【発明の詳細な説明】
製紙における改変澱粉の代用品
発明の分野
本発明は、製紙の分野に関する。詳細には、本発明は、製紙における改変澱粉
に代わる供給源を提供する。
発明の背景
澱粉が成分として用いられる製紙において３つの主要な段階が存在する。第１
段階は、セルロース線維が澱粉とスラリー中で混合され、そしてスラリーがワイ
ヤーベルト上へ狭い開口部を通って押し出される「ウェットエンド(wet end)」
である。水は、形成されたシートがベルトの長さを移動する際に、迅速に除去さ
れる。代表的には、ベルト上の５〜15メートルの距離の後、シート自体の重量を
支え得るように、シートはそれから十分な水分を除去されている。シートは、多
数のホイルおよびロールを通って移動し、ここでさらに水が除去される。これは
約11％の水分まで乾燥される。
澱粉を含む製紙の第２段階は、「糊づけ(sizing)工程」である。ここで、紙は
糊づけプレスを通過し、ここで澱粉スラリーがシートに塗布される。シートは、
再び一連のホイルおよびロールを通過する。シートはローラーで乾燥され、そし
て最終産物としてプレス機から取り外され得る。
第３工程は、紙を澱粉と熱可塑性分子との混合物でコーティングすることを含
む。特定のラインについては、これは糊づけ工程の後に生じる。新生のロールが
また取り出され得、そしてコーティングのために別のプレス機上へ再び取り付け
られ得る。代表的なコーティングデバイスは紙の幅を移動する２つの刃を有する
。これらの刃は、コーティング材料を２つのローリングドラムに塗布する。紙は
、ドラムとコーティング材料（澱粉および熱可塑性成分を含む）との間を通過し
、紙の上のドラムから離れる。紙がドラムから離れた後、紙は多くの乾燥機を通
過する。紙が乾燥したら、２つのドラム（１つは、高密度の線維で作られ、そし
て
もう一方は加熱された鋼鉄ドラムである）を含む「ソフトカレンダー(soft cale
ndar)」上を通過する。２つのドラムと加熱された鋼鉄ドラムとの間を紙が通過
することによって、十分に加熱してコーティング剤混合物の熱可塑性成分を融解
し、紙上にしっかりした光沢仕上げを提供する。
上記のプロセスにおいて代表的に使用されるセルロースの木材パルプ線維は天
然において陰イオン性である。陽イオン性澱粉の「ウェットエンド」スラリーへ
の添加は、塩架橋を介するパルプ線維の架橋により接着剤として作用する。従っ
て、架橋した重合体ネットワークが作製され、これは澱粉およびセルロース線維
を含む。代表的には、「ウェットエンド」において用いられるカチオン性澱粉は
、３価アミンまたは４価アミンである。これらのアミン基は、湿式粉砕器(wet m
iller)により澱粉に添加される。
表面の糊づけ用の澱粉は、シートが「ウェットエンド」から離れた後にシート
に対し強度および滑らかな仕上げの両方を与えるために使用さる。そのような澱
粉はまた、種々のコーティングを受け入れるようにシートを調製する。より安価
なグレードの紙の製造において、および繊維板の製造においては、糊づけ用澱粉
は非改変トウモロコシ澱粉として単純に使用される。高いグレードの紙について
は、化学的に改変された澱粉が使用される。これは、紙への滑らかで一様な高い
質の表面の塗布のために重要である。
澱粉は、劣化、すなわち、別のゼラチン様澱粉スラリーにおいて高次構造（ヘ
リックスおよび結晶化の両方）を再形成する傾向がある。高品質の紙上での劣化
した澱粉の析出は、紙上に局部的な不一致を生じ、そしてそれは容認できない。
さらに、糊づけプレス機中の劣化した澱粉は、装置を清浄するためにラインを止
めることを必要とし得る。
糊づけの塗布のために最も頻繁に使用される澱粉は、例えばヒドロキシエチル
澱粉のような共有結合した中性の添加物を有する澱粉である。これは、湿式粉砕
プラントで単離された後、エチレンオキシドと澱粉との反応により調製される。
ヒドロキシエチル（または類似の）添加物の機能は、その化学的性質とは無関係
である；むしろ、それは立体障害を提供するように作用し、それによって高次構
造の形成を阻害する。この立体障害は、劣化を減少させるために重要である。添
加物により与えられる周期的な隆起は、劣化を導く高次構造の形成を崩壊する。
速度は、製紙において最も重要な事項である。プレス速度を制限することによ
って、澱粉を均一にする。プレスは、しばしばその全能力の速度より下で行われ
る。この適用に依存して、澱粉スラリーは３〜15％（通常は５〜６％）の間の固
体である。固体の増加は、製造されている紙シートから取り除かれるべき水の量
の減少を必然的に生じる。このことは、プレス機を高速で作動させることを可能
にする。
ヒドロキシエチル化澱粉はまた、温度の低下または濃度の増加に伴って、高次
構造を形成する。紙の表面での高次構造の形成が必須である。シートへの塗布の
後、澱粉はこれらの高次構造のいくらかを再形成し、そして構造的強度を与え、
インクおよび色素の受け入れを促進する均一な表面を作製する。しかし、高次構
造は、スラリーにでも塗布デバイスについても形成するべきではない。なぜなら
、これは、劣化した澱粉を清浄するために生産ラインを停止する必要があるから
である。
ヒドロキシエチル基の機能は、劣化が生じる時の澱粉の温度をより低くし、そ
して／またはその濃度を上昇させることである。処理ラインはすでに澱粉スラリ
ーの特定の温度について最適化されているので、劣化の傾向の減少は、スラリー
中のより高い炭水化物含量を可能にする。
コーティングプロセスにおいて紙シートに塗布される混合物は、ヒドロキシメ
チル化澱粉および熱可塑性分子を含む。使用される最も一般的な熱可塑性分子は
、スチレンブタジエンのようなラテックスである。ヒドロキシエチル澱粉の機能
は、上記のとおりである。熱可塑性分子の機能は、紙の上に高級な光沢仕上げを
形成することである。これは、インクおよび色素を取り込む増大した能力を生じ
、そして一般的には印刷シートの分解性を改善する。
上記に基づいて、製紙において、改変澱粉と機能的に類似である改変された澱
粉代用物の必要性が存在する。さらに、劣化の傾向がより少ない改変澱粉の代用
物を提供する必要がある。さらに、現在の方法より早く、そしてプレス機がそれ
らの全能力のスピードにより近く作動することが可能である、紙の製造の方法を
提供する必要がある。さらに、環境に優しく、そして化学的処理を必要とする投
入材料を含まない紙を製造する方法を提供する必要がある。
従って、本発明の目的は、製紙において使用される場合、劣化の傾向が少ない
改変澱粉の代用物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、現存の方法より迅速であり、そしてより効率的な紙
を製造する方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、澱粉が必要とする高価な化学的改変を必要としない
、製紙における澱粉の代用物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、現存の方法より環境に優しい紙を製造するための方
法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、製紙の間のコーティング工程において現在使用され
ている熱可塑性分子の代用物を提供することである。
発明の要旨
本発明は、製紙において改変澱粉および／またはラテックスの代用物として使
用され得るグルカンを提供する。本発明のグルカンは、Streptococcus mutans種
のグルコシルトランスフェラーゼＢ（「GTF B」）酵素により産生され、そして
製紙において現在使用されている改変澱粉と機能的に類似である。本発明のグル
カンはまた、製紙のコーティング工程において現在使用されている熱可塑性分子
に対して類似の物理的特性を示す。
本発明はまた、生物学的に産生される投入材料である、本発明のグルカンを利
用する製紙の方法を提供する。従って、本方法は、化学的排液を産生する投入材
料を必要とする現在の方法より対費用効果が高く、そして環境に優しい。
発明の詳細な説明
本明細書中で使用される場合、「グルカン」は、α(1→3)、α(1→6)である結
合、および分枝α(1→3,6)を有するグルコースポリマーを意味する。
本明細書中で使用される場合、「アミロプラスト」は、植物貯蔵組織中の澱粉
蓄積細胞小器官を意味する。
本明細書中で使用される場合、「液胞」は、液胞膜により制限される細胞性区
画を意味する。
Streptococcus mutansは、口腔内に内在し、歯のエナメル質にコロニーを形成
する種である。例えば、Kuramitsu，「Characterization of Extracellular Glu
cosyl Transferase Activity of Streptococcus-mutans.」Infect ．Immun.;第12
(4)巻;738-749頁;(1975);およびYamashitaら，「Role of the Streptococcus-Mu
tans-gtf Genes in Caries Induction in the Specific-Pathogen-Free Rat Mod
el」Infect ．Immun.;第61(9)巻;3811-3817頁;(1993)を参照のこと；共に、本明
細書中にその全体が参考として援用される。Streptococcus mutans種は、食用ス
クロースを利用して種々の細胞外グルカンを作製するグルコシルトランスフェラ
ーゼＢ(「GTF B」)酵素を分泌する。例えば、Kametakaら、「Purification and
characterization of Glucosyltransferase from Streptococcus-mutans OMZ176
with Chromatofocusing,」Microbios;第51(206)巻;29-36頁;(1978)を参照のこ
と；本明細書中に参考として援用される。
可溶性グルカンおよび不溶性グルカンの両方が合成され、原因であるタンパク
質が単離され、そして特徴付けられている。例えば、Aokiら，「Cloning of a S
treptococcus-mutans Glucosyltransferase Gene Coding for Insoluble Glucan
Synthesis．Infect. Immun.;第53(3)巻;587-594頁;(1986);Shimamuraら，「Ide
ntification of Amino Acid Residues in Streptococcus Mutans Glucosyltrans
ferases Influencing the Structure of the Glucan Produced,」J. Bacteriol.
第176(16)巻;4845-50頁;(1994)；および、Kametakaら;「Purification and Char
acterization of Glucosyltransferase from Streptococcus-:mutans OMZ176 wi
th Chromatofocusing,」Microbios;第51(206)巻;29-36頁;(1987)を参照のこと;
全ては本明細書中にその全体が参考として援用される。
タンパク質は大きく（約155kDa)、そしてスクロースのグリコシル部分の、α(
1→3)結合およびα(1→6)結合を介するアクセプターグルカンへの基の転移を触
媒する。例えば、Wenhamら，「Regulation of Glucosyl Transferase and Fruct
osyl Transferase Synthesis by Continuous Cultures of Streptococcus-mutan
s,」J. Gen. Microbiol.;第114巻(第１部);117-124頁;(1979)；Fuら，「Maltode
xtrin Acceptor Reactions of Streptococcus-mutans 6715 glucosyltransf
erases,」Carbohydr ．Res.;第217;巻;210-211頁;(1991);およびBhattacharjeeら
，「Formation of Alpha-(1→6)，Alpha-(1→3)，and Alpha(1→2)Glycosidic L
inkages by Dextransucrase from Streptococcus Sanguis in Acceptor-Depende
nt Reactions,」Carbohydr ．Res.;第242巻;191-201;(1993)を参照のこと；全て
は本明細書中にその全体が参考として援用される。
グルカン合成に関連する遺伝子が単離され、そして配列決定されている。Shim
amuraら、（本明細書中上記に引用）および、Russelら，「Expression of a Gen
e for Glucan-binding Protein from Streptococcus-mutans in「Escherichia-c
oli」J. Gen. Microbiol ．;第131(2)巻;295-300頁;(1985)；Russellら，「Char
acterization of Glucosyltransferase Expressed from a Streptococcus-Sobri
nus Gene Cloned in Escherichia-coli,」J. Gen. Microbiol.;第133(4)巻;９35
-944頁；(1987);およびShirozaら，「Sequence Analysis of the GTF B Gene fr
om Streptococcus Mutans,」J. Bacteriol ．;第169(9)巻;4263-4270(1987)を参
照のこと;全ては本明細書中にその全体が参考として援用される。
GTF酵素により産生される種々のグルカンの構造は、任意の所定のグルカン中
に存在するα(1→3)、α(1→6)、およびα(1→3,6)分枝の割合に関して全く不均
一である。トウモロコシのような植物への天然に存在するGTF BおよびGTF B変異
タンパク質をコードする遺伝子の形質転換は、新規の組成物を有するアミロプラ
ストおよび液胞を提供する。
アミロプラストおよび／または液胞に取り込まれたGTF B酵素活性は、同じア
ミロプラストおよび／または液胞中での澱粉およびグルカンの蓄積を導く。劣化
は、澱粉分子の一部が相互作用し、そして続いて鎖間ヘリックスまたは鎖内ヘリ
ックスを形成する場合に生じる。澱粉とグルカンとの混合物において、へリック
ス形成を導く澱粉−澱粉相互作用の頻度が減少される。混合ポリマーから作製さ
れるペーストは、結果として劣化する傾向がより少ない。これは特に、形質転換
標的として予想される、澱粉の相対的な割合が減少した澱粉蓄積変異体において
真実である。
トランスジェニックGTF B酵素によりトウモロコシアミロプラストおよび／ま
たは液胞中で産生されるグルカンは、澱粉が必要とするような化学的改変を伴わ
ずに紙の処理において機能し得る。結果的に、ポリマー溶液は、変化した流体学
的特性を有し、そして澱粉と比べて劣化する傾向がより少ない。グルカンは分枝
状であり、そして不規則であり、そして同程度かまたは優れた効力を有する代用
改変澱粉であり得る。これらは、澱粉必要とするようないかなる高価な化学的改
変も必要としない。コーティング塗布について、本発明のグルカンは上記の利点
に加え、熱可塑性の特性を示す。
本発明によるグルカンの産生において有用な野生型GTFおよびその変異体は、
以下に提供される。以下のコードが使用される：
アミノ酸 １文字記号
アラニン Ａ
アスパラギン Ｎ
アスパラギン酸 Ｄ
グルタミン Ｑ
グルタミン酸 Ｅ
イソロイシン Ｉ
リジン Ｋ
トレオニン Ｔ
チロシン Ｙ
バリン Ｖ
本発明のグルカンを産生するために使用した変異体GTF B酵素の同定に使用し
た命名法は、以下のようである：
数字は、ポリペプチド鎖中のアミノ酸の位置をいう；第１の文字は野生型酵素に
おけるアミノ酸をいう；第２の文字は変異酵素におけるアミノ酸をいう；および
複数の変異を有する酵素は、/により分離されたそれぞれの変異を有している。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
好ましくは、I448V;D457N;D567T;K1014T;D457N/D567T;D457N/D571K;D567T/D571K
;D567T/D571K/K1014T;I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;およびY169VY170
A/Y171Aからなる群より選択される。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
より好ましくは、I448V;K1014T;D567T/D571K/K1014T;I448V/D457N/D567T/D57IK/
K779Q/K1014T;およびY169A/Y170A/Y171Aからなる群より選択される。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
さらにより好ましくは、K1014T;I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;および
Y169A/Y170A/Y171Aからなる群より選択される。
紙のコーティングのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、
最も好ましくは、I448V/D457N/D567T/D571K/K779Q/K1014T;またはY169A/Y170A/Y
171Aである。
紙の糊づけのためのグルカンの産生に使用されるｓ変異体GTF B酵素は、好ま
しくは、I448V;D457N;D567T;K779Q;K1014T;D457N/D567T;D457N/D571K;D567T/D57
1K;およびD567T/D571K/K1014Tからなる群より選択される。
紙の糊づけのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、より好
ましくは、I448V;D457N;K779Q;D567T/D571K;およびD567T/D571K/K1014Tからなる
群より選択される。
紙の糊づけのためのグルカンの産生に使用される変異体GTF B酵素は、最も好
ましくは、I448Vである。
本発明のグルカンは、好ましくはトランスジェニックのトウモロコシ、ジャガ
イモ、キャッサバ、サツマイモ、ライムギ、オオムギ、コムギ、サトウモロコシ
、カラスムギ、キビ、ライコムギ、サトウキビおよびイネにおいて産生される。
より好ましくは、本発明のグルカンは、トウモロコシ、ジャガイモ、サトウキビ
、キャッサバまたはサツマイモにおいて産生される。さらにより好ましくは、本
発明のグルカンは、トウモロコシまたはジャガイモにおいて産生される。最も好
ましくは、本発明のグルカンはトウモロコシにおいて産生される。
本発明の非常に好ましい実施態様において、澱粉生合成を欠損したトウモロコ
シ株が、変異体GTF B遺伝子で形質転換される。そのような株は、天然に存在す
るトウモロコシ変異体(すなわち、sh2、bt2、bt1)か、または野生型トウモロコ
シと比較した場合、胚乳中に低い量の澱粉を蓄積するように操作されたトランス
f the ADP-glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Potatoes Leads to Suga
r-Storing Tubers and Influences Tuber Formation and Expression of Tuber
Storage Prote in Genes,」The EMBO Journal;第11(4)巻;1229-1238頁;(1992);
およびCreech，「Carbohydrate Synthesis in Maize.」Advances in Agronomy;
第20巻;275-322頁;(1968)を参照のこと；両方が本明細書中にそれらの全体が参
考として援用される。
本発明のグルカンの産生は、当該分野で周知である形質転換の方法に従って行
われ、従って本発明の一部を構成しない。本発明の化合物は、転写および翻訳さ
れる場合、所望のグルカンを産生するGTF酵素を生じる合成的遺伝子を含む発現
カセットの挿入により合成される。所望の配列の植物発現のための適切な調節配
列を提供するこのような空の発現カセットもまた周知であり、そして合成遺伝子
についてのヌクレオチド配列（RNAまたはDNAのいずれか）は、標準的な教科書お
よび提供される参考文献を用いてタンパク質のアミノ酸配列に容易に由来し得る
。上記の合成遺伝子は、植物優先(plant-preffered)コドンを好ましく使用して
、所望のタンパク質の発現を増強する。
以下の記載は、本発明の組成物ならびにそれらの作成および使用の方法をさら
に例示する。しかし、当業者に同等に公知である他の方法もまた使用され得るこ
とが理解される。
本発明の酵素または変異体をコードする遺伝子は適切な発現カセット中に挿入
され得、そして植物種の細胞内へ導入され得る。従って、この方法の特に好まし
い実施態様は、植物において活性である転写プロモーター配列およびイニシエー
ター配列とともに適切なリーディングフレーム中にある変異体遺伝子または野生
型遺伝子をコードするDNA配列を植物のゲノム中へ挿入することを含む。調節配
列の制御下でのDNA配列の転写および翻訳は、植物の組織内で上昇した量のタン
パク質を提供するレベルでタンパク質配列の発現を生じる。
次いで、GTF Bタンパク質のアミノ酸の適切な配列をコードする合成DNA配列が
調製され得、そしてこの合成DNA配列は、適切な植物発現カセット中に挿入され
得る。
同様に、多数の植物の発現カセットおよびベクターが、当該分野で周知である
。用語「発現カセット」は、それらが適切なリーディングフレーム中の構造遺伝
子
に隣接する場合、植物細胞において機能するプロモーター配列、イニシエーショ
ン配列、および終結配列を含む制御配列の完全なセットを意味する。発現カセッ
トは、切断および任意の所望の構造遺伝子の挿入のために適切な制限部位の組合
せを、頻繁にかつ好ましく含む。クローン化遺伝子が、構造配列に対して正確な
リーディングフレームにおける開始コドンを有することが重要である。
本明細書中の用語「ベクター」は、宿主細胞中で複製が可能であり、そして外
来遺伝子を発現し得るDNA配列を意味する。代表的には、ベクターは、適切な酵
素の使用により予想される様式で切断され得る１つ以上の制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位を有する。このようなベクターは、好ましくは、抗生物質および除草
剤の耐性を与えるさらなる構造遺伝子配列を含むように構築され、これらは次い
で、形質転換細胞を同定および分離するためのマーカーとして役立つ。好ましい
マーカー／選択剤は、カナマイシン、クロロスルフロン(chlorosulfuron)、ホス
ホノトリシン(phosphonothricin)、ハイグロマイシン、およびメトトレキサート
を含む。ベクター中の外来の遺伝物質が機能的に発現される細胞は、ベクターに
より「形質転換」されており、そして「形質転換体」と呼ばれる。
特に好ましいベクターはプラスミドである。プラスミドは、細胞の染色体の一
部ではない環状２本鎖DNA分子を意味する。
上記に述べたように、目的の遺伝子をコードするゲノムDNAおよびcDNAの両方
が、本発明において使用され得る。目的の遺伝子はまた、部分的にcDNAクローン
から、および部分的にゲノムクローンから構築され得る。目的の遺伝子が単離さ
れている場合、宿主細胞中で遺伝子の効率的な発現を提供するのに必要な調節配
列を含む遺伝子構築物が作成される。本発明によれば、遺伝子構築物は、(a)目
的のタンパク質または形質をコードする遺伝子配列、(b)目的の構造遺伝子のい
ずれかの側に作動可能に連結された１つ以上の調節配列、を含む。代表的には、
調節配列は、プロモーターおよびターミネーターからなる群より選択される。調
節配列は、自己かまたは異種の供給源由来であり得る。
所望の制御配列に作動可能に連結された本発明の変異体の構造遺伝子を含む発
現カセットは、適切なクローニングベクターに連結され得る。一般的に、宿主細
胞と互換性がある種に由来する複製配列および制御配列を含むプラスミドベクタ
ーまたはウイルス（バクテリオファージ）ベクターが使用される。クローニング
ベクターは、代表的には複製開始点、ならびに形質転換宿主細胞において表現型
選択マーカーを提供し得る特定の遺伝子を有する。代表的には、抗生物質または
選択的除草剤に対して耐性を与える遺伝子が使用される。遺伝物質が標的細胞内
へ導入された後、首尾良く形質転換された細胞および／または細胞のコロニーは
、これらのマーカーに基づく選択により単離され得る。
代表的には、中間体宿主細胞が本発明の実行において使用されて、クローニン
グベクターのコピー数が増大される。コピー数の増加と共に、目的の遺伝子を含
むベクターは、所望の植物細胞内への導入のために有意な量にて単離され得る。
本発明の実施において使用され得る宿主細胞は、原核細胞（例えば、E．coli、S
．typhimuriumおよびSerratia marcescensのような細菌宿主を含む）を含む。酵
母または糸状菌のような真核生物の宿主もまた、本発明において使用され得る。
これらの宿主もまた微生物であるので、細菌内ではタンパク質の発現を引き起こ
さない植物プロモーターがそのベクターで使用されることを確認することが必須
である。
次いで、単離されたクローニングベクターは、細胞または組織培養において植
物発現カセットのDNA配列の少なくとも１つのコピーを外来DNAとして含む形質転
換植物細胞提供するために、単子葉植物または双子葉植物由来の細胞へのエレク
トロポレーション（プロトプラストにおいて）、レトロウイルス、照射、および
マイクロインジェクションを含む任意の適当な技術を使用して植物細胞内へ導入
される。公知の技術を用いて、プロトプラストは再生され得、そして細胞または
組織の培養物は、本発明によるタンパク質の遺伝子を保有しそして発現する全体
の稔性植物を形成するために再生され得る。従って、本発明の非常に好ましい実
施態様は、形質転換トウモロコシ植物であり、その細胞はGTF Bの変異体の発現
カセットのDNA配列の少なくとも１コピーを外来DNAとして含む。
本明細書中で提供される植物ベクターは、Agrobacterium tumefaciens中に取
り込まれ得、次いで主として双子葉種由来の感受性の植物細胞内にベクターを移
入するために使用され得ることもまた当業者に理解される。従って、本発明は、
Agrobacterium tumefaciens感受性双子葉植物中にGTF Bを導入するための方法を
提供し、ここで発現カセットは、Agrobacterium tumefaciensを細胞に感染させ
ることによって細胞に導入され、そのプラスミドは本発明の植物発現カセットを
含むように改変されている。
例えば、ジャガイモ植物はAgrobacterium tumefaciensを介して形質転換され
、本発明のグルカンを産生し得る。形質転換カセットは、パタチンプロモーター
、続いて、関連するGTF Bコード配列およびネオマイシンホスホトランスフェラ
ーゼポリアデニル化部位／ターミネーターを含む。例えば、Utsumiら、「Expres
sion and Accumulation for Normal and Modified Soybean Glycinins in Potat
o Tubers,」Plant Science;第102(2)巻;181-188頁;(1994)(Limerick)を参照のこ
と;本明細書中にこの全体が参考として援用される。トランスジェニックカセッ
トは、形質転換ベクター内に配置される。例えば、BIN19、またはその誘導体は
、Agrobacterium tumefaciensを介する形質転換の場合に有用である。例えば、V
isserら、「Transformation of Homozygous Diploid Potato with an Agrobacte
rium-tumefaciens Binary Vector System by Adventitious Shoot Regeneration
on Leaf and Stem Segments,」Plant Mol ．Biol.:第12(3)巻;329-338頁;(1989)
を参照のこと;本明細書中にこの全体が参考として援用される。
トウモロコシ形質転換ベクターについて、プロモーターは、発現が特異的であ
り、かつ胚乳細胞に限定される任意のプロモーターを含む。22 kDa zein、Opaqu
e2、gamma zeinおよびwaxyのいずれかをコードするものが含まれる。これらはGT
F B遺伝子内に至り、そして内在性ターミネーターまたは異種PINIIターミネータ
ーが続く。GTF Bタンパク質は、適切な移行配列を使用してトウモロコシ胚乳ア
ミロプラストへ指向される。アミロプラスト中に蓄積するために酵素をアミロプ
ラスト内へ指向することにおいて有用である移行配列は、リブロース２リン酸カ
ルボキシラーゼ小サブユニット、waxy、brittle-1、およびクロロフィルAB結合
タンパク質を含むが、これらに限定されない。移行配列は、プロモーターとGTF
Bコード配列との間に並列され、そして翻訳リーディングフレーム内にGTF B成分
と融合される。
液胞中に蓄積するために、酵素を液胞に指向することにおいて有用な移行配列
は当該分野で周知である。液胞ターゲッティングについては、例えばEbskampら
、
「Accumulation of Fructose Polymers in Transgenic Tobacco,」Bio/technol ogy
;第12巻，272-275頁;(1994)を参照のこと;本明細書中にこの全体が参考とし
て援用される。
トウモロコシの形質転換および再生については、例えばArmstrong,C.，「Rege
neration of Plants from Somatic Cell Cultures:Applications for in vitro
Genetic Manipulation,」The Maize Handbook;Freelingら編,663-671頁;(1994)
を参照のこと;本明細書中にこの全体が参考として援用される。
一旦所定の植物が形質転換されると、合成されたグルカンは、当業者に公知の
標準的方法により単離され得る。このようにしてトランスジェニック植物におい
て得られるグルカンは、改変澱粉の代わりに用いられ得、そして糊づけおよび／
またはコーティング工程において利用され得る。コーティング工程において有用
な処方物については、例えば、Heiserら，「Starch Formations,」Starch and S tarch Products in Paper Coating
;Kearneyら編，147-162頁;(1990);Tappi Pres
sを参照のこと;本明細書中にこの全体が参考として援用される。
糊づけおよびコーティングの両方において、本発明のグルカンは約４〜約15重
量％、より好ましくは、約５〜約12重量％、また好ましくは、約６〜約８重量％
の量において利用される。重量％は、100mlの溶液に対する分子のグラムとして
定義される。
本発明のグルカンは、澱粉および／もしくはラテックス分子を完全に置換する
ように使用されるか、または澱粉−グルカンもしくはラテックス-グルカンの混
合物が、スラリーにおいて使用される。糊づけ塗布において、グルカン：澱粉比
は、約10:90〜約100:0、より好ましくは約40:60〜約100:0、よりなお好ましくは
約60:40〜約100:0、最も好ましくは約100:0の範囲である。
コーティング塗布において、グルカン：澱粉比は、約10:90〜約100:0、より好
ましくは約40:60〜約100:0、よりなお好ましくは約60:40〜約100:0、最も好まし
くは約100:0にの範囲である。コーティング塗布において、グルカン：ラテック
ス比は、約10:90〜約100:0、より好ましくは約40:60〜約100:0、よりなお好まし
くは約60:40〜約100:0、最も好ましくは約100:0の範囲である。
本出願に引用された全ての出版物は、本発明に属する当業者の技術レベルを表
示する。全ての出版物は、各個別の出版物または特許出願が参考として援用され
るために特異的かつ個別に示されるように、同じ範囲で参考として本明細書中に
援用される。
上記の実施態様に対する改変は当業者の能力の範囲内であり、そしてこのよう
な改変は、以下の請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱しない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
A substitute for modified starch in papermaking.
Field of the invention
The present invention relates to the field of papermaking. Specifically, the present invention relates to modified starch in papermaking.
Provide an alternative source.
Background of the Invention
There are three main stages in papermaking where starch is used as a component. First
The step is to mix the cellulose fibers with the starch in a slurry, and
`` Wet end '' extruded through a narrow opening on the yabelt
It is. Water is quickly removed as the formed sheet travels the length of the belt.
It is. Typically, after a distance of 5 to 15 meters on the belt, the weight of the sheet itself is
The sheet has been dehydrated enough to support it. Sheets are many
It travels through a number of foils and rolls where more water is removed. this is
Dry to about 11% moisture.
The second stage of papermaking with starch is the "sizing process". Where the paper
It passes through a gluing press, where the starch slurry is applied to the sheet. The sheet is
Again pass through a series of foils and rolls. The sheet is dried on a roller and then
And can be removed from the press as a final product.
The third step involves coating the paper with a mixture of starch and thermoplastic molecules.
No. For certain lines, this occurs after the gluing step. The new roll
Can also be removed and remounted on another press for coating
Can be A typical coating device has two blades that move across the width of the paper
. These blades apply the coating material to two rolling drums. Paper is
, Passing between the drum and the coating material (including starch and thermoplastic components)
Move away from the drum on the paper. After the paper leaves the drum, it passes through many dryers.
Spend. Once the paper has dried, two drums (one made of high density fiber and
hand
The other is a heated steel drum) containing a soft cale (soft cale
ndar) ”. Paper passes between two drums and heated steel drum
Sufficient heating to melt the thermoplastic components of the coating mixture
And provide a firm gloss finish on the paper.
Cellulose wood pulp fibers typically used in the above process are
It is anionic in nature. To "wet end" slurry of cationic starch
The addition of acts as an adhesive by crosslinking the pulp fibers via salt crosslinking. Follow
Thus, a crosslinked polymer network is created, which comprises starch and cellulose fibers.
including. Typically, the cationic starch used in the "wet end" is
Or a trivalent amine or a tetravalent amine. These amine groups are used in wet mills (wet m
iller) to the starch.
The starch for surface gluing is applied after the sheet has left the "wet end".
Used to provide both strength and a smooth finish. Such lees
The flour also prepares the sheet to accept various coatings. Cheaper
Starches for the production of high grade paper and fiberboard
Is simply used as unmodified corn starch. About high grade paper
Uses chemically modified starch. It is smooth and uniform high on paper
It is important for quality surface applications.
The starch is degraded, ie, has a higher order structure (heavy) in another gelatinous starch slurry.
(Both ricks and crystallization). Deterioration on high quality paper
Precipitation of the resulting starch causes local inconsistencies on the paper, which is unacceptable.
In addition, degraded starch in the gluing press shuts down the line to clean the equipment.
May need to be turned on.
The starches most frequently used for gluing applications are, for example, hydroxyethyl
Starch with a covalently attached neutral additive such as starch. This is wet grinding
After being isolated in the plant, it is prepared by the reaction of ethylene oxide with starch.
The function of the hydroxyethyl (or similar) additive is independent of its chemical properties
Rather, it acts to provide steric hindrance, and thereby
Inhibits structure formation. This steric hindrance is important for reducing degradation. Attachment
The periodic bumps provided by the addendum disrupt the formation of higher order structures leading to degradation.
Speed is the most important factor in papermaking. By limiting the press speed
To make the starch uniform. Pressing is often performed below the speed of its full capacity
You. Depending on the application, the starch slurry may have a solids between 3-15% (usually 5-6%).
Body. The increase in solids is the amount of water that must be removed from the paper sheet being manufactured.
Inevitably occurs. This allows the press to operate at high speed
To
Hydroxyethylated starch also has higher order with decreasing temperature or increasing concentration.
Form the structure. The formation of higher-order structures on the surface of the paper is essential. Of the application to the sheet
Later, the starch reforms some of these higher-order structures and provides structural strength,
Create a uniform surface that facilitates ink and dye acceptance. However, higher-order
The structure should not be formed in the slurry nor in the application device. Because
Because this requires shutting down the production line to clean the degraded starch
It is.
The function of the hydroxyethyl group is to lower the temperature of the starch when degradation occurs,
And / or increase its concentration. Processing line is already starch slurry
Optimized for a specific temperature of the
Allows for a higher carbohydrate content in the medium.
The mixture applied to the paper sheet in the coating process is a hydroxyme
Contains chilled starch and thermoplastic molecules. The most common thermoplastic molecules used are
And latexes such as styrene butadiene. Function of hydroxyethyl starch
Is as described above. The function of the thermoplastic molecule is to create a high-grade glossy finish on paper.
It is to form. This results in increased ability to take up inks and dyes
And generally improves the degradability of the printed sheet.
Based on the above, in papermaking modified starches that are functionally similar to the modified starches
There is a need for a powder substitute. Further, substitution of modified starch with less tendency for deterioration
You need to provide things. In addition, faster than current methods, and the press
A method of paper production that can operate closer to their full capacity speed.
Must be provided. In addition, investments that are environmentally friendly and require chemical treatment
There is a need to provide a method of making paper that does not contain input material.
Accordingly, an object of the present invention is to reduce the tendency for deterioration when used in papermaking.
It is to provide a substitute for the modified starch.
It is a further object of the present invention to provide a faster and more efficient paper than existing methods.
Is to provide a method for producing the same.
A further object of the present invention is that it does not require the expensive chemical modifications required by starch
, To provide a substitute for starch in papermaking.
A further object of the present invention is to provide a method for producing greener paper than existing methods.
Is to provide the law.
A further object of the present invention is that it is currently used in the coating process during papermaking.
Is to provide a substitute for certain thermoplastic molecules.
Summary of the Invention
The invention is used as a substitute for modified starch and / or latex in papermaking.
Provide a glucan that can be used. The glucan of the present invention is a Streptococcus mutans species
Produced by the enzyme glucosyltransferase B ("GTF B"), and
It is functionally similar to the modified starch currently used in papermaking. Guru of the present invention
Cans are also thermoplastic molecules currently used in the paper coating process.
Exhibit similar physical properties to
The invention also utilizes the glucans of the invention, which are biologically produced input materials.
The papermaking method used is provided. Therefore, the present method is a method of producing a chemical waste
Cost-effective and environmentally friendly than current methods that require a fee.
Detailed description of the invention
As used herein, “glucan” is a combination of α (1 → 3) and α (1 → 6).
And a glucose polymer having a branch α (1 → 3,6).
As used herein, "amyloplast" refers to starch in plant storage tissue.
Means accumulating organelles.
As used herein, "vacuum" is a cellular compartment restricted by the vacuolar membrane.
Means painting.
Streptococcus mutans are endogenous in the oral cavity and colonize tooth enamel
It is a seed to do. For example, Kuramitsu, "Characterization of Extracellular Glu
cosyl Transferase Activity of Streptococcus-mutans.Infect . Immun.; Twelfth
(4); 738-749; (1975); and Yamashita et al., "Role of the Streptococcus-Mu
tans-gtf Genes in Caries Induction in the Specific-Pathogen-Free Rat Mod
el "Infect . Immun.61 (9); 3811-3817; (1993);
In its entirety, it is incorporated by reference in its entirety. Streptococcus mutans species are
Glucosyltransferase that produces various extracellular glucans using sucrose
Secretes the enzyme B ("GTF B"). For example, Kametaka et al., "Purification and
characterization of Glucosyltransferase from Streptococcus-mutans OMZ176
with Chromatofocusing, "Microbios; 51 (206); 29-36; (1978)
And; incorporated herein by reference.
Both soluble and insoluble glucans are synthesized and the causative protein
The quality has been isolated and characterized. For example, Aoki et al., "Cloning of a S
treptococcus-mutans Glucosyltransferase Gene Coding for Insoluble Glucan
Synthesis.Infect. Immun.53 (3); 587-594; (1986); Shimamura et al., "Ide
ntification of Amino Acid Residues in Streptococcus Mutans Glucosyltrans
ferases Influencing the Structure of the Glucan Produced, "J. Bacteriol.
176 (16); 4845-50; (1994); and Kametaka et al .; Purification and Char.
acterization of Glucosyltransferase from Streptococcus-: mutans OMZ176 wi
th Chromatofocusing, "Microbios; 51 (206); 29-36; (1987);
All are incorporated herein by reference in their entirety.
The protein is large (approximately 155 kDa) and the glycosyl moiety of sucrose, α (
Transfer of groups to the acceptor glucan via the 1 → 3) and α (1 → 6) bonds.
Mediate. For example, Wenham et al., "Regulation of Glucosyl Transferase and Fruct
osyl Transferase Synthesis by Continuous Cultures of Streptococcus-mutan
s, "J. Gen. Microbiol.Vol. 114 (Part 1); 117-124; (1979); Fu et al., "Maltode.
xtrin Acceptor Reactions of Streptococcus-mutans 6715 glucosyltransf
erases, "Carbohydr . Res .;217; Vol. 210- 211; (1991); and Bhattacharjee et al.
, "Formation of Alpha- (1 → 6), Alpha- (1 → 3), and Alpha (1 → 2) Glycosidic L
inkages by Dextransucrase from Streptococcus Sanguis in Acceptor-Depende
nt Reactions, "Carbohydr . Res.; 242; 191-201; (1993); all.
Is hereby incorporated by reference in its entirety.
Genes involved in glucan synthesis have been isolated and sequenced. Shim
amura et al. (cited above herein) and Russel et al., "Expression of a Gen.
e for Glucan-binding Protein from Streptococcus-mutans in `` Escherichia-c
oli "J. Gen. Microbiol .131 (2); 295-300; (1985); Russell et al., "Char.
acterization of Glucosyltransferase Expressed from a Streptococcus-Sobri
nus Gene Cloned in Escherichia-coli, "J. Gen. Microbiol.; 133 (4); 935
-944; (1987); and Shiroza et al., "Sequence Analysis of the GTF B Gene fr
omStreptococcus Mutans, "J. Bacteriol .; Volume 169 (9); 4263-4270 (1987)
See; all are incorporated herein by reference in their entirety.
The structure of various glucans produced by the GTF enzyme can be found in any given glucan.
Are completely unequal with respect to the proportion of α (1 → 3), α (1 → 6), and α (1 → 3,6) branches present in
One. Naturally occurring GTF B and GTF B mutations in plants such as maize
Transformation of a gene encoding a protein can be performed using amylopras having a novel composition.
Provide strikes and vacuoles.
GTF B enzyme activity incorporated into amyloplasts and / or vacuoles is the same.
Leads to the accumulation of starch and glucan in myloplasts and / or vacuoles. deterioration
Indicates that some of the starch molecules interact and are subsequently interchain or intrachain
It occurs when forming a box. Helix in a mixture of starch and glucan
The frequency of starch-starch interactions leading to water formation is reduced. Made from mixed polymer
The resulting paste is less prone to degradation as a result. This is especially true for transformation
In a starch accumulation mutant with a reduced relative proportion of starch expected as a target
Is true.
Maize corn amyloplast and / or maize by transgenic GTF B enzyme
Glucans produced in the vacuole or in vacuoles are subject to chemical modifications as required by starch.
It can work in paper processing without. As a result, polymer solutions have changed fluidology
And has a lower tendency to degrade than starch. Glucan branches
And irregular, and substitutes of comparable or superior potency
It may be a modified starch. These are any expensive chemical modifications that require starch.
No change is needed. For coating application, the glucan of the present invention has the above advantages.
In addition, it exhibits thermoplastic properties.
Wild-type GTFs and mutants thereof useful in the production of glucans according to the present invention include:
Provided below. The following code is used:
amino acid One letter symbol
Alanine A
Asparagine N
Aspartic acid D
Glutamine Q
Glutamic acid E
Isoleucine I
Lysine K
Threonine T
Tyrosine Y
Valine V
Used to identify the mutant GTF B enzyme used to produce the glucan of the invention.
The nomenclature used is as follows:
The numbers refer to amino acid positions in the polypeptide chain; the first letter refers to the wild-type enzyme.
The second letter refers to the amino acid in the mutant enzyme; and
An enzyme having a plurality of mutations has each mutation separated by /.
The mutant GTF B enzyme used in the production of glucan for paper coating is
Preferably, I448V; D457N; D567T; K1014T; D457N / D567T; D457N / D571K; D567T / D571K
; D567T / D571K / K1014T; I448V / D457N / D567T / D571K / K779Q / K1014T; and Y169VY170
Selected from the group consisting of A / Y171A.
The mutant GTF B enzyme used in the production of glucan for paper coating is
More preferably, I448V; K1014T; D567T / D571K / K1014T; I448V / D457N / D567T / D57IK /
K779Q / K1014T; and Y169A / Y170A / Y171A.
The mutant GTF B enzyme used in the production of glucan for paper coating is
Even more preferably, K1014T; I448V / D457N / D567T / D571K / K779Q / K1014T; and
It is selected from the group consisting of Y169A / Y170A / Y171A.
The mutant GTF B enzyme used in the production of glucan for paper coating is
Most preferably, I448V / D457N / D567T / D571K / K779Q / K1014T; or Y169A / Y170A / Y
171A.
The s-mutant GTF B enzyme used in the production of glucan for paper sizing is preferred.
Or I448V; D457N; D567T; K779Q; K1014T; D457N / D567T; D457N / D571K; D567T / D57
1K; and D567T / D571K / K1014T.
Mutant GTF B enzymes used to produce glucan for paper sizing are more favorable.
Preferably consists of I448V; D457N; K779Q; D567T / D571K; and D567T / D571K / K1014T
Selected from group.
Mutant GTF B enzymes used in the production of glucan for paper sizing are the most preferred.
More preferably, it is I448V.
The glucan of the present invention is preferably a transgenic corn, potato
Potato, cassava, sweet potato, rye, barley, wheat, sweet sorghum
, Oats, millet, triticale, sugarcane and rice.
More preferably, the glucans of the invention are corn, potato, sugarcane
, Cassava or sweet potato. Even more preferably, the book
The glucans of the invention are produced in corn or potato. Most favorable
Preferably, the glucan of the present invention is produced in corn.
In a highly preferred embodiment of the present invention, a corn deficient in starch biosynthesis
A strain is transformed with the mutant GTF B gene. Such strains are naturally occurring
Corn mutants (i.e., shTwo, BtTwo, Bt1) Or wild type corn
Trans engineered to accumulate lower amounts of starch in endosperm when compared to
f the ADP-glucose Pyrophosphorylase in Transgenic Potatoes Leads to Suga
r-Storing Tubers and Influences Tuber Formation and Expression of Tuber
Storage Prote in Genes, "The EMBO Journal; 11 (4); 1229-1238; (1992);
And Creech, "Carbohydrate Synthesis in Maize."Advances in Agronomy;
20; 275-322; (1968); both are incorporated herein in their entirety.
It is used as an idea.
The glucan of the present invention is produced according to a transformation method well known in the art.
Therefore, they do not form a part of the present invention. The compounds of the present invention can be transcribed and translated.
Expression, including synthetic genes that result in GTF enzymes that produce the desired glucan
It is synthesized by inserting a cassette. Proper regulatory arrangements for plant expression of desired sequences
Such empty expression cassettes providing sequences are also well known, and synthetic genes
The nucleotide sequence (either RNA or DNA) for can be found in standard textbooks and
And easily derived from the amino acid sequence of the protein using the provided references
. The synthetic gene described above preferably uses plant-preffered codons.
Enhance the expression of the desired protein.
The following description further describes the compositions of the present invention and methods of making and using them.
An example is shown below. However, other methods equally known to those skilled in the art may also be used.
Is understood.
The gene encoding the enzyme or variant of the invention is inserted into an appropriate expression cassette
And can be introduced into cells of a plant species. Therefore, especially preferred of this method
A preferred embodiment is a transcription promoter sequence and an initiator that are active in a plant.
Mutant or wild-type gene in the appropriate reading frame with the
Inserting the DNA sequence encoding the type gene into the genome of the plant. Adjustment
Transcription and translation of DNA sequences under sequence control results in increased amounts of proteins in plant tissues.
This results in expression of the protein sequence at a level that provides protein.
Then, a synthetic DNA sequence encoding the appropriate sequence of amino acids in the GTF B protein
And the synthetic DNA sequence can be inserted into a suitable plant expression cassette.
obtain.
Similarly, numerous plant expression cassettes and vectors are well known in the art.
. The term "expression cassette" refers to the structural inheritance in the appropriate reading frame.
Child
Promoter sequence that functions in plant cells,
And the complete set of control sequences, including termination sequences and termination sequences. Expression cassette
The combination of restriction sites appropriate for cleavage and insertion of any desired structural gene
Frequent and preferably. Make sure that the cloned gene is
It is important to have a start codon in the reading frame.
The term "vector" herein is capable of replicating in a host cell and
Means a DNA sequence capable of expressing the next gene. Typically, the vector is a suitable yeast
One or more restriction endonucleases that can be cleaved in a manner expected by the use of
It has a zeta recognition site. Such vectors are preferably antibiotics and herbicides.
It is constructed to include additional structural gene sequences that confer drug resistance,
And serves as a marker for identifying and isolating transformed cells. preferable
Markers / selective agents include kanamycin, chlorosulfuron, phos
Phonothricin, hygromycin, and methotrexate
including. Cells in which foreign genetic material in the vector is functionally expressed
It has been more "transformed" and is referred to as a "transformant".
Particularly preferred vectors are plasmids. A plasmid is one of the chromosomes of a cell
Refers to a circular double stranded DNA molecule that is not a part.
As mentioned above, both genomic DNA and cDNA encoding the gene of interest
May be used in the present invention. The gene of interest is also partially
And partially from genomic clones. The gene of interest is isolated
If necessary, the regulatory elements necessary to provide efficient expression of the gene in the host cell.
A genetic construct containing the sequence is created. According to the present invention, the gene construct comprises (a)
A gene sequence encoding a target protein or trait;
One or more regulatory sequences operably linked to either side. Typically,
The regulatory sequence is selected from the group consisting of a promoter and a terminator. Key
The knot sequences can be from autologous or heterologous sources.
A gene comprising the structural gene of the mutant of the present invention operably linked to a desired control sequence.
The current cassette can be ligated into a suitable cloning vector. Generally, host
Plasmid vector containing replication and control sequences from a cell-compatible species
Or viral (bacteriophage) vectors are used. Cloning
Vectors typically have an origin of replication, as well as a phenotype in the transformed host cell.
It has a specific gene that can provide a selectable marker. Typically, an antibiotic or
Genes that confer resistance to selective herbicides are used. Genetic material in target cells
After being introduced into, successfully transformed cells and / or colonies of cells
, Can be isolated by selection based on these markers.
Typically, intermediate host cells are used in the practice of the present invention to
The copy number of the vector is increased. As the copy number increases,
Such vectors can be isolated in significant amounts for introduction into the desired plant cells.
Host cells that can be used in the practice of the present invention include prokaryotic cells (eg, E. coli, S.
. typhimurium and bacterial hosts such as Serratia marcescens). Yeast
Eukaryotic hosts, such as mother or filamentous fungi, can also be used in the present invention.
Since these hosts are also microorganisms, they cause protein expression in bacteria.
It is essential to ensure that no plant promoter is used in that vector
It is.
The isolated cloning vector is then implanted in cell or tissue culture.
Containing at least one copy of the DNA sequence of the product expression cassette as foreign DNA
Electing cells from monocot or dicot plants to provide transformed plant cells
Troporation (in protoplasts), retrovirus, irradiation, and
Transfer into plant cells using any suitable technique, including microinjection
Is done. Using known techniques, protoplasts can be regenerated and
The culture of the tissue contains the entire gene carrying and expressing the gene of the protein according to the invention.
Can be regenerated to form fertile plants. Thus, a highly preferred implementation of the present invention.
An embodiment is a transformed corn plant, wherein the cells express a mutant of GTF B.
At least one copy of the DNA sequence of the cassette is included as foreign DNA.
The plant vectors provided herein are incorporated into Agrobacterium tumefaciens.
And then transfer the vector into sensitive plant cells, mainly from dicotyledonous species.
It will also be appreciated by those skilled in the art that Therefore, the present invention
A method for introducing GTF B into Agrobacterium tumefaciens-sensitive dicots
Provided, where the expression cassette infects cells with Agrobacterium tumefaciens.
By introducing the plant expression cassette of the present invention into the cell.
It has been modified to include:
For example, potato plants are transformed via Agrobacterium tumefaciens.
Can produce the glucan of the present invention. The transformation cassette is a patatin promoter
Followed by the relevant GTF B coding sequence and neomycin phosphotransferase
Includes a protease polyadenylation site / terminator. For example, Utsumi et al., "Expres
sion and Accumulation for Normal and Modified Soybean Glycinins in Potat
o Tubers, "Plant Science; 102 (2); 181-188; (1994) (Limerick).
And; this is hereby incorporated by reference in its entirety. Transgenic cassette
Is placed in a transformation vector. For example, BIN19, or a derivative thereof,
And Agrobacterium tumefaciens. For example, V
isser et al., `` Transformation of Homozygous Diploid Potato with an Agrobacte
rium-tumefaciens Binary Vector System by Adventitious Shoot Regeneration
on Leaf and Stem Segments, "Plant Mol . Biol.: 12 (3); 329-338; (1989)
, Which is hereby incorporated by reference in its entirety.
For corn transformation vectors, the promoter is specific for expression.
And any promoter restricted to endosperm cells. 22 kDa zein, Opaqu
Includes those encoding any of e2, gamma zein and waxy. These are GT
Leads to the FB gene and is either an endogenous terminator or a heterologous PINII terminator
-Followed. The GTF B protein is derived from corn endosperm
Pointed to Miloplast. Amylop for enzymes to accumulate in amyloplasts
The translocation sequence useful in directing into the last is ribulose diphosphate
Ruboxylase small subunit, waxy, brittle-1, and chlorophyll AB binding
Including but not limited to proteins. The translocation sequence consists of a promoter and GTF
GTF B component aligned with B coding sequence and in translation reading frame
Fused with
Useful translocation sequences in directing enzymes to the vacuole for accumulation in the vacuole
Are well known in the art. For vacuolar targeting, see, for example, Ebskamp et al.
,
`` Accumulation of Fructose Polymers in Transgenic Tobacco, ''Bio / technol ogy
12: 272-275; (1994); incorporated herein by reference in its entirety.
Used.
For transformation and regeneration of corn, see, for example, Armstrong, C., "Rege
neration of Plants from Somatic Cell Cultures: Applications for in vitro
Genetic Manipulation, "The Maize Handbook; Freeling et al., Pp. 663-671; (1994)
, Which is hereby incorporated by reference in its entirety.
Once a given plant has been transformed, the synthesized glucan is known to those skilled in the art.
It can be isolated by standard methods. In this way the transgenic plant smells
The resulting glucan can be used in place of the modified starch, and glue and / or
Or it can be utilized in a coating process. Useful in coating process
See, for example, Heiser et al., "Starch Formations,"Starch and S tarch Products in Paper Coating
; Kearney et al., Pp. 147-162; (1990); Tappi Pres
s; hereby incorporated by reference in its entirety.
In both gluing and coating, the glucans of the present invention have about 4 to about 15 plies.
%, More preferably from about 5 to about 12% by weight, and also preferably from about 6 to about 8% by weight.
Used in quantities. Wt% is given as grams of molecules per 100 ml of solution
Defined.
The glucan of the present invention completely replaces starch and / or latex molecules
Or a mixture of starch-glucan or latex-glucan
The compound is used in the slurry. In glue application, glucan: starch ratio
Is from about 10:90 to about 100: 0, more preferably from about 40:60 to about 100: 0, even more preferably
It ranges from about 60:40 to about 100: 0, most preferably about 100: 0.
In coating applications, the glucan: starch ratio may be from about 10:90 to about 100: 0, more preferably.
Preferably about 40:60 to about 100: 0, more preferably about 60:40 to about 100: 0, most preferably
In the range of about 100: 0. In coating application, glucan: Latec
The ratio is from about 10:90 to about 100: 0, more preferably from about 40:60 to about 100: 0, even more preferred.
In the range of about 60:40 to about 100: 0, most preferably about 100: 0.
All publications cited in this application are indicative of the levels of those skilled in the art to which the invention pertains.
Show. All publications are referenced by their respective publications or patent applications.
To the same extent as reference herein, as specifically and individually indicated to
Incorporated.
Modifications to the above embodiments are within the ability of those skilled in the art, and
Such modifications do not depart from the scope of the invention as set forth in the following claims.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｓ 3/02 Ｃ１２Ｓ 3/02
Ｄ２１Ｈ 19/10 Ｄ２１Ｈ 19/10 Ｂ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ
Ｓ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ
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Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI Theme coat ゛ (Reference) C12S 3/02 C12S 3/02 D21H 19/10 D21H 19/10 B (81) Designated countries EP (AT, BE) , CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN) , ML, MR, NE, SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, SZ, UG), EA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM) , AL, AM, AT, AU, AZ, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, GE, HU, IS IS, JP, KE, KG, KP, KR, KZ, LK, LR, LS, LT, LU, LV, MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, PL, PT, RO, RU , SD, SE, SG, SI, SK, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, UZ, VN