JP2000516445A - 合成遺伝子を含むワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチド又はタンパタ質をコードするＤＮＡ配列を含む合成ポリヌクレオチドが提供される。この合成ポリヌタレオチドのＤＮＡ配列は、非同種宿主における発現に最適化されたコドンを含む。本発明は、ＨＩＶ ｅｎｖはもちろん、ＨＩＶｅｎｖの改変をコードする合成ＤＮＡ分子によって例示される。この合成分子のコドンは計画された宿主細胞が好むコドンを含む。この合成分子は外来遺伝物質の好ましい形態を提供する。この合成分子は、中和抗体及び細胞媒介免疫によりＨＩＶ感染に対する免疫学的予防をもたらすポリヌクレオチドワクチンとして用いることができる。本発明は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含むイン・ビホ脊椎動物に直接導入された場合に、コードされたタンパク質の発現をその動物体内で誘発するポリヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 合成遺伝子を含むワクチン 発明の背景 １．ＨＩＶ感染： ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は後天性ヒト免疫不全症候群（ＡＩ ＤＳ）及び関連疾患の病因学的作用因子である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科 のＲＮＡウイルスであり、全てのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ −ｅｎｖ−ＬＴＲ３’構成を示す。加えて、ＨＩＶ−１は、ｔａｔ及びｒｅｖ遺 伝子を含む、調節もしくは未知の機能を有する多少の遺伝子を含む。ｅｎｖ遺伝 子はウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードし、これは１６０キロダルトン （ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳された後、細胞性プロテアーゼに よる開裂を受けて外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）及 び膜貫通４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を生じる。ｇｐ１２ ０及びｇｐ４１は会合したままであり、ウイルス粒子及びＨＩＶ感染細胞表面上 に現れる。ｇｐ１２０はヘルパーＴリンパ球、マクロファージ及び他の標 的細胞上に存在するＣＤ４受容体に結合する。ｇｐ１２０がＣＤ４に結合した後 、ｇｐ４１はウイルス侵入の原因である融合現象に媒介する。 ウイルス粒子上のｇｐ１２０がＴ４リンパ球又は他の標的細胞の表面上のＣＤ ４受容体に結合したときに感染が始まる。結合したウイルスは標的細胞と合体し 、そのＲＮＡゲノムを細胞の二本鎖ＤＮＡに逆転写する。ウイルスＤＮＡが細胞 の核の遺伝物質に組み込まれ、そこでこのウイルスＤＮＡが新たなウイルスＲＮ Ａ、ウイルスタンパク質、及び新たなウイルス粒子の産生を導く。新たな粒子は 標的細胞の膜から発芽し、他の細胞に感染する。 免疫防御に重要であるＴ４リンパ球の破壊は、ＨＩＶ感染の特徴である進行性 免疫機能障害の主因である。標的細胞の喪失はほとんどの侵入体に抗する身体の 能力を大きく損なうが、ウイルス、真菌、寄生虫及びミコバクテリアを含む特定 の細菌に対する防御に特に深刻な打撃を加える。 ＨＩＶ−１は、感染した細胞を、複製し、それらから発芽し、かつ細胞膜に損 傷を与えることにより殺す。ＨＩＶ−１は、感染した細胞の表面に現れるウイル スｇｐ１２０により標的細胞 を間接的に殺すことがあろう。Ｔ細胞上のＣＤ４受容体がｇｐ１２０に対する強 い親和性を有するため、ＣＤ４受容体を発現する健常細胞がｇｐ１２０に結合し 、感染細胞と融合して融合細胞を形成することがある。融合細胞は生存すること ができない。 また、ＨＩＶ−１は感染細胞に対する正常な細胞性免疫防御を誘発することも ある。抗体の助力で、またはそれ無しに、細胞毒性防御細胞はその表面上にウイ ルスタンパク質を示す感染細胞を破壊することができる。最終的に、遊離のｇｐ １２０がＨＩＶ−１に感染した個体の血液中を循環し得る。この遊離のタンパク 質は未感染細胞のＣＤ４受容体に結合し、それらを感染したように見せて免疫応 答を誘発することが可能である。 ＨＩＶ−１での感染はほとんど常に致死的なものであり、現時点ではＨＩＶ− １感染に対する治療は存在しない。ＨＩＶ−１感染を予防する上で有効なワクチ ンはいまだに得られていない。復帰突然変異又は感染の危険性のため、生弱毒化 ワクチンはおそらくワクチンとして用いることができない。大部分のサブユニッ トワクチンのアプローチはＨＩＶ感染の予防では成功していない。ＨＩＶ−１感 染の治療は、何人かのの感染者を延 命させるものの、深刻な副作用を有する。したがって、この致死的感染との格闘 に有効な治療及びワクチンに対する大きな必要性が存在する。 ２．ワクチン ワクチン接種は疾患予防の有効な形態であり、いくつかの型のウイルス感染に 対して成功することが立証されている。防御体液性及び細胞性免疫を誘発するた めにヒト免疫系にＨＩＶ−１抗原を提示する方法の決定は困難な作業である。今 日まで、有効なＨＩＶワクチンを生成しようとする試みは成功していない。ＡＩ ＤＳ患者においては、遊離のウイルスは低濃度でのみ存在する。ＨＩＶ−１の伝 染は、細胞−細胞相互作用により融合及び融合細胞形成を介して高まる。したが って、遊離のウイルス又はウイルスサブユニットに対して産生する抗体は、ウイ ルス感染細胞の排除の点では一般に無力である。 ワクチンは、抗原を“覚える”身体の能力を利用する。所定の抗原との最初の 遭遇の後、免疫系はその抗原の免疫学的記憶を個体の一生の間保持する細胞を産 生する。引き続いてその抗原に晒すと、免疫応答が刺激され、その病原体の排除 又は不活性化が生じる。 免疫系は病原体を２通りの方法：体液性応答及び細胞媒介応答により処理する 。体液性応答においては、リンパ球が、抗原に結合し、それによりその病原体を 不活性化する特異的抗体を産生する。細胞媒介応答は、感染細胞を特異的に攻撃 して破壊する細胞毒性ヘルパ−Ｔリンパ球を含む。 ＨＩＶ−１ウイルスを用いるワクチンの開発には、そのワクチンが免疫系にお いて活性化することが必要な細胞と同じ細胞（すなわち、Ｔ４リンパ球）の幾つ かにＨＩＶ−１が感染する問題がある。免疫系の損傷が生じる前にＨＩＶを不活 性化するワクチンを開発することが有利である。特に適する型のＨＩＶワクチン は、ＨＩＶ変種を認識し、かつ感染の開始期のＨＩＶ陽性個体において作用する 抗−ＨＩＶ免疫応答を生成する。 中和及び防御免疫応答を誘発することが望まれる、ウイルス、特にはヒト免疫 不全ウイルスのような高率で突然変異を生じるものに対するワクチンを開発する 上での主な問題は、異なるウイルス単離体又は株の間でのウイルスエンベロープ タンパク質の多様性である。マウス及びヒトの両者における細胞毒性Ｔリンパ球 （ＣＴＬ）は保存された内部ウイルスタンパク質から誘導されるエピトープを認 識することか可能であり、ウイルスに 対する免疫応答において重要であるものと考えられるため、異なるウイルス株に 対する異種防御を提供することが可能なＣＴＬワクチンの開発に労力が注がれて いる。 ＣＤ８⁺ＣＴＬは、それらのＴ細胞受容体がＭＨＣクラスＩ分子と会合したウ イルスペプチドを認識したときにウイルス感染細胞を殺すことが知られている。 このウイルスペプチドは、内生的に合成されたウイルスタンパク質から、そのタ ンパク質の位置又はウイルス内での機能とは無関係に誘導される。したがって、 保存されたウイルスタンパク質に由来するエピトープを認識することにより、Ｃ ＴＬは交差株防御をもたらすことが可能である。ＭＨＣクラスＩと会合すること が可能なＣＴＬ認識のためのペプチドは、細胞質もしくは小胞体内に存在し、又 はそれを通過するタンパク質に由来する。一般には、（ＭＨＣクラスＩＩ分子に よって提示される抗原の場合のように）エンンドソーム処理経路に入る外来性タ ンパク質はＣＤ８⁺ＣＴＬ応答の生成に有効ではない。 ＣＴＬ応答を生成しようとする労力の大部分では細胞内でのタンパク質抗原の 産生に複製ベクターが用いられるか、又は細胞質ゾルへのペプチドの導入に焦点 が当てられている。これら のアプローチには、それらのワクチンとしての有用性が低下し得るという制限が ある。レトロウイルスベクターには、その組換えウイルスの複製する能力を一方 では維持しながら、融合タンパク質として発現し得るポリペプチドのサイズ及び 構造に制限があり、そして、引き続く免疫のためのワクチニアのようなベクター の有効性はそれらのベクター自体に対する免疫応答により弱体化されよう。また 、ウイルスベクター及び改変病原体にはヒトにおけるそれらの使用を妨げ得る固 有の危険性がある。さらに、提示させようとするペプチドエピトープの選択は個 体のＭＨＣ抗原の構造に依存し、したかって、ペプチドワクチンには、異種交配 集団におけるＭＨＣハプロタイプの多様性のために有効性に限界がある可能性が ある。 ３．ＤＮＡワクチン Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｙ，Ｎ．及びＲｅｓｈｅｆ，Ｌ．［ＰＮＡＳ ８３，９５ ５１−９５５５，（１９８６年）］は、マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）、静脈内（ ｉ．ｖ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）により導入されたＣａＰＯ₄沈殿ＤＮＡが発 現可能であることを示した。ＣａＣｌ₂処理無しでマウスにＤＮＡ発現ベクター をｉ．ｍ．注射することにより、筋肉細胞によるＤＮＡ の取り込み及びそのＤＮＡによってコードされるタンパク質の発現が生じた。こ のプラスミドはエピソーム的に維持され、複製しなかった。続いて、ラット、魚 類及び霊長類の骨格筋、並びにラットの心筋へのｉ.ｍ.注射の後に持続性の発現 が観察されている。核酸を治療薬として用いるこの技術はＷＯ９０／１１０９２ 号（１９９０年１０月４日）に報告されており、この報告では裸のポリヌクレオ チドが脊椎動物のワクチン接種に用いられた。 免疫が筋肉内であることはこの方法の成功に必要なことではない。ウシ成長ホ ルモン（ＢＧＨ）をコードするＤＮＡをコートした金微小弾丸をマウスの皮膚に 導入することにより、そのマウスで抗−ＢＧＨ抗体が産生した。生きている動物 の皮膚、筋肉、脂肋及び乳組織の形質移入にはジェットインジャクター（ｊｅｔ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）が用いられている。核酸を導入するための様々な方法が再 検討されている。マウスにおけるＤＮＡ：カチオン性リポソーム複合体の静脈内 注射によりクローン化導入遺伝子の全身性発現を生じることはＺｈｕら［Ｓｃｉ ｅｎｃｅ ２６１：２０９−２１１（１９９３年７月９日）］によって示された 。Ｕｌｍｅｒら［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： １７４５−１７４９（１９９３年）］は、インフルエンザウイルスタンパク質を コードするＤＮＡの筋肉内注射によるインフルエンザウイルスの感染に対する異 種防御に関して報告した。 病原体及び腫瘍抗原に対する所望の免疫応答を誘発することが可能な特定の治 療及び予防薬に対する必要性が、本発明によって満たされる。この治療アプロー チにおいて特に重要な点は、抗原遺伝子が得られた株とは異種のウイルス株によ って引き起こされた感染又は疾患であっても、それを予防することが可能なＴ細 胞免疫応答を誘発する能力である。これはＨＩＶを扱う場合に特に関心のあるも のであり、何故ならばこのウイルスは急速に突然変異するものと認識されており 、かつ多くの毒性単離体が同定されているためである［例えば、２４５の別々の ＨＩＶ単離体を同定しているＬａＲｏｓａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：９３２ −９３５（１９９０年）を参照］。この認識された多様性に対応して、研究者ら はペプチド免疫に基づくＣＴＬの生成を試みている。このようにして、Ｔａｋａ ｈａｓｈｉら［Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：３３３−３３６（１９９２年）］は、 ＨＩＶエンベロープ（ｇｐ１６０）決定基を認識する広範囲に交差反応性の細胞 毒性Ｔ細胞の誘発について報告した。し かしながら、これらの研究者らは真の交差反応性ＣＴＬ応答を達成することが困 難であることを認識し、Ｔ細胞の非常に厳格な初回刺激又は再刺激と既に刺激さ れているＣＴＬからの細胞毒性を含むエフェクター機能の誘発とは対立している ことを示唆した。 Ｗａｎｇらは、クローン化ゲノム（非スプライス化）ＨＩＶ遺伝子を筋肉内接 種することによる、マウスにおけるＨＩＶに対する免疫応答の誘発に関して報告 した。しかしながら、これらの研究において達成された免疫応答の水準は非常に 低かった。加えて、ＷａｎｇらのＤＮＡ構築体では連続するＴａｔ／ｒｅｖ−ｇ ｐ１６０−Ｔａｔ／ｒｅｖコーディング配列をコードするＨＩＶの本質的なゲノ ム断片が用いられた。以下に詳述されるように、これはｇｐ１６０の高水準の発 現を得るための準最適系である。また、これは、Ｔａｔの発現がカポジ肉腫の進 行に寄与するため、潜在的な危険性を有する。 ＷＯ９３／１７７０６号にはウイルスに対して動物をワクチン接種する方法が 記述されており、この方法では担体粒子が遺伝子構築体で被覆され、その被覆粒 子が加速されて動物の細胞に入れられた。ＨＩＶに関しては、末端反復配列を除 く、本質 的にゲノム全体を用いることが提案された。一般に、ワクチンの安全性を保証す るため、ＨＩＶの構築体はＨＩＶのゲノムの約５０％以上を含むべきではないと 信じられている。そうすることにより、その多くが未知の、又は理解が乏しい機 能を有する酵素的部分及びウイルス調節タンパク質の除去が確実になる。このよ うに、有用なヒトＨＩＶワクチンが遺伝子送達技術から現れるかどうか幾つかの 問題が残っている。 本発明では、ポリヌクレオチドを生体組織に導入してタンパク質の発現を誘発 する既知の方法のいずれもが考慮されている。しかしながら、本発明は、ＨＩＶ 及び他のタンパク質を抗原処理経路に導入してＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗体を効 率的に産生させるための新規免疫原を提供する。この医薬品は、細胞性及び体液 性の両者の抗−ＨＩＶ及びＨＩＶ中和免疫応答を誘発するワクチンとして有用で ある。本発明においては、上述の問題に対する取り組みが行われ、動物体内に導 入されたときにそれらの方法に付随する危険性を伴うことなくＨＩＶタンパク質 及びエピトープの効率的な発現を導くポリヌクレオチド免疫原を提供することに より解決されている。このようにして生成した免疫応答は、ＨＩＶの認識、ＨＩ Ｖの複製の阻害、ＨＴＶに感 染した細胞を同定して殺すことに有効であり、かつ多くのＨＩＶ株に対して交差 反応性である。 ４．コドンの用法及びコドンコンテキスト 生物のコドン対形成は高度に非ランダムであり、生物間で異なる。この情報は 所望の水準の翻訳効率を有する改変もしくは合成遺伝子の構築及び発現、ゲノム のどの領域がタンパク質コーディング領域であるのかの決定、異種遺伝子への翻 訳休止部位の導入、及びヌクレオチド配列の関係又は系統起源の確認に用いられ る。 形質転換生物における外来異種遺伝子の発現は今や日常的なものである。例え ばネズミ及びヒト遺伝子を含む多くの哺乳動物遺伝子が単細胞生物にうまく挿入 されている。これに関する標準技術には、プラスミドもしくはファージのような ベクターに発現させようとする外来遺伝子を導入し、そのベクターを生物への遺 伝子の挿入に用いることが含まれる。そのような遺伝子の本来のプロモーターは 、一般に、その遺伝子が挿入される宿主に適合する強力なプロモーターと置換さ れる。タンパク質配列決定機器は、例え微量であっても、天然タンパク質のアミ ノ酸配列を明らかにすることを可能にする。これらのアミノ酸 配列から、それらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列を推定することができる 。ＤＮＡ合成も急速に発展している技術であり、これらの推定ＤＮＡに相当する 合成遺伝子を容易に構築することができる。 発現系及び組換えＤＮＡの知識の萌芽にもかかわらず、生物において外来もし くは合成遺伝子を発現させようと試みる場合には重大な障害が残っている。例え ば、多くの天然の活性タンパク質は、それらが外来宿主において発現される場合 に生じるものとは異なる様式でグリコシル化される。このため、多くの哺乳動物 遺伝子を発現させるための細菌宿主に酵母のような真核生物宿主が好ましいこと がある。グリコシル化の問題は継続する研究の主題である。 別の問題はより理解が乏しい。合成遺伝子の翻訳は、強力なプロモーターと組 み合わせた場合であっても、しばしば予想よりも非常に劣る効率で進行する。同 じことが発現生物にとって外来性の外来遺伝子にもよく当てはまる。回収可能な 量の翻訳産生物が生成する十分に効率的な様式で遺伝子が転写される場合であっ ても、そのタンパク質はしばしば不活性であるか、又はその本来のタンパク質と は特性が何らかの点で異なる。 後者の問題は、通常、様々な生物におけるタンパク質の折り畳みの相違のため であると認識されている。この問題の解決法はわかりにくく、タンパク質の折り 畳みを制御する機構に対する理解は不十分である。 翻訳効率に関連する問題はコドンコンテキスト効果に関連するものと信じられ ている。全ての生物におけるタンパク質コーディング領域は様々な機能的な束縛 を受けており、その幾つかは適切な翻訳開始及び停止シグナルに加えて適切に作 用するタンパク質をコードする必要性に依存している。しかしながら、これらの 束縛の点からは容易に理解できないタンパタ質コーディング領域の幾つかの特徴 が認められている。このような特徴の重要な分類はコドンの用法及びコドンコン テキストに関係している。 コドンの使用は非常に偏向していて、異なる生物の間で大きく変化することが 知られている。コドンの使用パターンはｔＲＮＡイソアクセプターの相対量に関 連することが示されている。多量のタンパク質をコードする遺伝子と少量のタン パク質をコードする遺伝子とはコドン優先度が相違している。コドンの使用にお ける偏向がペプチド伸長速度を変更する可能性は広く論 じられている。コドンの使用における相違は翻訳速度の相違に関連するが、翻訳 に対するコドン選択の直接効果を示すことは困難である。コドン使用パターンに 関する他の提示される束縛には翻訳の忠実度の最大化及びタンパク質合成の動力 学的効率の最適化が含まれる。 コドンの非ランダム使用とは別に、コドン／アンチコドン認識がコドンそれ自 体の外部の配列によって影響を受ける、“コドンコンテキスト”と呼ばれる現象 のかなりの証拠が蓄積されている。非センスコドンはもちろんミスセンスコドン の抑制の効率に対する近傍ヌタレオチドの強力な影響が存在する。明らかに、天 然の細菌集団における多量のサプレッサー活性はもちろん、セレノシステイン及 びホスホセリンをコードする“終止”コドンの使用も終止がコンテキスト依存性 であることを必要とする。類似のコンテキスト効果は、翻訳の忠実度はもちろん 、翻訳開始の効率にも影響を及ぼすことが示されている。 大腸菌のタンパク質コーディング領域の統計分析は“コドンコンテキスト”の 別の表出を示している。ある位置での特定のコドンの存在は隣接するコドンにお ける特定のヌクレオチドの出現頻度に影響を及ぼし、これらのコンテキストの束 縛は高水 準で発現する遺伝子と低水準で発現する遺伝子とでは顕著に異なる。コンテキス ト効果は認識されてはいるが、コドンに隣接する好ましいヌクレオチドに関連す る統計的規則の推定される価値は比較的低い。これは、所望の水準の翻訳効率を 達成するためのコドンの選択のためにこのようなヌタレオチド優先度データの利 用を制限している。 自動ヌクレオチド配列決定機器の出現は様々な生物の多量の配列データを利用 可能にしている。それらのデータの理解は実質的な困難を提示する。例えば、遺 伝子配列データをタンパク質の配列に関連付けるためには、そのケノムのコーデ ィング領域を特定することが重要である。加えて、特定の生物のゲノムの系統が 実質的関心事である。幾つかの生物のゲノムは系統が混ざり合ったものであるこ とが知られている。現在、ウイルス起源の配列の幾つかが真核生物のゲノムに安 定に組み込まれている。これらウイルス配列それ自体は別の実質的に関連のない 種に由来するものである可能性がある。遺伝子の系統の理解は、他の生物におけ る関連遺伝子とそれらの翻訳産生物との適切な類似性を引き出す上で重要である 可能性がある。 翻訳に対するコドンコンテキスト効果のより良好な理解、及 びあらゆる所望の翻訳効果に適するコドンを決定する方法が必要とされる。また 、ヌクレオチド配列データからゲノムのコーディング領域を特定する方法も必要 とされる。さらに、タンパク質の折り畳みを制御し、かつ外来遺伝子が宿主にお いて発現したときに適切に折りたたまれることを保証する方法も必要とされる。 所望の翻訳効率に従って変更又は構築された遺伝子は非常に価値のあるものであ る。 産業上及び製薬上関心のあるタンパク質を微生物によって発現させるための組 換えＤＮＡ技術の実施の別の側面は“コドン優先度”である。遺伝子発現のため の既存の機構は遺伝的に形質転換された宿主細胞が所定かつ所望の産生物を構築 するように“作動する”というものであることは以前に言及されているが、微生 物内で達成される発現の水準は、部分的には挿入された外来遺伝子内に存在する アミノ酸特異的遺伝暗号の特定の代替形態に依存して広範な変動を受ける可能性 がある。４種類の可能性のあるヌクレオチド塩基の“トリプレット”は６４種類 の異なる形態で存在し得る。これらの形態が（転写開始及び終止に加えて）わず か２０種類の異なるアミノ酸のメッセージを提供するということは、幾つかのア ミノ酸が２つ以上のコドン でコードされ得ることを意味する。実際、幾つかのアミノ酸は６種類もの“余分 の”代替コドンを有し、これに対して別の幾つかのものは単一の必要とされるコ ドンを有する。完全には理解されていない理由により、代替コドンは異なる細胞 型の外来ＤＮＡ内に完全に均一に存在するわけではなく、特定の細胞型において は特定のコドンに対する可変の天然階層もしくは“優先度”が存在するように思 われる。 一例として、アミノ酸ロイシンはＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡ及 びＴＴＧ（それぞれ、ｍＲＮＡコドン、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵ Ａ及びＵＵＧに対応する）を含む６つのＤＮＡコドンのいずれかによって指定さ れる。微生物のゲノムコドン頻度の徹底的な分析により、大腸菌の外来ＤＮＡが 最も一般的にはＣＴＧロイシン指定コドンを含み、これに対して酵母及び粘菌の ＤＮＡが最も一般的にはＴＴＡロイシン指定コドンを含むことが明らかになって いる。この階層の観点から、大腸菌宿主によってロイシンに富むポリペプチドの 高水準の発現が得られる可能性がある程度はコドン使用の頻度に依存するものと 一般に考えられる。例えば、ＴＴＡに富む遺伝子は全ての可能性において大腸菌 における発現に劣り、これ に対してＣＴＧに富む遺伝子はおそらく高度にポリペプチドを発現する。同様に 、酵母細胞がロイシンに富むポリペプチドを発現させるために計画された形質転 換宿主細胞である場合、挿入されるＤＮＡにおける使用に好ましいコドンはＴＴ Ａである。 組換えＤＮＡ技術に関するコドン優先現象の暗示は明白であり、この現象は、 うまく形質転換された宿主生物において外来遺伝子の高発現水準を達成すること の従来の多くの失敗を説明している。“好ましさ”に劣るコドンが挿入された遺 伝子内に繰り返し存在し、その宿主細胞の発現のための機構が効率的に作動して いない可能性がある。この現象は、計画された宿主細胞の好ましいコドンを含む ように設計されている合成遺伝子が組換えＤＮＡ技術を実施するのに好ましい形 態の外来性遺伝物質を提供することを示唆する。 ５．タンパク質の輸送 真核細胞を分類する機能の多様性はそれらの膜境界の構造的な分化に依存して いる。これらの構造を生成し、かつ維持するためには、タンパク質が、小胞体内 のそれらの合成部位から細胞を通って予め決められた目的地に輸送されなければ ならない。これは、その輸送されるタンパク質が、主要輸送経路への接触 点に位置する経路選択の主因である分子機構によって認識される選別信号を示す ことを必要とする。大部分のタンパク質の選別決定は、それらの最終目的地、そ れらがその機能を発揮する細胞内の位置、がそれらの恒久的な滞留地となるため 、それらがそれらの生合成経路を経るときに１回だけなされることが必要である 。 細胞内の整合性の維持は、部分的には、タンパク質の選択的な選別及びそれら の正しい目的地への正確な輸送に依存する。過去数年にわたり、タンパク質の標 的設定及び局在化のための分子機構の精査が活発に研究されている。‘宛先ラベ ル’として作用し得るタンパク質上に定義された配列モチーフが同定されている 。多くの選別信号が膜タンパタ質の細胞質ドメインに関連することが見出されて いる。発明の要約 ペプチド又はタンパタ質をコードするＤＮＡ配列を含む合成ポリヌクレオチド が提供される。この合成ポリヌクレオチドのＤＮＡ配列は非同種宿主における発 現に最適化されたコドンを含む。本発明はＨＩＶ ｅｎｖはもちろんのことＨＩ Ｖ ｅｎｖの改変をもコードする合成ＤＮＡ分子によって例示される。 この合成分子のコドンには計画された宿主細胞の好ましいコドンが含まれる。こ の合成分子は外来性遺伝物質の好ましい形態を提供する。この合成分子は、中和 抗体及び細胞介在免疫によりＨＩＶ感染に対する有効な免疫予防を提供するポリ ヌクレオチドワクチンとして用いることができる。本発明は、霊長類及びヒトの ような哺乳動物を含む脊椎動物にイン・ビボで直接導入されたときに、コードさ れたタンパク質の発現をその動物体内に誘発するポリヌクレオチドを提供する。図面の簡単な説明 図１はＨＩＶ ｅｎｖカセットに基づく発現方策を示す。 図２はＤＮＡワクチン媒介抗−ｇｐ１２０応答を示す。 図３はネズミＤＮＡワクチン接種受容動物の血清の抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ 力価を示す。 図４はＨＩＶ ｅｎｖ ＰＮＶ細胞培養物形質移入の後のｇｐ１２０の相対発 現を示す。 図５はｔＰＡ−ｇＰ１４３／ｏＰｔＡ対ｏｐｔＢ ＤＮＡワクチン接種の後の 平均抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ応答を示す。 図６はネズミＤＮＡワクチン接種受容動物の血清によるＨＩＶの中和を示す。 図７はネズミＨＩＶ ｅｎｖ ＤＮＡワクチン接種受容動物からの血清による ＨＩＶ中和を示す。 図８は最適化されたＨＩＶ ｅｎｖ ＤＮＡ構築体の免疫ブロット分析である 。 図９はｇｐ１４０ＤＮＡ及びｏ−ｇｐ１６０タンパク質を最終的にワクチン接 種した後のアカゲザルにおける抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ応答を示す。 図１０は最終ワクチン接種後のアカゲザルのＳＨＩＶ中和抗体応答を示す。発明の詳細な説明 ペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む合成ポリヌタレオチド が提供される。この合成ポリヌタレオチドのＤＮＡ配列は非同種宿主における発 現に最適化されたコドンを含む。本発明はＨＩＶ ｅｎｖをコードする合成ＤＮ Ａ分子によって例示されることに加えて、ＨＩＶ ｅｎｖの改変も提供される。 この合成分子のコドンには計画された宿主細胞の好ましいコドンが含まれる。こ の合成分子は外来性遺伝物質の好ましい形態を提供する。この合成分子は、中和 抗体及び細胞介在免疫によりＨＩＶ感染に対する免疫学的予防を提供するポリヌ クレオチドワクチンとして用いることができる。本発明は、霊長類及びヒトのよ うな哺乳動物を含む脊椎動物にイン・ビボで直接導入されたときに、コードされ たタンパク質の発現をその動物体内に誘発するポリヌタレオチドを提供する。 したがって、ＨＩＶ ｅｎｖをコードする合成ＤＮＡ分子及びＨＩＶ ｅｎｖ の改変された形態をコードする合成ＤＮＡ分子が提供される。この合成分子のコ ドンは計画された宿主細胞によって好まれるコドンを用いるように設計される。 上述のように、本発明のこの部分の合成分子は、中和抗体及び細胞媒介免疫によ ってＨＩＶ感染に対する有効な免疫学的予防を提供するポリヌクレオチドワタチ ンとして用いることができる。この合成分子は免疫原組成物として用いることが できる。また、本発明のこの部分は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含む脊 椎動物にイン・ビホで直接導入されたときに、コードされたタンパク質の発現を その動物体内に誘発するポリヌクレオチドをも提供する。 ここで用いられる場合、ポリヌクレオチドは、生存する脊椎動物細胞に導入さ れたときにその細胞の機構をそのポリヌクレオチドを含む遺伝子によってコード される翻訳産生物を生成す るように導くことが可能であるような必須調節要素を含む核酸である。本発明の 一態様においては、このポリヌクレオチドは、転写プロモーターに作動的に連結 する少なくとも１つのＨＩＶ遺伝子を含むポリデオキシリボ核酸である。本発明 の別の態様においては、ポリヌクレオチドワクチン（ＰＮＶ）は、真核細胞の機 構（リボソーム、ｔＲＮＡ、及び他の翻訳因子）による翻訳を受容可能な少なく とも１つのＨＩＶ遺伝子をコードするポリリボ核酸を含む。このポリヌクレオチ ドによってコードされるタンパク質が病理学的状態を除く動物に通常生じること がないもの（すなわち、異種タンパク質）、例えば、ヒト免疫不全ウイルスに関 連するタンパク質、（ＨＩＶ）、後天性免疫不全症候群の病因学的作用因子、（ ＡＩＤＳ）である場合、その動物の免疫系は防御免疫応答を開始するように活性 化される。これらの外来性タンパク質はその動物の組織によって生成されるため 、発現したタンパク質は主要組織適合性系、ＭＨＣによって関連生物（ＨＩＶ） が実際に感染した場合と類似する方式で処理される。本開示において示されるよ うに、その結果は同種病原体に対する免疫応答の誘発である。 したがって、本発明者らは、生物学的系に導入されたときに ＨＩＶタンパク質及びエピトープの発現を誘発する核酸を調製している。誘発さ れた抗体応答は両者共に発現したＨＩＶタンパク質に特異的であり、ＨＩＶを中 和する。加えて、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識して破壊する細胞毒性Ｔリンパ 球が誘発される。 本発明は、哺乳動物の組織に導入されたときに、単細胞内にイン・ビボで分散 した遺伝子産生物の発現を誘発するポリヌクレオチドの使用方法を提供する。本 発明は、ｒｅｖ−非依存性遺伝子を得るのにｒｅｖ依存性ＨＩＶ遺伝子の複数の 操作を必要としない異なる解決法を提供する。ここに記述されるｒｅｖ−非依存 性発現系はそれ自体の資質として有用であり、単細胞におけるイン・ビボでの単 一の所望の遺伝子産生物の発現を示すための系である。 本発明の用途の多くが抗ウイルスワクチンに適用されるため、このポリヌクレ オチドはしばしばポリヌクレオチドワクチン、又はＰＮＶと呼ばれる。これは、 免疫刺激及び坑腫瘍治療におけるこれらのポリヌクレオチドのさらなる有用性を 本発明の範囲外とするものではない。 本発明の一態様においては、ＨＩＶ遺伝子産生物をコードす る遺伝子が発現ベクターに組み込まれる。このベクターは真核生物のＲＮＡポリ メラーゼによって認識される転写プロモーターを含み、かつＨＩＶ遺伝子コーデ ィング領域の末端に転写ターミネーターを含む。好ましい態様において、このプ ロモーターは、多くの他の既知プロモーター、例えば、強力な免疫グロブリン又 は他の真核生物遺伝子プロモーターを用いることができることを当該技術分野に おける熟練者は認識するであろうが、イントロンＡ配列を有するサイトメガロウ イルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）である。好ましい転写ターミネーター はウシ成長ホルモンターミネータ一である。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨターミネー ターの組み合わせが特に好ましい。 原核生物におけるポリヌクレオチドの調製を助けるため、真核生物細胞におい て抗生物質の発現が生じないように原核生物プロモーター転写制御の下で、抗生 物質耐性マーカーも発現ベクターに好ましく含められる。アンピシリン耐性遺伝 子、ネオマイシン耐性遺伝子及び他の薬学的に許容し得る抗生物質耐性マーカー を用いることができる。原核細胞における発酵によるポリヌクレオチドの高水準 の産生を助成するため、ベクターが原核生物の複製起点を含み、かつ高コピー数 のものであること が有利である。幾つかの商業的に入手可能な原核生物クローニングベクターがこ れらの利点をもたらす。非必須ＤＮＡ配列は除去することが望ましい。また、こ のベクターは真核生物細胞において複製できないことが望ましい。これは、ポリ ヌタレオチドワクチンの配列がレシピエントのゲノムに組み込まれる危険性を最 小にする。ポリヌクレオチドの発現を特定の組織型に限定することが望まれる場 合には、組織特異的プロモーター又はエンハンサーを用いることができる。 態様の１つにおいては発現ベクターｐｎＲＳＶが用いられ、このベタターでは ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）がプロモーターとして用 いられる。別の態様においては、ＣＭＶプロモーター及びＢＧＨ転写ターミネー ターがクローン化された突然変異ｐＢＲ３２２ベクターであるＶ１が用いられる 。別の態様においては、Ｖ１及びｐＵＣ１９の要素を組み合わせてＶ１Ｊと呼ば れる発現ベクターが生成されている。Ｖ１Ｊ又は他の所望の発現ベクターにはＨ ＩＶ遺伝子、例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｇｐ１６０、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅ ｎｖ、又は坑−ＨＩＶ免疫応答を誘発することが可能な他のあらゆるＨＴＶ遺伝 子がクローン化される。別の態様においては、アン ピシリン耐性遺伝子がＶ１Ｊから除去され、かつネオマイシン耐性遺伝子に置き 換えられてＶ１Ｊ−ｎｅｏが生成され、これには本発明に従って用いるために異 なるＨＩＶ遺伝子がクローン化されている。別の態様においてはこのベタターは Ｖ１Ｊｎｓであり、これは独自のＳｆｉ１制限部位がＶ１Ｊ−ｎｅｏの２１１４ 位の単一のＫｐｎ１部位に加工により組み込まれていることを除いてＶ１Ｊｎｅ ｏと同じである。ヒトゲノムＤＮＡにおけるＳｆｉ１部位の出現頻度は非常に低 い（１００，０００塩基当たり約１部位）。したがって、このベクターは、抽出 されたゲノムＤＮＡを単にＳｆｉ１消化することにより宿主ＤＮＡへの発現ベク ターの組み込みを注意深く監視することを可能にする。さらなる改良においては 、ベクターはＶ１Ｒである。このベクターにおいては、非常に小型のベクターを 生成するため、可能な限りの非必須ＤＮＡがベクターから“切り取られ”た。こ のベクターはＶ１Ｊｎｓの誘導体である。このベクターは、望ましくない配列が コードされることを気にすることなくより大きなインサートを用いることを可能 にし、細胞による取り込みを最適化する。 本発明の一態様は、ＨＩＶ ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇａｇ 及びＨＩＶの実験室適合株、例えば、ＳＦ２、ＩＩＩＢもしくはＭＮに由来する 遺伝子産生物をコードする遺伝子を含む。当該技術分野における熟練者は、ＨＩ Ｖ−１に由来する遺伝子に類似する機能を有するＨＩＶ−２株に由来する遺伝子 の使用がＨＩＶ−１構築体についてここに記述されるものに類似する免疫応答を 生成するものと予想されることを認識するであろう。これらの遺伝子を得るため のクローン化及び操作方法は当該技術分野における熟練者に公知である。 ＨＩＶの実験室適合株に対する免疫応答の誘発がＨＩＶの主要野外単離体の中 和をもたらすのに適するものではない可能性があることは認識される。したがっ て、本発明の別の態様においては、ＨＩＶの毒性主要野外単離体に由来する遺伝 子がポリヌクレオチド免疫原に組み込まれる。これは、このウイルス遺伝子のｃ ＤＮＡコピーを調製した後、個々の遺伝子をポリヌクレオチド免疫原にサブクロ ーン化することにより達成される。多くのＨＩＶ株の多くの遺伝子の配列が現在 公的にＧＥＮＢＡＮＫから入手可能であり、このようなＨＩＶの主要野外単離体 は、これらの株を利用可能とするためにクオリティ・バイオロジカル社（Ｑｕａ ｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．） ［７５８１ リンドバーグ・ドライブ、ゲイザースバーグ、メリーランド２０８ ７９］と契約している国立アレルギー及び感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉ ｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ ｉｓｅａｓｅｓ）（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。また、このような株は世 界保健機構（ＷＨＯ）［ＨＩＶの単離及び特徴付けのためのネットワーク（Ｎｅ ｔｗｏｒｋ ｆｏｒ ＨＩＶ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅ ｒｉｚａｔｉｏｎ）、ワクチン開発ユニット（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｖｅｌｏｐ ｍｅｎｔ Ｕｎｉｔ）、研究局（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ａ ＩＤＳに関する世界的プログラム（ＧｌｏｂａｌＰｒｏｇｒａｍｍｅ ｏｎ Ａ ＩＤＳ）、ＣＨ−１２１１ジュネーブ ２７、スイス］からも入手可能である。 この研究から、当該技術分野における熟練者は、本発明の有用性の１つが、ＨＩ Ｖの配列の多様性とＨＩＶの中和の血清学との相関を他のパラメーターに加えて 作成することができるように、イン・ビボはもちろんのことイン・ビトロでの試 験及び分析のための系を提供することであることを認識するであろう。ＨＩＶ株 の主要単離体に由来する遺伝子の組み込みにより、このウイルスの 臨床的な単離体に対する免疫応答を誘発し、したがって、当該分野において未だ に満たされていない必要性を満たす免疫原が提供される。さらに、毒性単離体が 変化するに従い、必要に応じて新しい配列を反映するようにこの免疫原を改変す ることができる。 用語の一貫性を保つため、ここではポリヌクレオチド免疫原構築体の記述に当 たり以下の慣例に従う：“ベクター名称−ＨＩＶ株−遺伝子−追加要素”。した がって、ＭＮ株のｇｐ１６０遺伝子が発現ベクターＶ１Ｊｎｅｏにクローン化さ れている構築体は、ここで与えられる名称は：“Ｖ１Ｊｎｅｏ−ＭＮ−ｇｐ１６ ０”である。この構築体に加えられる追加要素は以下にさらに詳細に説明される 。ウイルスの病因株が変化するため、医薬に組み込むのに最適である正確な遺伝 子は変化し得る。しかしながら、以下に示されるように、異種株に対して防御す ることが可能なＣＴＬ応答が誘発されるため、全ウイルス又はサブユニットポリ ペプチドベースのワクチンと比較して、本発明の免疫原及びワクチンにおいては 株の可変性はそれほど重要ではない。加えて、この医薬は新規遺伝子を挿入する 操作が容易であるため、これは分子生物学の標準技術によって容易になさ れる調整である。 ここで用いられる“プロモーター”という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合 するＤＮＡ鎖上の認識部位を指す。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼと開始複 合体を形成し、転写活性を惹起して駆動する。この複合体は、“エンハンサー” と呼ばれる活性化配列又は“サイレンサー”と呼ばれる阻害配列によって改変す ることができる。 ここで用いられる“リーダー”という用語は、遺伝子と共に転写される、構造 遺伝子の５’末端のＤＮＡ配列を指す。リーダーは、通常、しばしばプロ配列と 呼ばれるＮ−末端ペプチド伸長を有するタンパク質を生じる。細胞外の媒体又は 膜のいずれかに分泌されることが運命付けられているタンパク質については、一 般には疎水性であるこのシグナル配列はそのタンパク質を小胞体内に導き、その タンパク質はここから適切な目的地に放出される。 ここで用いられる“イントロン”という用語は、遺伝子産生物内のアミノ酸を コードしない、遺伝子中央部に生じるＤＮＡの区画を指す。イントロンの前駆体 ＲＮＡは切除され、したがってｍＲＮＡに転写されることもタンパク質に翻訳さ れること もない。 “カセット”という用語は、発現させようとする核酸配列を含む本発明の配列 を指す。カセットは、概念上は、カセットテープに類似する。各々のカセットは それ自体の配列を有する。したがって、カセットを交換することにより、そのベ クターは異なる配列を発現する。５’及び３’末端の制限部位のため、カセット は容易に挿入し、除去し、又は別のカセットと置き換えることができる。 “３’非翻訳領域”又は“３’ＵＴＲ”という用語は、通常その遺伝子と共に 転写される、構造遺伝子の３’末端の配列を指す。この３’ＵＴＲ領域は通常ポ リＡ配列を含む。この３’ＵＴＲはＤＮＡから転写されるが、タンパク質に翻訳 される前に切除される。 “非コーティング領域”又は“ＮＣＲ”という用語は、構造遺伝子の３’ＵＴ Ｒ領域に近接する領域を指す。このＮＣＲ領域は転写終止シグナルを含む。 “制限部位”という用語は制限エンドヌクレアーゼの配列特異的開裂部位であ る。 “ベクター”という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主 組織に導入することが可能な幾つかの手段を指す。プラスミド、バクテリオファ ージ及びコスミドを含む様々な型のベクターが存在する。 “有効量”という用語は、適切な水準のポリペプチドを産生するのに十分なＰ ＮＶが注射されることを意味する。当該技術分野における熟練者はこの水準が変 化し得ることを認識する。 本発明を説明するため、以下のＨＩＶに関する背景を説明する。ヒト免疫不全 ウイルスはリボ核酸（ＲＮＡ）ゲノムを有する。このＲＮＡゲノムは、ここで教 示される方法に従ってクローン化及び操作するためのｃＤＮＡコピーを生成する ため、当該技術分野において公知の方法に従って逆転写されなければならない。 このゲノムの各末端はプロモーターとして作用する末端反復配列である。これら の末端の間で、このゲノムは、様々なリーディングフレームにおいて、ｇａｇ− ｐｏｌ−ｅｎｖを主要遺伝子産生物としてコードしている（ｇａｇはグループ特 異的抗原であり、ｐｏｌは逆転写酵素、又はポリメラーゼであり、また、この領 域によって、代わりのリーディングフレームにおいて、例えばｇｐ１６０のｇｐ １２０及びｇｐ４１への、翻訳後処理の原因となるウイルスプロテアーゼがコー ドされ、 ｅｎｖはエンベロープタンパク質であり、ｖｉｆはビリオン感染性因子であり、 ｒｅｖはビリオンタンパク質発現の調節因子であり、ｎｅｇは陰性調節因子であ り、ｖｐｕはビリオン生産性因子“ｕ”であり、ｔａｔは転写のトランス活性化 因子であり、ｖｐｒはウイルスタンパク質ｒである）。これらの要素の各々の機 能は記述されている。 本発明の一態様においては、ＨＩＶ又はＳＩＶタンパク質をコードする遺伝子 が転写プロモーターに直接連結される。ｅｎｖ遺伝子は大きな膜結合タンパク質 ｇｐ１６０をコードし、これは翻訳後にｇｐ４１及びｇｐ１２０に改変される。 ｇｐ１２０遺伝子は発現のためにサイトメガロウイルスプロモーターの制御の下 に配置することができる。しかしながら、ｇｐ１２０は膜に結合せず、したがっ て、発現の際に細胞から分泌され得る。ＨＩＶは感染細胞内で休止状態に留まる 傾向があるため、細胞結合ＨＩＶエピトープに対する免疫応答も生じることが望 まれる。加えて、ウイルスの中和に最も有効な抗体応答を生成させるため、ウイ ルス感染によって生じるものに構造上類似する膜結合オリゴマーＥＮＶ抗原をワ クチンが産生することが望ましい。この目的は、分泌ｇｐ１４０エピトープ（ｇ ｐ１４０＞ｇｐ １２０＋ｇｐ４１の外部ドメイン）又は細胞膜会合エピトープｇｐ１６０をイン ビボ発現させて免疫応答を開始させることにより、本発明において達成される。 しかしながら、ｇｐ１６０の発現は、ｒｅｖが存在しない状態では、非スプライ ス遺伝子の核から搬出されないために抑制される。この系を理解するためには、 ＨＩＶの生活環をさらに詳細に説明しなければならない。 ＨＩＶの生活環において、宿主細胞の感染の際、ＨＩＶ ＲＮＡゲノムがプロ ウイルスＤＮＡに逆転写され、単一の転写単位として宿主のゲノムＤＮＡに組み 込まれる。そのＬＴＲはプロモーターをもたらし、これがＨＩＶ遺伝子を５’か ら３’の方向（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）に転写して全ゲノムの非スプライス転 写体を形成する。この非スプライス転写体はｍＲＮＡとして作用し、そこからｇ ａｇ及びｐｏｌが翻訳され、これに対してｅｎｖをコードする遺伝子の翻訳には 制限付きのスプライシングが生じなければならない。調節遺伝子産生物ｒｅｖが 発現するためには、このゲノムの設定においてはｒｅｖ及びｅｎｖが重複してい るため、２以上のスプライシング現象が生じなければならない。ｅｎｖの転写が 生じるためにはｒｅｖの転 写が停止しなければならず、逆も同様である。加えて、核からの非スプライスＲ ＮＡの搬出にはｒｅｖが存在することが必要である。しかしながら、ｒｅｖがこ のように作用するためには、ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ）か転写体上に存在しな ければならない［Ｍａｌｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２５４−２５７（１９ ８９年）］。 本発明のポリヌクレオチドワクチンにおいては、完全にスプライスされた遺伝 子を提供することにより（すなわち：リーディングフレームの切り替え又は非コ ーディング領域の除去を必要としない、所望の遺伝子産生物の完全なオープンリ ーディングフレームの提供；当該技術分野における通常の技術を有する者は特定 の遺伝子をスプライスしたときに生じるその遺伝子に幾らかの許容範囲が存在す ることを認識する；しかしながら、機能的なコーディング領域が得られる限りこ れは許容される）、この特定のＨＩＶ遺伝子の必須スプライスが排除されている 。したがって、態様の１つにおいては、各遺伝子産生物の断続的な発現が必要と ならないようにｇｐ１６０の全コーディング領域がスプライスされる。 本発明によって生じる二重の体液性及び細胞性免疫応答は、 ＨＩＶがその集団内はもちろんのこと感染した個体においても突然変異を生成す る傾向を考えると、ＨＩＶ感染の阻止に特に重要である。ＨＩＶに有効な防御ワ クチンを処方するためには、例えばｇｐ１６０（ｅｎｖは、ＵＳヒト集団に蔓延 する株であるＨＩＶ−１、分岐群Ｂ株全体にわたって約８０％保存されている） 、ＨＩＶの主要中和標的、はもちろん、ｇｐ１６０の保存部分及びｇａｇによっ てコードされている内部ウイルスタンパク質に対して反応性の細胞毒性Ｔ細胞に 対する多価抗体応答の両者を生成させることが望ましい。我々は、通常の実験室 株；感染集団内に見出される優性主要ウイルス単離体；抗体エピトープを中和す る交差株を暴露するように設計された変異ｇｐ１６０；及びｇａｇ及びｐｏｌ遺 伝子（ＨＩＶ単離体全体にわたって〜９５％保存されている）のような他の代表 的なＨＩＶ遺伝子から選択されるｇｐ１６０遺伝子を含むＨＩＶワクチンを作製 している。 免疫不全状態に進んでいない事実上全てのＨＩＶ血清陽性患者が坑−ｇａｇ ＣＴＬを有し、これに対してこれらの患者の約６０％は交差株ｇｐ１６０特異的 ＣＴＬを示す。しかしながら、ＡＩＤＳとして知られる疾患状態まで進行してい る感染個 体に見出されるＨＩＶ特異的ＣＴＬの量は非常に少なく、このことは、交差株Ｃ ＴＬ応答を誘発することができるという我々の発見の重要性を示している。 我々のｅｎｖ及びｇａｇポリヌクレオチドワクチン構築体によって誘発された 免疫応答はマウス及び霊長類において示される。ｅｎｖに対する抗体の産生をマ ウスにおいて監視することにより、所定の構築体が適切に免疫原性であること、 すなわち、ワクチン接種された動物の高い割合が抗体応答を示すことを確認する ことができる。また、マウスは、我々の構築体によるＣＴＬ誘発を試験するのに 適する安易な動物モデルをもたらし、したがって、特定の構築体がそのような活 性を生成することが可能であるかどうかを評価するのに用いられる。サル（アフ リカザル、ミドリザル、アカゲザル、チンパンジー）は、より大きな非げっ歯類 動物における抗体評価のための霊長類を含むさらなる種をもたらす。また、これ らの種は、マウス血清中に観察されるレトロウイルスに対する高水準の内在性中 和活性のため、抗血清中和検定を行う上でマウスよりも好ましい。これらのデー タは、チンパンジー／ＨＩＶ_IIIB追加抗原モデルにおける実験において、この系 について既知の中和抗体の防御水準 に基づく防御を達成するのに十分な免疫原性が我々のワクチンによって生じるこ とを示す。しかしながら、現在科学団体において浮かび上がり、徐々に受け入れ られている防御の定義は、ＨＩＶ感染の完全な防御を示す、いわゆる“無菌化免 疫”から疾患の予防に常に移りつつある。この目的の幾つかの関連項目には、Ｈ ＩＶ逆転写酵素活性、血清試料の感染性、血液中のｐ２４又は他のＨＩＶ抗原の 濃度のＥＬＩＳＡ検定、増加するＣＤ４⁺Ｔ細胞濃度、及び生存率の拡大のいず れかによる測定での血液ウイルス力価の減少が含まれる［例えば、抗−ＨＩＶワ クチンの効力の定義を進展させることの考察については、Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｓ ｃｉｅｎｃｅ ２６２：１８２０−１８２１，１９９３年を参照］。また、本発 明の免疫原は、ＨＩＶの感染性（臨床的、主要野外）単離体に対する中和免疫応 答も生成する。免疫学 Ａ．ｅｎｖに対する抗体応答 １．ｇｐ１６０およびｇｐ１２０ ＥＬＩＳＡ検定を用いて、分泌ｇｐ１２０ 又は膜結合ｇｐ１６０のいずれかを発現するワクチンベクターがｅｎｖ特異的抗 体の産生に有効であるかどう かを決定する。我々のワクチン接種ベクターによるｅｎｖ発現の初期イン・ビト ロ特徴付けはｇｐ１６０形質移入細胞溶解物の免疫ブロット分析によりもたらさ れる。これらのデータは、形質移入細胞のｇｐ１６０発現を可視化する抗−ｇｐ ４１及び抗−ｇｐ１２０モノクローナル抗体を用いて、ｇｐ１６０の発現を確認 し定量化する。本発明の一態様においては、以下の理由によりｇｐ１６０がｇｐ １２０より好ましい：（１）初期ｇｐ１２０ベクターはマウスにおいては矛盾し た免疫原性をもたらし、ミドリザルにおいては応答性が非常に乏しいか、もしく は非応答性であった；（２）ｇｐ１６０は、ｇｐ４１を抱合することによる約１ ９０アミノ酸残基の追加をもたらすことにより、追加の中和抗体はもちろんのこ とＣＴＬエピトープにも寄与する；（３）ｇｐ１６０の発現は４量体組立体及び 全体の立体配座に関してウイルスｅｎｖにより類似し、これはオリゴマー依存性 中和エピトープをもたらし得る；および（４）我々は、マウス、フェレット、及 び非ヒト霊長類において中和抗体を産生させるための膜結合インフルエンザＨＡ 構築体の成功［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５−１７４９； Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．ら，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅ１１ Ｂｉｏｌ． １２：７７７−７８３，１９９３年を参照］と同様に、抗−ｇｐ１ ６０抗体の産生が抗−ｇｐ１２０抗体の産生を上回ることを見出している。どの 型のｅｎｖか好ましいか、又はｅｎｖサブ断片のカタテルが好ましいかどうかの 選択は以下に概述される実験によって決定される。 ２．中和活性の存在及び広さ サルに由来するＥＬＩＳＡ陽性抗血清を試験し 、それが同種及び非同種ＨＩＶ株の両者を中和することを示す。 ３．Ｖ３対非Ｖ３中和抗体 ｅｎｖ ＰＮＶについての主な目的は広範な中和 抗体を生成することである。Ｖ３ループに対する抗体が非常に株特異的であるこ とが今や示されており、かつこの応答の血清学が株の定義に用いられている。 ａ． 非Ｖ３中和抗体は、ＣＤ４結合の原因である、ｇｐ１２０内の不連続 構造エピトープを主として認識するように思われる。このドメインに対する抗体 はポリクローナルであり、おそらくはそのウイルスが細胞リガンドに結合するこ とを必要とすることにより強要される、突然変異の抑止のために、より広範に交 差中和する。免疫動物の血清により９６ウェルプレートに固定化されたＣＤ４へ のｇｐ１２０の結合のブロックを試 験するのにイン・ビトロ検定が用いられる。第２のイン・ビトロ検定は、プラス チック上に固定化された、選択されたＶ３ドメインに相当する合成ペプチドへの 直接抗体結合を検出する。これらの検定は、我々の研究において用いられるいず れの動物の型に由来する抗血清にも適合し、我々のワクチンが産生する中和抗体 の型を決定することはもちろん、ウイルス中和とのイン・ビトロ相関も提供する 。 ｂ． ｇｐ４１は少なくとも１つの主要中和決定基を有し、これは、広範に 中和する２Ｆ５モノクローナル抗体(バイラル・テスティング・システムズ社(Ｖ ｉｒａｌ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｏｒｐ．)、テキサス・コマー ス・タワー、６００トラビス・ストリート、スート４７５０、ヒューストン、Ｔ Ｘ７７００２−３００５（ＵＳＡ）、又はバルトハイム・ファルマツォイチカ（ Ｗａｌｄｈｅｉｍ Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｋａ）ＧｍｂＨ、ボルツマンガッセ １１、Ａ−１０９１ ウィーン、オーストリアから商業的に入手可能）によって 認識される高度に保存された直鎖エピトープと、ｇｐ４１のＮ−末端に位置する 十分に保存された“融合タンパク質”ドメインを含む他の潜在的部位に相当する 。上述の免疫ブロットによるｇｐ ４１に対する抗体の検出に加えて、プラスチックに固定化されたこれらドメイン が提示している合成ペプチドに結合する抗体のためのイン・ビトロ検定試験が用 いられる。 ４．抗体応答の成熟 ＨＩＶ血清陽性患者においては、中和抗体応答が主とし て抗−Ｖ３から、ｇｐ４１エピトープを含む、上述の（＃３）構造ｇｐ１２０ド メインエピトープを含むより広範に中和する抗体を含むものへと進行する。これ らの型の抗体応答を時間及び引き続くワクチン接種の全過程両方にわたって監視 する。 Ｂ．ｅｎｖ及びｇａｇに対するＴ細胞反応性 １．ＣＴＬ応答の生成 細胞内で合成されるウイルスタンパタ質はＭＨＣＩ制 限ＣＴＬ応答を生成する。これらのタンパク質の各々が血清陽性患者においてＣ ＴＬを誘発する。我々のワクチンもまた、マウスにおいてＣＴＬを誘発すること が可能である。マウス株の免疫原性は、インフルエンザＮＰで示されるように、 このような研究の助けとなる［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４ ５−１７４９，１９９３年を参照］。幾つかのエピトープがＨＩＶタンパク質、 ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｎｅｆ及びｇａｇについてＢａｌｂ／ｃマウスにおいて定義さ れ ており、それによりイン・ビトロＣＴＬ培養及び細胞毒性検定が容易になってい る。これらの遺伝子が形質移入された、ネズミ肥満細胞腫Ｐ８１５のような同系 腫瘍系を、ＣＴＬはもちろんイン・ビトロ抗原特異的再刺激の標的を提供するの に用いることが有利である。ＭＨＣクラスＩ制限細胞毒性Ｔリンパ球を誘発する ことが可能な免疫原を定義する方法は公知であり［Ｃａｌｉｎ−Ｌａｕｒｅｎｓ ら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（９）：９７４−９７８，１９９３年を参照；特に、 Ｅｒｉｋｓｓｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ １１（８）：８５９−８６５，１９９３ 年を参照、ここでは、ＨＩＶ ｇｐ１２０上のＴ細胞活性化エピトープが霊長類 においてマッピングされており、ｇ１２０アミノ酸１４２−１９２、２９６−３ ４３、３６７−４００、及び４１０−４５３を含む幾つかの領域か各々リンパ球 増殖を誘発することが見出された；さらに、不連続領域２４８−２６９及び２７ ０−２９５がリンパ球増殖性であった。アミノ酸１５２−１７６を含むペプチド もＨＩＶ中和抗体を誘発することが見出された］、これらの方法は、本発明のＰ ＮＶに含めるための免疫原性エピトープの同定に用いることができる。あるいは 、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、プロテアーゼ、又はｇａｇをコード する遺伝子全体を用いることができる。この主題についてさらに再検討するには 、例えば、Ｓｈｉｒａｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１６５７−１６６７ ，１９９２年；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：５６９−５７ ４，１９９１年；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：５７５−５ ８３，１９９１年；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８８ ：８７６−８８４，１９９１年を参照のこと。ここで用いられているように、Ｔ 細胞エフェクター機能は、成熟Ｔ細胞表現型、例えば、細胞毒性、Ｂ細胞活性化 のためのサイトカイン分泌、及び／又はマクロファージ及び好中球の補充もしく は刺激に関連する。 ２．Ｔ_H活性化の測定 ワクチン接種動物から誘導される脾臓細胞培養物を、 組換えタンパク質又はペプチドエピトープのいずれかを添加することによる特異 的抗原の記憶復活について、試験する。付随する脾臓抗原提示細胞ＡＰＣによっ て提示される、このような抗原によるＴ細胞の活性化を、これらの培養物の増殖 又はサイトカイン産生により監視する。サイトカイン産生のパターンはまた１型 又は２型としてのＴ_H応答の分類を可能にする。ドメインＴ_H２応答は免疫無防備 状態の血清陽性患 者における細胞性免疫の排除と相関するように思われるため、患者において所定 のＰＮＶによって生じる応答の型を定義することが可能であり、生じる免疫応答 の操作を可能にする。 ３．遅延型過敏症（ＤＴＨ） ｉ．ｄ．注射の後のウイルス抗原に対するＤＴ Ｈは、細胞性の主としてＭＨＣＩＩ制限性の免疫を示すものである。組換えＨＩ Ｖタンパク質及び既知エピトープの合成ペプチドを商業的に入手することが可能 性であるため、ＤＴＨ応答はこれらの試薬を用いてワクチン接種された脊椎動物 において容易に決定され、したがって、細胞性免疫の誘発についてのさらなるイ ン・ビホ相関がもたらされる。防御 上述の免疫学的研究に基づいて、我々のワクチンが脊椎動物において毒性ＨＩ Ｖによる攻撃に対して有効であると断言することができる。これらの研究は、こ れらの動物をＰＮＶ構築体、又はｇｐ１６０_IIIB、ｇａｇ_IIIB、ｎｅｆ_IIIB及び ＲＥＶ_IIIBを含むＰＮＶ構築体のカクテルで十分にワクチン接種した後に、ＨＩ Ｖ_IIIB／チンパンジーウイルス投与モデルにおいてなされる。このＩＩＩＢ株は 、この株の致死量のチンパンジー力価が確立されているため、これに関しては有 用である。 しかしながら、ＨＩＶのあらゆる株及び所定の株に特異的であり、又は非同種エ ピトープを用いる同じ研究が考えられる。第２のワクチン接種／ウイルス投与モ デルは、チンパンジーに加えて、ｓｃｉｄ−ｈｕ ＰＢＬマウスである。このモ デルは、ヒトリンパ球免疫系、及びマウス宿主におけるＨＩＶ投与が続く我々の ワクチンの試験を可能にする。この系は、あらゆるＨＩＶ株での使用に容易に適 合し、かつＨＩＶの主要野外単離体の複数の株に対する防御の証拠をもたらすた め有利である。第３のウイルス投与モデルはハイブリッドＨＩＶ／ＳＩＶウイル ス（ＳＨＩＶ）を用いる。そのうちの幾つかはアカゲザルに感染し、結果として 死に至らしめる免疫不全症に導くことが示されている［Ｌｉ，Ｊ．ら，Ｊ．ＡＩ ＤＳ ５：６３９−６４６，１９９２年を参照］。アカゲザルに我々のポリヌク レオチドワクチン構築体をワクチン接種することにより、引き続く致死量のＳＨ ＩＶ投与に対する防御が生じる。ＰＮＶ構築体の要約 ＨＩＶ及び他の遺伝子を、ポリヌクレオチドワクチン接種に対して最適化され ている発現ベクターにライゲートする。転写プロモーター、免疫原エピトープ、 転写ターミネーター、細菌 複製起点及び抗生物質耐性遺伝子の必須要素を残して、本質的に全ての外来性Ｄ ＮＡを除去する。 ｅｎｖ及びｇａｇのようなＨＩＶ後期遺伝子の発現はｒｅｖ依存性であり、ｒ ｅｖ応答要素（ＲＲＥ）がウイルス遺伝子転写体上に存在することを必要とする 。ｇｐ１２０の分泌形態は、ｒｅｖが存在しない状態において、ｔＰＡ（組織型 プラスミノーゲン活性化因子）に由来するもののような異種リーダー、好ましく は、高度に発現した哺乳動物タンパク質において見出されるもののようなリーダ ーペプチド、例えば免疫グロブリンリーダーペプチド、でｇｐ１２０リーダーペ プチドを置換することにより生成させることができる。我々は、形質移入細胞（ ＲＤ、ヒト横紋筋肉腫系）において分泌ｇｐ１２０を効率的に発現するＶ１Ｊｎ ｓにｔＰＡ−ｇｐ１２０キメラ遺伝子を挿入している。モノシストロンｇｐ１６ ０は、ｒｅｖ発現ベクターを加えることなしには、形質転換によっていかなるタ ンパク質をも産生しない。代表的な構築体成分には以下のものが含まれる（これらに限定されるものではな い） １．ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MN； ２．ｇｐ１６０_IIIB； ３．ｇａｇ_IIIB：抗−ｇａｇ ＣＴＬ用； ４．ｔＰＡ−ｇＰ１２０_IIIB； ５．ｔＰＡ−ｇｐ１４０ ６．構造的な突然変異：Ｖ１、Ｖ２、及び／又はＶ３ループ欠失又は置換を 有するｔＰＡ−ｇＰ１６０； ７．ＨＩＶ以外の病原体によって発現される抗原、例えば、これらに限定さ れるものではないか、インフルエンザウイルス核タンパク質、赤血球凝集素、マ トリックス、ノイラミニダーゼ、及び他の抗原性タンパタ質；単純ヘルペスウイ ルス遺伝子；ヒトパピローマウイルス遺伝子；結核抗原；Ａ、Ｂ、又はＣ型肝炎 ウイルス抗原をコードする遺伝子。 引き続くウイルス投与に対するポリヌクレオチドＨＩＶ免疫原の防御効率は、 本発明の非複製プラスミドＤＮＡでの免疫により示される。これは、感染性因子 が含まれず、ウイルス粒子の組立体を必要とせず、かつ決定基の選択が可能であ ることから有利である。さらに、ｇａｇ及びプロテアーゼ及び幾つかの他のウイ ルス遺伝子産生物の配列がＨＩＶの様々な株の間で保存されているため、そのク ローン化遺伝子が得られた株と同種 であるＨＩＶの毒性株はもちろん、それとは異種の株による引き続くウイルス投 与に対する防御が可能である。 ｇｐ１６０をコードするＤＮＡ発現ベクターをｉ．ｍ．注射することにより、 引き続くウイルス投与に対する相当程度の防御免疫が生じる。特に、ｇｐ１６０ 特異的抗体及び主要ＣＴＬが生じる。保存されているタンパク質に対する免疫応 答は、可変性エンベロープタンパク質が抗原的シフト及びドリフトするにもかか わらず、有効であり得る。ＨＩＶ遺伝子産生物の各々がある程度の保存を示し、 かつＣＴＬが細胞内発現及びＭＨＣ処理に応答して生じるため、多くのウイルス 遺伝子がｇｐ１６０について達成されるものに類似する応答を生じるものと断言 できる。このように、発現ベクターにおいてクローン化され、かつ配列決定され た接合物によって示されるように、これらの遺伝子の多くが、これらの構築体が 利用可能な形態の免疫原作用因子であるようにクローン化されている。 本発明は、自己複製作用因子又はアジュバントを必要とすることなく交差株防 御免疫を誘発するための手段を提供する。加えて、本発明のポリヌクレオチドで の免疫はいくつかの他の利点を提供する。このワクチン接種のアプローチは、Ｃ Ｄ８⁺Ｃ ＴＬ応答が感染性作用因子と腫瘍の両方の病態生理学的処理にとって重要である ［Ｋ．Ｔａｎａｋａら，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，３５９（１９ ８８年）］ため、この両者に適用可能であるはずである。したがって、形質転換 プロセスにとって重要なタンパク質に対する免疫応答の誘発は癌防御又は免疫治 療の有効な手段であり得る。ウイルスタンパク質及びヒト成長ホルモンＤＮＡを 注射した後に発現するタンパク質に対する高力価抗体の産生は、これが、保存さ れた抗原を標的とする細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンとは別に、もしくはそれと組 み合わせて、抗体ベースのワクチンを作製する安易かつ非常に有効な手段である ことを示唆する。 ＤＮＡ構築体の産生及び精製の容易さは好都合なことにタンパク質精製の伝統 的な方法に匹敵し、したがって、組み合わせワクチンの生成を容易にする。した がって、例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、又は他のあらゆるＨＩＶ 遺伝子をコードする複数の構築体を調製し、混合し、かつ同時投与することがで きる。ＤＮＡ注射の後にタンパク質の発現が維持されるため、Ｂ及びＴ細胞の記 憶の持続が高められ、それにより長期間持続する体液性及び細胞媒介性免疫が生 じ得る。 ＤＮＡ構築体を調製し、かつ精製するための分子生物学の標準技術により、本 発明のＤＮＡ免疫原の調製が可能となる。したがって、分子生物学の標準技術は 本発明の生成物の生成に十分なものではあるが、ここに開示される特定の構築体 は、驚くべきことに、これまで標準的な不活性化全ウイルス又はサブユニットタ ンパク質ワクチンでは達成することができなかった結果である交差株及び主要Ｈ ＩＶ単離体の中和を生じる新規ポリヌクレオチド免疫原を提供する。 ワクチンレシピエントに導入しようとする発現可能なＤＮＡ又は転写されたＲ ＮＡの量は、用いられる転写及び翻訳プロモーターの強度及び発現する遺伝子産 生物の免疫原性に依存する。一般には、約１ｎｇないし１００ｍｇ、好ましくは 約１０μｇないし３００μｇの免疫学的もしくは予防的有効量が筋肉組織に直接 投与される。皮下注射、皮内導入、皮膚を通す圧入、及び他の投与様式、例えば 、腹腔内、静脈内、又は吸入送達も期待される。追加ワクチン接種を施すことも 期待される。ＨＩＶポリヌクレオチド免疫原をワクチン接種した後、ｇｐ１６０ 、ｇ１２０、及びｇａｇ遺伝子産生物のようなＨＩＶタンパク質免疫原で追加免 疫することも考慮される。インターロイキン− １２タンパク質又はＧＭ−ＣＳＦ又は類似のタンパク質を、単独でもしくは組み 合わせて、本発明のＰＮＶの非経口導入と同時にもしくはそれに続いて、非経口 投与する、例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は他の投与手段で投与することも有 利である。 このポリヌクレオチドは裸であってもよく、すなわち、あらゆるタンパク質、 アジュバント又はレシピエントの免疫系に衝撃を与える他の作用因子と会合して いなくともよい。この場合、ポリヌクレオチドは生理学的に許容し得る溶液、例 えば、これらに限定されるものではないが、無菌生理食塩水又は無菌緩衝生理食 塩水中にあることが望ましい。あるいは、このＤＮＡはリポソーム、例えば、レ シチンリポソームもしくは当該技術分野において公知の他のリポソームと、ＤＮ Ａ−リポソーム混合物として会合していてもよく、又は当該技術分野において免 疫応答を高めることが知られるアジュバント、例えば、タンパク質もしくは他の 担体と会合していてもよい。細胞のＤＮＡ取り込みを補助する作用因子、例えば 、これに限られるものではないが、カルシウムイオンも有利に用いることができ る。これらの作用因子は、一般にここでは、形質移入促進試薬及び薬学的に許容 し得る担体と呼ばれる。ポリヌクレオチドが被覆されて いる微小弾丸を被覆するための技術は当該技術分野において公知であり、同様に 本発明に関連して有用である。 以下の例は説明として提示されるものであり、いかなる方法においても本発明 を限定することを意図するものではない。 実施例１ 材料の説明 ベクターｐＦ４１１及びｐＦ４１２：これらのベクターは、Ｒ．Ｇａｌｌｏの 実験室において構築されたベクターｐＳＰ６２からサブクローン化した。ｐＳＰ ６２はバイオテック・リサーチ・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から入手可能な試薬である。 ｐＳＰ６２は、ラムダＨＸＢ２からサブクローン化したＨＸＢ２ゲノムの１２． ５ｋｂ ＸｂａＩ断片を有する。ｐＳＰ６２をＳａｌＩ及びＸｂａＩ消化するこ とによりＨＸＢ２断片：５’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ、６．５ｋｂ及び３’−Ｓａ ｌＩ／ＸｂａＩ、６ｋｂが生じる。これらのインサートをｐＵＣ１８のＳｍａＩ 及びＳａｌＩ部位にサブクローン化することによりｐＦ４１１（５’−ＸｂａＩ ／ＳａｌＩ）及びｐＦ４１２（３’−ＸｂａＩ／ＳａｌＩ）が生じる。ｐＦ４１ １はｇａｇ ／ｐｏｌを含み、ｐＦ４１２はｔａｔ／ｒｅｖ／ｅｎｖ／ｎｅｆを含む。レプリゲン（ｒｅｐｌｉｇｅｎ）試薬 組換えｒｅｖ（ＩＩＩＢ）、＃ＲＰ１０２４−１０ 組換えｇｐ１２０（ＩＩＩＢ）、＃ＲＰ１００１−１０ 抗−ｒｅｖモノクローナル抗体、＃ＲＰ１０２９−１０ 抗−ｇｐ１２０ｍＡＢ、＃１ｃ１、＃ＲＰ１０１０−１０ＡＩＤＳ研究及び参照試薬プログラム 抗−ｇｐ４１ｍＡＢハイブリドーマ、Ｃｈｅｓｓｉｅ８、＃５２６ この方策は、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）並びにＨＩＶ、主としてＨＩＶ ｇａｇ（〜９５％保存）及びｅｎｖ（ｇｐ１６０又はｇｐ１２０；７０−８０％ 保存）遺伝子産生物に対する中和抗体応答の両者を誘発するように設計されてい る。抗−ｅｎｖ及び抗−ｇａｇ ＣＴＬ応答の重要性が、これらの細胞性免疫の 開始と中和抗体が出現する前に生じる感染後の一次ウイルス血症のクリアランス とが知られているように併行していることにより、疾患のない状態の維持におけ るＣＴＬの役割と同様、強調されるか、ｇｐ１６０はＨＩＶ粒子上の既知の中 和抗体エピトープのみを含む。ＨＩＶはその遺伝的多様性で名高いため、我々は 、高度に保存されたｇａｇ遺伝子が広範な交差株ＣＴＬ応答を生成するはずでは あるが、臨床的単離体及びｇｐ４１（〜９０％保存）から誘導される幾つかの代 表的なｅｎｖ遺伝子を含めることにより、より幅の広い中和抗体が得られること を期待している。 実施例２ ＨＩＶ後期遺伝子産生物の異種発現 ｅｎｖ及びｇａｇのようなＨＩＶ構造遺伝子は、完全長タンパク質を産生する ために、ＨＩＶ調節遺伝子ｒｅｖの発現を必要とする。我々は、ｇａｇのｒｅｖ 依存性発現が低水準のタンパク質を生じ、ｒｅｖそれ自体が細胞にとって毒性で あり得ることを見出している。我々はイン・ビトロでｇｐ１６０の比較的高水準 のｒｅｖ依存性発現を達成したけれども、このワクチンはｒｅｖ／ｇｐ１６０ ＤＮＡでのイン・ビボ免疫化の後のｇｐ１６０に対する低水準の抗体しか誘発し なかった。これは、ｒｅｖの既知細胞毒性効果に加えて、数百の核を有する筋小 管においてｒｅｖ機能を得ることの増加した困難性（ｇａｇ又はｅｎｖタンパク 質の発現が生じるには、ｒｅｖタンパク質 がｒｅｖ依存性転写体と同じ核内にあることが必要である）の結果生じるものと 思われる。しかしながら、ｅｎｖ遺伝子の選択された改変によりｒｅｖ非依存性 発現を得ることが可能である。これらのプラスミドのワクチンとしての利用は評 価中である。 一般に、我々のワクチンは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、ＢＧＨポリ アデニル化部位、及びｐＵＣ主鎖を含んでなる我々の一般化されたワクチン接種 ベクターＶ１Ｊｎｓ内での発現を最適化するため、主としてＨＩＶ（ＩＩＩＢ） ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を用いている。いかに大きな遺伝子セグメントが用いら れるかに依存して（例えば、ｇｐ１２０対ｇｐ１６０）ｒｅｖ依存性発現の効率 を変化させることは、ｅｎｖについて、その本来の分泌リーダーペプチドを組織 特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）遺伝子のものと置換し、ＣＭＶイ ントロンＡを有するＣＭＶＩＥプロモーターの後ろの得られたキメラ遺伝子を発 現させることにより達成することができる。ｔＰＡ−ｇｐ１２０がこの方式で構 築された分泌ｇｐ１２０ベクターの例であり、これはワクチン接種マウス及びサ ルにおいて抗−ｇｐ１２０免疫応答を誘発するのに十分作用する。 膜固定化タンパク質が、分泌されたタンパク質に比較してより多量の（及び、 おそらくは、ＨＩＶ中和に対してより特異的な）抗体応答を誘発し得、また追加 の免疫エピトープを提供するという報告のため、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６ ０及びＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｇｐ１６０を調製した。ｔＰＡ−ｇＰ１６０ベクタ ーは、発現の水準はｒｅｖ／ｇｐ１６０、ｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラスミ ドで得られるものよりも非常に低いものの、形質移入細胞の免疫ブロット分析に よって示されるように、ｒｅｖを添加することなく、検出可能な量のｇｐ１６０ 及びｇｐ１２０を産生した。これは、おそらく、ｇｐ１６０転写体にｒｅｖ依存 性を付与する阻害領域（ＩＮＳと呼ばれる）がｇｐ４１のＣＯＯＨ−末端を含む ｇｐ１６０内の複数の部位にあるためである（ｇｐ１４３構築体方策の模式図に ついては図１を参照）。ｔＰＡ−ｇｐ１６０のＣＯＯＨ−末端が切りつめられた 形態、ｔＰＡ−ｇｐ１４３についてベクターを調製した。これは、これらの阻害 配列を除去することによりｅｎｖの発現水準全体を増大させるために設計された 。また、このｇｐ１４３ベクターは、細胞表面ではなくリソソームへの膜タンパ ク質の転換を生じることが知られるペプチドモチーフ（例えば、 ｌｅｕ−ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１領域も取り除く。したがって、ｇｐ１４ ３は、完全長ｇｐ１６０と比較してｅｎｖタンパク質の発現（ｒｅｖ依存性を低 下させることにより）及び細胞表面へのタンパク質の輸送効率の両者を高めるこ とが期待され、ＤＮＡワクチン接種の後の抗−ｇｐ１６０抗体をより誘発するこ とができよう。ｔＰＡ−ｇＰ１４３を、発現のさらなる阻害配列を除去するため に、ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）配列（３５０ｂｐ）のさらなるサイレント突然変 異により、さらに改変した。この構築体ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥは、２つの形 態、ｇｐ１２０／４１のタンパク分解開裂部位の除去（形態Ａ）又は保持（形態 Ｂ）のいずれかで調製した。両形態は、ワクチニアにおいて発現した開裂不可能 なｇｐ１６０を用いるマウスのワクチン接種が開裂可能な形態よりも非常に高い 水準のｇｐ１６０に対する抗体を誘発したという報告のために調製した。 細胞形質移入体におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０の発現の定量的ＥＬＩＳＡを 、これらのベクターの相対的発現可能性を決定するために開発した。２９３細胞 のイン・ビトロ形質移入、続いて細胞会合対分泌／放出ｇｐ１２０の定量を行う ことにより、以下の結果を得た：（１）ｔＰＡ−ｇＰ１６０は、細胞内 対細胞表面への輸送で同様の特性を保持しつつ、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも５− １０倍少ないｇｐ１２０を発現した；（２）ｔＰＡ−ｇｐ１４３は、低水準の細 胞会合ｇｐ１４３で、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも３−６倍多くｇｐ１２０を分泌 し、ｇｐ１６０の細胞質のテールが、この配列を部分的に欠失させることにより 解決することができる、ｇｐ１６０の細胞内滞留を引き起こすことが確認される ；及び（３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ Ａ及びＢは、形態Ａについて タンパク分解の除去が確認されたものの、親のｔＰＡ−ｇＰ１４３よりも〜１０ 倍高いタンパタ質の発現水準をもたらした。図４は要点（１）−（３）を支持す る代表的なデータを示す。 このように、我々のｒｅｖ非依存性発現を増加させる方策は、発現全体の段階 的な増加と共に、膜固定化ｇｐ１４３のリソソームから細胞表面への再方向付け も与える。異なるウイルス株の間に幾つかの抗原性の相違が存在する場合、様々 なウイルス単離体から誘導されるｇｐ１２０配列を、ＮＨ₂−末端（ｔＰＡリー ダー）又はＣＯＯＨ−末端（ｇｐ４１）のいずれかにこれらの改変を含むベクタ ーカセットに挿入することが可能であるはずであることに注意することが重要で ある。換言すると、 これは、様々な主要ウイルス単離体から誘導されるｇｐ１２０を挿入することに より容易に改変して臨床的に関連するワクチンを得ることができる遺伝的構築体 である。 これらの発現方策をワクチン用途に関連するウイルスに適用し、我々のアプロ ーチの普遍性を確認するため、我々は主要ＨＩＶ単離体（ノースアメリカンコン センサスＶ３ペプチドループ；マクロファージ向性及び非融合細胞誘発性表現型 を含む）から誘導されるｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターをも調製した。このベクタ ーは形質移入２９３細胞でｇｐ１２０の高い発現／分泌をもたらし、かつマウス において抗−ｇｐ１２０抗体を誘発し、これはそれが機能的形態でクローン化さ れていたことを示す。主要単離体ｇｐ１６０遺伝子も実験室株から誘導されるｇ ｐ１６０と同じ方法での発現に用いる。 実施例３ ＨＴＶ−１ ｅｎｖポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答 ： ｇｐ１２０ＤＮＡワクチンを接種したミドリザル（ＡＧＭ）及びアカゲザル（ ＲＨＭ）は２−３回のワクチン接種の後低水準の中和抗体を示し、これは追加ワ クチン接種では増加させる ことができなかった。これらの結果は、オリゴマーｇｐ１６０かおそらくはｇｐ １２０単量体よりも中和抗体の誘発に関連する標的抗原であるというＨＩＶワク チン分野での認識（Ｍｏｏｒｅ及びＨｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７巻：８６３頁（ １９９３年））の増加と共に、ｇｐ１６０ベースのベクター（上記参照）の有効 な発現の獲得に焦点を当てる方向に我々を導いている。また、マウス及びＡＧＭ に一次単離体誘導ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンをワクチン接種した。これらの動 物は５００−５０００の範囲の抗−Ｖ３ペプチド（相同性配列を用いる）逆最終 点（reciprocal endopoint）抗体力価を示し、このワクチンの設計が臨床的に関 連するウイルス単離体に対して機能的であることを示す。 ｇｐ１６０ベースのワクチン、ｒｅｖ−ｇｐ１６０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０は マウス及び非ヒト霊長類において一貫して抗体応答を誘発することに失敗し、又 は低抗体力価を生じた。ｔＰＡ−ｇｐ１４３プラスミドを用いた我々の最初の結 果は、２回のワクチン接種の後、マウス及びＡＧＭにおいて＞１０³の幾何平均 力価を生じた。これらのデータは、我々が、発現水準を高めることによりｇｐ１ ６０様ワクチンの免疫原性を大きく 改善していることを示す。この構築体を、ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ Ａ及びＢベクターに加えて、抗体応答、特にウイルスの中和について特徴付けを 続ける。 同様に、ｇｐ１２０ＤＮＡのワクチン接種は、ＴＨ−１様サイトカイン分泌プ ロフィール（すなわち、ＩＬ−４をほとんど、もしくは全く伴わないｇ−インタ ーフェロン及びＩＬ−２産生）を有する試験した全てのリンパ性区画（脾臓、血 液、鼠径部、腸間膜及び腸骨節）において強力なヘルパーＴ細胞応答を生じた。 これらのサイトカインは一般に強力な細胞性免疫を促進し、ＨＩＶ血清陽性患者 の疾患がない状態の維持に関連付けられている。リンパ節は、ウイルスが血液中 に未だ検出することができないときでさえ、ウイルスの大貯蔵部を有する、ＨＩ Ｖ複製の主要部位であることが示されている。我々のＤＮＡワクチンで示されて いるような、様々なリンパ部位に抗−ＨＩＶ免疫応答を誘発することが可能なワ クチンは、最初の感染の後のリンパ管のコロニー形成の成功を妨げる手助けをし 得る。 前に述べられているように、我々は、以下の目的の実現がこのプログラムの成 功の機会を最大化するのに必須であると考える：（１）霊長類においてより強い 中和抗体応答を生成するこ とが可能なｅｎｖベースのべクター；（２）霊長類においてＣＴＬ及びヘルパー エフェクター機能によって特徴付けられる強力なＴリンパ球応答を誘発するｇａ ｇ及びｅｎｖベクター；（３）臨床的に関連するＨＩＶ−１株に由来するｅｎｖ 及びｇａｇ遺伝子の我々のワクチンにおける使用並びにそれらが誘発する免疫学 的応答、特に主要単離体の中和の特徴付け；（４）適切に最適化されたワクチン を用いる、動物ウイルス投与モデル、例えば、チンパンジー／ＨＩＶ（ＩＩＩＢ ）又はアカゲザル／ＳＨＩＶにおける防御の実証；並びに（５）臨床用途に適す る免疫応答の持続期間の決定。これらの目的のうちの最初の３つについては大き な進歩が見られ、ｇｐ１６０及びｇａｇに対する我々の最近のワクチン接種構築 体がこれらの初期結果を改善するかどうかを決定するための実験が進行中である 。 実施例４ ワクチン生成のためのベクター Ａ．Ｖ１Ｊｎｅｏ発現ベクター、配列番号１： 大規模発酵器においてアンピシリンを用いることができない可能性があるため 、Ｖ１Ｊを有する細菌の抗生物質選別に用いられるａｍｐ^rを除去する必要があ った。ＳｓｐＩ及びＥａｍ １１０５Ｉ制限酵素を用いる消化により、Ｖ１ＪのｐＵＣ主鎖からのａｍｐ^rを 除去した。残りのプラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製し、Ｔ４ＤＮ Ａポリメラーゼで平滑末端化した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し た。トランスポゾン９０３から誘導され、かつｐＵＣ４Ｋプラスミドに含まれる 商業的に入手可能なｋａｎ^r遺伝子をＰＳｔＩ制限酵素を用いて切り出し、アガ ロースゲル電気泳動により精製して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した 。この断片をＶ１Ｊ主鎖にライゲートし、Ｖ１Ｊｎｅｏ＃１及び３と命名される 、ｋａｎ^r遺伝子をいずれかの方向に有するプラスミドを誘導した。これらのプ ラスミドの各々を制限酵素消化分析、接合領域のＤＮＡ配列決定により確認し、 これらが同様の量のプラスミドをＶ１Ｊとして産生することが示された。これら のＶ１Ｊｎｅｏベクターは、異種遺伝子産生物の発現もＶ１Ｊに匹敵するもので あった。Ｖ１Ｊにおけるａｍｐｒと同じ方向にｋａｎ^r遺伝子を含むＶ１Ｊｎｅ ｏ＃３を発現構築体として任意に選択し、以下これをＶ１Ｊｎｅｏと呼ぶ（配列 番号１）。 Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ発現ベクター： 組み込み研究を容易にするため、Ｖ１ＪｎｅｏにＳｆｉＩ部 位を加えた。商業的に入手可能な１３塩基対ＳｆｉＩリンカー（ニュー・イング ランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ））をこのベ クターのＢＧＨ配列内のＫｐｎＩ部位に加えた。Ｖ１ＪｎｅｏをＫｐｎＩで直線 化し、ゲル精製し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑末端化して平滑末端化Ｓ ｆｉＩリンカーにライゲートした。制限マッピングによりクローン単離体を選択 し、リンカー全体の配列決定により確認した。この新たなベクターをＶ１Ｊｎｓ と命名した。（ＳｆｉＩを有する）Ｖ１Ｊｎｓにおける異種遺伝子の発現は（Ｋ ｐｎＩを有する）Ｖ１Ｊｎｅｏにおける同じ遺伝子の発現に匹敵するものであっ た。 Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ： 分泌及び／又は膜タンパク質に異種リーダーペプチド配列を付与するため、ヒ ト組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーを含むようにＶ１ Ｊｎを改変した。２つの合成相補的オリゴマーをアニールした後、ＢｇｌＩＩ消 化したＶ１Ｊｎにライゲートした。センス及びアンチセンスオリゴマーは、５’ −ＧＡＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＧＡＴ ＧＣＡ ＡＴＧ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＧ Ｇ ＣＴＣ ＴＧＣ ＴＧＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＧＡ ＧＣＡ ＧＴＣ ＴＴＣ ＧＴＴ ＴＣＧ ＣＣＣ ＡＧＣ ＧＡ−３’（配列番号２）、及び５’−ＧＡＴ ＣＴ Ｃ ＧＣＴ ＧＧＧ ＣＧＡ ＡＡＣ ＧＡＡ ＧＡＣ ＴＧＣ ＴＣＣ ＡＣ Ａ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＡＧ ＣＣＣ ＴＣ Ｔ ＣＴＴ ＣＡＴ ＴＧＣ ＡＴＣ ＣＡＴ ＧＧＴ−３’（配列番号３）で あった。センスオリゴマーにおいてコザック配列に下線が付されている。これら のオリゴマーはＢｇｌＩＩ開裂配列へのライゲートに適合する突出塩基を有する 。ライゲートの後、下流ＢｇｌＩＩは引き続くライゲートのために保持しながら 、上流ＢｇｌＩＩ部位を破壊した。接合部及びｔＰＡリーダー配列全体をＤＮＡ 配列決定により確認した。加えて、我々のコンセンサス最適化ベタターＶ１Ｊｎ ｓ（＝ＳｆｉＩ部位を有するＶ１Ｊｎｅｏ）と一致させるため、ＫｐｎＩ部位を Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＳｆｉＩリンカー（カタログ＃ １１３８、ニュー・イングランド・バイオラブス）と共にライゲートすることに より、ＳｆｉＩ制限部位をＶ１Ｊｎ−ｔＰＡのＢＧＨターミネーター領域内のＫ ｐｎＩ部位に配置した。この改変を、制限消化及びアガロース ゲル電気泳動により確認した。 実施例５ Ｉ．ＨＩＶ ｅｎｖワクチン構築体：分泌ｅｎｖ誘導抗原（ｇｐ１２０及びｇｐ１４０）を産生するワクチン ｇｐ１２０のようなｒｅｖ依存性ｅｎｖ遺伝子の発現を以下のように行った： ｇｐ１２０を、ＨＩＶのＭＮ株から、本来のリーダーペプチド配列と共に（Ｖ１ Ｊｎｓ−ｇｐ１２０）、又は本来のリーダーペプチドを置換する組織プラスミノ ーゲン活性化因子（ｔＰＡ）リーダーペプチドと共に融合体として（Ｖ１Ｊｎｓ −ｔＰＡ−ｇｐ１２０）、ＰＣＲクローン化した。ｔＰＡ−ｇｐ１２０の発現は ｒｅｖ非依存性であることが示されている［Ｂ．Ｓ．Ｃｈａｐｍａｎら，Ｎｕｃ ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９巻，３９７９頁（１９９１年）；ｇｐ１２０遺伝子 をｒｅｖ非依存性にする上で他のリーダー配列が同様の作用をもたらすことに注 意すべきである］。これは、上述のベクターを用いて以下のｇｐ１２０構築体を 調製することにより達成された。実施例６ １２０ワクチン構築体 ： Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_MNｇｐ１２０： ペプチドリーダー配列の最初の３０個のアミノ酸を除去し、かつＶ１Ｊｎｓ− ｔＰＡにクローン化してアミノ酸残基３０の後の残りのｇｐ１２０配列が続くｔ ＰＡリーダーペプチドからなるキメラタンパク質の作製を容易にするように設計 されたオリゴマーを用いて、ＨＩＶＭＮｇｐ１２０遺伝子（メドイムン（Ｍｅｄ ｉｍｍｕｎｅ））をＰＣＲ増幅した。この設計は、ｒｅｖ非依存性ｇｐ１２０発 現及びこのプラスミドを有する細胞からの可溶性ｇｐ１２０の分泌を考慮するも のである。用いられたセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、５’−ＣＣ Ｃ ＣＧＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＡＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧ ＧＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’（配列番号４）、及び５’−Ｃ ＣＣＣ ＡＧ Ｇ ＡＡＴＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＴＡ ＧＣＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＣＴ Ｃ ＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＣＴ Ｃ−３’（配列番号５）であった。翻 訳停止コドンに下線が付されている。これらのオリゴマーは、センスオリゴマー のＢａｍＨＩの３’側に位置する ＢｃｌＩ部位と共に、翻訳オープンリーディングフレームのいずれかの末端にＢ ａｍＨＩ制限酵素部位を含む。このＰＣＲ産生物をＢｃｌＩ、次いでＢａｍＨＩ で連続的に消化し、ＢｇｌＩＩ消化されているＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡにライゲート した後、子ウシ腸アルカリホスファターゼ処理した。得られたベクターを配列決 定してｔＰＡリーダーとｇｐ１２０コーディング領域との間のインフレーム融合 を確認し、ｇｐ１２０の発現及び分泌を形質移入ＲＢ細胞の免疫ブロット分析に より検証した。 Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_IIIBｇＰ１２０： このベクターは、ＨＩＶＩＩＩＢ株をｇｐ１２０配列に用いたことを除いて、 Ｉ．Ａ．に類似する。用いられたセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、 それぞれ：５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ Ｔ ＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３’（配列番号６）、及び５’−ＣＣ Ａ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＣＴ ＴＴＴ ＴＴ Ｃ ＴＣＴ ＣＴＧ ＣＡＣ ＣＡＣ ＴＣＴ ＴＣ−３’（配列番号７）であ った。これらのオリゴマーは、インサートのいずれかの末端にＢｃｌＩ部位をも たらすことに加えて、３’末端のＢｃｌＩ部位のすぐ上流にＥｃｏ ＲＶをもたらす。５’末端ＢｃｌＩ部位は、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌＩＩ部 位にライゲートしてｔＰＡリーダー配列及びその本来のリーダー配列を伴わない ｇｐ１２０をコードするキメラｔＰＡ−ｇｐ１２０遺伝子の作製を可能にする。 ライゲーション産生物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により確認した。 実施例７ １４０ワクチン構築体 ： これらの構築体は、本来のリーダーの代わりにｔＰＡリーダーを有するｔＰＡ −ｇｐ１２０と同様にＰＣＲにより調製したが、遺伝子を膜貫通ペプチドのＮＨ₂ −末端で直ちに終止することにより分泌抗原を産生するように設計した（計画 されたカルボキシ末端アミノ酸配列＝ＮＨ₂−．．．．．ＴＮＷＬＷＹＩＫ−Ｃ ＯＯＨ）［配列番号８］。ｇｐ１２０産生構築体とは異なり、ｇｐ１４０構築体 はオリゴマー抗原を産生し、かつ２Ｆ５モノクローナル抗体によって定義される ＥＬＤＫＷＡ（配列番号５３）のような既知のｇｐ４１含有抗体中和エピトープ を保持するべきである。 ｇｐ１２０及びｇｐ４１の接合部のｇｐ１６０タンパク分解開裂部位が保持さ れているか（Ｂ）又は除去されているか（Ａ） に応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で、Ｋｉｅｎｙら（Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．２巻： ２１９−２５５頁（１９８８年））によって記述されるように適切なアミノ酸置 換により構築体を調製した（野生型配列＝ＮＨ₂−．．．．．ＫＡＫＲＲＶＶＱ ＲＥＫＲ．．．．．ＣＯＯＨ（配列番号９）及び突然変異配列＝ＮＨ₂−．．． ．．ＫＡＱＮＨＶＶＱＮＥＨＱ．．．．．ＣＯＯＨ（配列番号１０）、変異アミ ノ酸には下線が付されている）。 Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ／ＳＲＶ−１ ３’− ＵＴＲ（ＨＩＶ−１_IIIBベース） ： この構築体は、（最適化されたＲＲＥ−Ａセグメントを含む）ベクターＩＶＢ からＡｖｒＩＩ／ＥｃｏＲＶセグメントを得るために、以下のセンス及びアンチ センスＰＣＲオリゴマーを用いてＰＣＲにより得た：５’−ＣＴ ＧＡＡ ＡＧ Ａ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＡＡＴ ＴＴＧ ＧＧＧ Ｔ ＴＧ ＣＴＣ ＴＧＧ−３’（配列番号１１）、及び５’−ＣＧＣ ＡＧＧ Ｇ ＧＡ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ Ｔ ＡＴ ＡＴＡ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＴＴ ＴＧＴ ＴＡＴ Ｇ−３’（ 配列番号１２）。サルレトロウイルス−１（ＳＲＶ−１、下記参照） から誘導される、合成遺伝子セグメントとして調製された３’−ＵＴＲを、ｇｐ １４０オープンリーディングフレームのすぐ３’側に導入されたＳｒｆＩ制限酵 素部位に挿入した。このＵＴＲ配列は、ＨＩＶ ｅｎｖ及びｇａｇのｒｅｖ非依 存性発現を容易にするものとして前に記述されている。 Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ／ＳＲＶ−１ ３’− ＵＴＲ（ＨＩＶ−１_IIIBベース） ： この構築体は、構築体ＩＶＣを出発物質として用いることによりｅｎｖタンパ ク分解開裂部位が保持されていることを除いて、ＩＴＡに類似する。 Ｃ．Ｖ１ＪｎＳ−ｔＰＡ−ｇｐ１４／ｏｐｔ３０−Ａ（ＨＩＶ−１_IIIBベース） ： この構築体は、ＡｖｒＩＩ及びＳｒｆＩで制限酵素消化し、次いでｇｐ３０に 相当するが翻訳に最適のコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメント（下記ｇｐ３ ２−ｏｐｔを参照）をライゲートすることにより、ＩＶＢから誘導した。このｇ ｐ３０−ｏｐｔ ＤＮＡは、ｇｐ３２−ｏｐｔから、以下のセンス及びアンチセ ンスオリゴマーを用いるＰＣＲ増幅により得た：それぞれ、５’−ＧＧＴ ＡＣ Ａ ＣＣＴ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＴ Ｇ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＴＧＧ−３’（配列番号１３）及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＡＴ ＡＴＣ Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＴＡ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＣＡ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＡＴ Ｇ−３’ （配列番号１４）。このＤＮＡセグメントをＡｖｒＩＩ及びＥｃｏＲＶ制限酵素 で消化し、対応するＤＮＡセグメントを除去するためにＡｖｒＩＩ及びＳｒｆＩ で消化したＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ（ＩＶＤ）にライゲ ートした。得られた生成物をライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定及び免疫ブ ロット分析により検証した。 Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ｂ（ＨＩＶ−１_IIIBベース ） ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＩＣに類似する。 Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ： この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に最適コドンを含んでなる。その定常領域（ Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）は、可変領域１−５に対応する追加合成ＤＮＡセグメン トが翻訳に最適のコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメントを用いて挿入されて いる、ＩＶ Ｂ、Ｄ、Ｈに記述されるものである（以下のＨＩＶ−１ ＭＮＶ１−Ｖ５に基づ く例を参照）。 Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＩＥに類似する。 Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ（非ＩＩＩＢ株）： この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体を通しての最適コドン用法の決定に用いられることを除いて、 上記ＩＩＥに類似する。 Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ（非ＩＩＩＢ株）： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＩＧに類似する。 実施例８ ｇｐ１６０ワクチン構築体 ： 上述のｇｐ１６０タンパタ分解開裂部位に応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で構 築体を調製した。 Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖ： このベクターは、エクソン１のｔａｔコーディング領域全体がｒｅｖオープン リーディングフレームの初めまで欠失していることを除いて、上記Ｄ項に記述さ れるものの変種である。Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０ＩＩＩＢ（上記Ａ項を参照）を ＰｓｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で消化してｇｐ１６０遺伝子の５’領域を除去し た。ＰＣＲ増幅を用いて、ＨＸＢ２ゲノムクローンに由来するｇｐ１６０の第１ ＲＥＶエクソンからＫｐｎＩ部位までをコードするＤＮＡセグメントを得た。セ ンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーは、それぞれ、５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＣＧ ＴＣＣ Ｔ ＡＴＧ ＧＣＡ ＧＧＡ ＡＧ Ａ ＡＧＣ ＧＧＡ ＧＡＣ−３’（配列番号１５）及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＡ ＧＧＴ ＡＣＣ ＣＣＡ ＴＡＡ ＴＡＧ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＣ− ３’（配列番号１６）であった。これらのオリゴマーは、それぞれ、ＤＮＡ断片 の５’及び３’末端にＰＳｔＩ及びＫｐｎＩ制限酵素部位を付与する。得られた ＤＮＡをＰＳｔＩ及びＫｐｎＩで消化し、アガロース電気泳動ケルから精製して Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０（ＰｓｔＩ／ＫｐｎＩ）にライゲートした。得られたプ ラスミドを制限酵素消化により検証した。Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０ ： ＨＩＶ_IIIbクローンＨＸＢ２から誘導されるＨＩＶ_IIIbゲノムの３’末端側半 分を含むプラスミドｐＦ４１２から、ＰＣＲ増幅により、ＨＩＶ_IIIbｇｐ１６０ をクローン化した。ＰＣＲのセンス及びアンチセンスは、それぞれ、５’−ＧＧ Ｔ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＧＡ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＡ Ｇ ＡＡＡ ＴＡＴ ＣＡＧ Ｃ−３’（配列番号１７）、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｃ−３’（配列番号１８）であった。コザッ ク配列及び翻訳停止コドンには下線か付されている。これらのオリゴマーは、ｅ ｎｖ遺伝子の両端の翻訳オープンリーディングフレームの外側にＢｃｌＩ制限酵 素部位を付与する。（ＢｃｌＩ消化部位はＢｇｌＩＩ消化部位とのライゲートに 適合し、その後、両制限酵素に対する感受性は喪失する。ＢｃｌＩはｇｐ１６０ のＰＣＲクローン化のために選択した。これは、この遺伝子がＢａｍＨＩ部位の 他に内部ＢｇｌＩＩを含むためである）。このアンチセンスオリゴマーはまた、 上述の他のＰＣＲ由来の遺伝子のためＢｃｌＩサイトの前にＥｃｏＲｖを挿 入する。増幅したｇｐ１６０遺伝子をアガロースゲル精製し、ＢｃｌＩで消化し て、ＢｇｌＩＩで消化され、かつ子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されて いるＶ１Ｊｎｓにライゲートした。このクローン化遺伝子は約２．６ｋｂのサイ ズであり、Ｖ１Ｊｎｓとのｇｐ１６０の各接合部をＤＮＡ配列決定により確認し た。 Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ６０（ＨＩＶ−１_IIIBベース）： こベクターは、本来のリーダー配列を含まない完全長ｇｐ１６０をＰＣＲによ り得たことを除いて、上記実施例１（Ｃ）に類似する。センスオリゴマーはＩ． Ｃ．において用いられたものと同じであり、アンチセンスオリゴマーは、５’− ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＣＣＣ ＡＴＣ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡＡ ＡＡＴ ＣＣＴ ＴＴＣ Ｃ−３’（配列番号１９）であった 。これらのオリゴマーは、インサートのいずれかの末端はもちろん、３’末端の ＢｃｌＩ部位のすぐ上流のＥｃｏＲＶにもＢｃｌＩ部位を付与する。５’末端Ｂ ｃｌＩ部位は、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌＩＩ部位にライゲートして、ｔＰＡ リーダー配列及びその本来のリーダー配列を 含まないｇｐ１６０をコードするキメラｔＰＡ−ｇｐ１６０を作製することを可 能にする。ライゲーション産生物を制限消化及びＤＮＡ配列決定により検証した 。 Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ６０／ｏｐｔ Ｃ１／ｏｐｔ４１−Ａ（ＨＩＶ− １_IIIBベース） ： この構築体はＩＶＨに基づくものであり、ｇｐ３２ではなくＣ５及びｇｐ４１ について完全に最適化されたコドンセグメントを有し、ｔＰＡリーダーが続くｇ ｐ１２０のアミノ末端でＣ１を置換するさらなる最適化コドンセグメント（下記 参照）を有する。この新たなＣ１セグメントは、接合Ｃ１／１４３を合成するた めに下記ＰＣＲ用オリゴマーを用いるＳＯＥ ＰＣＲにより、残りのｇｐ１４３ セグメントに接合させた：５’−ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＴＴ Ａ ＡＡ Ｃ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＧ ＡＡＧ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣ−３’（配列番号２０）。得られるｇｐ１４３遺伝子はＶ１−Ｖ ５領域を除いて最適のコドンの使用を含み、Ｃ１及びＶ１の接合部に配置される 、他のＨＩＶ遺伝子に由来する可変領域を挿入するための独自ＰｍｅＩ制限酵素 部位を有する。 Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ｂ（ＨＩＶ_{II IB}ベース） ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＩＩＤに類似する。 Ｆ Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ（ＨＩＶ−１_IIIBベ ース） ： この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に上述の最適コドンを含んでなる。その定常 領域（Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）はＩＩＩＤ、Ｅに記述されるものであり、これは （全ての完全に最適化されたｇｐ１６０に用いられる）カセットとして用いられ 、これに対して、可変領域Ｖ１−Ｖ５は最適コドンを含んでなる合成ＤＮＡセグ メントから誘導される。 Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ： この構築体は、ｅｎｖタンパタ分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＩＩＦに類似する。 Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ（非ＩＩＩＢ株）： この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の 決定に用いられたことを除いて、上記ＩＩＩＦに類似する。 Ｉ．１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐt ａｌｌ−Ｂ（非ＩＩＩＢ株）： この構築体は、ｅｎｖタンパク分開裂部位が保持されていることを除いて、Ｉ ＩＩＨに類似する。 実施例９ ｇｐ１４３ワクチン構築体 ： これらの構築体は、上述の他のｔＰＡ含有構築体と同様に、本来のリーダーの 代わりにｔｐＡを用いてＰＣＲにより調製したが、ＣＯＯＨ末端化膜結合ｅｎｖ を産生するように設計した（計画された細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂−ＮＲＶＲ ＱＧＹＳＰ−ＣＯＯＨ）。この構築体は、ｔＰＡ導入が付随するｅｎｖの発現の 増加と、ｅｎｖの細胞内部分に対応する転写体又はペプチド領域が発現又はタン パク質安定性／細胞表面への輸送に負に衝撃を与え得る可能性を最少化すること とを組み合わせる目的で設計した。上述のように、ｇｐ１６０タンパク分解開裂 部位が除去されているか、又は保持されているかに応じて２つの形態（Ａ又はＢ ）で構築体を調製した。ｇｐ１４３に対する切り詰めから得られる残留ｇｐ４１ 断片をｇｐ３２と呼ぶ。 Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３： この構築体は、以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーで、プラスミ ドｐＦ４１２を用いるＰＣＲにより調製した：５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＣＡ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＴＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＡＣＡ ＧＴＣ−３ ’（配列番号２１）、及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ ＧＣＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＡ Ｃ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＡＣ−３’（配列番号２２）。得られたＤＮＡ断片は、 ｅｎｖオープンリーディングフレームのすぐ３’側に位置するＳｒ−ｆＩ部位で 消化されたＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ／ＢｇｌＩＩにクローン化するためのＢｃｌＩ制 限部位をいずれかの末端に含む。構築体を、ライケーション接合部のＤＮＡ配列 決定及び形質移入細胞の免疫ブロット分析により検証した（図８）。 Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ： この構築体は、独自ＭｕｎＩ制限酵素部位及び上述の下流ＳｒｆＩ部位を用い るＤＮＡセグメントの切除により、ＩＶＡに基づくものであった。このセグメン トはｇｐ１２０Ｃ５ドメイン及びｇｐ３２全体のタンパク質に相当する。ｇｐ１ ６０の ｒｅｖ応答性要素（ＲＲＥ Ａ）の〜３５０ｂｐに対応する、翻訳に最適なコド ンを含む合成ＤＮＡセグメントを、スプライス重複伸長（ＳＯＥ）ＰＣＲにより 残りのｇｐ３２セグメントの接合し、これによりこれらの２つの断片の接合部に ＡｖｒＩＩ制限酵素部位が創出された（しかしながら、アミノ酸配列に変化はな い）。これらのＰＣＲ反応は、ｇｐ３２含有ドメインを生成させるため、それぞ れ以下のセンス及びアンチセンスＰＣＲオリゴマーを用いて行った：５’−ＣＴ ＧＡＡ ＡＧＡ ＣＣＡ ＧＣＡ ＡＣＴ ＣＣＴ ＡＧＧ ＧＡＴ ＴＴＧ ＧＧＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＴＧＧ−３’（配列番号２３）及び５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＴＧＡ ＴＣＡ Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＧＧＧ ＴＧＡ ＡＴＡ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＣＴ ＣＡＣ ＴＣＴ ＧＴＴ ＣＡＣ−３’［配 列番号２４］（これは、ＩＶＡに対してアンチセンスオリゴマーとして用いられ た）。突然変異ＲＲＥ（ｍｕｔＲＲＥ−Ａ）セグメントを、以下のセンスオリゴ マー、５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＣＡＡ ＴＴＧ ＧＡＧ ＧＡＧ ＣＧＡ ＧＴ Ｔ ＡＴＡ ＴＡＡ ＡＴＡ ＴＡＡ Ｇ−３’（配列番号２５）及びｇｐ３２ セグメントの作製に用いたアンチセンスオリゴマーを用いるＳＯＥ ＰＣＲにより、ｇｐ３２の野生型配列に接合した。得られた接合ＤＮＡセグメン トをＭｕｎＩ及びＳｒｆＩ制限酵素で消化し、親のｇｐ１４３／ＭｕｎＩ／Ｓｒ ｆＩ消化プラスミドにライゲートした。得られた構築体を、ライゲーション及び ＳＯＥ ＰＣＲ接合部のＤＮＡ配列決定並びに形質移入細胞の免疫ブロット分析 により検証した（図８）。 Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ： この構築体は、ｍｕｔＲＲＥ−Ａの代わりにｍｕｔＲＲＥ−Ｂ合成遺伝子セグ メントを用いることによりｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを 除いて、ＩＶＢに類似する。 Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ： この構築体は、ＡｖｒＩＩ及びＳｒｆＩ制限酵素消化、次いでｇｐ３２に対応 するが翻訳に最適なコドンを含んでなる合成ＤＮＡセグメント（下記ｇｐ３２ ｏｐｔを参照）のライゲーションにより、ＩＶＢから誘導した。得られた産生物 をライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定及び免疫ブロット分析により検証した 。 Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ： この構築体は、ＩＶＣを初期プラスミドとして用いることに よりｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いて、ＴＶＤに類似 する。 Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ＳＲＶ−１ ３’−ＵＴＲ： この構築体は、シミアンレトロウイルス（ＳＲＶ−１、下記参照）から誘導さ れた３’−ＵＴＲがｇｐ１４３オープンリーディングフレームのすぐ３’側に導 入されたＳｒｆＩ制限酵素部位に挿入されたことを除いて、ＩＶＡに類似する。 このＵＴＲ配列は、ＨＩＶ ｅｎｖ及びｇａｇのｒｅｖ非依存性発現を容易にす るものとして前に記述されている。 Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ａ： この構築体はＩＶＤに基づくものであり、Ｃ５及びｇｐ３２について完全に最 適化されたコドンセグメントを有し、ｔＰＡリーダーに続くｇｐ１２０のアミノ 末端のＣ１がさらなる最適化コドン配列（下記参照）で置換されている。この新 たなＣ１セグメントは、接合Ｃ１／１４３セグメントを合成するための以下のＰ ＣＲ用オリゴマーを用いるＳＯＥ ＰＣＲにより、残りのｇｐ１４３セグメント に接合した：５’−ＣＣＴ ＧＴＧ ＴＧＴ ＧＡＧ ＴＴＴ ＡＡＡ Ｃ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＡＴ ＴＴＧ ＡＡ Ｇ ＡＡＴ ＧＡＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＡＣ−３’（配列番号２６）。得られる ｇｐ１４３遺伝子はＶ１−Ｖ５領域を除いて最適のコドンの使用を含み、他のＨ ＩＶ遺伝子に由来する可変領域を挿入するための独自ＰｍｅＩ制限酵素部位がＣ １及びＶ１の接合部に配置されている。 Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ｂ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＶＨに類似する。 Ｉ．Ｖ１Ｈｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐt ａｌｌ−Ａ： この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に最適コドンを含んでなる。その定常領域（ Ｃ１、Ｃ５、ｇｐ３２）は４Ｂ、Ｄ、Ｈに記述されるものであり、可変領域Ｖ１ −Ｖ５に対応するさらなる合成ＤＮＡセグメントが翻訳に最適なコドンを含んで なる合成ＤＮＡセグメントを用いて挿入されている。 Ｊ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＩ ＶＪに類似する。 Ｋ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ（非ＩＩＩＢ株）： この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上 記ＩＩＩＧに類似する。 Ｌ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ（非ＩＩＩＢ株）： この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上 記ＩＩＩＧに類似する。 実施例１０ ｇｐ１４３／ｇｌｙＢワクチン構築体 ： これらの構築体は、上述の他のｔＰＡ含有構築体（ｔＰＡ−ｇｐ１２０、ｔＰ Ａ−ｇｐ１４０、ｔＰＡ−ｇｐ１４３及びｔＰＡ−ｇｐ１６０）と同様に、本来 のリーダーの代わりにｔｐＡリーダーを用いてＰＣＲによって調製したが、ｇｐ １４３と同様にＣＯＯＨ末端化膜結合ｅｎｖを産生するように設計した。しかし ながら、ｇｐ１４３／ｇｌｙＢ構築体は、６個のアミノ酸が細胞内ペプチドドメ インを含むように計画され、最後の４ 個がヒトグリコホリンＢ（ｇｌｙＢ）タンパク質のカルボキシル末端のものと同 じである点でｇｐ１４３とは異なる（計画された細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂− ＮＲＬＩＫＡ−ＣＯＯＨ（配列番号２７）、ｇｌｙＢ並びにｅｎｖ及びｇｌｙＢ の両者に共通の“Ｒ”に対応する残基には下線が付されている）。この構築体は 、ｅｎｖの細胞内部分に対応するあらゆる転写体又はペプチド領域を完全に除去 することにより、さらなるｅｎｖ発現及び細胞表面への定方向ターゲティングを 獲得する目的で設計した。このｅｎｖの細胞内部分は、この領域を、短細胞質ド メイン（細胞内アミノ酸配列＝ＮＨ₂−ＲＲＬＩＫＡ−ＣＯＯＨ）を有する多量 に発現するタンパク質（ｇｌｙＢ）からのペプチド配列で置換することにより、 発現又はタンパク質安定性／細胞表面への輸送に負の衝撃を与え得る。上述のよ うに、ｇｐ１６０タンパク分解開裂部位が除去されているか、又は保持されてい るかに応じて２つの形態（Ａ又はＢ）で構築体を調製した。 Ａ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙＢ： この構築体は、ｇｐ１４３の細胞内ペプチドドメインを上述 のグリコホリンＢのものに置き換えるのに以下のアンチセンスＰＣＲオリゴマー を用いたことを除いてＩＶＤと同じである：５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＡＴ Ａ ＴＣ Ｇ ＣＣＣ ＧＧＧ Ｃ ＴＴＡ ＴＴＡ ＧＧＣ ＣＴＴ ＧＡＴ Ｃ ＡＧ ＣＣＧ ＧＴＴ ＣＡＣ ＡＡＴ ＧＧＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＧＣ−３ ’（配列番号２８）。 Ｂ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙＢ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶ Ａに類似する。 Ｃ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙＢ： この構築体は、ｇｐ１２０の第１定常領域（Ｃ１）がＩＶＨと同様に翻訳に最 適なコドンで置き換えられていることを除いてＶＡと同じである。 Ｄ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙＢ ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶ Ｃに類似する。 Ｅ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ： この構築体のｅｎｖ遺伝子は完全に上述の最適コドンを含んでなる。 Ｆ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶ Ｅに類似する。 Ｇ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ（非ＩＩ ＩＢ株） ： この構築体は、ＩＩＩＢ以外の株に由来するｅｎｖアミノ酸配列が可変（Ｖ１ −Ｖ５）領域全体にわたる最適コドン用法の決定に用いられたことを除いて、上 記ＩＩＩＧに類似する。 Ｈ．Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ（非ＩＩ ＩＢ株） ： この構築体は、ｅｎｖタンパク分解開裂部位が保持されていることを除いてＶ Ｇに類似する。様々なループの欠失を伴うＨＩＶ ｅｎｖワクチン構築体 ： これらの構築体は上に記載される全てのｅｎｖ形態（ｇｐ １２０、ｇｐ１４０、ｇｐ１４３、ｇｐ１６０、ｇｐ１４３／ｇｌｙＢ）を含み 得るが、調製の間にｇｐ１２０内の様々なループ（例えば、Ｖ１、Ｖ２、及び／ 又はＶ３）が欠失している。これらの改変の目的は、ＣＤ４結合部位のような保 存された中和エピトープの露出を滞らせ得るペプチドセグメントを除去すること である。例えば、Ｖ１／Ｖ２欠失を創出してＣ１及びＣ２セグメントの接合を生 成させるため、ＰＣＲ反応において以下のオリゴマーが用いられる：５’−ＣＴ Ｇ ＡＣＣ ＣＣＣ ＣＴＧ ＴＧＴ ＧＴＧ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＧ Ｔ ＴＧＴ ＡＡＣ ＡＣＣ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＡＣＡ ＣＡＧ−３’ （配列番号２９）。 実施例１１ ｅｎｖ遺伝子の発現を増大させるための合成遺伝子セグメントの設計 ： 遺伝子セグメントを、同一の翻訳された配列（注記される場合を除く）を有し つつ“アミノ酸配列データから推定される合成オリゴヌクレオチドプローブ：理 論的及び実際的な考慮（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ Ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉ ｃａｌ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）”と題するＪ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ ．１８３巻，１−１２頁（１９８５年）からの研究論文においてＲ．Ｌａｔｈｅ によって定義される代替コドン用法を伴う配列に変換した。ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝 子セグメントのｒｅｖ非依存性発現を増大させるための下記方法論は、哺乳動物 細胞におけるこの遺伝子の効率的な発現の公知の不可能性が転写体組成物全体の 影響であるという我々の仮説に基づいた。したがって、同じタンパク質配列をコ ードする代替コドンを用いることにより、ｒｅｖが存在しない状況におけるｅｎ ｖ発現に対する束縛を除去することができる。ｅｎｖ内でのコドン用法を精査す ることにより、コドンの高い割合が高度に発現するヒト遺伝子によってはほとん ど用いられることがないもののうちにあることが明らかになった。用いられる特 別なコドン置換法は、Ｌａｔｈｅらからのデータを用いて、以下のように記述す ることができる。 １．適性オープンリーディングフレームについてコドンの配置を同定する。 ２．野生型のコドンを、観察されたヒト遺伝子による使用頻 度と比較する（Ｌａｔｈｅらの表３を参照）。 ３．コドンが最も一般的に用いられるものではない場合には、表５のデータに 基づいて、それを高発現に最適なコドンに置き換える。 ４．新たなコドンの第３ヌクレオチド及び第１のもののすぐ３’側に隣接する コドンの第１ヌクレオチドを検査する。新たなコドンの選択により５’−ＣＧ− ３’対形成が生じている場合には、それを表５に指示される選択に置き換える。 ５．この手順を全遺伝子セグメントが置換されるまで繰り返す。 ６．新たな遺伝子配列を、これらのコドン置換によって生じる望ましくない配 列（例えば、“ＡＴＴＴＡ”配列、イントロンスプライス認識部位の不注意によ る創出、望ましくない制限酵素部位等）について検査し、これらの配列を除去す るコドンを代わりに用いる。 ７．合成遺伝子セグメントを組み立て、発現の改善について試験する。 これらの方法を、完全に発現に最適なコドン用法を含んでなる遺伝子を創出す る、以下のＨＩＶ ｅｎｖの合成遺伝子セグ メントを創出するために用いた：それぞれ、５６／１９、７３／２６、７８／２ ８、及び６１／２５のコドン置換／ヌクレオチド置換の割合が各々のセグメント について得られている、（ｉ）ｇｐ１２０−Ｃ１（ｏｐｔ）；（ｉｉ）Ｖ１−Ｖ ５（ｏｐｔ）；（ｉｉｉ）ＲＲＥ−Ａ／Ｂ（ｍｕｔ又はｏｐｔ）；及び（ｉｖ） ｇｐ３０（ｏｐｔ）。これらのセグメントの各々は上に詳細に記述されており、 以下に記載される実際の配列を有する。 ｇｐ１２０−Ｃ１ （ｏｐｔ） これは、発現に最適なコドン用法を有するように設計された、成熟Ｎ−末端か らＶ１の初めまでのｇ１２０定常領域１（Ｃ１）遺伝子である。 ＭＮ Ｖ１−Ｖ５ （ｏｐｔ） これは、発現に最適のコドン用法を有する、ＨＩＶ ＭＮ Ｖ１−Ｖ５の誘導 タンパク質配列（１０６６ＢＰ）に対応する遺伝子セグメントである。 ＲＲＥ．Ｍｕｔ （Ａ） これは、発現に最適なコドン用法を含んでなる、ＨＩＶ−１のｒｅｖ応答性要 素（ＲＲＥ）に対応するＤＮＡセグメントである。“Ａ”形態は、ボールド体で 示されるヌクレオチドを用いることにより、ｇｐ１２０／ｇｐ４１接合部の既知 タンパク分解開裂部位も除去している。 ＲＲＥ．Ｍｕｔ （Ｂ） これは、発現に最適なコドン用法を含んでなる、ＨＩＶ−１のｒｅｖ応答性要 素（ＲＲＥ）に対応するＤＮＡセグメントである。“Ｂ”形態はｇｐ１２０／ｇ ｐ４１接合部の既知タンパク分解開裂部位を保持する。 ｇｐ３２ （ｏｐｔ） これは、発現に最適なコドンを含んでなる、（ＲＲＥの末端に接して開始する ）ＡｖｒＩＩ部位からｇｐ１４３の末端までのｇｐ３２遺伝子セグメントである 。 ＳＲＶ−１ ＣＴＥ （Ａ） これは、シミアンレトロウイルス−１ゲノムに由来する３’−ＵＴＲに対応す る合成遺伝子セグメントである。このＤＮＡは、ｒｅｖ非依存性発現を増大させ るため、以下の方向で、ＨＩＶ遺伝子の３’−末端に配置される。 ＳＲＶ−１ ＣＴＥ （Ｂ） この合成遺伝子セグメントは、ＡＴＴＴＡ配列の除去に１つのヌクレオチド突 然変異（ボールド体で示される）を用いたことを除いて、上に示されるＳＲＶ− １ ＣＴＥ（Ａ）と同一である。この配列は、増加されたｍＲＮＡターンオーバ ーを伴っている。 実施例１１ イン・ビトロでのｇｐ１２０ワクチンの発現 ： これらの構築体について、形質移入ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞において、イ ン・ビトロ発現を試験した。形質移入ＲＤ細胞から分泌されるｔＰＡ−ｇｐ１２ ０を定量することにより、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターが分泌ｇｐ １２０を産生することが示された。イン・ビボｇｐ１２０ワクチン接種 ： Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MNＰＮＶが誘発するクラスＩＩ ＭＨＣによ って制限されるＴリンパ球ｇｐ１２０特異的抗原反応性 ２００μｇのＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１２０_MNを２回ワクチン接種している Ｂａｌｂ／ｃマウスを犠牲にし、組換えｇｐ １２０に対するヘルパ−Ｔリンパ球の反応性をイン・ビトロ測定するためそれら の脾臓を抽出した。Ｔ細胞増殖検定を、ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）と共に、組 換えｇｐ１２０μ_IIIB（レプリゲン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）、カタログ＃ＲＰ１０ １６−２０）を５μｇ／ｍｌで用いて、４×１０⁵細胞／ｍｌで行った。これら の細胞による³Ｈ−チミジン取り込みの基礎レベルを、２μｇ／ｍｌでのＣｏｎ Ａ刺激を用いて最大増殖を誘発しながら、これらの細胞を培地単独で培養するこ とにより得た。ＣｏｎＡ誘発反応性は〜３日でピークになり、その時点で培地対 照試料と共に収集し、これに対して、抗原処理試料は５日目にさらなる培地対照 と共に収集した。ワクチン接種マウスの応答性を、未処置の年齢が一致する同系 マウスと比較した。ＣｏｎＡ陽性対照は、予想通り、未処置及び免疫マウスの両 者で非常に高い増殖を示した。非常に強いヘルパーＴ細胞記憶応答性がｇｐ１２ ０処理によりワクチン接種マウスにおいて得られ、これに対して未処置のマウス は応答しなかった（非活性の閾値は＞３−４の刺激指数（ＳＩ）である；ＳＩは 試料ｃｐｍ／培地ｃｐｍの比として算出する）。ワクチン接種マウスについて６ ５及び１４のＳＩが得られ、これは、それぞれ、これらのマウスに ついての５６４３及び１１，９００の抗−ｇｐ１２０ＥＬＩＳＡ力値に匹敵する 。興味深いことに、これら２匹のマウスについて、抗体についてより応答が大き いものはより低い抗体力値を有するものよりもＴ細胞反応性が非常に低かった。 この実験は、分泌されたｇｐ１２０ベクターがイン・ビボにおいてヘルパーＴ細 胞を効率的に活性化するだけではなく、強力な抗体応答を生成することを示す。 加えて、これらの免疫応答の各々を、接種ＰＮＶによってコードされるものと比 較して異種である抗原を用いて決定した（ＩＩＩＢ対ＭＮ）。 実施例１２ ｇｐ１６０ワクチン 分泌されるｇｐ１２０構築体に加えて、我々は完全長膜結合ｇｐ１６０の発現 構築体を調製している。ｇｐ１２０に加えてｇｐ１６０構築体の理論的根拠は、 （１）ＣＴＬ刺激、及び強力なＨＩＶ中和モノクローナル抗体（２Ｆ５、上記参 照）が指向するｇｐ４１を含む中和抗体産生の両者についてより多くのエピトー プが入手可能であること；（２）ウイルス産生ｇｐ１６０に関してより未変性の タンパク質構造を得ることが可能であること；及び（３）免疫原性のための膜結 合インフルエン ザＨＡ構築体の成功［Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９巻：１７４５−１ ７４９頁，１９９３年；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｄ．ら，ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌ．，１２巻：７７７−７８３頁，１９９３年］である。ｇｐ１６ ０は異種リーダーペプチド配列を有していてもかなりのｒｅｖ依存性を保持して おり、そのため、ｒｅｖが存在しない状況での発現を増大させるためさらなる構 築体を作製した。実施例１３ ＨＩＶ細胞毒性Ｔリンパ球の検定 ： この項に記述される方法は、ワクチン接種マウスに用いられる検定を説明する 。本質的に類似する検定を、各動物の標的細胞として自己Ｂ細胞系を確立しなけ ればならないことを除いて、霊長類で用いることができる。これは、ヒトについ てはエプスタイン・バーウイルスを用いて、アカゲザルについてはＢ型ヘルペス ウイルスを用いて達成することができる。 末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新たに採取された血液又は脾臓から、白血球 から赤血球を分離するのにフィコール−ヒパーク遠心を用いて誘導する。マウス については、リンパ節も用いることができる。エフェクターＣＴＬは、ＰＢＭＣ から、Ｉ Ｌ−２（２０Ｕ／ｍｌ）及びコンカナバリンＡ（２μｇ／ｍｌ）中で６−１２日 イン・ビトロ培養することにより、又は特異的抗原を用いることにより、同数の 照射抗原提示細胞を用いて調製することができる。特異的抗原は、用いられる動 物のＭＨＣハプロタイプのＣＴＬ認識のための既知エピトープである合成ペプチ ド（通常９−１５アミノ酸）、又は適切な抗原を発現するように加工されたワク チニアウイルス構築体であり得る。標的細胞は同系であっても、ＣＴＬのイン・ ビトロ刺激について記述される適切な抗原を提示するように処理されているＭＨ Ｃハプロタイプ一致細胞系であってもよい。Ｂａｌｂ／ｃマウスに対しては、Ｐ １８ペプチド（ＡｒｇＩｌｅＨｉｓＩｌｅＧｌｙＰｒｏＧｌｙＡｒｇＡｌａＰｈ ｅＴｙｒＴｈｒＴｈｒＬｙｓＡｓｎ［配列番号３７］、ＨＩＶ ＭＮ株用）を、 照射同系脾臓細胞を用いるイン・ビトロでのＣＴＬの再刺激に１０μＭの濃度で 用いることができ、かつ細胞毒性検定の間の標的細胞の増感に、１−１０μＭで 、この検定の前に３７℃年で約２時間インキュベートすることにより用いること ができる。これらのＨ−２^dＭＨＣハプロタイプマウスに対しては、ネズミ肥満 細胞腫細胞系Ｐ８１５が良好な標的細胞をもたらす。標的を３７℃ で１−２時間インキュベートし（〜５×１０⁶細胞について０．２ｍＣｉ）、次 いで標的細胞を数回洗浄することにより、抗原−増感標的細胞にＮａ⁵¹ＣｒＯ₄ を結合させ、これはＣＴＬで殺したときに標的細胞の内部から放出される。ＣＴ Ｌ集団を標的細胞と、エフェクターの標的に対する様々な比、例えば、１００： １、５０：１、２５：１で混合し、共にペレット化して３７℃で４−６時間イン キュベートした後に上清を収集し、次いでこれを、ガンマカウンターを用いて放 射能の放出について検定する。細胞毒性を、標的細胞からの自発的放出が差し引 かれている、（０．２％トリトンＸ−１００処理を用いて得られる）標的細胞か ら放出され得る総カウントの割合として算出する。 実施例１４ ＨＩＶ特異的抗体の検定 ： 特異的組換えタンパク質又は合成ペプチドのいずれかを基質抗原として用いて 、ＨＩＶに対して産生された抗体を検出するようにＥＬＩＳＡを設計した。９６ ウェルマイクロタイタープレートを、４℃で一晩、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩 水）中に２μｇ／ｍｌの組換え抗原を５０μｌ／ウェル用いて、振動プラットホ ーム上で被覆した。抗原は組換えタンパク質（ｇｐ １２０、ｒｅｖ：レプリゲン社；ｇｐ１６０、ｇｐ４１：アメリカン・バイオ− テクノロジーズ社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ ｎｃ．））又は合成ペプチド（ＩＩＩＢに由来するウイルス単離体配列に対応す るＶ３ペプチド等：アメリカン・バイオ−テクノロジーズ社；モノクローナル抗 体２Ｆ５のｇｐ４１エピトープ）であった。プレートを洗浄バッファ（ＰＢＳ／ ０．０５％ツィーン２０）を用いて４回洗浄した後、室温で１時間、振動させな がら２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファ（ＰＢＳ／０．０５％ツィーン ２０中１％のカーネーション（Ｃａｒ−ｎａｔｉｏｎ）ミルク溶液）を添加した 。プレ血清及び免疫血清をブロッキングバッファに所望の希釈範囲で希釈し、ウ ェル当たり１００μｌを加えた。プレートを室温で１時間、振動させながらイン キュベートした後、洗浄バッファで４回洗浄した。次に、ブロッキングバッファ で１：２０００に希釈した、セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合させた二次 抗体（抗−アカゲザルＩｇ、サザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Ｓｏ ｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；抗−マウ ス及び抗−ウサギＩｇ、ジャクソン・イムノ・リサーチ（Ｊａｃｋｓ ｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））を１００μｌ／ウェルで各試料に添 加し、振動させながら室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッフ ァで４回洗浄した後、１００ｍＭクエン酸バッファ、ｐＨ４．５中１ｍｇ／ｍｌ のｏ−フェニレンジアミン（ｏ−ＰＤ、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ））１００μｌ／ウェルを添加することにより発色させた。プレートを、４５０ ｎｍでの吸収について、動力学的（反応の最初の１０分）並びに１０及び３０分 終末点の両者で読み取った（サーモマックス（Ｔｈｅｒｍｏ−ｍａｘ）マイクロ タイターリーダー、モレキュラー・デバイスイズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖ ｉｃｅｓ））。 実施例１５ ＨＩＶ中和抗体の検定 ： ワクチン接種動物から誘導した血清を用いる、ＨＩＶ単離体のイン・ビトロ中 和の検定を以下の通りに行った。試験血清及び免疫前血清を、使用前に、５６℃ で６０分間熱不活性化した。滴定した量のＨＩＶ−１を試験血清の１：２連続希 釈液に添加し、室温で６０分間インキュベートした後、９６ウェルマイクロタイ ター中の１０⁵ＭＴ−４ヒトリンパ球に添加した。この ウイルス／細胞混合物を３７℃で７日間インキュベートし、培養物をテトラゾリ ウム染料で染色することによりウイルスが介在する細胞の死滅について検定した 。ウイルスの中和は、ウイルスが介在する細胞の死の防止により観察される。 実施例１６ 臨床的ＨＩＶ単離体からの遺伝子の単離 ： ＨＩＶウイルス遺伝子を、ＣｏｎＡ処理により活性化している感染ＰＢＭＣか らクローン化した。ウイルス遺伝子を得るための好ましい方法は、所望の遺伝子 に隣接する特定のオリゴマーを用いる感染細胞ゲノムからのＰＣＲ増幅によるも のであった。ウイルス遺伝子を得るための第２の方法は、感染細胞の上清からウ イルスＲＮＡを精製し、この物質から引き続くＰＣＲでｃＤＮＡを調製すること によるものであった。この方法は、用いられるＰＣＲオリゴマー及び特定の初回 刺激オリゴマーではなくｃＤＮＡを作製するのに用いられるランダム６量休を除 いて、ネズミＢ７遺伝子のクローン化について上に記述されるものに非常に類似 する。 ゲノムＤＮＡを、感染細胞ペレットから、プロテイナーゼＫ及びＳＤＳをそれ ぞれ０．１ｍｇ／ｍｌ及び０．５％の最終濃 度まで添加したＳＴＥ用液（１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）中で溶解することにより精製した。この混合物 を５６℃で一晩インキュベートし、０．５容量のフェノール：クロロホルム：イ ソアミルアルコール（２５：２４：１）で抽出した。次いで、最終濃度０．３Ｍ までの酢酸ナトリウム及び２容量の冷エタノールを添加することにより水相を沈 殿させた。溶液からＤＮＡをペレット化した後、そのＤＮＡを０．１×ＴＥ用液 （１×ＴＥ＝１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸 濁させた。この時点で、２ＵのＲＮＡ分解酵素Ａと共にＳＤＳを０．１％まで添 加し、３７℃で３０分間インキュベートした。この溶液をフェノール／クロロホ ルム／イソアミルアルコールで抽出した後、前と同様にエタノールで沈殿させた 。ＤＮＡを０．１×ＴＥに懸濁させ、その２６０ｎｍでの紫外吸収を測定するこ とにより定量した。ＰＣＲに用いるまで、試料を−２０℃で保存した。 パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）キ ット及びｇｐ１６０用の下記センス及びアンチセンスオリゴマーを用いる手順を 用いて、ＰＣＲを行った：そ れぞれ、５’−ＧＡ ＡＡＧ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＧＡ ＣＡＧ ＴＧＧ ＣＡ Ａ ＴＧＡ−３’（配列番号３８）及び５’−ＧＧＧ ＣＴＴ ＴＧＣ ＴＡＡ ＡＴＧ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ＣＣＣ ＧＧＧ ＣＡＴＧ ＴＧ Ｇ−３’(配列番号３９)。これらのオリゴマーは得られるＤＮＡ断片の３’−末 端にＳｒｆＩ部位を追加する。ＰＣＲ誘導セグメントをＶ１Ｊｎｓ又はＶ１Ｒワ クチン接種ベクターのいずれかにクローン化し、ライゲーション接合部位に加え てＶ３領域をＤＮＡ配列決定により確認した。 実施例１７ Ｔ細胞増殖検定 ： ＰＢＭＣを得、ＰＢＭＣ集団内での増殖によって決定される特異的抗原に対す る記憶復活応答について試験する。増殖を、細胞培養物に添加した³Ｈ−チミジ ンを用いて、収集前のインキュベーションの最後の１８−２４時間監視する。細 胞収集装置は増殖が生じている場合アイソタイプ含有ＤＮＡをフィルター上に留 め、これに対して、静止状態の細胞はアイソタイプを取り込まず、これは遊離形 態でフィルター上に留まることがない。げっ歯類又は霊長類のいずれかの種につ いて、４×１０⁵ 個の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート内の合計２００μｌの完全培 地（ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎児血清）に塗布する。バックグランド増殖応答はＰ ＢＭＣ及び培地単独で決定し、これに対して、植物性血球凝集素（ＰＨＡ）又は コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）のようなレクチンを１−５μｇ／ｍｌの濃度で用 いて非特異的応答を生成させ、陽性対照として機能させる。特異的抗原は既知ペ プチドエピトープ、精製タンパク質、又は不活性化ウイルスのいずれかからなる 。抗原濃度は、ペプチドについては１−１０μＭ、タンパク質については１−１ ０μｇ／ｍｌの範囲である。レクチン誘発増殖は細胞培養インキュベーションの 第３−５日にピークとなり、これに対して、抗原特異的応答は第５−７日にピー クとなる。培地のバックグランドを少なくとも３倍上回る放射カウントが得られ た場合に特異的増殖が生じ、これは、しばしば、バックグランドに対する割合、 又は刺激指数（ＳＩ）として得られる。ＨＩＶ ｇｐ１６０は、ｇｐ１６０／ｇ ｐ１２０免疫化又はＨＩＶ感染個体のＴ細胞増殖を引き起こすことが知られる幾 つかのペプチドを含むことが知られている。これらのうち最も一般的に用いられ るものは：Ｔ１（ＬｙｓＧｌｎＩｌｅＩｌｅＡｓｎＭｅｔＴｒ ｐＧｌｎＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｙｓＡｌａＭｅｔＴｙｒＡｌａ［配列番号４０］ ）；Ｔ２（ＨｉｓＧｌｕＡｓｐＴｌｅＩｌｅＳｅｒＬｅｕＴｒｐＡｓｐＧｌｎＳ ｅｒＬｅｕＬｙｓ［配列番号４１］）；及びＴＨ４（ＡｓｐＡｒｇＶａｌＩｌｅ ＧｌｕＶａｌＶａｌＧｌｎＧｌｙＡｌａＴｙｒＡｒｇＡｌａＩｌｅＡｒｇ［配列 番号４２］）である。これらのペプチドは、抗原感作マウス、非ヒト霊長類、及 びヒトに由来するＰＢＭＣの増殖を刺激することが示されている。 実施例１８ ベクターＶＩＲの調製 ： 我々の基本的ワクチン接種ベクターの最適化を継続する努力において、我々は Ｖ１Ｊｎｓの誘導体を調製し、それをＶ１Ｒと命名した。このベクターの構築の 目的は、最適化された異種遺伝子発現特性の全て及びＶ１Ｊ及びＶ１Ｊｎｓがも たらす高いプラスミド収率を依然として保持する最小サイズのベクターワクチン 、すなわち不必要なＤＮＡ配列を含まないもの、を得ることである。我々は、文 献からはもちろんのこと実験によっても、（１）大腸菌複製起点を含むｐＵＣ主 鎖内の領域を細菌からのプラスミド収率に影響を及ぼすことなく除去することが 可能であり；（２）細菌のターミネーターが代わりに挿入されている場合には、 カナマイシンオープンリーディングフレームに続くｋａｎ^r遺伝子の３’領域が 除去可能であり；かつ（３）ＢＧＨの３’側半分の〜３００ｂｐが（ＢＧＨ要素 内の元来のＫｐｎＩ制限酵素部位に続く）その調節機能に影響を及ぼすことなく 除去することが可能であることを決定した。 それぞれ、ＣＭＶｉｎｔＡプロモーター／ＢＨＧターミネーター、複製起点、 及びカナマイシン耐性を表す３つのＤＮＡセグメントをＶ１Ｊｎｓから合成する ためにＰＣＲを用いることにより、Ｖ１Ｒを構築した。各セグメントに独自の制 限酵素をＰＣＲオリゴマーを用いて各セグメント末端に追加した：ＣＭＶｉｎｔ Ａ／ＢＨＧについてはＳｓｐＩ及びＸｈｏＩ；ｋａｎ^r遺伝子についてはＥｃｏ ＲＶ及びＢａｍＨＩ；及びｏｒｉ^rについてはＢｃｌＩ及びＳａｌＩ。これらの 酵素部位は、それらが、ＰＣＲ誘導ＤＮＡセグメントの各々の方向性ライゲーシ ョン及び各々の部位の引き続く喪失を可能にするため選択された：ＥｃｏＲＶ及 びＳｓｐＩはライゲーションに適合する平滑末端化ＤＮＡを残し、これに対して 、ＢａｍＨＩ及びＢｃｌＩはＳａｌＩ及びＸｈｏＩと同様の相補的突出を残す。 これらの セグメントをＰＣＲにより得た後、各セグメントを上に指示される適切な制限酵 素で消化し、次いで、３つのＤＮＡ全てを含む単一の反応混合物中で共にライゲ ートした。ｏｒｉｒの５’末端は、それがカナマイシン耐性遺伝子に終止情報を もたらすことができるように、この領域に通常見出されるＴ２ ｒｈｏ非依存性 ターミネーター配列を含むように設計した。ライゲートした産生物を、制限酵素 消化（＞８酵素）はもちろんのことライゲーション接合部のＤＮＡ配列決定によ っても確認した。ＤＮＡプラスミドの収量及びＶ１Ｒ内のウイルス遺伝子を用い る異種発現はＶ１Ｊｎｓに類似するように思われる。達成されたベクターサイズ の正味の減少は１３４６ｂｐであった（Ｖ１Ｊｎｓ＝４．８６ｋｂ；Ｖ１Ｒ＝３ ．５２ｋｂ）、［本明細書の配列番号４３；図１１及びＷＯ９５／２４４８５号 の配列番号１００も参照；ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／／０２６３３号］ 。 Ｖ１Ｒの合成に用いられたＰＣＲオリゴマー配列（制限酵素部位には下線が付 され、配列に続く括弧内に同定されている）： （１）５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＧ ＣＴＡ ＴＴＧ ＧＣＣ ＡＴＴ ＧＣＡ ＴＡＣ Ｇ−３’［Ｓｓｐ Ｉ］、（配列番号４４）： （２）５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＡ ＣＣＧ ＧＧＴ ＣＡ Ａ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＧＣ ＡＣＣ−３’［ＸｈｏＩ］、（配列番号４５）： （ＣＭＶｉｎｔＡ／ＢＨＧセグメント用） （３）５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＧＡＴ ＡＴＣ ＧＧＡ ＡＡＧ ＣＣＡ ＣＧ Ｔ ＴＧＴ ＧＴＣ ＴＣＡ ＡＡＡ ＴＣ−３’［ＥｃｏＲＶ］、（配列番号 ４６）： （４）５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ Ｇ ＴＡＡ ＴＧＣ ＴＣＴ ＧＣＣ ＡＧＴ ＧＴＴ ＡＣＡ ＡＣＣ−３’［ＢａｍＨＩ］、（配列番号４ ７）： （カナマイシン耐性遺伝子セグメント用） （５）５’−ＧＧＴ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＣＡ ＣＧＴ ＡＧＡ ＡＡＡ ＧＡ Ｔ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＧ−３’［ＢｃｌＩ］、（配列番号 ４８）： （６）５’−ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＴＣ ＧＡＣ ＣＣ ＧＴＡ ＡＡＡ ＡＧＧ ＣＣＧ ＣＧＴ ＴＧＣ ＴＧＧ−３’［ＳａｌＩ］、（配列番号４９）： （大脳菌複製起点用） Ｖ１Ｒについて、以下のオリゴマーを用いてライゲーション接合部を配列決定 した： ５’−ＧＡＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＡＡ ＡＴＧ ＴＡＣ−３’（配列番号５ ０）：［ＣＭＶｉｎｔＡ／ｋａｎ^r接合部］ ５’−ＣＡＡ ＴＡＧ ＣＡＧ ＧＣＡ ＴＧＣ−３’（配列番号５１）：［ ＢＧＨ／ｏｒｉ接合部］ ５’−Ｇ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＡＣ−３’（配列番号５２） ：［ｏｒｉ／ｋａｎ^r接合部］ 実施例１９ ＨＩＶ後期遺伝子産生物の異種発現 ｅｎｖ及びｇａｇのようなＨＩＶ構造遺伝子は、完全長タンパク質を効率的に 産生するため、ＨＩＶ調節遺伝子ｒｅｖの発現を必要とする。我々は、ｇａｇの ｒｅｖ依存性発現によっては低水準のタンパク質しか生じず、かつｒｅｖそれ自 体が細胞にとって毒性であり得ることを見出している。我々はイン・ビトロで比 較的高い水準のｇ１６０のｒｅｖ依存性発現を達成したが、このワクチンは、ｒ ｅｖ／ｇｐ１６０ ＤＮＡでのイン・ビボ免疫化の後、ｇｐ１６０に対する抗体 を低水準でしか誘発しない。これは、ｒｅｖの既知の細胞毒性効果に加えて、数 百 の核を有する筋小管においてｒｅｖ機能を得ることの困難性の増加（ｇａｇ又は ｅｎｖタンパク質の発現が生じるには、ｒｅｖタンパク質がｒｅｖ依存性転写体 と同じ核内にあることが必要である）の結果生じる可能性がある。しかしながら 、ｅｎｖ遺伝子の選択された改変を用いてｒｅｖ依存性発現を得ることが可能で ある。 １．ｅｎｖのｒｅｖ非依存性発現： 一般に、我々のワクチンは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーター、ＢＧＨ誘導 ポリアデニル化及び転写終止配列、並びにｐＵＣ主鎖を含んでなる我々の一般化 されたワクチン接種ベクターＶ１Ｊｎｓ内での発現を最適化するため、主として ＨＩＶ（ＩＩＩＢ）ｅｎｖ及びｇａｇ遺伝子を用いている。いかに大きな遺伝子 セグメントが用いられるかに依存して（例えば、ｇｐ１２０対ｇｐ１６０）、ｒ ｅｖ依存性発現の効率を変化させることは、ｅｎｖについて、その本来の分泌リ ーダーペプチドを組織特異的プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）遺伝子のも のと置換し、ＣＭＶイントロンＡを有するＣＭＶＩＥプロモーターの後ろの得ら れたキメラ遺伝子を発現させることにより達成することができる。ｔＰＡ−ｇｐ １２０がこの方式で構築 された分泌ｇｐ１２０ベクターの例であり、これはワクチン接種マウス及びサル において抗−ｇｐ１２０免疫応答を誘発するのに十分作用する。 膜固定化タンパク質が、分泌されたタンパク質と比較して、より多量の（及び 、おそらくは、ＨＩＶ中和に対してより特異的な）抗体応答を誘発し得、加えて さらなるエピトープを獲得するという報告のため、Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１ ６０及びＶ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｇｐ１６０を調製した。ｔＰＡ−ｇｐ１６０ベク ターは、発現の水準はｒｅｖ／ｇｐ１６０、ｒｅｖ依存性ｇｐ１６０発現プラス ミドで得られるものよりも非常に低いものの、形質移入細胞の免疫ブロット分析 によって示されるように、ｒｅｖを添加することなく、検出可能な量のｇｐ１６ ０及びｇｐ１２０を産生した。これは、おそらく、ｇｐ１６０転写体にｒｅｖ依 存性を付与する阻害領域がｇｐ４１のＣＯＯＨ−末端を含むｇｐ１６０内の複数 の部位に生じるためである。ｔＰＡ−ｇｐ１６０のＣＯＯＨ−末端が切りつめら れた形態（ｔＰＡ−ｇｐ１４３）についてベクターを調製した。これは、これら の阻害配列を除去することによりｅｎｖの発現水準全体が増大するように設計さ れた。また、このｇｐ１４３ ベクターは、細胞表面ではなくリソソームへの膜タンパク質の転換を生じること が知られるペプチドモチーフ（例えば、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ）を含む細胞内ｇｐ４１ 領域も取り除く。したがって、ｇｐ１４３は、（ｒｅｖ依存性を低下させること により）ｅｎｖタンパク質の発現を増大させ、かつ完全長ｇｐ１６０と比較して 細胞表面へのタンパク質の輸送効率を高めることが期待され、これらのタンパク 質がＤＮＡワクチン接種の後の抗−ｇｐ１６０抗体のより高い誘発が予想される 。ｔＰＡ−ｇｐ１４３を、発現のさらなる阻害配列を除去するためのｒｅｖ応答 性要素（ＲＲＥ）配列（３５０ｂｐ）のさらなるサイレント突然変異により、さ らに改変した。この構築体ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥは２つの形態：ｇｐ１２０ ／４１のタンパク分解開裂部位の除去（形態Ａ）又は保持（形態Ｂ）のいずれか で調製した。両形態は、ワクチニアにおいて発現した開裂不可能なｇｐ１６０を 用いるマウスのワクチン接種が開裂可能な形態よりも非常に高い水準でｇｐ１６ ０に対する抗体を誘発したという文献報告のために調製した。 細胞形質移入体におけるｇｐ１６０／ｇｐ１２０の発現用の定量的ＥＬＩＳＡ を、これらのベクターの相対的発現可能性を 決定するために開発した。２９３細胞のイン・ビトロ形質移入、続いて細胞会合 対分泌／放出ｇｐ１２０の定量を行うことにより、以下の結果を得た：（１）ｔ ＰＡ−ｇｐ１６０は、細胞内対細胞表面からの放出で同様の特性を保持しつつ、 ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも５−１０倍少ないｇｐ１２０を発現した；（２）ｔＰ Ａ−ｇｐ１４３は、低水準の細胞会合ｇｐ１４３で、ｒｅｖ／ｇｐ１６０よりも ３−６倍多くｇｐ１２０を分泌し、これによりｇｐ１６０の細胞質のテールがこ の配列を部分的に欠失させることにより解決することができるｇｐ１６０の細胞 内滞留を引き起こすことが確認される；及び（３）ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔ ＲＲＥ Ａ及びＢは、形態Ａについてタンパク分解処理の除去が確認されたもの の、親のｔＰＡ−ｇｐ１４３よりも〜１０倍高いタンパク質の発現水準をもたら した。 このように、我々のｒｅｖ非依存性発現を増加させる方策は、発現水準全体の 段階的な増加と共に、膜固定化ｇｐ１４３のリソソームから細胞表面への再方向 付けをも生じている。これが遺伝的構築体であり、この構築体には、異なるウイ ルス株の間に幾つかの抗原性の相違が存在する場合、様々な一次ウイルス単離体 から誘導されるｇｐ１２０配列を、ＮＨ₂−末端（ｔＰ Ａリーダー）又はＣＯＯＨ−末端（ｇｐ４１）のいずれかにこれらの改変を含む ベクターカセット内に挿入することが可能であるはずであることに注意すること が重要である。 図２−７は、ｇｐ１４３ベースの構築体、好ましくはｔＰＡ−ｇｐ１４３ベー スの構築体を含むがこれに限定されるものではない様々な構築体の、ＨＩＶ感染 に対するＤＮＡワクチンとしての使用を支持するデータを示す。図２は、ｔＰＡ −１４３（ｏｐｔ４１）がＧＭＴ＝１０³の範囲で抗−ｇｐ１２０抗体応答を誘 発することを示す。図３では、ｇｐ１４３ベースの構築体を含む幾つかのＤＮＡ ワクチンについて抗−ｇｐ１２０抗体の力価が測定され、比較されている。図４ は、ｔＰＡ−ｇｐ１６０構築体と比較した、ｔＰＡ−ｇｐ１４３及びｔＰＡ−１ ４３／ｍｕｔＲＲＥの相対的な発現を示す。図５では、ｔＰＡ−ｇｐ１４３構築 体のｏｐｔＡ及びｏｐｔＢ形態の両方について抗−ｇｐ１２０抗体の産生が測定 されている。図６は、ネズミのＤＮＡワクチン接種に続くＨＩＶ株に対する中和 抗体の産生を促進する、ｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＡ及びｔＰＡ−ｇｐ１４３ −ｏｐｔＢを含む幾つかのＤＮＡワクチンの能力を示す。図７も、ｔＰＡ−ｇｐ １４３−ｏｐｔＡ、ｔＰＡ−ｇｐ １４３−ｏｐｔＢ、ｔＰＡ−ｇｐ１４３−ｏｐｔＡ−ｇｌｙＢ及びｔＰＡ−ｇｐ １４３−ｏｐｔＢ−ｇｌｙＢを含む様々なＤＮＡワクチン構築体のＨＩＶ中和デ ータを示す。 ２．臨床的単離体から誘導されるｇｐ１２０の発現： これらの発現方策をワクチン用途に関連するウイルスに適用し、我々のアプロ ーチの普遍性を確認するため、我々は一次ＨＩＶ単離体（ノースアメリカンコン センサスＶ３ペプチドループ；マクロファージ向性及び非融合細胞誘発性表現型 を含む）から誘導されるｔＰＡ−ｇｐ１２０ベクターをも調製した。このベクタ ーは形質移入２９３細胞でｇｐ１２０の高い発現／分泌をもたらし、かつマウス において抗−ｇｐ１２０抗体を誘発し、したがって、それが機能的形態でクロー ン化されていたことを示す。主要単離体ｇｐ１６０遺伝子も実験室株から誘導さ れるｇｐ１６０と同じ方法での発現に用いられる。 ３．ＨＩＶ ｅｎｖポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答 マウスにおいて免疫応答に対するワクチン接種経路の効果：ｇｐ１６０の発現 を改善しようとする努力は継続中であるが、我々は免疫応答及びそれらを増強す る方法の評価にｔＰＡ−ｇｐ １２０ＤＮＡ構築体を用いている。筋肉内（ｉ．ｍ．）及び皮内（ｉ．ｄ．）ワ クチン接種経路を、このベクターについて、１００、１０、及び１μｇの用量で マウスにおいて比較した。いずれの経路によるワクチン接種も、３種類全ての用 量水準での２−３回のワクチン接種の後に、抗体応答（ＧＭＴ＝１０³−１０⁴） を誘発した。各々の経路は、類似の抗−ｇｐ１２０抗体力値を明確な用量依存性 応答を伴って誘発した。しかしながら、我々はｉ．ｄ．ワクチン接種について、 特に最初の接種後のより低い用量で、より大きな応答の可変性を観察した。さら に、抗原特異的イン・ビトロ増殖及びサイトカイン分泌によって測定されるヘル パーＴ細胞応答は、ｉ．ｄよりもｉ．ｍ．ワクチン接種の後により高かった。我 々は、このワクチンについては、ｉ．ｍ．と比較して、ｉ．ｄ．ワクチン接種は いかなる利点をももたらさないものと結論づけた。 ４．マウスにおけるｇｐ１２０ＤＮＡワクチン媒介ヘルパーＴ細胞免疫： ｇｐ１２０ＤＮＡワクチン接種は、Ｔ_H−１様サイトカイン分泌プロフィール （すなわち、ＩＬ−４をほとんど、もしくは全く伴わないｇ−インターフェロン 及びＩＬ−２産生）を有す る試験した全てのリンパ性区画（牌臓、血液、鼠径部、腸間膜及び腸骨節）にお いて強力なヘルパーＴ細胞応答を生じた。これらのサイトカインは一般に強力な 細胞性免疫を促進し、ＨＩＶ血清陽性患者の疾患がない状態の維持に関連付けら れている。リンパ節は、ウイルスが血液中に未だ検出することができないときで さえ、ウイルスの大貯蔵部を有する、ＨＩＶ複製の主要部位であることが示され ている。我々のＤＮＡワクチンで示されているような、様々なリンパ部位に抗− ＨＩＶ免疫応答を誘発することが可能なワクチンは、最初の感染の後のリンパ管 のコロニー形成の成功を妨げる手助けをし得る。 ５．ｅｎｖ ＤＮＡワクチン媒介抗体応答： ｇｐ１２０ＤＮＡワクチンを接種したミドリザル（ＡＧＭ）及びアカゲザル（ ＲＨＭ）は２−３回のワクチン接種の後低水準の中和抗体しか示さず、これは追 加ワクチン接種では増加させることができなかった。これらの結果は、オリゴマ ーｇｐ１６０がおそらくはｇｐ１２０単量体よりも中和抗体の誘発に関連する標 的抗原であるというＨＩＶワクチン分野での認識の増加と共に、ｇｐ１６０ベー スのベクター（上記参照）の有効な発現の獲得に焦点を当てることに我々を導い ている。また、 マウス及びＡＧＭに主要単離体誘導ｔＰＡ−ｇｐ１２０ワクチンをワクチン接種 した。これらの動物は５００−５０００の範囲の（相同性配列を用いる）抗−Ｖ ３ペプチド逆最終点抗体力価を示し、これは、このワクチンの設計が臨床的に関 連するウイルス単離体に対して機能的であることを示す。 ｇｐ１６０ベースのワクチン、ｒｅｖ−ｇｐ１６０及びｔＰＡ−ｇｐ１６０は マウス及び非ヒト霊長類において一貫して抗体応答を誘発することに失敗し、又 は低い抗体力値しか生じない。ｔＰＡ−ｇｐ１４３プラスミドを用いた我々の最 初の結果は、２回のワクチン接種の後、マウス及びＡＧＭにおいて＞１０³の幾 何平均力価（ＧＭＴ）を生じた。これらのデータは、我々が、発現水準の増加及 び細胞表面へのｅｎｖのより効率的な細胞内輸送によりｇｐ１６０様ワクチンの 免疫原性を大きく改善していることを示す。この構築体を、ｔＰＡ−ｇｐ１４３ ／ｍｕｔＲＲＥ Ａ及びＢベクターに加えて、抗体応答、特にウイルスの中和に ついて特徴付けを続ける。 ６．サルにおけるｅｎｖ ＤＮＡワクチン介在ＣＴＬ応答： 我々は、ｇｐ１２０及びｇｐ１６０／ＩＲＥＳ／ｒｅｖ ＤＮＡをワクチン接 種したＲＨＭのＣＴＬ応答の特徴付けを継続 した。このワクチンを接種された４頭のサルは全て、２回のワクチン接種の後に 、有意のＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬ活性を示した（エフェクター／標的＝２０で の２０−３５％の特異的キル活性）。第４のワクチン接種の後、これらの活性は 同じ試験条件下で５０−６０％キル活性に増加し、これは、追加のワクチン接種 が応答を大幅に引き上げたことを示す。このＣＴＬ活性は最後のワクチン接種の 後少なくとも７ヶ月間それらのピーク水準の約５０％で持続し、これは、長期間 の記憶が確立されていることを示す。 実施例２０ ＳＩＶ／ＨＩＶ（ＳＨＩＶ）キメラ ： 候補ＨＩＶ−１ワクチンの防御効力を試験する上で主な障害は、このウイルス に適切な動物ウイルス投与モデルを欠くことである。ＨＩＶに密接に関連するシ ミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）がアカゲザルに感染してＡＴＤＳを引き起こ すものの、ＨＩＶ−１ウイルス単離体に感染し得る唯一の動物種はチンパンジー である。しかしながら、この感染から得られるウイルス血症は低水準で、一過性 で、かつ病原性効果（例えば、リンパ球減少症、免疫不全関連日和見感染等）を 示さない。近年、 ＳＩＶ及びＨＩＶゲノムを含んでなるハイブリッドウイルスが開発され、これら はアカゲザルに対しても感染性であり、かつ感染関連ＡＩＤＳを引き起こし得る 。この型のウイルスの例はＳＨＩＶ−４（ＩＩＩＢ）である（Ｌｉら，Ｊ．ｏｆ Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ，Ｖｏｌ．５，６３９−６４６（１９９２年））。このウイルスは、調節遺伝子 ｔａｔ及びｒｅｖ、並びに構造遺伝子ｅｎｖを除くＳＩＶ（ＭＡＣ２３９）ゲノ ムを含む。候補ＨＩＶワクチンの原則的な成分はｅｎｖに基づくため、このウイ ルスは、ヒトの臨床的な目的で開発されたワクチンを動物モデルにおける感染に 対する防御効力について試験することを可能にする。 実施例２１ プラスミドＤＮＡ及び組換えタンパク質組み合わせワクチン ： プラスミドＤＮＡ ＨＩＶ ｅｎｖ成分及び組換えＨＩＶ ｅｎｖタンパク質 成分の両者を有するワクチンを、アカゲザルにおいて抗体応答を誘発するそれら の能力について試験した。図９及び図１０は、それぞれ、ＨＩＶ ｅｎｖ遺伝子 含有ＤＮＡワクチン及び（適切なアジュバント中に配合された）組換え タンパク質をアカゲザルにワクチン接種した後に得られる抗−ｇｐ１２０ＥＬＩ ＳＡ抗体及びＳＨＩＶ−４（ＩＩＩＢ）ウイルス中和抗体力値を示す。これらの サルは、高力値のｅｎｖ特異的抗体及び中和抗体を産生した。遺伝子及び卵白ア ルブミンを含まない“ブランク”ＤＮＡをワクチン接種した対照サルは検出可能 ないかなるｅｎｖ特異的応答をも示さず、これに対して、このワクチンのタンパ ク質成分のみをワクチン接種したサルはＥＬＩＳＡによって検出される低水準の 抗原特異的抗体は示したが中和抗体は示さなかった。これらのサルにＳＨＩＶ− ４（ＩＩＩＢ）ウイルス投与した場合、全ての対照及びタンパク質のみのサルは 感染し、これに対して、ｅｎｖ ＤＮＡ及びタンパタ質の両者が接種されたもの は検出可能なＳＨＩＶウイルス血症を示さなかった。これらのサルは、現在、可 能性のある感染の遅延開始について周期的に試験を行っている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/06 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ 5/10 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ９６１４９４２．２ (32)優先日 平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９６１４９４３．０ (32)優先日 平成８年７月16日(1996．7．16) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｇ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ダビース，メリー・エレン アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 フリード，ダニエル・シー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 リウ，マーガレツト・エー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126 (72)発明者 ペリー，ヘレン・シー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカー ン・アベニユー・126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ペプチド又はタンパタ質をコードするＤＮＡ配列を含み、該ＤＮＡ配列が 非同種宿主における発現に最適化されたコドンを含む合成ポリヌクレオチド。 ２． 前記タンパク質がＨＩＶタンパク質である請求項１記載の合成ポリヌクレ オチド。 ３． 前記ＤＮＡ配列がＨＩＶ ｅｎｖタンパク質又はそれらの断片をコードし 、該ＤＮＡ配列が哺乳動物宿主における発現に最適化されたコドンを含む請求項 １記載の合成ポリヌクレオチド。 ４． Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＴＶ_MNｇｐ１２０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ＨＩＶ_IIIBｇｐ１２０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ／ＳＲＶ−１ ３’ −ＵＴＲ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ／ＳＲＶ−１ ３’ −ＵＴＲ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ３０−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔｐＡ−ｇＰ１４０／ｏｐｔ３０−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｒｅｖ／ｅｎｖ：； Ｖ１Ｊｎｓ−ｇｐ１６０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ４１−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１６０／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｍｕｔＲＲＥ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ＳＲＶ−１ ３’−ＵＴＲ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ａ／ｇｌｙ Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔＣ１／ｏｐｔ３２−Ｂ／ｇｌｙ Ｂ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ： Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ａ／ｇｌｙＢ； Ｖ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ−ｇｐ１４３／ｏｐｔ ａｌｌ−Ｂ ／ｇｌｙＢ；及びそれらの組み合わせから選択される請求項３記載のポリペプチ ド。 ５． ヒト組織を含むイン・ビボ脊椎動物組織に導入した際に抗−ＨＩＶ中和抗 体、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫応答、又は防御免疫応答を誘発し、該ポリヌクレオ チドかＨＩＶ ｇａｇ、ＨＩＶプロテアーゼ及びそれらの組み合わせをコードす る遺伝子を含む請求項２記載のポリヌクレオチド。 ６． 脊椎動物においてＨＩＶエピトープに対する免疫応答を誘発するための方 法であって、脊椎動物の組織に１ｎｇないし１００ｍｇの請求項２記載のポリヌ タレオチドを導人することを包含する方法。 ７． ｒｅｖ非依存性ＨＩＶ遺伝子をイン・ビボで免疫応答を誘発するのに用い るための方法であって、 ａ）ｒｅｖ非依存性ＨＩＶ遺伝子を合成し； ｂ）該合成された遺伝子を、該遺伝子が制御配列に作動的に連結されているこ とによって発現可能であるように調節配列に連結し、ここで該制御配列は、生き ている組織に導入された場合、該遺伝子の転写開始及び引き続く翻訳を導く、 ことを包含する方法。 ８． ＨＩＶの毒性株によって引き起こされる感染又は疾患に対して免疫応答を 誘発するための方法であって、脊椎動物の組織に請求項２記載のポリヌクレオチ ドを導入することを包含する方法。 ９． ＨＩＶ感染に対する免疫応答を誘発するためのワクチンであって、請求項 ２記載のポリヌクレオチド及び薬学的に許容し得る担体を含むワクチン。 １０． 霊長類において抗−ＨＩＶ免疫応答を誘発するための方法であって、該 霊長類の組織に請求項２記載のポリヌクレオチドを導入し、かつ同時に、インタ ーロイキン１２、ＧＭ−ＣＳＦ、又はそれらの組み合わせを非経口投与すること を包含する方法。 １１． 抗原提示細胞を誘発して細胞毒性及びヘルパーＴ細胞の増殖並びにＨＩ Ｖ抗原に特異的なリンホカインの分泌を含むエフェクター機能を刺激する方法で あって、脊椎動物の細胞をイン・ビボで請求項２記載のポリヌクレオチドに晒す ことを包含する方法。 １２． ＨＩＶ ｅｎｖ又はそれらの断片をコードするＤＮＡのｒｅｖ非依存性 イン・ビボ発現を増大させる方法であって、 （ａ）適切なオープンリーディングフレームのコドンの配置を特定し； （ｂ）野生型のコドンを、観察されたヒト遺伝子による使用頻度について比較 し； （ｃ）野生型コドンを、ヒト遺伝子の高い発現に最適化されたコドンで置換し ；及び （ｄ）改善された発現について試験する、 ことを包含する方法。 １３． 請求項２記載のポリヌクレオチドを含む、ＨＩＶ感染に対する免疫応答 を誘発するためのワクチンであって、該ポリヌクレオチドがカナリポックス、ワ クチニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、リ ステリア、赤痢菌、特異的リガンド、ＢＣＧ、又はサルモネラ菌によって送達さ れるワクチン。 １４． ＨＩＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項２記載のポリ ヌクレオチドの投与及び弱毒化ＨＩＶ、殺したＨＩＶ、ＨＩＶタンパク質、ＨＩ Ｖタンパク質の断片、又はそれらの組み合わせの投与を包含し、該ポリヌクレオ チドの投与が弱毒化ＨＩＶ、殺したＨＩＶ、ＨＩＶタンパク質、ＨＩＶ タンパク質の断片、又はそれらの組み合わせの投与の前、又はそれと同時、又は それに続く方法。 １５． ＨＩＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項２記載のポリ ヌクレオチドをアジュバントと共に投与することを包含する方法。 １６． ＨＩＶ感染の治療方法であって、請求項２記載のポリヌクレオチドを患 者に投与し、かつ抗−ＨＩＶ化合物を患者に投与することを包含し、該ポリヌク レオチドの投与が該抗−ＨＩＶ化合物の投与の前、又はそれと同時、又はそれに 続く方法。 １７． 非同種宿主における遺伝子の発現を増大させる方法であって、 ａ）野生型遺伝子のコドンを非同種宿主が好むコドンと比較し； ｂ）野生型遺伝子のコドンを、非同種宿主が好むＤＮＡ配列を有する新たなコ ドンで置換し； ｃ）新たなコドンの第３ヌクレオチド及び該第１のコドンのすぐ３’側に隣接 する新たなコドンの第１ヌクレオチドを検査し、新たなコドンの選択により５’ −ＣＧ−３’対形成が創出されている場合にはそれを置換し； ｄ）望ましくない配列を除去して合成最適化遺伝子を得；及び ｅ）該合成遺伝子を非同種宿主に挿入する、 ことを包含する方法。 １８． 宿主においてペプチドを発現させる方法であって、請求項１記載の合成 ポリヌクレオチドを該宿主に投与することを包含する方法。 １９． 宿主による組換えタンパク質の産生を増大させる方法であって、 ａ）宿主細胞を請求項１記載の合成ポリヌクレオチドで形質転換して形質転換 宿主を産生し；及び ｂ）該形質転換宿主を該合成ポリヌクレオチドの発現及び該組換えタンパク質 の産生を許容する条件下で培養する、 ことを包含する方法。