JP2001501606A - 細胞表面の活性化と阻害の方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＴＩＭＰ−２として知られているマトリックス金属プロテアーゼのインヒビターと酵素ゼラチナーゼ−Ａ（ＧｅｌＡ）との相互作用が関与する、細胞表面活性化と阻害の方法が開示される。本発明の方法に決定的に重要なことは、酵素のＣ末端ドメイン（ＧｅｌＡ−ＣＴＤ）の表面上のユニークなＴＩＭＰ−２結合部位の発見であり、これはＡｓｐ⁶⁵⁶であることが測定されたが、またＧｅｌＡ−ＣＴＤドメインの他の残基（すなわち、Ｇｌｙ⁶⁵¹、Ｐｈｅ⁶⁵⁰、およびＴｙｒ⁶³⁶）を含んでもよく、これらと共にＡｓｐ⁶⁵⁶は隣接表面を形成する。この結合部位の同定により、ＭＭＰインヒビターのスクリーニングのため、およびＭＭＰが関係する疾患の予後と治療のための、有用な標的が提供される。ＭＭＰインヒビターの候補である化合物は、細胞表面活性化を競合的に阻害するように構築することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞表面の活性化と阻害の方法 発明の分野と目的 本発明は、細胞表面活性化と阻害のための方法に関する。さらに詳しくは本発 明は、ＴＩＭＰ−２として知られているマトリックス金属プロテアーゼのインヒ ビターと酵素ゼラチナーゼ−Ａとの相互作用が関与する、細胞表面活性化と阻害 の方法に関する。 マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）は、ヒトの疾患や成長に遍在してい る。ある量の組織修復や損傷に関係する多くのプロセスは、例えば、慢性関節リ ウマチまたは変形性関節症、および再狭窄における内皮壁のリモデリングで起き るIV型コラーゲンの分解のように、ＭＭＰにより影響を受けると考えられている 。ＭＭＰはまた、原発性腫瘍形成、転移、および大きな腫瘍の血管新生（脈管形 成）のような癌の種々の側面に関わっている。また、ＭＭＰは、不活性な腫瘍壊 死因子（ＴＮＦ）前駆体の活性なＴＮＦへの変換（次にこれが、慢性関節リウマ チ、クローン病、多発性硬化症、悪液質および敗血症に関わる）にも関与するこ とが知られている。 したがって、潜在的薬剤としてのＭＭＰインヒビターのスクリーニングは、医 学および薬剤学の分野において非常に有用である。 ＭＭＰは、チモーゲンとして咄乳動物細胞により分泌され、そして活性化され るとコラーゲンとプロテオグリカンのタンパク質分解による組織リモデリングを 開始する。分泌されたプロ酵素の活性化と、その特異的なインヒビターであるＴ ＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２との相互作用は、細胞外スペースにおける正味の 酵素活性を決定する。 ＴＩＭＰ−２は、ゼラチナーゼ−Ａ（ＧｅｌＡ）のプロフォームとの特異的複 合体を形成するが、ここには、この酵素のＣ末端ドメイン（ＧｅｌＡ−ＣＴＤ） との相互作用が介在する。７２kDa ＧｅｌＡのアミノ酸配列は、ゴールドバー グ（Goldberg）の米国特許第４，９２３，８１８号に開示されており、そしてＴ ＩＭＰ−２とのその複合体は、ゴールドバーグ（Goldberg）の公開ヨーロッパ特 許出願、ＥＰ４０４，７５０に開示されている。ＧｅｌＡは、触媒性ドメイン、 ３つのII型フィブロネクチン様反復、およびＣ末端ドメインを含む多ドメインタ ンパク質である。 可溶性ＧｅｌＡプロ酵素は、細胞表面に集められ、そこで膜結合金属プロテア ーゼであるＭＴ１−ＭＭＰにより特異的に活性化される。細胞表面へのＧｅｌＡ の結合およびこれに続く活性化にもまた、ＧｅｌＡ−ＣＴＤが介在する。したが って、細胞表面活性化は、外から加えた過剰のＴＩＭＰ−２または組換えＧｅｌ Ａ−ＣＴＤの存在下で阻害される。 ＴＩＭＰ−２との複合体により阻害されるＭＴ１−ＭＭＰが、どのようにして ＧｅｌＡプロペプチドを切断してプロ酵素の活性化を開始することができるのか 、以前には知られていない。この問題の解明は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤが細胞表面上 でＴＩＭＰ−２およびＭＴＩ−ＭＭＰと相互作用する機作を理解するためには決 定的に重要である。 発明の背景 （注：以下の背景情報および当業者には周知の従来試験法や実験操作、および本 明細書で使用される他のそのような最先端技術に関する参照文献は、括弧に示し 、本明細書の最後に添付する。） 分泌された金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）高 分子の分解により組織リモデリングを開始する（１〜３に総説）。形態形成、組 織修復、および脈管形成のような正常な生理学的プロセスは、これらの酵素の活 性の空間的および時間的調節に依存しているが、悪性細胞は、これらの同じプロ テアーゼを利用して侵襲および転移を促進する（４〜７）。細胞外スペースにお けるＭＭＰ活性の調節を決定する機作を明確に理解するという目標は、まだ達成 されていない。ＭＴ１−ＭＭＰ／ＧｅｌＡ系（８〜１６）は、可溶性ＭＭＰ、Ｇ ｅｌＡ（１７）の活性が、その細胞表面（ここでＧｅｌＡプロ酵素は、その活性 型へと変換される）に集められて空間的に制御される機作を最初に提供するもの である。ＭＴ１−ＭＭＰによるＣｏｓｌ細胞のトランスフェクションは、充分に 細胞表面へのＧｅｌＡ結合および活性化を引き起こしうる（８、１９）。Ｇｅ ｌＡの細胞表面活性化は、そのプロペプチドの２工程のタンパク質分解プロセシ ングを伴う。Ａｓｎ³⁷−Ｌｅｕペプチド結合の最初の切断は、膜結合金属プロテ アーゼであるＭＴ１−ＭＭＰ（９）に依存する。Ｃ末端ドメインのない端を切っ た型のＧｅｌＡプロ酵素が、膜結合ＭＴ１−ＭＭＰによって活性化しえないため 、この切断はまた、完全なＣ末端ドメインを有するＧｅｌＡに依存する（１３） 。その結果外から加えた組換えＧｅｌＡ−ＣＴＤは、Ａｓｎ³⁷−Ｌｅｕ切断の競 合的インヒビターである（９、１０）。最後にこの反応は、過剰のインヒビター ＴＩＭＰ−２の存在下で阻害されるが、ＴＩＭＰ−１は作用がない。結果として のプロペプチドの切断は、自己タンパク質分解性のＭＴ１−ＭＭＰ非依存性機作 により達成されて（９、１０、１８、１９）、アミノ末端残基Ｔｙｒ⁸¹を有する ６２kDaの活性なＧｅｌＡが生成する。これらのデータは、そのＣＴＤを介する 細胞表面へのＧｅｌＡの結合が、酵素活性化にとって必要不可欠なものであるこ とを証明する。我々は、２つの密接に関連のあるプロ酵素であるＧｅｌＡおよび Ｂが、それぞれＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１との特異的な複合体を形成する ことを以前に証明した（２０）。これらの複合体はまた、プロ酵素のカルボキシ ル末端ドメインとのインヒビター相互作用によっても形成される（２１、２２） 。すなわちＴＩＭＰ−２とＧｅｌＡ−ＣＴＤの細胞表面の結合活性は、相互に関 係しているようである。我々は、親和性クロマトグラフィー法を用いてＭＴ１− ＭＭＰの活性化型を精製し（９）、そしてこれが、Ｋｄ＝１．６５×１０^-9Ｍで 細胞表面ＴＩＭＰ−２受容体として作用することを証明した。次にＭＴ１−ＭＭ Ｐ−ＴＩＭＰ−２複合体は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤに対する受容体として作用する（ Ｋｄ＝０．４２×１０^-9Ｍ）。我々が示したデータは、ＧｅｌＡ−ＣＴＤの細胞 表面結合が、プロ−ＧｅｌＡの活性化を促進する活性化ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭ Ｐ−２／プロ−ＧｅｌＡの三分子複合体の形成により生じるという仮説を支持す る。しかしこのモデルは、以下の理由によりＧｅｌＡの活性化機作を充分に解明 するものではない。インヒビターＴＩＭＰ−２は、２つのドメインからなる。ア ミノ末端である阻害ドメインは、ＭＭＰの活性中心と相互作用して、阻害複合体 を形成する（２３、２４）。Ｃ末端ドメインは、ＧｅｌＡ−ＣＴＤに結合する。 すなわちＴＩＭＰ−２と活性化ＭＴＩ−ＭＭＰとの阻害複合体は、このインヒビ ターのＣ末端ドメインを露出させ、ＧｅｌＡ−ＣＴＤとの相互作用に対して利用 可能にさせる。実際に我々は、ＧｅｌＢ、ＴＩＭＰ−１および活性化間質コラゲ ナーゼの間の類似した三分子複合体を報告しており（２２）、ここで複合体のコ ラゲナーゼ成分は阻害された。さらにＴＩＭＰ−２によるＭＴ１−ＭＭＰの可溶 化型の特異的な阻害も最近証明されている（２５、２６）。すなわち、ＭＴ１− ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２／プロ−ＧｅｌＡ複合体の組立を必要とする細胞表面Ｇｅ ｌＡ活性化のモデルは、ＴＩＭＰ−２により阻害されるＭＴ１−ＭＭＰが、どの ようにＡｓｎ³⁷−Ｌｅｕペプチド結合を切断してプロ酵素の活性化を開始するこ とができるのかという質問には答えないままである。この質問への答えには、Ｇ ｅｌＡ−ＣＴＤが細胞表面上のＴＩＭＰ−２およびＭＴ１−ＭＭＰと相互作用す る機作の一層の理解が必要である。我々は最近ＧｅｌＡ−ＣＴＤの高解像度結晶 構造を報告した（２７）。ここで我々は、溶媒暴露ＧｅｌＡ−ＣＴＤアミノ酸残 基の広範な大量アラニン走査突然変異誘発の結果を報告し、そしてＧｅｌＡ−Ｃ ＴＤ構造の座標を用いてこのドメインの表面上のＴＩＭＰ−２結合部位を定義す る。関連するＭＭＰ構造における同じ領域に対するＴＩＭＰ−２結合部位の比較 により、我々は、一般的ＴＩＭＰ結合およびＴＩＭＰ−２−ＧｅｌＡ−ＣＴＤ相 互作用の特異性に必要な構造的特徴を解析する。我々はまた、野生型のものに対 する、ＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体のＧｅｌＡ活性化阻害活性の分析を報告する。 発明の簡単な説明 本発明により、組織修復と損傷を伴う疾患、およびＭＭＰが関わる他の疾患の 治療に有用な可能性のあるＭＭＰインヒビターのスクリーニングに有用な、細胞 表面活性化および阻害の方法が提供される。 本発明の方法に決定的に重要なものは、ＧｅｌＡ−ＣＴＤドメイン表面上のＴ ＩＭＰ−２結合部位のユニークな部分の発見であり、これは、非常に強力に結合 する残基Ａｓｐ⁶⁵⁶であることが本明細書において決定された。この決定的に重 要なＴＩＭＰ−２結合部位はまた、Ａｓｐ⁶⁵⁶が共に隣接表面を形成するＧｅｌ Ａ−ＣＴＤドメイン中の他の残基、すなわちあまり強力でなく結合する残基Ｇｌ ｙ⁶⁵¹、Ｐｈｅ⁶⁵⁰、およびＴｙｒ⁶³⁶を含んでもよい。 本発明の別の実施態様では、ＴＩＭＰ−２結合部位は、前記の４つの残基と、 これに加えて非常に強力に結合する残基Ａｓｐ⁶¹⁵、Ｌｙｓ⁶⁴⁶、Ｌｙｓ⁵⁷⁶、Ｔ ｒｐ⁵⁷⁴、およびＡｒｇ⁵⁹⁰、およびあまり強力でなく結合する残基Ｌｙｓ⁵⁷⁹、 Ｌｙｓ⁶⁰⁴、およびＡｓｎ⁶¹¹を含む。ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合に及 ぼすこれらの残基の作用は、突然変異誘発により確認されている。 点突然変異は、ＴＩＭＰ−２結合部位におけるこれらの残基で作成して、Ｇｅ ｌＡ−ＣＡＤへのＴＩＭＰ−２結合に強い影響を与える（例えば、結合を阻害す るかまたは遅延させる）ことが可能であり、その結果ユニークなスクリーニング 法を提供する。 このＴＩＭＰ−２結合部位の同定は、ＭＭＰインヒビターのスクリーニングの ための、およびＭＭＰが関わる疾患の予知と治療のための有用な標的を提供する 。細胞表面活性化を競合的に阻害するように構築される化合物は、ＭＭＰインヒ ビターの候補になりうる。 発明の詳細な説明 添付の図面と本発明の以下の説明は、本発明および好ましい実施態様をより詳 細にさらに説明するために提供される。 図面の簡単な説明 図の凡例 図１．ＴＩＭＰ−２と相互作用する残基を示すＧｅｌＡ−Ｃｔｄの空間充填モ デル（Ａ、３４）およびリボン図（Ｂ、３５）。Ａ）ＴＩＭＰ−２と直接相互作 用すると考えられる残基は、着色して名前を記載してある。突然変異してアラニ ンにした時ＴＩＭＰ−２結合が２〜１００倍の消失を示した残基はシアン色に着 色され、一方突然変異してアラニンにした時ＴＩＭＰ−２結合が１００倍以上の 消失を示した残基は暗青色に着色されている。ＴＢＳ−１およびＴＢＳ−２領域 は、それらの各領域を覆うマゼンタ色の点線の四角形により示される。Ｂ）Ｇｅ ｌＡ−Ｃｔｄのリボン図は、標準的β−プロペラ折り畳みを示す。ＧｅｌＡ−Ｃ ｔｄの各ブレードは、ローマ数字で示してある。Ｃａ２＋イオンは、対称の中心 軸に沿って赤色で示される。ブレードＩとIVをつなぐジスルフィド結合は、Ｎ− およびＣ−末端として示される。ＴＩＭＰ−２と直接相互作用すると考えられる 残基は、マゼンタ色で示されかつ名前を記載してある。全ての残基は、ブレー ドIII、ブレードIVまたはこの２つのブレードをつなぐループ上に位置する。 図２．ＴＩＭＰ−２へのＧｅｌＡ−Ｃｔｄ結合の競合測定法。１．７×１０^-9 Ｍの¹²⁵Ｉ−標識ＷＴ ＧｅｌＡ−Ｃｔｄ（１０⁸cpm/μｇ）および記載の濃度の 未標識精製組換えＷＴまたは変異体のＧｅｌＡ−Ｃｔｄを含有する１００μＬの 溶液を、マイクロタイタープレートのＴＩＭＰ−２（５０ng）でコーティングし たウェル中でインキュベートして、方法に記載したように洗浄した。結合放射活 性は、ガンマカウンターで個々のウェルを計数することにより求めた。バックグ ラウンドを差し引いた後、ウェルに保持されたＣＰＭを１．００に標準化して、 図に示されるように、野生型（◇、Ｋｉ／Ｋｄ＝１）または変異体Ｇｌｙ⁶⁵¹（ ×、Ｋｉ／Ｋｄ＝３）；Ｌｙｓ⁵⁷⁹（□、Ｋｉ／Ｋｄ＝６）；Ｌｙｓ⁶⁰⁴（△、Ｋ ｉ／Ｋｄ＝２５）；およびＡｓｐ⁶¹⁵（○、Ｋｉ／Ｋｄ＝３００）について未標 識の競合するＧｅｌＡ−Ｃｔｄの濃度に対してプロットした。野生型自己競合の 値は、８回の別々の実験の平均であり、エラーバーは、標準誤差を表す。変異体 の値は、２回の測定の平均である。コンピュータで作成した理論曲線をデータに 当てはめて、ＷＴについての見かけのＫｄおよび変異体についてのＫｉを、各実 線の曲線により図に示されるように当てはめから求めた。 図３．ＴＩＭＰ−２結合部位を示すＧｅｌＡ−Ｃｔｄの分子表面。ＧｅｌＡ− Ｃｔｄの分子表面は、ＧＲＡＳＰを使用して計算し表示した。ＴＩＭＰ−２結合 部位は、マゼンタ色に着色されている。黄色の記載は、いくつかのＴＩＭＰ−２ 結合残基、および表面に対するその位置を意味する。本明細書に記載される境界 の残基は、緑色で示されており、ＴＩＭＰ−２結合部位を取り囲むように見える 。 図４．ＧｅｌＡ−ＣｔｄとＣｌＩ−Ｃｔｄの分子表面および表面の静電位の比 較。（４Ａ）ＧｅｌＡ−Ｃｔｄと（４Ｂ）ＣｌＩ−Ｃｔｄ両方の分子表面を示す 。それぞれの静電位を計算して、正電位は青色で、そして負電位は赤色で示して 表示する。マゼンタ色の点線は、本文に記載される近似のＴＩＭＰ−２結合部位 に一致する。ＴＢＳ−１とＴＢＳ−２が示され、図１に記載された同じ領域に一 致する。ＧｅｌＡ−ＣｔｄのＴＢＳ−１領域は、多くの正の電位を表示している が、一方ＣｌＩ−Ｃｔｄははるかに正の電位が少なく、ＴＢＳ−１結合界面にわ たって相当量の負の電位を有する。両方の分子のＴＢＳ−２領域は、同様に異な る電 位を示す。両方の分子の分子表面は、これらが有意に差のあるファンデルワール ス接触表面を与えるであろうことを示唆する。 図５．ＭＭＰファミリーのメンバーのＣ末端ドメインからのβ−プロペラブレ ードIIIおよびIVの配列の整列。ＴＩＭＰ−２結合部位を規定する全ての残基を 含有するＧｅｌＡのアミノ酸配列を、他のＭＭＰと共に整列させた。ブレードII IまたはブレードIVに見い出される配列は、下線を付した領域の下にある。ＴＩ ＭＰ−２結合部位の一部であるＧｅｌＡ残基および他の酵素からの対応する残基 は、太字で示してある。ＴＢＳ−１領域を構成する残基（説明文を参照のこと） は、太字で下線を付したが、一方残りの残基は、ＴＢＳ−２の一部であり、単に 太字で示してある。（^*）は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合に及ぼすそ の作用が突然変異誘発により確認された残基を示す。 図６．ＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体によるＧｅｌＡの膜依存性活性化の阻害。１５ ngの精製ＧｅｌＡを、ＨＴ１０８０細胞からの２０μｇの原形質膜タンパク質と 共に、０．１mM ＣａＣｌ₂を含有する２５mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐ Ｈ７．５）中で、各パネルに示されるように、増大する濃度（１〜６）の組換え ＧｅｌＡ−ＣＴＤ ＷＴまたは変異体＃２８（Ａｓｐ⁵⁶⁹）、＃３１（Ｌｙｓ⁵⁷⁹ ）、＃３９（Ｌｙｓ⁶⁰⁴）、＃４１（Ａｓｐ⁶¹⁵）、＃２２９（Ａｓｐ⁵⁷⁶）、＃ ２３４（Ａｒｇ⁵⁹⁰）、＃２４７（Ｌｙｓ⁶⁴⁶）、＃２５０（Ｔｒｐ⁵⁷⁴）、＃２ ５２（Ｔｙｒ⁶³⁶）、＃２５５（Ｐｈｅ⁶⁵⁰）、＃２５７（Ｇｌｙ⁶⁵¹）、＃２５ ８（Ａｓｐ⁶⁵⁶）、＃２５９（Ａｓｎ⁶¹¹）の存在下で３７℃で２時間インキュベ ートした。活性化反応の結果は、すでに記載されたように酵素図（zymogram）で 分析した（９、１０）。生じる酵素図のイメージは、フラットベッドスキャナー を用いて得て、ネガに変換した。 図１Ａおよび図３の着色した領域は、白黒コピーでは以下のように示される： 図１Ａ−暗青色で示される残基は、Ａｓｐ⁶⁵⁶、Ａｓｐ⁶¹⁵、Ｌｙｓ⁶⁴⁶、Ｌｙ ｓ⁵⁷⁶、Ｔｒｐ⁵⁷⁴およびＡｒｇ⁵⁹⁰である。シアン色で示される残基は、Ｇｌｙ^{6 51} 、Ｐｈｅ⁶⁵⁰、Ｔｙｒ⁶³⁶、Ａｓｎ⁶¹¹、Ｌｙｓ⁵⁷⁹およびＬｙｓ⁶⁰⁴である。 図３−緑色の着色した領域に示される境界残基は、Ｌｙｓ⁶⁴⁹、Ｇｌｎ⁶⁴¹、 Ｌｙｓ⁵⁷⁸、Ｌｙｓ⁶³³、Ａｓｐ⁶⁰⁸およびＡｓｐ⁶¹⁸である。赤色のＴＩＭＰ−２ 結合部位は、残基Ａｓｐ⁶⁵⁶、Ｐｈｅ⁶⁵⁰、Ｔｙｒ⁶³⁶、Ａｓｐ⁶¹⁵、Ａｓｎ⁶¹¹、 Ｌｙｓ⁶⁴⁶、Ｌｙｓ⁵⁷⁶、Ｔｒｐ⁵⁷⁴およびＬｙｓ⁶⁰⁴を示す。 本発明をさらに例示するために、以下の詳細な例を実施したが、本発明が、こ れらの例または例に記載される細部に限定されると理解してはならない。 例 材料と方法 細胞培養 ＨＴ１０８０線維肉腫細胞を、４％ウシ胎児血清と２mMグルタミンを補足した ＲＰＭＩ１６４０培地中で、５％ＣＯ₂の存在下で単層培養で増殖させて、１２ −Ｏ−テトラデカノイル−ホルボールアセテート（ＴＰＡ）で処理した（５０ng /ml、１６時間）。ＨＴ１０８０細胞からの原形質膜の単離は、記載（９、１０ ）されるように不連続ショ糖勾配を用いて行った。 酵素精製 ＧｅｌＡ発現プラスミドｐ６Ｒ７２ｈｙｇを、ＥｌＡ発現ｐ２ＡＨＴ２ａ細胞 中にトランスフェクションして、記載（９、１０）されるように安定にトランス フェクションした細胞株ｐ２ＡＨＴ７２１２Ａの調整培地からＧｅｌＡを精製し た。 ＴＩＭＰ−２の発現と精製。組換えＴＩＭＰ−２を、ｐ６Ｒｈｙｇ発現ベクター 中のＴＩＭＰ−２ ｃＤＮＡでトランスフェクションしたｐ２ＡＨＴ２ａ細胞で 発現させて、リアクティブレッド（Reactive Red）−１２０−アガロース（シグ マ（Sigma）、Ｒ−０５３０３）、Ｑ−セファロース（ファルマシア（Pharmacia ）＃１７−０５１０−０１）、ＣＭ−セファロースＣＬ−６Ｂ（シグマ（Sigma ）＃ＣＣＬ−６Ｂ−１００）およびＲＰ−ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーを 用いて、すでに記載（９、１０）されたようにｐ２ＡＨＴ２ａＴ２細胞の無血清 調整培地から精製した。 ＦＬＡＧ ＧｅｌＡ−ＣＴＤ融合タンパク質の発現と精製。発現ベクターｐＦＬ ＡＧ７２ＣＴを、Ｌｅｕ⁴⁴⁴−Ｃｙｓ⁶⁶⁰をコードするＧｅｌＡ ｃＤＮＡ（１７ ）からの断片を大腸菌（E．coli）分泌ベクターｐＦｌａｇ１（アイビーアイ 社（IBI Inc.））中にクローニングすることにより作成した。融合タンパク質Ｆ ＬＡＧ−ＣＴをコードする生じるベクターは、大腸菌（E．coli）ＴＯＰＰ５宿 主（ストラタジェン（Stratagene））中にトランスフェクションした。すでに記 載（９、１０、２７）したようにリアクティブレッド−１２０−アガロース（シ グマ（Sigma）、Ｒ−０５０３）およびＭ１抗ｆｌａｇ抗体親和性カラムでのク ロマトグラフィーにより、タンパク質をペリプラズム画分から精製した。この方 法を用いて５０種の変異体および野生型ＧｅｌＡ ＣＴのそれぞれを精製した。 ＦＬＡＧ ＧｅｌＡ−ＣＴＤ融合タンパク質の突然変異誘発。発現ベクターｐＦ ＬＡＧ７２ＣＴは、ＰＣＲ介在性部位特異的突然変異誘発法を用いて直接突然変 異を起こした。１対の逆平行の３３塩基対長プライマーを各変異体について合成 した。所望の突然変異を含有するこれらのプライマーを、コード配列の両側に位 置する２つのプライマーのいずれかとの１対のＰＣＲ反応において使用した。生 じるＰＣＲ産物の両方とも突然変異を含んでいた。これらを混合し、融解してア ニーリングして、全コード配列を包含する部分的ヘテロ二本鎖を生成した。両側 に位置する両方のプライマーによりプライムされる第３のＰＣＲ反応において、 これを鋳型とした。生じるＰＣＲ産物のそれぞれは、ｐＦＬＡＧ７２ＣＴ発現ベ クターにクローニングして戻して、配列解析に付して突然変異の存在を確認した 。生じる全ての変異体タンパク質を精製して、以下に記載するようにＴＩＭＰ− ２結合について測定した。ＴＩＭＰ−２結合に負の作用を及ぼした変異体の配列 は、二次的なＰＣＲが起こした突然変異の出現を排除するために全コード領域の 配列決定により証明した。二次的突然変異が存在すれば、第２ラウンドのＰＣＲ か、または制限酵素介在性サブクローニングを用いるかのいずれかにより、目的 の変異体から分離した。 ＦＬＡＧ−ＧｅｌＡ−ＣＴＤ融合タンパク質のＴＩＭＰ−２結合 ＴＩＭＰ−２結合および競合測定法は、９６ウェルのモジュールプレート（mo dular plates）（コスター（Costar））で行った。５０ngの精製ＴＩＭＰ−２を 含有する１００μｌの充填緩衝液（２０mMトリスＨＣｌ、ｐＨ９）を各ウェルへ 添加して、ＴＩＭＰ−２をコーティングしたプレートを調製して、室温で１時間 インキュベートした。この溶液を２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ 中０．５％ＢＳＡおよび０．０２％ブリジ（Brij）、ｐＨ７．２）で置換して、 ４℃でＯＮインキュベートした。結合実験には、１００μｌの結合緩衝液（ＰＢ Ｓ中１mg/mlＢＳＡおよび０．０１％ブリジ）中の増大する濃度の競合コールド リガンドを、ＴＩＭＰ−２またはＢＳＡ（対照）でコーティングしたウェルに加 えて、３０分間インキュベートし、次に１０−６Ｍの¹²⁵Ｉ−ＧｅｌＡ−ＣＴＤ （６．５×１０⁷〜１×１０⁸dpm/μｇ）を加えた。１時間インキュベーションを 続けて、次に結合緩衝液でプレートを５回洗浄し、各ウェルを計数して保持され た放射活性を求めた。 ＧｅｌＡプロ酵素の活性化 １５〜５０ngのＧｅｌＡプロ酵素を、０．１mM ＣａＣｌ₂を含有する最終容 量１０μｌの２５mM ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ７．５）中で、原形質膜 （１〜４μｇの原形質膜タンパク質）による活性化のために使用した。反応物は 、３７℃で１２０分間インキュベートして、試料緩衝液を添加して反応を終わら せて、記載（９、１０）されるようにゼラチン酵素図分析に付した。 タンパク質構造解析 アラニンへ突然変異させるとＴＩＭＰ−２結合を消失させた残基は、ＴＩＭＰ −２と直接相互作用する可能性の高いものと、ＴＩＭＰ−２結合に及ぼすその作 用がそれぞれの変異体の環境の詳細な検討に基づく間接的な構造の変動の結果で ある可能性の高いものに分類した。ＴＩＭＰ−２と相互作用する残基のセットは 、ＧｅｌＡ−ＣＴＤの単一の隣接表面に限定されており、そしてこれは、２つの 近接する領域、ＴＢＳ１とＴＢＳ２に分類される。ＴＩＭＰ−２結合残基の近く にあるがアラニンへのその突然変異がＴＩＭＰ−２結合に作用を及ぼさない境界 残基を使用して、我々は、解析すると突然変異していない残基を含む分子表面と して、ＴＩＭＰ−２結合部位を規定することができた。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤと間質コラゲナーゼのＣ末端ドメイン（ＣｌＩ−Ｃｔｄ）を 、その各Ｃ_α原子に沿って整列させた。２つの構造は、３．７ÅのＣ_α位におけ る平均平方根二乗の差で整列させ、グラフィックスプログラムＯ（２８）を用い て視覚化した。モデル作成ソフトウェアのシビル（Sybyl）（バージョン６．２ 、トリポスアソシエーツ（Tripos Associates）、セントルイス、ミズーリ州） を 用いて、ＧｅｌＢ−ＣＴＤのモデルを作成した。ＧｅｌＡ−ＣＴＤ構造は、構造 の基本的鋳型を与え、Ｃ_α原子の座標は、配列同一性の領域で保存されていた。 これらの領域では、さらに側鎖のコンホメーションも保存されていた。配列同一 性のない領域では、Ｃ_α位は不変であったが、側鎖のコンホメーションは、回転 異性体ライブラリーセットから選択された。ＧｅｌＢ残基の挿入による立体的衝 突は、いずれかの隣接する原子（側鎖原子であろうと基本骨格原子であろうと） を移動するか、または置換残基のＣ_α位を移動することにより軽減させた。配列 中の残基の挿入または欠失を必要とする領域は、ループや湾曲部に沿ってのみ発 生したため、類似の配列を持ち、かつ近くの原子とファンデルワールス接触が最 も少ない湾曲部またはループを、ブルックヘブン（Brookhaven）タンパク質デー タバンクから選択することによりモデル化した。最後に、このモデルは、全構造 にわたってファンデルワールス接触を最少にすることにより完成した。最終的な ＧｅｌＢ−ＣＴＤモデルは、各Ｃ_α原子に沿ってＧｅｌＡ−ＣＴＤと整列させた 。 結果 ＧｅｌＡ−ＣＴＤ構造の説明 ＧｅｌＡ−ＣＴＤ座標は、低いＲ因子（１８．８％）および低い平均座標誤差 （＜０．２５Å）の高解像度結晶構造（解像度＝２．１５Å）に由来し（２７） 、そして基本骨格および側鎖原子の位置は充分に決定される。構造は、Ｌｅｕ^{46 1} 〜Ｃｙｓ⁶⁶⁰の間の全ての残基を含み、ここで位置があまり規定されない残基は Ｇｌｕ⁵²⁹とＧｌｕ⁵³⁰だけである。ＧｅｌＡ−ＣＴＤの全体構造は、４つのブレ ードのβ−プロペラとして説明することが最適である（図１）。４つの「ブレー ド」は、それぞれ逆平行β−シートの４つの鎖からなる。β−シートドメインは 、ねじれており、４つ目の最も外側の鎖は、最も内側の鎖と８０°近い角度を形 成している。各ブレードは、中央の偽の４重の軸に配置しており、軸の周りの９ ０°回転が、１つのブレードを別のブレードの上に位置づける。４つのブレード により形成される回転軸に平行なチャネルは、Ｃａ²⁺イオン、Ｎａ⁺Ｃｌ^-イオン 対および多くの安定に結合した水分子を含有する。各ブレードの最も内側の鎖は 、全て平行であり、Ｃａ²⁺イオンがチャネルのＮ末端から突き出している。４つ のブレードの間の領域は、このような広い界面にわたって相互に接触するの に充分大きい疎水性残基（主にＰｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ）からなる。連結ル ープが疎水性界面を横切っており、近接するブレードをつなぐ。ブレードIVは、 Ｃｙｓ⁴⁶⁹とＣｙｓ⁶⁶⁰の間のジスルフィド結合によりブレードＩに共有結合して いる。 アラニン走査突然変異誘発法によるＧｅｌＡ−ＣＴＤにおけるＴＩＭＰ−２結合 部位の同定 ＧｅｌＡ−ＣＴＤの溶媒暴露アミノ酸残基のアラニン走査突然変異誘発法を使 用して、ＴＩＭＰ−２と相互作用する分子表面を規定した。結果は、ＧｅｌＡ− ＣＴＤの結晶構造における各点突然変異の位置と環境を調べて解釈（図１、２７ ）され、その結果ＴＩＭＰ−２と直接相互作用することができるＧｅｌＡ−ＣＴ Ｄの残基だけが同定された。発現ベクターｐＦＬＡＧ７２ＣＴを、方法欄に記載 されるようにＰＣＲ介在性部位特異的突然変異誘発法を用いて、直接突然変異さ せた。得られる５０種全ての変異体タンパク質は、すでに記載（９、１９）され たように精製して、方法欄に記載されるようにＴＩＭＰ−２結合について測定し た。ＴＩＭＰ−２結合に負の作用を及ぼした変異体の配列は、二次的なＰＣＲが 起こす突然変異の出現を排除するために全コード領域の配列決定により証明した 。野生型（ＷＴ）ＧｅｌＡ−ＣＴＤに対する異なるＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体のＴ ＩＭＰ−２結合親和性を定量するために、我々は９６ウェルモジュールプレート 中でのＴＩＭＰ−２結合および競合測定法を開発した。結合実験のために、増大 する濃度の競合コールドリガンドを含有する１０^-9Ｍの¹²⁵Ｉ−ＧｅｌＡ−ＣＴ Ｄを、ＴＩＭＰ−２またはＢＳＡ（対照）でコーティングしたウェルに加えて、 方法欄に記載のように個々のウェルを計数して、保持された放射活性を求めた。 各変異体の見かけのＫｉは、競合測定法からのデータをコンピュータで作成した 一連の曲線に当てはめて求めた。こうして求めた見かけＫｉの２５％変動から、 明らかにデータをあまりよく表さない曲線が生成した。ＷＴ ＧｅｌＡ−ＣＴＤ および４つの変異体についてのこの解析結果の例を、図２に示す。図２に示す変 異体は、観察された変動範囲を例示するように選択した。ＴＩＭＰ−２結合に作 用した（Ｋｉ／Ｋｄ＞１）全ての変異体を表１に要約する。以下のアミノ酸残基 Ｌｙｓ⁴⁷⁰、Ａｒｇ⁴⁸²、Ａｒｇ⁴⁹¹、Ａｒｇ⁴⁹⁵、Ａｓｐ⁵⁰¹、Ｇｌｕ⁵¹⁵、 Ｇｌｕ⁵¹⁸、Ｌｙｓ⁵¹⁹、Ｇｌｕ⁵²⁹、Ｌｙｓ⁵³¹、Ｇｌｕ⁵³⁹、Ｇｌｕ⁵⁴⁹、Ａｒｇ⁵⁵⁰ 、Ａｓｐ⁵⁶⁴、Ａｒｇ⁵⁶⁷、Ｌｙｓ⁵⁷⁸、Ａｓｐ⁵⁸⁶、Ｌｙｓ⁵⁹⁶、Ａｓｐ⁶⁰⁸、 Ａｓｐ⁶¹⁸、Ｈｙｓ⁶²⁸、Ｌｙｓ⁶³³、Ｌｙｓ⁶³⁹、Ｇｌｕ⁶⁴¹、Ｌｙｓ⁶⁴⁹、Ｌｅｕ⁶³⁸ 、Ｇｌｎ⁶⁴³、およびＬｅｕ⁵⁴⁸の１つを、Ａｌａで置換すると、この測定法 においてＴＩＭＰ−２へのＧｅｌＡ−ＣＴＤの結合親和性（Ｋｄ＝Ｋｉ）に影響 しなかった。ＡｒｇによるＬｙｓ⁵¹⁹の、ＴｈｒによるＡｌａ⁴⁷⁹の、またはＡｒ ｇによるＬｅｕ⁵⁴⁸の単一置換も影響がなかった。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤへのＴＩＭＰ−２結合残基の局在化 結合の消失を示す全てのＧｅｌＡ−ＣＴＤの点変異体の中で、Ａｓｐ⁵⁶⁹のみ はＴＩＭＰ−２結合表面の一部であるとは考えられない。残りの変異体は全て、 図１のＴＩＭＰ−２結合表面−１（TIMP-2 Binding Surface-1）（ＴＢＳ−１） およびＴＩＭＰ−２結合表面−２（ＴＢＳ−２）として示されるＧｅｌＡ−ＣＴ Ｄの２つの近接する領域内にある。ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合部位は 、この広い結合部位に見られる異なる特徴の考察を進めるために、かつ関連タン パク質上のこれらの領域の比較を平易にするために、２つの領域に分類される。 結合部位を２つの領域に分類する物理的根拠はないが、我々はＴＩＭＰ−２結合 部位に見られる異なる特徴を考察するために分類する。ＴＢＳ−１は、ブレード IIIとIVの間に形成され、２つの近接するブレードの間に納まって、小さな疎水 性の空洞を形成する、大きな芳香族残基からなる非極性界面（Ｔｒｐ⁵⁷⁴に接触 する）を含む。ＴＢＳ−１のこの非極性部分を囲むのは、多くの正に荷電した残 基であり、これらには主に、ブレードIIIの第２（Ｌｙｓ⁵⁷⁶、Ｌｙｓ⁵⁷⁹）、第 ３（Ａｒｇ⁵⁹⁰）、および第４（Ｌｙｓ⁶⁰⁴）鎖、さらにはブレードIVの第３と第 ４鎖の間にできた大きな湾曲部にあるＬｙｓ⁶⁴⁶が寄与する。非極性の空洞は、 空洞を横切りブレードIIIとIVをつないでいるループする鎖に結合している。Ａ ｓｎ⁶¹¹を含むこのループ領域は、ＴＢＳ−１の一部と考えられるが、ＴＢＳ− ２と近接しており、ＧｅｌＡ−ＣＴＤの推定ＴＩＭＰ−２結合表面の一部を形成 する。ＴＢＳ−２は、大部分がブレードIVに局在するＴＩＭＰ−２結合に必要な 残基を含有する。Ｐｈｅ⁶⁵⁰とＧｌｙ⁶⁵¹は、ブレードIVの第４鎖に局在する。Ｔ ｙｒ⁶³⁶は、ブレードIVの第３鎖に由来するが、Ｐｈｅ⁶⁵⁰およびＧｌｙ⁶⁵¹ と共に近接する表面を形成する。Ａｓｐ⁶⁵⁶は、ブレードIVの末端の単一α−ら せん湾曲部に局在する。Ａｓｐ⁶¹⁵は、ブレードIIIとIVをつなぐループ部分の一 部であるが、Ｔｙｒ⁶³⁶に近接して位置する。ＴＢＳ−１とＴＢＳ−２は一緒に なって、ＧｅｌＡ−ＣＴＤの全推定ＴＩＭＰ−２結合表面を作り上げる。図１か ら、その突然変異がＴＩＭＰ−２結合に少なくとも１００倍の消失を引き起こし た残基は、主として空洞の内と周囲のＴＢＳ−１に見い出される。Ａｓｐ⁶¹⁵は 、アラニンに突然変異されると、ＴＩＭＰ−２結合の１００倍以上の消失を示し た、ＴＢＳ−２由来の唯一の残基である。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合表面のモデル作成においてもまた、ＴＩ ＭＰ−２結合に作用を及ぼさなかった点突然変異を利用することができる。推定 結合領域の近くかまたは近接するＧｅｌ−ＣＴＤ上のいくつかの残基は、アラニ ンに突然変異されてもＴＩＭＰ−２結合に影響を及ぼさなかった。 これらの変異体は、ＴＩＭＰ−２結合表面の外側の限界を規定する助けとなる ため、境界残基と考えられる。これらは、Ｌｙｓ⁵⁷⁸、Ａｓｐ⁵⁸⁶、Ａｓｐ⁶⁰⁸、 Ａｓｐ⁶¹⁸、Ｌｙｓ⁶³³、Ｌｙｓ⁶³⁹、Ｇｌｕ⁶⁴¹、Ｇｌｎ⁶⁴³、およびＬｙｓ⁶⁴⁹を 含む。このリストは網羅的なものではなく、かつ完全にはその部位を囲まないが 、これは相当な数であり、そして図１に見られるように、これらはＧｅｌＡ−Ｃ ＴＤのＴＩＭＰ−２結合表面の形状を決めるのに大きく貢献している。 ＴＩＭＰ−２のＧｅｌＡ−ＣＴＤ結合に及ぼす点突然変異の作用は、「直接」 または「間接」として特徴づけることができる。直接作用を有する点突然変異は 、結晶構造中でこれらの残基がほぼ全体に溶媒に暴露していて、近くの側鎖また は基本骨格原子と顕著なファンデルワールス接触、塩橋または水素結合を作らな いため、ＴＩＭＰ−２との直接相互作用により恐らく結合の消失を示す。「間接 」として分類されるものは、隣接する原子とのこのような相互作用に関係する残 基の点変異体である。ＴＩＭＰ−２結合に及ぼすこれらの変異体の作用は、ＴＩ ＭＰ−２との直接相互作用の消失の結果であるか、またはＴＩＭＰ−２結合の消 失を「間接」的に引き起こす点突然変異の結果としての局所構造の変動のためで あろう。ＴＩＭＰ−２結合に作用を及ぼす多くの点変異体は、「直接」として分 類 され、Ｌｙｓ⁵⁷⁶、Ｌｙｓ⁵⁷⁹、Ａｒｇ⁵⁹⁰、Ｌｙｓ⁶⁰⁴、Ａｓｎ⁶¹¹、Ａｓｐ⁶¹⁵、 Ｌｙｓ⁶⁴⁶、およびＰｈｅ⁶⁵⁰の変異体を含む（表１を参照のこと）。Ｔｙｒ⁶³⁶ もまた、ヒドロキシル基を含む環のほとんどが溶媒に暴露されており、かつＣ_δ １とＣ_ε１原子のファンデルワールス相互作用が局所の構造に顕著に変動を与え ないようであるため、直接と考えられる。「間接」として分類される残基は、Ａ ｓｐ⁵⁶⁹、Ｔｒｐ⁵⁷⁴、Ｇｌｙ⁶⁵¹、およびＡｓｐ⁶⁵⁶である。「間接」として分類 される残基は、Ａｓｐ⁵⁶⁹、Ｔｒｐ⁵⁷⁴、Ｇｌｙ⁶⁵¹、およびＡｓｐ⁶⁵⁶である。 図３に示す全ＴＩＭＰ−２結合部位は、表面積１０２７Ųである。表面の内 側は、その点変異体がＴＩＭＰ−２結合の消失を示す残基により規定される。表 面の境界は、ＴＩＭＰ−２結合に作用を及ぼす最も外側の残基と、上述の境界残 基により規定される。全表面を作成するために、突然変異を起こさなかった他の 残基を結合表面の一部として含める必要があった。これらの残基は、結合表面の 境界の外側には原子がなくてよく、かつ表面の内側に表面に接近可能な原子を持 つ必要があるという基準により選択した。ＴＩＭＰ−２結合表面の一部として含 まれる非突然変異残基は、残基Ａｓｎ⁵⁷⁷、Ｔｙｒ⁵⁸¹、Ｐｈｅ⁵⁸⁸、Ａｌａ⁶⁰⁹、 Ｔｒｐ⁶¹⁰、Ａｌａ⁶¹²、Ｉｌｅ⁶¹³、Ｐｒｏ⁶¹⁴、Ｌｅｕ⁶⁴⁵、およびＶａｌ⁶⁴⁸、 さらにＰｈｅ⁶⁰²のＣ_ζおよびＣ_ε１環炭素である。この群の全ての芳香族残基 さらにはＬｅｕ⁶⁴⁵は、ＴＢＳ−１中の非極性空洞を形成するのに貢献する。Ａ ｌａ⁶¹²、Ｉｌｅ⁶¹³、およびＰｒｏ⁶¹⁴は、ブレードIIIとIVをつなぐループ上に ある。Ｉｌｅ⁶¹³は、その基本骨格原子だけが表面に接近可能であるためユニー クである。Ｖａｌ⁶⁴⁸は、ＴＢＳ−２のファンデルワールス接触表面の一部を作 る。Ｌｅｕ⁶³⁸（Ｐｈｅ⁶⁵⁰とＴｙｒ⁶³⁶の間の小さなくぼみにある）は、アラニ ンに突然変異されてもＴＩＭＰ−２結合の消失を示さなかったため、結合表面に は穴が存在する。すなわち、Ｌｅｕ⁶³⁸のＣ_γ、Ｃ_δ１およびＣ_δ２原子は、Ｔ ＩＭＰ−２結合表面の一部と考えられない。ＴＩＭＰ−２結合に及ぼすこれらの 突然変異の作用を合理的に解釈するには、これらの残基の構造的環境のさらに広 い説明が必要である。 「間接」変異体の構造解析 上述のように、ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合部位に含まれるいくつか の残基は、「間接」変異体として分類され、Ａｓｐ⁵⁶⁹、Ｔｒｐ⁵⁷⁴、Ｇｌｙ⁶⁵¹ 、およびＡｓｐ⁶⁵⁶を含む。ここで我々は、これらの残基がまたＧｅｌＡ−ＣＴ Ｄ分子の他の部分とも相互作用するという事実から、ＴＩＭＰ−２結合に及ぼす アラニンへのこれらの突然変異の作用を合理的に解釈できる。 Ａｓｐ⁵⁶⁹のＯ_δ１は、Ｇｌｙ⁵⁸⁵の基本骨格アミドプロトンと水素結合を形成し 、そしてこれは、ブレードIIIの第２と第３鎖の間に形成されるきつい湾曲部に 局在している。Ａｓｐ⁵⁶⁹→Ａｌａの突然変異は、ＴＩＭＰ−２結合のわずかな 減少を引き起こすだけである。ブレードIIIの第３鎖は、残基Ａｒｇ⁵⁹⁰を含有し ており、これのアラニンへの突然変異は結合の大きな消失（＞１００倍）を示し 、ＴＩＭＰ−２と直接相互作用する。また、Ａｓｐ⁵⁶⁹は、ＴＩＭＰ−２結合に 影響する他の点変異体により形成される隣接結合表面からは遠い。ＴＩＭＰ−２ がＡｓｐ⁵⁶⁹と直接相互作用することはありうるが、Ａｓｐ⁵⁶⁹→Ａｌａ突然変異 の作用は、湾曲部のコンホメーションを強制するＧｌｙ⁵⁸⁵との重要な構造的Ｈ 結合の消失の結果としてＡｒｇ⁵⁹⁰の位置の変更が介在している可能性が高い。 Ｔｒｐ⁵⁷⁴は、ブレードIIIとIVの間のポケットを形成する多くの疎水性残基の １つである。これは、Ｔｙｒ⁵⁸¹およびＴｒｐ⁶¹⁰を含む隣接する側鎖からの多く の原子とファンデルワールス接触をする。Ｔｒｐ⁵⁷⁴のＣ_ζ３とＣ_η２原子のみ が表面に接近可能であるため、Ｔｒｐ⁵⁷⁴→Ａｌａ変異体の結合の大きな消失は 、これらの原子とＴＩＭＰ−２との相互作用の消失のせいではなく、突然変異の 結果としての隣接する残基の再配列のせいである可能性が高い。突然変異作用の 最も合理的な解釈は、ＴＩＭＰ−２がＧｅｌＡ−ＣＴＤと結合するとこのポケッ トとのファンデルワールス接触をし、そしてＴｒｐ⁵⁷⁴→Ａｌａが、ＧｅｌＡ− ＣＴＤにより与えられるファンデルワールス表面を変化させることによりＴＩＭ Ｐ−２結合を崩壊させることである。従Ｔｒｐ⁵⁷⁴→Ａｌａ突然変異の作用は「 間接」ではあるが、ポケット中の表面原子へのＴＩＭＰ−２の直接結合を示唆し ている。 Ｇｌｙ⁶⁵¹→Ａｌａ突然変異は、ＴＩＭＰ−２結合に穏やかな作用を及ぼす。 アラニンはそのＣ_βのおかげで許容しうるφ、ψ角が立体的に制限されているた め、Ｇｌｙ⁶⁵¹→Ａｌａ突然変異のＴＩＭＰ−２結合に及ぼす作用は、タンパク 質基本骨格における変化の結果でありうる。アラニンは、とりうるφ、ψコンホ メーションにおいてグリシンよりもエネルギー的に制限される。しかし、Ｇｌｙ⁶⁵¹ はブレードIVの最も外側のβ鎖の充分に形成されたβ−シートに存在し、か つ逆平行β鎖と釣り合ったファイ、プサイ角（φ＝−１５７．９、ψ＝１７４． ８）をとるため、アラニンはこの部位で同じコンホメーションをとるようである 。すなわち、アラニン変異体のＴＩＭＰ−２結合の消失は、残基６５１上のＣ_β 原子の付加のためであり、これが、接近によりＴＩＭＰ−２と６５１のＣ_αとの 相互作用をブロックする。二重変異体Ｇｌｕ⁶⁴¹→Ａｌａ／Ｇｌｙ⁶⁵¹→Ａｒｇは 、ＴＩＭＰ−２結合の＞１００倍の消失を示す。Ｇｌｕ⁶⁴¹は、全体に溶媒に暴 露されており、隣接する原子と相互作用せず、そして単一変異体のＧｌｕ⁶⁴¹→ Ａｌａは、ＴＩＭＰ−２結合に作用を及ぼさない。Ｇｌｕ⁶⁴¹は、全体に溶媒に 暴露されており、隣接する原子と相互作用しないようであるため、二重変異体の 作用は、協同の結果とは考えられない。すなわち、二重変異体の作用は、専らＧ ｌｙ⁶⁵¹→Ａｒｇ突然変異のせいである。恐らく、Ｇｌｙ⁶⁵¹→Ａｒｇ変異体は、 ＴＩＭＰ−２が通常結合するＧｅｌＡ−ＣＴＤ上の近くの表面をカバーする。ア ルギニンはアラニンよりもはるかに大きく、また荷電しているため、アラニンよ りもＴＩＭＰ−２結合にはるかに劇的な作用を及ぼしても驚くにあたらない。Ｇ ｌｙ⁶⁵¹→ＡｌａとＧｌｙ⁶⁵¹→Ａｒｇ両方がＴＩＭＰ−２結合を減少させるとい う事実は、ＴＩＭＰ−２が、Ｇｌｙ⁶⁵¹のＣ_αおよびＧｌｙ⁶⁵¹近くの表面残基で ＧｅｌＡ−ＣＴＤと接触することを示唆している。 Ａｓｐ⁶⁵⁶は、溶媒に暴露されており、Ｔｙｒ⁶³⁷のヒドロキシル基とのＨ結合 を形成する。Ａｓｐ⁶⁵⁶→Ａｌａ突然変異のＴＩＭＰ−２結合に及ぼす作用は、 このＨ結合の消失によるＴｙｒ⁶³⁷の配向の変動の結果であろう。ＴＩＭＰ−２ はＴｙｒ⁶³⁷とのみ相互作用することもありうるが、この突然変異の作用の最も 単純な解釈は、Ａｓｐ⁶⁵⁶がＴＩＭＰ−２と直接相互作用することである。この 結論は、Ａｓｐ⁶⁵⁶付近に正の電荷を与えるＧｌｙ⁶⁵¹→Ａｒｇ突然変異のＴＩＭ Ｐ−２結合の大きな消失を部分的に説明するであろう。また、Ａｓｐ⁶⁵⁶は、 Ｇｌｙ⁶⁵¹、Ｐｈｅ⁶⁵⁰、およびＴｙｒ⁶³⁶（他のＴＩＭＰ−２結合残基）と隣接 表面を形成する。ＴＩＭＰ−２は、Ｔｙｒ⁶³⁷と相互作用するかもしれないが、 この残基は本試験では突然変異させなかったため、これがＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴ ＩＭＰ−２結合表面の一部であると明確に考えることはできない。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤと間質コラゲナーゼの比較 ＧｅｌＡ−ＣＴＤの表面上のＴＩＭＰ−２結合部位を規定したため、ＴＩＭＰ −２結合部位のどの構造的特徴が共有されるかおよびどれが相互に異なるかを同 定するために、ＴＩＭＰ−２と結合しない間質コラゲナーゼのＣ末端ドメイン（ ＣｌＩ−Ｃｔｄ）（２９）の既知の構造と比較することは有益である。驚くべき ことに、正に荷電した残基の多くが、配列と構造の両方が保存されていることを 見いだされた。ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＬｙｓ⁵⁷⁹、Ａｒｇ⁵⁹⁰、およびＬｙｓ⁶⁰⁴は ＣｌＩ−Ｃｔｄで保存されており、そして構造中で同様なコンホメーションをと っている（図３と４）。さらに、ＧｅｌＡ−ＣＴＤ中のＬｙｓ⁶⁴⁶をＣｌＩ−Ｃ ｔｄ中のＡｒｇ⁴⁵³と整列させると、そのＣ_α原子を整列させた時、配列は同一 ではないが電荷は保存されており残基はよく重なる。Ａｒｇ５９０とＬｙｓ６４ ６の点突然変異は全て、ＧｅｌＡ−ＣＴＤ中のＴＩＭＰ−２結合の少なくとも１ ００倍の消失を示す。また、アラニンに突然変異させるとＴＩＭＰ−２結合の１ ００倍以上の消失を示すＬｙｓ５７６は、ＣｌＩ−Ｃｔｄでは保存されておらず 、ここでは負に荷電したＡｓｐ残基になっている。ＴＩＭＰ−２結合に大きく貢 献すると考えられるＡｒｇ５９０やＬｙｓ６４６のようないくつかの荷電した残 基もまた、ＴＩＭＰ−２に結合しないＣｌＩ−Ｃｔｄにおいて保存されているこ とに注目すると興味深い。明らかに、ＣｌＩ−Ｃｔｄには見い出されないＧｅｌ Ａ−Ｃｔｄの他の特徴は、そのＴＩＭＰ−２結合性を説明するために同定する必 要がある。 整列した構造をさらに検討すると、ＧｅｌＡ−ＣＴＤ中の非極性空洞が、Ｃｌ Ｉ−Ｃｔｄでは多くの負に荷電した残基により覆われていることが判る。Ｇｅｌ Ａ−ＣＴＤのＴｒｐ⁵⁷⁴、Ｌｙｓ⁵⁷⁶、およびＡｌａ⁶⁰⁹は、ＣｌＩ−Ｃｔｄの負 に荷電した残基と整列する。ＣｌＩ−Ｃｔｄでは、Ａｓｐ³⁸⁵はポケットの周辺 部にある；Ｇｌｕ³⁸³はポケットから突き出しており、そしてＧｌｕ⁴¹⁸はポ ケット上に伸びている。ＴＩＭＰ−２結合に及ぼすこれら負の電荷の作用は未だ 不明であるが、その負の電位は、ＴＩＭＰ−２からの近くの正の電荷を遮蔽しう る。あるいは、ＴＩＭＰ−２がＧｅｌＡ−ＣＴＤの非極性空洞とファンデルワー ルス接触しないならば、空洞中の全ての荷電した基の作用は、この相互作用をブ ロックしそして実際にＴＩＭＰ−２／ＧｅｌＡ−ＣＴＤ結合界面の内側の負の電 荷を埋めるはずである。ＣｌＩ−Ｃｔｄの空洞中の負の電位は、ＧｅｌＡ−ＣＴ ＤではＬｅｕ⁶⁴⁵であるＬｙｓ⁴⁵²の存在により部分的に減少する。Ｌｅｕ⁶⁴⁵は 、ＴＢＳ−１の疎水性空洞の中に向いている非極性残基である。図３は、ＧＲＡ ＳＰにより計算および表示したＧｅｌＡ−ＣＴＤとＣｌＩ−Ｃｔｄ両方の電荷電 位を示す。ＧｅｌＡ−ＣＴＤとＣｌＩ−ＣｔｄのＴＢＳ−１領域の比較は、形成 されるポケットが、異なる接近可能な表面を与えることを定性的に示唆する。ポ ケット中のいくつかの残基は保存されており、注目すべき例外は、ＧｅｌＡ−Ｃ ＴＤのＴｒｐ⁶¹⁰とＰｈｅ⁵⁸⁸である。他の差は、ブレードIIIとIVをつなぐルー プに見られる。ここで、Ａｓｐ⁶¹⁵は、ＣｌＩ−Ｃｔｄでは等配電子であるが荷 電していないＡｓｎ⁴²⁴になり、一方ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＡｓｎ⁶¹¹、Ａｌａ⁶¹² 、Ｐｒｏ⁶¹⁴は、ＣｌＩ−Ｃｔｄでは他の残基に変化する。 Ｉｌｅ⁶²³のみが保存されているが、この残基は、構造中に表面に接近可能な基 本骨格原子のみを有する。明らかに、ＧｅｌＡ−ＣＴＤとＣｌＩ−Ｃｔｄは、非 常に異なる電荷分布および連結ループに沿った接触表面を与える。 整列した分子のＴＢＳ−２を比較すると、さらに微妙な作用が明らかになる。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤでは溶媒中に突き出しているＰｈｅ⁶⁵⁰、ならびにＴｙｒ⁶³⁶、 Ｇｌｙ⁶⁵¹およびＡｓｐ⁶⁵⁶は、ＣｌＩ−Ｃｔｄでは保存されていない。一方これ らの電荷は、この領域でＴＩＭＰ−２を結合するＣｌＩ−Ｃｔｄの可能性を低下 させる、異なる接触表面と異なる表面電位の両方を作成する。 関連配列の比較 他のＭＭＰのＣ末端ドメインの配列を整列させて（図５）、ＣｌＩ−Ｃｔｄと ＧｅｌＡ−ＣＴＤの比較で注目された特徴が、他のＭＭＰファミリーメンバー（ 特にＴＩＭＰ−２に結合することが知られていないもの）についても当てはまる かどうかを調べた。この整列の最も著しい特徴の１つは、充分なＴＩＭＰ−２ 結合に必要ないくつかの残基が、ＭＭＰファミリーの多くのメンバー中でよく保 存されていることである。ＣｌＩ−Ｃｔｄとの比較とまさに同様に、Ｌｙｓ⁵⁷⁹ 、Ａｒｇ⁵⁹⁰、Ｌｙｓ⁶⁰⁴およびＬｙｓ⁶⁴⁵は、ファミリーの多くのメンバーでよ く保存されている。ＧｅｌＢ−ＣＴＤは、正に荷電した残基のこの群の間で相同 性が最も小さい。また、ＣｌＩ−Ｃｔｄ中の負の電荷（ＧｅｌＡ−ＣＴＤではＴ ｒｐ⁵⁷⁴、Ｌｙｓ⁵⁷⁶、およびＡｌａ⁶⁰⁹に存在した）もまた、ＭＭＰファミリー の多くのメンバーで見られる。ＧｅｌＡ、ＧｅｌＢおよびＭＴＩ−ＭＭＰだけが 、空洞中に負の電荷を配置しない。配列の整列をさらに検討すると、ＧｅｌＡ− ＣＴＤが、Ａｌａ⁶⁰⁹〜Ｐｒｏ⁶¹⁴の間の領域において他のメンバーとほとんど相 同でないことが示される。これらの残基は、ブレードIIIとIVをつなぐループ領 域を作る。他のメンバーは、この領域にわたって多くの相同製を示しており、Ｄ ＦＰＧＩＸ（ここでＸはＧ、Ｄ、ＥまたはＰのいずれかである）コンセンサス配 列によく適合する。ＧｅｌＡが、この領域ではその側鎖が構造に埋め込まれてい るＩｌｅ⁶¹³でのみ相同であり、結合したＴＩＭＰ−２と直接相互作用できない ことに注目すると興味深い。 ＴＢＳ−２領域からの残基の整列は、ＧｅｌＡとＧｅｌＢがこの範囲にわたっ て最も類似しているが、同一ではないことを示している。これらの残基の多くは 、Ｌｅｕ⁶⁴⁵とＬｙｓ⁶⁴⁶を除いて、ＧｅｌＡ−ＣＴＤ中のＴＢＳ−２と考えられ るもののほとんどを作り上げる。Ａｓｐ⁶¹⁵もまたＴＢＳ−２の一部と考えられ ており、かつＧｅｌＢにおいて相同である。ＭＴ１−ＭＭＰとストロムライシン （stromelysin）−３は、Ａｓｐ⁶¹⁵とＡｓｐ⁶⁵⁶の保存的置換と同一であるかま たはこれを構成する、次に最もよく類似している残基である。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤとＧｅｌＢ−ＣＴＤの比較 ＧｅｌＡ−ＣＴＤとＧｅｌＢ−ＣＴＤのモデルの間で整列した構造の比較は、 これらが、ＴＩＭＰ−２結合表面にわたってＣｌＩ−Ｃｔｄよりも多くの相同性 を有することを示している。配列の整列から見られるように、ＴＢＳ−２の残基 は非常に相同的であった。ＧｅｌＡ−ＣＴＤからのＴｙｒ⁶³⁶、Ｖａｌ⁶⁴⁸、Ｇｌ ｙ⁶⁵¹、Ａｓｐ⁶¹⁵およびＡｓｐ⁶⁵⁶は、ＧｅｌＢ−ＣＴＤにおいて構造的に保存 されている。１つの残基のみが顕著に異なっており、Ｐｈｅ⁶⁵⁰がＧｅｌ Ｂ−ＣＴＤではＶａｌ⁶⁹⁴になる。ブレードIVの第３と第４鎖をつなぐ湾曲部は 、残基の挿入のためＧｅｌＢ−ＣＴＤにおける再構築を要した。しかし大体、こ れらの残基は両方の構造において同様に配置された。ブレードIVの第３と第４鎖 をつなぐループは、２つの残基の挿入を適応させるために再構築する必要があっ た。これによりループのサイズが増大したが、なおＧｅｌＢ−ＣＴＤのＬｅｕ^{68 8} とＡｓｎ⁶⁸⁹は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＬｅｕ⁶⁴⁵とＬｙｓ⁶⁴⁶の近くに配置された 。そのため新しい電荷は導入されないが、この領域の接触表面はＧｅｌＢ−ＣＴ Ｄでは幾分異なるであろう。 ＴＢＳ−２とは対照的に、ＧｅｌＢ−ＣＴＤのモデルのＴＢＳ−１は、Ｇｅｌ Ａ−ＣＴＤとは劇的に異なる。非極性空洞の残基には多数の変化があった。 Ｔｒｐ⁵⁷⁴、Ｔｙｒ⁵⁸¹、Phe588、Ｐｈｅ⁶⁰²、およびＴｒｐ⁶¹⁰は、Ｇｅｌ−ＣＴ Ｄでは保存されていない。配列の変化により、ＧｅｌＢ−ＣＴＤでは空洞がはる かに深くなり、空洞の底は、Ｌｅｕ⁶⁸⁸とＭｅｔ⁶⁵³からの非極性原子の寄与によ り規定される。ＴＢＳ−１においてこの２つの間で保存される他の残基は、空洞 の周辺にある正に荷電したいくつかの残基である。ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＬｙｓ^{57 9} とＡｒｇ⁵⁹⁰は、ＧｅｌＢ−ＣＴＤにおいて保存されている。ＧｅｌＢ−ＣＴＤ は、Ｌｙｓ⁵⁷⁶で保存的に置換されて、ここで正の電荷が保存される。ＧｅｌＡ −ＣＴＤのＬｙｓ⁶⁰⁴とＬｙｓ⁶⁴⁶のような他の正の電荷は、ＧｅｌＢ−ＣＴＤで は極性であるが荷電していない残基になる。全体的にみて、ＧｅｌＡ−ＣＴＤや ＣｌＩ−Ｃｔｄで見られるよりもＧｅｌＢ−ＣＴＤのＴＢＳ−１領域では正に荷 電した残基が少ない。ＧｅｌＢ−ＣＴＤでブレードIIIとIVをつなぐループ領域 は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤへの中程度の相同性を示すが、ＧｅｌＢ−ＣＴＤへのＬｅ ｕ⁶⁵⁹の挿入のためにわずかな再構築を必要とした。挿入は、ループ残基のＣ_α 位を同様にモデル作成することを不可能にするため、ＧｅｌＡ−ＣＴＤやＣｌＩ −Ｃｔｄとは異なる構造を有するようにモデル作成される。ＧｅｌＡ−ＣＴＤの Ｐｒｏ⁶¹⁴はＧｅｌＢ−ＣＴＤにおいて保存されているが、ループの再構築のた めに重なる。Ａｓｎ⁶¹¹とＡｌａ⁶¹²は、ＧｅｌＢ−ＣＴＤでは異なるが、ＣｌＩ −Ｃｔｄ構造で見られる残基と同一である。 ＧｅｌＡの膜依存性活性化を阻害しないＧｅｌＡ−Ｃｔｄの変異体はＴＩＭＰ− ２結合部位内に集中する ＧｅｌＡ−ＣＴＤと細胞表面との相互作用は、プロ酵素の活性化に必須である 。その結果ＧｅｌＡの膜依存性活性化は、組換えＧｅｌＡ−ＣＴＤの存在下で競 合的に阻害される（緒言と考察を参照のこと）。我々が以前報告した結果は、Ｍ ＭＰ／ＴＩＭＰ−２／ＧｅｌＡ−ＣＴＤ複合体の組立が、ＧｅｌＡの活性化を促 進し、そして過剰のＧｅｌＡ−ＣＴＤの存在下でのＧｅｌＡ活性化の阻害が、複 合体中のインヒビターＴＩＭＰ−２へのＧｅｌＡの結合との直接競合のためであ るという仮説を支持する。この複合体の組立が、本当にＧｅｌＡ活性化のために 前もって必要なことであるかどうかという問題に対する直接のアプローチは、活 性化阻害とＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合性を分離することができるかど うかを決定することである。したがって我々は、ＧｅｌＡの膜依存性活性化をイ ンビトロで阻害する、上述の５０種のＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体の能力を調査した 。増大する量の精製ＷＴまたは変異体ＧｅｌＡ−ＣＴＤタンパク質を膜ＧｅｌＡ 活性化反応に加えて、活性化阻害の尺度である残りのプロ酵素種の量を酵素図で 解析した。結果は図６に示す。最も注目に値するのは、ＴＩＭＰ−２結合部位の 外側の点突然変異が、ＷＴ ＧｅｌＡ−ＣＴＤ（Ｔ２⁺Ａｉ⁺表現型）同様にＧｅ ｌＡ活性化を阻害したという事実である。さらに、活性化阻害の消失を示した唯 一の点突然変異は、上述のＴＩＭＰ−２結合部位で見い出されるものであった。 しかし、ＴＩＭＰ−２結合活性の劇的な消失（Ｋｉ／Ｋｄ＞１００）を示した変 異体は、２つの群に分類される。Ｌｙｓ⁵⁷⁶、Ａｒｇ⁵⁹⁰、およびＴｒｐ⁵⁷⁴の変 異体は、完全にＧｅｌＡ活性化（Ｔ２^-Ａｉ^-表現型）をしなかった。Ａｓｐ⁶¹⁵ 、およびＬｙｓ⁶⁴⁶の変異体はＷＴと見分けがつかないが、変異体Ｇｌｕ⁶⁴¹＋Ｇ ｌｙ⁶⁵¹→Ａｒｇは活性化阻害活性のごくわずかな消失を示した。変異体Ａｓｐ^{6 56} とＴｙｒ⁶³⁶は、ＴＩＭＰ−２結合の顕著な消失（Ｋｉ／Ｋｄ＝１０）および 活性化阻害活性の同等な消失を示した。変異体Ｌｙｓ⁶⁰⁴は、ＴＩＭＰ−２結合 のかなりの消失（Ｋｉ／Ｋｄ＝２５）を示したが、活性化阻害には、ほとんどま たは全く影響しなかった。他の全ての変異体（表１と図６を参照のこと）は、Ｔ ＩＭＰ−２結合の非常に穏やかな消失（Ｋｉ／Ｋｄ＜１０）を特徴とし、活性化 阻害測定法ではＷＴと区別がつかなかった。すなわちＴＩＭＰ− ２結合部位にある残基の点変異体は、ＴＩＭＰ−２結合の消失の程度とこれらの 各活性化阻害活性の消失との間に、完全な相関を常に示すわけではない。このよ うな相関を示す変異体は、ＴＢＳ１と２の間に分布する。両方の機能が激しく消 失するもの（Ｔｒｐ⁵⁷⁴、Ｌｙｓ⁵⁷⁶、およびＡｒｇ５９０）は、ＴＩＭＰ−２結 合部位のＴＢＳ−１領域に集中している（図１を参照のこと）。両方の機能に穏 やかに影響する２つの変異体（Ａｓｐ⁶⁵⁶とＴｙｒ⁶³⁶）はＴＢＳ２に見い出され る。ＴＩＭＰ−２結合と活性化阻害に及ぼす影響に最も大きな不一致のある２つ の変異体（Ａｓｐ⁶¹⁵とＬｙｓ⁶⁴⁶）は、ＴＢＳ１と２の境界に見い出される。最 後にＴ２^b+Ａ^i-表現型の変異体は存在しないことに注目することは重要である。 考察。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤは偽の４重対称を示すため、どんな構造的特徴が、ブレード IIIとIVの間の界面にほぼ位置するＴＩＭＰ−２結合部位を、他の３つのブレー ドの間の界面に見い出される同様な部位から区別するかを考えることは興味深い 。 分子の表面に表示される静電位を有するＧｅｌＡ−ＣＴＤ構造のＧＲＡＳＰ表示 は、ブレードIIIとIVの間の界面が、界面近くに高濃度の正電荷を有する（図３ ）ことでユニークであることを示している。さらに、ブレードIVの最も外側の鎖 は、ブレードIIとIIIに見られるようなβ−バルジ（bulges）のない規則的な逆 平行β鎖を形成するため、ＧｅｌＡ−ＣＴＤ構造においてユニークである。ブレ ードＩの第４の鎖は、β−バルジを含まないが、第３の鎖とのその基本骨格のＨ 結合パターンは、ｃｉｓプロリン、Ｐｒｏ⁵⁰⁶の存在により顕著に歪められる。 ｃｉｓプロリンは、IVを除く全てのブレードの第４の鎖で同定される。すなわち 、高度に局在化した正の電荷と近接するブレードの標準的なβ鎖コンホメーショ ンとが、この高度に対称性の分子の関連位置に見い出されないユニークな結合表 面を部分的に作成するであろう。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤ上のＴＩＭＰ−２結合部位が規定されたため、関連ＭＭＰの 既知の構造と配列を見て、どのように結合と特異正が達成されるかというアイデ アを考えることが可能である。このような解析における２つの基本的な仮定は、 １）全ての関連ＭＭＰ配列が、ＧｅｌＡ−ＣＴＤおよびＣｌＩ−Ｃｔｄについて 記載されたものと同じ折り畳みをとること、および２）ＴＩＭＰ−１が、Ｇｅｌ Ａ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合に匹敵して、ＧｅｌＢ−Ｃｔｄに結合することで ある。これら２つの仮定が事実であれば、ＭＭＰ類へのＴＩＭＰ類の結合の性質 に関するいくつかの興味深い観察を確かに行うことができ、以下に考察する。 １）ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＢＳ−１にある正に荷電した残基は、ＴＩＭＰ−２に 結合するのに必要であるが充分ではない。突然変異試験は、充分なＴＩＭＰ−２ 結合活性にはこれらの残基が明らかに必要であることを示すが、これらの荷電し た残基の多くが、ＴＩＭＰ−２に結合することが知られていないＭＭＰにおいて 保存されているという事実は、これらの残基の存在がＴＩＭＰ−２結合を引き起 こすのに充分ではないことを示唆している。ＴＩＭＰ−２は、負に荷電したＣ末 端テール配列ＥＦＬＤＩＥＤＰを有しており、これは除去されると、ＴＩＭＰ− １と類似の減少した結合反応速度プロフィールを示す（３０）。ＴＩＭＰ−１は 、そのＣ末端に負に荷電した配列を持たない。静電力は、分子間の広範囲の相互 作用にしばしば影響するため、正の電荷はドッキングの前にＧｅｌＡ−ＣＴＤの 結合部位の近くにＴＩＭＰ−２分子を引き寄せる働きをしうる。一旦結合すると 、静電相互作用は維持されるが、完全な特異的結合をするのにファンデルワール ス力が優勢になる。他の非ＴＩＭＰ結合ＭＭＰのＴＢＳ−１領域において記載さ れる負の電荷は、広範囲の相互作用を低下させ、また負に荷電したＴＩＭＰ−２ 配列とこれらのＭＭＰの保存される正に荷電した残基との間の静電相互作用を最 小にすることが可能である。また、ＴＩＭＰ−１に特異的に結合するＧｅｌＢが 、ＴＩＭＰ−２結合表面でＧｅｌＡよりも２つ少ない正に荷電した残基を有する ことに注目することも興味深い。恐らくこれら２つの残基Ｌｙｓ⁶⁰⁴とＬｙｓ⁶⁴⁶ は、ＴＩＭＰ−２の負に荷電したテールへの結合において役割を演じている。ま た、Ｌｙｓ⁵⁹⁵とＬｙｓ⁵⁹⁷は、本試験では突然変異しなかったが、結合部位の近 くにあり、ＴＩＭＰ−２テールと相互作用しうる。Ｌｙｓ⁵⁹⁷は、他のＭＭＰの いずれでも保存されていないため、特に興味深い。 ２）ＴＢＳ−１との相互作用は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤへのＴＩＭＰ−２結合の特異 性に対して、ＴＢＳ−２よりも大きく寄与する可能性がある。ＧｅｌＡ−ＣＴＤ とＧｅｌＢ−ＣＴＤは、ＴＢＳ−２領域においてかなりの相同性を共有するため 、 この領域では特異性は測定できそうにない。おそらくＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ− ２は、両方の分子で同様にＴＢＳ−２領域に結合するであろう。ＧｅｌＡとＢの 間で最も異なるＴＩＭＰ−２結合部位の領域は、ＴＢＳ−１に見い出される。こ こで、ＧｅｌＢは、２つの正に荷電した残基を失っている。また、配列解析とモ デル比較により、この２つが異なる非極性の空洞を有するであろうことが示され る。ＧｅｌＢ空洞は、ＧｅｌＡのものよりも深く広い。さらに、ＧｅｌＡ−ＣＴ ＤのブレードIIIとIVをつなぐループＡｌａ⁶⁰⁹〜Ａｓｐ⁶¹⁵は、ＧｅｌＢ−Ｃｔ ｄのものとは異なる。ループは、ＧｅｌＢ配列へのＬｅｕ残基の挿入によって、 配列と基本骨格構造の両方で異なっている。 ３）ファンデルワールス力は、ＴＩＭＰ−２結合および特異性において主要な役 割を演じる。ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合部位は、内輸に見積もって１ ０００Ųを超えてカバーする広い表面であり、主に荷電していない残基からな る。結合部位の荷電した残基の中で、多くは非ＴＩＭＰ結合ＭＭＰのＣ末端ドメ インに見い出され、このことは荷電した残基の存在だけでは結合を説明するのに 充分ではないことを示唆している。同様に、ＧｅｌＡ−ＣＴＤが、ＧｅｌＢ−Ｃ ｔｄと共通の非常に多くの荷電した残基を有するという事実は、ＴＩＭＰ−２の 特異的な結合が、単純な静電相互作用の結果でないことを示唆する。恐らく、結 合の強度と特異性は、静電引力と同様にファンデルワールス相互作用に由来する 。生化学試験により、ＧｅｌＡ−ＣＴＤへのＴＩＭＰ−２の結合は、低いｐＨと イオン性界面活性剤に感受性であるが、高い塩濃度には抵抗性であることを示し た（２０、３０）。これらの結果は、ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合には 、顕著なイオン性要素とファンデルワールス要素の両方が存在することを示唆す る。本明細書に記載されるＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合部位は、疎水性 空洞近くに集中した高く正に荷電した領域と延長したほぼ荷電されていないファ ンデルワールス接触界面活性剤をと含む、約１０００Ųの広い表面である。こ の部位の荷電した領域は、結合のｐＨおよびイオン強度依存性を説明し、一方こ の部位の空洞と広いファンデルワールス表面は、複合体を完全に解離させるため に界面活性剤が必要であることを説明する。 非ＴＩＭＰ結合ＭＭＰの最も顕著な配列の特徴の１つは、ＴＢＳ−１の空洞の 中または近くの負に荷電した残基を持ちやすい傾向である。これらの電荷は、潜 在的にＴＩＭＰ−２結合に有害な影響を及ぼすと考えられた。前述のように、Ｇ ｅｌＡとＢを除いて、ＭＴ１−ＭＭＰだけが、空洞の中または近くにある残基に 負の電荷を持たないことが確認されている。さらに、図４に示されるように、Ｇ ｅｌＡとＢに共有される多くの配列の特徴がＭＴ１−ＭＭＰにおいても見い出さ れる。ＧeｌＡのＰｒｏ⁶¹⁴、Ａｓｐ⁶¹⁵、およびＡｓｐ⁶⁵⁶残基は同様にＭＴ１− ＭＭＰで保存されている。 ＧｅｌＡとＭＴ１−ＭＭＰに共有されないＴＩＭＰ−２結合部位の残基には、 なお多くの配列の特徴があるが、ＭＴ１−ＭＭＰは、非ゼラチナーゼＭＭＰの中 で最も相同的である。まとめると、これらの観察結果は、ＭＴ１−ＭＭＰがＴＩ ＭＰ−２に結合することができるかも知れないことを示唆している。実際に最近 の観察結果はこの結論を支持する（２５、２６）。 プローゼラチナーゼとのインヒビターの相互作用は、そのＣ末端ドメインによ り媒介される（２０〜２２）。ＴＩＭＰ−２のＣ末端ドメインは、Ｃｙｓ¹²⁸〜 Ｐｒｏ¹⁹⁴の６７残基長である。ここには、６個のシステインがあり、これらは ＴＩＭＰ−１との類似により３つのジスルフィド結合を形成すると仮定される（ ３１）。すなわち、ＴＩＭＰ−２のＣ末端ドメインは、小型で球状になりそうで ある。Ｃ末端部分は、わずか１つの残基Ｇｌｕ¹²⁷によりＮ末端ドメインから分 離されているため、ＴＩＭＰ−２のＮ−およびＣ末端ドメインは空間的に相互に 非常に近づいて位置する必要がある。ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合部位 の大きな表面積を仮定すれば、ＴＩＭＰ−２のＮ末端ドメインの部分も結合に関 与することが可能である。ＴＩＭＰ−１とＴＩＭＰ−２のＮ末端ドメインは、そ の各Ｃ末端ドメイン（２７％同一）よりも大きな相同性（４４％同一）を示し、 そしてＧｅｌＡとＢのＴＢＳ−２セクションはそのＴＢＳ−１領域よりもはるか に類似しているため、ＴＩＭＰ−２のＮ末端ドメインの部分が、Ｇｅｌ−Ｃｔｄ のブレードIV残基に結合することは可能である。これは、ＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴ ＢＳ−１がＴＩＭＰ−２のＣ末端部分により結合させることを意味するであろう 。上述のように、ＴＩＭＰ−２のＣ末端ドメインは、完全な結合活性に必要な負 に荷電した配列を含有する。ＴＢＳ−１は、特にＧｅｌＡでは、多くの正に荷電 し た残基を持ち、そしてＧｅｌＡとＢの配列とモデルの比較に基づくと、ＴＢＳ− ２よりもはるかに配列と構造の相同性が少ない。この理由のため、ＧｅｌＡのＴ ＢＳ−１は、ＴＩＭＰ−１とは対照的にＴＩＭＰ−２に対するその特異性を決定 するようである。さらに、ＴＩＭＰ−２のＣ末端ドメインが延長されないことを 仮定すると、ＴＢＳ−２の部分は、実際にＴＩＭＰ−２のＮ末端ドメインの一部 に結合するかも知れない。 ＧｅｌＡは、触媒性ドメイン、３つのII型フィブロネクチン様反復を有するド メイン、およびＣ末端ドメインを含有する多ドメインタンパク質である。これら のドメインの４要素配置は未だ知られていない。欠失試験と架橋実験からの生化 学的証拠は、活性ＧｅｌＡが、ＴＩＭＰ−２のＮ末端とＣ末端ドメインにより、 その触媒性ドメインとＣ末端ドメインで同時に結合することを示唆する。ＴＩＭ Ｐ−２は、比較的小さく球状のタンパク質（ＭＷ＝２１kDa）であり、そのＮ末 端部分は小型で、ＯＢ折り畳みをとり（３２）、そしてＭＭＰの触媒性ドメイン に結合することにより基質切断を競合的に阻害する。本明細書に記載されるＴＩ ＭＰ−２結合部位を仮定すれば、触媒性ドメインの活性部位は、ＴＩＭＰ−２に 結合するとＣ末端ドメインのブレードIIIとIVの間の界面の比較的近くに位置す ると仮定することができる。ＧｅｌＡが固定したコンホメーションをとるか、ま たは自由に溶液中にあるかは、未だ決定されておらず、今後の研究課題である。 細胞表面ＧｅｌＡ活性化の機作 可溶性ＭＭＰであるＧｅｌＡは、細胞表面に集められて、そこでＭＴ１−ＭＭ Ｐ依存性に活性化される（３３に総説）。最初のＭＴ１−ＭＭＰ依存性Ａｓｎ³⁷ −Ｌｅｕプロ−ペプチド切断は過剰のＴＩＭＰ−２により阻害され、ＧｅｌＡ− ＣＴＤにより競合的に阻害される。したがって、そのＣ末端ドメインのない端を 切ったＧｅｌＡは、この機作では活性化しえない（１３）。すなわち説得力のあ る証拠は、その活性化に前もって必要な、細胞表面へプロ酵素を集合させること におけるＧｅｌＡ−ＣＴＤの役割を支持する。この機作におけるＴＩＭＰ−２の 役割は、さらに議論のあるところである。組換えＧｅｌＡ−ＣＴＤが、活性化Ｍ Ｔ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２複合体への結合により細胞表面と相互作用して、活 性化ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２／ＧｅｌＡ−ＣＴＤの三分子複合体 を形成することができることは明らかである。また、慎重に力価測定した量のＴ ＩＭＰ−２は、細胞膜依存性にＴＩＭＰ−２枯渇系における活性化の効率を増大 させうることを証明することも可能である。これらの結果は、ＭＴ１−ＭＭＰ／ ＴＩＭＰ−２／ＧｅｌＡ−ＣＴＤ複合体の組立が、細胞表面ＧｅｌＡの活性化を 促進するという仮説を支持する。逆にその膜貫通ドメインのない可溶性ＭＴ１− ＭＭＰは、ＧｅｌＡプロペプチドをＡｓｎ³⁷−Ｌｅｕで忠実に切断しうることが 明らかになった（２６）。この可溶性の精製した系において、ＴＩＭＰ−２は専 ら特異的なＭＴ１−ＭＭＰインヒビターとして機能する。ＧｅｌＡプロペプチド の切断は、そのＣ末端ドメインの存在に依存せず、そして膜依存性ＧｅｌＡ活性 化とは反対に、端を切ったＧｅｌＡは、可溶性活性化ＭＴ１−ＭＭＰの基質であ る。すなわち、細胞膜上のＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２／ＧｅｌＡ複合体の組 立が、本当にＧｅｌΛ活性化に前もって必要であるかどうかを他のアプローチに より確認することが必須である。 過剰のＧｅｌＡ−ＣＴＤの存在下でのＧｅｌＡ活性化の阻害は、ＧｅｌＡの細 胞表面結合との直接競合のせいであるため、上記問題に対する協力なアプローチ は、活性化阻害とＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合性を分離しうるかどうか を決定することである。ＧｅｌＡ−ＣＴＤの化学修飾とタンパク質分解修飾を利 用した我々の以前の実験は、このような効果を達成できなかった（９、１０）。 ＧｅｌＡ−ＣＴＤの全ての操作で、膜活性化測定法におけるＴＩＭＰ−２結合と 阻害活性の両方が失われた。突然変異誘発は、この問題に取り組むのに大いに良 好なアプローチを提供する。活性化阻害機能の消失とＴＩＭＰ−２に結合する能 力の間の完全な相関は、充分な数のＴＩＭＰ−２結合部位変異体が解析されるな らば、ＴＩＭＰ−２がＧｅｌＡ活性化のメディエーターとして働くことの決定的 な証拠となりうる。ここで我々は、ＧｅｌＡの膜依存性活性化をインビトロで阻 害する上述の全５０種のＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体の能力を調査している。ＴＩＭ Ｐ−２結合部位の外側の全ての変異体は、ＷＴ ＧｅｌＡ−ＣＴＤ（Ｔ２ｂ⁺Ａ ｉ⁺表現型）と同様にＧｅｌＡ活性化を阻害する。ＴＩＭＰ−２結合活性の劇的 な消失（Ｋｉ／Ｋｄ＞１００）を示した変異体は、分類された。Ｌｙｓ⁵⁷⁶、Ａ ｒｇ⁵⁹⁰、およびＴｒｐ⁵⁷⁴のアラニン置換を有する変異体は、ＧｅｌＡ活性 化を阻害しなかった（Ｔ２ｂ^-Ａｉ^-表現型）。Ａｓｐ⁶¹⁵、およびＬｙｓ⁶⁴⁶変異 体は、ＷＴと区別がつかなかったが、Ｇｌｕ⁶⁴¹のアラニン置換およびＧｌｙ⁶⁵¹ のＡｒｇ置換を有する二重変異体は、活性化阻害活性のわずかな消失を示しただ けであった。ＴＩＭＰ−２結合部位の他の変異体は、活性化阻害に中程度の作用 〜無作用を示す。 重要なことに、Ｔ２ｂ⁺Ａｉ^-表現型の変異体は見い出されなかった。すなわち 、全てのＡｉ^--変異体をＴＩＭＰ−２結合部位で濃縮して、Ｔ２ｂ⁺Ａｉ^-変異体 は単離されなかったが、ＴＩＭＰ−２結合の消失とＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体の活 性化阻害性との間の相関は絶対ではない。この不一致は、点突然変異の作用を測 定するために使用した測定法における差によって説明することができる。例えば 、本明細書で記載されるＧｅｌＡ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−２結合部位の一部だけが 、実際にＭＴ１−ＭＭＰに結合したＴＩＭＰ−２と相互作用する。これは、全Ｇ ｅｌＡ−ＣＴＤ結合部位を保証するために必要なＴＩＭＰ−２のＣ末端ドメイン の一部のみを暴露するＭＴ１−ＭＭＰとのＴＩＭＰ−２の相互作用の性質による ものであろう。すなわちＧｅｌＡ−ＣＴＤ ＴＩＭＰ−２結合部位の変異体の一 部のみが、活性化を競合的に阻害する能力を消失する（Ｔ２ｂ^-Ａｉ^--）。この 場合に、ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２／ＧｅｌＡ複合体の組立はなおＧｅｌＡ 活性化のために前もって必要であり、そしてＴＩＭＰ−２により占有され阻害さ れるＭＴ１−ＭＭＰが、どのようにＧｅｌＡプロペプチドを切断することができ るかという問題は残される。この反応の機作のために、いくつかの説明を引き合 いに出すことができる。ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２複合体が可溶性ＧｅｌＡ の受容体として作用し、三分子提示複合体を形成する、活性化モデルを提案する ことができる。次にＴＩＭＰ−２を含まないＭＴ１−ＭＭＰの別の分子が、Ａｓ ｎ³⁷−Ｌｅｕプロ−ペプチドの切断を実行する。その結果ＧｅｌＡの活性化は、 未占有活性化ＭＴ１−ＭＭＰ対ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩＭＰ−２複合体の比に感受 性であり、そして飽和量のＴＩＭＰ−２が活性化を阻害する。 Ｔ２ｂ^-Ａｉ^--およびＴ２ｂ^-Ａｉ⁺変異体の存在が、ＧｅｌＡ−ＣＴＤが別の 未だ同定されていない細胞表面受容体に結合することを意味し、そして生じる複 合体が、ＴＩＭＰ−２を含まないＭＴ１−ＭＭＰにより活性化されると解釈 するならば、本明細書に与えられたデータに基づく第２セットのＧｅｌＡ活性化 モデルを提案することができる。例えば、ＧｅｌＡ−ＣＴＤの結合は、最近報告 されたようにαＶβ５インテグリンとの相互作用により起こりうる（３４）。突 然変異誘発の結果は、ＴＩＭＰ−２結合部位の外側にＡｉ^-変異体は見い出され なかったため、ＴＩＭＰ−２とＧｅｌＡ−ＣＴＤ上の推定受容体結合部位が重な っていることを示す。この重複は、なぜＴＩＭＰ−２が、ＭＴ１−ＭＭＰ／ＴＩ ＭＰ−２複合体以外の受容体により媒介される場合でさえ、細胞表面へのＧｅｌ Ａの結合を阻害しうるかを潜在的に説明しうる。すでに我々は、ＣｌＩとＧｅｌ Ｂ−ＣＴＤのＴＩＭＰ−１結合部位が重なるＧｅｌＢ／Ｃｌｌの類似してはいる が可溶性の複合体を報告した（２２）。 表１．ＴＩＭＰ−２結合活性に影響するＧｅｌＡ−ＣＴＤ変異体（Ｋｉ／Ｋｄ＞ １）。野生型のＫｄと変異体のＫｉは図７のように測定した。ＤとＩＤは、それ ぞれ直接および間接にＴＩＭＰ−２結合に影響する変異体を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 14/81 Ｃ０７Ｋ 14/81 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ＧｅｌＡ−ＣＴＤドメインの表面上のＴＩＭＰ−２結合部位の以下の残 基：Ａｓｐ⁶⁵⁶、Ｇｌｙ⁶⁵¹、Ｐｈｅ⁶⁵⁰およびＴｙｒ⁶³⁶を含んでなる、ＭＭＰイ ンヒビターのスクリーニングのための標的領域。 ２． ＧｅｌＡ−ＣＴＤドメインの表面上のＴＩＭＰ−２結合部位の以下の残 基：Ａｓｐ⁶⁵⁶、Ｇｌｙ⁶⁵¹、Ｐｈｅ⁶⁵⁰、Ｔｙｒ⁶³⁶、Ａｓｐ⁶¹⁵、Ｌｙｓ⁶⁴⁶、Ｌ ｙｓ⁵⁷⁶、Ｔｒｐ⁵⁷⁴、Ａｒｇ⁵⁹⁰、Ｌｙｓ⁵⁷⁹、Ｌｙｓ⁶⁰⁴およびＡｓｎ⁶¹¹を含ん でなる、ＭＭＰインヒビターのスクリーニングのための標的領域。 ３． 請求の範囲第１項に記載のＴＩＭＰ−２結合部位での反応による、細胞 表面活性化および阻害に及ぼす試験化合物の作用を測定することを含んでなる、 ＭＭＰインヒビターのスクリーニング方法。 ４． 請求の範囲第２項に記載のＴＩＭＰ−２結合部位での反応による、細胞 表面活性化および阻害に及ぼす試験化合物の作用を測定することを含んでなる、 ＭＭＰインヒビターのスクリーニング方法。