態で処方され得る。力価は
従来技術（たとえば、ルスキー(Lusky) ら、1998, 上
掲）によって測定できる。ベクターに基づく用量は、
０．０１〜１００ｍｇ、有利には０．０５〜１０ｍｇお
よび好ましくは０．５〜５ｍｇのＤＮＡを含み得る。さ
らに、組成物の薬剤は、薬学的見地から許容される賦形
剤と組み合わせてもよい。処方物は、希釈剤、補助剤ま
たは賦形剤を含んでいてもよい。直接に注射される液体
または使用前に再構成され得る乾燥粉末（凍結乾燥な
ど）として提供され得る。
【００４７】さらに、本発明のベクター、宿主細胞およ
びウイルス性粒子は、任意に、遺伝子導入効率または安
定性を改善する１種以上の物質と組み合わせ得る。この
ような物質は本技術分野では周知であり（たとえば、フ
ェルグナ−(Felgner) ら、(Proc.West.Pharmacol.Soc.3
2(1987), 115-121);ホジソン(Hodgson) およびソレイマ
ン(Solaiman)(Nature Biotechnology,14(1996), 339-34
2); レミー(Remy)ら、(Bioconjugate Chemistry 5(199
4), 647-654) 、また特にポリマー、カチオン性脂質、
リポゾーム、核タンパク質および中性脂肪が挙げられ
る。これらはまた、組合せて使用してもよい（すなわ
ち、カチオン性および中性脂肪）。
【００４８】さらに、本発明は、宿主細胞または生物体
内への遺伝子導入を意図される薬剤の調製、および好ま
しくは遺伝子治療または免疫療法によるヒトまたは動物
の体の治療を目的とする、本発明のアデノウイルスベク
ター、本発明の使用に関して記載されたポリヌクレオチ
ドおよび発現ベクター、本発明のウイルス粒子または宿
主細胞の使用に関する。第１の可能性として、医薬はイ
ンビボで(たとえば、静脈内注射で、接近可能な腫瘍
に、エアロゾルにより肺内に、等）直接に投与してもよ
い。患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋肉
細胞等）を採取し、標準的プロトコールに従って、イン
ビトロでそれらをトランスフェクトまたは感染させ、さ
らに患者にそれらを再投与することからなるイクスビボ
(ex vivo)方法を適用することが可能である。
【００４９】本発明の前記使用の好ましい態様では、前
記アデノウイルスベクター中に保持されたＥ４配列は、
（ｉ） ＯＲＦ３および４、（ii） ＯＲＦ３／４、
（iii) ＯＲＦ３および６＋７、（iv） ＯＲＦ３およ
び６、（ｖ） ＯＲＦ３および７、または（vi） ＯＲ
Ｆ３および６／７である。好ましくは、対応する医薬組
成物は肺組織への遺伝子導入のためのものである。
【００５０】本発明において、他の好ましい使用態様で
は、前記アデノウイルスベクター中に保持されたＥ４配
列は、（ｉ） ＯＲＦ３、（ii） ＯＲＦ３および４、
（iii) ＯＲＦ３／４、（vi） ＯＲＦ３および６＋
７、（ｖ） ＯＲＦ３および６、（vi） ＯＲＦ３およ
び７、または（vii) ＯＲＦ３および６／７である。好
ましくは、対応する医薬組成物は肝臓組織へ遺伝子導入
するためのものである。
【００５１】本発明の使用の前記好ましい態様に関連し
て言及されたアデノウイルスベクターは、毒性を減少さ
せ、および／または宿主細胞または生物体による炎症応
答の減少を引き起こす。これは、下記に記載される実施
例によって説明される。
【００５２】本発明はまた、治療上有効量の本発明のア
デノウイルスベクター、本発明の使用に関連して記載さ
れたポリヌクレオチドおよび発現ベクター、本発明のウ
イルス性粒子または宿主細胞を、そのような治療を必要
とする患者に投与する治療方法に関する。
【００５３】さらに、本発明はまた、同時または別個に
使用する組合せ製品として、（ｉ） 調節要素に機能可
能に結合した目的遺伝子を含む発現ベクター、および
（ii） 本発明の使用に関連して上記に記載されたポリ
ヌクレオチドを含む製品を提供する。
【００５４】この態様において、発現ベクターは従来の
もの、およびプラスミドまたはウイルス由来のものであ
ってもよい。ベクターの語はフリーゲノム（ＤＮＡ）ま
たはウイルスキャプシドにパッケージされたゲノム（ビ
リオン）を包含する。前記したように、ポリヌクレオチ
ドもまた、このようなベクター内に挿入してもよい。
【００５５】
【発明の実施の形態】材料と方法 以下に説明する構築は、サンブルック(Sambrook)ら（19
89, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laborat
ory Press, Cold Spring Harbor, NYまたは近刊版）に
詳述される遺伝子工学および分子クローニングの一般的
な技術に従って、または市販キットを使用する場合、製
造者の説明書に従って実施する。相同組換え工程は、優
先的に大腸菌ＢＪ５１８３株(ハナハン(Hanahan), J. M
ol. Biol. 166(1983), 557-580)を使用し、カルチエ(Ch
artier)ら(J. Virol. 70 (1996),4805-4810)に記載され
るようにして行う。制限部位の修復に関して使用する技
術は、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのラージフラグメン
ト（Klenow）を使用して、５’突出末端を埋めることか
らなる。以下に説明する種々の構築に使用するアデノウ
イルスゲノム断片は、ジーンバンク(Genebank)のデータ
バンクに参照番号Ｍ７３２６０で開示されるＡｄ５ゲノ
ムのヌクレオチド配列中の位置に正確に従って示されて
いる。
【００５６】細胞生物学では、細胞は当業者に周知であ
る標準的な技術によりトランスフェクトまたは形質導入
される。リン酸カルシウム法が言及されているが、他の
いかなるプロトコールを使用してもよい。それらについ
て、培養条件は従来とおりである。２９３細胞系(グラ
ハム(Graham)ら、1977,上掲；ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５
７３)は、Ａｄ５ゲノムの５’末端の染色体への組込み
から生じている。ＴＧ５６０６細胞系(ラスキー(Lusky)
ら、(1998), 上掲)は、Ａｄ５Ｅ４ＯＲＦ６＋７（すな
わち、相当するポリヌクレオチドおよびスプライス産物
ＯＲＦ６／７を生産し得るＯＲＦ６およびＯＲＦ７の両
方を含む配列）配列およびｐａｃ選択遺伝子を保持する
プラスミドｐＴＧ５６０６により安定にトランスフェク
トされた２９３細胞系から誘導される。Ａ５４９はＡＴ
ＣＣ（ＣＣＬ−１２５）で得られる。その他の細胞系も
同様に用いられる。
【００５７】ウイルス生成、ウイルス増殖および力価測
定 ウイルスを生成させるためには、ウイルスゲノムを、以
前に報告されたように(カルチエ(Chartier)ら、1996,
J, Virol. 70, 4805-4810)、ＰａｃＩ消化によってそれ
ぞれの組換えプラスミドから取り出し、適当な相補細胞
系にトランスフェクトした。野生型Ｅ４ベクターを２９
３細胞中で生成させ、一方、全てのＥ４修飾ベクターを
ＴＧ５６０６細胞中で生成させた。ウイルス増殖、精製
および間接ＤＢＰ免疫蛍光法による感染単位（ＩＵ／ｍ
ｌ）の力価測定は、報告の通りであった（ラスキー(Lus
ky)ら、1998、上掲）。各ベクター調製物のウイルス粒
子濃度（Ｐ／ｍｌ）は、ウイルスＤＮＡ含量の測定のた
めの光学密度を使用して計算した（ミッテレーダー(Mit
tereder)ら、1996、J. Virol. 70, 7498-7509）。Ｅ４
相補の有無にかかわらず、Ｅ４修飾ベクターの増殖は、
２９３細胞中で評価し、ＴＧ５６０６細胞中のものと比
較した。
【００５８】動物研究 この研究では、マウスとして、６〜８週齢の雌免疫適格
Ｃ５７Ｂ１／６、ＣＢＡまたは免疫不全性Ｃ．Ｂ１７−
scid/scidマウス（IFFA Credo, L’albresle,France）
を使用した。ＣＦＴＲ導入遺伝子を含有するベクターを
気管内に（Ｉ．Ｔ．）または静脈内に（ＩＶ）、示した
用量で投与した。動物を、示した時間に屠殺した。器官
を取り出し、等片にスライスし、分析まで液体窒素中で
直ちに凍結した。
【００５９】ＤＮＡ分析 全ＤＮＡを、報告されたようにして、組織培養細胞また
は器官から抽出した（ラスキー(Lusky)ら、1998、上
掲）。概略的には、細胞または組織を、ＤＮＡ分解緩衝
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、４００
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）のプロテイナーゼ
Ｋ溶液（１％ＳＤＳ中、プロテイナーゼＫ１ｍｇ）によ
り一夜、消化した。このＤＮＡをフェノールクロロホル
ム抽出、次いでエタノール沈殿によって単離した。ＤＮ
Ａ（１０μｇ）をＢａｍＨＩによって消化し、Ａｄ５ゲ
ノムＤＮＡ（ｎｔ２７３３１〜３１９９３）から精製し
た32Ｐ−標識ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII制限断片を使用
したサザンブロッティング分析法によって分析した。
【００６０】ＲＮＡ分析 全ＲＮＡを、報告されたようにして、また供給者が推奨
するようにして、組織培養細胞および器官から抽出し
た。ノーザンブロット分析法では、全ＲＮＡ１０〜１５
μｇをゲル電気泳動に付し、ニトロセルロースフィルタ
ーへ移した。ＣＦＴＲ−特異的ｍＲＮＡを、ＣＦＴＲｃ
ＤＮＡから精製した32Ｐ−標識ＢａｍＨＩ制限断片（２
５４０ｂｐ）を使用して検出した。ウイルス特異的ｍＲ
ＮＡを、32Ｐ−標識オリゴヌクレオチドを使用して、特
にウイルスＬ１３メッセージのヘキソンｍＲＮＡとハイ
ブリダイズさせて検出した。
【００６１】毒性研究 種々のアデノウイルス構築物の毒性研究を、Ｉｆｆａ
Ｃｒｅｄｏ(L’albresles, France)から購入した６週齢
免疫適格雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ
３ＨまたはＣＢＡ）について行った。マウスを特定病原
体除去施設に収容した。アデノウイルスベクター、容量
１００μｌを尾静脈注入により静脈（i.v.）投与した。
動物を少なくとも１ケ月の期間に亘り、種々の時点
（５、１６および３０または４、１４、３０および６０
日）に屠殺した。肝臓を取り出し、解剖病理分析まで、
１０％ホルムアルデヒド緩衝液中に保存した。ウイルス
粒子濃度は、ウイルスＤＮＡ含有量の測定のための光学
密度を使用して計算した（ミッテレダー(Mittereder)
ら、1996, J. Virol. 70, 7498-7509）。
【００６２】解剖病理分析を、ヘマトキシリンおよびエ
オシンで染色した１０％ホルマリン固定パラフィン包埋
組織について行った。肝臓障害（異栄養）および炎症状
態（リンパ球浸潤）を目視判定した。
【００６３】肝臓毒性を、屠殺時間毎に採取した血清試
料のトランスアミナーゼ含量を分析して評価した。ＧＯ
Ｔ（グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）お
よびＧＰＴ（グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナー
ゼ）濃度を標準的酵素法によって測定した。ＧＯＴは、
Ｌ−アスパラギン酸と２−オキサログルタミン酸の間の
アミノ基転移を触媒して、Ｌ−グルタミン酸およびオキ
サロ酢酸を生成するアスパラギン酸アミノトランスフェ
ラーゼ（ＡＳＴ）活性の代表的なものであり、後者はリ
ンゴ酸デヒドロゲナーゼの存在下にＮＡＤＨと反応す
る。ＮＡＤＨ酸化速度は、３４０ｎｍの光学的吸収の減
少から評価し（Cobas Integra）、直接的にＡＳＴ触媒
活性に比例する。ＧＰＴは、Ｌ−アラニンと２−オキソ
グルタル酸の間の反応を触媒し、Ｌ−グルタミン酸とピ
ルビン酸を生成するアラニンアミノトランスフェラーゼ
（ＡＬＴ）活性の代表的なものであり、後者は乳酸デヒ
ドロゲナーゼの存在下にＮＡＤＨと反応する。このＮＡ
ＤＨ酸化速度は３４０ｎｍの光学的吸収の減少から評価
され、直接的にＡＬＴ触媒活性に比例する。
【００６４】
【実施例】次に、下記実施例を用いて本発明を説明す
る。
【００６５】
【実施例１】 Ｅ４修飾ベクターの構築 ＣＭＶプロモーター駆動発現カセットを保持する、一連
の同質遺伝子型ＡｄＥ１°およびＡｄＥ１°Ｅ４°ベク
ターを作製した。全てのベクターは、Ｅ１配列（ｎｔ４
５９〜３３２７を欠失）およびＥ３（ｎｔ２８５９２〜
３０４７０を包含する小さな欠失（Ｓ）またはｎｔ２７
８７１〜３０７４８にわたる大きな欠失（Ｌ）のいずれ
か）の本質部分を欠失したアデノウイルスバックボーン
を有する。なお、本明細書中でヌクレオチド番号付け
は、クロボチェック(Chroboczek)ら（Virology 186 (19
92), 280-285）(またはＡＴＣＣ Ｍ７３２６０)に従
う。これらは全てｈＣＭＶプロモーターから転写され、
βグロビンポリＡシグナルによって終結する、Ｅ１領域
に代えて挿入されたヒトＣＦＴＲｃＤＮＡを含む。下記
ベクターはＥ４欠失の大きさによって異なる。しかし、
これら全ては、Ｅ４領域または個々のＥ４ＯＲＦの発現
のために、ウイルスＥ４プロモーターを使用する。これ
らはカルチエ（Chartier）ら（1997、上掲）およびラス
キー(Lusky)ら（1998、上掲）に報告された大腸菌の相
同組換えによる感染プラスミドとして構築される。ウイ
ルスは、その欠損に従い、Ｅ１（２９３）またはＥ１お
よびＥ４（ＴＧ５６０６）相補細胞系中にて作製され
る。完全Ｅ４領域およびＥ４ＯＲＦ６／７を保持するベ
クターはＥ４機能の相補を必要としない。さらに、全て
のベクターで、内因性ポリＡ部位を使用する。
【００６６】ＡｄＴＧ６４２１は、Ｅ４ＯＲＦ６＋７
（すなわち、対応するポリヌクレオチドおよびスプライ
ス産物ＯＲＦ６／７を生産し得るＯＲＦ６およびＯＲＦ
７の両方を含む配列）を含む。ＢｇｌII（ｎｔ３４１１
２）およびＡｖｒII（ｎｔ３５４６１）制限部位の間の
配列を欠失し、末端を平滑化し結合したものである。
【００６７】ＡｄＴＧ６４４７は、ＯＲＦ１〜４を含
み、ＯＲＦ６および７を欠失している。これはＭｕｎＩ
部位（ｎｔ３２８２２）およびＡｃｃＩ部位（ｎｔ３３
９８４）の間のウイルス配列ｎｔ３２８２７〜３３９８
５を欠失させて作製された。次いで、これらの部位を平
滑化し結合したものである。
【００６８】ＡｄＴＧ６４４９は、Ｅ４ＯＲＦ３および
４を含む。これは、ＰｖｕII（ｎｔ３４７９６）および
Ｅｃｏ４７−３（３５５０１）による制限切断および再
結合によって、ｎｔ３４７９９〜３５５０３にわたる配
列をＯＲＦ１および２からさらに欠失させてＡｄＴＧ６
４４７から得られる。
【００６９】ＡｄＴＧ６４７７は、ＡｄＴＧ６４４９か
ら誘導され、ＴｔｈＩ（ｎｔ３４０６４）およびＮａｒ
Ｉ（ｎｔ３４１８９）部位の間の部分的欠失によって不
活性化されたＯＲＦ４を有する。したがって、このベク
ターはＥ４ＯＲＦ３を含む。
【００７０】ＡｄＴＧ６４８７は、ＳｓｐＩとＥｃｏ４
７−３部位の間のｎｔ３４６３２〜３５５０３にわたる
配列を欠失させることによりＡｄＴＧ６４４７から誘導
される。したがって、このベクターはＥ４ＯＲＦ４を含
む。
【００７１】ＡｄＴＧ６４９０は、２つの別な欠失を含
む。まず、ＯＲＦ１および２は、ＰｖｕII部位（ｎｔ３
４７９６）およびＥｃｏ４７−３（３５５０１）間のｎ
ｔ３４７９９〜３５５０３を欠失する。さらに、ＯＲＦ
４はＴｔｈＩ（ｎｔ３４０６４）およびＮａｒＩ（ｎｔ
３４１８９）間のｎｔ３４０６９〜３４１９０の配列の
欠失により、不活性化される。したがって、このベクタ
ーはＯＲＦ３、６＋７を含む。Ｅ４ＯＲＦ６は最初のＡ
ＴＧ（ｎｔ３４０７４）を欠くことに注意すべきであ
る。このベクターはＥ４相補が無くても、２９３細胞中
で増幅され得るから、第２ＡＴＧ（ｎｔ３４０４７）
で、翻訳が開始され、その生成物は機能的であると推定
される。
【００７２】ＡｄＴＧ６４１８は、上記した特徴全てを
有し、野生型Ｅ４領域を含む陽性コントロールである
（Ｅ４＋）。ＡｄＴＧ５６４３はＥ４領域の大きな欠失
を含む陰性コントロールである（Ｅ４°）。このＥ４欠
失は、ＯＲＦ１（ラスキー(Lusky)ら、(1998)、上
掲））を除いて、Ｅ４コーディング配列のほとんどを除
去したＡｄ２（チャルバーク(Challberg)およびケトナ
ー(Ketner), Virology, 114 (1981), 196-209）のＨ２
ｄｌ８０８欠失と同一である。
【００７３】これらのウイルス粒子を回収し、精製し、
ラスキー(Lusky)ら(1998、上掲)に記載されるようにし
て、力価測定した。ＡｄＴＧ６４１８を２９３細胞で生
産させ、他の全てを２９３−Ｅ４（ＴＧ５６０６）細胞
で生産させた。力価測定データは、ベクターバックボー
ンの特徴をまとめた下記表１に示される。
【００７４】
【表１】
【００７５】この結果は、Ｅ４領域内の欠失は、十分な
相補が提供される限り、同様な力価によって示されるよ
うに、ウイルス増殖を損なわないことを示す。さらに、
ＯＲＦ３、６および７を除いて、Ｅ４ＯＲＦの全てを欠
失すると有益な効果を有し、より多くの感染性ウイルス
を生産することが可能となる。
【００７６】初期の研究では、Ｅ４ＯＲＦ３、または
６、または６＋７のいずれかを含むＡｄベクターは、Ｅ
４相補がなくても増殖する能力を保持すると示されてき
た（ファン(Huang)およびヒアリング(Hearing)、1989、
J.Virol. 63,2605-2615）。したがって、ベクター中の
Ｅ４ＯＲＦのぞれぞれまたはその組合せの機能性を確認
するため、これらのベクターの増殖を、Ｅ４相補を欠く
場合（２９３細胞）またはＥ４相補のある場合（ＴＧ５
６０６細胞）についてモニターした。ファン(Huang)お
よびヒアリング(Hearing)によるデータと一致して、Ｅ
４ＯＲＦ６＋７（ＡｄＴＧ６４２１）またはＥ４ＯＲＦ
３、６＋７（ＡｄＴＧ６４９０）を含むベクターは、２
９３細胞において、高い収率で増殖でき、野生型Ｅ４領
域を含むベクター（ＡｄＴＧ６４１８）で得られた収率
と同様であった。このことから、ベクターＡｄＴＧ６４
２１中で、Ｅ４ＯＲＦ６およびＥ４ＯＲＦ６／７タンパ
ク質の翻訳はＯＲＦ６翻訳フレームに存在する最初のＡ
ＴＧから開始できると指摘される。その反対に、ベクタ
ーＡｄＴＧ６４９０のＥ４ＯＲＦ６およびＥ４ＯＲＦ６
／７タンパク質における最初のＡＴＧは、このベクター
の構築の過程で欠失している。したがって、Ｅ４ＯＲＦ
６および６／７の翻訳はＯＲＦ６翻訳フレーム内の第２
ＡＴＧ（アミノ酸１０）を使用しなければならない。こ
のベクター（ＡｄＴＧ６４９０）は２９３細胞中で高レ
ベルで増殖できるから、これらのデータはＥ４ＯＲＦ６
および６／７タンパク質の最初のＮ−末端アミノ酸９個
は、少なくともウイルス増殖には不必要であることを示
す。
【００７７】Ｅ４ＯＲＦ１〜４（ＡｄＴＧ６４４７）お
よびＥ４ＯＲＦ３＋４（ＡｄＴＧ６４４９）を含むベク
ターはまた、レベルが低下するものの（野生型Ｅ４ベク
ターに比べて、１００倍減少）、Ｅ４相補のない状態で
増殖可能であった。ＯＲＦ３（ＡｄＴＧ６４７７）のみ
を含むベクターは、ウイルス収率が野生型Ｅ４ベクター
のものと比較して、約１０００倍減少しても、２９３細
胞中でその増殖が明らかであった。このように、ベクタ
ーＡｄＴＧ６４４７、ＡｄＴＧ６４４９およびＡｄＴＧ
６４７７の増殖は、これらの構築物でのＯＲＦ３の機能
性を確認するものであった。Ｅ４ＯＲＦ４（ＡｄＴＧ６
４８７）またはＯＲＦ１（ＡｄＴＧ５６４３）を含むベ
クターは先に報告されたように（ラスキー(Lusky)ら、1
998、上掲）、２９３細胞中で増殖できなかった。しか
しながら、全てのベクターはＥ４相補の存在下に高力価
にまで増殖できた。
【００７８】
【実施例２】 ＣＦＴＲ発現 Ａ．ＣＭＶプロモーター活性に及ぼすＥ４機能の影響 Ｅ１°（ＡｄＴＧ６４１８）およびＥ１°Ｅ４°（Ａｄ
ＴＧ５６４３）ベクターを使用して、非相補ヒトＡ５４
９細胞を感染多重度１００ＩＵ／細胞でインビトロ感染
させた。全細胞性ＲＮＡを感染細胞から感染７２時間後
に抽出し、ＣＦ特異プローブを使用して、ＣＦＴＲｍＲ
ＮＡの定常状態濃度を分析した。その結果はＥ１°ベク
ターからの強いＣＦＴＲ発現を示した。反対に、ＣＦＴ
Ｒ発現はＥ１°Ｅ４°ベクターから検出できなかった。
これらのデータは、ウイルス性Ｅ４領域が、ＣＦＴＲ発
現を行うために使用されるＣＭＶプロモーターからの転
写に影響を与えることを示す。しかしながら、強い定常
状態レベルは、野性型Ｅ４領域またはＥ４領域ＯＲＦ１
〜４を含む無ＣＦＴＲベクターの共感染により、回復さ
れる。これはあるＥ４遺伝子産物がＣＭＶ駆動(driven)
導入遺伝子発現を活性化できることを示す。同様な結果
はＲＳＶプロモーターを使用して得られた。Ｅ４領域を
欠くと、ＲＳＶ駆動導入遺伝子発現は遮断され、イント
ランスのＥ４領域によって回復される。
【００７９】Ｂ．免疫欠損マウスでの導入遺伝子発現 ＡｄＥ１°およびＥ１°Ｅ４°ベクターをスキッド(Sci
d)マウス（ウイルス用量１．５×１０9ＩＵ／動物）へ
気管内（ＩＴ）注射した。Ｅ１°ベクターについて、ウ
イルスゲノムおよびＣＦＴＲｍＲＮＡの持続性を注射１
００日後までモニターした。放射性アデノウイルス制限
断片を使用して、ウイルスＤＮＡをサザンブロット分析
法により検出した。次いで、シグナルをオートラジオグ
ラフ（GS-700 Imaging densitometer; Bio-RAd) の光学
濃度走査によって定量した。ＣＦＴＲｍＲＮＡの定常状
態濃度を前記のようにして評価した。
【００８０】ＡｄＥ１°ゲノム量は、経時的に最初の値
の１０％未満まで一様に低下したけれども、驚くべきこ
とに、ＣＭＶプロモーターからの最初の強いＣＦＴＲ発
現は、ウイルスゲノムのクリアランスにも拘わらず、１
００日の期間に亘り、維持誘導された。このように、Ｅ
４領域を含むベクターを使用すると、ウイルスゲノムは
盛んに除去されるが、導入遺伝子発現は一定に残存し、
経時的に活性化されるようであった。
【００８１】同様な分析を対応するＡｄＥ１°Ｅ４°ベ
クターについて実施した。ウイルスゲノムのクリアラン
スは、Ｅ１°ベクターにおいて見られたものと、実質的
に同じように生じた。注射３日後のＣＭＶ駆動導入遺伝
子発現は、Ｅ１°ベクターで見られたものと非常に似て
いたが、１４日後までにＥ１°Ｅ４°ベクターからの導
入遺伝子発現は、突然に遮断された。ウイルスゲノムの
持続およびクリアランスは、Ｅ１°とＥ１°Ｅ４°ベク
ターについて実質的に同じであるから、発現データはＣ
ＭＶ発現カセットの能力がＥ４領域の存在で増強される
ようであることを示す。
【００８２】この問題を探求するために、Ｅ１°Ｅ４°
ＣＦＴＲベクターを無ＣＦＴＲベクターＥ１°Ｅ４ＯＲ
Ｆ１−４（ＡｄＴＧ４６８０）と共に注射した。その結
果はＥ４ＯＲＦ１〜４がイントランスに存在すると、強
くて安定なＣＦＴＲ導入遺伝子発現を可能にすることを
示す。第２実験で、ＡｄＥ１°Ｅ４°ＣＦＴＲベクター
を注射したスキッドマウスに、ＡｄＴＧ４６８０を４５
日後に注射することにより、１４日以内にＣＭＶ駆動導
入遺伝子発現のレスキュー(rescue)が導かれた。これら
の結果は、ＣＭＶプロモーターが不可逆的には抑制され
なかったことを示す。
【００８３】Ｃ．免疫適格マウスでの導入遺伝子発現 ウイルスゲノム持続性およびＣＦＴＲ導入遺伝子発現
を、また、ＣＭＶ−ＣＦＴＲ発現カセットを含むＡｄＴ
Ｇ６４１８（Ｅ１°）またはＡｄＴＧ５６４３（Ｅ１°
Ｅ４°）を注射した免疫適格マウスにおいてモニター
し、比較した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでは、両タイプの
ベクターに関するＤＮＡクリアランスの動態が非常に似
ていて、ウイルスゲノムのコピー数が注射後１４日以内
に最初の値の１０％未満まで減少した。ＣＢＡマウスで
は、ＡｄＥ１°Ｅ４°ベクターゲノムは同様な動態によ
り除去された。対照的に、ＡｄＥ１°ベクターゲノムは
注射１４日後迄に最初の量の１％未満まで下がった。
【００８４】Ｃ５７ｂｌ／６およびＣＢＡマウスにおけ
るＡｄＥ１°Ｅ４°ベクターからの導入遺伝子発現は安
定でなく、注射１４日後に検出できなかった。驚くべき
ことに、ＡｄＥ１°ベクターからの導入遺伝子発現は、
ＣＢＡマウスのみで、注射１４日後までに遮断された。
しかし、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスでは、ＡｄＥ１°ベクタ
ーからのＣＦＴＲ発現が注射１２０日後にもなお観察さ
れた。これらの結果はＣ５７Ｂｌ／６マウスが、導入遺
伝子に対して、いくぶん寛容性があるとの考えを支持す
るものである。さらに、ＡｄＥ１°ＣＦＴＲ導入遺伝子
発現の維持もまた、Ｅ４転写活性機能の影響を受けるの
かもしれない。
【００８５】Ｄ．ウイルスＥ４領域の機能性吟味(disse
ction) さらに、ウイルスＥ４領域からの転写活性を探求するた
めに、個々のＥ４ＯＲＦを含むベクターおよびこれらを
組み合わせたものについて、上記のように、スキッドマ
ウスにおいて、インビトロおよびインビボの評価を行っ
た。
【００８６】Ａ５４９細胞へ形質導入後、ウイルスＤＮ
Ａが全試料において検出された。これは、Ｅ４領域内の
欠失がインビトロでのＤＮＡ持続性を変化させないこと
を示す。しかし、ＣＦＴＲｍＲＮＡの定常状態濃度は、
種々の試料により劇的に変化した。予期したように、強
いシグナルがポジティブコントロールＡｄＴＧ６４１８
（Ｅ１°Ｅ４＋）で見られたが、Ｅ４領域の欠失（Ａｄ
ＴＧ５６４３）は、ＣＦＴＲ発現を完全に遮断する結果
になった。ＯＲＦ３（ＡｄＴＧ６４７７）、ＯＲＦ４
（ＡｄＴＧ６４８７）またはＯＲＦ６＋７（ＡｄＴＧ６
４２１）の存在は、部分的に導入遺伝子発現を回復し
た。しかし、ＣＦＴＲｍＲＮＡの濃度は、ポジティブコ
ントロール（野性型Ｅ４）で得られたものに比べて、非
常に弱いままであった。ＯＲＦ３および４（ＡｄＴＧ６
４４９）の存在は、ＯＲＦ１〜４（ＡｄＴＧ６４４７）
の存在と同様にＣＭＶプロモーターの活性をほとんど完
全に回復した。しかし、ＯＲＦ３、６＋７（ＡｄＴＧ６
４９０）の存在下ではＣＭＶプロモーター活性は、野性
型に比べて改善された。
【００８７】この実験では、ウイルスＥ４領域の存在下
に、肺（Ｉ．Ｔ．）での導入遺伝子発現は１００日まで
安定であったことが示される。反対に、ウイルスＥ４領
域の欠失は注射３日後〜１４日後の間、遺伝子発現を遮
断する結果となった。ＡｄＥ１°Ｅ４°バックグラウン
ド(background)では、導入遺伝子発現はウイルスＥ４Ｏ
ＲＦ１〜４によって、イントランスで活性化された。さ
らに、ＡｄＥ１°Ｅ４°−ＣＦＴＲベクターを含むマウ
スでは、導入遺伝子発現は最初の注射後、４５日で、Ａ
ｄＥ１°Ｅ４ＯＲＦ１−４ベクターの注入により、レス
キューされた。この結果は、ＣＭＶプロモーターは不可
逆的に抑止されず、Ｅ４遺伝子産物はポジティブにＣＭ
Ｖプロモーターを制御することを示す。個々のＥ４ＯＲ
Ｆについての我々のデータは、トランスアクティベーシ
ョン機能はＥ４領域ＯＲＦ３プラスＯＲＦ４またはＯＲ
Ｆ３プラスＯＲＦ６＋７を含むベクター中で維持される
ことを示す。
【００８８】Ｅ．組織特異的発現 宿主免疫応答による干渉なしで、インビボでの導入遺伝
子発現の活性化および持続性に及ぼすＥ４修飾の効果を
モニターするために、１．５×１０9ビリオンの各構築
物（ｗｔＥ４、ＯＲＦ１〜４、ＯＲＦ３および４、ＯＲ
Ｆ３、６および７、ＯＲＦ３またはＯＲＦ１のみを保持
する）を免疫欠損スキッドマウスに気管内（Ｉ．Ｔ．）
および静脈内（Ｉ．Ｖ．）注射により投与した。ベクタ
ー持続性および導入遺伝子発現を、それぞれサザンブロ
ット分析法およびＣＦＴＲノーザンブロット分析法によ
って、感染動物の肺および肝臓中で、経時的に（肺組織
で、３、１４、４５および８３日、肝臓組織で、３、１
４および３０日）モニターした。
【００８９】ベクタークリアランスは、肺では、経時的
により安定であると考えられるＥ４ＯＲＦ３（ＡｄＴＧ
６４７７）およびＥ４ＯＲＦ３、６＋７（ＡｄＴＧ６４
９０）を含むベクターを除いて、全てのベクターで同様
であり、同様な割合で生じた。全てのベクターは導入遺
伝子を初め（３日後)は、高濃度および同等濃度に発現
した。しかし、２重欠失ベクターＡｄＥ１°Ｅ４°で見
られたように、Ｅ４ＯＲＦ３（ＡｄＴＧ６４７７）、Ｅ
４ＯＲＦ４（ＡｄＴＧ６４８７）およびＥ４ＯＲＦ６＋
７（ＡｄＴＧ６４２１）を含むベクターでは、ＣＦＴＲ
発現は注射３日後および１４日後の間に遮断された。対
照的に、Ｅ４ＯＲＦ１〜４（ＡｄＴＧ６４４７）および
Ｅ４ＯＲＦ３＋４（ＡｄＴＧ６４４９）を含むベクター
並びにＥ４ＯＲＦ３、６＋７（ＡｄＴＧ６４９０）を含
むベクターでは、ＣＦＴＲ発現は、種々のレベルではあ
るが、８３日の間（実験期間）持続した。興味深いこと
にＡｄＴＧ６４９０ベクターで得られた導入遺伝子発現
は、モニター時間内で構成的に高いレベルを持続するよ
うであり、ＣＦＴＲｍＲＮＡの定常状態レベルは野生型
Ｅ４ベクター（ＡｄＴＧ６４１８）で得られたものより
も高かった。反対にＥ４ＯＲＦ１〜４（ＡｄＴＧ６４４
７）およびＥ４ＯＲＦ３、４（ＡｄＴＧ６４４９）ベク
ターからの導入遺伝子発現は、持続している間、構成的
に高いレベルでなかった。これらのベクターによる導入
遺伝子発現は注射１４日後に減少し、４５日に誘発さ
れ、注射８３日後に再び減少するようである。
【００９０】ＣＦＴＲ発現持続の同様なパターンが、免
疫適格Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにて観察された。
【００９１】驚くべきことに、肝臓ではＥ４ＯＲＦ３単
独が、導入遺伝子の安定および持続的発現を促進するに
十分であった。Ｅ４ＯＲＦ３＋４またはＥ４ＯＲＦ３、
６＋７の組合せもまた、導入遺伝子発現を持続した。Ｅ
４ＯＲＦ３単独が、肝臓で導入遺伝子発現をレスキュー
することができ、肺ではそうではないとの知見は、組織
または細胞型特異的因子がＥ４機能と共同して、ＣＭＶ
プロモーターからの遺伝子発現を制御することを示す。
【００９２】まとめると、我々の結果は、トランス活性
化機構と同様に、ＡｄＥ４領域の状態がＣＭＶプロモー
ターなどの異種プロモーターの発現を制御するとの概念
を確信させるものである。さらに、我々のデータはＥ４
領域の影響は複雑であることを示す。Ｅ４ＯＲＦ３は明
らかにＣＭＶプロモーターの制御に要求される。肝臓で
は、Ｅ４ＯＲＦ３単独の機能は持続的遺伝子発現を促進
するに十分である。さらに、ＯＲＦ３効果はＯＲＦ４ま
たはＯＲＦ６＋７の存在下に増強された。気管内（Ｉ．
Ｔ．）投与後、肺での導入遺伝子発現は、Ｅ４ＯＲＦ３
＋ＯＲＦ４の組合せ、またはＥ４ＯＲＦ３、６＋７によ
りのみ回復した。同様な結果は、ベクター持続性および
導入遺伝子発現を肝臓中で、３、２１、４５および９０
日後にモニターした第２実験で得られた。
【００９３】
【実施例３】 後期ウイルス遺伝子発現に及ぼすＡｄ５
−Ｅ４遺伝子産物の影響 後期ウイルス遺伝子発現におけるＥ４遺伝子産物の影響
をモニターするために、個々のＥ４ＯＲＦまたはその組
合せを含むＡｄＥ１°ベクターを、感染多重度１０００
ＩＵ／細胞にて、Ａ５４９細胞に感染させた。対照とし
て、ＡｄＥ１°Ｅ４ｗｔおよびＡｄ５を同様に感染させ
た。感染７２時間後に、全メッセンジャーＲＮＡを感染
細胞から調製し、ノーザンブロット分析法に付し、ヘキ
ソンｍＲＮＡに特異的なＤＮＡプローブを使用して、後
期ウイルス遺伝子発現の代表的なものであるウイルスヘ
キソンｍＲＮＡを検出した。その結果を表２にまとめ
る。
【００９４】
【表２】
【００９５】これらの結果は、全Ｅ４領域の欠失はウイ
ルス遺伝子発現の排除につながることを示す。Ｅ４ＯＲ
Ｆ１〜４またはＥ４ＯＲＦ３、４を含むベクターは、Ａ
ｄ５Ｅ１°Ｅ４ｗｔと比較した場合、同様なレベルの後
期ウイルス遺伝子発現を示した。後期ウイルス遺伝子発
現はＯＲＦ３またはＯＲＦ６＋７の存在下では減少し
た。興味深いことに、Ｅ４ＯＲＦ３をＯＲＦ６＋７と組
合せると（Ａｄ５Ｅ１°ＯＲＦ３，６＋７）、後期ウイ
ルス遺伝子発現はさらに著しく減少した。重要なこと
は、Ｅ４ＯＲＦ３、６＋７の組合せは、インビトロおよ
びインビボで、最高レベルで、かつ持続性ある導入遺伝
子発現を示した。
【００９６】これは、Ｅ４ＯＲＦ３、６＋７を含むＡｄ
５Ｅ１°などのベクターは、治療用途において重要な特
徴の組み合せ、すなわち、高レベルで持続性ある導入遺
伝子発現と極めて低レベルのウイルス抗原発現の組み合
わせにより、宿主の免疫原性が低リスクであることを示
す。
【００９７】
【実施例４】 アデノウイルスベクターの肝細胞毒性 Ａ．Ｅ１欠失アデノウイルスベクターの肝細胞毒性 Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスに、空
ベクター（導入遺伝子なし）から産生した１．２×１０
11個のウイルス粒子を静脈投与した後、Ｅ１欠失アデノ
ウイルス構築物の肝細胞毒性を評価した。肝臓切片の病
理解析は、肝細胞性腫脹、収縮、好酸性変性、アポトー
シスおよびマイトネクロシスなどの種々の肝細胞障害を
示した。融合(confluent)壊死は見られなかった。門脈
小管は正常であった。損傷は決まった優性位置はなく、
散在していた。肝臓損傷と組合わさって、多くの門脈管
がリンパ球性浸潤によって拡大された。単核細胞のいく
つかの病巣が門脈および小葉中心の静脈壁近くに分散し
ていた。いくつかの実験では、肝臓損傷は早くも４日目
に明らかとなり、２１〜３０日迄には悪化した。
【００９８】さらに、Ｅ１欠失アデノウイルスベクター
を静脈投与すると、対照レベルに比べて、血清トランス
アミナーゼ（ＧＯＴ、ＧＰＴ）のレベルが高くなった。
いくつかの実験では、トランスアミナーゼの上昇は、注
射後、早くも４〜５日目に観察された。最大は通常、注
射後、１４〜２１日の間に得られ、ＧＯＴよりもＧＰＴ
に対して、より高く示された。ＧＰＴは肝細胞障害およ
び肝壊死の感度の高いマーカーであり、一方、ＧＯＴは
心筋梗塞中に上昇する。Ｅ１ベクターで得られたトラン
スアミナーゼ値は、病理解析によって明らかにされた肝
障害を確認するものである。
【００９９】Ｂ．Ｅ４欠失アデノウイルスベクターの肝
細胞毒性 この研究の目的は、Ｅ１およびＥ４の２重欠失した空の
アデノウイルスベクターの毒性をＥ１単独欠失のものと
比較することである。この実験は上記に示したものと同
じ実験条件で行った。１．２×１０11個のＥ１〜Ｅ4 粒
子を注射したマウスから得られた肝臓切片の解剖病理解
析は肝臓毒性の減少を示した。異栄養病巣がときどき見
られたが、Ｅ１欠失アデノウイルスベクターに比べて、
明らかに減少した。興味深いことに、いくつかのリンパ
球浸潤が観察されたが、異栄養病巣を誘発していなかっ
た。
【０１００】さらに、空のＥ１およびＥ４欠失ベクター
を注射したマウスの血清で測定した、ＧＯＴおよびＧＰ
Ｔトランスアミナーゼ濃度は、バックグランドレベル
（対照）と等しかった。これらの結果はＥ４領域をアデ
ノウイルスバッグボーンから除去した場合、肝臓障害が
低いことを示す病理観察を確認するものであった。
【０１０１】したがって、そのＥ１欠失相当物と対比す
ると、ＡｄＥ１／Ｅ４欠失ベクターは、より低い毒性お
よび炎症反応を再現可能に生じ、このことは、Ｅ４遺伝
子産物自体が炎症反応の誘発に関与することを示唆して
いる。
【０１０２】Ｃ．アデノウイルスベクターの毒性におけ
る個々のＥ４ＯＲＦの役割 アデノウイルスベクターの毒性におけるＥ４遺伝子産物
の役割を理解するために、Ｅ４領域の個々のＯＲＦ、ま
たはそれらの組合せをディスプレーする同種遺伝子ベク
ターまたは空のベクターを設計し、作成した。これらの
ベクターは、宿主免疫および炎症反応と導入遺伝子との
干渉を排除するために、ＣＦＴＲ発現カセットを欠くこ
とのみ、実施例１に記述したものと相違する。これらの
構築物の粒子２×１０11個をＣＢＡマウスに静脈注射し
て、その肝臓毒性を評価した。肝臓部分の病理解析結果
を表３にまとめる。
【０１０３】
【表３】
【０１０４】先に示したように、Ｅ１欠失ベクター（野
性型Ｅ４領域を有する）は注射後、早くも４日目に異栄
養と炎症を誘発し、毒性は注射後２１日間増加した。全
Ｅ４領域を欠失すると、この毒性は劇的に減少した。Ｏ
ＲＦ３、６＋７を含むベクターを除いて、個々のＥ４Ｏ
ＲＦおよびＯＲＦ６＋７とＯＲＦ３、４の組合せを含む
ベクターでは、Ｅ４欠失アデノウイルスベクターと比べ
て、毒性および炎症の減少を示した。対照的に、Ｅ４Ｏ
ＲＦ３、６＋７を含むベクターは、野性型Ｅ４領域を保
持するアデノウイルスベクターのように、肝細胞障害お
よび炎症を誘発した。
【０１０５】注射後４および２１日目にＧＯＴおよびＧ
ＰＴを測定して、これらの結果が確認された。既に述べ
たように、野性型Ｅ４遺伝子産物を発現するビリオンの
注射により、注射２１日後に肝臓細胞への毒性を示す高
レベルのトランスアミナーゼを誘発した。同様な誘発が
大きくはないが、Ｅ４ＯＲＦ４単独およびＥ４ＯＲＦ３
と６＋７の組合せを保持するＥ１ベクターで観察され
た。対照的に、ＯＲＦ３単独またはＯＲＦ３、４を保持
するアデノウイルスで得られたトランスアミナーゼ濃度
は、対照およびＥ１／Ｅ４ベクターで測定したものと同
じ範囲内であり、したがって、肝細胞にとって非毒性で
あると言える。ＯＲＦ６＋７単独を保持するベクター
は、僅かに増大したＧＯＴおよびＧＰＴ血清濃度を示し
た。
【０１０６】毒性または非毒性が、注射したウイルスの
低注入量の結果でないかどうかを証明するために、ウイ
ルスＤＮＡ持続性をサザンブロット分析法によって肝臓
で評価した。同様な量のウイルスＤＮＡが全ベクターに
おいて見られ、野性型Ｅ４、Ｅ４ＯＲＦ３、６＋７また
はＥ４ＯＲＦ４を保持するベクターで見られた高毒性
は、あるＥ４遺伝子産物の影響であることを示唆する。
【０１０７】結論として、Ｅ４領域を分析し、肺および
肝臓での導入遺伝子発現の持続および肝細胞毒性につい
てＥ４修飾ベクターを探ることによって、いくつかの予
期しない結果が生じた。
【０１０８】Ｅ４ＯＲＦ３とＥ４ＯＲＦ４またはＥ４Ｏ
ＲＦ６＋７のいずれかとを組み合わせると、肺での導入
遺伝子発現を持続することができた。しかし、導入遺伝
子のプロファイルは、異なった組合せとは定性的および
定量的に異なっていた。Ｅ４ＯＲＦ３、６＋７の存在下
で導入遺伝子発現は構成的であり、野性型Ｅ４領域の存
在下よりも高レベルでさえあった。対照的に、Ｅ４ＯＲ
Ｆ３および４の存在下での導入遺伝子発現は、持続した
けれども、周期的に減少および誘発された。興味深いこ
とに、Ｅ４ＯＲＦ３、４ベクターは低肝細胞毒性を誘発
した。
【０１０９】肝臓では、Ｅ４ＯＲＦ３の存在はＣＭＶプ
ロモーターからのＣＦＴＲ遺伝子発現を制御するに十分
であった。同様に、Ｅ４ＯＲＦ３、４またはＥ４ＯＲＦ
３、６＋７の組合せは、導入遺伝子発現を持続させるこ
とができた。さらに、Ｅ４ＯＲＦ３またはＥ４ＯＲＦ
３、４を含むベクターは、非常に低レベルの肝臓毒性お
よび炎症を示す。これらのベクターは低毒性と持続性導
入遺伝子発現とを両立するので、肝臓特異的遺伝子治療
の用途において有益となるであろう。
【０１１０】
【発明の効果】本発明により、Ｅ４欠失アデノウイルス
ベクターで見られた導入遺伝子発現の不安定性を示さな
い発現ベクター、および細胞中で導入遺伝子の長期発現
を得ることができる手段が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 31/18 31/18 35/00 35/00 37/06 37/06 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 5/10 7/00 7/00 7/02 7/02 5/00 Ａ

Claims (45)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｅ１領域の少なくとも全てまたは部分が
    欠失しているかまたは非機能性であり、かつ、Ｅ４領域
    の一部が欠失しているアデノウイルスゲノム由来の、調
    節要素に機能可能に連結された目的遺伝子を含む組換え
    アデノウイルスベクターであって、宿主細胞または生物
    体中で前記目的遺伝子の発現および／または発現の持続
    性を改善するのに十分なＥ４配列を保持するアデノウイ
    ルスベクター。
  2. 【請求項２】 保持されるＥ４配列が、（ｉ） ＯＲＦ
    ３、ＯＲＦ６＋７、（ii） ＯＲＦ３およびＯＲＦ７、
    （iii) ＯＲＦ３およびＯＲＦ６、または（iv） ＯＲ
    Ｆ３およびＯＲＦ６／７からなる請求項１記載のベクタ
    ー。
  3. 【請求項３】 保持されるＥ４配列がＯＲＦ３およびＯ
    ＲＦ４並びに／またはＯＲＦ３／４からなる請求項１記
    載のベクター。
  4. 【請求項４】 保持されるＥ４配列がＯＲＦ１、２、３
    および４からなる請求項１記載のベクター。
  5. 【請求項５】 保持されるＥ４配列が同種Ｅ４プロモー
    ターに機能可能に連結されている請求項１〜４のいずれ
    か１項に記載のベクター。
  6. 【請求項６】 保持されるＥ４配列が異種プロモーター
    に機能可能に連結されている請求項１〜４のいずれか１
    項に記載のベクター。
  7. 【請求項７】 保持されるＥ４配列がスプライシング配
    列を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載のベクタ
    ー。
  8. 【請求項８】 保持されるＥ４配列が、Ｅ４領域が通常
    に存在する位置と異なった位置でアデノウイルスゲノム
    中に位置する請求項１〜７のいずれか１項に記載のベク
    ター。
  9. 【請求項９】 Ｅ２および／またはＬ１〜Ｌ５領域の１
    つ以上のウイルス性遺伝子が非機能性である請求項１〜
    ８のいずれか１項に記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 さらにＥ３領域の全てまたは部分が欠
    失している請求項１〜９のいずれか１項に記載のベクタ
    ー。
  11. 【請求項１１】 ヒト、イヌ、トリ、ウシ、マウス、ヒ
    ツジ、ネコ、ブタまたはサル起源のアデノウイルス由来
    またはそれらのハイブリッド由来である請求項１〜１０
    のいずれか１項に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 ヒトアデノウイルス５（Ａｄ５）また
    は２（Ａｄ２）由来である請求項１１記載のベクター。
  13. 【請求項１３】 前記目的遺伝子が、サイトカイン、細
    胞または核受容体、リガンド、凝固因子、ＣＦＴＲタン
    パク、インシュリン、ジストロフィン、増殖因子、酵
    素、酵素阻害剤、アポトーシス誘発物質、アポトーシス
    阻害剤、細胞分裂停止剤、アポリポタンパク質、酸素遊
    離基捕捉剤、抗腫瘍効果を有するポリペプチド、細菌
    性、寄生性またはウイルス性の感染を阻害する能力を有
    するポリペプチド、抗体、毒素、免疫毒素およびマーカ
    ーをコードする遺伝子からなる群から選択される請求項
    １〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
  14. 【請求項１４】 調節要素がプロモーターを含む請求項
    １〜１３のいずれかに１項に記載のベクター。
  15. 【請求項１５】 プロモーターが、初期サイトメガロウ
    イルスプロモーターまたはＲＳＶ（ラウス肉腫ウイル
    ス) ＬＴＲ由来である請求項１４記載のベクター。
  16. 【請求項１６】 調節要素に機能可能に結合し、かつ発
    現ベクターに挿入された目的遺伝子の発現および／また
    は発現の持続性を改善するために、ＯＲＦ１、ＯＲＦ
    ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６／
    ７、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７からなる群から個々にまた
    は組み合わせて選択された、アデノウイルスのＥ４領域
    の１つ以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）
    を含むポリヌクレオチドの使用。
  17. 【請求項１７】 ポリヌクレオチドが、Ｅ４領域のＯＲ
    Ｆ１、２、３および４、好ましくはＯＲＦ３および４並
    びに／またはＯＲＦ３／４を含む請求項１６記載の使
    用。
  18. 【請求項１８】 ポリヌクレオチドが、前記Ｅ４領域の
    （ｉ） ＯＲＦ３、６＋７、（ii） ＯＲＦ３および
    ７、（iii) ＯＲＦ３および６、または（iv） ＯＲＦ
    ３およびＯＲＦ６／７を含む請求項１６記載の使用。
  19. 【請求項１９】 ポリヌクレオチドが、同種Ｅ４プロモ
    ーターに機能可能に結合している請求項１６〜１８のい
    ずれか１項に記載の使用。
  20. 【請求項２０】 ポリヌクレオチドが、異種プロモータ
    ーに機能可能に結合してる請求項１６〜１８のいずれか
    １項に記載の使用。
  21. 【請求項２１】 ポリヌクレオチドがスプライシング配
    列を含む請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の使
    用。
  22. 【請求項２２】 ポリヌクレオチドが、目的遺伝子を含
    む発現ベクターに挿入されている請求項１６〜２１のい
    ずれか１項に記載の使用。
  23. 【請求項２３】 ポリヌクレオチドおよび目的遺伝子が
    独立のベクターに挿入されている請求項１６〜２１のい
    ずれか１項に記載の使用。
  24. 【請求項２４】 ベクターが、プラスミド、合成ベクタ
    ーまたはウイルスベクターである請求項１６〜２３のい
    ずれか１項に記載の使用。
  25. 【請求項２５】 ベクターがアデノウイルスベクターで
    ある請求項２４記載の使用。
  26. 【請求項２６】 アデノウイルスベクターが、Ｅ１領域
    の少なくとも全てまたは部分および天然Ｅ４領域の全て
    が欠失しているアデノウイルスゲノム由来である請求項
    ２５記載の使用。
  27. 【請求項２７】 アデノウイルスベクターが、Ｅ２およ
    び／またはＬ１〜Ｌ５領域の１つ以上のウイルス遺伝子
    が非機能性であるアデノウイルスゲノム由来である請求
    項２５または２６記載の使用。
  28. 【請求項２８】 アデノウイルスベクターが、さらに、
    Ｅ３領域の全てまたは部分が欠失している請求項２５〜
    ２７のいずれか１項に記載の使用。
  29. 【請求項２９】 アデノウイルスベクターが、ヒト、イ
    ヌ、トリ、ウシ、マウス、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサ
    ル起源のアデノウイルス由来またはそれらのハイブリッ
    ド由来である請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の
    使用。
  30. 【請求項３０】 アデノウイルスベクターがヒトアデノ
    ウイルス５（Ａｄ５）または２（Ａｄ２）由来である請
    求項２９記載の使用。
  31. 【請求項３１】 ポリヌクレオチドが、天然Ｅ４領域が
    通常に存在する位置と異なる位置でアデノウイルスベク
    ター中に位置する請求項２５〜３０のいずれか１項に記
    載の使用。
  32. 【請求項３２】 ポリヌクレオチドが、欠失した天然Ｅ
    ４領域の代わりにアデノウイルスベクター中に位置する
    請求項２５〜３０のいずれか１項に記載の使用。
  33. 【請求項３３】 目的遺伝子が、サイトカイン、細胞ま
    たは核受容体、リガンド、凝固因子、ＣＦＴＲタンパ
    ク、インシュリン、ジストロフィン、増殖因子、酵素、
    酵素阻害剤、アポトーシス誘発物質、アポトーシス阻害
    剤、細胞分裂停止剤、アポリポタンパク質、酸素遊離基
    捕捉剤、抗腫瘍効果を有するポリペプチド、細菌性、寄
    生性またはウイルス性の感染を阻害する能力を有するポ
    リペプチド、抗体、毒素、免疫毒素およびマーカーをコ
    ードする遺伝子から選択される請求項１６〜３２のいず
    れか１項に記載の使用。
  34. 【請求項３４】 調節要素がプロモーターを含む請求項
    １６〜３３のいずれか１項に記載の使用。
  35. 【請求項３５】 プロモーターが、初期サイトメガロウ
    イルスプロモーターまたはＲＳＶ（ラウス肉腫ウイル
    ス) ＬＴＲ由来である請求項３４記載の使用。
  36. 【請求項３６】 調節要素に機能可能に結合している目
    的遺伝子を含み、そして、調節要素に機能可能に結合
    し、かつ、ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、
    ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ６／７、ＯＲＦ６およびＯＲＦ７
    からなる群から個々にまたは組み合わせて選択される、
    アデノウイルスのＥ４領域の１つ以上のオープンリーデ
    ィングフレーム（ＯＲＦ）を含む非アデノウイルスベク
    ター。
  37. 【請求項３７】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載
    のアデノウイルスベクター、または請求項２４〜３６の
    いずれか１項に記載されるＥ４のＯＲＦを含む発現ベク
    ターを含む感染性ウイルス粒子。
  38. 【請求項３８】 下記工程を有する請求項３７記載の感
    染性ウイルス粒子を調製する方法。 （ｉ）請求項１〜１５のいずれか１項に記載のベクター
    または請求項２５〜３６のいずれか１項に記載されるＥ
    ４のＯＲＦを含む発現ベクターを、そのベクターをイン
    トランス(in trans)で相補する能力を有する相補細胞中
    へ導入し、トランスフェクトされた相補細胞を得、（i
    i）トランスフェクトされた相補細胞を、感染性ウイル
    ス粒子の生産を可能とする適当な条件下に培養し、およ
    び（iii)感染性ウイルス粒子を細胞培養物から回収す
    る。
  39. 【請求項３９】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載
    のベクターおよび請求項１６〜３６のいずれか１項に記
    載されるＥ４ＯＲＦを含む発現ベクター若しくはポリヌ
    クレオチドを含むか、または請求項３７記載の感染性ウ
    イルス粒子に感染した宿主細胞。
  40. 【請求項４０】 請求項１〜１５のいずれか１項に記載
    のアデノウイルスベクター、請求項１６〜３６のいずれ
    か１項に記載されるＥ４ＯＲＦを含む発現ベクター若し
    くはポリヌクレオチド、請求項３７記載の、若しくは請
    求項３８記載の方法により得られる感染性ウイルス粒
    子、または請求項３９記載の宿主細胞を含む組成物。
  41. 【請求項４１】 遺伝子移入用の医薬組成物調製のため
    の、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアデノウイ
    ルスベクター、請求項１６〜３６のいずれか１項に記載
    されるＥ４ＯＲＦを含む発現ベクター若しくはポリヌク
    レオチド、請求項３７記載の、若しくは請求項３８記載
    の方法により得られる感染性ウイルス性粒子、または請
    求項３９記載の宿主細胞の使用。
  42. 【請求項４２】 遺伝子移入が、ヒトまたは動物体の治
    療のための遺伝子治療である請求項４１記載の使用。
  43. 【請求項４３】 アデノウイルスベクター中に保持され
    るＥ４配列が、（ｉ） ＯＲＦ３または４、（ii） Ｏ
    ＲＦ３／４、（iii) ＯＲＦ３および６＋７、（iv）
    ＯＲＦ３および６、（ｖ） ＯＲＦ３および７、または
    （vi） ＯＲＦ３および６／７であり、医薬組成物が、
    肺組織へ遺伝子移入するためのものである請求項４１記
    載の使用。
  44. 【請求項４４】 アデノウイルスベクー中に保持される
    Ｅ４配列が、（ｉ） ＯＲＦ３、（ii） ＯＲＦ３およ
    び４、（iii) ＯＲＦ３／４、（iv） ＯＲＦ３および
    ６＋７、（ｖ） ＯＲＦ３および６、（vi） ＯＲＦ３
    および７、または（vii) ＯＲＦ３および６／７であ
    り、医薬組成物が、肝臓組織へ遺伝子移入するためのも
    のである請求項４２記載の使用。
  45. 【請求項４５】 同時または別個に使用する組合せ製品
    として、（ｉ） 調節要素に機能可能に連結された目的
    遺伝子を含む発現ベクター、および（ii） 請求項１６
    〜２１または２３〜３２のいずれか１項に記載される特
    性を有するポリヌクレオチドを含む製品。
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