JP2000515386A - Ｋｕ欠損細胞と非ヒトトランスジェニック動物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ターゲティングされた破壊により突然変異されているＸＲＣＣ５遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子を含む、Ｋｕ−欠損細胞およびトランスジェニック動物が記載される。ＸＲＣＣ５突然変異胚およびマウス由来の繊維芽細胞は、早期に老化することがわかった。これらの細胞は、増殖が低下しており、Ｓ期に入るのが遅く、小さいコロニーが多い変化したコロニー分布を有し、寿命が短く、最終分化に特徴的な形態を示した。突然変異細胞はまた、γ線放射に対して高度に感受性であった。突然変異マウスは対照同腹子より成長が遅いため、組織培養データは、インビボで少なくとも部分的に再現された。ＸＲＣＣ５突然変異（ｘｒｃｃ５^M1と呼ぶ）は、読みとり枠をシフトさせるヌクレオチド７０１〜９６４の欠失であった。欠失した対立遺伝子は、検出可能な転写物を産生せず、リンパ球の成長とｖ（Ｄ）Ｊ組換えは大幅に破壊されているため、ｘｒｃｃ５^M1は、無効（null）であると予想される。

Description

【発明の詳細な説明】 Ku 欠損細胞と非ヒトトランスジェニック動物 本出願は、1996年8月8日出願の米国特許出願第08/695,866号に対して優先権を 主張する。 1.0.発明の分野 本発明は、Kuと呼称される自己抗原に欠損があるように遺伝子操作された細胞 と非ヒトトランスジェニック動物に関する。Kuのサブユニットの一つであるKu86 （Ku80とも呼称される）とＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ-PK）をコ ードするXRCC5遺伝子をターゲッティングした破壊により、細胞中のKu活性とＤ ＮＡ-PK活性は低下し、そして、遺伝子操作された該細胞は、その後Ku欠損トラ ンスジェニック動物を作製するために使われる。 2.0.発明の背景 細胞のＤＮＡは、通常、動的環境に存在する。遺伝子の安定性を維持し遺伝的 多様性を産み出すため、修復、組換え、複製、及び細胞周期制御の細胞機能は密 接に絡み合っている(Petesら,1991,Recombination in yeast,In:The Molecular and Cellular Biology the Yeast Saccharomyces(J.R.Broach,J.R.Pringle,and E.W.Jones編),pp.407-521,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York;Drapkinら,1994,Cell 77:9-12;Kuhnら,1995,Genes Dev.9 193- 203;Friedbergら,1995,DNA repair and mutagenesis,pp.147-192,ASMPress Wash ington,D.C.;Liら,1995,Cell 83:1079-1089による総説を参照)。その産物がこれ らプロセスのいずれかに重要な影響を与える遺伝子の変異は、神経障害、免疫不 全症、および癌に対する素因を含む様々な臨床的徴候を生じる。 修復と組換えの分子機構を理解することは、これらプロセスの欠陥と関係する 疾患の病因学を理解するために有益であろう。トランスジェニック動物は、in v ivoにおけるＤＮＡの動的特性を研究するのに有用である。特に、トランスジェ ニックマウスは理想的である。ヒトとマウスの遺伝子構成と組織の類似性は注目 に値する（Lyon and Searle,1989,Genetic variants and strains of the labor atory mouse,2nd ed.Oxford University Press,Oxford）。更に、マウスとヒト の間の解剖的類 似性は、直接的な生理学的比較の機会を提供する。p53癌サプレッサーのごとき タンパク質産物をコードする遺伝子のターゲッティング破壊（Donehowerら，199 2,Nature 356:215-221）、ミスマッチ修復タンパク質（Bakerら，1995,Cell 82: 309-319;de Windら，1995,Cell 82:321-330）および色素性乾皮症（xerodermapi gmentosa）相補群（Sandsら,1995,Nature 377:162-165;deVriesら,1995,Nature 377:169-173;Nakaneら,1995,Nature 377:165-168）はヒトの遺伝障害と著しい類 似性を示した。 様々な特定ＤＮＡ損傷を矯正するために、いくつかの異なるＤＮＡ修復経路が 関わる。これらの経路は、ヌクレオチド除去（nucleotide excision）修復、ミ スマッチ（mismatch）修復および二本鎖切断（double-strand break）（DSB）修 復を含む。ヌクレオチド除去修復およびミスマッチ修復に関わる機構はかなり良 く理解されており、これらのプロセスに影響を与える変異は特性決定されている (Friedberg,1992 Cell 71;887-889;Cleaver,1994,Cell 76;1-4参照）。DSB修復 に関わる機構はまだ少ししか理解されていない。哺乳動物のいくつかの遺伝障害 は、DSB修復の欠陥に特色があり、電離性放射線に対する過敏症および免疫不全 と関連している。これらの遺伝障害は、ヒトの毛細管拡張性運動失調症（Ataxia -Telangiectasia）（AT）およびマウスとウマの常染色体劣性重症複合型免疫不 全症（autosomalrecessive scid）を含む。 ATは常染色体劣性欠陥であり、進行性神経変性症、免疫不全症、癌に対する感 受性、早期老化、眼、耳および顔の一部の永久拡張性血管をもたらす（Lehmann and Carr,1995,Trends in Genet.11:375-377参照）。AT患者由来の細胞はしばし ば染色体切断を示し、染色体異常を蓄積する傾向がある。更に、「正常な」細胞 はＤＮＡ損傷を受けると一時的にＤＮＡ複製を中止するが、AT細胞はＤＮＡ損傷 が存在してもＤＮＡ複製を続ける。AT患者から単離した細胞も染色体内組換えの 速度増加を示し（Meyn,1993,Science 260:1327-1330）、電離性放射線に応答し て細胞周期停止を起さない（Kastanら,1992,Cancer Res.51:6304-6311）。AT患 者は癌に対する素因があり、電離性放射線に過敏である(Taylorら，1975,Nature 258:427-429)。AT遺伝子は最近、クローニングされた（Savitskyら,1995,Scien ce 268:1749-1753）が、サッカロミセス セレビジア（Saccharomyces cerevisi ae） TOR1およびTOR2(G1-S期トランジション)、哺乳動物FRAPおよびrRAFT(G1-Sトラン ジション)、シゾサッカロミセス ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）RAD3(r ad3細胞はX線および紫外線に感受性があり、ＤＮＡ損傷後、G2で停止を起さない )、サッカロミセス セレビジア(S.cerevisiae)MEC1(S-MおよびG2-Mチェックポ イントと減数分裂組換えに必要)および哺乳動物ＤＮＡ-PK_CS（V(D)J組換え中お よび電離放射線曝露後に発生したDSBの修復に含まれるＤＮＡ-PKの触媒サブユニ ット；以下参照）を含むホスファチジルイノシトール（PI）3-キナーゼと相同性 （homology）がある（Zakian,1995,Cell 82:685-687参照）。これらタンパク質 に観察される相同性は、ATMが細胞増殖と細胞周期制御に重要な役割を果すこと を示す。これらタンパク質は脂質キナーゼと相同性を有するが、これらはプロテ インキナーゼとして機能することができる（Hunter，1995,Cell 83:1-4参照）。 例えば、ＤＮＡ-PK_CSはin vitroでプロテインキナーゼ活性を有するが、脂質キ ナーゼ活性は検出されていない（Hartleyら,1995,Cell82;849-856）。 マウスのscid（重症複合型免疫不全）変異は劣性であり、リンパ球発生におい てT細胞受容体（TCR）と免疫グロブリン（Ig）遺伝子の再配列（V(D)J組換え） 中に起こる特異クラスの切断ＤＮＡ末端の修復失敗に因る免疫不全症を起こす( 以下参照)。同様な欠陥は最近アラビアウマの子ウマ（Arabian foals）で記述さ れている（Wilerら,1995,Proc.Natl.Acad,Sci.92:11485-11489）。V(D)J組換え 中に行われるDSBの修復は、TCR鎖（T細胞の場合）とIgタンパク質（B細胞の場合 ）を産生するのに不可欠である。この様に、scid動物ではBおよびT両方の細胞発 生は早期に停止して免疫不全を生じる。 V(D)J組換えは、TCRと免疫グロブリン分子の様々な領域をコードするエキソン の形成に関わる（Rothら，1995，Current Biology，5:496-499;Weaver，1995，T rends in Genet．11:388-392参照）。組換えは、V、D、およびJコードエレメン トに隣接して位置する組換えシグナル配列におけるDSB導入より開始される。開 裂はRAG-1およびRAG-2タンパク質により実施され、2つのタイプの切断末端：ヘ アピン形状に共有結合でシールされたコード末端(Rothら,1992,Cell 70:983-991 ；Zhu and Roth,1995,Immunity 2:101-112)と平滑なシグナル末端(Rothら,1993, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10788-10792;Schlisselら,1993,Genes Dev.7； 2520-2532)を生成する。コード末端の結合は、V、D、またはJ遺伝子セグメント を組み立てて、再配列した可変領域エキソン（接合部をコードジョイントと呼ぶ ）を形成し、シグナル末端の結合はシグナルジョイントと呼称される相互産物（ reciprocal product）を形成する。無細胞系（van Gentら,1995,Cell 81:925-93 4;McBlaneら,1995,Cell 83:387-395）およびin vivo（Ramsden and Gellert,199 5,Genes Dev.9:2409-2420）の両方における最近の実験は、平滑シグナル末端と ヘアピンコード末端が事実上、V(D)J組換えの正常な中間体であることを強く示 唆している。 in vivoのＤＮＡ中間体の特性決定とin vitroの開裂反応の分析より、RAG-1お よびRAG-2の役割について重要な情報が得られているが、シグナルおよびコード 末端の結合に関わる機構は未だ知られていない。マウスscid変異はコードジョイ ントの形成をブロックし、ヘアピンコード末端の蓄積により特徴付けられる（Ro thら，1992;Zhu and Roth,1995）。 scid動物と細胞系もまた、DSB修復の失敗に由来して電離性放射線に過敏であ る(Fulop and Phillips,1990,Nature 347:479-482;Biedermannら,1991,Proc.Nat l.Acad.Sci.USA 88:1394-1397)。この観察は、一般的なDSB修復経路とV(D)J組換 えの間にオーバーラップがあるとの初めての指摘を提供し、なおその後、両プロ セスに影響するいくつかの変異が現在同定されている（Rothら,1995参照）。 最近の研究は、単純タンパク質複合体であるＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ （ＤＮＡ-PK）が、V(D)J組換えとDSB修復の両方に重要な役割を果たすことを示 している。ＤＮＡ-PKの触媒サブユニットであるＤＮＡ-PK_CS、（ATM同族体）は 、マウス(Bluntら，1995，Cell 80:813-823;Kirchgessnerら，1995，Science 26 7:1178-1182;Boubnovら,1995,Proc,Natl,Acad.Sci,USA 92:890-894;Lees-Miller ら,1995,Science 267:1183-1185)およびウマ(Wilerら,1995)のscid不全に対する 強力な候補薬であることが示された。 V(D)J組換えとDSB修復を妨げる別の細胞系変異が、その後同定されている(Per golaら，1993,Mol.Cell.Biol,13:3464-3471;Taccioliら，1993,Science 260:207 -210)。これらの細胞系はXRCC4〜XRCC7と呼称される4つの相補群からなる。XRCC 5〜7の３群は、ＤＮＡ-PKの３成分のそれぞれを表す。DSB修復と V(D)J組換えに影響する４つの同定された変異の内の３つがＤＮＡ-PKの成分に影 響を与えるという観察は、ＤＮＡ-PKがこれらのプロセスにおいて重要な役割を 果たすことを示唆する。ＤＮＡ-PKは、Ku、Ku70とKu86サブユニットからなるヘ テロ二量体を結合するＤＮＡおよびＤＮＡ-PK_CSからなる三量体分子である。XRC C7は、ＤＮＡ-PK_CSをコードするようである(マウスおよび子ウマscid)。sxi-1細 胞系（XRCC6）はKu70 ｃＤＮＡにより補足することができる（Weaver,1995;Lee ら,1995,Mutation Research 336:279-291）。XRCC5はKu86 ｃＤＮＡにより救う ことができ（Taccioliら，1994;Smiderら，1994，Science 266:288-291;Boubnov ら,1995）、そして、XRCC5細胞中のKu86をコードする配列の部分を除去するゲノ ム欠失が観察された(Erramiら,1996,Mol.Cell.Biol.16:1519-1526)。Ku86の欠損 は不安定なKu70を生じ、Ku86 ｃＤＮＡの発現により救われる（Erramiら，1996 ）。それ故に、Ku86の欠損はKu70の欠損につながり、いずれかのタンパク質をコ ードする配列の変異が効果的に他を切除するのであろう。更に、Ku86欠損はＤＮ Ａ-PK活性を消失させる（Finnieら,1995,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:320-324） 。それ故に、Ku86をコードする配列の変異は効果的にＤＮＡ-PK_CS機能を切除す るであろう；しかし、ＤＮＡ-PK_CSとは無関係なKu機能もあリ得る。最近、XRCC4 遺伝子は新規なタンパク質をコードすることが示され（Liら，1995,Cell 83;107 9-1089）、そして、xrcc4変異細胞系は正常なＤＮＡ-PK活性を示す。 ＤＮＡ-PKはＤＮＡ損傷により活性化され、転写因子とp53癌抑制タンパク質を 含む様々な基質をリン酸化する能力を有する。ＤＮＡ末端にKuが結合すると、キ ナーゼ活性は活性化されて、in vitroで様々なタンパク質基質のリン酸化を引き 起こす。 （Gottlieb and Jackson,1994,Trends Biochem,Sci.19:500-503）。ＤＮＡ-PKは ＤＮＡ損傷を感知する機能を有することが示唆された（Rothら,1995）。ＤＮＡ- PKが細胞周期制御に関与し得るという示唆は、触媒サブユニットであるＤＮＡ-P K_CSが細胞周期制御、ＤＮＡ修復およびＤＮＡ損傷応答に関与するPI 3-キナーゼ ・ファミリーメンバーと相同性を有するという最近の観察と一致する（Zakian,1 995参照）。この見解は、明確な細胞周期チェックポイント欠損は記載されてい ないが、Ku欠損細胞がわずかに長い細胞分裂時間を有するという観察により支持 される（Jeggo,1985,Mutation Research 145;171-176;Jeggo,1990,Mutation Res earch 239:1-16;Leeら,1995,Mutation Research 336;279-291）。 本明細書で論じられる参考文献は、本出願の出願日前に開示されたものを単に 記載しただけである。本明細書のどの記載も、発明者が先行発明の故にかかる開 示に先立つ権利は与えられないことの承認と解釈されてはならない。 3.0.発明の概要 本発明の目的は、Ku86コード配列（XRCC5遺伝子）の破壊によりKuを欠損した 動物細胞を提供することである。 本発明の更なる目的は、K86コード配列（XRCC5遺伝子）をターゲッティングし た破壊によりKuの欠損した非ヒトトランスジェニック胚、動物、および子孫を提 供することである。 本発明の具体的に例示された一つの実施様態は、XRCC5遺伝子の２つの染色体 対立遺伝子を有する二倍体動物（マウス）細胞であり、対立遺伝子の少なくとも １つがXRCC5遺伝子における遺伝子操作による変異（すなわち、ターゲッティン グした破壊）を受け、その結果、Ku活性のレベルが野生型より低い細胞を産生す る。 本発明の更なる実施様態は、Ku欠損非ヒトトランスジェニック胚および動物を 作製するために、新規の遺伝子操作で修飾したKu欠損細胞の使用である。 本発明の他の実施様態は、XRCC5遺伝子をターゲッティングした破壊を含み、 従って野生型より低いレベルのKu活性をもたらす、Ku欠損非ヒト、好ましくはマ ウス、トランスジェニック胚および動物である。本発明のKu欠損非ヒトトランス ジェニック動物は、変異XRCC5対立遺伝子についてはヘテロ接合性またはホモ接 合性であることができる。 4.0.図面の簡単な説明 図1．XRCC5のターゲッティング手順。a．ターゲッティングベクターは、アミノ 酸229〜313をコードする２つのエキソン（ヌクレオチド701〜964、Gene Bank受 託番号#66323を含有する）を含むXRCC5ゲノム配列を欠失するように設計した。 この欠失は、アミノ酸313後のフレームシフト変異を発生する。四角形はエキソ ンを表す;影付きエキソンはターゲッティングにより欠失される。ポジティブ選 択カセットは、ホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（pgk-1;Adraら，198 7,Gene 60:65-74）により、ウシ成長ホルモン（bovine growth hormone）ポリア デニル化配列（bpA;Pfarrら,1986,DNA 5:115-122）と共に発現されたピューロマ イシン（puromycin）N-アセチルトランスフェラーゼ（Mielkeら，1995,Trend.Ge net.11:258-259）を含有するPGKpurobpAとした。ネガティブ選択カセットはMCIt k（Mansourら,1988,Nature 336:348-352）とした。b．xrcc5^M1+/-交配体の子孫 を、テールＤＮＡのサザンブロット分析によりスクリーニングした。BamHI消化 ＤＮＡを欠失の外側のプローブとハイブリダイズさせた。野生型(+/+)ゲノム断 片は12kbであり、ターゲッティングされる遺伝子は7.5kbである。遺伝子型は各 レーンの上に示した（xrcc5^M1+/-、+/-；xrcc5^M1-/-、-/-）。c．遺伝子型を付 した胚繊維芽細胞由来の全ＲＮＡのノーザンブロット分析。ＲＮＡはｃＤＮＡプ ローブとハイブリダイズした(ヌクレオチド533-1393)。黒矢印は、2.5kbの野生 型(+/+)XRCC5 ｍＲＮＡを示す。白矢印は、長さ2.2kbの変異ｍＲＮＡの予測位置 を示す。ＲＮＡサイズマーカーはブロットの左側に示した。β-アクチンハイブ リダイゼーション対照は下部のパネルである。d．遺伝子型を付した（レーンの 上に示す）胚繊維芽細胞由来のXRCC5 ＲＮＡの5'及び3'領域のRT-PCR。左パネル ：図示したプライマーセット由来のPCR産物を、エチジウムブロマイド（EtBr） 染色アガロースゲル中で示した。右パネル：図示したプローブとハイブリダイズ したPCR産物のサザンブロット。HPRT ＲＮＡに対するRT-PCRを、ＲＮＡの完全性 を確保するために実施した。プライマーとプローブの位置は(a)に示してある。 略語：s、センス鎖プライマー；as、アンチセンス鎖プライマー；tk、チミジン キナーゼ遺伝子（ネガティブ選択）；puro、ピューロマイシンアセチルトランス フェラーゼ（ポジティブ選択）；制限酵素部位：B、BamHI；H、HindIII;S、SpeI 。 図2．対照（xrcc5^M1+/-および野生型）とxrcc5^M1-/-マウスの成長曲線。成長曲 線、早期時点については写真。胚日数14.5で、対照とxrcc5^M1-/-マウスの平均重 量はそれぞれ0.44gm(n=15)および0.27gm(n=5)であった。胚日数17.5で、対照とx rcc5^M1-/- マウスの平均重量はそれぞれ0.96gm（n=7）および0.70gm（n=3）であった。常に 、最も重いxrcc5^M1-/-マウスは最も軽い対照マウスより重量が小さかった。誕生 後、10匹の対照マウスと6匹のxrcc5^M1-/-マウスを観察した。ヘテロ接合体と野 生型マウスの結果は、それらが同じであるので一緒にした。DOB、誕生日；E、胚 期。 図3.xrcc5^M1-/-マウス由来の胸腺細胞を発生の早期に停止した。xrcc5^M1-/-マウ ス(-/-)由来の胸腺細胞と脾臓T細胞とそれらの対照同腹児（野生型、+/+；xrcc5^M1+/- 、+/-）をフローサイトメトリーにより分析した。細胞は、CD4、CD8および ／またはCD25に対するフルオロクロム複合抗体で染色した；図示したプロファイ ルは19日マウス由来である；scidサンプルは21日由来である。数字は、図示した 領域内の全細胞の百分率を表す。左のパネル、CD4⁺CD8⁺胸腺細胞の百分率；中央 パネル、全胸腺細胞からのCD25⁺細胞百分率（注記：野生型およびxrcc5^M1+/-マ ウス由来のゲートCD4^-CD8^-細胞はそれぞれ23％および18％CD25⁺を与えた）；右 パネル、CD4⁺脾臓T細胞の百分率。野生型およびxrcc5^M1-/-マウス由来のCD4⁺脾 臓細胞もまた、CD3に対する抗体により鮮明に染色された（図示されてない）。x rcc5^M1-/-およびscidマウスに観察された分散CD4⁺集団は未熟、CD3^lo、TCRαβ^- 細胞であった。そこで、該百分率をカッコ中に示した。野生型およびxrcc5^M1+/- マウスのCD8⁺集団はX軸に対して圧縮されていることに注意すること。 図4．xrcc5^M1-/-由来のB細胞を発生の早期に停止した。xrcc5^M1-/-マウス（-/- ）と対照同腹児（野生型、+/+；xrcc5^M1+/-、+/-）由来の骨髄と脾臓を、前駆体 と成熟B細胞の存在について分析した。細胞は、B220およびCD43またはIgMに対す る複合抗体で染色した。プロファイルは図３に示したのと同じマウスのものであ る。百分率は図示した領域に対するものである。左パネル、B220⁺CD43^-プレB細 胞；中央および右パネル、骨髄および肺臓それぞれ由来の表面IgMを発現するB22 0⁺の百分率。xrcc5^M1-/-およびscidマウス由来のサンプル中に、プロB細胞集団 を表す若干のB220^dullCD43⁺細胞があることに注意すること。 図5．コードおよびシグナルジョイント形成は、xrcc5^M1-/-マウスで著しく低下 する。 a〜d。xrcc5^M1-/-マウス（-/-）由来の骨髄と胸腺ＤＮＡサンプルを、コードジ ョイント形成について、半定量的PCR分析を行った。xrcc5^M1-/-マウス中のコー ドジョイント形成の数度(abundance)を評価するために、野生型(+/+)またはxrcc 5^M1+/-(+/-)同腹児由来のＤＮＡで滴定を実施した。Ig重鎖D_H-J_H4(a)およびIgV_H -J_H4(b)コードジョイントを示す。Ig PCR産物は、個々のxrcc5^M1-/-マウス、10 日、16日、および2ヶ月（左から右へ）、および同腹児（野生型、10日；xrcc5^{M1 +/-} 、16日）由来の骨髄ＤＮＡサンプルから誘導した。PCR産物の予測サイズは、 ほぼ120bp（D_H-J_H4）および360bp（V_H7183-J_H4）である。胸腺細胞ＤＮＡ由来の T細胞受容体Ｖβ8-Jβ2.6(c)およびDδ2-Jδ1(d)再配列を示す。xrcc5^M1-/-サン プルは2つの16日マウスをプールした。PCR産物の予測サイズは、Ｖβ8-Jβ2.5に 対して540bp、Ｖβ8-Jβ2.6に対して300bp、Ｄδ2-Jδ1に対して160bpおよびＤ δ2-Jδ1生殖系産物に対してほぼ1kbである。断らない限り、xrcc5^M1-/-マウス 由来のＤＮＡ200ngと+/-および-/-同腹児由来の100ngを、TCRおよびIg増幅に使 用した。scid骨髄と胸腺細胞ＤＮＡサンプル（200ng）を比較のため、同じ時間 増幅した。e．xrcc5^M1-/-マウスでは、シグナルジョイント形成は実質的に低下 した。T細胞受容体Ｄδ2-Jδ1シグナルジョイントに対する環状PCRを図示し、結 合したシグナル配列（三角形）を示した。内部オリゴヌクレオチドプローブの位 置をアスタリスクで示す。ブロットの矢印は、完全なシグナルジョイントを含有 するPCR産物の予測サイズを示す。全てのレーンは同じゲルからのものである。( c)と(d)で試験したものと同じ16日齢xrcc5^M1-/-胸腺ＤＮＡサンプルをこのアッ セイに使用した。略語：R、コードジョイントを含有する再配列体由来のPCR産物 の予測位置；GL生殖系；ｍ、放射線標識サイズ標準（1kbラダー、GIBCO-BRL）； sj、シグナルジョイント。関連するマーカー断片のサイズを示した。 図6．全長シグナル末端は、xrcc5^M1-/-胸腺細胞に存在する。a．シグナル末端検 出のためのLMPCRアッセイの図。三角形で表したシグナル配列を、二本鎖プライ マー（太線）のライゲーション前の開裂産物として示した。全長シグナル末端は ライゲーション時に、ApaLI制限部位を発生する。プローブの位置をアスタリス クで終わる線により示した。PCRプライマーの位置は矢印で示した。b．xrcc5^{M1+ /-} 胸腺Ｄ ＮＡ由来のＤδ2シグナル末端の滴定は、LMPCRが半定量的であることを示す。PC R産物の予測サイズを示した。c,d．それぞれ、2つのプールした16日サンプルのx rcc5^M1-/-マウス（-/-）とそれらのxrcc5^M1+/-同腹児（+/-）の胸腺ＤＮＡ中の Ｄδ２およびJδ1シグナル末端。それぞれのLMPCRサンプルの一部をApaLIで消化 した。無切断および切断サンプル由来のLMPCRを隣接レーンに載せた。200gのＤ ＮＡを各PCR増幅に使用した（se、シグナル末端）。e．T4 ＤＮＡポリメラーゼ 処理は非平滑シグナル末端を救うことができなかった。本実験では、xrcc5^M1-/- 胸腺細胞ＤＮＡの２つの異なる調製物を試験した。各PCR増幅に500ngのＤＮＡを 使用した。記載のレーン（T4pol.）は、ライゲーション前にT4 ＤＮＡポリメラ ーゼ処理をしたサンプルを含む。 図7．xrcc5^M1-/-胸腺細胞中のヘアピンコード末端の蓄積。a．シグナル末端とヘ アピンコード末端を検出するためのLMPCRの概略図。緑豆(mung bean)ヌクレアー ゼ（mbn）による処理はヘアピンコード末端を開放し、ライゲーションを可能と する。シグナル末端と開放コード末端への２本鎖プライマーのライゲーションに 続いて、PCR増幅によりそれぞれ119bpおよび135bpの産物を産生する。プローブ の位置をアスタリスクで終る線により示す。b．Ｄδ2コード末端に対するアッセ イ。16日xrcc5^M1-/-マウス(-/-)由来の２つのプールした胸腺細胞ＤＮＡサンプ ルを緑豆ヌクレアーゼ（mbn）により処理し、続いてLMPCRを実施した。対照同腹 児（野生型、（+/+）；xrcc5^M1+/-、（+/-））とscidマウス由来の胸腺細胞ＤＮ Ａを平行して処理し、比較を示した（ce、コード末端；se、シグナル末端）。 図8．0、1、1.5、2および3Gyに曝露したxrcc5^M1-/-、xrcc5^M1+/-（ヘテロ接合体 ）および野生型MEFに対する線量応答曲線。生存率(SF)は、2つのxrcc5^M1-/-胚か ら誘導した細胞（平均値を記載）と1つのヘテロ接合体および1つの野生型胚から 誘導した細胞について測定した。 図9．xrcc5^M1-/-、xrcc5^M1+/-（ヘテロ接合体）および野生型MEFとMSFに対する 成長パラメータ。a．MEF成長曲線。b．MSF成長曲線。c．MEFのBrdU標 識。対照MEF、左パネル；xrcc5^M1-/-MEF、右パネル。 図10．複製的老化の測定。 カッコ内は観察数。a．xrcc5^M1-/-および対照MEFと MSFに対するコロニーサイズ分布。ヘテロ接合体と野生型細胞の結果を合わせて 平均し、対照群とした。b.xrcc5^M1-/-と対照MSFに対する3T3分析。xrcc5^M1-/-MS Fは７継代で増殖を停止した。2つの対照MSFは20継代で増殖を停止した。3つの対 照MSFは16〜19継代で自発的に不死化し、高速（20継代で11=/-2×10⁴細胞/1.5cm プレート）で増殖を続けた。1つの対照MSFは、20継代で自発的に不死化し、高速 （21継代で9.3×10⁴細胞/1.5cmプレート）で増殖を続けた。アスタリスクは、自 発的不死化が観察された点を示し、該細胞から発生した数は、それ以後、本図の 数に含めなかった。ヘテロ接合体と野生型細胞の結果を合わせて平均し、対照群 とした。c.対照(1,3)およびxrcc5^M1-/-MEF（2,4）の形態学。4継代MEFの細胞懸 濁液（1,2）。MEFの結晶バイオレット染色（3,4）。 5.0.発明の詳細な説明 本発明は、Ku欠損細胞、およびKu欠損非ヒト動物の生産を目的とする。本発明 により意図される非ヒトトランスジェニック動物は、一般に、KuまたはXRCC5同 族体をコードする全ての脊椎動物、および好ましくは哺乳動物を含む。かかる非 ヒトトランスジェニック動物は、例えば、トランスジェニックブタ、トランスジ ェニックラット、トランスジェニックウサギ、トランスジェニックウシ、トラン スジェニックヤギ、および他のトランスジェニック動物種、特に当業界で公知の 哺乳動物種を含むことができる。更に、ウシ、ヒツジ、およびブタ種、齧歯科の 他のメンバー、例えばラット、ならびにウサギおよびモルモット（guinea pig） 、およびチンパンジーのごとき非ヒト霊長類を、本発明の実施に使うことができ る。特に好ましい動物は、ラット、ウサギ、モルモット、そして最も好ましいの はマウスである。 本発明の好ましい実施様態は、2つのXRCC5遺伝子の染色体対立遺伝子を有する 二倍体マウス細胞、マウス胚、およびマウスを含み、XRCC5対立遺伝子の少なく とも1つは該細胞が野生型レベルより低いKu活性を産生する変異を含有する。か かるKu欠損動物および細胞は、なかんずく、疾患モデルとして、治療薬および照 射と化学突然変異誘発物質のごとき突然変異誘発刺激効果の分析と試験のために 、有用で あると考えられる。複製または細胞老化（senescence）は、細胞の終末停止につ ながる細胞共通のプロセスであり、多分、腫瘍形成に対する抑制として機能し、 また、生物加齢を反映し得る（Campisi，1996，Cell 84:497-500）。Ku欠損細胞 および動物が明らかに加速老化の特徴を示すとすれば、本明細書で記載される細 胞と動物もまた、生物学的加齢、およびそれを遅くする薬剤の研究に有用である と考えられる。 特に、xrcc5^M1-/-細胞の増殖および／または加齢異常性を救う条件をスクリー ニングする方法が意図される。かかる条件の例は、外因性添加タンパク質または 化学因子の存在、トランスフェクションした遺伝子または内因性遺伝子の過剰発 現、トランスフェクションした遺伝子または内因性遺伝子の異所性（ectopic） 発現、または遺伝子の突然変異誘発その他を含むが、これらに限定されない。 本明細書で使われるxrcc5^M1は、２つの野生型XRCC5染色体対立遺伝子の少なく とも1つが、野生型レベルより低いKu活性を産生するように変異したことを意味 する。Ku86欠損の程度は、標準分子生物学的方法を使って容易に測定することが できる。例えば、Ku86メッセンジャーＲＮＡレベルの欠損については、逆転写酵 素介在ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を使って測定することができる（図１参 照）。この様に、用語「Ku欠損（Kudeficient）」は、ホモ接合XRCC5変異細胞、 ならびにXRCC5変異遺伝子型に対してヘテロ接合である細胞の両方を含むが、ホ モ接合遺伝子型が好ましい。用語「Ku欠損」は、また、Ku70をコードする遺伝子 に対してヘテロ接合変異体である細胞とKu70をコードする遺伝子に対してホモ接 合変異体である細胞の両方を含むであろう。本発明の目的として、Ku欠損となる ように遺伝子操作した細胞または動物は、通常、対応する野生型細胞または動物 より少なくとも約20%少ないKu70またはKu86、好ましくは、野生型細胞または動 物より少なくとも約50%少ないKu70またはKu86、更に好ましくは、野生型細胞ま たは動物より少なくとも約90%少ないKu70またはKu86を発現すべきである。特に 好ましい実施様態では、Ku欠損細胞または動物は、野生型細胞または動物で見出 されるKu70またはKu86タンパク質の1.0%より少なく産生するであろうし、特定的 に好ましい実施様態では、Ku欠損細胞または動物による全長（野生型）XRCC転写 の産生は、検出不可能なレベルであろう。 XRCC5遺伝子の変異またはターゲッティングした破壊は、当業界で公知の十分 確 立された数多くの変異法のどれかを使い、遺伝子操作することができる。変異は 、好ましくは、欠失(deletion)変異であるが、本発明の範囲には置換(substitut ion)変異および／または挿入(insertion)変異も含まれる。置換変異体は、Hasty ら(1991，Nature 350:243-246)により記載されたごとく、位置指定突然変異誘発 により調製することが可能であり、Ku86タンパク質の不全産生（abortive produ ction）またはKu活性の欠落した変異タンパク質の産生を生じるようにXRCC5遺伝 子の5'末端近くに停止コドンまたは他の変異を導入する。同様に、挿入変異は、 エキソン制限部位、またはXRCC5遺伝子のエキソン配列と制限酵素地図（図１） により容易に同定される他の部位の、いずれかの便宜的な制限部位、およびHast yら（1991，Molecular and Cellular Biology 11:4509-4517）;Joynerら（1989 ，Nature 338:153-156）により記載された技術を利用して、XRCC5遺伝子内に導 入することができる。挿入または他の変異を導入する他の方法は、XRCC5遺伝子 座に組み込まれるレトロウイルスで感染させ、von Melchnerら（Genes and Deve lopment 6:919-927）により記載されたごとく、変異xrcc5対立遺伝子を作製する ことからなる。しかし、本発明の変異体は、好ましくは、欠損xrcc5対立遺伝子 をより作りやすくするために、Ku86をコードするＤＮＡ配列の部分を欠落する（ すなわち、欠失変異）。欠失変異体の他の特徴は、von Melchnerより教示された 挿入変異と比較して、非変異対立遺伝子への復帰の可能性が著しく低いことであ る。 XRCC5遺伝子のコード領域はサイズはほぼ2196bpである。本発明の目的のため には、XRCC5遺伝子をコードするヌクレオチドはジーンバンクのアクセス番号#X6 6323と番号付けされたものである。欠失変異体は、Ku86タンパク質の適切なフォ ールディングまたは基質結合を阻止するように、XRCC5遺伝子のコード領域から ＤＮＡ断片を脱離して産生することができる。欠失のサイズは変化し得るが、通 常、大きい欠失がKu活性の欠損を生じやすいので、大きい欠失が小さい欠失より 好ましい。典型的には、欠失変異は、1塩基または本質的には所与の遺伝子の全 塩基（非コードフランキング領域を含む）までの除去を含むべきである。あるい は、コード領域から、単塩基対または2塩基対または3でわりきれない何らかの数 の塩基対を除去することはフレームシフト変異を起こし、機能性Ku86タンパク質 を作る機能を損なうであろう。後者の例では、フレームシフト誘導停止コドンに よりポリペプチド合成が 不発となるので、末端切断ポリペプチドが産生され得る。突然変異誘発および変 異の全体レビューのためには、"An Introduction to Genetic Analysis"，4th e diton，1989(D．Suzuki，A．Griffiths，J．Miller，and R．Lewontin編)，W．H ．Freeman & Co.，N.Y.，New Yorkを参照されたい。 XRCC5遺伝子のコード領域における単塩基対（または多塩基対）を変えること もまた、もしアミノ酸変化を生じれば、Ku86タンパク質の適切なフォールディン グを変更し、その結果、Ku欠損を作り出し得る変異を誘発することができる。こ の様に発生させた単一のアミノ酸変化はまた、Ku86のその基質に対するアフィニ ティを変え、Ku活性の欠損を生じ得る。他の代替法は、XRCC5メッセンジャーＲ ＮＡの適切なスプライシングに影響を与えたXRCC5遺伝子の非コード領域に、欠 失または他の変異を発生させることであろう。かかる変異は、効果的に、全エキ ソンまたは野生型XRCC5メッセージと比較していくつかのエキソンを失った変異X RCC5転写物を作り出すことができるであろう。他の代替法は、非コード調節領域 を欠失してXRCC5遺伝子の発現を減少することであろう。欠失の好ましいサイズ は、遺伝子の5'末端近くのほぼ数百ヌクレオチドである。好ましくは、かかる欠 失は、3でわりきれないコード領域からある数のヌクレオチドを欠失し、その結 果、フレームシフト変異も作り出すであろう。あるいは、プロモーター配列は欠 失するか変更して、XRCC5遺伝子の転写を減少することができよう。 遺伝子のコドン使用を変更して、所与の遺伝子の発現を変更することも可能で ある。この種の変更は、発現レベルを増加または減少するが、産生物のアミノ酸 配列を保存する。 アンチセンスＲＮＡ導入遺伝子もまた、部分的または全体的に特定遺伝子の発 現を停止するために使用することができる（Helene.，C．and Toulme，J.，1990 ，Biochimica Bioshys．Acta 1049:99;Pepinら，1991 Nature 355:725;Stout，J ．and Caskey，T.，1990，Somat．Cell Mol．Genet．16:369;Munirら，1990，So mat．Cell Mol．Genet．16:383，それぞれを参考として本明細書に組み込む）。 「アンチセンス ポリヌクレオチド」は、(1)XRCC5遺伝子の配列のごとき参照 標的配列の全てまたは部分と相補性があり、かつ、染色体遺伝子座ｍＲＮＡのご とき相補性標的配列と特異的にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドで ある。 かかる相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、関係標的配列に対する特異的ハ イブリダイゼーションが該ポリヌクレオチドの機能的物性として保持される限り 、ヌクレオチド置換（substituion）、付加（addition）、欠失（deletion）、 または転位（transposition）を含むことができる。相補的アンチセンスポリヌ クレオチドは、個々のｍＲＮＡ種と特異的にハイブリダイゼーションが可能で、 転写および／またはｍＲＮＡ種のＲＮＡプロセシングおよび／またはコードされ たポリヌクレオチドの翻訳を妨げるかまたは抑制するアンチセンスＲＮＡを含む （Chingら，1989，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:10006-10010;Broderら，Ann ．Int．Med．113:604-618;Loreauら，1990，FEBS Letters 274:53-56;Holcenber ら，WO9l/11535,WO91/09865;WO91/04753;WO90/13641;およびEP 386563，それぞ れを本明細書に参考として組み込む）。アンチセンス配列は、細胞中で標的遺伝 子配列または配列に実質的に相補性のある、長さで少なくとも約15個の隣接する ヌクレオチド、典型的には長さで少なくとも20〜30個のヌクレオチド、そして好 ましくは、長さで約30個以上のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列である。或 る実施様態では、アンチセンス配列は、相補的標的配列と比較して、置換、付加 、または欠失を有し得るが、特異的ハイブリダイゼーションが保持される限り、 該ポリヌクレオチドは、通常、遺伝子発現のアンチセンスインヒビターとして機 能するであろう。 本発明の目的に対しては、アンチセンス配列は、内因性XRCC5標的遺伝子配列 に相補性がある。ある場合には、XRCC5標的領域配列に対応するセンス配列は、 特に転写の妨害によって、発現を抑制する機能を有することがあり得る。あるい は、アンチセンスポリヌクレオチドは通常、転写後のレベルでXRCC5発現を抑制 するであろう。 アンチセンスポリヌクレオチドが細胞内でポリペプチド産生を阻害するのであ れば、それらは更に、非ヒトトランスジェニック動物のKu産生能力を変化し得る 。 アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスジェニック多能性胚幹細胞（plur ipotent embryonic stem cell）に挿入した異種発現カセットから産生すること ができ、続いて、ここに記載したKu欠損動物を発生させるために使用することが できる。 本発明の遺伝子修飾動物細胞は、当業界で十分確立されたいくつかの技術のい ず れかにより調製することができる。特に、本明細書に参考として組み込まれたCa pecchi and Thomasに1995年11月7日に付与された米国特許第5,464,764号に教示 されたものと概念的に類似の技術を使うことができる。一般的に、Ku欠損細胞は 、次の工程を使って遺伝子操作することができる。 (1)クローニングベクターおよび少なくとも1つの陽性的に選択可能なマーカー 遺伝子（陽性選択マーカー遺伝子）を含むＤＮＡ断片とを含むターゲッティング ベクターを、お互いに同じ5'から3'への配向（相同性領域（regions of homolog y）と呼ぶ）にあるマウスXRCC5遺伝子またはゲノム遺伝子座の2領域に隣接して 構築し； (2)ターゲッティングベクターには、相同性領域の1つに隣接した陰性的に選択 可能なマーカー遺伝子（陰性選択マーカー遺伝子）が含まれ、この陰性選択マー カー遺伝子は所望の相同組換えイベント（XRCC5遺伝子の部分を欠失する）回収 の見込みを増加し得るが、必要条件ではなく； (3)XRCC5^+/+マウス細胞を工程（2）のターゲッティングベクターでトランスフ ェクションし； (4)工程3からのトランスフェクションした細胞をベクター上のマーカーに対し て選択し；および (5)上記陽性選択マーカーを含有するか発現して陰性選択マーカーを発現しな い工程（4）の細胞から、Ku欠損マウス細胞をスクリーニングすること。 工程（1）のターゲッティングベクターに存在しなければならない正確なXRCC5 遺伝子または遺伝子座配列は、欠失のために選んだ配列および（2）欠失変異の 遺伝子操作で使用される制限ヌクレアーゼに依存するであろう。 工程（1）で必要とされる相同性の特定領域は、ターゲッティングベクター中 の欠失の特異性に依存する。概して、ターゲッティングベクターに使われる相同 領域は、好ましくは、少なくとも400bpを含むが、それより長いかまた短い領域 も使うことができる。概して、高度のターゲッティング効率を確保するには、ほ ぼ1.5kbまたはそれより大きい相同領域を使うことが好ましい。図1で詳細に記載 されたターゲッティングベクター、欠失の両側の5'および3'相同領域は、それぞ れ3kbおよび4.4kbであった。 欠失のサイズもまた変化し、ターゲッティングベクターで使われる相同領域に 依存する。非隣接相同領域が欠失ターゲッティングベクターに使われるので、相 同領域間に局在する野生型対立遺伝子の領域は、ターゲッティングベクターによ る相同組換え後に欠失されるべき領域を構成する。特定の例において欠失される 領域は長さでほぼ6.0kbであるが、この特定サイズは重要ではなく、大きくても また少なくても、Ku欠損の効果を果たしつつ遺伝子座から欠損され得る。概して 、対応して変異したXRCC5メッセンジャーＲＮＡを生じるXRCC5遺伝子のエキソン の少なくとも一部分、または全エキソンを欠失することが好ましい。 本発明で使用される特定の陽性および陰性選択マーカーは、本発明の実施には 重要でない。好ましい陽性および陰性選択マーカーの例を表１に掲げる。陽性選 択マ一カーは相同領域の間に位置すべきであり、陰性マーカーは、もし使う場合 は、相同領域の外側、図1aに示したごとくこれらの領域の対し5'または3'いずれ かにあるべきである。相同領域は通常、ベクター中でお互いに同じ5'から3'への 配向で存在すべきである。逆に、陽性または陰性選択マーカーの相対的配向は重 要でない。事実上、陰性選択マーカーの存在は標的クローンの選択を改善し得る としても、陰性選択マーカーを含むことは実際には必要でない。 好ましくは、陽性選択マーカーは、遺伝子修飾のためターゲッティングされる 細胞で発現される。もし選択可能マーカーをコードするＤＮＡ配列が、陽性また は陰性いずれかの表現型選択特性を配列を発現する細胞に与えることができれば 、陽性または陰性選択マーカーはトランスフェクションした細胞で機能している と考えられる。概して、マーカーは、マーカーの発現に介在する調節配列と作動 可能的に結合しているであろう。核酸マーカーは、もし他の核酸配列と機能的関 係を持つように配置されるときは「作動可能的に結合」している。例えば、プロ モーターまたはエンハンサーは、もしそれが配列の転写に影響を与えれば、コー ド配列と作動可能的に結合している。転写調節配列については、作動可能的に結 合しているとは、結合されているＤＮＡ配列は隣接していることを意味する。 更に、陽性選択マーカー遺伝子を機能的にする方法は本発明では重要でない。 陽性選択は、組み込まれた陽性選択マーカーを有しないまたは発現しない細胞を 死滅させるか、または除外する適切な薬剤に、細胞を曝露することにより達成さ れる。 限定されないが、かかる薬剤の代表的なリストを表1に掲げた。陽性選択マーカ ー遺伝子は、その発現を駆動するプロモーターを有してもよいし、または、転写 エレメントを標的遺伝子座に陽性選択マーカーと並置して駆動してもよい。後者 の遺伝子組織は、転写エレメントがトランスフェクションした細胞で活性を有す る必要がある。 陽性選択マーカーに加えて、ターゲッティングベクター中に遺伝子操作した変 異は、ＤＮＡ配列、例えばオリゴヌクレオチドリンカーを、XRCC5遺伝子相同性 の領域間に、欠失したXRCC5ＤＮＡの代わりに含むことができる。該オリゴヌク レオチドリンカーは通常、長さでほぼ8〜10ヌクレオチドであるが、もっと長く 、例えばほぼ50ヌクレオチド、またはもっと短く、例えばほぼ4、5または7ヌク レオチドであることができる。オリゴヌクレオチドリンカーの好ましい長さは、 長さでほぼ20〜40ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドリンカーのＤＮＡ配 列は重要でない。 オリゴヌクレオチドをターゲッティングベクターＤＮＡの相同領域間に挿入す る方法は、使用するオリゴヌクレオチドリンカーのタイプに依存するであろう。 オリゴヌクレオチド配列中に1つ以上の制限ヌクレアーゼ部位を含有するパリン ドローム配列二本鎖リンカー（New England Biolabs）を公知の方法で挿入する ことができる（Maniatisら，1982，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor La boratory，Cold Spring Harbor Press，N.Y.）。 オリゴヌクレオチドリンカーはまた、ターミナルトランスフェラーゼを使い、 相補的ホモポリマーの末端を接続して、プラスミドＤＮＡの欠失部に挿入するこ とができるし（Maniatisら，上記）、または、一本鎖オリゴヌクレオチドリンカ ーは、プラスミド中の欠失に、開裂プラスミドの3'-窪み（recessed）および3'- 突出(protruding)付着末端に相補的な末端を有するオリゴヌクレオチドのアニー リングを経て架橋し、続いて、オリゴヌクレオチド配列に相補的なギャップをＤ ＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）でフィルインすることにより、挿入すること ができる。その後、T4 ＤＮＡリガーゼでライゲーションして、閉環ＤＮＡ分子 を再生することができる。 あるいは、位置指定突然変異誘発を使い、特異的欠失を同時に構築し、一本鎖 オリゴヌクレオチドを使いリンカー配列を挿入して、標的遺伝子の所望の領域を 「ル ープアウト」することができる（Krogstad and Champoux（1990）J．Virol．64( 6):2796-2801,参考として本明細書に組み込む）。 もしオリゴヌクレオチドリンカーの長さと配列の妥当な選択により、欠失領域 がエキソンを妨害するようにターゲッティングベクターが設計されれば、XRCC5 遺伝子内の欠失に加えて、フレームシフト変異および／または停止コドンをXRCC 5遺伝子中に産生することができる。 ターゲッティングベクター中に遺伝子操作した変異は、陽性選択マーカーに加 えて、XRCc5遺伝子相同領域間のＤＮＡ配列、例えばスプライス受容部位配列を 含むことができる。かかる配列は異常な、従って無機能のｍＲＮＡを生じること が示されている。 相同領域で使用されるＤＮＡ配列は一般に、ＸＲＣＣ５遺伝子配列、ＸＲＣＣ ５遺伝子座の両側に位置する配列、またはこれらの組合せに由来するものである 。ＸＲＣＣ５ノックアウトマウスが所望の場合、ＸＲＣＣ５ＤＮＡを得るマウス の系統は決定的に重要ではないが、遺伝子は、遺伝子導入についてターゲティン グされた細胞と同じ系統由来であることが好ましい。標的細胞と同系のＤＮＡを 使用する（相同領域中）と、一般に遺伝子ターゲティングの効率を上げる。相同 領域は、種々のクローニングベクター（例えば、ラムダファージベクター、コス ミドベクター、プラスミドベクター、ｐ１ファージベクター、酵母人工染色体ベ クターなど）中にクローニングされるマウスＤＮＡのゲノムライブラリーから得 てもよい。ターゲティングベクター中に取り込まれる相同領域はまた、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用してゲノムＤＮＡから得てもよい。ＰＣＲ法は一 般に、ＸＲＣＣ５遺伝子の公表された配列を使用する。こうして得られた相同領 域は、ターゲティングベクター中にサブクローニングすることができる。あるい は、相同領域は、適切なｃＤＮＡライブラリーから得てもよい。 本発明のＸＲＣＣ５ターゲティングベクターを作製するのに、多種類のクロー ニングベクターが使用できる。そのようなクローニングベクターの例には、ｐＢ Ｒ３２２、およびｐＢＲ３２２ベースのベクター（Sekiguchi，1983，Gene 21:2 67）、ｐＭＢ９、ｐＢＲ３２５、ｐＫＨ４７（Bethesda Research Laboratories ）、ｐＢＲ３２８、ｐＨＣ７９、ファージシャロン（Charon）２８（Bethesda R esearch Laboratories、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルズ（Boehringer-Mannh eim Biochemicals））、ｐＫＢｌｌ、ｐＫＳＶ−１０（P-L Biochemicals）、お よびオリゴヌクレオチド（ｄｇ）−テイルドｐＢＲ３２２（Bethesda Research Laboratories）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたは同様のプラスミド（Stratagene ）、ｐＵＣ１９または関連プラスミド（New England Biolabs）などがあるが、 これらに限定されない。 ターゲティングベクターは普通、陽性選択性マーカー、および随時、両側に位 置する陰性選択性マーカー（これは、クローニングベクターが、例えば、薬剤耐 性のような選択性を発現する遺伝子を含有する限り、決定的に重要ではない）に より分離される、２つのＸＲＣＣ５相同性の領域を含む。ターゲティングベクタ ーはまた、他のクローニングベクター（例えば、ラムダファージベクター、コス ミドベクター、プラスミドベクター、ｐ１ファージベクター、酵母人工染色体ベ クターなど）中にクローニングされてよい。 他の選択肢は、ターゲティングベクターの成分を、ＰＣＲにより合成し、相同 領域の間に陽性選択性マーカーが配置され、相同領域が互いに正しい配向に配置 されるように、各成分を連結することにより、ターゲティングベクターの成分を 調製することである。 本発明において有用なユニークなクローニング部位を含有する他のクローニン グベクターは、具体的に例示されるターゲティングベクター（図１を参照）を作 製するためにベクターＤＶ６．０とともに使用される、ＳａｌＩとＨｉｎｄIII （５’の相同領域について使用される）およびＳｐｅＩとＨｉｎｄIII（３’の 相同領域について使用される）以外の、制限ヌクレアーゼの評価により選択して もよい。 マウスＸＲＣＣ５遺伝子を含有する断片を作製するために、多様な追加の制限 ヌクレアーゼの任意のものが使用される。すなわち、マウスＸＲＣＣ５遺伝子制 限地図は、本発明を便利に実施するために多種類のクローニングベクターのうち のどれが使用されるかについて、指針を与える。実際、ＸＲＣＣ５遺伝子を突然 変異させるためのＸＲＣＣ５ターゲティングベクターを作製するのに、制限エン ドヌクレアーゼの多くの組合せが使用できる。 これらの相同領域は、例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Stratagene） 、 ｐＵＣシリーズ（New England Biolabs）、またはｐＧＥＭシリーズ（Promega） （ただし、これらに限定されない）のような多くの市販のプラスミドのうち任意 のものにクローニングすることができる。 本発明のターゲティングベクターを増殖させるのに使用される具体的な宿主は 決定的に重要ではないが、好ましくは宿主は、機能性のｈｓｄ修飾系を有する。 このような宿主の例には、大腸菌（E．coli）Ｋ１２ ＰＲ１（Bolivarら、1977 ，Gene 2:95）；大腸菌（E．coli）Ｋ１２ ＨＢ１０１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３ ６９４）；大腸菌（E．coli）ＭＭ２１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３６７８０）：お よび大腸菌（E．coli）ＤＨ１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．３３８４９）がある。本発明 において好適な宿主は、大腸菌（E．coli）ＤＨ５α株（Life Technologies）で ある。同様に、大腸菌（E．coli）またはサッカロミセス・セレビッシェ（Sacch aromyces cerevisiae）、またはこの両方の中で増殖するターゲティングベクタ ー、または枯草菌（B．subtilis）中で増殖するプラスミドベクターのような、 別のベクター／クローニング系が使用できるであろう（Ureら、1983，Methods i n Enzymology，「組換えＤＮＡ」、１０１巻、パートＣ、Academic Press、ニュ ーヨーク州）。 本発明において突然変異を受ける具体的なマウス細胞は決定的に重要ではない ;しかし、好ましくは前駆体細胞または少なくとも多分化能細胞である。前駆体 という用語は、多分化能細胞が、本発明の所望のトランスフェクションされた多 分化能細胞の前駆体であることを意味する。確立された技術を使用して、多分化 能細胞は、突然変異動物を作製するためにin vivoで培養される（Evansら、1981 ，Nature 292:292-156）。本発明において使用されるマウス細胞の具体例には、 胚幹（ＥＳ）細胞（好ましくは、ＥＳ細胞の一次単離株）（例えば、ＡＢ１また はＡＢ２．１）があるが、これらに限定されない；ＡＢ２．１：ｈｐｒｔ^-細胞 株；ＡＢ１：ｈｐｒｔ⁺細胞株。他の選択性マーカー（例えば、表１に例示され たもの）は、他の幹細胞株で使用することができる。 ＥＳ細胞の一次単離株は、基本的にＥＫ．ＣＣＥ細胞株について、または一般 的にＥＳ細胞について記載されたように、胚から直接得られる。本発明で使用さ れる具体的な幹細胞は決定的に重要ではない。 ＥＳ細胞は、好ましくは、例えばＳＴＯ細胞および／または一次胚繊維芽細胞 の ような間質細胞で培養される（Robertson、1987、「奇形癌腫と胚幹細胞：実際 的アプローチ」、E.J．Robertson編（オックスフォード：IRL Press）、７１− １１２頁に記載されている）。間質（および／または繊維芽）細胞は、異常ＥＳ 細胞のクローン性増殖（clonal outgrowth）を低下させる。 本発明のＫｕ欠損マウスを得るために、突然変異胚幹細胞を、Bradley，1987 、「奇形癌腫と胚幹細胞：実際的アプローチ」、E．Robertson編（オックスフォ ード：IRL Press）、１１３−１５１頁、に記載のマウス胚盤胞中に注入される 。 本発明で使用される具体的なマウス胚盤胞は、決定的に重要ではない。そのよ うな胚盤胞の例には、Ｃ５７ＢＬ６マウス、Ｃ５７ＢＬ６白色（Albino）、スイ ス非近交系、ＣＦＬＰ、ＭＦＩなどから得られるものがある。 注入された胚盤胞から作製されるｘｒｃｃ５^M1変異体対立遺伝子についてヘテ ロ接合性のマウスを、ＸＲＣＣ５遺伝子中の突然変異について、例えば該突然変 異のＤＮＡプローブ（図１）を使用してサザンブロットまたはＰＣＲによりスク リーニングすることができる。例えば、下記の実施例４では、突然変異遺伝子座 の３’のプローブを使用するサザンブロットにより、１２kbの突然変異ＤＮＡ断 片、および７．５kbの野生型ＤＮＡ断片（図１ａ、ｂ）の存在を検出することに より、作製した突然変異についてヘテロ接合性のマウスが同定された。 本発明の突然変異マウスは、ＸＲＣＣ５遺伝子の突然変異についてホモ接合性 の胚を得るために交配するか、および／またはこれらの他の系統にｘｒｃｃ５^M1 突然変異を移すために他のマウス株と交配してもよい。例えば、下記実施例４に 記載のように、突然変異遺伝子座の３’のプローブを使用するサザンブロットに より、７．５kbの突然変異ＤＮＡ断片の存在のみを検出し、１２kbの野生型ＤＮ Ａ断片（図１ａ、ｂ）の存在は検出しないことにより、作製した突然変異につい てホモ接合性のマウスが同定された。 以下の実施例は、本発明を例示するために提供される。当業者の技術レベルか ら、本発明の具体的な特徴との実質的な差を発生することなく、上記または下記 の開示内容を改変することができると予想される。従って、以下の実施例は例示 のためのみであって、決して本発明を限定するものではない。 ６．０． 実施例 胚幹細胞は、実質的に公表されている方法（「奇形癌腫と胚幹細胞：実際的ア プローチ」、E.J．Robertson編、IRL Press、ワシントンＤ．Ｃ．、１９８７；Z jilstraら、1985，Nature 342:435-438；およびSchwartzbergら、1989，Science 246:799-803、これらは参考のため本明細書に組み込まれる）に従って処理した 。 ＤＮＡクローニング操作は、基本的に、J．Sambrookら（Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第２版、1989、およびその定期的改訂版、Cold Spring Ha rbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、ニューヨーク州、（これは参考 のため本明細書に組み込まれる））に記載のように行なった。 オリゴヌクレオチドは、Applied BioSystemsオリゴヌクレオチド合成装置を使 用して、製造業者の説明書に従って合成した。 ６．１． マウスＸＲＣＣ５遺伝子のクローニング マウスＸＲＣＣ５遺伝子は、マウス１２９株ゲノムライブラリーからクローニ ングした。さらに詳しくは、マウス細胞由来のＲＮＡについての、ヌクレオチド 配列（ジーンバンク（gene bank）アクセス番号Ｘ６６３２３）情報に基づくオ リゴヌクレオチドと逆転写酵素介在ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、ＸＲＣＣ ５遺伝子の断片を得た。こうして得られたマウス遺伝子の断片を、プラスミドベ クターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋（Stratagene）中にサブクローニングし た。ＸＲＣＣ５遺伝子のサブクローンを使用して放射能標識プローブを作製し、 このプローブを使用して、マウス１２９−株ゲノムラムダファージライブラリー をスクリーニングして、マウスＸＲＣＣ５遺伝子を含有するファージを同定した 。３つの陽性ファージを単離し、増殖させ、標準的方法によりＤＮＡインサート について制限マッピングを行い、ＸＲＣＣ５ゲノム遺伝子座の制限地図を作成し た（図１ａを参照）。制限地図データに基づき、ハイブリダイゼーションにより 推定エキソンを同定し、選択エキソン性配列決定を行なった。 ６．２． ターゲティングベクターの構築 Ｋｕ−欠損マウスを作製するために、まずターゲティングベクターを構築した 。このベクターは、マウスＸＲＣＣ５遺伝子の５’末端と相同的な３．０kbのＤ ＮＡ、およびマウスＸＲＣＣ５遺伝子の３’末端と相同的な４．４kbのＤＮＡを 含有していた。このベクターはまた、陽性選択マーカー（プロマイシンカセット ）、およ び陰性選択マーカー（チミジンキナーゼ遺伝子；Mansourら、1988）を含有して いた。 さらに詳しくは、制限地図データに基づき、５’および３’相同性領域を選択 した。５’相同性領域は、ＸＲＣＣ５ゲノム遺伝子座の５’末端の近傍に位置し 、約３．０kbのＤＮＡ断片を放出するＳａｌＩ（作製）／ＨｉｎｄIII消化物（ 図１ａ）により単離した。 ３’相同性領域は、約４．４kbのＤＮＡ断片を産生するＳｐｅＩ／ＨｉｎｄII I消化物（図１ａ）により単離した。使用した陽性選択性マーカーは、プロマイ シンカセットである。 陽性選択ターゲティングベクターを調製するために、６．０kbのＨｉｎｄIII ／ＳｐｅＩゲノム断片（これは、コードヌクレオチド７０１〜９６４を含有する ）を除去し、陽性選択性マーカーカセットで置換した。陽性−陰性選択ターゲテ ィングベクターを調製するために、陰性選択性チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子 を、３’相同性領域の外に加えた。次にユニークなＳａｌＩ部位を使用して、ベ クターを切断してから、トランスフェクションを行なった（図１）。 ６．３． マウス胚幹細胞のトランスフェクション マウス胚幹細胞中で、ＸＲＣＣ５ゲノム遺伝子座を有するターゲティングベク ターの相同的組換えを行なった（図１を参照）。さらに詳しくは、第６．２．節 に記載の陽性−陰性ターゲティングベクター１０μｇを、１×１０⁷個のマウス １２９系統胚幹細胞中にトランスフェクションし、得られた細胞をピューロマイ シン存在下で増殖させて、ターゲティング構築物をうまく取り込んだ細胞を選択 した。ＸＲＣＣ５遺伝子座にて相同的組換え事象を受けた細胞についての選択を 増強するために、薬剤ＦＩＡＵを使用して、ｔｋ遺伝子に対する陰性選択も行な った。生き残ったコロニーを、Ramirez-Solis（1992，Anal．Biochem．201:331- 336）に記載のようにミニ−サザンにより、ターゲティングベクターの間の２重 相互相同的組換え事象（double reciprocal homologous recombination event） を検出するためのプローブとしての該ターゲティングベクターの相同性の領域の ３’側であるＸＲＣＣ５遺伝子座、およびＥＳ細胞の染色体のＸＲＣＣ５遺伝子 座（図１ａ、ｂ）由来の標識ＤＮＡ断片を使用して、スクリーニングした。 ミニサザンのためのＥＳ細胞ゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩで消化した 。１２kbの野生型対立遺伝子と比較して、７．５kbの突然変異対立遺伝子を検出 した５’プローブを使用して、所望の組換え事象を検出した。所望の遺伝子置換 事象を含む多くの陽性ＥＳ細胞クローンが同定された（すなわち、約６．０kbの ゲノム欠失）。 ６．４． Ｋｕ−欠損マウスの作製 第６．３．節に記載のように得られた２つのＥＳ細胞クローンを、既に記載さ れているように（Bradley、1987）、Ｃ５７ＢＬ６白色（アルビノ種）宿主胚盤 胞中に注入した。注入した胚盤胞を、擬妊娠の雌に移植すると、野ネズミ色（ag outi）と白色の外皮の色が混じっていることにより証明されるように、キメラ子 孫が生まれた（ＥＳ細胞株からの野ネズミ色の寄与と、野生型宿主胚からの白色 の寄与、Bradley、1987を参照）。キメラの雄のマウスを野生型Ｃ５７ＢＬ６白 色の雌に交配させると、野ネズミ色の子が生まれ、これはキメラマウスのＥＳ細 胞成分の生殖細胞株がうまく伝達されたことを示しており、Ｃ５７ＢＬ６白色／ １２９ハイブリッドが得られた（Ｃ５６７ＢＬ６／１２９ハイブリッドと呼ぶ） 。３週間令で、キメラ交配からの子孫を、以下に記載するように突然変異ｘｒｃ ｃ５^M1対立遺伝子についてスクリーニングした。 得られたマウスからゲノムＤＮＡを単離した。次に１０μｇの得られたゲノム ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、本質的的にミニサザンについて前記したように（ 図１ｂ）３’プローブを使用してサザンブロット解析を行なった。６．０kbのゲ ノム配列の欠失と、マウスＸＲＣＣ５遺伝子からの２６３塩基対のコード配列の 除去とにより証明されるように、２つのＥＳ細胞クローンは、所望の突然変異対 立遺伝子を生殖細胞株を介して伝達した。 雄のマウスと雌のマウスはまた、突然変異対立遺伝子（ｘｒｃｃ５^M1）につい てヘテロ接合性であることが証明され、これらのマウスを相互に交配させた。得 られた子孫からゲノムＤＮＡを単離し、１０μｇのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで 消化し、前記の３’ＸＲＣＣ５プローブを使用して、サザンブロット解析を行な った。単一の１２kbバンドは、ホモ接合性の野生型の動物（＋／＋）を示し、単 一の７．５kbバンドは、ターゲッティングされた突然変異対立遺伝子についてホ モ接合性（ｘ ｒｃｃｔ^M1／ｘｒｃｃ５^M1またはｘｒｃｃ５^M1-/-または突然変異体）の動物を 示した。両方のバンドが存在することは、ヘテロ接合性の動物（ｘｒｃｃ５^M1/+ またはｘｒｃｃ５^M1+/-）であることを示す。 ｘｒｃｃ５^M1+/-マウスのいくつかの交配対を相互に交配させて、ｘｒｃｃ５^{M 1-/-} マウスを得た。メンデル型の遺伝が観察された。 ６．５． ｘｒｃｃ５^M1突然変異は無効（null）である可能性が高い ＸＲＣＣ５転写物レベルに対するｘｒｃｃ５^M1突然変異の効果を、対照および 突然変異（１４．５日）の胚から得られたマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）から単 離されたｍＲＮＡについてノーザン解析により測定した（図１ｃ）。ｍＲＮＡ負 荷（ローディング）の対照としてβ−アクチン転写物レベルも測定したところ、 対照および突然変異の胚で検出された。ＸＲＣＣ５ ｍＲＮＡは、対照で検出さ れたが突然変異ＭＥＦでは検出されなかった。 ＸＲＣＣ５転写物レベルに及ぼすｘｒｃｃ５^M1突然変異の効果を、対照と突然 変異の１４．５日の胚由来のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）から単離されたｍＲ ＮＡについて、逆転写酵素介在ポリメラーゼチェイン反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によ り測定した（図１ｄ）。ｍＲＮＡ負荷（ローディング）の対照としてＧＡＰＤＨ 転写物レベルを測定したところ、対照および突然変異の胚で検出された。ＸＲＣ Ｃ５ ｍＲＮＡは対照では検出されたが、突然変異ＭＥＦでは、内部オリゴヌク レオチドプローブを用いてハイブリダイゼーションした後も検出されなかった。 フレーム外(out-of-frame)欠失とＸＲＣＣ５ ｍＲＮＡの欠如は、ｘｒｃｃ５^M1 突然変異が無効である可能性を示している。 ６．６． ｘｒｃｃ５^M1マウスは小さい 時間を一致させたヘテロ接合性交配を、ｘｒｃｃ５^M1+/-雌とｘｒｃｃ５^M1+/- 雄を用いて行なった。ｘｒｃｃ５^M1-/-胚またはマウスで観察された最も顕著な 異常は、ｓｃｉｄマウスでは観察されなかったサイズが小さい（図２）ことであ り、これは、ＫｕがＤＮＡ−ＰＫ_CSとは独立に機能する可能性を示している。非 効率的な体重増加を示す６匹の突然変異マウスの脳、肺、心臓、腎臓、肝臓、胃 、小腸、大腸、膵臓および卵巣の組織学的切片では、明白な欠陥は観察されなか った（データは示していない）。胸腺、脾臓、およびリンパ節の組織学的切片は 、成熟リン パ球の大きな低下を示したが、ｓｃｉｄマウスは正常に成長するため、これは成 長を低下させることはない（表２）。 ６．７． ｘｒｃｃ５^M1突然変異マウスでは成熟Ｔ細胞およびＢ細胞は成長しな い Ｋｕ８６は培養繊維芽細胞中のＶ（Ｄ）Ｊ組換えに関係しているため、本発明 者らは、免疫系の成長に対する作用について突然変異マウスを調べた。Ｔ細胞と Ｂ細胞の正常な成長は、抗原受容体遺伝子セグメントのみごとな再編成に基づく 極めて秩序立ったプロセスである。ＴＣＲβ遺伝子座での再編成は、成長のＣＤ ４^-ＣＤ８^-ＣＤ２５⁺段階の前駆体Ｔ細胞で始まる。β鎖がうまく再編成される と、ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺ＣＤ２５^-段階に進み、ここでＴＣＲα再編成が起きる。 本発明者らは、新生児から１０週間令までの２４匹のＫｕ−欠損マウスとその 同腹子を調べた。図３に代表的マウスのフローサイトメトリーにより示すように 、Ｋｕ−欠損マウスからの胸腺細胞をＣＤ４^-ＣＤ８^-ＣＤ２５⁺段階で停止させ た。野生型またはヘテロ接合性のマウスの胸腺細胞ではわずかに５〜１０％のみ がＣＤ４^-ＣＤ８^-細胞であったのに対して、Ｋｕ−欠損胸腺細胞の９０％以上が ＣＤ４^-ＣＤ８-であった。野生型またはヘテロ接合性のマウスの胸腺細胞の大部 分が、より成熟した成長段階であった。ＣＤ４^-ＣＤ８^-胸腺細胞の５０％以上は 、突然変異マウスではＣＤ２５⁺であった。さらに表現型解析からは、Ｋｕ−欠 損マウスの胸腺細胞は、ＣＤ３¹⁰ＴＣＲαβ^-およびＴＣＲγδ^-であることが判 明した。 Ｋｕ−欠損胸腺細胞の成長を早期にブロックすると、ｓｃｉｄ胸腺細胞と同様 に非常に細胞の少ない胸腺が得られ、野生型またはヘテロ接合性の同腹子より５ ０〜１７０倍細胞が少なかった（表２）。リンパ節もまた細胞が少なく回復が難 しく、胸腺細胞成長の欠陥は末梢に反映されることを示唆した。脾臓、リンパ節 、および血液を、高レベルのＣＤ３、およびＣＤ４もしくはＣＤ８のいずれかを 発現する成熟ＴＣＲαβ⁺細胞の検出について測定した。野生型またはヘテロ接 合性マウスの末梢中で容易に区別可能な異なる成熟したＴ細胞集団は、Ｋｕ−欠 損マウスではフローサイトメトリーでは検出されなかった（図３の脾臓を参照さ れたい；リンパ節および末梢血リンパ球データは示していない）。 たまに、Ｋｕ−欠損マウスの脾臓またはリンパ節中に珍しいＣＤ４⁺細胞が検 出された（図４）；しかし、これらの細胞は、ＣＤ３¹⁰ＴＣＲαβ^-表現型につ いて は未成熟であった。 Ｋｕ−突然変異マウスのＢ細胞コンパートメントの分析からもまた、初期段階 で成長の停止が見られた。通常、免疫グロブリン重鎖の再編成は、骨髄中のｐｒ ｏ−Ｂ細胞（Ｂ２２０^dullＣＤ４３⁺）中で始まる。いったん機能性重鎖が発現 されると、細胞はｐｒｅ−Ｂ段階（Ｂ２２０^-ＣＤ４３^-）に進み、ここでＩｇ軽 鎖の再編成が起きる。Ｋｕ−欠損マウス中のＢ細胞の成長は、図４に示すように Ｂ２２０^dullＣＤ４３⁺段階で停止する。本発明者らは、Ｋｕ−欠損マウス中の この段階で停止される細胞の数は、ｓｃｉｄ骨髄中の数と同じであり、両方の突 然変異マウスにおいて総骨髄細胞の５〜１０％の範囲であると考えている。Ｋｕ −欠損マウス中では顕著なＢ２２０⁺ＣＤ４３^-集団は同定されず、表面ＩｇＭを 発現する細胞は検出されなかった。Ｋｕ−欠損マウス由来の成熟Ｂ細胞は、脾臓 （図４）、リンパ節、または末梢血（データは示していない）では明らかではな かった。要約すると、Ｋｕ−欠損マウスの免疫表現型は、ｓｃｉｄマウスに似て おり（Bosmaら、1983，Nature 301:527-530；Schulerら、1986，Cell 46:963-97 2）、機能性ＴＣＲとＩｇ分子の集合（assembly）に大きな障害があることを示 唆している。 ６．８． コーディングジョイント（coding joint）の形成障害 Ｂ細胞系統のコーディングジョイントを検出するために、各マウスの骨髄から ＤＮＡ調製物を、半定量ＰＣＲ測定法を使用してＩｇ重鎖再編成について増幅し た。Ｄ_H−Ｊ_H４コーディングジョイントの増幅により、野生型またはｘｒｃｃ５^M1-/- 同腹子中の多くの再編成が明らかになった（図５ａ）。ｘｒｃｃ５^M1-/-ま たは年齢の一致したｓｃｉｄマウスでも、まれなＤ−Ｊ再編成が検出された。本 発明者らは、野生型ＤＮＡの連続希釈物から得られる生成物と比較して、これら の再編成の豊富さは、ｓｃｉｄマウスとｘｒｃｃ５^M1-/-骨髄で約１０倍低下し たと推定する（図５ａ）。同様のレベルのＤ_H−Ｊ_Hコーディングジョイントが、 ｓｃｉｄ骨髄ですでに検出されている（Pennycookら、1993，J．Exp．Med．178: 1007-1016）。Ｖ_H−Ｊ_H４再編成の増幅は、ｓｃｉｄとｘｒｃｃ５^M1-/-骨髄の両 方で非常に低レベル（野生型マウスより少なくとも１００倍少ない）のコーディ ングジョイントを検出した（図５ｂ）。これらのデータは、ｓｃｉｄマウスと同 様に、Ｉｇ重鎖遺伝子座でのコーディングジョイントの生成は、ｘｒｃｃ５^{M1-/ -} マウスでは大きく障 害されていることを示す。 ＴＣＲ再編成により形成されるコーディングジョイントを検出するために、胸 腺細胞ＤＮＡ調製物の半定量ＰＣＲ分析を行なった。本発明者らは、Ｖβ８−Ｊ β２．６結合により由来する稀なコーディングジョイントが、ｓｃｉｄマウス由 来の胸腺細胞ＤＮＡ調製物のＰＣＲ増幅により検出できることを、すでに証明し た（Bogueら、1996，GenesDev．10:553-565）。新生児ｓｃｉｄマウス由来の胸 腺細胞ＤＮＡ調製物および１６日令のｘｒｃｃ５^M1-/-マウス由来の２つの異な る調製物を増幅するために、同じプライマーが使用された。すべての３つの試料 で同量の適当なサイズのＰＣＲ産物が検出された（図５ｃ）。ｘｒｃｃ５^M1+/- 胸腺細胞由来のＤＮＡの一連の希釈物と比較して、ｓｃｉｄとｘｒｃｃ５^M1-/- 胸腺細胞で少なくとも約１００倍の、豊富なＶβ８−Ｊβ２．６コーディングジ ョイントが検出される（図４ｃ）。ｓｃｉｄ胸腺細胞中で容易に検出できるＤδ ２−Ｊδ１コーディングジョイントを検出することができるプライマーを使用し て、胸腺細胞ＤＮＡも増幅した(Carroll and Bosma，1991，Genes Dev．5:1357- 1366；Rothら、1992）。ＴＣＲ.β再編成について観察されたように、ｓｃｉｄ とｘｒｃｃ５^M1-/-胸腺細胞の両方で、Ｄδ２−Ｊδ１コーディングジョイント 由来のＰＣＲ産物が検出されたが、その量は後者でやや少なかった（図４ｄ）。 Ｉｇ再編成データとともに、これらの結果は、Ｋｕ−欠損マウスは、ｓｃｉｄマ ウスと比較して、コーディングジョイント形成に大きな障害を示すことを証明し ている。しかし、ｓｃｉｄマウスですでに証明されたように、コーディング末端 の小集団は、明らかにＫｕ−欠損マウス中のコーディングジョイント形成に対す るブロックを迂回しているようである。 ｓｃｉｄリンパ球中の内因性ＴＣＲとＩｇ遺伝子座でしばしば観察される大き な欠失は、ＰＣＲをベースとする測定法で検出されるように、Ｋｕ−欠損マウス 中にも存在した（データは示していない）。これらの結果は、ｘｒｃｃ５^M1-/- マウスは、Ｔ細胞およびＢ細胞の成長に欠陥があり、ｓｃｉｄマウスと同様にコ ーディングジョイント形成に欠陥があるため、Ｋｕ機能は、ＤＮＡ−ＰＫ_CS機能 にとって必須であることを示唆する。 ６．９． シグナルジョイントの生成の障害 Ｄδ２−Ｊδ１コーディングジョイントがＫｕ−欠損マウスで検出されたため 、 高感度のＰＣＲ測定法を使用して、反対の生成物であるＤδ２−Ｊδ１シグナル ジョイントを探索した。シグナルジョイントから得られたＰＣＲ産物を、ｓｃｉ ｄマウスからの１０ngの胸腺細胞ＤＮＡという少量で検出した（図５ｅ）。これ らの生成物の本体を、その認識部位が完全なシグナルジョイントにより形成され る制限酵素ＡｐａＬ１で消化してさらに証明した（Rothら、1992）。２つの異な るｘｒｃｃ５^M1-/-胸腺細胞調製物からの２００ngのＤＮＡの増幅後に適切なサ イズのＰＣＲ産物は見られなかったが、稀で小さい生成物が検出された（図４ｅ ）。これらのＰＣＲ産物は、ｘｒｃｃ５突然変異細胞株ですでに見られている（ Taccioliら、1993）ように、欠失を含有するシグナルジョイント由来であっても よい。これらのデータは、ｓｃｉｄマウスと異なり、Ｋｕ−欠損マウスは、ＸＲ ＣＣ５突然変異細胞株からの以前の結果と一致して、シグナルジョイントの形成 の大きな欠陥を示している。これらの結果は、ｓｃｉｄマウスはシグナルジョイ ント生成において欠陥を持たないため、Ｋｕは、ＤＮＡ−ＰＨ_CSとは独立に機能 することを示唆する。 ６．１０． ヘアピンコード末端と完全長シグナル末端の存在 前記したように、Ｋｕは、コード末端およびシグナル末端を安定化させるか、 または分解から防御する役割を有するという仮説が立てられている。このモデル は、シグナル末端がｘｒｃｃ５^M1-/-細胞中では珍しく、もし存在するなら、こ れらの末端はヌクレオチドの喪失を示すはずであることを予測させる。これらの 予測を試験するために、本発明者らは、高感度の半定量的連結介在ＰＣＲ（ＬＭ ＰＣＲ）測定法（Rothら、1993；Zhu and Roth，1995，Immunity 2:101-112）を 使用してシグナル末端を調べた。図６ａに略図を示すこの方法は、２本鎖オリゴ ヌクレオチドを、破壊された末端に連結して、次に該オリゴヌクレオチドにハイ ブリダイズするプライマーと、目的の領域に特異的なプライマーとを使用してＰ ＣＲ増幅することにより、破壊された分子を検出する。短いＰＣＲ産物はポリア クリルアミドゲル上に示されるため、末端から数ヌクレオチドが喪失しただけで も容易に検出されるであろう。さらに、ＲＳＳのすべてのヌクレオチドを保持す る末端のみが、オリゴヌクレオチドに連結するとＡｐａＬ１部位を生成するため 、シグナル末端の完全性は、ＡｐａＬ１で消化するだけで評価することができる （図６ａ）。 Ｄδ２の５’側のＲＳＳでの切断により得られたシグナル末端の分析を、図６ ｂ に示し、ｘｒｃｃ５^M1+/-胸腺細胞から得られるＰＣＲ産物の豊富さは、ＬＭＰ ＣＲ測定法で添加されるＤＮＡの量に大体比例することを証明する。５’Ｄδ２ シグナル末端に由来するＰＣＲ産物は、ｘｒｃｃ５^M1-/-マウス由来の胸腺細胞 ＤＮＡの２つの異なる調製物で観察された（図６ｃ）。この生成物は単一のバン ドとして移動し、その量は、ｘｒｃｃ５^M1+/-または野生型胸腺細胞から得られ たＰＣＲ産物の量に同等である。ｘｒｃｃ５^M1-/-胸腺細胞由来の９５％を越え る量の生成物はＡｐａＬ１で切断され、これは、野生型およびｓｃｉｄ胸腺細胞 ですでに観察されているように（Rothら、1993；Zhu and Roth，1995）、Ｄδ２ シグナル末端は保存されていることを示す。Ｄδ２の３’側上のＲＳＳで切断し て得られたシグナル末端を解析することにより、同様の結果が得られた。 上記結果を確認し拡張するために、Ｊδ１シグナル末端も解析した。Ｄδ２で 観察されたように、シグナル末端から得られるＬＭＰＣＲ産物は、ｘｒｃｃ５^{M1 -/-} マウス由来の２つの異なる胸腺細胞ＤＮＡ調製物中で容易に検出された（図 ６ｄ）。実質的にすべてのＪδ１シグナル末端はＡｐａＬ１で切断され、これら の末端が、Ｋｕ−欠損マウスで保存されていることを示していた。非平滑末端を 有するシグナル末端を探索するために、胸腺細胞ＤＮＡ調製物をＴ４ ＤＮＡポ リメラーゼで処理してから、連結させて非平滑末端を平滑型に変換した。しかし 、非平滑シグナル末端は、調べた３つの遺伝子座のいずれでも検出されなかった （図６ｅ）。これらのデータは、Ｋｕ−欠損マウス中で低レベルの非平滑シグナ ル末端が存在する可能性を否定しないが、大多数のシグナル末端は平滑かつ完全 長であり、野生型およびｓｃｉｄ胸腺細胞中のシグナル末端の以前の研究（Zhu and Roth，1995）と一致する。 胸腺細胞中のコード末端の状態を評価するために、ＴＣＲ Ｄδ２エレメント を試験したが、これは、同じＰＣＲプライマーを使用すると、コード末端とシグ ナル末端の両方の検出を可能にし、便利な内部対照を与える（図７ａ）。ＴＣＲ δ遺伝子座の以前のＬＭＰＣＲおよびサザンブロット試験は、ヘアピンコード末 端はｓｃｉｄ胸腺細胞中でシグナル末端とほぼ同様に豊富にあるが、コード末端 は野生型胸腺細胞中では検出することができないことを証明した（Rothら、1992 ；Zhu and Roth，1995）。これらのデータは、コード末端はシグナル末端より迅 速に結合され 、検出できるレベルまで蓄積しないことを示唆し、これは、プレ−Ｂ細胞株で行 われた速度論的解析と一致する（Ramsden and Gellert，1995，Genes Dev．9:24 09-2420）。 平滑コード末端がもし存在するなら、これは直接連結され、シグナル末端につ いての測定法で検出されるであろう１３５ｎｔのＰＣＲ産物を生成するであろう （図６ａ）。しかし、野生型とｓｃｉd胸腺細胞についてすでに証明されている （Zhu and Roth，1995）ように、ｘｒｃｃ５^M1+/-または野生型胸腺細胞由来の ＤＮＡの増幅により、そのような生成物は検出されなかった（図６ｂ）。非平滑 末端を有するコード末端候補を検出するために、ＤＮＡ試料をＴ４ＤＮＡポリメ ラーゼで前処理して、１本鎖伸長部分を平滑末端に変換した。ここでもまた、コ ード末端は検出されなかった（図６ｅ）。これらのデータは、野生型とｓｃｉｄ マウスについてすでに証明されている（Zhu and Roth，1995）ように、ｘｒｃｃ ５^M1-/-胸腺細胞中では平滑または非平滑コード末端ともに検出できるレベルま で蓄積しないことを示している。 共有結合で閉じたコード末端を検出するために、ＤＮＡ調製物を、ヘアピンを 開いて連結可能な平滑末端を与えるヤエナリ（mung bean）ヌクレアーゼ（ｍｂ ｎ）で処理した（図７ａ）。既に記載されているように（Zhu and Roth，1995） ように、ヘアピンコード末端は、ｓｃｉｄ胸腺細胞ＤＮＡ中で検出された（図７ ｂ）。ほぼ等量のコード末端およびシグナル末端が観察され、以前のサザンブロ ット試験（Rothら、1992）に一致した。ｘｒｃｃ５^M1-/-マウス由来の２つの異 なる胸腺細胞ＤＮＡ調製物のＬＭＰＣＲは、シグナル末端およびコード末端の両 方から得られるほぼ等量のＰＣＲ産物を生成した。予想されるように、ｘｒｃｃ ５^M1+/-または野生型胸腺細胞では、シグナル末端しか検出されなかった。ＴＣ Ｒ Ｄδ１エレメントに特異的なＰＣＲプライマーを使用する別の実験もまた、 ｓｃｉｄおよびＫｕ−欠損胸腺細胞の試料中でヘアピンコード末端を検出し、野 生型胸腺細胞ＤＮＡ中ではシグナル末端だけが検出された（データは示していな い）。これらのデータは、Ｋｕ−欠損マウスはｓｃｉｄマウスと同様に、ヘアピ ンコード末端の処理に欠陥があることを示す。 ６．１１． ｘｒｃｃ５^M1突然変異細胞はγ線放射に対して高度に感受性である Ｋｕは不死化した細胞株でのみ解析されているため、繊維芽細胞はｘｒｃｃ５^M1-/- 胚から得た。本発明者らは、Ｋｕ−欠損細胞株（Jeggo，1990;Weaver，199 5）から得られたデータに基づき、ｘｒｃｃ５^M1-/-細胞はイオン化放射線に対し て高度に感受性であろうと予測した。γ線放射に対する用量応答曲線を、ｘｒｃ ｃ５^M1-/-および対照（野生型およびｘｒｃｃ５^M1-/-）マウス胚繊維芽細胞（Ｍ ＥＦ）について作製し、ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦは、予想通り、γ線放射に対し て高度に感受性であった（図８）。ＤＮＡ−ＰＫ_CSと協同してＫｕは、遺伝子の 病変に結合して、おそらくここに他のタンパク質を集めることにより、障害ＤＮ Ａを直接修復しているかも知れない。さらにＤＮＡ−ＰＫは、転写を阻害し、Ｄ ＮＡ障害に対する細胞サイクル応答を刺激して、修復に影響を与えているかも知 れない。 ６．１２． ｘｒｃｃ５^M1-/-細胞はゆっくり増殖する 放射線実験は、ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦで予想外の表現型を明らかにした。こ れらは、対照のＭＥＦよりゆっくり増殖するようであり、この欠陥は、継代を繰 り返すと顕著になった。細胞を高密度で蒔いた後、ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦと対 照ＭＥＦおよびマウス皮膚繊維芽細胞（ＭＳＦ）の増殖速度を測定した。ｘｒｃ ｃ５^M1-/-ＭＥＦ（図９ａ）とｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＳＦ（図９ｂ）の両方で増殖は 低下していた。５−ブロモ−２’デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識すること により、同期したＭＥＦで細胞サイクルが観察された。おそらくは、細胞分裂時 間の延長を予測し組織培養およびマウスでの遅い増殖を説明するであろう、細胞 サイクル中の非効率的な進行のために、対照ＭＥＦより８倍少ないｘｒｃｃ５^{M1 -/-} ＭＥＦが、Ｓ期に入った（図９ｃ）。 ６．１３． ｘｒｃｃ５^M1-/-突然変異細胞は速く老化する ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦと対照ＭＥＦおよびＭＳＦについてコロニーサイズ分 布（ＣＳＤ）を測定して、低密度でその増殖ポテンシャルを樹立した（図１０ａ ）。１４．５日の胚からＭＥＦを作製し、８〜１２週および４６〜４８週令のマ ウスからＭＳＦを作製した。４〜１５細胞からなるコロニー（小コロニー）およ び＞１５細胞からなるコロニー（大コロニー）のパーセントを測定した。興味深 いことに、対照と比較して、大きいコロニーの割合は、ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦ とｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＳＦでそれぞれ８倍および１１倍の低下があった。 ＣＳＤ観察結果に基づき、ｘｒｃｃ５^M1-/-細胞は早期の老化を示すと予測し た。ＣＳＤは、ヒト胚性肺および皮膚繊維芽細胞およびそのドナーの年齢と寿命 を正確に予測した（Smithら、1978、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75:1353-1356 ；Smithら、1980，Mech．Age Dev．6:283-286）。組織培養またはインビボで何 度も継代された細胞は、大きいコロニーの割合が徐々に低下する。対照とｘｒｃ ｃ５^M1-/-マウスの両方についてドナーの年令の増加とともに、大きいコロニー の割合が徐々に低下するため、ＭＥＦとＭＳＦの両方について同じ観察結果が得 られた。ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＳＦと対照ＭＳＦの寿命を、３Ｔ３分析により測定 した（図１０ｂ）。予想されたように、ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＳＦは、対照ＭＳＦ より早い形態で老化した。さらにｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦとｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＳ Ｆの形態は、対照よりはるかに少ない継代で分化が進んでおり（図１０ｃ）、早 期の老化を示した（Bayreutherら、1988、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 85:5112 -5116）。これらの結果は、ｓｃｉｄ細胞ではなくｘｒｃｃ５^M1-/-細胞が組織培 養で早く老化したため、ＫｕはＤＮＡ−ＰＫ_CSとは独立に機能する可能性を示唆 する。 ６．１４． ｘｒｃｃ５^M1-/-ＭＥＦ中の増殖／老化欠陥のレスキューのスクリ ーニング ＸＲＣＣ５についての細胞突然変異を用いて、増殖／老化欠陥をレスキューす る遺伝的突然変異についてスクリーニングする。使用される細胞の具体的なタイ プは、Ｋｕ活性について欠陥である限り、重要ではない。これは、ＸＲＣＣ５ま たはＫｕ７０をコードする遺伝子中の突然変異を含むが、これらに限定されない 。 Ｋｕ欠損細胞中の増殖−老化欠陥をレスキューする突然変異は、多くの方法で 行われ、突然変異を作製するために使用される具体的な方法は重要ではない。突 然変異の作製方法の例では、一般的にＤＮＡ障害性物質（２本鎖破壊はこれらの 細胞に対して致死的であるため、好ましくは、２本鎖を破壊しない物質）に細胞 を暴露させる。別の方法は、細胞をレトロウイルスで感染させることである。レ トロウイルスの組み込みは、突然変異を導入し、タグとしても作用する。突然変 異を作製するための別の方法は、ランダムに導入されたトランス活性化プロモー ターによりアンチセンスｍＲＮＡを作製することである。 増殖をレスキューするための別の方法は、Ｋｕ活性が欠損した細胞中でトラン ス 遺伝子を異所性に発現することである。様々な発現ライブラリーが使用でき、具 体的なライブラリーの種類は重要ではない。使用される細胞の具体的なタイプは 、Ｋｕ活性が欠陥である限り、重要ではない。これは、ＸＲＣＣ５、またはＫｕ ７０をコードする遺伝子の突然変異を含むが、これらに限定されない。 増殖をレスキューする別のアプローチは、Ｋｕ活性が欠損した細胞中で内因性 遺伝子の過剰発現を誘導することである。種々の技術が使用でき、具体的な技術 は重要ではない。使用される細胞の具体的なタイプは、Ｋｕ活性が欠陥である限 り、重要ではない。これは、ＸＲＣＣ５、またはＫｕ７０をコードする遺伝子の 突然変異を含むが、これらに限定されない。 増殖／老化表現型をレスキューするための別のアプローチは、Ｋｕ欠損マウス を、サプレッサー遺伝子または細胞サイクルを負に調節する任意の遺伝子が欠損 したマウス（ｐ５３突然変異マウスおよびｐ２１突然変異マウスを含むが、これ らに限定されない）と交配（bleed）することである。増殖／老化欠陥のレスキ ューは、これらのマウスから得られる細胞および／またはマウス中で解析される 。 増殖／老化表現型をレスキューする別のアプローチは、Ｋｕ−欠損マウスを、 細胞サイクルを介して増殖を促進する遺伝的改変マウス（これは、癌遺伝子を過 剰発現するマウスを含むが、これらに限定されない）と交配することである。増 殖／老化欠陥のレスキューは、これらのマウスから得られる細胞および／または マウス中で解析される。 上記明細書で記載したすべての文献および特許は、引用により本明細書に組み 込まれる。本発明の範囲と精神を逸脱することなく、本発明に記載の方法および システムの種々の修飾および変更が可能であることは、当業者には明らかであろ う。本発明を具体的な好適な実施態様について記載したが、本発明はそのような 具体例に限定すべきでないことは理解されたい。分子生物学または関連分野の当 業者に明らかな、本発明を実施するための上記方法の種々の修飾は、次の請求の 範囲内にあると考えられる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，Ｔ Ｒ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １.ＸＲＣＣ５遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子中に遺伝子操作された突然 変異を含む、二倍体動物細胞。 ２．突然変異ＸＲＣＣ５対立遺伝子についてホモ接合性である、請求項１記載の 細胞。 ３．前記突然変異は欠失突然変異である、請求項１記載の細胞。 ４．前記突然変異は、ＸＲＣＣ５コード配列のヌクレオチド７０１〜９６４が欠 失している、請求項３記載の細胞。 ５．マウス胚幹細胞である、請求項１記載の細胞。 ６.ＸＲＣＣ５遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子の発現または機能を改変す る、遺伝子操作された突然変異を含む、非ヒトトランスジェニック動物。 ７．請求項６記載の非ヒトトランスジェニック動物の突然変異胚子孫。 ８．ＸＲＣＣ５遺伝子中の前記突然変異についてホモ接合性である、請求項６記 載の動物。 ９．前記突然変異は欠失突然変異である、請求項６または８のいずれか１項に記 載の動物。 １０．前記欠失突然変異は、ＸＲＣＣ５コード配列のヌクレオチド７０１〜９６ ４を含む、請求項９記載の動物。 １１．ＸＲＣＣ５遺伝子中の前記突然変異についてホモ接合性な、単離された胚 繊維芽細胞である、請求項１記載の細胞。 １２．ＸＲＣＣ５^M1-/-細胞の表現型をレスキューする突然変異をスクリーニン グするための方法であって、 （Ａ）遺伝的に改変したＫｕ−欠損細胞を増殖させて、８回目の継代以後に老化 しない細胞を観察する工程； （Ｂ）８回目の継代以後に老化しない細胞について３Ｔ３または３Ｔ９または集 団の倍化解析を行って、寿命を測定する工程； （Ｃ）老化細胞中で見いだされる特徴について、継代８以後に老化しない細胞の 形態を観察する工程；および （Ｄ）工程Ｃからの細胞中のゲノム改変を同定する工程、 を含んでなる前記方法。 １３．前記条件は、トランスフェクションされた遺伝子または内因性遺伝子の過 剰発現を含む、請求項１２記載の方法。 １４．前記条件は、トランスフェクションされた遺伝子または内因性遺伝子の異 所性発現を含む、請求項１２記載の方法。 １５．前記条件は、細胞サイクルの負の調節が欠損しているか、または細胞サイ クルを介して進行することに優れている、遺伝的バックグランドで、ＸＲＣＣ５^M1 突然変異、またはＫｕ−欠損を引き起こす任意の突然変異を増殖（bleed）す ることを含む、請求項１２記載の方法。