【発明の詳細な説明】
骨形成を促進するための成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬の使用
本発明の分野
本発明は、仮骨伸延（callus distraction）と同時の、動物における骨形成を
促進するための成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬の使用に関する。
本発明は、さらに、伸延手順と同時の骨形成を提供するために十分な量で成長
ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬を、その必要な動物に投与することによる
、伸延骨形成に供される動物における骨折の治癒を強化する方法に関する。
本発明は、さらに、仮骨伸延と同時の骨形成の促進のための医薬の製造のため
の、そして伸延骨形成における骨折の治癒の強化のための医薬の製造のための、
成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬の使用に関する。
本発明は、さらに、伸延骨形成による、骨折、外傷後の変形、及び特発性変形
を患う患者の治療方法であって、伸延手順と共にそのような治療の必要な患者に
成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬の有効量を投与する方法に関する。
本発明の背景
骨形成及び骨折の治癒は、関係するであろう基礎的な生物学的プロセスに依存
している。これらの手順は、未だ十分に理解されていないが、一部、その生物学
的相関を理解するために、そして一部、治癒のプロセスに影響を及ぼし、又は刺
激することができる“生物
学的ツール”を開発するために、集中的に研究されている。
広義における骨治癒の順序は、以下のように概説されることができる：
外傷は、骨マトリックスからの骨由来成長因子の放出を、そしてその周囲組織
及び血液からの他の局所的成長因子の放出を顕出する。上記因子のいくらかは知
られており、それは、１）その領域内での高められた代謝、２）上位ホルモンの
分泌の変化、及び３）原始細胞の分化を導いて骨細胞を形成し、そしてそれらを
増殖させる特定の反応、を顕出する。この特定の反応は、ホルモンに依存するい
くつかのポリペプチド成長因子の間の相互作用に依存する。
伸延骨形成（仮骨伸延）は、肢伸延(limb lenghening)及び骨輸送のために広
く認められている（例えば、Aronson et al.，Clinical Orthopaedics and Rela
ted Research（1989 April）241:106-116，Paley et al.，Clinical Orthopaedi
cs and Related Research（1989）April 241:146-165，Aronson et al.，Clinic
al Orthopaedics and Related Research（1989 Junel）243:71-9を参照のこと）
。簡単に言えば、それは、重度の先天性、外傷後の、又は他の獲得された、変形
をもつ肢を救う方法である。緊張状態にある経骨（trans-osseous）ワイヤーに
より環外固定装置のユニバーサル・システムを一般に使用する上記方法は、過去
35年間にわたり開発されてきた。半侵入性技術は、骨切断及び節間欠陥、角度及
び回転不整列、能動感染、虚血、関節拘縮、癒着不能、外傷後及び特発性の極度
の変形のために治療された300,000を超える患者（大人及び子供）において成功
していることを証明している。骨輸送は、生きた骨で節間骨欠陥を満たすために
生きている骨の遊離のセグメントを動かすことを含む。上記輸送骨セグメントの
従端（trailing end）は、伸延骨形成による宿主の骨表面と連続性を維持する。
上記輸送骨
セグメントの主端(leading end)は、変形性骨形成により標的骨表面に融合する
。上記経骨ワイヤーの小さな直径は、１日当り１ミリメーターまでの少しずつの
伸延のために必要な長い処置時間にわたる良好な患者の耐性に貢献する。上記方
法は、外部固定装置（環及び片側生固定装置）のユニバーサル・システム、及び
髄質内釘を使用することもできる（Raschke et al．Clin Orthop．1992）。典型
的には、骨折は、約15cmの骨伸延に対応して６ヶ月間の期間にわたり伸延される
。骨成長は、この６ヶ月間の期間の間生じない。次の１〜１年半の間、伸延は行
われず、その代わり骨成長が生じる。
しかしながら、上記方法の欠点は、長い期間の処置期間に因る患者への不便及
び高コストである。従って、治療加速のための強い必要性がある。
今般、驚くべきことに、成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬が、骨の再
生及び併合を加速し、そしてこれ故、短期間の処置期間内で骨の品質（例えば、
より大きな骨質量、より大きなねじり剛性、より大きな機械剛性）を改善するこ
とが発見された。
我々の組織学的研究は、上記伸延期間の間に、いくらかの骨化作用がその伸延
領域の周辺面において生じ、一方、その伸延領域の中心において、伸延化（leng
hening）が未だ行われることができることを示している。従って、上記伸延期間
及び併合期間の加速が見られる。
骨折が治癒しているとき、その骨は、その治癒プロセスが、その骨折が荷重を
かかえるために十分に発達するまで、実質的に荷重をかけられない。治癒された
骨の強さは、その骨に中程度に荷重を与え、そしてその荷重へのその応答を計測
することにより、計測されることができる。治癒中の骨折した骨の機械的剛性を
計測するための方法及び装置は、例えば、US 5 339 533及びEP 0 117 859中に記
載されている。治癒中の骨折のねじれ剛性は、例えば、その骨折の各側において
それらの骨の両端が、それぞれの外部ホルダーに固定され、それにより、それら
が主にその骨の軸のまわりに互いに対して回転され、そしてその回転を行うため
に必要な回転モーメントが回転角の関数として測定される。
背景技術
いくつかの刊行物はラットにおける骨折治癒に対する成長ホルモンの効果に関
する。
・Ashton et al．(Br．J．Exp．Pathol．64:479，1983)及びTylkowski et al
．(Clin．Orthop．115:274，1976)は、成長ホルモンの投与によるラット脛骨（t
ibiae）の治癒について開示しており、この脛骨治癒は高められた強さをもつ。
・Jrgensen et al．(Calcified Tissue，44，1989，abstract D20)は、hGHに
よるラットの注射について記載する。大腿骨及び脛骨の機械的強さが計測された
。骨折の最大剛性は高められた。
・Bak et al．(Bone 11:233，1990)は、ラット脛骨骨折の生体力学的特性に対
するhGHの効果について記載する。治癒の40日後、骨折の最大剛性が増加した。
・Nielsen et al．(Acta Orthop Scand 1991，62(3):244-247)は、ラットにお
ける脛骨骨折に対する成長ホルモンの促進効果を記載する。GHが、成長板の双生
領域（geminal zone）内で細胞分化を刺激することにより長さ方向の骨成長を刺
激するということが結論付けられる。骨折の最大剛性は、２〜３週間の成長ホル
モンを注射されたラットにおいて増加した。
・Mosekilde et al．(Bone and Mineral，The XIth International Conferenc
e on Calcium Regulating Hormones，Florence，Ital
y，April 24-29，1992，abstract No.504)は、ラット脛骨骨折に対する成長ホル
モンの長期間の効果を記載する。これらの結果は、仮骨形成に対するGHの開始刺
激効果を現したが、その仮骨は、非処置ラットのものよりも有意に低い柵状織骨
容量をもつゆるやかな構造であった。
・Carpenter et al．(Journal of Bone and Joint Surgery，74-A(3):359，19
92)は、成長ホルモンがウサギにおける骨折治癒の生体力学を変化させることに
失敗したことを記載する。この研究に従えば、成長ホルモンの投与は、骨折治癒
に対する効果を全くもっていなかった。
・Mosekilde et al．(Bone 14:19-27，1993)は、ラットにおける骨折治癒に対
する成長ホルモンの効果について記載する。この研究に基づいて、仮骨形成に対
する成長ホルモンの開始刺激効果が存在するけれども、成長ホルモン処置の間に
形成された仮骨は、極めてゆるい構造をもって異常であり、そしてこの仮骨のモ
デリング及びリモデリングは遅れるということが結論付けられた。骨髄細胞は、
鉱物化された仮骨組織を犠牲にして成長し、又は仮骨組織の正常な構造が破壊さ
れるようである。
・Castillo et al．(Hormone Research，33rd Annual Meeting of the Europe
an Society for Paediatric Endocrinology(ESPE)，Maastricht，June 22-25，1
994，abstract No.360)は、ラットにおける骨折に対するヒト成長ホルモンの刺
激効果を記載する。組換えhGH療法は、骨折後12及び18日目におけるラットにお
ける大腿骨の治癒を加速させる。hGHは、たぶん、幹細胞を刺激することにより
直接的に、そして局所IGF−１の生産を刺激することにより間接的に、骨格組織
に対して作用する。
・Buonomo et al．(abstract No．Ｐ-1576 from Program & Abstr
acts(Vol．I:June 12-13)，10th International Congress of Endocrinology，J
une 12-13，1996，San Francisco，USA)は、イヌにおける骨成長因子及び骨折治
癒に対するイヌのソマトトロピン(cST)の代謝効果について記載している。cSTに
より処置されたイヌは、非処置イヌのものに比較して、治癒骨折の、それぞれ３
−及び５−倍に増加した強さ及び剛性を示した。
しかしながら、骨骨折の伸延は上記研究のいずれにおいても行われなかった。
本発明は、成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬を投与するとき、伸延骨
形成の間の骨折の強化された治癒に関する。毎日（ブタにおいて１日当り２ミリ
メーターまで）骨折を伸延するとき、その伸延期間の間、治癒は期待されないで
あろう。驚くべきことに、今般、成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬が伸
延期間の間に骨の成長を刺激し、そしてこれ故、骨治癒の全般に対して強化効果
を有し、より短い処置期間をもたらすことが示された。
本発明の要約
今般、驚くべきことに、成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬が骨形成を
加速し、そして併合(consolidation)を再生し、そしてそれ故、より短い期間の
処置期間内に骨の品質（例えば、より大きな骨質量、より大きなねじれ剛性、よ
り大きな機械剛性）を改善することが発見された。
今般、骨折した骨又は骨欠陥の伸長又は治癒の間の、成長ホルモンの投与が、
その治癒を加速して、癒合すべき表面の間のしっかりした接着のより速い発展を
与えるであろうということが示された。
１の態様に従えば、本発明は、仮骨伸延と同時の、動物における骨形成を促進
するための成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬
の使用に関する。
他の態様に従えば、本発明は、伸延骨形成に供される動物における骨折の治癒
を強化する方法であって、伸延手順と同時の、骨形成を提供するために十分な量
で成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬を、その必要な動物に投与すること
を含む方法に関する。
本発明の好ましい側面に従えば、前記動物は、好ましくはヒトである。
本発明の他の好ましい側面に従えば、前記成長ホルモンは、ヒト成長ホルモン
である。
本発明の他の好ましい側面に従えば、前記成長ホルモン分泌促進薬は、以下の
式（Ｉ）：
をもつ５−アミノ−５−メチル−ヘキ−２−セノン酸Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)
−１−（メチル−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)
カルバモイル）−２−（ナフタレン−２−イル）エチル)アミド、及び以下の式
（II）：
をもつH-Aib-His-D-2Nal-D-Phe-Lys-NH2、及び以下の式（III）：をもつＮ−〔１（Ｒ）−〔（１，２−ジヒドロ−１−メタンスルホニルスピロ〔
３Ｈ−インドール−３，４’−ピペリジン〕−１’−イル）カルボニル〕−２−
（フェニルエチルオキシ）エチル〕−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド・
メシレートのリストから選ばれる。
本発明は、さらに、仮骨伸延と同時の骨形成の促進のための医薬の製造のため
の成長ホルモン又は成長ホルモンの分泌促進薬の使用に、そして伸延骨形成にお
ける骨折の治癒の強化のための医薬の製造のための成長ホルモン又は成長ホルモ
ン分泌促進薬の使用に関する。
本発明は、さらに、伸延骨形成による、骨折した骨、外傷後及び特発性の極度
の変形を患う患者の治療方法であって、その伸延手順と共にそのような治療の必
要な患者に成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬の有効量を投与することを
含む方法に関する。
本発明に従えば、適当な又は所望の作用部位に上記活性化合物を有効に輸送す
るいずれかの経路、例えば、経口、鼻内、経膣、直腸、舌下、経皮又は非経口（
例えば、筋中、腹膜内、静脈内、又は皮下注射、又はインプラント）並びに肺吸
入であることができる。
図 面
図１は、GH処理されたブタにおける脛骨のねじれ剛性を示す。
図２は、対側性脛骨に関するねじれ剛性を示す。
図３は、対側性脛骨に関する最大ねじれモーメントを示す。
図４は、GH処理されたブタにおける脛骨のDIGI−計測（デジタルＸ−線）を示
す。
図５は、GH処理されたブタにおけるDIGI−計測に対する標準偏差（SD）を示す
。
本発明の詳細な説明
成長ホルモン
成長ホルモンは、成長することができる全ての組織の成長を刺激するホルモン
である。成長ホルモンは、下垂体から放出される。その放出は、直接的であるか
間接的であるかを問わず多数のホルモン及び神経伝達物質の厳格なコントロール
の下にある。成長ホルモンの放出は、成長ホルモン放出性ホルモン（GHRH）によ
り刺激され、そしてソマトスタチンにより阻害されることができる。両ケースに
おいて、上記ホルモンは視床下部から放出されるが、それらの作用
は、主に、下垂体内に在る特異的レセプターを介して仲介される。本文脈中、“
成長ホルモン”は、いずれかの源、例えば、トリ、ウシ、ウマ、ヒト、ヒツジ、
ブタ、サケ、マス又はマグロの成長ホルモンからの、好ましくは、ウシ、ヒト又
はブタからの成長ホルモンであることができ、そしてヒト成長ホルモンが最も好
ましい。本発明に従って使用される成長ホルモンは、例えば、慣用のやり方で下
垂体腺を抽出することにより、天然源から単離された生来の成長ホルモン、又は
例えば、E．B．Jensen and S．Carlsen in Biotech and Bioeng．36，1-11(1990
)中に記載されたような、組換え技術により製造された成長ホルモンであること
ができる。“成長ホルモン誘導体”は、１以上のアミノ酸残基が欠失されている
成長ホルモンの短縮形態；その置換が抗原性又は減少された作用の如き悪影響を
もたない限り、生来の分子中の１以上のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基、好ま
しくは天然のアミノ酸の残基により置換されているそのアナログ；又はその誘導
体、例えば、成長ホルモンの脱アミド化又はスルホキシド化形態又はＮ−又はＣ
−末端伸長をもつ形態、例えば、Met-hGH，Met-Glu-Ala-Glu-hGH又はAla-Glu-hG
Hであることができる。好ましい成長ホルモンはhGHである。成長ホルモン擬態物
質は、例えば、GHレセプターを二量体化することができるペプチドである。成長ホルモン分泌促進薬
成長ホルモン分泌促進薬は、インビボにおいて内因性成長ホルモンを放出する
能力を有する化合物である。分泌促進薬は、例えば、成長ホルモン放出性ホルモ
ン（GHRH）及びそのアナログ、成長ホルモン放出性因子又はインビボにおける成
長ホルモンの放出を刺激する小さなオリゴ又はポリペプチド、例えば、短鎖成長
ホルモン放出性ペプチド（例えば、GHRP（２又は６）であってそれぞれ、WO93/0
4081とEP83864中に開示されているもの）、又は成長因子、例えば、IGF−１又は
IGF−２であることができる。
下垂体からの成長ホルモンの放出を刺激する他の化合物も記載されている。例
えば、アルギニン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（L−Dopa）、
グルカゴン、バソプレッシン、PACAP(下垂体アデニルイル・シクラーゼ活性化ペ
プチド)、ムスカリン・レセプター・アゴニスト及び合成ヘキサペプチド、GHRP
（成長ホルモン放出性ペプチド）は、下垂体に対する直接的効果により、又は視
床下部からのGHRH及び／又はソマトスタチンの放出に影響を及ぼすことにより、
内因性成長ホルモンを放出させる。
哺乳類において成長ホルモンのレベルを高め、そして本発明に従って使用され
ることができる化合物は、特許及び特許出願番号WO97/00894、WO97/23508、WO95
/17422、WO95/17423（例えば、H-Aib-His-D-2Nal-D-Phe-Lys-NH2）、WO96/22997
、WO96/24580、WO96/24587、WO96/05195、及びEP18072、EP83864、WO89/07110、
WO89/07111、WO89/10933、WO88/09780、WO83/02272、WO91/18016、WO92/01711、
WO93/04081WO96/15148、WO96/22782、GB 2297972、GB 2298657、GB 2298647、WO
96/02530、WO96/13265、WO95/34311、WO95/16675、WO95/16692、WO95/14666、WO
95/13069、WO95/12598、WO95/09633、WO95/03290、WO95/03289、WO94/19367、EP
662481、WO94/08583、WO94/07486、WO94/11012、WO94/07483、WO94/18169、WO94
/05634、及びWO92ノ16524中に開示された化合物を含む。さらに、WO94/13696は
、哺乳類において成長ホルモンのレベルを高める化合物、例えば、Ｎ−〔１（Ｒ
）−〔(1，２−ジヒドロ−１−メタンスルホニルスピロ〔３Ｈ−インドール−３
，４’−ピペリジン〕−１’−イル）カルボニル〕−２−（フェニルエチルオキ
シ）エチル〕−２−アミノ−メチルプロパンアミド・メシレート：
を開示している。また、化合物５−アミノ−５−メチル−ヘキセ−２−ノン酸Ｎ
−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチル−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）
−２−フェニルエチル）カルバモイル）−２−（ナフタレン−２−イル）エチル
)アミド：
は、哺乳類において成長ホルモンのレベルを高める。上記化合物は、共に、本発
明に従って使用されることができる。好ましい成長ホルモン又は分泌促進薬
好ましい成長ホルモンは、メチオニル化されたヒト成長ホルモン（Met-hGH）
及びヒト成長ホルモン(hGH)であり、ヒト成長ホルモンが最も好ましい。好まし
い成長ホルモン分泌促進薬は、以下の式（Ｉ）：をもつ５−アミノ−５−メチル−ヘキセ−２−ノン酸Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)
−１−（メチル−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)
カルバモイル）−２−（ナフタレン−２−イル）エチル)アミド、及び以下の式
（II）：
をもつH-Aib-His-D-2Nal-D-Phe-Lys-NH2、及び以下の式（III）：
をもつＮ−〔１（Ｒ）−〔（１，２−ジヒドロ−１−メタンスルホニルスピロ〔
３Ｈ−インドール−３，４’−ピペリジン〕−１’−イル）カルボニル〕−２−
（フェニルエトキシ）エチル〕−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド・メシ
レートである。ここで、５−アミノ−５−メチル−ヘキセ−２−ノン酸Ｎ−メチ
ル−Ｎ−（（１Ｒ)−１−（メチル−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２
−フェニルエチル)カルバモイル）−２−（ナフタレン−２−イル）エチル)アミ
ド（式(Ｉ))が最も好ましい。略 号
H-Aib＝Ｈ−アミノ−イソ酪酸
D-2Nal＝Ｄ−２−ナフチルアラニン
D-Phe＝Ｄ−フェニルアラニン医薬投与
本明細書中に言及する成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬により処置さ
れるべき患者のための養生法は、当業者により決定されるはずである。療法にお
いて投与されるべき日用量は、内科医により決定されることができ、そして使用
される特定の化合物に依存するであろう。便利な日用量は、好適には、約６μｇ
／kg／日〜約
720μｇ／kg／日、好ましくは約６μｇ／kg／日〜約350μｇ／kg／日、より好
ましくは、約30μｇ／kg／日〜約200μｇ／kg／日、最も好ましくは、約50μｇ
／kg／日〜約150μｇ／kg／日である。
上記成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬は、伸延期間の間に投与されな
ければならず、そしてさらに、骨の品質が満足ゆくまで、（伸延期間の後）治癒
期間のいくつか又は全ての間、投与されることができる。投与期間は、通常、約
５週〜約200週、好ましくは、約20週〜約100週の範囲内にあるであろう。
投与経路は、適当な又は所望の作用部位に上記活性化合物を有効に輸送するい
ずれかの経路、例えば、経口、鼻内、経膣、直腸、舌下、経皮又は非経口（例え
ば、筋中、腹膜内、静脈内又は皮下注射、又はインプラント）並びに肺吸入であ
ることができる。成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬は、各投与経路のた
めに適当な剤形に配合されることができる。上記組成物又は剤形は、慣用の形態
、例えば、カプセル、錠剤、エアロゾル、溶液、懸濁液又は表在局所的適用で現
われることができる。
しかしながら、成長ホルモン自体のタンパク質の性質は、非経口投与以外を実
行不可能にする。さらに、他の直接的に作用する天然の分泌促進薬、例えば、GH
RH及びPACAPは、上記理由のために経口投与が実行可能でない、長いポリペプチ
ドである。
成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進薬は、皮下、静脈内又は筋中、投与さ
れることができ、又はそれは、治癒されるべき骨表面への連続的又は拍動性の注
入により投与されることができる。本発明の好ましい側面に従えば、成長ホルモ
ンは皮下投与される。
他の分泌促進薬、例えば、アルギニン、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルア
ラニン（Ｌ−Dopa）、ムスカリン性レセプター・アゴニスト、５−アミノ−５−
メチル−ヘキセ−２−ノン酸Ｎ−メチル
−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチル−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フ
ェニルエチル)カルバモイル）−２−（ナフタレン−２−イル）エチル)アミド（
式(Ｉ))、H-Aib-His-D-2Nal-D-Phe-Lys-NH2(式(Ｈ)、及びＮ−〔１（Ｒ）（１，
２−ジヒドロ−１−メタンスルホニルスピロ〔３Ｈ−インドール−３，４’−ピ
ペリジン〕−１’−イル）カルボニル〕−２−（フェニルエチルオキシ）エチル
〕−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド・メシレート（式(III))は、より小
さな分子であり、これらは、経口、経膣、直腸、鼻内、肺又は経皮投与について
実行可能であることができる。経口経路が好ましい。このような化合物は、場合
により医薬として許容される塩形態、例えば、無機又は有機酸、例えば、塩化水
素酸、臭化水素酸、硫酸、酢酸、リン酸、乳酸、マレイン酸、フタル酸、クエン
酸、グルタル酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、サリチル酸、コハク酸、酒石
酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、スルファミン酸又はフマル酸の医
薬として許容される酸付加塩の形態、又はアルカリ金属又はアルカリ土類金属又
は低級アルキルアンモニウム塩の形態にあることができる。このような塩形態は
、遊離塩基形態とほぼ同じ活性オーダーを示すと信じられている。
経口投与のための固形剤形は、カプセル、錠剤、ピル、粉末、及び顆粒を含む
。このような固形剤形においては、活性化合物は、少なくとも１の不活性な医薬
として許容される担体、例えば、スクロース、ラクトース、又はデンプンと混合
される。このような剤形は、正常な運用におけるように、不活性希釈剤以外の追
加の物質、例えば、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含むこともで
きる。カプセル、錠剤、及びピルの場合、その剤形は緩衝化剤を含むこともでき
る。錠剤及びピルは、腸溶コーティングによりさらに調製されることができる。
経口投与のための液体剤形は、本分野において一般に使用される不活性希釈剤
を含有する、医薬として許容されるエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、エ
リキシル、例えば、水を含む。このような不活性希釈剤に加えて、組成物は、ア
ジュバント、例えば、水和剤、乳化剤及び懸濁剤、及び甘味料、調味料(flavour
ing agents)、及び香料を含むこともできる。
非経口投与のための調製物は、無菌水性又は非水性溶液、懸濁液、又はエマル
ジョンを含む。非水性溶媒又はビヒクルの例は、プロピレン・グリコール、ポリ
エチレン・グリコール、植物油、例えば、オリーブ油及びコーン油、ゼラチン、
及び注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルである。このような剤
形は、アジュバント、例えば、保存料、水和剤、乳化剤、及び分散剤を含有する
こともできる。それらは、例えば、バクテリア保持フィルターを通しての濾過に
より、その組成物中に滅菌剤を取り込むことにより、上記組成物を照射すること
により、又はその組成物を加熱することにより、滅菌されることができる。それ
らは、使用前又は直前に、滅菌水、又はいくつかの他の滅菌の注射可能な媒質中
に溶解されることができる滅菌固体組成物の形態で製造されることもできる。
直腸又は膣投与のための組成物は、好ましくは、活性物質に加えて、賦形剤、
例えば、ココア・バター又は座剤ワックスを含有することができる坐剤である。
鼻又は舌下投与のための組成物も、本分野において周知の標準的な賦形剤を用い
て調製されることができる。本発明に従って使用されることができる医薬組成物
の製造のための慣用の技術は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences ，
1985中に記載されている。上記組成物は、慣用の形態、例えば、カプセル、錠
剤、エアロゾル、溶液、懸濁液又は表在局所的適用の形態で、現われることがで
きる。
使用される医薬担体又は希釈剤は、慣用の固体又は液体担体であることができ
る。固体担体の例は、ラクトース、白土、スクロース、サイクロデキストリン、
タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、カシア、ステアリン酸マグネシウム、ステ
アリン酸又はセルロースの低級アルキル・エステルである。液体担体の例は、シ
ロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオ
キシエチレン又は水である。
同様に、上記担体又は希釈剤は、本分野において知られたいずれかの持続性放
出材料、例えば、グリセリル・モノステアレート又はグリセリル・ジステアレー
トを、単独で又はワックスと混合されて、含むことができる。
固体担体が経口投与のために使用される場合、その調製物は、錠剤化され、粉
末又はペレット形態で硬質ゼラチン・カプセル内に入れられ、又はそれは、トロ
ーチ又は菱形剤(lozenge)の形態にあることができる。固体担体の量は、広く変
化するであろうが、通常、約25mg〜約１ｇであろう。液体担体が使用される場合
、その調製物は、シロップ、エマルジョン、軟質ゼラチン、カプセル又は滅菌さ
れた注射可能な液体、例えば、水性又は非水性の液体懸濁液又は溶液の形態にあ
ることができる。
慣用の錠剤化技術により調製されることができる典型的な錠剤は、以下のもの
を含有することができる：
コ ア：
活性化合物（遊離の化合物又はその塩として） 100mg
コロイド状２酸化珪素(Aerosil) 1.5mg
セルロース(微晶質)(Avicel) 70mg
修飾セルロース・ガム（Ac−Di−Sol） 7.5mg
ステアリン酸マグネシウム
コーティング：
HPMC 約９mg
*Mywacett9-40 T 約0.9mg
*フィルム・コーティングのために可塑剤として使用するアシル化モノグリ
セリド
鼻投与のためには、その調製物は、エアロゾル適用のために、液体担体、特に
水性担体中に溶解され又は懸濁された成長ホルモン分泌促進薬を含有することが
できる。この担体は、添加物、例えば、可溶化剤、例えば、プロピレン・グリコ
ール、界面活性剤、吸収増強剤、例えば、レシチン（ホスファチジルコリン）又
はサイクロデキストリン、又は保存料、例えば、パラベンを含有することができ
る。
本発明を、以下の実施例によりさらに説明するが、これらは、いかなる方法に
おいても、請求される本発明の範囲を限定することを意図されるものではない。
実施例実施例１
以下の式：
をもつ５−アミノ−５メチル−ヘキセ−２−ノン酸Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−
１−（メチル((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）
−２−フェニルエチル)カルバモイル）−２−（ナフタレン−２−イル）エチル)
アミドの合成
３−ヒドロキシ−１，１−ジメチルプロピルカルバミン酸tert−ブチル・エス
テル：
工程Ａ： ０℃において、エチル・クロロホルメート（1.10ml，11.5mmol）を
、テトラヒドロフラン（10ml）中の３−tert−ブトキシカルボニルアミノ−３−
メチルブタノン酸（2.50ｇ，11.5mmol）とトリエチルアミン（1.92ml，13.8mmol
）の溶液に滴下した。この溶液を０℃で40分間撹拌した。形成された沈澱を濾別
し、そしてテトラヒドロフラン（20ml）で洗浄した。この液を直ちに０℃に冷却
した。テトラヒドロフラン（14.4ml，28.8mmol）中のホウ水素化リチウムの２Ｍ
溶液を滴下した。この溶液を２時間０℃で撹拌し、そして次に４時間の期間にわ
たり室温まで暖めた。それを０℃に冷却した。メタノール（5ml）を注意して添
加した。１Ｎ塩化水素酸(100ml)を添加した。この溶液を酸酢エチル（２×100ml
，３×50ml）で抽出した。この併合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム(100ml)で
洗浄し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させた。この溶媒を真空中で除去した
。この粗生成物を、酢酸エチル／ヘプタン１：２を用いたシリカ(110g)上でクロ
マトグラフィーにかけて３−ヒドロキシ−１，１−ジメチルプロピルカルバミン
酸tert−ブチル・エステルを得た。
３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタナール：
工程Ｂ： DMSO（1.22ml，17.2mmol）を、ジクロロメタン（15ml）中−78℃に
おいて塩化オキサリル(1.1ml，12.9mmol)の溶液に添加した。この混合物を−78
℃で１５分間撹拌した。ジクロロメタン（10ml）中の３−ヒドロキシ−１，１−
ジメチルプロピルカルバミン酸tert−ブチル・エステル(1.75ｇ，8.6mmol)の溶
液を15分間の期間にわたり滴下した。この溶液をさらに15分間−78℃で撹拌した
。トリエチルアミン(6.0ml，43mmol)を添加した。この溶液を５分間−78℃で撹
拌し、そして二次に室温まで暖めた。この溶液をジクロロメタン(100ml)で希釈
し、そして１Ｎ塩酸(100ml)で抽出した。この水相をジクロロメタン（50ml）で
抽出した。併合有機層を飽和炭酸水素ナトリウム(100ml)で洗浄し、そして硫酸
マグネシウム上で乾燥させた。この溶媒を真空中で除去した。粗生成物を酢酸エ
チル／ヘプタン（１：３）を用いたシリカ(140g)上のカラム・クロマトグラフィ
ーにより精製して、1.10gの３−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メ
チルブタナールを得た。
エチル（２Ｅ）−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−５−メチルヘキ
セ−２−ノエート：
工程Ｃ： トリエチルホスホノ酢酸(1.96ml，9.8mmol)をテトラヒドロフラン
（30ml）中に溶解した。カリウムtert−ブトキシド(1.10g，9.8mmol)を添加した
。この溶液を室温で40分間撹拌した。テトラヒドロフラン（6ml）中の３−（ter
t−ブトキシカルボニルアミノ）−３−メチルブタナール(1.10ｇ，5.5mmol)の溶
液を添加した。この溶液を室温で75分間撹拌した。それを、酢酸エチル(100ml)
と１Ｎ塩化水素酸(100ml)で希釈した。相を分離させた。この水相を酢酸エチル
（２×50ml）で抽出した。この併合有機相を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（60ml
）で洗浄し、そして硫酸マグネシウム上で乾燥させた。この溶媒を真空中で除去
した。この粗生成物を、酢酸エチル／ヘプタン（１：４）を用いたシリカ（90g
）上でのカラム・クロマトグラフィーにより精製して、エチル（２Ｅ）−５−（
tert−ブトキシカルボニルアミノ）−５−メチルヘキセ−２−ノエートを得た。 （２Ｅ）−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−５−メチルヘキセ−２
−ノン酸：
工程Ｄ： エチル（２Ｅ）−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−５−
メチルヘキセ−２−ノエート(1.233ｇ，4.54mmol)をジオキサン（20ml）中に溶
解した。水酸化リチウム(0.120g，5.00mmol）を固体として添加した。水（10ml
）を、清澄な溶液が達成されるまで、添加した。この溶液を16時間室温で撹拌し
た。この溶液
を水（70ml）で希釈し、そしてtert−ブチル・メチル・エーテル（２×100ml）
で抽出した。この水相を１Ｎ硫酸水素ナトリウム（pH＝１）で酸性にし、そして
tert−ブチルメチルエーテル（３×70ml）で抽出した。有機相を併合し、そして
硫酸マグネシウム上で乾燥させた。この溶媒を真空中で除去して、1.05gの（２
Ｅ）−５−（tert−ブトキシカルボニルアミノ）−５−メチルヘキセ−２−ノン
酸を得た。粗生成物をさらなる合成のために使用した。
Ｎ−メチル−Ｎ−((Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)
カルバミン酸tert−ブチル・エステル： 工程Ｅ： Ｎ−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチル−Ｄ−フェニルアラニ
ン(1.22ｇ，4.4mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール・ヒドレート(0.59g
，4.4mmol)、及び１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジ
イミド・ヒドロクロリド(0.88ｇ，4.6mmol)を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
（25ml）中に溶解し、そして30分間撹拌した。メチルアミン(メタノール中40％
溶液0.51ｇ，6.6mmol)を添加し、そしてその混合物を一夜撹拌した。塩化メチレ
ン（80ml）と水(100ml)を添加し、そして相を分離させた。この有機相を水酸化
ナトリウム（20ml，１Ｎ）、硫酸水素ナトリウム（50ml，10％）、及び水（50ml
）で洗浄した。この有機
相を乾燥させ（硫酸マグネシウム）、そして溶媒を真空中で除去して、1.39gの
Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル
）カルバミン酸tert−ブチル・エステルを得た。
（Ｒ）−Ｎ−メチル−２−メチルアミノ−３−フェニルプロピオンアミド：
工程Ｆ： Ｎ−メチル−Ｎ−((Ｒ)１−（メチルカルバモイル）−２−フェニ
ルエチル)カルバミン酸tert−ブチル・エステル（1.39g，7.23mmol）を、トリフ
ルオロ酢酸（5ml）と塩化メチレン（10ml）の混合物中に溶解させ、そして45分
間撹拌した。揮発成分を真空中で除去し、そしてその残渣を酢酸エチル(100ml)
と水(100ml)の混合物と共に撹拌した。炭酸水素ナトリウム（50ml、飽和）を添
加し、そして相を分離させた。この有機相を乾燥させ（硫酸マグネシウム）、そ
して溶媒を真空中で除去して、330mgの（Ｒ）−Ｎ−メチル−２−メチルアミノ
−３−フェニルプロピオンアミドを得た。
Ｎ−メチル−Ｎ｛（１Ｒ）−１−（Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチル
カルバモイル）−２−フェニルエチル)カルバモイル）−２−（２−ナフチル）
エチル｝カルバミン酸tert−ブチル・エステル：
工程Ｇ： （Ｒ）−tert−ブトキシカルボニル−Ｎ−メチルアミノ−３−（２
−ナフチル）プロピオン酸(548mg，1.66mmol)を塩化メチレン（5ml）中に溶解さ
せ；１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール(227mg，1.66mmol)をＮ，Ｎ
−ジメチルホルムアミド（２ml）と共に添加した。１−エチル−３−（３−ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド・ヒドロクロリド(351mg，1.83mmol)を添
加し、そしてその溶液を15分間撹拌した。塩化メチレン（4ml）とジイソプロピ
ルエチルアミン（0.28ml，1.66mmol）中に溶解された（Ｒ）−Ｎ−メチル−２−
メチルアミノ−３−フェニルプロピオンアミド(320mg，1.66mmol)を添加し、そ
してその混合物を一夜撹拌した。塩化メチレン（50ml）を添加し、そしてその有
機相を、水（100ml）、硫酸水素ナトリウム（50ml，５％）、及び炭酸水素ナト
リウム（50ml、飽和）で洗浄した。この有機相を乾燥させ（硫酸マグネシウム）
、そして溶媒を真空中で除去した。この残渣を、酢酸エチル／塩化メチレン（１
：１）を使用してクロマトグラフィーに
かけて（シリカ、２×45cm）、604mgのＮ−メチル−Ｎ−｛（１Ｒ）−１−（Ｎ
−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)カ
ルバモイル）−２−（２−ナフチル）エチル｝カルバミン酸tert−ブチル・エス
テルを得た。
（２Ｒ）−Ｎ−メチル−２−メチルアミノ−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチルカル
バモイル）−２−フェニルエチル)−３−（２−ナフチル）プロピオンアミド：
工程Ｈ： Ｎ−メチル−Ｎ−｛（１Ｒ）−１−（Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−
１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)カルバモイル）−２−（２
−ナフチル）エチル｝カルバミン酸tert−ブチル・エステル(600mg，1．19mmol)
を、10分間トリフルオロ酢酸／塩化メチレン（１：１，５ml）中で撹拌し、そし
て揮発成分を真空中で除去した。この残渣をジエチルエーテル（２×５ml）を用
いてストリッピングし、そしてメタノール（２ml）中に溶解させ、そして炭酸水
素ナトリウム（10ml）と酢酸エチル（15ml）と混合した。この有機相を分離させ
、そして乾燥させて（硫酸マグネシウム
）、420mgの（２Ｒ）−Ｎ−メチル−２−メチルアミノ−Ｎ−((1Ｒ)−１−（メ
チルカルバモイル）−２−フェニルエチル)−３−（２−ナフチル）プロピオン
アミドを得た。
((３Ｅ)−１，１−ジメチル−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（Ｎ−メ
チル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)カルバ
モイル）−２−（２−ナフチル）エチル)カルバモイル）ブチ−３−ニル)カルバ
ミン酸tert−ブチル・エステル：
工程Ｉ： （２Ｅ）−５−（tert−ブチルオキシカルボニルアミノ）−５−メ
チルヘキセ−２−ノン酸(200mg，0.82mmol)、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾ
トリアゾール(112mg，0.82mmol)、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−カルボジイミド・ヒドロクロリド(173mg，0.90mmol)を、塩化メチ
レン（10ml）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（1ml）の混合物中に溶解させ、
そして15分間撹拌した。塩化メチレン（５ml）とジイソプロピルエ
チルアミン（0.14ml）中に溶解されたＮ−メチル−２−メチルアミノ−Ｎ−((１
Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニルエチル)−３−（２−ナフチル
）プロピオンアミド(332mg，0.82mmol)を添加し、そしてその混合物を窒素雰囲
気下で一夜撹拌した。この混合物を塩化メチレン（50ml）で希釈し、水（50ml）
、炭酸水素ナトリウム（30ml、飽和）、及び硫酸水素ナトリウム（30ml，５％）
で洗浄した。これらの相を分離させ、そして有機相を硫酸マグネシウムで乾燥さ
せ、そして真空中で蒸発させた。この残渣をクロマトグラフィー（シリカ、２×
40cm）にかけて、450mgの((３Ｅ)−１，１−ジメチル−４−（Ｎ−メチル−Ｎ−
((１Ｒ)−１−（Ｎ−メチル−Ｎ−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−
フェニルエチル）カルバモイル)−２−（２−ナフチル）エチル)カルバモイル）
ブチ−３−ニル)−カルバミン酸tert−ブチル・エステルを得た。
工程Ｊ： ((３Ｅ)−１，１−ジメチル−４−（メチル−(１Ｒ）−１−（メチ
ル−((１Ｒ)−１−（メチルカルバモイル）−２−フェニル−エチル)カルバモイ
ル）−２−（２−ナフチル）エチル)カルバモイル）ブチ−３−ニル)カルバミン
酸tert−ブチル・エステル(403mg，0.63mmol)を、トリフルオロ酢酸（４ml）と
塩化メチレン（４ml）の混合物中で10分間撹拌した。揮発成分を真空中で除去し
、そして粗生成物を、溶離液として塩化メチレン、エタノール、及びアンモニア
（水中25％）の混合物（80／18／２）を使用したシリカ(400g)上のクロマトグラ
フィーにかけた。単離された生
成物を、２回、酢酸エチル中の３Ｍ塩化水素酸中に溶解させ、そして蒸発させ、
次に、塩化メチレン中に再溶解させ、蒸発させて、１40mgの表題の化合物を得た
。 HPLC：Ｒt＝29.02分（方法Ａ１）
ESMS：ｍ／ｚ＝529(100％)(Ｍ＋Ｈ)+ 実施例２
ラットとウサギとの比較においてマイクロ豚（micropig）動物モデルは、内分
泌学的サイクル及び骨折修復プロセスに関してヒトに対する優れた類似性を示す
。骨治癒は、従来の試験における１回の破壊機械的テストとは反対に、インビボ
における初期のねじれ剛性計測により連続的にモニターされた。ミニ豚(mini pigs)：
30匹の雌のYucatanミニ豚を、Charles River（Saint Aubin l'es Elbeuf，Fra
nce）から得た。麻酔及び外科手順：
外科手順に先立って、上記ブタを、鎮静のために、筋中に、Stre
カテーテル・システムであって、外頸静脈中への従来の手術において行われてい
たもの（以下参照）を使用して、上記ブタに６〜８mlのThiopentalを静脈内に注
射した（５mg／kg）。これらのブタに、7.5〜7.0mm直径のチューブを使用して、
挿管した。挿管後、ブタを人工呼吸に供し、そして一般的知覚麻酔を、静脈内Th
ｉopental及びFentanylにより維持した。
脛骨を、蛍光計測により検査した。4.5mmのチタニウムSchanz's
スクリューのための挿入部位は、その脛骨の中央にある計画された骨切り術の３
cm近位と遠位を定めた。腓骨（fidula）を５mm片の除去により骨切り術を施した
。固定装置のフレームを、ミッド−シャフト軸に整列させて固定した。この脛骨
を水平方向に骨切断した。軸−整列の記録及び証明を、Ｘ−線分析により行った
。計 測
ねじれ剛性(Torsional stiffness)：
改造された外環固定装置及び剛性計測装置を、治癒期間の間、ねじれ剛性を計
測するために設計した。この固定装置は、計測の間、骨のトルク動き（軸方向）
を許容する。この計測装置は、ロード・セル（HBM，EF7A H3/57K/1251bs，Hotti
nger Baldwin Messtechnik）及び交換要素(HBM，WSF/20mm，ID-NO.1094/1，Hott
inger Baldwin Messtechnik）であって、計測値増幅装置(HBM，MGC，Hottinger
Baldwin Messtechnik)及びパーソナル・コンピューター(HBM，MGC，Hottinger B
aldwin Messtechnik)に接続されているものから成る。
最初の計測は、術後直後、０日目に行われた。伸延期間の後（15日目）に、剛
性計測を、15，19，21，24、及び28日目に行った。計測のために、上記動物を鎮
静させ、そして支持されていない肢−ハンギング（limb-hanging）のためのハン
モック内で分離した。保護カバーと固定装置ボルトを取り除き、そして荷重変位
ユニットを、上記固定装置に並べて置いた。４サイクルの動きを適用し、そして
得られた力及び変位を記録した。網状骨を破壊しないように、計測を15〜20°の
角度に制限した。再骨折させないように、最後の日の計測を約10Nmのトルクに制
限した。
慣用のＸ−線：
伸延された肢のＸ−線を、整列と固定をコントロールするために
各テスト日に得た（剛性計測と同じ日に行った）。焦点とＸ−線フィルムとの間
の距離は115cmであった。２つの異なる露出設定を行った：１）66KV及び2.5mAs
；２）55KV及び5.0mAs。これらのフィルムを画像分析装置(Pace-System Diagnos
tix 2048)を介してデジタル化し、データをWORM上に保存した。骨密度の評価は
、Diagnostix 2048及び内部ソフトウェアを用いて行われた。第２の分析を、マ
ッキントッシュ−PC上のNIH−イメージ・ソフトウェアを使用して行った。Ｘ−
線の標準化を、10チャンバー・アルミニウム・ファントムと６チャンバー・ヒド
ロキシアパタイト・ファントムを使用して確立した。
デジタルＸ−線：
古典的なＸ−線方法を、Siemens Digiscan診断薬を使用して繰り返した。超音波：
改良された超音波伝達のためのゲル・パッドをもつ7.5MHz変換器(PICKERCS950
0)を、音伝達の距離、皮質骨のグレースケール密度、伸延組織、及び伸延ギャッ
プの幅の計測のために使用した。これらの計測は、剛性計測が行われた日と同じ
日に行われた。各動物について、変換ホルダーを、伸延ギャップに対して上記変
換器の反復可能な位置を保証するように形状化した。検査当り３つの画像を撮影
した。この画像をマッキントッシュ・コンピューター上のNIH−ソフトウェアを
使用して評価した。
血液サンプル：
時間当り４つのサンプルを、基礎GHレベルを計測するためにブタの耳の静脈を
通した中心静脈カテーテル挿入から６時間の間、採取した。ポート−カテーテル
・システムを各ブタ内に移植し、これにより外頸静脈を貫通させた。14の血液サ
ンプルを各ブタから採取し
、サンプル１を、GH又は偽薬の投与前に採取した。サンプル２を０日目に採取し
た（最初の外科手術、及びGH−又は偽薬適用の第１日目）。その後のサンプルを
、殺されるまで剛性計測を行った日と同じ日に採取した。血液サンプルの採取を
、２mlの血液を捨て、次に5.5ml血清の３サンプルを、そして5.5mlヘパリン血液
の２サンプルを採取して行った。これらのサンプルを遠心分離した(3,000rpmで1
0分間)。IGFI、遊離IGFI,IGF結合性タンパク質、合計及び遊離T3及びT4、及び骨
特異的アルカリ性・ホスファターゼを計測した。
QCTスキャン：
全ての動物を、コンピューター断層撮影法（CT）を使用して調べた。右肢のCT
スキャンを、３mmの間隔において３mmのスキャンにより水平方向に採取した。固
体ヒドロキシアパタイト・ファントムが含まれた。
機械的ねじれテスト：
殺生後、右肢と左肢を解剖した。それらの関節のまわりの柔組織を取り除き、
そして脛骨の端を、Beracryl内に鋳型した。これらの構造物を、材料試験機(Zwi
ck，Ulm，Germany)内に入れ、そしてねじれモーメントを加えた。得られた変位
及びねじれモーメントを記録した。テストを、破壊まで１分当り30°の速度で行
った。このシステムは、20％のトルクにおいて上記テストを自動的に終了させた
。
組織学：
殺生前30日目に、カルセイン・グリーン(calcein green)を、15mg／kg体重の
投与量で、静脈内投与した。剤検前20日目に、25mg／kg体重の投与量におけるテ
トラサイクリンを静脈内投与した。殺生前５日目に、キシレンオレンジ（90mg／
kg体重）を静脈内投与した
。両脛骨、腰椎体、骨盤セクション、及びその左の第９肋骨を収穫した。最終剛
性計測の後、完全な構造完全性の保存のためにDellingに従う骨の固定(１部のホ
ルマリン溶液37％（無酸）及び９部のホスフェート−緩衝溶液pH7.0)を行った。
その後、正確な削り装置を用いた３mmと２mmの切片の調製（前部：脛骨、腰椎体
；乗直：脛骨、骨盤肋骨）を行った。この２mm試料を、アルコールとTechnovit
7200 VLCの組合せを使用して浸潤させた。Technovit 7200 VLC内への埋め込みは
、２つの段階：１）低く軽い強度、温度40℃；２）高く軽い強度、６時間続く全
重合、から成っていた。この試料を、蛍光顕微鏡のために好適な、30μｍの厚さ
にまで染色しないで削った。
上記３mm切片を、Kulzer Technovit 9100メチルメタクリレート内に埋め込み
、そして37℃で乾燥ストーブ内で重合させた。中央−前面の５μｍ−セクション
を作った。通常の組織学的調製方法の後に、以下の染色を適用した。Goldner ト
リクローム：この染色は、類骨(osteoid)と鉱物化した骨様構造との区別のため
に、そしてさらに、硬骨細胞（ハウシップ凹窩を備え、１以上の核を含む大きく
、不規則な形状、泡様であり、そして僅かに異染性の細胞質をもつ）、骨芽細胞
（類骨に接し、単核、好塩基性、立方形であり、優性なゴルジ体をもつ）と骨細
胞（細管により取り囲まれ、小さく、骨内にある）の区別のために好適である。
サフラニン−Ｏと組合されたVon Kossa染色：鉱物化された骨（暗褐色／黒）、
軟骨（暗赤色）と結合組織（明赤色）の間のはっきりした対比が達成される。ア
ストラ−ブルー（Astra-blue）：この染色は、活性な軟骨の骨形成のためのヒン
トとしての石灰化した軟骨（暗青色）の区別を可能にする。シリウス・レッド（
Sirius red）：好適な分極とラムダ・フィルターは、網状骨と層板骨の間の差異
を示す。
骨と仮骨の静及び動力学的パラメーターを、画像分析装置(Leitz Quantimed)
を用いて計測した。興味をもった部位の顕微鏡画像を、３−素子−CCDカメラ（S
ony）によりデジタル化し、そして画像分析ワープステーションの画像プロセッ
サーのRAM内にロードした。画像のオーバー−シェーディング（over-shading）
、正規化、強化、及びバイナリー化の半自動的処理は、興味のある構造の単離と
、この構造の画素ベースの計測のための次の段階を提供した。ミニ豚における組換え成長ホルモンを用いた仮骨伸延の加速：
成長ホルモンで処理されたミニ豚群の最終的な骨ねじれ強度を、対照群に対し
て検査した。
方 法：
30匹の成熟した雌Yucatanミニ豚を、２つの処置群に等しく分配した試験群内
のミニ豚は、組換えブタ成長ホルモン（γ−pGH:100μｇ／kg）の毎日の注射を
受容し、対照群内のミニ豚は、偽薬として塩化ナトリウムを受容した。左脛骨と
腓骨を骨切り術に供し、そして外部固定装置を用いて安定化させた。全荷重が許
容された。脚を10日間２mm／日において毎日２回伸延し、そして次に10日間併合
に供した。殺生後、ねじれモーメントを上記伸延に適用し、そして材料試験装置
内の及び最大ねじれモーメントにある対側脛骨を測定した。４匹の動物を、骨感
染又は外科手順の失敗に因り試験から排除し、そして２匹の動物のデーターが試
験装置の失敗により失われた。ｔ−検定を、処理群間の最大ねじれモーメントに
おける差異を決定するために使用した。
結 果：
GH−処置ミニ豚群の脛骨は、偽薬のものよりも131％高い最大ねじれモーメン
トを示した(GH：19.5±7.8Nm、偽薬8.45±5.4 Nm,Ｐ＝0.001)。無傷の対側脛骨
との比較において、GH群と対照群は、
64±22％と26±12.9％の最大ねじれモーメントに達した(Ｐ＜0.001)。
討 議：
上記結果は、GHが、殺生時に骨再生ねじれ強さを増加させることを証明してい
る。我々の知る限り、それは、大きな動物モデルにおいて同族GHを使用した最初
の研究であり、一方、他の研究は、ラット又はウサギにおいてウシ又はヒトのGH
を使用していた。本研究において、我々は、他の研究の標準化されていない骨折
創生に反して、比較的標準化された骨形成の方法である、伸延骨形成由来の骨再
生を調べた。これらの結果は、同族（homologous）GHの全身投与が、仮骨伸延に
おける骨再生の併合又は結合(consolidation)を加速することを証明している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，
ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ
Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ
，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，
ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ
Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ
，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，
ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ
(72)発明者 ビンドハーゲン，ヘニンク
ドイツ連邦共和国，デー―30159 ハノー
ファー，アルムスバルトシュトラーセ 23