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JP2001504689A - 多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト - Google Patents

多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト

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JP2001504689A JP51975498A JP51975498A JP2001504689A JP 2001504689 A JP2001504689 A JP 2001504689A JP 51975498 A JP51975498 A JP 51975498A JP 51975498 A JP51975498 A JP 51975498A JP 2001504689 A JP2001504689 A JP 2001504689A
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スタテン，ニコラス，アール．
ストリーター，フィリップ，アール．
マイナリイ，ジョン，シー．
ミンスター，ナンシイ，アイ．
ウオルフ，スーザン，エル．
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ジー．ディー．サール アンド カンパニー
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Abstract

(57)【要約】 新規の多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質、多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質をコードするＤＮＡ、多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質の製造方法、および多機能性キメラ造血受容体アゴニストタンパク質の使用方法が開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト 本特許願は、１９９６年１０月２５日提出の合衆国暫定特許願連続第６０／０ ２９，６２９号明細書のタイトル３５、合衆国コード§１１９の下で優先枢を主 張するものである。 発明の技術分野 本発明は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストに関する。これら多機能 性キメラ造血レセプターアゴニストは、キメラ分子の各個成分の一つ以上の活性 を保有し、また改善された造血細胞刺激活性および（または）改善された活性プ ロフイルを示すこともあり、そして後者は個々の造血成長因子と関連した望まし くない、生物活性の減少を包含し、かつ（または）物理的性質の向上（溶解性、 安定性および能率の増大を含む）を示すこともある。 発明の背景 骨髄細胞の分化および（または）増殖を刺激するコロニー刺激因子（ＣＳＦ） は、それらが造血幹細胞誘導細胞のレベル降下を回復させる治療の可能性を有す るという理由から大いに関心を集めた。ヒトおよびネズミ両系におけるＣＳＦは 、それらの活性に従って同定され、識別された。例えば、顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ− ＣＳＦ）およびマクロフアージーＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）は、それぞれ好中性の顆 粒球とマクロフアージのコロニーの容器内形成を促進するのに対し、ＧＭ−ＣＳ Ｆおよびインターロイキン−３（ＩＬ−３）は、より広い活性をもち、マクロフ アージ、好中性および好酸性両方の顆粒球コロニーの形成を促進する。ＩＬ−３ はまたマスト、巨核球ならびに純粋および混合赤芽球コロニーの形成を促進する 。 Ｕ．Ｓ．４，８７７，７２９およびＵ．Ｓ．４，９５９，４５５は、テナガザ ルＩＬ−３ｃＤＮＡおよび推論上のヒトＩＬ−３ＤＮＡ配列ならびにそれらが暗 号を指定しているタンパク質のアミノ酸配列を開示している。そこに開示された ｈＩＬ−３はタンパク質のアミノ酸配列における８位にプロリンでなくセリンを もつ。 国際特許願（ＰＣＴ）ＷＯ８８／００５９８は、テナガザルおよびヒト様のＩ Ｌ−３を開示している。ｈＩＬ−３は、ｓｅｒ8−＞ｐｒｏ8置換を含む。ｃｙｓ をＳｅｒにより置換することによってジスルフィド橋をこわし、そしてグリコシ ル化部位の一つ以上のアミノ酸を置換することが示唆されている。 Ｕ．Ｓ．４，８１０，６４：３は、ヒトＧ−ＣＳＦをコード化するＤＮＡ配列 を開示している。 ＷＯ９１／０２７５４は、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−３とがらなる融合タンパク質 を開示している。このタンパク質はＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３単独と比べて増 大した生物活性をもつ。多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの成分として 、非グリコシル化ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦ類縁タンパク質を開示している。 ＷＯ９２／０４４５５は、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ− １１ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦからなる群から選ばれるリンホカインに融合したＩ Ｌ−３から構成された融合タンパク質を開示している。 ＷＯ９５／２１１９７およびＷＯ９５／２１２５４は、広い多機能性造血特性 をもつ有能な融合タンパク質を開示している。 ＧＢ２，２８５，４４６は、ｃ−ｍｐｌリガンド（トロンボポイエチン）およ び種々な形のトロンボポイエチンに関するものであり、これらは、巨核球および 巨核球前駆体の複製、分化および成熟に影響することが示され、血小板減少症の 治療に使用できるかも知れない。 ＥＰ６７５，２０１Ａは、ｃ−ｍｐｌリガンド（巨核球成長および発達因子） （ＭＧＤＦ）、ｃ−ｍｐｌリガンドの対立遺伝子変異体、およびポリエチレング コールといった水溶性重合体に付着させたｃ−ｍｐｌリガンドに関する。 ＷＯ９５／２１９２０は、ネズミおよびヒトのｃ−ｍｐｌリガンドおよびその ポリペプチド断片を提供している。このタンパク質は、生体内および生体外治療 において血小板産生の促進に有用である。 Ｌｉｎ、Ｆ−Ｋ．による米国特許第４，７０３，００８号明細書は、エリトロ ポイエチンをコード化するｃＤＮＡ配列、エリトロポイエチンの調製法と使用を 開示している。 ＷＯ９１／０５８６７は、ＥＰＯ（Ａｓｎ69)、ＥＰＯ（Ａｓｎ125， Ｓｅｒ127）、ＥＰＯ（Ｔｈｒ125）、およびＥＰＯ（Ｐｒｏ124，Ｔｈｒ125）と いったヒトエリトロポイエチンより多数の炭水化物付着部位をもつヒトエリトロ ポイエチン類縁体を開示している。 ＷＯ９４／２４１６０は、高い活性、特定的には２０、４９、７３、１４０、 １４３、１４６、１４７および１５４位のアミノ酸置換を有するエリトロポイエ チンムレインを開示している。 ＷＯ９４／２８３９１は、天然ｆｌｔ３リガンドタンパク質配列およびｆｌｔ ３リガンドをコード化するｃＤＮＡ配列、ｃＤＮＡを移入した宿主細胞にｆｌｔ ３リガンドを発現させる方法ならびに造血障害をもつ患者をｆｌｔ３リガンドに より治療する方法を開示している。 米国特許第５，５５４，５１２号明細書は、単離タンパク質としてのヒトｆｌ ｔ３リガンド、ｆｌｔ３リガンドをコード化するＤＮＡ、ｆｌｔ３リガンドをコ ード化するｃＤＮＡを移入した宿主細胞、およびｆｌｔ３リガンドで患者を治療 する方法を指向している。 ＷＯ９４／２６８９１は、２９個のアミノ酸を挿入した単離体およびその断片 を含めて、哺乳動物のｆｌｔ３リガンドを提供する。タンパク質アミノ酸配列の再配列 進化におけるＤＮＡ配列の再配列は、タンパク質の構造と機能の多様性をつく り出す上で重要な役割を演じている。遺伝子複製とエキソンの再編成は、とりわ け基本的突然変異の割合は低いので、迅速に多様性をつくり出し、それによって 生物に競合的優位性を与える重要な機構を提供する（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ １：１９１−２００，１９９２）。 組換えＤＮＡ法の出現は、タンパク質の折りたたみ、構造および機能に及ぼす 配列転位の効果の研究を可能にした。新配列をつくり出す際に用いられる方法は 、タンパク質のアミノ酸配列の線状再編成により関係づけられる、天然のタンパ ク質対のそれと類似する(Cunningham，等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．76: 3218-3222，1979；Teather&Erfle，J．Bacteriol．172：3837-3841，1990;Schim ming等，Eur．J．Biochem．204：13-19，1992；Yamiuchi and Minamikawa，FEBS Lett．260:127-130,1991；MacGregor等，FEBS Lett．378: 263-266)。タンパク質に対するこの型の再配列の最初の容器内適用がＧｏｌｄｅ ｎｂｅｒｇとＣｒｅｉｇｈｔｏｎにより記述された（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１ ６５：４０７−４１３，１９８３）。新しいＮ−末端は元の配列の内部部位（切 断点）のところで選び、新しい配列は、最初のＣ末端のところか、その付近にあ るアミノ酸に達するまで、切断点から最初の順序と同じアミノ酸順序をもつ。こ の時点で、新しい配列は、直接的に、あるいは追加の配列部分（リンカー）を経 て、最初のＮ−末端のところの、あるいはその付近のアミノ酸に結合され、そし てこの新しい配列は、それがもとの配列の切断点部位に対してＮ−末端となるア ミノ酸のところまたはその付近の点に達するまで、もとの順序と同じ順序で続き 、そしてこの残基が鎖の新しいＣ−末端を形成する。 この方法は大きさが５８から４６２アミノ酸に及ぶタンパク質に適用された(G oldenberg&Creighton，J．Mol．Biol．165:407-413，1983；Li&Coffino,Mol．Ce ll．Biol．13:2377-2383，1993)。試みたタンパク質は、主としてａ−らせん（ インターロイキン−４；Ｋｒｅｉｔｍａｎ等，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７：３１１− ３１８，１９９５），ｂ−シート（インターロイキン−１；Ｈｏｒｌｉｃｋ等， Ｐｒｏｔｅｌｎ Ｅｎｇ．５：４２７−４３１，１９９２），あるいは両者の混 合（酵母 ホスホリボシル アントラニレート イソメラーゼ；Ｌｕｇｅｒ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：２０６−２１０，１９８９）を有するタンパク質を含 めて、広範囲の構造分類を代表した。タンパク質機能の広いカテゴリーはこれら 配列再編成の研究で表わされる： 酵素 Ｔ４ リゾチーム Zhang等，Bichemistry 32:12311-12318,1993;Z hang等，Nature Struct．Biol.1:434-438(1995 ) ジヒドロ葉酸レダクターゼ Buchwalder等，Biochemistry 31:1621-1630,19 94;Protasova等，Prot．Eng．7:1373-1377，19 95) リボヌクレアーゼ Ｔ１ Mullins等，J．Am．Chem．Soc．116:5529-5533 ，1994;Garrett等，Protein Science 5:204-211，1996) バチルス グルカンス Hahn等，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A.91:10 417-10421，1994)アスパルテートトランスカルバモイラーゼ Yang & Schachman,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A ．90:11980-11984，1993)ホスホリボシルアントラニレートイソメラーゼ Luger 等，Science 243:206-210(1989;Luger 等，Prot．Eng．3:249-258，1990) ペプシン／ペプシノーゲン Lin等,Protein Science 4:159-166，1995)グリセルアルデヒド -3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ Vignais等，Protein Science 4:994-1 000，1995)オルニチンデカルボキシラーゼ Li & Coffino，Mol．Cell．Biol．13:2377-238 3，1993) 酵母 ホスホグリセレートデヒドロゲナーゼ Ritco-Vonsovici 等，Biochemistry3 4:16543-16551，1995) 酵素阻害剤 塩基性膵臓 トリプシン阻害剤 Goldenberg & Creighton，J．Mol．Biol.165:4 07-413，1983) サイトカイン インターロイキン−１ｂ Horlick等，Protein Eng．5:427-431，1992) インターロイキン−４ Kreitman等，Cytokine 7:311-318，1995) チロシン キナーゼ 認識 ドメイン ａ−スペクトリン ＳＨ３ ドメイン Viguera，等，J．Mol．Biol．247:670 -681，1995) トランスメンブラン タンパク質 キメラ タンパク質 インターロイキン−４−Kreitman等，Proc．Natl．Acad. シュードモナス Sci．U.S.A．91:6889-6893，1994)。 エキソトキシン これら研究の結果は、非常に変動した。多くの場合、より低い活性、溶解性、 または熱力学的安定性が観察された（Ｅ．ｃｏｌｉ ジヒドロ葉酸レダクターゼ 、アスパルテート トランスカルバモイラーゼ、 ホスホリボシル アントラニ レート イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート デヒドロゲナ ーゼ、オルニチン デカルボキシラーゼ、ｏｍｐ Ａ、酵母ホスホグリセレート デヒドロゲナーゼ）。他の場合では、配列転換したタンパク質は、その自然の対 照物と殆ど同一の多くの性質を有するようであった（塩基性膵臓トリプシン阻害 剤、Ｔ４リゾチーム、リボヌクレアーゼＴ１、バチルスｂ−グルカナーゼ、イン ターロイキン−１ｂ、ａ−スペクトリンＳＨ３ドメイン、ペプシノーゲン、イン ターロイキン−４）。例外的な場合では、天然配列の幾つかの性質に勝る予想外 の向上が見られた。例えば、再配列したａ−スペクトリンＳＨ３ドメイン配列に 対する溶解性およびリフォールジング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）割合、および転移 インターロイキン−４−シュードモナス エキソトキシン融合分子のレセプター 親和性および抗腫瘍活性が観察された(Kreitman等，Proc．Natl．Acad．Sci.U.S .A．91:6889-6893，1994；Kreitman等，Cancer Res．55:3357-3363，1995)。 これらの型の研究に対する主要な動機づけは、タンパク質の折たたみと安定性 における狭域および広域相互作用の役割を研究することであった。この型の配列 再編成は、もとの配列においては広域の相互作用の部分集合を、新配列における 狭域相互作用に変換し、またその逆も成り立つ。これら配列再編成の多くが、少 なくとも若干の活性をもつコンホメーションに到達しうるという事実は、タンパ ク質の折たたみが多重折たたみ経路により起こるという説得力のある証拠である （Ｖｉｇｕｅｒａ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｌｏｌ．２４７：６７０−６８１，１９９ ５）。ａ−スペクトリンのＳＨ３ドメインの場合では、ヘアピン状の折り返しに 相当する位置での新末端の選択が、安定性は幾分低いが、それでも折りたたむこ とのできるタンパク質を生じた。 ここで引用した研究に用いられた内部切断点の位置は、もっぱらタンパク質の 表面上に見出され、両端あるいは中点に向かって明瞭な偏りがなく、線形配列中 に隈なく分布する（もとのＮ−末端から切断点までの相対距離における変動は、 全配列長さの約１０から８０％である）。これら研究において、最初のＮ−末端 とＣ−末端とをつなぐリンカーは０から９残基にわたった。一つの場合において は（Ｙａｎｇ＆Ｓｃｈａｃｈｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１９８０−１１９８４，１９９３）、配列の一部分をもと のＣ−末端セグメントから欠失させ、この端を切り取ったＣ−末端からもとのＮ −末端への連結を行なった。柔軟な親水性残基、例えばＧｌｙおよびＳｅｒ、が しばしばリンカーに使われる。Ｖｉｇｕｅｒａ等（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４ ７：６７０−６８１，１９９５）は、もとのＮ−およびＣ−末端を３または４残 基リンカーとつなぐことを比較した。３残基リンカーの方が熱力学的に不安定で あった。Ｐｒｏｔａｓｏｖａ等（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：１３７３−１３ ７７，１９９４）は、Ｅ．ｃｏｌｉジヒドロ葉酸レダクターゼのもとのＮ−末端 をつなぐ際に３または５残基リンカーを使用したところ、３残基リンカーのみ好 収量でタンパク質を生成した。発明の要約 造血タンパク質は、式： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1を有するアミノ 酸配列からなり、 上記式中のＲ1とＲ2は、それぞれ独立に （Ｉ）式：［ここで、Ｎ−末端から任意に１−６個のアミノ酸を、またＣ−末端から１−５ 個のアミノ酸を、前記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失させる ことができ； また、Ｎ−末端をＣ−末端へ直接つなぐか、あるいはＮ−末端をＣ−末端へつ なぐことのできる、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミノ酸：のところにもつことのできるリンカー（Ｌ2）を介してＮ−末端をＣ−末端につ なぐ］ を有する修飾ＥＰＯアミノ酸配列からなる、ヒトＥＰＯレセプターアゴニストポ リペプチド； （II）式［ここで、前記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチドのＣ−末端から任 意に１−２３個のアミノ酸を欠失させることができ；またＮ−末端をＣ−末端へ 直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端をＣ−末端へつなぐことが でき、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミノ酸：のところにもつことができる）を介してつなぐ］ を有する修飾幹細胞因子アミノ酸配列からなる、ヒト幹細胞因子レセプターアゴ ニストポリペプチド； （III）式：［ここで、下記ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチドのＣ−末端から１ −７個のアミノ酸を任意に欠失させ；またＮ−末端はＣ−末端へ直接つなぐか、 あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端をＣ−末端へつなぐことができ、そして新 しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミノ酸： のところにもつことができる）を介してつなぐ］ を有する修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列からなる、ヒトｆｌｔ−３レセプ ターアゴニストポリペプチド； （IV）式：［式中、１位のXaaはThr,Ser,Arg,TyrまたはGly； ２位のXaaはProまたはLeu； ３位のXaaはLeu,Arg,TyrまたはSer； 13位のXaaはPhe,Ser,His,ThrまたはPro； 16位のXaaはLys,Pro,Ser,ThrまたはHis； 17位のXaaはCys,Ser,Gly,Ala,Ile,TyrまたはArg; 18位のXaaはLeu,Thr,Pro,His,IleまたはCys； 22位のXaaはArg,Tyr,Ser,ThrまたはAla； 24位のXaaはIle,Pro,TyrまたはLeu； 27位のXaaはAsp,またはGly； 30位のXaaはAla,Ile,LeuまたはGly； 34位のXaaはLysまたはSer； 36位のXaaはCysまたはSer； 42位のXaaはCysまたはSer； 43位のXaaはHis,Thr,Gly,Val,Lys,Trp,Ala,Arg,Cys,またはLeu； 44位のXaaはPro,Gly,Arg,Asp,Val,Ala,His,Trp,Gln,またはThr； 46位のXaaはGlu,Arg,Phe,Arg,IleまたはAla； 47位のXaaはLeuまたはThr； 49位のXaaはLeu,Phe,ArgまたはSer； 50位のXaaはLeu,Ile,His,ProまたはTyr； 54位のXaaはLeuまたはHis； 64位のXaaはCysまたはSer； 67位のXaaはGln,Lys,LeuまたはCys； 70位のXaaはGln,Pro,Leu,ArgまたはSer； 74位のXaaはCysまたはSer； 104位のXaaはAsp,GlyまたはVal； 108位のXaaはLeu,Ala,Val,Arg,Trp,GlnまたはGly； 115位のXaaはThr,His,LeuまたはAla； 120位のXaaはGln,Gly,Arg,LysまたはHis； 123位のXaaはGlu,Arg,PheまたはThr； 144位のXaaはPhe,His,Arg,Pro,Leu,GlnまたはGlu； 146位のXaaはArgまたはGln； 147位のXaaはArgまたはGln； 156位のXaaはHis,GlyまたはSer； 159位のXaaはSer,Arg,Thr,Tyr,ValまたはGly； 162位のXaaはGlu,Leu,GlyまたはTrp； 163位のXaaはVal,Gly,ArgまたはAla； 169位のXaaはArg,Ser,Leu,ArgまたはCys； 170位のXaaはHis,ArgまたはSer； そして、修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から、Ｎ−末端から任意に１−１１個 のアミノ酸を、またＣ−末端から１−５個のアミノ酸を任意に欠失させることが でき、また Ｎ−末端はＣ−末端へ直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端をＣ −末端へつなぐことができ、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれアミ ノ酸： のところにもつことができる）を介してつなぐ］ を有する修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列からなる、ポリペプチド； （Ｖ）式： ［式中、17位のXaaはSer,Lys,Gly,Asp,Met,Gln,またはArg； 18位のXaaはAsn,His,Leu,Ile,Phe,Arg,またはGln； 19位のXaaはMet,Phe,Ile,Arg,Gly,Ala,またはCys； 20位のXaaはIle,Cys,Gln,Glu,Arg,Pro,またはAla； 21位のXaaはAsp,Phe,Lys,Arg,Ala,Gly,Glu,Gln,,Asn,Thr,SerまたはVal； 22位のXaaはGlu,Trp,Pro,Ser,Ala,His,Asp,Asn,Gln,Leu,ValまたはGly； 23位のXaaはIle,Val,Ala,Gly,Trp,Lys,Phe,Leu,Ser,またはArg； 24位のXaaはIle,Gly,Val,Arg,Ser,Phe,またはLeu； 25位のXaaはThr,His,Gly,Gln,Arg,Pro,またはAla； 26位のXaaはHis,Thr,Phe,Gly,Arg,Ala,またTrp； 27位のXaaはLeu,Gly,Arg,Thr,Ser,またはAla； 28位のXaaはLys,Arg,Leu,Gln,Gly,Pro,ValまたはTrp； 29位のXaaはGln,Asn,Leu,Pro,Arg,またはVal； 30位のXaaはPro,His,Thr,Gly,Asp,Gln,Ser,Leu,またはLys； 31位のXaaはPro,Asp,Gly,Als,Arg,Leu,またはGln； 32位のXaaはLeu,Val,Arg,Gln,Asn,Gly,Als,またはGlu； 33位のXaaはPro,Leu,Gln,Ala,Thr,またはGlu； 34位のXaaはLeu,Val,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,Thr,Arg,Ala,Phe,IleまたはMet； 35位のXaaはLeu,Ala,Gly,Asn,Pro,Gln,またはVal； 36位のXaaはAsp,Leu,またはVal； 37位のXaaはPhe,Ser,Pro,Trp,またはIle； 38位のXaaはAsn,またはAla； 40位のXaaはLeu,Trp,またはArg； 41位のXaaはAsn,Cys,Arg,His,Met,またはPro； 42位のXaaはGly,Asp,Ser,Cys,Asn,Lys,Thr,Leu,Val,Glu,Phe,Tyr,Ile,Metまたは Ala； 43位のXaaはGlu,Asn,Tyr,Leu,Phe,Asp,Ala,Cys,Gln,Arg,Thr,GlyまたはSer； 44位のXaaはAsp,Ser,Leu,Arg,Lys,Thr,Met,Trp,Glu,Asn,Gln,AlaまたはPro； 45位のXaaはGln,Pro,Phe,Val,Met,Leu,Thr,Lys,Trp,Asp,Asn,Arg,Ser,Ala,Ile,G luまたはHis； 46位のXaaはAsp,Phe,Ser,Thr,Cys,Glu,Asn,Gln,Lys,His,Ala,Tyr,Ile,Valまたは Gly； 47位のXaaはIle,Gly,Val,Ser,Arg,Pro,またはHis； 48位のXaaはLeu,Ser,Cys,Arg,Ile,His,Phe,Glu,Lys,Thr,Ala,Met,ValまたはAsn ； 49位のXaaはMet,Arg,Ala,Gly,Pro,Asn,His,またはAsp； 50位のXaaはGlu,Leu,Thr,Asp,Tyr,Lys,Asn,Ser,Ala,Ile,Val,His,Phe,Metまたは Gln； 51位のXaaはAsn,Arg,Met,Pro,Ser,Thr,またはHis； 52位のXaaはAsn,His,Arg,Leu,Gly,Ser,またはThr； 53位のXaaはLeu,Thr,Ala,Gly,Glu,Pro,Lys,Ser,またはMet； 54位のXaaはArg,Asp,Ile,Ser,Val,Thr,Gln,Asn,Lys,His,AlaまたはLeu； 55位のXaaはArg,Thr,Val,Ser,Leu,またはGly； 56位のXaaはPro,Gly,Cys,Ser,Gln,Glu,Arg,His、Thr,Ala,Tyr,Phe,Leu,Valまた はLys； 57位のXaaはAsnまたはGly； 58位のXaaはLeu,Ser,Asp,Arg,Gln,Val,またはCys； 59位のXaaはGlu Tyr,His,Leu,Pro,またはArg； 60位のXaaはAla,Ser,Pro,Tyr,Asn,またはThr； 61位のXaaはPhe,Asn,Glu,Pro,Lys,Arg,またはSer； 62位のXaaはAsn,His,Val,Arg,Pro,Thr,Asp,またはIle； 63位のXaaはArg,Tyr,Trp,Lys,Ser,His,Pro,またはVal； 64位のXaaはAla,Asn,Pro,Ser,またはLys； 65位のXaaはVal,Thr,Pro,His,Leu,Phe,またはSer； 66位のXaaはLys,Ile,Arg,Val,Asn,Glu,またはSer； 67位のXaaはSer,Ala,Phe,Val,Gly,Asn,Ile,Pro,またはHis； 68位のXaaはLeu,Val,Trp,Ser,Ile,Phe,Thr,またはHis； 69位のXaaはGln,Ala,Pro,Thr,Glu,Arg,Trp,Gly,またはLeu； 70位のXaaはAsn,Leu,Val,Trp,Pro,またはAla； 71位のXaaはAla,Met,Leu,Pro,Arg,Glu,Thr,Gln,Trp,またはAsn； 72位のXaaはSer,Glu,Met,Ala,His,Asn,Arg,またはAsp； 73位のXaaはAla,Glu,Asp,Leu,Ser,Gly,Thr,またはArg； 74位のXaaはIle,Met,Thr,Pro,Arg,Gly,Ala； 75位のXaaはGlu,Lys,Gly,Asp,Pro,Trp,Arg,Ser,Gln,またはLeu； 76位のXaaはSer,Val,Ala,Asn,Trp,Glu,Pro,Gly,またはAsp； 77位のXaaはIle,Ser,Arg,Thr,またはLeu； 78位のXaaはLeu,Ala,Ser,Glu,Phe,Gly,またはArg； 79位のXaaはLys,Thr,Asn,Met,Arg,Ile,Gly,またはAsp； 80位のXaaはAsn,Trp,Val,Gly,Thr,Leu,Glu,またはArg； 81位のXaaはLeu,Gln,Gly,Ala,Trp,Arg,Val,またはLys； 82位のXaaはLeu,Gln,Lys,Trp,Arg,Asp,Glu,Asn,His,Thr,Ser,Ala,Tyr,Phe,Ile,M etまたはVal； 83位のXaaはPro,Ala,Thr,Trp,Arg,またはMet； 84位のXaaはCys,Glu,Gly,Arg,Met,またはVal； 85位のXaaはLeu,Asn,Val,またはGln； 86位のXaaはPro,Cys,Arg,Ala,またはLys； 87位のXaaはLeu,Ser,Trp,またはGly； 88位のXaaはAla,Lys,Arg,Val,またはTrp； 89位のXaaはThr,Asp,Cys,Leu,Val,Glu,His,Asn,またはSer； 90位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Gly,Asp,Ile,またはMet； 91位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Phe,Leu,Asp,またはHis； 92位のXaaはPro,Phe,Arg,Ser,Lys,His,Ala,Gly,IleまたはLeu； 93位のXaaはThr,Asp,Ser,Asn,Pro,Ala,Leu,またはArg； 94位のXaaはArg,Ile,Ser,Glu,Leu,Val,Gln,Lys,His,Ala,またはPro； 95位のXaaはHis,Gln,Pro,Arg,Val,Leu,Gly,Thr,Asn,Lys,Ser,Ala,Trp,Phe,Ile, またはTyr； 96位のXaaはPro,Lys,Tyr,Gly,Ile,またはThr； 97位のXaaはIle,Val,Lys,Ala,またはAsn； 98位のXaaはHis,Ile,Asn,Leu,Asp,Ala,Thr,Glu,Gln,Ser,Phe,Met,Val,Lys,Arg,T yrまたはPro； 99位のXaaはIle,Leu,Arg,Asp,Val,Pro,Gln,Gly,Ser,Phe,またはHis； 100位のXaaはLys,Tyr,Leu,His,Arg,Ile,Ser,Gln,またはPro； 101位のXaaはAsp,Pro,Met,Lys,His,Thr,Val,Tyr,Glu,Asn,Ser,Ala,Gly,Ile,Leu, またはGln； 102位のXaaはGly,Leu,Glu,Lys,Ser,Tyr,またはPro； 103位のXaaはAsp,またはSer； 104位のXaaはTrp,Val,Cys,Tyr,Thr,Met,Pro,Leu,Gln,Lys,Ala,Phe,またはGly； 105位のXaaはAsn,Pro,Ala,Phe,Ser,Trp,Gln,Tyr,Leu,Lys,Ile,Asp,またはHis； 106位のXaaはGlu,Ser,Ala,Lys,Thr,Ile,Gly,またはPro； 108位のXaaはArg,Lys,Asp,Leu,Thr,Ile,Gln,His,Ser,AlaまたはPro； 109位のXaaはArg,Thr,Pro,Glu,Tyr,Leu,Ser,またはGly； 110位のXaaはLys,Ala,Asn,Thr,Leu,Arg,Gln,His,Glu,Ser,またはTrp； 111位のXaaはLeu,Ile,Arg,Asp,またはMet； 112位のXaaはThr,Val,Gln,Tyr,Glu,His,Ser,またはPhe； 113位のXaaはPhe,Ser,Cys,His,Gly,Trp,Tyr,Asp,Lys,Leu,Ile,ValまたはAsn； 114位のXaaはTyr,Cys,His,Ser,Trp,Arg,またはLeu； 115位のXaaはLeu,Asn,Val,Pro,Arg,Ala,His,Thr,Trp,またはMet； 116位のXaaはLys,Leu,Pro,Thr,Met,Asp,Val,Glu,Arg,Trp,Ser,Asn,His,Ala,Tyr, Phe,Gln,またはIle； 117位のXaaはThr,Ser,Asn,Ile,Trp,Lys,またはPro； 118位のXaaはLeu,Ser,Pro,Ala,Glu,Cys,Asp,またはTyr； 119位のXaaはGlu,Ser,Lys,Pro,Leu,Thr,Tyr,またはArg； 120位のXaaはAsn,Ala,Pro,Leu,His,Val,またはGln； 121位のXaaはAla,Ser,Ile,Asn,Pro,Lys,Asp,またはGly； 122位のXaaはGln,Ser,Met,Trp,Arg,Phe,Pro,His,Ile,Tyr,またはCys； 123位のXaaはAla,Met,Glu,His,Ser,Pro,Tyr,またはLeu； また、１から１４個のアミノ酸を修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら任意に欠失でき、そして（または）１から１５個のアミノ酸をＣ−末端から任 意に欠失でき；Ｘａａにより表示されたアミノ酸のうち０から４４個は天然（１ −１３３）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは異なり；また Ｎ−末端はＣ−末端へ直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端を Ｃ−末端へつなぐことができ、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれア ミノ酸：のところにもつことができる）を介してつながれる］ を有する修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列からなる、ポリペプチド； （VI）式：［式中、 １１２位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； １１３位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； １１４位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； １１５位のＸａａは、これを欠失させるか、またはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；そして Ｎ−末端は、Ｃ−末端へ直接つなぐか、あるいはリンカー（Ｌ2）（Ｎ−末端 をＣ−末端へつなぐことができ、そして新しいＣ−末端とＮ−末端を、それぞれ アミノ酸： のところにもつことができる）を介してつながれる］ を有する修飾ヒトｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列からなる、ポリペプチド； （VII）式：［式中、 17位のXaaはSer,Lys,Gly,Asp,Met,Gln,またはArg； 18位のXaaはAsn,His,Leu,Ile,Phe,Arg,またはGln； 19位のXaaはMet,Phe,Ile,Arg,Gly,Ala,またはCys； 20位のXaaはIle,Cys,Gln,Glu,Arg,Pro,またはAla； 21位のXaaはAsp,Phe,Lys,Arg,Ala,Gly,Glu,Gln,Asn,Thr,SerまたはVal； 22位のXaaはGlu,Trp,Pro,Ser,Ala,His,Asp,Asn,Gln,Leu,ValまたはGly； 23位のXaaはIle,Val,Ala,Gly,Trp,Lys,Phe,Leu,Ser,またはArg； 24位のXaaはIle,Gly,Val,Arg,Ser,Phe,またはLeu； 25位のXaaはThr,His,Gly,Gln,Arg,Pro,またはAla； 26位のXaaはHis,Thr,Phe,Gly,Arg,Ala,またはTrp； 27位のXaaはLeu,Gly,Arg,Thr,Ser,またはAla； 28位のXaaはLys,Arg,Leu,Gln,Gly,Pro,ValまたはTrp； 29位のXaaはGln,Asn,Leu,Pro,Arg,またはVal； 30位のXaaはPro,His,Thr,Gly,Asp,Gln,Ser,Leu,またはLys； 31位のXaaはPro,Asp,Gly,Ala,Arg,Leu,またはGln； 32位のXaaはLeu,Val,Arg,Gln,Asn,Gly,Ala,またはGlu； 33位のXaaはPro,Leu,Gln,Ala,Thr,またはGlu； 34位のXaaはLeu,Val,Gly,Ser,Lys,Glu,Gln,Thr,Arg,Ala,Phe,IleまたはMet； 35位のXaaはLeu,Ala,Gly,Asn,Pro,GlnまたはVal； 36位のXaaはAsp,Leu,またはVal； 37位のXaaはPhe,Ser,Pro,Trp,またはIle； 38位のXaaはAsn,またはAla； 40位のXaaはLeu,Trp,またはArg； 41位のXaaはAsn,Cys,Arg,Leu,His,Met,またはPro； 42位のXaaはGly,Asp,Ser,Cys,Asn,Lys,Thr,Leu,Val,Glu,Phe,Tyr,Ile,Metまたは Ala； 43位のXaaはGlu,Asn,Tyr,Leu,Phe,Asp,Ala,Cys,Gln,Arg,Thr,GlyまたはSer； 44位のXaaはAsp,Ser,Leu,Arg,Lys,Thr,Met,Trp,Glu,Asn,Gln,AlaまたはPro； 45位のXaaはGln,Pro,Phe,Val,Met,Leu,Thr,Lys,Trp,Asp,Asn,Arg,Ser,Ala,Ile,G luまたはHis； 46位のXaaはAsp,Phe,Ser,Thr,Cys,Glu,Asn,Gln,Lys,His,Ala,Tyr,Ile,Valまたは Gly； 47位のXaaはIle,Gly,Val,Ser,Arg,Pro,またはHis； 48位のXaaはLeu,Ser,Cys,Arg,Ile,His,Phe,Glu,Lys,Thr,Ala,Met,ValまたはAsn ； 49位のXaaはMet,Arg,Ala,Gly,Pro,Asn,His,またはAsp； 50位のXaaはGlu,Leu,Thr,Asp,Tyr,Lys,Asn,Ser,Ala,Ile,Val,His,Phe,Metまたは Gln； 51位のXaaはAsn,Arg,Met,Pro,Ser,Thr,またはHis； 52位のXaaはAsn,His,Arg,Leu,Gly,Ser,またはThr； 53位のXaaはLeu,Thr,Ala,Gly,Glu,Pro,Lys,Ser,またはMet； 54位のXaaはArg,Asp,Ile,Ser,Val,Thr,Gln,Asn,Lys,His,AlaまたはLeu； 55位のXaaはArg,Thr,Val,Ser,Leu,またはGly； 56位のXaaはPro,Gly,Cys,Ser,Gln,Glu,Arg,His,Thr,Ala,Tyr,Phe,Leu,Valまたは Lys； 57位のXaaはAsnまたはGly； 58位のXaaはLeu,Ser,Asp,Arg,Gln,Val,またはCys； 59位のXaaはGlu,Tyr,His,Leu,Pro,またはArg； 60位のXaaはAla,Ser,Pro,Tyr,Asn,またはThr； 61位のXaaはPhe,Asn,Glu,Pro,Lys,Arg,またはSer； 62位のXaaはAsn,His,Val,Arg,Pro,Thr,Asp,またはIle； 63位のXaaはArg,Tyr,Trp,Lys,Ser,His,Pro,またはVal； 64位のXaaはAla,Asn,Pro,Ser,またはLys； 65位のXaaはVal,Thr,Pro,His,Leu,Phe,またはSer； 66位のXaaはLys,Ile,Arg,Val,Asn,Glu,またはSer； 67位のXaaはSer,Ala,Phe,Val,Gly,Asn,Ile,Pro,またはHis； 68位のXaaはLeu,Val,Trp,Ser,Ile,Phe,Thr,またはHis； 69位のXaaはGln,Ala,Pro,Thr,Glu,Arg,Trp,Gly,またはLeu； 70位のXaaはAsn,Leu,Val,Trp,Pro,またはAla； 71位のXaaはAla,Met,Leu,Pro,Arg,Glu,Thr,Gln,Trp,またはAsn； 72位のXaaはSer,Glu,Met,Ala,His,Asn,Arg,またはAsp； 73位のXaaはAla,Glu,Asp,Leu,Ser,Gly,Thr,またはArg； 74位のXaaはIle,Met,Thr,Pro,Arg,Gly,Ala； 75位のXaaはGlu,Lys,Gly,Asp,Pro,Trp,Arg,Ser,Gln,またはLeu； 76位のXaaはSer,Val,Ala,Asn,Trp,Glu,Pro,Gly,またはAsp； 77位のXaaはIle,Ser,Arg,Thr,またはLeu； 78位のXaaはLeu,Ala,Ser,Glu,Phe,Gly,またはArg； 79位のXaaはLys,Thr,Asn,Met,Arg,Ile,Gly,またはAsp； 80位のXaaはAsn,Trp,Val,Gly,Thr,Leu,Glu,またはArg； 81位のXaaはLeu,Gln,Gly,Ala,Trp,Arg,Val,またはLys； 82位のXaaはLeu,Gln,Lys,Trp,Arg,Asp,Glu,Asn,His,Thr,Ser,Ala,Tyr,Phe,Ile,M etまたはVal； 83位のXaaはPro,Ala,Thr,Trp,Arg,またはMet； 84位のXaaはCys,Glu,Gly,Arg,Met,またはVal； 85位のXaaはLeu,Asn,Val,またはGln； 86位のXaaはPro,Cys,Arg,Ala,またはLys； 87位のXaaはLeu,Ser,Trp,またはGly； 88位のXaaはAla,Lys,Arg,Val,またはTrp; 89位のXaaはThr,Asp,Cys,Leu,Val,Glu,His,Asn,またはSer； 90位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Gly,Asp,Ile,またはMet； 91位のXaaはAla,Pro,Ser,Thr,Phe,Leu,Asp,またはHis； 92位のXaaはPro,Phe,Arg,Ser,Lys,His,Ala,Gly,Ile,またはLeu； 93位のXaaはThr,Asp,Ser,Asn,Pro,Ala,Leu,またはArg； 94位のXaaはArg,Ile,Ser,Glu,Leu,Val,Gln,Lys,His,Ala,またはPro； 95位のXaaはHis,Gln,Pro,Arg,Val,Leu,Gly,Thr,Asn,Lys,Ser,Ala,Trp,Phe,Ile, またはTyr； 96位のXaaはPro,Lys,Tyr,Gly,Ile,またはThr； 97位のXaaはIle,Val,Lys,Ala,またはAsn； 98位のXaaはHis,Ile,Asn,Leu,Asp,Ala,Thr,Glu,Gln,Ser,Phe,Met,Val,Lys,Arg,T yrまたはPro； 99位のXaaはIle,Leu,Arg,Asp,Val,Pro,Gln,Gly,Ser,Phe,またはHis； 100位のXaaはLys,Tyr,Leu,His,Arg,Ile,Ser,Gln,またはPro； 101位のXaaはAsp,Pro,Met,Lys,His,Thr,Val,Tyr,Glu,Asn,Ser,Ala,Gly,Ile,Leu, またはGln； 102位のXaaはGly,Leu,Glu,Lys,Ser,Tyr,またはPro； 103位のXaaはAsp,またはSer； 104位のXaaはTrp,Val,Cys,Tyr,Thr,Met,Pro,Leu,Gln,Lys,Ala,Phe,またはGly； 105位のXaaはAsn,Pro,Ala,Phe,Ser,Trp,Gln,Tyr,Leu,Lys,Ile,Asp,またはHis； 106位のXaaはGlu,Ser,Ala,Lys,Thr,Ile,Gly,またはPro； 108位のXaaはArg,Lys,Asp,Leu,Thr,Ihe,Gln,His,Ser,AlaまたはPro； 109位のXaaはArg,Thr,Pro,Glu,Tyr,Leu,Ser,またはGly； 110位のXaaはLys,Ala,Asn,Thr,Leu,Arg,Gln,His,Glu,Ser,またはTrp； 111位のXaaはLeu,Ile,Arg,Asp,またはMet； 112位のXaaはThr,Val,Gln,Tyr,Glu,His,Ser,またはPhe； 113位のXaaはPhe,Ser,Cys,His,Gly,Trp,Tyr,Asp,Lys,Leu,Ile,ValまたはAsn； 114位のXaaはTyr,Cys,His,Ser,Trp,Arg,またはLeu； 115位のXaaはLeu,Asn,Val,Pro,Arg,Ala,His,Thr,Trp,またはMet； 116位のXaaはLys,Leu,Pro,Thr,Met,Asp,Val,Glu,Arg,Trp,Ser,Asn,His,Ala,Tyr, Phe,Gln,またはIle； 117位のXaaはThr,Ser,Asn,Ile,Trp,Lys,またはPro； 118位のXaaはLeu,Ser,Pro,Aht,Glu,Cys,Asp,またはTyr； 119位のXaaはGlu,Ser,Lys,Pro,Leu,Thr,Tyr,またはArg； 120位のXaaはAsn,Ala,Pro,Leu,His,Val,またはGln； 121位のXaaはAla,Ser,Ile,Asn,Pro,Lys,Asp,またはGly； 122位のXaaはGln,Ser,Met,Trp,Arg,Phe,Pro,His,Ile,Tyr,またはCys； 123位のXaaはAla,Met,Glu,His,Ser,Pro,Tyr,またはLeu； ここで、修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端からは１から１４個のアミ ノ酸を任意に欠失させ、そして（または）１から１５個のアミノ酸をＣ−末端か ら任意に欠失させることができ；そしてＸａａにより表示されたアミノ酸のうち １から４４個は、天然（１−１３３）ヒトインターロイキン−３の対応するアミ ノ酸と異なる］ を有する修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列からなる、ポリペプチド； および （VIII）コロニー刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキン か らなる群から選ばれる因子、 からなる群から選ばれ、そしてＬ1はＲ1をＲ2に結合させることのできるリン カーであるが、ただし 少なくともＲ1かＲ2のいずれかは式（Ｉ）、（II）、または（III）を有する ポリペプチドから選ばれることを条件とし； 前記造血タンパク質は、任意にその直前に（メチオニン-1）、（アラニン-1） または（メチオニン-2、アラニン-1）を置くことができる。 上記ポリペプチド（Ｉ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（Ｉ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は次の通りである： 本発明に係るＥＰＯレセプターアゴニストはアミノ酸置換（例えば、ＷＯ９４ ／２４１６０に記載のもの、あるいはＡｓｎ24Ａｓｎ83）およびＡｓｎ126にお けるグリコシル化部分の一つ以上を他のアミノ酸、例えば（しかし、これに限定 されない）ＡｓｐまたはＧｌｕ、に変える）、欠失および（または）挿入を含む ことができる。また、本発明ＥＰＯレセプターアゴニストはもとのタンパク質の Ｎ−末端およびＣ−末端のいずれかまたは両方にアミノ酸欠失を、そして（また は）前に示した式中の配列再編成タンパク質の新しいＮ−末端およ び（または）Ｃ−末端からの欠失を有しうることも企図されている。 上記ポリペプチド（II）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は、それぞれ次の通りである： 上記ポリペプチド（II）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は、それぞれ６４−６５、６５−６６、９２−９３およ び９３−９４である。 上記ポリペプチド（III）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることの できる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（III）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることの できる最も好ましい切断点は、３９−４０、６５−６６、８９−９０、９９−１ ００および１００−１０１である。 上記ポリペプチド（IV）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（IV）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は３８−３９、４８−４９、９６−９７、１２５−１２ ６、１３２−１３３および１４１−１４２である。 上記ポリペプチド（Ｖ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（Ｖ）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は、３４−３５、６９−７０および９０−９１である。 上記ポリペプチド（VI）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる一層好ましい切断点は次の通りである： 上記ポリペプチド（VI）中に新しいＣ−末端およびＮ−末端をつくることので きる最も好ましい切断点は、８１−８２、１０８−１０９、１１５−１１６、１ １９−１２０、１２２−１２３および１２５−１２６である。 本発明に係る多機能性レセプターアゴニストはまた次式： により表わすことができる。式中、 Ｘ1は、残基１のところをアミノ末端として順次１からＪまで番号を付けたア ミノ酸残基をもつもとのタンパク質の残基ｎ＋１からＪまでの配列に相当するア ミノ酸配列からなるペプチドであり； Ｌは任意のリンカーであり； Ｘ2は、最初のタンパク質の残基１からｎまでのアミノ酸配列からなるペプチ ドであり； Ｙ1は、残基１のところをアミノ末端として順次１からｋまで番号をつけたア ミノ酸残基を有するもとのタンパク質の残基ｎ＝１からｋまでの配列に相当する アミノ酸配列からなるペプチドであり； Ｙ2は最初のタンパク質の残基１からｎまでのアミノ酸配列からなるペプチド であり； Ｌ1とＬ2は任意のペプチドスペーサーであり； ｎは１からＪ−１にわたる整数であり； 各ｂ、ｃ、およびｄはそれぞれ０か１であり； ａおよびｅは０か１のいずれかであるが、ただしａとｅが両方とも０となるこ とはできず；そして Ｔ1およびＴ2はタンパク質である。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、キメラ分子の個々 のタンパク質成分中にアミノ酸置換、欠失および（または）挿入を含むことがで きる。また本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、最初のタンパク 質のＮ−末端およびＣ−末端のいずれまたは両方にアミノ酸欠失を、そして（あ るいは）前記式において配列再編成タンパク質の新しいＮ−末端および（または ）Ｃ−末端からの欠失を有しうることも企図されている。 本発明の特に適当な一具体例において、Ｎ−末端をＣ−末端につなぐ上式のリ ンカー（Ｌ）、（Ｌ1）または（Ｌ2）は、 からなる群から選ばれるポリペプチドである。 更に、本発明は多機能性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化するヌク レオチド配列からなる組換え発現ベクター、関連微生物発現系、および多機能性 キメラ造血レセプターアゴニストに関するものである。本発明はまた多機能性キ メラ造血レセプターアゴニストを含む医薬組成物ならびに多機能性キメラ造血レ セプターアゴニストの使用法に関するものである。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの生体内使用に加えて 、容器内使用は、患者に注入する前に、骨髄および血液細胞の活性化と増殖を促 進する能力を含む筈であると想像される。もう一つの企図された使用は、樹脂状 細胞の生体内および生体外生産に向けてである。 融合タンパク質の親和性低下は、少なくとも一部は、キメラ分子中に取り入れ られたとき、その自然のコンホメーションを個々の分子が達成できないこと、あ るいは融合タンパク質の個々の部分の活性部位間の立体障害によると考えられる 。本発明は、キメラ分子の個々の成分に匹敵するかそれより大きい結合親和性を もつ新規多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを提供することによってこれ らの不利益を克服するものである。 図面の簡単な説明 図１は、タンパク質の配列再編成を概略的に説明している。未変性タンパク質 のＮ−末端（Ｎ）とＣ−末端（Ｃ）をリンカーを介してつなぐか、または直接つ なぐ。タンパク質を切断点で開いて新しいＮ−末端（新Ｎ）と新しいＣ−末端（ 新Ｃ）をつくり出すと、その結果新しい線状アミノ酸配列をもつタンパク質を 生ずる。再配列分子は線状分子として新規合成することができ、最初のＮ−末端 とＣ−末端とをつなぐ、そして切断点でタンパク質を開くという段階を通過しな いかも知れない。 図２は、新しいタンパク質をつくり出すための方法Ｉのスキームを示す。前記 タンパク質においては、自然のままのタンパク質の最初のＮ−末端とＣ−末端を リンカーでつなぎ、異なるＮ−末端とＣ−末端のタンパク質をつくり出している 。示した例では、配列の再編成の結果として、最初のタンパク質のアミノ酸９７ のところに生じた新しいＮ−末端、アミノ酸１１（ａ．ａ．１−１０は欠失）に リンカー領域を経由して接続された最初のＣ−末端（ａ．ａ．１７４）および最 初の配列のアミノ酸９６につくり出された新しいＣ−末端をもつタンパク質をコ ード化する新遺伝子を得る。 図３は、新しいタンパク質をつくり出すための方法IIのスキームを示す。この 場合、自然のままのタンパク質の最初のＮ−末端とＣ−末端をリンカー無しでつ なぎ、異なるＮ−末端とＣ−末端のタンパク質をつくり出す。示した例では、配 列の再編成の結果として、最初のタンパク質のアミノ酸９７につくり出された新 しいＮ−末端、最初のＮ−末端に接続された最初のＣ−末端（ａ．ａ．１７４） および最初の配列のアミノ酸９６につくり出された新しいＣ−末端をもつタンパ ク質をコード化する新遺伝子を得る。 図４は、新しいタンパク質をつくり出すための方法IIIのスキームを示す。こ の場合、自然のままのタンパク質の最初のＮ−末端とＣ−末端をリンカーでつな ぎ、異なるＮ−末端およびＣ−末端のタンパク質をつくり出す。示した例では、 配列の再編成の結果として、最初のタンパク質のアミノ酸９７につくり出された 新しいＮ−末端、アミノ酸１にリンカー領域を経て接続された最初のＣ−末端（ ａ．ａ．１７４）、および最初の配列のアミノ酸９６につくり出された新しいＣ −末端をもつタンパク質をコード化する新遺伝子を得る。 図５はｆｌｔ３レセプターアゴニストｐＭＯＮ３２３３２、ｐＭＯＮ３２３３ ３、ｐＭＯＮ３２３３４およびｐＭＯＮ３２３３５からなる多機能性レセプター アゴニストの、ＭＵＴＺ−２細胞増殖検定法で組換え未変性ｆｌｔ３（Ｇｅｎｚ ｙｍｅ）と比べた生物活性を示す。 図６は、Ｌｉｎ等（ＰＮＡＳ ８２：７５８０−７５８４，１９８５）の配列 に基づいたヒトの熟成ＥＰＯをコード化するＤＮＡ配列を示す。 図７ａおよび７ｂは、Ｍａｒｔｉｎ等（Ｃｅｌｌ ６３：２０３−２１１，１ ９９０）の配列に基づいた自然のままの幹細胞因子をコード化するＤＮＡ配列を 示す。 図８は、Langley等（Archives of Bichemistry and Biophysica 311:55-61,19 94）の配列に基づいた可溶性幹細胞因子をコード化するＤＮＡ配列を示す。 図９ａおよび９ｂは、Lyman等（Oncogene 11:1165-1172,1995）から得たｆｌ ｔ３リガンドの２０９アミノ酸成熟形をコード化するＤＮＡ配列を示す。発明の詳細な説明 本発明は、共有結合したポリペプチドから形成される多機能性キメラ造血レセ プターアゴニストを包含するものであり、これらの各々は異なる特異的細胞レセ プターを経由して相補的生物活動を開始させる作用をする。造血は一連の複雑な 細胞現象を必要とし、この場合、幹細胞はあらゆる主要な系統において成熟しつ つある細胞の大集団を絶えずつくり出す。現在造血増殖活性を有する少なくとも ２０種の既知調節物質がある。これら増殖調節物質の大部分は一つの型あるいは 他の型のコロニー形成を容器内で促進しうるだけであり、各調節物質により促進 されるコロニー形成の正確なパターンは全く特有のものである。二種の調節物質 が正確に同じパターンのコロニー形成を促進しないことは、コロニー数により、 あるいは更に重要なこととしては、発達しつつあるコロニーをつくり上げている 細胞の系統と成熟パターンにより評価される通りである。増殖応答は、単純化さ れた容器内培養系で最も容易に分析できる。三つの全く異なるパラメーター、即 ちコロニーの大きさの変化、コロニー数の変化および細胞系統を区別できる。二 つ以上の因子が始原細胞に対して作用することがあり、より多数の後代の形成を 誘発することによりコロニーの大きさを増大させる。二つ以上の因子が多数の始 原細胞を増殖させるかもしれない。それは、もっぱら一つの因子に対して応答す る始原細胞の別個の部分集合が存在するためか、あるいは若干の始原細胞が応答 しうる前に、二つ以上の因子による刺激を必要とするからである。二つ以上の因 子の使用による細胞上の更に他のレセプターの活性化は、最初は異なっている信 号経路が核に達する共通の最終経路に合体するので、有糸分裂信号を高めるよう である（Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：２７，１９８９）。他の機構 は相乗作用を説明できるであろう。例えば、もし信号を出す一つの経路が、第二 の因子により起こるもう一つの信号経路の中間的活性化により制限されたとすれ ば、これは超加成的応答を生ずるかも知れない。ある場合には、一つのレセプタ ー型の活性化が他のレセプターの高められた発現を誘発しうる（Ｍｅｔｃａｌｆ 、Ｂｌｏｏｄ ８２：３５１５−３５２３，１９９３）。二つ以上の因子が一つ の因子よりも異なるパターンの細胞系統を生ずることがある。多機能性キメラ造 血レセプターアゴニストの使用は、どの単一因子によっても不可能な増殖応答か ら生ずる潜在的な臨床上の利点をもつかも知れない。 造血因子および他の成長因子のレセプターは、関連するタンパク質を二つの別 個の群に分離できる、即ち（１）チロシンレセプター、例えば上皮成長因子、Ｍ −ＣＳＦに対するもの（Ｓｈｅｒｖ，Ｂｌｏｏｄ，７５：１，１９９０）および ＳＣＦに対するもの（Ｙａｒｄｅｎ等，ＥＭＢＯ Ｊ．６：３３４１，１９８７ ）および（２）造血レセプター、これはチロシンキナーゼ領域は含まないが、そ の細胞外領域に明瞭な相同性を示す（Ｂａｚａｎ，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：６ ９３４−６９３８，１９９０）。後者の群に包含されるものとして次のものが挙 げられる： エリトロポイエチン(EPO)(D'Andrea等，Cell 57:277，1989)，GM-CSF(Gearing等 ，EMBO J．8:3667，1989)，IL-3(Kitamura等，Cell 66:1165，1991)，G-CSF(Fuk unaga等，J．Bio．Chem．265:14008-15，1990)，IL-4(Harada等，PNAS USA 87:8 57，1990)，IL-5(Takaki等，EMBO J．9:4367，1990)，IL-6(Yamasaki等，Scienc e 241:825，1988)，IL-7(Goodwin等，Cell 60:941-51，1990)，LIF（Gearing等 ，EMBO J．10:2839，1991）およびIL-2(Cosman等，Mol-Immunol．23:935-94，19 86)。 後者の群のレセプターの大部分は、異種二量体として高親和性形で存在する。リ ガンド結合後、その特異的ａ−鎖は少なくとも一つの他のレセプター鎖（ｂ−鎖 、ｇ−鎖）と関係づけられるようになる。これら因子の多くは、共通のレセプタ ーサブユニットを共有する。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５に対するａ − 鎖は同じｂ−鎖を共有し(Kitamura等，Cell 66:1165，1991)，Takaki等，EMBO J ．10:2833-8，1991),そしてＩＬ−６，ＬＩＦおよびＩＬ−１１に対するレセプ ター複合体は共通のｂ−鎖（ｇｐ１３０）を共有する(Taga等，Cell 58:573-81 ，1989;Gearing等，Science 255:1434-7，1992)。ＩＬ−２，ＩＬ−４，ＩＬ− ７，ＩＬ−９およびＩＬ−１５のレセプター複合体は、共通のｇ−鎖を共有する (Kondo等，Science 262:1874，1993;Russell等，Science 266:1042-1045，1993; Noguchi等，Science 262:1877，1993;Giri等，EMBO J．13:2822-2830，1994)。 多様に作用する造血因子の使用は、因子産生細胞およびそれらの誘発系に置か れた要求を軽減することにより潜在的利点を有するかも知れない。もし細胞が因 子を産生する能力に制限があるとすれば、因子の各々の要求される濃度を低下さ せることにより、そしてそれらを合わせて用いることにより、因子産生細胞に対 する要求を有効に減らすことができるであろう。多重に作用する造血因子を使用 することによって、必要とされる因子の量が低下し、多分不利な副作用の可能性 が減るかも知れない。 本発明に係る新規化合物は、 Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2，Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1，Ｒ1−Ｒ2，およびＲ2−Ｒ1 （式中、Ｒ1およびＲ2は上で定義した通りである） からなる群から選ばれる式により表わされる。Ｒ2は、なるべくは、Ｒ1と異なる 、しかし相補的な、活性をもつコロニー促進因子がよい。相補的な活性とは、他 の細胞モジュレーターに対する応答を高めるか変化させる活性を意味する。Ｒ1 ポリペプチドは、Ｒ2ポリペプチドに直接つなぐか、またはリンカー部分を経て つながれる。「直接」という用語は、ポリペプチドがペプチバリンカー無しにつ ながれた多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを定義するものである。従っ て、Ｌ1はＲ1およびＲ2の両方が枠内でつながれる化学結合またはポリペプチド 部分を表わし、最も普通には、Ｌ1はＲ1とＲ2が、Ｒ1のカルボキシ末端をＬ1の アミノ末端に、またＬ1−のカルボキシ末端をＲ2のアミノ末端につなぐアミド結 合によりつながれた線状ペプチドである。「枠内でつながれる」とは、Ｒ1およ びＲ2をコード化するＤＮＡの読み枠間に翻訳停止あるいは中断が無いこと を意味する。 他の成長因子、即ちコロニー促進因子（ＣＳＦ）、の一覧（これだけに限らな い）は、（Ｉ）、（II）または（III）に結合させることができるサイトカイン 、リンホカイン、インターロイキン、造血成長因子であり、ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ− ＣＳＦ，ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯまたはＭＧＤＦとしても知られている）、 Ｍ−ＣＳＦ、エリトロポイエチン（ＥＰＯ）、IL-1，IL-4，IL-2，IL-3，IL-5， IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，LIF，flt3/flk 2リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球 分化因子および幹細胞因子（ＳＣＦ）（スチール因子またはｃ−キットリガンド としても知られている）を含む。更にまた、本発明は修飾Ｒ1またはＲ2分子ある いはこれらＲ1またはＲ2分子をコード化する変異あるいは修飾ＤＮＡ配列の使用 を包含する。本発明はまたＲ1またはＲ2がｈＩＬ−３変異体、ｃ−ｍｐｌリガン ド変異体、またはＧ−ＣＳＦ変異体である多機能性キメラ造血レセプターアゴニ ストをも包含するものである。「ｈＩＬ−３変異体」は、アミノ酸置換および（ または）ＷＯ９４／１２６３８、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９５／００６ ４６に開示されたような欠失したｈＩＬ−３の部分を有するｈＩＬ−３分子、な らびにこの分野で知られる他の変異体として定義される。「ｃ−ｍｐｌリガンド 変異体」は、米国特許願連続番号０８／３８３，０３５に開示された。アミノ酸 置換および（または）欠失ｃ−ｍｐｌリガンドの部分を有するｃ−ｍｐｌリガン ド分子、ならびにこの分野で公知の他の変異体として定義される。「Ｇ−ＣＳＦ 変異体」は、本明細書中に開示されたアミノ酸置換および（または）欠失Ｇ−Ｃ ＳＦの部分を有するＧ−ＣＳＦ分子、ならびにこの分野で公知の他の変異体とし て定義される。上記一覧に加えて、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２ ６３８に教示されたＩＬ−３変異体、ＷＯ９７／１２９７７に開示されたＧ−Ｃ ＳＦLレセプターアゴニスト、ＷＯ９７／１２９７８に開示されたｃ−ｍｐｌレ セプターアゴニスト、ＷＯ９７／１２９７９に開示されたＩＬ−３レセプターア ゴニストは、本発明に係るＲ1またはＲ2となりうる。本明細書中に用いた「ＩＬ −３変異体」は、ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２６３８に教示され たＩＬ−３変異体を指す。本明細書で用いた「融合タンパク質」 は、ＷＯ９５／２１１９７およびＷＯ９５／２１２５４に教示された融合タンパ ク質を指す。本明細書中で用いた「Ｇ−ＣＳＦレセプターアゴニスト」は、ＷＯ ９７／１２９７８に開示されたＧ−ＣＳＦレセプターアゴニストを指す。本明細 書中で用いた「ｃ−ｍｐｌレセプターアゴニスト」は、ＷＯ９７／１２９７８に 開示されたｃ−ｍｐｌレセプターアゴニストを指す。本明細書中で用いた「ＩＬ −３レセプターアゴニスト」は、ＷＯ９７／１２９７９に開示されたＩＬ−３レ セプターアゴニストを指す。本明細書中で用いた「多機能性レセプターアゴニス ト」は、ＷＯ９７／１２９８５に教示された多機能性レセプターアゴニストを指 す。 連結基（Ｌ1）は、一般に１個から５００個のアミノ酸の長さを有するポリペ プチドである。２分子をつなぐリンカーは、（１）二つの分子が折りたたまれて 互に独立して作用するように、（２）二つのタンパク質の機能領域を妨害しうる 強制された二次構造を出現させる傾向を有しないように、（３）機能性タンパク 質領域を妨害しうる疎水性の特性を最少にもつように、そして（４）一つの細胞 上でＲ1とＲ2がそれらの対応するレセプターと同時に相互作用しうるように、Ｒ1 とＲ2の立体的な分離を設けるように計画するのがよい。典型的には、たわみ易 いタンパク質領域における表面アミノ酸はＧｌｙ，ＡｓｎおよびＳｅｒを含む。 Ｇｌｙ，ＡｓｎおよびＳｅｒを含むアミノ酸配列の実質的にどの入れ替えもリン カー配列に対する上記の基準を満すことが期待される筈である。他の中性アミノ 酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａ、もリンカー配列に使用できる。更に他のアミノ 酸も、他機能性キメラ造血レセプターアゴニストの構成を容易にするため、リン カー配列に独特の制限部位をつけ加えるので、リンカーに含めることができる。 本発明に係る特に適当なＬ1リンカーは、式： の群から選ばれる配列を含む。 高度に柔軟性のあるリンカーの一例は、繊維状バクテリアオファージ、例えば バクテリオファージＭ１３またはｆｄのｐIIIタンパク質中に存在するグリシン およびセリンに富むスペーサー部である（Ｓｃｈａｌｌｅｒ等、ＰＮＡＳ ＵＳ Ａ ７２：７３７−７４１，１９７５）。この領域は、ｐIII表面タンパク質の 二つの領域間に長いたわみ性のスペーサー部を提供する。このスペーサー部は次 のアミノ酸配列からなる： 本発明は、エンドペプチダーゼ認識配列を含むリンカーも包含する。このよう な切断部位は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの個々の成分を分離し て、それらが適切に折りたたまれているかそして容器内で活性があるかどうかを 決定するために貴重であるかも知れない。種々なエンドペプチダーゼの例として 、プラスミン、エンテロキナーゼ、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織プラスミ ノーゲン活性化物質、クロストリペイン、キモシン、コラゲナーゼ、ラッセルク サリヘビの毒液プロテアーゼ、ポストプロリン切断酵素、Ｖ８プロテアーゼ、ト ロンビンおよびＸａ因子が挙げられるが、これらに限定されない。 重鎖免疫グロブリンＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤあるいはＩｇＥのヒンジ 領域から得られるペプチドリンカーセグメントは、付着ポリペプチド間に角張っ た関係を与える。システインがセリンで置き換えられたヒンジ領域が特に有用で ある。特に適当な本発明リンカーは、システインがセリンに変わったネズミＩｇ Ｇガンマー２ｂヒンジ領域から誘導された配列である。これらリンカーはまたエ ンドペプチダーゼ切断部位を含むこともある。このようなリンカーの例として下 記の配列が挙げられる： しかし、本発明は用いたリンカー配列の形、寸法または数によって制限を受け ず、リンカーについての唯一の必要条件は、それが機能上、多機能性キメラ造血 レセプターアゴニストの折りたたみおよび働きを妨害しないことである。リンカーＬ2の決定 Ｒ1および（または）Ｒ2に使用されるリンカーＬ2のアミノ酸配列の長さは、 経験的に、あるいは構造上の情報から得られる案内を用いて、あるいはこれら二 つの方法を併用して選ぶことができる。 構造上の情報が手に入らない場合には、試験を行なうために小さいリンカー系 列を調製することができる。それには、０から５０Åの範囲にまたがるようにそ の長さを変え、そして表面露出と一致させるためにその配列を選ぶ(親水性，Hop p & Woods，Mol．Immunol．20:483-489，1983)，Kyte & Doolittle，J．Mol．Bi ol．157:105-132;溶媒暴露表面積，Lee & Richards，J．Mol．Biol．55:379-400 ，1971）設計およびＲ1またはＲ2のコンホメーションを乱すことなく必要なコン ホメーションをとる能力（コンホメーション的にたわみ易い；Karplus & Schulz ，Naturwissenschaften 72:212-213，1985）を利用する。残基１個当り２．０か ら３．８Åの翻訳平均を仮定すると、これは、試験長が０から３０残基となるこ とを意味し、０から１５残基が特に適当な範囲である。このような実験的系列の 代表例は、ｎ回反復される（ｎは１，２，３または４である）「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ −Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」のようなカセット配列を用いてリンカーを組立てることであ ろう。当業者は、リンカーとして役立ちうる、長さまたは組成の種々と変わる多 くのこのような配列があり、第一に考慮すべきことは、それらが過度に長くもな ければ短かくもないということである（Sandhu,Critical Rev，Biotech．12:437 -462，1992参照）。もしこれら配列が長過ぎると、エントロピー効果によって三 次元の折りたたみが不安定化するようであり、また折りたたみが動力学的に実際 的でなくなるかも知れず、そしてもしこれらが短か過ぎると、張力的あるいは立 体的ないずみのため、分子を不安定化するようである。 タンパク質の構造上の情報の解析における専門家は、ｃ−アルファー炭素間の 距離として定義される鎖端間の距離を用いることにより、使用すべき配列の長さ を限定でき、あるいはリンカーの経験による選択で試験せねばならない可能性の 数を少なくとも制限できることを認識するであろう。当業者はまた時には、ｘ− 線回折または核磁気共鳴分光法のデータから導かれる構造モデルでは、ポリペプ チド鎖の両端の位置が明確にされないこと、そしてもしそれが本当であるならば 、要求されるリンカーの長さを適切に算定するために、この状況を考慮する必要 があることをも認識するであろう。それらの位置が明確に述べられている残基か ら、鎖の両端に配列が類似した二つの残基を選び、それらのｃ−アルファー炭素 間の距離を用いてそれらの間のリンカーに対するおよその長さを計算する。計算 された長さを規準として使用して、次にある範囲の残基数をもつリンカーを選ぶ （２から３．８Å／残基を用いて計算）。これらのリンカーは、最初の配列を必 要に応じて短かくしたりあるいは長くしたりした配列から構成することができ、 そして長くしたときは、前述したようにたわみ易くそして親水性にするように追 加残基を選ぶことができ；あるいは任意に、一連のリンカー（一例は前記「Ｇ１ ｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」カセット法である）を使用する代りに、最初の配 列を使用することができ、あるいは任意に、最初の配列と適当な長さをもつ新し い配列とのコンビネーションを使用してもよい。Ｒ1およびＲ2のアミノ末端およびカルボキシル末端の決定 生物学的に活性のある状態に折りたたむことができるＲ1およびＲ2の配列は、 最初のポリペプチド鎖中から、開始（アミノ末端）位置と終止（カルボキシル末 端）位置を適当に選ぶと同時に、上記のようなリンカー配列Ｌ2を用いることに より調製できる。アミノ末端とカルボキシル末端は、下記の指標を用いて、切断 点領域と呼ばれる共通の配列の範囲内から選ばれる。このようにして、新規アミ ノ酸配列は、同じ切断点領域内からアミノ末端とカルボキシル末端とを選ぶこと によりつくり出される。多くの場合、新しい末端の選択は、カルボキシル末端の 最初の位置がアミノ末端のそれより直ぐ先にあるようになるであろう。しかし、 当業者は、領域内のどの場所の末端の選択も機能すること、そしてこれらは新し い配列のアミノおよびカルボキシル部分への付加あるいは欠失いずれかに効果的 に通じるであろうことを認識するであろう。 タンパク質の一次アミノ酸配列が、生物学的機能の発現に必要な三次元構造へ の折りたたみを要求するということは分子生物学の中核的な主義である。タンパ ク質単結晶のｘ−線回折あるいはタンパク質溶液の核磁気共鳴分光法を用いて、 三次元構造の情報を得、そして解釈する方法は当業者にとって公知である。切断 点領域の確認と関係のある構造上の情報に関する例として、タンパク質二次構造 の位置および型(アルファーおよび３−１０らせん、平行および逆平行ベーター シート、鎖の反転および旋回、および輪；Kabsch & Sander，Biopolymers 22:25 77-2637，1983)，アミノ酸残基の溶媒暴露度、残基相互の相互作用の程度と型（ Chothia，Ann．Rev．Biochem．53:537-572，1984）、およびポリペプチド鎖に沿 ったコンホメーションの静的および動的分布(Alber & Mathews，Methods Enzymo l，154:511-533，1987)が包含される。ある場合には、残基の溶媒暴露について 更に情報が知られている；一例は炭水化物の翻訳後の付着部位であり、これは必 然的にタンパク質表面上である。構造上の実験情報が手に入らない、あるいは得 ることが不可能である場合には、タンパク質の三次構造および二次構造、溶媒の 接近し易さ、ならびに旋回および輪の存在を予想するために、一次アミノ酸配列 を分析する方法も利用できる。直接構造法が実行不可能な場合には、表面暴露を 実験的に測定するための生化学的方法も時として応用できる；例えば、表面暴露 を推論するために、制限タンパク質分解の後、鎖切断部位の確認の方法を用いる (Gentile & Salvatore，Eur．J．Biochem．218:603-621，1993)。 従って、実験的に誘導された構造上の情報か、または予想による方法のいずれ かを用いることにより(例えば、Srinivisan & Rose Proteins:Struct.，Funct． & Genetics，22：81-99，1995)、親アミノ酸配列を詳しく調べて、これらが二次 構造および三次構造を維持するために完全か不完全かに従って領域を分類する。 周期的な二次構造（アルファーおよび３−１０らせん、平行および逆平行ベータ ーシート）に含まれることが知られる領域内の配列の存在は避けるべき領域であ る。同様にして、溶媒暴露の程度の低いことが観察される、あるいは予想される 、アミノ酸配列の領域は、いわゆるタンパク質の疎水性芯部の一部であろうと思 われるので、これもアミノ末端およびカルボキシル末端の選択に対して避けるべ きである。これとは著しく違って、表面旋回または輪の中にあることが知られる 、または予想される、領域、そしてとりわけ生物活性の発現に必要でないことが 分かっている領域は、ポリペプチド鎖の末端が位置するのに好適な部位である。 上 記基準に基づいて特に適当とされるアミノ酸配列の連続範囲は切断点領域と呼ぶ 。 更に他のペプチド配列も、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク 質（例えば、ポリーＨｉｓ）の精製または同定を容易にするために加えることが できる。特異的単クローン抗体による多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト タンパク質の迅速な検定と簡便な精製を可能にすると思われる高度に抗原性のペ プチドも加えることができる。 「変異体（ｍｕｔａｎｔ）アミノ酸配列」、「変異体（ｍｕｔａｎｔ）タンパ ク質」、「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）タンパク質」、「ムレイン」、または「変 異体ポリペプチド」は、アミノ酸欠失、置換、またはその両方のために未変性配 列から変わったアミノ酸配列、あるいは未変性配列から内在的につくられた変異 体のヌクレオチド配列によりコード化されたアミノ酸配列を有するポリペプチド を指す。「未変性（自然のままの）配列」とは、野生型あるいは天然型の遺伝子 またはタンパク質と同一のアミノ酸または核酸配列を指す。 造血成長因子は、ヒト造血始原細胞によるコロニー形成を促進する能力により 特徴づけることができる。生ずるコロニーには赤芽球、顆粒球、巨核球、顆粒球 マクロファージおよびそれらの混合が含まれる。造血成長因子の多くは、最初は 霊長類で、その後ヒトで実行された研究において、骨髄機能および末梢血球数を 治療上有益なレベルまで回復させる能力が実証された。造血成長因子のこれら生 物活性の多く、あるいはすべては信号の導入と高親和性レセプター結合を含む。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、単一因子と比較した とき、同じ位の、あるいは更に大きい生物活性を有するといった、あるいは半減 期の向上または不利な副作用の減少、あるいはこれら特性の併合を有することに よって、有用な特性を発揮できる。 アゴニスト活性を殆どあるいは全くもたない多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストは、拮抗物質として、免疫学または免疫療法への使用に供される抗体調 製用の抗原として、遺伝プローブとして、あるいは他の有用なｈＩＬ−３ムテイ ン（ｍｕｔｅｉｎ）をつくるために用いられる中間体として役立ちうる。 本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質の生物活性 は、因子依存性細胞系列におけるＤＮＡ合成により、あるいは容器内骨髄検定に おいてコロニー形成単位を数えることにより測定できる。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、作用が単一の造血アゴニ ストと比較して改善された治療プロフィルをもつ。例えば、本発明に係る若干の 多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、他の造血アゴニストと比較して類 似の、あるいはもっと強力な成長因子活性を有し、同様な、あるいは相応の、副 作用増加を有しない。 本発明は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質をコード化す るＤＮＡ配列、大体類似していて実質的に同じ機能を果すＤＮＡ配列、および本 発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化するＤＮＡとは 、遺伝暗号の縮重のためだけで相違するＤＮＡ配列をも包含する。また本発明に は、オリゴヌクレオチドによりコード化されたポリペプチドおよび変異体ＤＮＡ を組み立てるために使われるオリゴヌクレオチド中間体も包含される。 現在この分野で標準の遺伝工学技術(米国特許第４，９３５，２３３号およびS ambrook等，"Molecular Cloning A Laboratory Manual"，Cold Spring Harbor L aboratory，1989)を本発明に係るＤＮＡ配列の構築に使用できる。一つのこのよ うな方法は、カセット変異誘発（Wells等，Gene 34:315-323，1985）であり、こ の場合プラスミド中の暗号配列の部分を、二つの制限部位の間の遺伝子の部分に 望むアミノ酸置換をコード化する合成オリゴヌクレオチドで置き換える。 望む遺伝子をコード化する相補的合成オリゴヌクレオチドの対をつくり、相互 にアニーリングすることができる。オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列は、求める 遺伝子のアミノ酸に対する配列をコード化するが、ただし置換されたものおよび （または）配列から欠失したものを除く。 プラスミドＤＮＡは選ばれた制限エンドヌクレアーゼで処理し、次にアニーリ ングしたオリゴヌクレオチドに結合させることができる。結合した混合物を用い て適格なＪＭ１０１細胞を適当な抗生物質に対する耐性細胞へ変換できる。単一 コロニーを拾い、望む遺伝子をもつプラスミドを同定するために、制限分析およ び（または）ＤＮＡ配列決定によりプラスミドＤＮＡを調べることができる。 ＤＮＡ配列の少なくとも一つを他のコロニー促進因子のＤＮＡ配列で置き換え た新規多機能性造血アゴニストのＤＮＡ配列のクローン化は、中間ベクターの使 用により成し逐げられる。別法として、ある遺伝子を、他の遺伝子を含むベクタ ー中に直接クローン化することができる。ＤＮＡ配列を結合するために、また失 なわれた配列を置き換えるために、リンカーおよびアダプターを使用できるが、 この場合制限部位は対象領域に対して内部である。従って、一つのポリペプチド 、ぺプチドリンカー、および他のポリペプチドをコード化する遺伝物質（ＤＮＡ ）を、細菌、酵母、昆虫の細胞または哺乳動物細胞の変換に用いる適当な発現ベ クター中に挿入する。変換された有機体を増殖させ、タンパク質を標準技術によ り単離する。それ故に、生じた生成物は新しいタンパク質であって、リンカー領 域により第二のコロニー促進因子に結合されたコロニー促進因子をもつ。 本発明のもう一つの面は、これら新規多機能性キメラ造血レセプターアゴニス トの発現に使用するプラスミドＤＮＡベクターを提供することである。これらベ クターは、本発明に係る新規ペプチドをコード化する前記新規ＤＮＡ配列を含む 。多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを発現しうる微生物を変換すること のできる適当なベクターには、用いた宿主細胞に従って選ばれる転写および翻訳 の調節配列に結合された多機能性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化す るヌクレオチド配列からなる発現ベクターが含まれる。 前記の修飾配列を取り込むベクターは本発明に包含され、そして多機能性キメ ラ造血レセプターアゴニストポリペプチドの製造に役立つ。本法に用いられるベ クターはまた本発明に係るＤＮＡコード化配列と機能的に共同して選ばれた調節 配列を含み、このものは選ばれた宿主細胞中でその複製および発現を方向づけで きる。 本発明のもう一つの方向として、新規多機能性キメラ造血レセプターアゴニス トの製造法が提供される。本発明方法は、新規多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストの発現をコード化するＤＮＡ配列を含むべクターで変換された適当な細 胞または細胞系を培養するものである。適当な細胞あるいは細胞系は細菌の細胞 である。例えば、E．coliの株は、生物工学の分野でよく知られた宿主細胞であ る。このような株の例として、E．coli株JM101(Yanish-Perron等，Gene 33:103- 119，1985)およびMON105（Obukowicz等，Applied Environmental Microbiology 58:1511-1523，1992）が挙げられる。また、バクテリオファージ Mu（Weinberg等，Gene 126:25-33，1993）に基づいたE．coliに対する染色体発 現ベクターを利用する多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質の発 現も本発明に包含される。B.subtilisの種々な株も本法に使用できる。当業者に とって公知の酵母細胞の多くの株も、本発明ポリペプチドの発現に対する宿主細 胞として利用できる。E.coli細胞質で発現させたとき、本発明多機能性キメラ造 血レセプターアゴニストをコード化する遺伝子はまた遺伝子の５’末端にコドン を加えてタンパク質のＮ−末端のところにＭｅｔ-2−Ａｌａ-1あるいはＭｅｔ-1 をコード化するように構築できる。E．coliの細胞質つくられるタンパク質のＮ 末端は、発現時にメチオニンがＮ−末端から切除されるように、メチオニンアミ ノペプチダーゼによる(Ben Bassat等，J．Bac．169:751-757，1987)また多分他 のペプチダーゼによる翻訳後処理によって影響を受ける。本発明多機能性キメラ 造血レセプターアゴニストは、Ｎ−末端にＭｅｔ-1，Ａｌａ-1またはＭｅｔ-2− Ａｌａ-1を有する多機能性キメラ造血レセプターアゴニストペプチドを含みうる 。これら変異体多機能性キメラ造血レセプターアゴニストはまた分泌シグナルペ プチドをＮ−末端へ融合することによりE．coliで発現される。このシグナルペ プチドは分泌過程の一部としてポリペプチドから切断される。E．coliにおける 遺伝子の高レベル発現を成し遂げるための追加的戦略はSavvas，C．M．（Microb iological Reviews 60:512-538，1996）に見出される。 またチャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）のような、哺乳動物細胞も 本発明への使用に適している。哺乳動物細胞における外来遺伝子の一般的発現方 法は、Kaufman，R．J.，1987）Genetic Engineering，Principles and Methods ，Vol．9，J．K．Setlow，editor，Plenum Press，New Yorkに論評されている。 哺乳動物細胞内で機能しうる強力なプロモーターが真核の分泌シグナルペプチド コード化領域の転写を推進する発現ベクターが構築される。前記領域は、多機能 性キメラ造血レセプターアゴニストをコード化する領域へ翻訳的に結合される。 例えば、pc DNA I/Neo，pRc/RSU，およびpRc/CMV（Invitrogen Corp.,サン ジ ェゴ、カリフォルニア州から得られる）のようなプラスミドを使用できる。真核 分泌シグナルペプチドコード化領域は遺伝子そのものに由来してもよく、あるい は他の分泌哺乳動物タンパク質から得てもよい(Bayne，M．L．等，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 84:2638-2642，1987)。遺伝子を含むベクターの構築後、ベクタ ーＤＮＡを哺乳動物細胞中に移入する。このような細胞は、例えば、COS7，HeLa ，BHK，CHO、またはマウスＬ−系統でよい。これら細胞を、例えばＤＭＥＭ培地 （JRH Scientific）で培養できる。培地中に分泌されたポリペプチドは、細胞の 移入後あるいは抗生物質耐性に対する選択の後に安定な細胞系の確立後、２４− ７２時間の過渡的発現の後に、標準の生化学的方法により回収できる。適当な哺 乳動物宿主細胞の選択ならびに変換、培養、増幅、スクリーニングおよび生成物 の生産と精製はこの分野で公知である。例えば、Gething and Sambrook，Nature ，293:620-625，1981)、あるいは別法としてKaufman等，Mol．Cell．Biol.，5(7 ):1750-1759，1985）あるいはHowley等、米国特許第４，４１９，４４６号参照 。他の適当な哺乳動物細胞系はサルＣＯＳ−１細胞系である。同様に有用な哺乳 動物細胞系はＣＶ−１細胞系である。 望む場合には、本発明方法において、宿主細胞として昆虫細胞を利用できる。 例えば、Miller等，Genetic Engineering，8:277-298(Plenum Press 1986)およ びそこに引用された参考文献参照。更にまた、バキュロウィルスベクターを使用 する昆虫細胞での外来遺伝子の一般的発現法は、Summers，M．D.およびSmith，G ．E.，1987−バキュロウィルスベクターおよび昆虫細胞培養手順の方法のマニュ アル、Texas Agricultunal Experiment Station Bulletin No．1555に記載され ている。バキュロウィルス伝達ベクターからなる発現ベクターを構築するが、こ の場合、強力なバキュロウィルスプロモーター（例えば、ポリヘドロンプロモー ター）が、真核分泌シグナルペプチドコード化領域の転写を推進する。該領域は 、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストポリペプチドをコード化する領域へ 翻訳的に結合される。例えば、プラスミドpVL 1392(Invitrogen Corp.，サンジ ェゴ、カリフォルニア州から得られる)を使用できる。多機能性キメラ造血レセ プターアゴニストポリペプチドをコード化する遺伝子を運ぶベクターの構築後、 このＤＮＡ２マイクログラムを、昆虫細胞、株ＳＦ９、中へ、バキュロウィルス ＤＮＡ（Summers & Smith，1987参照）１マイクログラムと共に同時移入する。 多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを運ぶ純粋な組換えバキュロウィルス を用いて、例えばExcell 401無血清培地（JRH Biosciences，Lenexa，カンサス 州）中で培養した細胞を感染させる。培地中に分泌された多機能性キメラ造血レ セプターアゴニストは、標準の生化学的方法で回収できる。多機能性キメラ造血 レセプターアゴニストタンパク質を発現する哺乳動物あるいは昆虫の細胞から得 た上澄は、最初幾つかの市販濃縮装置のいずれかを用いて濃縮できる。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、造血系統あるいはそれら の併合系統の背髄性、赤芽球性、リンパ系、あるいは巨核球の細胞の濃度減少に よって特徴づけられる疾患の治療に有用である。更に、これらアゴニストは、骨 髄性細胞および（または）リンパ系細胞の成熟を活性化するために使用できる。 本発明ポリペプチドによる治療を受けるのに適した症状には、白血球減少症があ る。この病気は末梢血液中の循環する白血球の数の減少である。白血球減少症は ある種のウィルスまたは放射線に対する暴露により誘発される。これは種々な形 式の癌療法、例えば化学療法剤、放射線に対する暴露、ならびに感染症や出血の 副作用であることが多い。本発明に係るこれら多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストによる白血球減少症の治療は、現在入手できる薬剤を用いる治療により 起こる望ましくない副作用を避けることができる。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、好中球減少症の治療に、 例えば無形成性貧血、周期性好中球減少症、特発性好中球減少症、チェディアッ ク・東症候群、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、白血病、背髄形成異常症候群およ び骨髄線維症といった症状の治療に有用である。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、血小板減少症の治療また は予防に有用であろう。血小板減少症に対する現在唯一の治療法は血小板輸注で あり、この方法は経費が高く、感染（ＨＩＶ，ＨＢＶ）および同種免疫の重大な 危険をもたらす。本多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは血小板輸注の必 要性を軽減あるいは減少させることができる。遺伝的欠陥、例えばファンコニ貧 血、ウィスコット−アルドリッチ、あるいはメイヘグリン症候群から、重篤な血 小板減少症が起こることがある。後天性血小板減少症は、例えば免疫血小板減少 症紫斑病、全身性紅斑性狼瘡、溶血性貧血、あるいは胎児・母体間不適合におけ るように自己または同種抗体から起こることがある。更にまた、血小板減少症に おいては、脾腫大、汎発性血管内凝固、血栓性血小板減少性紫斑病、人工心臓弁 の感染症が起こりうる。癌の化学療法および（または）放射線療法からも重篤な 血小板減少症が起こりうる。血小板減少症はまた癌、リンパ腫、白血病または線 維症による髄侵入からも起こりうる。 本発明に係る多機能キメラ造血レセプターアゴニストは、末梢血中の造血始原 細胞および幹細胞の起動に役立つ。末梢血由来の始原細胞は、自家髄移植の固定 の際、患者を再構成する場合に有効であることが示された。Ｇ−ＣＳＦおよびＧ Ｍ−ＣＳＦを含めて造血成長因子は、末梢血中の循環始原細胞および幹細胞の数 を高めることが示された。このことは末梢幹細胞収集のための操作を単純化し、 必要な成分除去の数を減らすことによって手順コストを劇的に引下げる。多機能 キメラ造血レセプターアゴニストは、幹細胞の起動に役立ち、末梢幹細胞移植の 効率を更に高めることができる。 本発明に係る多機能キメラ造血レセプターアゴニストは、造血前駆体および幹 細胞の生体外拡張にも役立つ。コロニー促進因子（ＣＳＦ）、例えばｈＩＬ−３ は、高用量化学療法後、しばしばこのような治療の結果として起こる好中球減少 症および血小板減少症を治療するために、単独で、他のＣＳＦと共同して、ある いは骨髄移植と併合して投与された。しかし、重篤な好中球減少症および血小板 減少症の期間は完全には除かれない。単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球 を含む）および巨核球からなる骨髄性系統は、生命をおびやかすことがある感染 症および出血の防止に重要である。好中球減少症および血小板減少症はまた病気 、遺伝的障害、薬物、毒素、放射線および従来からの腫瘍学療法といった多くの 療法処置の結果でもありうる。 骨髄移植がこの患者集団の治療に使用されて来た。しかし、骨髄の使用に関連 して、（１）骨髄、脾臓、または末梢血中の幹細胞の数が制限される、（２）移 植片対宿主病、（３）移植片拒絶、および（４）腫瘍細胞による可能な汚染を含 めて、妥協して処理した造血系を再構成するために幾つかの問題がある。幹細胞 は、骨髄、脾臓、および末梢血中の有核細胞の非常に小さい百分率を占める。よ り多数の幹細胞が造血回復を促進するような用量応答が存在する。従って、幹細 胞の容器内展開は造血の回復および患者の生存を高めるに違いない。同種間提供 者からの骨髄が移植用骨髄を得るために使用されて来た。しかし、ＨＬＡ適合同 胞提供者と受容者においても移植片対宿主病および移植片拒絶が骨髄移植を制限 している。同種間骨髄移植に代るものは、自家骨髄移植である。自家骨髄移植に おいては、患者自身の骨髄の若干を、骨髄切除療法、例えば、高用量化学療法、 に先立ち採取し、その後患者へ移植し戻す。自家移植片は、移植片対宿主病およ び移植片拒絶の危険を取り除く。しかし、自家骨髄移植は、髄中の幹細胞の数が 限られていることおよび腫瘍細胞による可能な汚染に関して依然問題を提出する 。幹細胞数の制約は幹細胞の生体外展開によって克服できる。その上、幹細胞は 、髄移植の腫瘍細胞汚染を減らすため、ＣＤ３４＋といった特異的表面抗原の存 在に基づき、幹細胞を特異的に単離できる。 下記特許は、幹細胞、ＣＤ３４＋細胞の分離、造血因子をもつ細胞の培養、造 血障害をもつ患者の処置に対する細胞の使用、および細胞拡張ならびに遺伝子治 療に対する造血因子の使用に関して、更に詳細事項を含んでいる。 ５，０６１，６２０は、特定の目的のための細胞から幹細胞を分離することに より提供されるヒト造血幹細胞からなる組成物に関する。 ５，１９９，９４２は、（１）患者から造血始原細胞を得；（２）ＩＬ−３、 ｆｌｔ３リガンド、ｃ−キットリガンド、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳ Ｆ／ＩＬ−３融合タンパク質およびこれらのコンビネーションからなる群から選 ばれる、成長因子をもつ細胞の生体外展開；（３）細胞製剤を患者へ投与する、 ことからなる自家造血細胞移植の方法を記載している。 ５，２４０，８５６は、細胞分離過程を自動的に制御するための装置を含む細 胞分別器に関する。 ＷＯ９１／１６１１６は、標的細胞を細胞混合物から選択的に単離し、分ける 装置および方法を記載している。 ＷＯ９１／１８９７２は、中空繊維バイオリアクターを使用して、骨髄細胞の 浮遊液をインキュベートすることによる、骨髄の容器内培養法を記載している。 ＷＯ９２／１８６１５は、サイトカインの特別な混合物を含む培地中で、移植 に用いるために、骨髄細胞を維持しかつ拡張する方法に関する。 ＷＯ９３／０８２６８は、（ａ）ＣＤ３４＋幹細胞を他の細胞から分離し、（ ｂ）分離した細胞を選択的培地で、幹細胞が選択的に展開されるようにインキ ュベートするという工程からなる、幹細胞を選択的に展開する方法を記載してい る。 ＷＯ９３／１８１３６は、末梢血から誘導された哺乳動物細胞の容器内維持法 を記載している。 ＷＯ９３／１８６４８は、ヒト好中球前駆細胞を高含有量の骨髄芽球および前 骨髄球と共に含有してなり、そして遺伝的あるいは後天的な好中球減少症治療用 の組成物に関する。 ＷＯ９４／０８０３９は、ｃ−キットタンパク質を発現する細胞を選択するこ とにより、ヒト造血幹細胞を濃厚化する方法を記載している。 ＷＯ９４／１１４９３は、カウンターフロー傾しゃ法を用いて単離される幹細 胞集団（ＣＤ３４＋で、大きさは小である）を記載している。 ＷＯ９４／２７６９８は、不均一細胞混合物から核形成不均一細胞集団を選択 的に分離するための、イムノアフィニティー分離と連続流動遠心分離とを併合す る方法に関する。 ＷＯ９４／２５８４８は、標的細胞の収集および処理のための細胞分離装置を 記載している。 ＩＬ−１ａ，ＩＬ−３，ＩＬ−６あるいはＧＭ−ＣＳＦを含む培養中ヒト骨髄 から得られる造血始原細胞の高度に濃厚化されたＣＤ３４＋前駆体の長期培養が Brandt等，J．Clin．Invest．86:932-941，1990に議論されている。 本発明の一面は、幹細胞の選択的生体外展開のための方法を提供することにあ る。「幹細胞」という用語は、全能性造血幹細胞ならびに初期前駆体および始原 細胞を指し、これらは骨髄、脾臓または末梢血から単離できる。用語「展開」と は細胞の分化と増殖を指す。本発明は、幹細胞の選択的生体外展開のための方法 を提供するものであり、本法は（ａ）幹細胞を他の細胞から分離し、（ｂ）前記 の分離された幹細胞を、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質（ 複数のことがある）を含む選択的培地で培養し、そして（ｃ）前記幹細胞を回収 する、という諸工程からなる。幹細胞、ならびに前駆細胞（始原細胞）（好中球 、赤血球、血小板などになるように運命づけられている）は、大抵の他の細胞か ら、これら細胞の表面上に存在するＣＤ３４といった個々の始原細胞マーカー 抗原の存否により、そして（または）形態学的特徴により区別できる。高度に濃 厚化されたヒト幹細胞フラクションの表現型は、ＣＤ３４＋、Ｔｈｙ−１＋およ びｌｉｎ−と報告されているが、本発明はこの幹細胞集団の展開に制限されない 。ＣＤ３４＋に富むヒト幹細胞フラクションは、報告された幾つかの方法、例え ばＣＤ３４＋と云った表面抗原に対して向けられた抗体を使用するアフィニティ ーカラムまたはビーズ、磁気ビーズまたはフローサイトメトリー、により分離で きる。更にまた、カウンターフロー傾しゃ法といった物理的分離法を用いて造血 始原細胞を濃厚化することもできる。ＣＤ３４＋始原細胞は不均一であり、異な る系統に付随する細胞表面付着分子の共同発現の存否により特徴づけられた幾つ かの小集団に分割される。最も未成熟な始原細胞は、既知系統付随マーカー、例 えばＨＬＡ−ＤＲまたはＣＤ３８、を発原せず、ＣＤ９０（ｔｈｙ−１）を発原 するかも知れない。他の表面抗原、例えばＣＤ３３，ＣＤ３８，ＣＤ４１，ＣＤ ７１，ＨＬＡ−ＤＲまたはｃ−ｋｉｔも造血始原細胞を選択的に単離するために 使用できる。分離された細胞は、培養フラスコ、無菌バッグ中で、または中空繊 維中で、選ばれた培地でインキュベートできる。細胞を選択的に展開するために 、種々なコロニー促進因子を利用できる。骨髄の生体外展開に利用されて来た代 表的因子の例として、ｃ−ｋｉｔリガンド，ＩＬ−３，Ｇ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳ Ｆ，ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−１１，ｆｌｔ−３リガンドまたはこれらのコン ビネーションが挙げられる。幹細胞の増殖は、幹細胞および他の細胞の数を、標 準技術（例えば、ヘマサイトメーター（hemacytometer）、ＣＦＵ、ＬＴＣＩＣ ）により、あるいはインキュベーション前後でのフローサイトメトリーにより、 数えることによってモニターできる。 幹細胞の生体外展開の幾つかの方法において、種々なコロニー促進因子、例え ばｃ−ｋｉｔリガンド(Brandt等，Blood 83:1507-1514[1994]，McKenna等，Bloo d 86:3413-3420[1995])，IL-3(Brandt等，Blood 83:1507-1514[1994],Sato等，B lood 82:3600-3609[1993])，G-CSF(Sato等，Blood 82:3600-3609[1993])，GM-CS F(Sato等，Blood 82:3600-3609[1993])，IL-1(Muench等，Blood 81:3463-3473[1 993])，IL-6(Sato等，Blood 82:3600-3609[1993]),IL-11(Lemoli等，Exp．Hem． 21:1668-1672[1993]，Sato等，Blood 82:3600- 3609[1993])，flt-3リガンド（McKenna等，Blood 86:3413-3420[1995]）および （または）そのコンビネーション（Brandt等，Blood 83:1507-1514[1994],Haylo ck等,Blood 80:1405-1412[1992]，Koller等，Biotechnology 11:358-363[1993] ，(Lemoli等，Exp．Hem．21:1668-1672[1993])，McKenna等，Blood 86:3413-342 0[1995]，Muench等，Blood 81:3463-3473[1993]，Patchen等，Biotherapy 7:13- 26[1994]，Sato等，Blood 82:3600-3609[1993]，Smith等，Exp．Hem．21:870-87 7[1993]，Steen等，Stem Cells 12:214-224[1994],Tsujino等，Exp．Hem．21:13 79-1386[1993]）を使用する幾つかの選択法および展開を利用する方法が報告さ れた。個々のコロニー促進因子のうち、ｈＩＬ−３は末梢血ＣＤ３４＋細胞の展 開において最も強力な一つであることが示された(Sato等，Blood 82:3600-3609[ 1993]，Kobayashi等，Blood 73:1836-1841[1989])。しかし、単一因子は多重因 子のコンビネーションと同じ位有効であるとは示されなかった。本発明は、単一 因子単独よりも効果的な多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを利用する生 体外展開法を提供するものである。 本発明のもう一つの面は、培地を入れた培養容器中に細胞を接種することから なる造血前駆体細胞を維持しそして（または）展開する方法を提供することであ る。前記培地は、ストローマ細胞系、例えばＨＳ−５に暴露することにより整調 し（WO96/02662，Roecklein and Torok-Strob，Blood 85:997-1105，1995）そし て本発明多機能性造血キメラレセプターアゴニストで補充したものである。 また、本発明に係る多機能性造血キメラレセプターアゴニストの用途の中に血 液銀行業務の応用面があることも構想されている。この場合、ＥＰＯレセプター アゴニストを患者に与えて血球数を増加させ、ある医学的手順に先立ち患者から 血液生成物を取出す。この血液生成物を貯蔵し、医学的手続きの後患者に輸血し 戻す。更にまた、多機能性造血キメラレセプターアゴニストの用途の中に、血液 提供に先立ち、多機能性造血キメラレセプターアゴニストを血液提供者に投与し て血球数を増加させ、それによって提供者が一層多くの血液を安全に提供できる ようにするという利用法もあるであろう。 成長因子のもう一つの計画された臨床上の使用は、遺伝子治療のための造血前 駆体および幹細胞の容器内活性化にある。造血始原細胞は生存期間が長く、そし て身体全体に隈なくそれらの娘細胞が分布しているので、造血始原細胞は、生体 外遺伝子移入のための良い候補である。造血始原細胞または幹細胞のゲノム中に 関心のある遺伝子を取り込ませるためには、細胞分裂およびＤＮＡ複製を促進す る必要がある。造血幹細胞は非常に短い頻度で循環する。このことは、成長因子 が遺伝子導入の増進に役立ち、それによって遺伝子治療に対する臨床的期待が高 まることを意味する。遺伝子治療の可能性のある応用面(Crystal，Science 270: 404-410[1995]参照）の例として、（１）多くの先天的代謝障害および免疫不全 の治療(Kay and Woo，Trends Genet．10:253-257[1994])、（２）神経学的障害( Friedmann,Trends Genet．10:210-214[1994])、（３）癌（Culver and Blaese， Trends Genet．10:174-178[1994]）および（４）伝染病(Gilboa and Smith，Tre nds Genet．10:139-144[1994])が挙げられる。 遺伝物質を宿主細胞中に導入する、当業者にとって公知の幾つかの方法がある 。ウィルス性および非ウィルス性両方の幾つかのベクターが、治療用遺伝子を一 次細胞中に移すために開発された。ウィルスを基本とするベクターには（１）複 製不全組換えレトロウイルス(Boris-Lawrie and Temin，Curr．Opin．Genet．De v.3:102-109[1993]，Boris-Lawrie and Temin，Annal．New York Acad．Sci.716 :59-71[1994]，Miller，Current Top．Microbiol．Immunol．158:1-24[1992])お よび複製不全組換えアデノウィルス(Berkner，BioTechniques 6:616-629[1998] ，Berkner，Current Top．Microbiol．Immunol．158:39-66[1992],Brody and Cr ystal，Annal．New York Acad．Sci．716:90-103[1994]がある。非ウィルス基本 ベクターには、タンパク質／ＤＮＡ複合体(Cristiano等，PNAS USA．90:2122-21 26[1993]，Curiel等，PNAS USA 88:8850-8854[1991]，Curiel,Annal．New York Acad．Sci．716:36-58[1994])，エレクトロポレーションおよびリポソーム媒介 投与法、例えば陽イオン性リポソーム類(Farhood等，Annal.New York Acad．Sci ．716:23-35[1994])が包含される。 本発明は、改善された生物学的活性、例えば単一コロニー促進因子によっては 見られない活性、を有する多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質 を利用する方法を提供するという点において、新しい遺伝物質を導入した、造血 細胞を展開させる現行法の改良法を提供する。 多くの薬物は、骨髄抑制あるいは造血不全を起こすことがある。このような薬 物の例は、ＡＺＴ，ＤＤＬ、アルキル化剤および抗代謝産物（化学療法に使用さ れる）、抗生物質、例えばクロラムフェニコール、ペニシリン、ガンシクロビル 、ダウノマイシンおよびサルファ剤、フェノチアゾン、トランキライザー、例え ばメプロバメート、鎮痛剤、例えばアミノピリンおよびジピロン、抗けいれん薬 、例えばフェニトインまたはカルバマゼピン、抗甲状腺薬、例えばプロピルチオ ウラシルおよびメチマゾールおよび利尿剤である。本発明に係る多機能性キメラ 造血レセプターアゴニストは、これら薬物で治療された患者にしばしば起こる骨 髄抑制または造血不全の防止または治療に有用である。 造血不全は、ウィルス、微生物、あるいは寄生虫による感染症の結果として、 また腎臓病あるいは腎臓不全に対する処置、例えば透析の結果としても起こりう る。本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストは、このような造血不全の 治療に有用である。 造血不全の治療法として、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを含む医 薬組成物の患者への投与がある。本発明多機能キメラ造血レセプターアゴニスト はまた、造血前駆細胞を患者に注射する前に、これら細胞を本発明多機能キメラ 造血レセプターアゴニストタンパク質で容器内処理することにより、造血前駆体 細胞の活性化と増幅を行なうためにも有用である。 例えば、Ｔおよび（または）Ｂリンパ球における種々な免疫不全、あるいは免 疫障害、例えば慢性関節リウマチ、も、本発明多機能キメラ造血レセプターアゴ ニストでの処置により有利な影響を受ける。免疫不全は、ウィルス感染症、例え ばＨＴＬＶＩ，ＨＴＬＶII，ＨＴＬＶIII、重い放射線暴露、癌療法の結果であ り、あるいは他の医学的処置の結果でもある。本発明多機能性キメラ造血レセプ ターアゴニストは、血小板減少症（血小板欠乏）、あるいは貧血を含めて、他の 血球欠乏症の治療に、単独で、または他のコロニー促進因子と併合して使用する こともできる。これら新規ポリペプチドに適した他の使用は、骨髄移植から回復 中の患者の生体内および生体外治療であり、また診断的あるいは治療的使用に向 けて標準法により発生させた単クローンおよび多クローン抗体の展開においてで ある。 本発明の他の面は、前述した諸症状の治療に向けての方法および治療組成物で ある。このような組成物は、治療上有効な量の一種以上の本発明多機能キメラ造 血レセプターアゴニストを製薬上容認しうる担体との混合物として含有する。こ の組成物は、非経口的に、静脈内に、または皮下に投与できる。本発明において 、使用に供される治療組成物を投与する場合には、発熱物質を含まない、非経口 的に容認できる水溶液の形をとるのがよい。このような非経口的に容認しうるタ ンパク質溶液の製造は、ｐＨ、等張性、安定性などを当然考慮した専門分野の裁 量内にある。 本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストのもう一つの意図した用途は 、免疫化に向けた補助剤として使用すべき、前駆体からの多数の樹枝状細胞の発 生に対してである。樹枝状細胞は免疫系において非常に重要な役割を演じている 。これらは休止Ｔ細胞の活性化に最も能率的に働く専門の抗原提供細胞であり、 生体内で単純なＴ細胞の活性化のための、従って一次免疫応答の開始のための主 要な抗原提供細胞である。これらは、腫瘍特異的溶性抗原（Ａｇ）を取り込み、 処理し、そして提供する。樹枝状細胞は、単純Ｔ細胞を密集させ、そして主要組 織適合性複合体（ＭＨＣ）および共同促進性分子の発現調節、サイトカインの産 生、およびリンパ器官に向かっての移動を早めることによりＡｇとの出会いに応 答する独特の能力をもつ。樹枝状細胞は、ＣＤ４−依存性免疫反応のための新生 抗原に対して宿主を感作するのに中心的重要性をもつので、これらはまた腫瘍免 疫の発生と調節に非常に重要な役割を演じている。 樹枝状細胞は顆粒球およびマクロファージに共通の骨髄ＣＤ３４＋前駆体に由 来し、純粋な樹枝状細胞コロニーを生ずる別個の樹枝状細胞コロニー形成単位（ ＣＦＵ−ＤＣ）の存在がヒトで確立されている。その上、ポスト−ＣＦＵＣＤ１ ４＋中間体が、明確なサイトカイン条件の下で樹枝状細胞あるいはマクロファー ジ経路に沿って分化する潜在能力について記述された。このビポテンシャル（bi potential）前駆体は、骨髄、臍帯血、および末梢血中に存在する。樹枝状細胞 は、培養樹枝状細胞の成熟を詳細に表わす特異的な細胞表面マーカー、例えばCD 1a+，CD3-，CD4-，CD20-,，CD40+，CD80+，およびCD83+に基づいて単離できる。 樹枝状細胞に基づく戦略は、腫瘍および感染作用因子に対する免疫応答を高め る方法を提供する。ＡＩＤＳは樹状細胞に基づく治療を使用できるもう一つの病 気である。それは、樹状細胞がＨＩＶ−１複製の増進に主要な役割を演じること ができるからである。免疫療法は、癌患者からの樹状細胞の誘発、外科的に取り 出された腫瘍塊から導かれる腫瘍Ａｇへの容器内暴露、および腫瘍患者へのこれ ら細胞の再注入を必要とする。腫瘍細胞の比較的粗製の膜調製物は、腫瘍抗原の 分子同定の必要性を避けて、腫瘍抗原の給源として十分であろう。腫瘍抗原はま た合成ペプチド、炭水化物、または核酸配列でもよい。更にまた本発明に係る多 機能性キメラ造血レセプターアゴニストのようなサイトカインの同時投与は、腫 瘍免疫の誘導を更に容易にすることができる。本発明多機能性キメラ造血レセプ ターアゴニストを、腫瘍患者へ他の造血成長因子と共に、あるいは単独で投与す ることにより、樹状細胞の数を増加させ、内因性腫瘍抗原を樹状細胞上に存在さ せるという免疫療法が生体内設定で可能であることが予測される。また、生体内 免疫療法は外因性抗原を用いても可能であるとする構想もある。また、免疫療法 治療は、本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストを単独で、あるいは他 の造血成長因子と共に、患者へ投与し、患者から樹状細胞前駆体または成熟樹状 細胞を取り出し、樹状細胞を抗原に暴露し、そして樹状細胞を患者に戻すことに よる、樹状細胞前駆体あるいは成熟樹状細胞の起動を含みうることも構想される 。更にまた、取り出された樹状細胞を、本発明に係る多機能性キメラ造血レセプ ターアゴニスト単独と、あるいは他の造血成長因子と共に生体外培養して、抗原 への暴露に先立ち樹状細胞の数を増加させる。樹状細胞を基本とする戦略はまた 自己免疫疾患における免疫応答を減少させる方法も提供する。 樹状細胞に関する研究は、この細胞を十分な数で、また合理的に純粋な形で調 製する際の困難により著しく妨げられて来た。生体外細胞展開の設定においては 、顆粒球−マクロファージコロニー促進因子（ＧＭ−ＣＳＦ）と腫瘍壊死因子− α（ＴＮＦ−α）とが、骨髄、臍帯血、または末梢血から回収された造血始原細 胞（ＣＤ３４＋細胞）からの樹状細胞の生体外誘発で共同し、ｆｌｋ−２／ｆｌ ｔ−３リガンドとｃ−ｋｉｔリガンド（幹細胞因子〔ＳＣＦ〕）が相乗作用する ことにより樹状細胞のＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦ−α誘導発生を高める(Siena，S.等 Experimental Hematology 23:1463-1471，1995)。また、免疫療法に供するのに 十分量の樹状細胞を得るため、本発明に係る多機能性キメラ造血レセプターアゴ ニストを使用する樹状細胞前駆体または成熟樹状細胞の生体外展開法も提供され る。 前記症状の治療法に含まれる投薬計画は、薬剤の作用を変化させる種々な因子 、例えば患者の体調、体重、性別および食餌、感染の軽重、投与回数および他の 臨床的因子を考慮して主治医により決定されるであろう。一般に、一日計画は、 体重１キログラム当り多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質０． ２−１５０μｇ／ｋｇの範囲内でよい。投与量は、与えられた多機能性キメラ造 血レセプターアゴニストタンパク質の活性に関して調節されるであろうが、投与 計画は体重１キログラム当り０．１マイクログラム／日といった低用量および１ ミリグラム／日といった高用量を含みうることに注目しても不合理ではない筈で ある。更にまた、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの投与量を、体重１ キログラム当り０．２−１５０マイクログラムの範囲より高くも低くも調節すべ き特殊な環境が存在する。それらには、他のコロニー促進因子あるいは成長因子 のＩＬ−３変異体との共同投与；化学療法薬剤および（または）放射線との共同 投与；グリコシル化多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質の使用 ；および本明細書中で以前に述べた種々な特許関連刊行物が含まれる。前述した 通り、治療法および組成物は、他のヒト因子との共同投与も含みうる。本発明ポ リペプチドとの同時または連続，共同投与に供される他の適当なコロニー促進因 子（ＣＳＦ）、サイトカイン、リンホカイン、造血成長因子およびインターロイ キンα一覧（これだけに限らない）には、GM-CSF，G-CSF，c-mplリガンド(TPOま たはMGDFとしても知られる），M-CSF，エリトロポイエチン(EPO)，IL-1，IL-4,I L-2，IL-3，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13,IL-1 5，IL-16，LIF，f1t3/f1k2リガンド、Ｂ−細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子及び 好酸性分化因子、幹細胞因子（ＳＣＦ）（スチール因子またはｃ−ｋｉｔリガン ドとしても知られる）、あるいはこれらのコンビネーションが包含される。上記 投与量は、治療組成物中のこのような追加成分を補償するように調節されるであ ろう。治療を受ける患者の進行は血液学的プロフイルの定期的な評価、例えば血 球数計数などによりモニターできる。材料および方法 特に断らない限り、すべての特製化学薬品は、Sigma，Co．（セントルイス、 ＭＯ）から得た。制限エンドヌクレアーゼおよびＴ４ＤＮＡリガーゼはNew Engl and Biolabs（ベバーリイ、ＭＡ）またはBoehringer Mannheim（インディアナポ リス、ＩＮ）から得た。E.coli 株の転換 E.coli株、例えばＤＨ５ａTM(Llfe Technologies，Gaithersburg，MD)および ＴＧ１（Amersham Corp.，アーリントンハイツ、ＩＬ）を連結反応の転換に使用 し、また哺乳動物細胞移入のためのプラスミドＤＮＡ源とする。E.coli株、例え ばJM101(Yanisch-Perron,等，Gene，33:103-119，1985)およびMON105（Obukowic z，等，Appl．and Envir．Micr.,58:1511-1523，1992）を、細胞質または細胞周 辺腔において本発明多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの発現に使用でき る。 MON105 ATCC#55204:F-，ラムダ-，IN(rrnD，rrE)1，rpoD+，rpoH358 DH5aTM:F-，phi80d1acZdeltaM15,デルタ(1acZYA-argF)U169，deoR，recAl,endAl ，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE441amda-，thi-1，gyrA96，re1A1 TG1:デルタ(lac-pro)，supE，thi-1，hsdD5/F’(traD36，proA+B，lacIq,lacZde ltaM15) JM101ATCC#33876:delta(pro lac)，supE，thi，F’(traD36，proA+B+，lacIq,la cZdeltaM15) ＤＨ５ａTMサブクローニング（Subcloning）能率細胞は応答能のある細胞とし て購入し、製造業者のプロトコールを用いてすぐ転換に供されるが、E.coli株Ｔ Ｇ１とＭＯＮ１０５は、両者共ＣａＣｌ2法を用いてＤＮＡを取り込む受容能を 付与するようにする。典型的には、２０から５０ｍｌの細胞をＬＢ培地（１％Ｂ ａｃｔｏ−トリプトン、０．５％Ｂａｃｔｏ−酵母エキス、１５０ｍＭ ＮａＣ ｌ）中で、Baush & Lomb Spectronic分光光度計（Rochester，NY）によって測定 したとき、６００ナノメーターにおいて約１．０光学密度単位の密度まで増殖さ せた。細胞を遠心により集め、５分の１培養体積のＣａＣｌ2溶液（５０ｍＭ ＣａＣｌ2，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．４）中に再浮遊させ、 ４℃に３０分保持した。細胞を再び遠心により集め、１０分の１培養体積のＣａ Ｃｌ2溶液中に再浮遊させた。連結ＤＮＡをこれら細胞０．２ｍｌへ加え、試料 を４℃で３０−６０分保持した。試料を４２℃に２分間移行させ、１．０ｍｌの ＬＢを加えた後試料を３７℃で１時間振盪した。これら試料からの細胞を、アム ピシリン耐性転換体を選別するときには、アムピシリン（１００マイクログラム ／ｍｌ、ｕｇ／ｍｌ）を、あるいはスペクチノマイシン耐性転換体を選別すると きには、スペクチノマイシン（７５ｕｇ／ｍｌ）を含むプレート（ＬＢ培地＋１ ．５％Ｂａｃｔｏ−寒天）上に広げる。プレートを３７℃で一晩インキュベート する。コロニーを拾い、ＬＢ＋適当な抗生物質（１００ｕｇ／ｍｌのアムピシリ ンまたは７５ｕｇ／ｍｌのスペクチノマイシン）中に接種し、振りまぜながら３ ７℃で培養する。新しいＮ−末端／Ｃ−末端をもつ遺伝子の創作法 方法Ｉ．リンカー領域（Ｌ2）を含む新しいＮ−末端／Ｃ−末端を有する遺伝子 の創作。 最初のＣ−末端とＮ−末端を隔てるリンカー領域（Ｌ2）を含む新しいＮ−末 端／Ｃ−末端をもつ遺伝子は、L．S．Mullins,等（J．Am．Chem．Soc．116,5529 -5533，1994）により述べられた方法に本質的に従ってつくられる。ポリメラー ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の多段階を用いて、タンパク質の一次アミノ酸配列を コード化するＤＮＡ配列を再編成させる。これら工程を図２に示す。 最初の段階においては、最初のプライマーセット（「新しい出発点」および「 リンカー出発点」）を用いて、最初の遺伝子配列から、新しいタンパク質の新し いＮ−末端部分、次いで最初のタンパク質のＣ−末端およびＮ−末端を連結する リンカー（Ｌ2）をコード化する配列を含むＤＮＡ断片（「断片出発点」）をつ くり出しそして増幅する。第二段階においては、二番目のプライマーセット（「 新しい停止点」および「リンカー停止点」）を用いて、最初の遺伝子配列から、 上で用いたと同じリンカー、次いで新しいタンパク質の新しいＣ−末端部分をコ ード化するＤＮＡ断片（断片停止点」）をつくり出し、そして増幅する。「新し い出発点」および「新しい停止点」プライマーは、新しい遺伝子を発現プラスミ ド中にクローン化させる適当な制御部位を含むうよに設計される。典型的 なＰＣＲ条件は、９５℃２分間融解１サイクル、９４℃１分間変性２５サイクル 、５０℃１分問アニーリング、そして７２℃１分間拡張；＋７２℃７分間拡張１ サイクルである。Perkin Elmer Gene Amp PCR Core試薬キットを用いる。１０ ０ｕｌの反応は、各プライマー１００ｐモルおよびテンプレートＤＮＡ１ｕｇ； および１×ＰＣＲ緩衝剤、２００ｕＭｄＧＴＰ，２００ｕＭｄＡＴＰ，２００ｕ ＭｄＴＴＰ，２００ｕＭｄＣＴＰ，２．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラ ーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡ熱サイ クラー（Perkin Elmer Corporation，ノルウォーク，CT）で実行する。 「断片出発点」および「断片停止点」は、リンカー領域に相補的配列を、そし てリンカーの両側に２個のアミノ酸をコード化する配列を有し、そして３番目の ＰＣＲ段階で互につなげられ新しいタンパク質をコード化する完全な長さの遺伝 子をつくる。ＤＮＡ断片「断片出発点」および「断片停止点」を１％ＴＡＥゲル 上で分解し、エチジウムブロマイドで染色し、Qiaex Gel Extractionキット（Qi agen）を用いて単離する。これら断片を等モル量ずつ合わせ、70℃で10分加熱し 、徐冷して「リンカー出発点」および「リンカー停止点」におけるこれらの共有 配列を経てアニールする。三番目のＰＣＲ段階においては、このアニールされた 断片へ、プライマー「新しい出発点」および「新しい停止点」を加えて完全な長 さの新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子をつくり出しそして増幅する。典型的なＰ ＣＲ条件は、９５℃２分間融解１サイクル；９４℃１分間変性、６０℃１分間ア ニーリングそして７２℃１分間拡張；＋７２℃７分間拡張１サイクルである。Pe rkin Elmer Gene Amp PCR Core試薬キットを用いる。１００ｕｌの反応は、各プ ライマー１００ｐモルおよび約０．５ｕｇのＤＮＡ；１×ＰＣＲ緩衝剤、２００ ｕＭｄＧＴＰ，２００ｕＭｄＡＴＰ，２００ｕＭｄＴＴＰ，２００ｕＭｄＣＴＰ ，２．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を 含む。ＰＣＲ反応物はWizard PCR Prepsキット（Promega）を用いて精製する。 方法II．リンカ-領域を有しない新規Ｎ−末端／Ｃ−末端をもつ遺伝子の創作。 最初のＮ−末端およびＣ−末端をつなぐリンカーを有しない新規Ｎ−末端／Ｃ −末端遺伝子は、ＰＣＲ増幅および平滑断端連結の二段階を用いてつくられる。 これら工程を図３に示す。最初の段階においては、プライマーセット（「新しい 出発点」および「Ｐ−ｂｌ出発点」）を用いて、最初の遺伝子配列から、新しい タンパク質の新しいＮ−末端部分をコード化する配列を含むＤＮＡ断片（「断片 出発点」）をつくり出し、そして増幅する。二番目の段階においては、プライマ ーセット（「新しい停止点」および「Ｐ−ｂｌ停止点」）を用いて、遺伝子配列 から、新しいタンパク質の新しいＣ−末端部分をコード化する配列を含むＤＮＡ 断片（「断片停止点」）をつくり出し、そして増幅する。「新しい出発点」およ び「新しい停止点」プライマーは、新しい遺伝子の発現ベクター中へのクローン 化を見込む適当な制限部位を含むように設計される。典型的なＰＣＲ条件は、９ ５℃２分間融解１サイクル；９４℃１分間変性２５サイクル、５０℃４５秒間ア ニーリグおよび７２℃４５秒間拡張である。Deep Ventポリメラーゼ(New Englan d Biolabs)を用いて製造業者により推奨された条件におけるオーバーハングの発 生を減らす。「Ｐ−ｂｌ出発点」および「Ｐ−ｂｌ停止点」プライマーを、５’ 端のところでホスホリル化して「断片出発点」および「断片停止点」相互の後の 平滑断端連結を助ける。１００ｕｌ反応は、１５０ｐモルの各プライマーおよび １ｕｇの鋳型ＤＮＡ；および１×Vent緩衝剤(New England Biolabs)，３００ｕ ＭｄＧＴＰ，３００ｕＭｄＡＴＰ，３００ｕＭｄＴＴＰ，３００ｕＭｄＣＴＰ， および１単位Deep Ventポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応はモデル４８０ＤＮＡ 熱サイクラー（Perkin Elmer Corporation，ノルウォーク，CT）で実行する。Ｐ ＣＲ反応生成物はWizard PCR Prepsキット(Promega)を用いて精製する。 これらプライマーは、新しい遺伝子の発現ベクター中へのクローニングを見込 む適当な制限部位を含むように設計される。典型的には、「断片出発点」はＮｃ ｏＩ制限部位をつくり出すように設計され、「断片停止点」はＨｉｎｄIII制限 部位をつくり出すように設計される。制限消化反応物は、Magic DNA Clean-up S ystemキット(Promega)を用いて精製される。断片出発点および停止点を１％ＴＡ Ｅゲル上で分割し、エチジウムブロマイドで染色し、Qiaex Gel Extractionキッ ト（Qiagen）を用いて単離する。これら断片を合わせ、ｐＭＯＮ３９３４の〜３ ８００塩基対ＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄ・ベクター断片の両端へ、５０℃で１０分間加 熱することによりアニールし、徐冷する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ(Boehringer Mannheim)を使用して三つの断片を互に連結する。その結果、完全な長さの新し いＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を含むが得られる。連結反応物の一部を用いてE.co li株ＤＨ５α細胞を転換させる(Life Technologies Gaithersburg，MD)。プラス ミドＤＮＡを下記のように精製し、配列を確認する。 方法III．縦列重複法による新しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子の創作 R.A.Horlick,等(Protein Eng．5:427-431，1992)に記載の方法に基づき新規Ｎ −末端／Ｃ−末端遺伝子をつくることができる。新規Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子 のポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ−ＣＲ）増幅は、縦列に重複させた鋳型ＤＮＡを用 いて行なわれる。段階を図３に示す。 縦列重複鋳型ＤＮＡは、クローン化によりつくる。このものは遺伝子の２コピ ーの最初のＣ−末端およびＮ−末端を接続するリンカーをコード化するＤＮＡ配 列により分けられた遺伝子の２コピーを含む。特別なプライマーセットを用いて 、完全な長さの新規Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を、縦列に重複した鋳型ＤＮＡか らつくり出し、そして増幅する。、これらプライマーは新しい遺伝子の発現ベク ター中へのクローン化を見込む適当な制限部位を含むように設計される。典型的 なＰＣＲ条件は９５℃２分間融解１サイクル；９４℃１分間変性２５サイクル、 ５０℃１分間アニリーングおよび７２℃１分間拡張；＋７２℃７分間拡張１サイ クルである。Perkin Elmer Gene Amp PCR Core試薬キット(Perkin Elmer Corpor ation，ノルウォーク，CT)を使用する。１００ｕｌ反応は、各プライマー１００ ｐモルおよび鋳型ＤＮＡ１ｕｇ；および１×ＰＣＲ緩衝剤、２００ｕＭｄＧＴＰ ，２００ｕＭｄＡＴＰ、２００ｕＭｄＴＴＰ，２００ｕＭｄＣＴＰ，２．５単位 ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ2を含む。ＰＣ Ｒ反応はモデル４８ＯＤＮＡ熱サイクラー(Perkin Elmer Corporation，ノルウ ォーク，CT)で実行する。ＰＣＲ反応物はWizard PCR Prepsキット(Promega)を用 いて精製する。新規Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子の多機能性レセプターアゴニスト発現ベクター中 へのクローニング 新規Ｎ−末端/c−末端遺伝子を、制限エンドヌクレアーゼで消化して末端をつ くり出す。これら末端は他のコロニー促進因子遺伝子を含む発現ベクター中へ の挿入に適合しうる。この発現ベクターも同様に制限エンドヌクレアーゼで消化 され、適合性末端を形成する。精製後、遺伝子およびベクターＤＮＡを合わせ、 Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結させる。この連結反応の一部を用いてE.coliを 転換する。プラスミドＤＮＡを精製し、配列して正しい挿入を確証する。正確な クローンをタンパク質発現のため培養する。ＤＮＡの単離および特徴づけ プラスミドＤＮΛは、幾つかの異なる方法により、そして当業者にとって公知 の市販キットを用いて単離できる。少数のこのような方法をここに示す。プラス ミドＤＮＡは、Promega Wizard1Miniprepキット(マジソン，WI)，Qiazen QIAwel lプラスミド単離キット（Chatsworth，CA）またはQiagen Plasmid Midiキットを 用いることにより単離される。これらキットは、プラスミドＤＮＡ単離に対する 方法と同じ一般手順に従う。手短かに言えば、細胞を遠心（５０００×ｇ）によ りペレット化し、連続ＮａＯＨ／酸処理でプラスミドＤＮＡを解放し、細胞破片 を遠心（１００００×ｇ）により除く。上澄（プラスミドＤＮＡを含む）を、Ｄ ＮＡ−結合性樹脂を含むカラム上に充填し、カラムを洗浄し、プラスミドＤＮＡ をＴＥで溶出する。対象とするプラスミドを含むコロニーについてスクリーング の後、E.coli細胞をＬＢ＋適当な抗生物質５０〜１００ｍｌ中に接種し、振盪し ながらエアーインキュベーター中３７℃で一晩培養する。精製されたプラスミド ＤＮＡを用いてＤＮＡ配列化、更に制限酵素消化、ＤＮＡ断片の追加的サブクロ ーニング、および哺乳動物細胞E.coliまたは他の細胞中への移入に供する。配列の確認 精製プラスミドＤＮＡをｄＨ2Ｏ中に再浮遊させ、Bausch and Lomb Spectroni c 601UV分光計で、２６０／２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定 量する。配列を決める混合物へ５％ＤＭＳＯを添加することにより通常修飾され る製造者の示唆したプロトコルに従い、ABI PRISMTMDyeDeoxyTMターミネーター 配列化学(Applied Biosystems Division of Perkin Elmer Corporation，Lincol n City，CA)キット（Part Number 401388または402078）を用いてＤＮＡ試料の 配列を決める。配列決定の反応は、モデル４８０ＤＮＡ熱 サイクラー(Perkin Elmer Corporation，ノルウォーク，CT)を用い推奨された増 幅条件に従って実行する。試料をcentvi-sepTMスピンカラム(Princeton Separat ions，アデルフィア，NJ)で精製して過剰の色素ターミネーターを除去し、凍結 乾燥する。蛍光色素標識した配列決定反応物を脱イオンホルムアミド中に再浮遊 させ、ＡＢＩモデル,３７３Ａ自動化ＤＮＡシーケンサーを使用して変性４．７ ５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル上で配列決定する。重複するＤＮＡ配列 断片を分析し、Sequencher DNA分析ソフトウェア(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)を使用してマスターＤＮＡコンチグス(contigs)に組み込む。哺乳動物細胞における多機能性レセプターアゴニストの発現 哺乳動物細胞移入／条件を整えた培地の調製 ＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ）からＢＨＫ−２１細胞系を得ることができる。 ２ｍＭ（ｍＭ）Ｌ−グルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補なった Dulbecco修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ／高−グルコース）中で細胞を培養する。 この組成物をＢＨＫ増殖培地と呼ぶ。選択培地は、４５３単位／ｍｌのハイドロ マイシンＢ（Calbiochem，サンジェゴ，CA）で補なったＢＨＫ増殖培地である。 ＢＨＫ−２１細胞系は、プラスミドｐＭＯＮ３３５９上に見出されたＩＥ１１０ プロモーターをトランス活性化するＨＳＶトランス活性タンパク質ＶＰ１６で前 以て安定に移入された(Hippenmeyer等，Bio/Technology，1037-1041頁，1993参 照)。ＶＰ１６タンパク質は、ＩＥ１１０プロモーターの後に挿入された遺伝子 の発現を推進する。トランス活性化タンパク質ＶＰ１６を発現するＢＨＫ−２１ 細胞はＢＨＫ−ＶＰ１６と称される。プラスミドｐＭＯＮ１１１８(Highkin等， Poultry Sci.，70:970-981，1991)は、ＳＶ４０プロモーターからハイグロマイ シン耐性遺伝子を発現する。同様なプラスミドはＡＴＣＣ，ｐＳＶ２−ｈｐｈか ら入手できる。 ＢＨＫ−ＶＰ１６細胞を６０ミリメートル（ｍｍ）の組織培養皿中に細胞３× １０5個／皿の量で移入２４時間前に接種する。対象遺伝子を含むプラスミドＤ ＮＡ１０ｕｇ、ハイグロマイシン耐性プラスミド３ｕｇ，ｐＭＯＮ１１１８，お よびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ「ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ」TM８０ｕｇ／皿を含 む３ｍｌの「ＯＰＴＩＭＥＭ」TM(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)中で細胞を16 時間移入する。その後培地を吸引し、３ｍ１の増殖培地と置き換えた。移入後４ ８時間で、各皿から培地を集め、活性について検定した（仮の整調培地）。細胞 をトリプシン−ＥＤＴＡにより皿から取り出し、１：１０に希釈し、１０ｍｌの 選択培地を含む１００ｍｍ組織培養皿に移す。選択培地中に約７日後、耐性細胞 は直径数ミリメートルのコロニーに育つ。これらコロニーを濾紙（コロニーとほ ぼ同じ寸法に切り、トリプシン／ＥＤＴＡに浸した）で皿から取り出し、１ｍｌ の選択培地を含む２４穴プレートの各穴に移した。コロニーを融合するまで発育 させた後、整調した培地を再検定し、陽性クローンを増殖培地中に展開させた。E.coli における多機能性レセプターアゴニストの発現 対象プラスミドを含むE.coli株ＭＯＮ１０５またはＪＭ１０１を、Ｍ９＋カザ ミノ酸培地中、New Brunswick Scientific（Edison，ニュージャージー）から得 られるエアーインキュベーターＭｏｄｅｌ Ｇ２５で振盪しつつ３７℃で増殖さ せる。増殖を、それが１．０の値に達するまでＯＤ６００でモニターし、この時 点で０．１Ｎ ＮａＯＨ中ナリジキシン酸（１０ミリグラム／ｍｌ）を５０μｇ ／ｍｌの最終濃度まで加える。次に培養を３７度で更に３から４時間振盪する。 培養期間中、望む遺伝子生成物の産生を最高にするために、培養中に隈なく高度 の通気を維持する。細胞を光学顕微鏡下で封入体（ＩＢ）の存在について検査す る。培養の１ｍｌ部分を取り出し、ペレット化細胞を煮沸し、それらを還元性緩 衝剤および電気泳動を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを経由して処理することによりタ ンパク質含量の分析に供する(Maniatis等，Molecular Cloning:A Laboratory Mo nual，1982)。培養を遠心して（５０００×ｇ）細胞をペレット化する。封入体調製、抽出、リフォールディング、透析、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、 ならびにE.coli中に封入体として集積する多機能性キメラ造血レセプターアゴニ ストの特性表示 封入体の単離： ３３０ｍｌ E.coli培養から得た細胞ペレットを、１５ｍｌの超音波処理緩衝 液（１０ｍＭ２−アミノ−２−（ビドロキシメチル）１，３−プロパンジオール 塩酸塩（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ），ｐＨ８．０＋１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（Ｅ ＤＴＡ）に再浮遊させる。これら再浮遊細胞を、Sonicator Cell Disruptor（Mo del W-375，Heat-Systems-Ultrasonics，Inc.，ファーミングデール，ニューヨ ーク）のミクロチッププロ・−ブを使用して超音波処理する。超音波処理緩衝液 中の三ラウンドの超音波処理とそれに続く遠心を用いて細胞を粉砕し、封入体（ ＩＢ）を洗浄する。超音波処理の最初のラウンドは３分のバースト、次いで１分 のバースト、および最終二ラウンドの超音波処理は各１分間である。 封入体ペレットから得られるタンパク質の抽出およびリフォールデイング： 最後の遠心工程の後、ＩＢペレットを１０ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ，ｐＨ９．５，８Ｍ尿素および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）中に再浮遊 させ、室温で約４５分かきまぜて発現タンパク質を変性させる。 抽出溶液を７０ｍｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．５および２．３Ｍ 尿素を含むビーカーへ移し、おだやかにかきまぜながら４℃の空気に１８から４ ８時間暴露してタンパク質をリフォールディングさせる。リフォールディングを 、Vydac（Hesperia，Ca.）C18逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ Ｃ）カラム(０．４６×２５ｃｍ）上での分析によりモニターする。０．１％ト リフクオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む４０％から６５％アセトニトリルの直線勾配を 用いてリフォールドをモニターする。この勾配を３０分にわたり１．５ｍｌ／分 の流速で展開する。一般に変性タンパク質はリフォールドタンパク質よりも遅れ て勾配中に溶出する。 精製： リフォールドに続いて、汚染E.coliタンパク質を酸沈殿により除く。リフォー ルド溶液のｐＨは、１５％（ｖ／ｖ）酢酸（ＨＯＡｃ）を用いることによりｐＨ ５．０からｐＨ５．２に滴定された。この溶液を４℃で２時間かきまぜ、次に１ ２，０００×ｇで２０分遠心して不溶タンパク質をペレット化する。 酸沈殿段階から生じた上澄を、３，５００ドルトンの分子量カットオフ（ＭＷ ＣＯ）を有するＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３膜を用いて透析する。この透析は、計 １８時間、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０の４１（５０倍過剰）２回 交換に対して行なう。透析は試料の伝導性を低下させ、ＤＥＡＥクロマトグラフ ィーに先立ち尿素を除く。次に試料を遠心して（１２，０００×ｇで２０分）、 透析後の不溶タンパク質をペレット化する。 イオン交換クロマトグラフィーに対してはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｂｉｏ−Ｓｃａｌ ｅ ＤＥＡＥ２ カラム（７×５２ｍｍ）を用いる。カラムは、平衡化緩衝液中 に１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、および０から５００ｍＭ塩化ナト リウム（ＮａＣｌ）勾配を含む緩衝液中で平衡化させ、４５カラム容以上を用い てタンパク質を溶出する。実験操作中ずっと１．０ｍｌ／分の流速を用いる。勾 配を横切ってカラム分画（２．０ｍｌ／分画）を集め、Vydac（Hesperia，Ca.） C18カラム（０．４６×２５ｃｍ）上のＲＰ ＨＰＬＣにより分析する。０．１ ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む４０％から６５％の直線勾配を用いる。こ の勾配を３０分にわたり１．５ｍｌ／分の流速で展開する。次に、集めた分画を 、１０ｍＭ酢酸アンモニウムＮＨ4Ａｃ），ｐＨ４．０の４１（５０〜５００倍 過剰）２回交換に対して透析する。透析は３，５００ドルトンのＭＷＣＯをもつ Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ３膜を用いて行なう。最後に０．２２μｍシリンジフィ ルター（μＳｔａｒ ＬＢシリンジフィルター、ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、 Ｍａ．）を用いて試料を無菌濾過し、４℃で貯蔵する。 ある場合には、折たたまれたタンパク質を、適当なマトリックスに付けたｍＡ ｂｓまたはレセプターサブユニットのようなアフィニティー試薬を用いてアフィ ニティー精製できる。別法として（あるいは更に）、各種クロマトグラフィー法 、例えばイオン交換、ゲル濾過あるいは疎水性クロマトグラフィーまたは逆相Ｈ ＰＬＣ、のいずれかを用いて精製をなし遂げることができる。 これらおよび他のタンパク質精製法は、Methods in Enzymology，Volume 182 ｀Guide to Protein Purification'Murray編Deutscher，Academic Press，San D iego，CA（1990）に詳述されている。 タンパク質特性表示： 精製されたタンパク質は、ＲＰ−ＨＰＬＣ、エレクトロスプレー質量分析、お よびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する。タンパク質定量はアミノ酸組成、ＲＰ− ＨＰＬＣ、およびブラッドフォードタンパク質定量によりなされる。ある場合に は、トリプシンペプチド地図作成を、エレクトロスプレー質量分析と共に実施す ることによりタンパク質の実体を確認する。生物活性ヒトインターロイキン−３に対するＡＭＬ増殖検定法 因子依存性細胞系AML 193をAmerican Type Culture Collection（ATCC，ロッ クビル，MD）から得た。これら細胞系は、急性骨髄性白血病をもつ患者から確立 されたもので、成長因子依存性細胞系であり、ＧＭ−ＣＳＦ添加培地で高い増殖 を示した。(Lange，B.，等，Blood 70:192，1987；Valtieri，M.，等，J.Immuno l．138:4042，1987)。ＡＭＬ１９３細胞がヒトＩＬ−３の存在下で増殖する能力 を詳しく報じられた(Santoli，D.，等，J．Immunol．139:348，1987)。細胞系変 異体ＡＭＬ１９３ １．３が使用された。これは、成長因子を洗い流し、サイト カイン依存性ＡＭＬ１９３細胞を成長因子に対して飢餓状態に２４時間置くこと によりＩＬ−３で長期培養に適合させた。次に細胞を、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ− ３を含む培地中２４ウェルプレートで、１×１０5個細胞／ウェルの量で再塗布 する。細胞をＩＬ−３中で迅速に増殖させるために約２７か月かかった。これら 細胞を、ＡＭＬ１９３ １．３として、その後組織培養培地（下記参照）をヒト ＩＬ−３で補填することにより維持した。 ＡＭＬ１９３ １．３細胞は、細胞浮遊液を２５０×ｇで１０分間遠心し、次 いで上澄をデカンテーションすることにより、冷ハンクス液（HBSS，Gibco,Gran d Island,NY）で６回洗浄した。ペレット化細胞をＨＢＳＳ中に再浮遊させ、６ 回の洗浄サイクルが終るまでこの手順を繰り返す。この手順で６回洗浄した細胞 を、組織培養培地中に、生存能のある細胞２×5から５×１０5個／ｍｌにわたる 密度で再浮遊させた。この培地はIscove'ｓ修飾Dulbecco's培地(IMDM,Hazelton ，Lenexa，KS)をアルブミン、トランスフェリン、脂質および２−メルカプトエ タノールで補うことにより調製される。ウシアルブミン（Boehringer-Mannheim, インジアナポリス，IN）を５００μｇ／ｍｌで加え；ヒトトランスフェリン(Boe hringer-Mannheim，インジアナポリス，IN)を１００μｇ／ｍｌで加え；ダイズ 脂質(Boehringer-Mannheim，インジアナポリス，IN)を５０μｇ／ｍｌで加え； そして２−メルカプトエタノール(Sigma，セントルイス，MO)を５×１０-5Ｍで 加える。 ヒトインターロイキン−３あるいは多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト タンパク質の連続希釈液を、９６ウェルＣｏｓｔａｒ３５９６組織培養プレート で、上記のように補なった組織培養培地中で三重系列としてつくる。各ウェルは 、連続希釈が終了したとき、インターロイキン−３あるいは多機能性キメラ造血 レセプターアゴニストタンパク質を含有する培地５０μｌを含んだ。対照ウェル は組織培養培地単独（負の対照）を含んだ。各ウェルへ、上記のように調製した ＡＭＬ１９３ １．３細胞浮遊液を、各ウェル中に５０μｌ（２．５×１０4個 細胞）をピペットで採ることにより加える。組織培養プレートを３７℃で、加湿 空気中５％ＣＯ2を用いて３日間インキュベートする。３日目に、５０μｌの組 織培養培地中に、０．５μＣｉ 3Ｈ−チミジン（２Ｃｉ／ｍＭ，New England N uclear,ボストン，MA）を加える。培養を加湿空気中５％ＣＯ2を用いて３７℃で １８−２４時間インキュベートする。水洗サイクル次いで７０％エタノール洗浄 サイクルを利用したＴＯＭＴＥＣ細胞ハーベスター（ＴＯＭＴＥＣ，Ｏｒａｎｇ ｅ，ＣＴ）を使用することにより、細胞ＤＮＡをガラスフィルターマット(Pharm acia LKB，Gaithersburg，MD)上に採る。フィルターマットを風乾し、次に試料 バッグ中に入れ、これへシンチレーション液(ScintiverseII，Fisher Scientifi c，St．Louis，MOまたはBetaplate Scintillation Fluid，Pharmacia LKB，Gait hersburg，MD)を加える。個々の組織培養ウェルから生ずる試料のベーター線放 出を、ＬＫＢ ＢｅｔａＰｌａｔｅモデル１２０５シンチレーションカウンター (Pharmacia LKB，Gaithersburg，MD)で計数し、データを各組織培養ウェルから 細胞中に取り込まれた3Ｈ−チミジンのカウント／分として表わす。各ヒトイン ターロイキン−３製剤または多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク 質製剤の活性は、インターロイキン−３または多機能性キメラ造血レセプターア ゴニストの勾配をつけた濃度により誘発される細胞増殖（3Ｈ−チミジン取り込 み）を測定することにより定量される。典型的には、０．０５ｐＭ−１０5ｐＭ の濃度範囲がこれら検定で定量される。インターロイキン−３または多機能性キ メラ造血レセプターアゴニストタンパク質の用量を測ることにより活性を決定す る。前記用量は、最大増殖の５０％を与える量（ＥＣ50）であり、これは０．５ ×（試験したインターロイキン−３のあらゆる濃度の三重の培養のうち、１ウェ ル当り取り込まれた3Ｈ−チミジンの最大平均カウント数／分−イ ンターロイキン−３を欠いた三重の培養に観察された3Ｈ−チミジン取り込みに より測ったバックグランド増殖）に等しい。このＥＣ50値はまた生物活性１単位 と等価である。どの検定も相対活性レベル帰属できるように比較の標準として自 然のままのインターロイキン−３を用いて実施される。 典型的には、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質を、系列の ２倍希釈で滴定された２０００ｐＭから０．０６ｐＭの濃度範囲で試験した。 各試料に対する活性は、データに四−パラメーターロジステイックモデルを適 合させることにより、最大応答の５０％を与える濃度により決定される。試料に 対する上方安定期（最大応答）および比較の標準が異ならなかったことが観察さ れた。従って、各試料に対する相対的効力計算は、試料に対するＥＣ50計算およ び上に示された標準から決定された。ＡＭＬ１９３．１．３細胞はｈＩＬ−３、 ｈＧＭ−ＣＳＦおよびｈＧ−ＣＳＦに応答して増殖する。従って、下記の追加検 定は、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質のＧ−ＣＳＦレセプ ターアゴニスト部分が活性であることを実証するために、幾つかの試料について 実行した。増殖検定は、ｈＩＬ−３レセプターアゴニスト部分へ中和性単クロー ン抗体を加えたり、差引いたりした、多機能性キメラ造血レセプターアゴニスト を用いて実行した。更に、因子Ｘａ切断部位をもつ融合分子を開裂させ、次に精 製し、分子の半分を増殖活性について検定した。これらの実験は、多機能性キメ ラ造血レセプターアゴニストタンパク質の両成分とも活性であることを示した。ＴＦ１ ｃ−ｍｐｌリガンド依存性増殖検定 ｃ−ｍｐｌリガンド増殖活性は、多能性ヒト細胞系ＴＦ１(Kitamura等，J.Cel l Physiol 140:323-334[1989])サブクローンを用いて検定できる。ＴＦ１細胞は ｈ−ＩＬ３（１００Ｕ／ｍｌ）に保たれている。ｃ−ｍｐｌリガンドに応答する サブ−クローンを確定するため、ｃ−ｍｐｌリガンドの１−１５３形を発現する 遺伝子で移入されたＢＨＫ細胞から得られる１０％上澄を含む継代培地に細胞を 保持する（ｐＭＯＮ２６４４８）。細胞の大部分は死ぬが、細胞のサブセットは 生き残る。希釈クローン化後、ｃ−ｍｐｌリガンド応答クローンを選び、これら 細胞を、検定設定の前田こ、継代培地へ０．３×１０6個細胞／ｍｌの密度に分 ける。これら細胞に対する継代培地は次の通りである：ＲＰＭＩ１６４０ （Ｇｉｂｃｏ），１０％ＦＢＳ（Ｈａｒｌａｎ，ロット＃９１２０６），移入Ｂ ＨＫ細胞からの１０％ｃ−ｍｐｌリガンド上澄、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ Ｇｉｂｃｏ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、および１００ｕｇ／ｍｌペニ シリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）。翌日、細胞を採取し、ＲＰＭＩま たはＩＭＤＭ培地中で２回洗浄し、最後にＡＴＬまたは検定培地中で洗浄する。 ＡＴＬ培地は下記成分からなる：ＡＴＬ１０００ｍｌ当り、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃ ｏ）、５００ｕｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１００ｕｇ／ｍｌヒトトランスフ ェリン、５０ｕｇ／ｍｌダイズ脂質、４×１０−８Ｍベーターメルカプトエタノ ールおよび２ｍｌＡ９９０９（Ｓｉｇｍａ，抗生物質溶液）。細胞を、９６ウェ ル低蒸発プレート（Ｃｏｓｔａｒ）で、検定培地中、最終密度０．２５×１０6 個細胞／ｍｌに（最終体積５０ｕｌ）希釈する。移入クローンからの一時上澄（ 整調培地）を、５０ｕｌの体積で、二重試料として最終濃度５０％で加え、最終 的希釈１．８％まで３倍に希釈する。１ｎｇ／ｍｌから出発し、３倍希釈を用い て０．００１４ｎｇ／ｍｌに希釈したＩＬ−３変異体ｐＭＯＮ１３２８８の用量 曲線の三重試料を正の対照として含める。プレートを５％ＣＯ2、３７℃でイン キュベートする。培養６日目に、０．５Ｃｉの３Ｈ／ウェル（ＮＥＮ）で２０ｕ ｌ／ウェルの体積でプレートを短時間標識し、５％ＣＯ2、３７℃で４時間イン キュベートする。プレートを回収し、Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンターでカウント する。ＭＵＴＺ−２細胞増殖検定 ヒト骨髄性白血病細胞系のＭＵＴＺ−２といった細胞系(German Collection o f Microorganisms and Cell Cultures，DSM ACC 271)を用いて、ｆｌｔ３レセプ ターアゴニストの細胞増殖活性を測定する。ＭＵＴＺ−２培養は、増殖培地中に 組換え未変性ｆｌｔ３リガンド（２０−１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて保持する。 検定の設定１８時間前に、ＭＵＴＺ−２細胞をＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で３ 回洗浄し、ＩＭＤＭ培地単独中に０．５−０．７×１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で 再浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートしてｆｌｔ３リガンドの細胞 を飢餓状態にする。検定の日、標準およびｆｌｔ３レセプターアゴニストを、無 菌の組織培養処理９６ウェルプレートで、検定培地中望む最終濃度の２倍より上 まで希釈する。ｆｌｔ３レセプターアゴニストおよび標準を三重に試験する。Ａ 列を除きすべてのウェルに５０μｌの検定培地を入れる。７５μｌのｆｌｔ３レ セプターアゴニストまたは標準をＡ列へ加え、この列から２５μｌを採り、プレ ートの残り（Ｂ列からＧ列まで）について連続希釈（１：３）を行なう。Ｈ列は 培地だけの対照として残す。飢餓状態にしたＭＵＴＺ−２細胞をＩＭＤＭ培地で ２回洗浄し、５０μｌの検定培地中に再浮遊させた。各ウェルへ５０μｌの細胞 を加えると、最終濃度０．２５×１０Ｅ６細胞／ｍｌになる。細胞を含む検定プ レートを３７℃、５％ＣＯ2で４４時問インキュベートする。次に各ウェルを、 ２０μｌの体積中トリチル化チミジン１μＣｉ／ウェルで４時間標識する。次に プレートを回収し、カウントする。他の容器内（インビトロ）細胞ベース増殖検定 当業者にとって公知の、他の容器内細胞ベース検定法もまた、ＡＭＬ１９３． １．３細胞増殖検定に記載の方法と同様にして、分子からなる因子により、多機 能性キメラ造血レセプターアゴニストの活性を測定するために有であるかも知れ ない。下記は他の有用な検定法の例である。 ＴＦ１増殖検定：ＴＦ１はｈＩＬ−３に相当する多能性ヒト細胞系である(Kit amura等，J．Cell Physiol 140:323-334[1989])。 ３２Ｄ増殖検定：３２ＤはマウスＩＬ−３依存性細胞系で、ヒトＩＬ−３には 相当しないが、制限種でないヒトＧ−ＣＳＦに相当する。 Ｂａｆ／３増殖検定：Ｂａｆ／３はマウスＩＬ−３依存性細胞系であり、ヒト ＩＬ−３またはヒトｃ−ｍｐｌリガンドには相当しないが、制限種でないヒトＧ −ＣＳＦに相当する。 Ｔ１１６５増殖検定：Ｔ１１６５はＩＬ−６依存性マウス細胞系（Ｎｏｒｄａ ｎ等、１９８６）であり、ＩＬ−６およびＩＬ−１１に相当する。ヒト血漿クロ ットｍｅｇ−ＣＳＦ検定：巨核球コロニー形成活性の検定に使用（Ｍａｚｕｒ等 、１９８１）。移入細胞系 ： マウスＢａｆ／３細胞系といった細胞系は、この細胞系が有しないコロニー促 進因子レセプター、例えばヒトＧ−ＣＳＦレセプターあるいはヒトｃ−ｍｐｌレ セプターを用いて移入することができる。これら移入された細胞系は、そのレセ プターが細胞系に移入されたリガンドの活性を測定するために使用できる。 一つのこのような移入Ｂａｆ／３細胞系は、ｃ−ｍｐｌ応答細胞系からつくら れ、そしてプラスミドｐｃＤＮＡ３の多数のクローン化部位中にクローン化され たライブラリーからｃ−ｍｐｌをコード化するＣＤＮＡをクローン化することに よりつくられた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンジェゴ Ｃａ．）。Ｂａｆ／３細 胞をエレクトロポレーションによりプラスミドで移入した。細胞をマウスＩＬ− ３の存在下、Ｗｅｈｉ整調培地中でＧ４１８選択下に培養した。クローンは限定 希釈により確立された。 同様にして、ヒトＧ−ＣＳＦレセプターをＢａｆ／３細胞系に移入することが でき、多機能性キメラ造血レセプターアゴニストの生物活性の決定に使用できる 。ｃ−ｍｐｌリガンド増殖活性の分析 方法 １．骨髄増殖検定 ａ．ＣＤ３４＋細胞精製： 正常な同種間髄提供者から、告知に基づく同意後、骨髄吸引物（１５−２０ｍ ｌ）を得た。細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ，Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で希釈 （１：３）し、３０ｍｌを１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇ ｍａ）上に重層し、３００ＲＣＦで３０分遠心した。単核界面層を集め、ＰＢＳ で洗浄した。ＣＤ３４＋細胞を、単核細胞調製物から、製造業者の説明書(CellP ro，Inc.，Bothell WA)に従いアフィニティーカラムを用いて濃縮した。濃厚化 の後、フローサイトメトリー分析を用いてＣＤ３４＋細胞の純度を測定したとこ ろ平均７０％であった。この分析はフイコエリトリンに複合したフルオレセイン および抗−ＣＤ３８に結合させた抗ＣＤ３４単クローン抗体を使用する(Bector Dickinson，サンジョーズ，CA)。 細胞をＸ−Ｖｉｖｏ１０培地（Bio-Whittaker，ウォーカーズビル，MD）中に ４０，０００個細胞／ｍｌで再浮遊させ、１ｍｌを１２−ウェル組織培養プレー ト（Ｃｏｓｔａｒ）に塗布した。成長因子ｒｈＩＬ−３を１００ｎｇ／ｍｌで加 え（ｐＭＯＮ５８７３）を若干のウェルに加えた。ｈＩＬ３変異体は１０ｎｇ／ ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌで用いた。ｃ−ｍｐｌリガンドまたは多機能性キメラ 造血レセプターアゴニストをコード化するプラスミドで移入したＢＨＫ細胞から 得た調整培地を、培養（およそ１０％希釈）１ｍｌへ加えた上澄１００μｌの添 加により試験した。細胞を３７℃加湿インキュベーター中５％ＣＯ2において、 ８−１４日間３７℃でインキュベートした。 ｂ．細胞採取と分析： 培養期間の終りに、各条件に対する全細胞数を得た。蛍光分析および倍数性決 定のため、細胞を巨核細胞緩衝液（ＭＫ緩衝液、１３．６ｍＭクエン酸ナトリウ ム、１ｍＭテオフィリン、２．２μｍ ＰＧＥ１、１１ｍＭグルコース、３％ｗ ／ｖ ＢＳＡ、ＢＳＡ中、ｐＨ７．４）（Tomer等，Blood 70:1735-1742,1987） 中で洗浄し、抗−ＣＤ４１ａＦＩＴＣ抗体を含むＭＫ緩衝液（１：２００）ＡＭ ＡＣ、ウエストブルック、ＭＥ）５００μｌに再浮遊させ、ＭＫ緩衝液中で洗浄 した。ＤＮＡ分析のため、細胞を０．５％Tween 20(Fisher，Fair Lawn NJ)を含 むＭＫ緩衝液中で氷上２０分間透過性を上げ、次いで０．５％Tween−２０およ び１％パラホルムアルデヒド(Fisher Chemical)中で３０分固定し、次いで５５ ％ｖ／ｖＭＫ緩衝液（２００ｍＯｓｍ）中ＲＮＡ−アーゼ（４００Ｕ／ｍｌ）を 含むプロピジウムヨーダイド（Calbiochem，La Jolla Ca）（５０μｇ／ｍｌ） 中氷上で１−２時間インキュベーションした。細胞をＦＡＣＳｃａｎまたはＶａ ｎｔａｇｅフローサイトメーター（Bacton Dickinson，サンジョーズ，CA）で分 析した。緑の蛍光（ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ）を、赤の蛍光（ＰＩ）に対する線形 および対数信号と共に集め、ＤＮＡ倍数性を決定した。全細胞を集めてＣＤ４１ ＋である細胞のパーセントを決定した。ＬＹＳＩＳ（Becton Dickinson,サンジ ョーズ，CA）によるソフトウェアを用いてデータ分析を実行した。ＣＤ４１抗原 を発現する細胞のパーセントは、フローサイトメトリー分析（パーセント）から 得た。ＣＤ４１＋細胞／ｍｌの絶対（Ａｂｓ）数は、 （Ａｂｓ）＝（細胞カウント）*（パーセント）／１００ により計算した。 ２．巨核細胞繊維素血餅検定 高ＣＤ３４＋集団を前記のように単離した。細胞を２５，０００個細胞／ｍｌ の密度で、サイトカイン（複数のことがある）と共に、あるいは無しに、基本Ｉ ｓｃｏｖｅｓ ＩＭＤＭ培地を０．３％ＢＳＡ、０．４ｍｇ／ｍｌ ａｐｏ−ト ランスフェリン、６．６７μＭ ＦｅＣｌ2、２５μｇ／ｍｌＣａＣｌ2、２５μ ｇ／ｍｌ Ｌ−アスパラギン、５００μｇ／ｍｌ ｅ−アミノ−ｎ−カプロン酸 およびペニシリン／ストレプトマイシンで補なった培地中に浮遊させた。３５ｍ ｍプレート中に塗布する前にトロンビンを加えて（０．２５単位／ｍｌ）血餅形 成を開始させた。細胞を３７℃加湿インキュベーター中５％ＣＯ2で１３日間３ ７℃でインキュベートし．た。この培養期間の終りに、プレートをメタノール： アセトン（１：３）で固定し、風乾し、−２００℃で染色まで貯蔵した。ペルオ キシダーゼ免疫細胞化学染色法を使用し（Zymed，Histostain-SP．サンフランシ スコ，CA）、これに抗−ＣＤ４１ａ、ＣＤ４２およびＣＤ６１からなる一次単ク ローン抗体のカクテルを用いた。染色後コロニーを数え、陰性、ＣＦＵ−ＭＫ（ 小さいコロニー、フォーカス１−２個、そして約２５細胞未満）、ＢＦＵ−ＭＫ （大きい、多フォーカスコロニー、細胞２５個＜を含む）あるいは混合コロニー （陽性および陰性細胞の混合物）として分類した。メチルセルロース検定 この検定法は、コロニー促進因子が正常な骨髄細胞を刺激して容器内で種々な 型の造血コロニーをつくる能力を反映している(Bradley等，Aust．Exp Biol.Sci ．44:287-300，1966)，Pluznik等，J．Cell Comp．Physio 66:319-324,1965)。 方法 約３０ｍｌの新鮮、正常、健康な骨髄吸引物を、告知に基づく同意後の個人か ら得る。無菌条件下で、試料を、５０ｍｌ円錐形チューブ（＃２５３３９−５０ Corning，Corning MD)中 １×ＰＢＳ（＃１４０４０．０５９ Life Technolog ies，Gaithersburg,MD.）溶液で希釈する（１：５）。希釈試料下にフィコール （Histopaque 1077 Sigma H-8889）を重層し、３０分遠心した（３００×ｇ）。 単核細胞帯を除き、１×ＰＢＳ中で２回、１％ＢＳＡ ＰＢＳ(Cellpro Co.，Bo thel，WA)で１回洗浄した。単核細胞を数え、ＣＤ３４＋細胞を、Ceprate LC（C D34）kit（Cellpro Co.，Bothel，WA）カラムを用いて選ぶ。 この分別を実行するのは、骨髄内のすべての幹細胞および始原細胞がＣＤ３４表 面抗原を示すからである。 培養を三重に設定する。３５×１０ｍｍペトリ皿（Ｎｕｎｃ＃１７４９２６） 中で最終体積１．０ｍｌとした。培養培地はTerry Fox Labs．（Hcc-4230培地(T erryFoxLabs，Vancouver，B．C.，カナダ）から購入し、この培地へエリトロポ イエチン（Amgen，Thousand Oaks，CA.）を加える。３，０００−１０，０００ ＣＤ３４＋細胞／皿を加える。哺乳動物細胞またはE.coliから精製した組換え ＩＬ−３、および多機能性キメラ造血レセプターアゴニストタンパク質（移入哺 乳動物細胞から得た調整培地中、あるいは移入哺乳動物細胞またはE.coliから得 た調整培地から精製）を加えて．００１ｎＭから１０ｎＭにわたる最終濃度を得 る。組換えｈＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦ，ｃ−ｍｐｌリガンドおよび多機能キメラ 造血レセプターアゴニストは社内で供給された。G-CSF(Newpogen)はAmgen（Thou sand Oaks Calf.）から得た。３ｃｃシリンジを用いて培養を再浮遊させ、１． ０ｍｌ／皿ずつ分与する。対照（ベースライン応答）培養にはコロニー促進因子 を与えなかった。正の対照培養は調整培地を用いる（ＰＨＡ促進ヒト細胞：Terr y Fox Lab．H2400)。培養を加湿空気中３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートする 。細胞５０個より多いと規定される造血コロニーは、４０×対物コンビネーショ ンを具えたNikonインバーテッド フェーズ（inverted phase）顕微鏡を使用し て、ピーク応答の日（１０−１１日）に数える。５０個より少ない細胞を含む細 胞グループはクラススターと呼ぶ。他方、コロニーはそれらをスライド上に広げ そして染色することにより同定でき、あるいはこれらを拾い出し、再浮遊させ、 染色のためシトスピンスライド上に吐出してもよい。ヒト臍帯血造血成長因子検定 造血コロニー促進因子（ＣＳＦ）活性の容器内検定に対しては、過髄細胞が伝 統的に使用される。しかし、ヒトの骨髄は常に入手できるとは限らず、そして提 供者間で相当な変動がある。臍帯血は、造血幹細胞および前駆体の給源として骨 髄に匹敵しうる(Broxmeyer等，PNAS USA 89:4109-113，1992；Mayani等，Blood 81:3252-3258，1993)。骨髄とは著しく異なり、臍帯血は常時入手容易である。 また、数人の提供者から新しく得られた細胞を溜めておくことにより検定の変り 易さを減少させること、あるいはこの目的のために低温保存された細胞バンクを つくり出すことの可能性もある。培養条件を調節することにより、そして（また は）系特異的マーカーについて分析することにより、顆粒球／マクロファージコ ロニー（ＣＦＵ−ＧＭ）について、巨核細胞ＣＳＦ活性について、あるいは高増 殖能コロニー形成細胞（ＨＰＰ−ＣＦＣ）活性について特異的に検定することが 可能である。 方法 単核細胞（ＭＮＣ）を、標準密度勾配（１，０７７ｇ／ｍｌ Histopaque）を使 用して、採取２４時間以内に臍帯血から単離する。臍帯血ＭＮＣを、幾つかの手 順、例えばＣＤ１４−，ＣＤ３４＋細胞に対しては免疫電磁（immunomagnetic） 選択；ＳＢＡ−，ＣＤ３４＋画分に対しては、Applied Immune Science(Santacl ara，CA)から得られる被覆フラスコを用いるパンニング（panning）；およびCel lpro（Bothell，WA）アビジンカラムを用いるＣＤ３４＋選択、により幹細胞お よび前駆体について更に濃縮した。新しく単離したか、または低温保存したＣＤ ３４＋細胞に富む画分を検定に用いる。試料の各系列希釈（濃度範囲１ｐＭから １２０４ｐＭ）に対する二重培養を、追加成長因子無しに０．９％メチルセルロ ースを含む培地１ｍｌ中に１×１０4個の細胞を用いて調製する（Stem Cell Tec hnologies，Vancouver，BC.から得られるMethocult H4230）。ある実験において は、Methocult H4230、または幹細胞因子（ＳＣＦ）、の代りに、エリトロポイ エチン（ＥＰＯ）を含むMethocult H4330（５０ｎｇ／ｍｌ）(Biosource Intern ational，Camarillo，CA)を加えた。７−９日間の培養後、＞３０個の細胞を含 むコロニーを数えた。評点記録において、主観的な偏向を除くため、検定を盲目 評点記録した。 変異体をつくり出すために、そしてそれらを細菌、哺乳動物細胞または昆虫細 胞で発現させるために使用できる組換えＤＮＡ法、求めるたんぱく質の精製およ びリフォールディング、ならびにタンパク質の生物活性を決定する検定法につい てのこれ以上の詳細は、同時提出特許願WO 95/00646，WO 94/12639，WO 94/1263 8，WO 95/20976，WO 95/21197，WO 95/20977，WO 95/21254およびUS 08/383，03 5に見出すことができ、これらは参考として全体的に取り入れている。 当業者にとって公知の更に詳細事項は、T．Maniatis,等，Molecular Cloning, A Laboratory Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)，およびその中 に引用された参考文献（参考としてここに取り入れている）；ならびにJ.Sambro ok，等，Molecular Cloning ，A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Harb or Laboratory，1989)およびその中に引用された参考文献（参考としてここに取 り入れている）に見出すことができる。 以下の例は本発明をより詳細に例示するが、本発明は決してこれらの具体例に 限定されるものではないことを理解されたい。例１ 親ＢＨＫ発現ベクターの作成 Ａ．哺乳動物発現プラスミドからのＡｆ１III部位の除去 ｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３１４６（ＷＯ９１／１２６３８）遺 伝子およびマウスＩｇＧ２ｂリンカー断片のフレーム内および３’にＮｃｏＩ− ＨｉｎｄIIIまたはＡｆ１III−ＨｉｎｄIII遺伝子断片を受け入れるために、新 しい哺乳動物発現ベクターを作成した。まず第１に、単一のＡｆ１III部位を、 ｐＭＯＮ３９３４（これは、ｐＭＯＮ３３５９の誘導体である）から除去した。 ｐＭＯＮ３３５９は、哺乳動物発現カセットを含むｐＵＣ１８ベースのベクター である。このカセットは、その後ろに修飾ヒトＩＬ−３シグナルペプチド配列と ＳＶ４０後期ポリアデニル化（ｐｏｌｙ−Ａ）シグナル（これは、ｐＵＣ１８ポ リリンカー中にサブクローニングされている）を有する単純ヘルペスウイルスプ ロモーターＩＥ１１０（−８００〜＋１２０）である（ヒッペンマイアー（Ｈｉ ｐｐｅｎｍｅｙｅｒ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９３，ｐｐ．１ ０３７−１０４１を参照）。細胞の外への遺伝子産物の分泌を促進する修飾ヒト ＩＬ−３シグナル配列は、その両側に５’末端にＢａｍＨＩ部位と３’末端にユ ニークなＮｃｏＩ部位が存在する。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を 、以下に示す（制限酵素部位を上に示す）。Ｎｃｏｉ部位内のＡＴＧ（メチオニ ン）部位は、シグナルペプチドのイニシエーターＡＴＧのフレーム内にある（下 線を引いてある）： Ａｆ１IIIで消化して単一のＡｆ１IIIを除去し、ＤＮＡポリメラーゼとヌクレ オチドを加えてオーバーハングを充填した。消化したＤＮＡ断片を、マジック ＰＣＲクリーンアップキット（Ｍａｇｉｃ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い て連結した。連結反応物をＤＨ５α（登録商標）に形質転換し、細胞をＬＢ寒天 ＋アンピシリンに広げた。Ａｆ１IIIとＨｉｎｄIIIを用いる制限解析により、個 々のコロニーをＡｆ１III部位の喪失についてスクリーニングすると、Ａｆ１III 部位が除去されている場合は単一の断片を得られた。得られたプラスミドをｐＭ ＯＮ３０２７５と名付けた。 Ｂ．ｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６／ＩｇＧ２ｂカセットのｐ ＭＯＮ３０２７５への転移 ｐＭＯＮ３０２４５からのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片（約４２５塩基対）を 、ｐＭＯＮ３０２７５のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片（約３８００塩基対）に連 結した。ｐＭＯＮ３０２４５（ＷＯ９４／１２６３８）は、マウスＩｇＧ２ｂヒ ンジ断片に結合 したｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６をコードする遺伝子を含有 する。ＩｇＧ２ｂヒンジのすぐ３’とＨｉｎｄIII部位の５’は、Ａｆ１III部位 である。遺伝子は、ｈＩＬ−３変種ｐＭＯＮ１３４１６／ＩｇＧ２ｂヒンジと同 じフレーム内にあるＮｃｏＩ−ＨｉｎｄIII断片またはＡｆ１III−ＨｉｎｄIII 断片としてＡｆ１III−ＨｉｎｄIII部位中にクローン化して、新規のキメラを作 成することができる。ＮｃｏＩ部位とＡｆ１III部位は適合性のあるオーバーハ ングを有し、連結するであろうが、認識部位はなくなっている。マウスＩｇＧ２ ｂヒンジ領域に結合したｐＭＯＮ１３４１６を有するｈＩＬ−３変種をコードす る、（配列番号１）のＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３０３０４は、 このクローニングの結果であった。例２ ダイマー鋳型のｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）遺伝子の１つのコピーを含有 する中間体プラスミドの作成 後ろにユニークなＥｃｏＲＩ認識部位が続くｃ−ｍｐｌ（１−１５３）リガン ドのコード配列を有するプラスミドＤＮＡを作成するために逆転写酵素／ポリメ ラーゼチェイン反応（ＲＴ／ＰＣＲ）により遺伝子を単離する。ｃ−ｍｐｌリガ ンドメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の供給源について、ヒト胎児（ロット＃ ３８１３０）および成人肝（ロット＃４６０１８）Ａ＋ＲＮＡは、クロンテク（ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（パロアルト、カリホルニア州）から得られる。第１の鎖の ｃＤＮＡ反応は、インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）（サンジエゴ、カリ ホルニア州）から得られるｃＤＮＡサイクル（登録商標）キット（ｃＤＮＡ Ｃ ｙｃｌｅTM Ｋｉｔ）を使用して行う。ＲＴ反応において、ランダムプライマー とオリゴｄＴプライマーを使用して、ヒトおよび胎児肝ｍＲＮＡの組合せからｃ ＤＮＡを作成する。アミノ酸１−１５３をコードするｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子 断片について、ＲＴ産物は、前進プライマー：ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号３ １７）と逆プライマー：Ｅｃｏｍｐｌのプライマーの組合せとともに、前駆体の 鋳型として作用する。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩプライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンド遺 伝子（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受け入れ番号＃３３４１０またはデ・サ ウバジ（ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ）ら，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５３３−５３８（ １９９４））にアニーリングし、ｃ−ｍｐｌリガンドの第１コドン（Ｓｅｒ＋１ ）のすぐ５’にＮｃｏＩ制限酵素部位をコードする。ＮｃｏＩ制限酵素部位は、 Ｓｅｒ＋１の前のメチオニンとアラニンコドンをコードし、Ａｌａコドンとｃ− ｍｐｌリガンドの最初の４つのコドン（Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ）およびＰｒｏ ）のコドン縮重を有する。Ｅｃｏｍｐｌプライマーは、ｃ−ｍｐｌリガンドの塩 基＃７２０−７３７にアニーリングし、Ａｒｇ−１５３のすぐ後のｃ−ｍｐｌリ ガンド遺伝子と同じフレーム内のＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）をコードする 。ＥｃｏＲＩ部位は、Ａｒｇ−１５３の後ろにＧｌｕとＰｈｅを作成する。約４ ８０塩基対のＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化し、ｐＭＯＮ３ ９９３（約４５５０塩基対）のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩベクター断片に連結した。 ｐＭＯＮ３９９３は、ｐＭＯＮ３３５９（例１に記載）の誘導体である。ＩＥ１ １０プロモーターとｐｏｌｙ−Ａシグナルの間のユニークなＢａｍＨＩ部位とし てサブクローニングしたヒトＩＬ−３シグナルペプチド配列は、その３’末端に ＮｃｏＩ部位を有し、後ろにユニークなＥｃｏＲＩ部位が続く。ｃ−ｍｐｌリガ ンドアミノ酸１−１５３（配列番号４６７）をコードする、（配列番号２）のＤ ＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ２６４５８は、このクローニングの 結果であった。例３ ダイマー鋳型の第２の遺伝子を含有する親プラスミドの作成 アミノ酸１（Ｓｅｒ）で開始し、アミノ酸１５３（Ａｒｇ）の後ろに終止コド ンを有するｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子断片の増幅のために、例２からのＲＴ反応 物は、以下のプライマーの組合せを有するＰＣＲの鋳型として機能する：ｃ−ｍ ｐｌＮｃｏＩ（配列番号３１７）（前進プライマー）およびｃ−ｍｐｌＨｉｎｄ III（配列番号３１９）（逆プライマー）。ｃ−ｍｐｌＮｃｏＩ（配列番号３１ ７）は例２に記載されている。ｃ−ｍｐｌリガンドの塩基＃７１６−７３７にア ニーリングするｃ−ｍｐｌＨｉｎdIII（配列番号３１９）は、最終コドンＡｒｇ153 のすぐ後ろに終止コドンとＨｉｎｄIII制限酵素を付加する。 ＲＴ ｃＤＮＡ試料から２種類のＰＣＲ産物が作成され、１つはアミノ酸１１ ２−１１５のコドンが欠失し、１つはこれらのコードの欠失は無い。哺乳動物発 現ベクターｐＭＯＮ３９３４への転移のために、ｃ−ｍｐｌリガンドＰＣＲ産物 （約４８０塩基対）をＮｃｏＩとＨｉｎｄIII制限酵素で消化する。ｐＭＯＮ３ ９３４は、ＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化され（約３８００塩基対）、ＰＣＲ産 物を受け入れるであろう。 ｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１−１５３（配列番号５４６）をコードするプラ スミドｐＭＯＮ３２１３２（配列番号８４）は、このクローニングの結果であっ た。ｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸１−１５３（配列番号５４８）をコードするプ ラスミドｐＭＯＮ３２１３４（配列番号８６）は、このクローニングの結果であ った。コドン１１２−１１５の欠失（Δ１１２−１１５）を有するｃ−ｍｐｌリ ガンドアミノ酸１−１５３（配列番号５４７）をコードするプラスミドｐＭＯＮ ３２１３３（配列番号８５）は、このクローニングの結果であった。例４ 第２のｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子中に１１２−１１５欠失を有するＰＣＲダイマ ー鋳型５Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３３（アミノ酸１１２−１１５の欠失を有する）の１キロ塩基対のＮｃ ｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１III ５Ｌ合成オリゴヌクレオチドリ ンカー５Ｌ−５’（配列番号３２２）と５Ｌ−３’（配列番号３２３）とともに して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンカーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３３のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも連結により保持されないであろう。ｐＭ ＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３３のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するであ ろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５４８はこのクローニングの結果であり、Ｇｌｕ ＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号７８３）リンカーを介して、アミノ 酸１１２−１１５（配列番号４６８）の欠失を含有するアミノ酸１−１５３ｃ− ｍｐｌリガンドに融合したアミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする （配列番号３）のＤＮＡ配列を含有する。例５ ＰＣＲダイマー鋳型４Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１ III ４Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー４Ｌ−５’（配列番号３２０）と４Ｌ −３’（配列番号３２１）とともに連結して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを 作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンガーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも連結により保持されないであろう。ｐＭ ＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するであ ろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５００はこのクローニングの結果であり、Ｇｌｕ ＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号２２３）リンカー（４Ｌ）を 介して、アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４６９）に融合した アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする（配列番号４）のＤＮＡ配 列を含有する。例６ ＰＣＲダイマー鋳型５Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３２の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１ III ５Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー５Ｌ−５’（配列番号３２２）と５Ｌ −３’（配列番号３２３）とともに連結して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを 作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンカーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３２のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも、連結により保持されないであろう。ｐ ＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３２のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するで あろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５０１はこのクローニングの結果であり、Ｇｌ ｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔ（配列番号７８３）リンカー（５Ｌ）を介し て、アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列番号４７０）に融合したアミ ノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする（配列番号４）のＤＮＡ配列を 含有する。 例７ＰＣＲダイマー鋳型８Ｌの作成 ｐＭＯＮ２６４５８の３．７キロ塩基対のＢｓｔXI／ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯ Ｎ３２１３４の１キロ塩基対のＮｃｏＩ／ＢｓｔXI断片に、ＥｃｏＲＩ／Ａｆ１ III ８Ｌ合成オリゴヌクレオチドリンカー８Ｌ−５’（配列番号３２２）と８Ｌ −３’（配列番号３２３）とともに連結して、新規な型のｃ−ｍｐｌリガンドを 作成するためのＰＣＲ鋳型を作成する。 このリンカーのＥｃｏＲＩ末端は、ｐＭＯＮ２６４５８のＥｃｏＲＩ末端に連 結するであろう。このリンカーのＡｆ１III末端は、ｐＭＯＮ３２１３４のＮｃ ｏＩ部位に連結し、制限部位はいずれも、連結により保持されないであろう。ｐ ＭＯＮ２６４５８とｐＭＯＮ３２１３４のＢｓｔXI部位とは、同様に連結するで あろう。プラスミドｐＭＯＮ２８５０２はこのクローニングの結果であり、Ｇｌ ｕＰｈｅＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＧｌｙＡｓｎＭｅｔＡｌａ（配列番号２２４ ）リンカー（８Ｌ）を介して、アミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンド（配列 番号４７１）に融合したアミノ酸１−１５３ｃ−ｍｐｌリガンドをコードする（ 配列番号６）のＤＮＡ配列を含有する。例８〜４４ 新しいＮ−末端とＣ−末端を有する新規ｃ−ｍｐｌリガンド遺伝子の作成 Ａ．新規ｃ−ｍｐｌリガンド受容体アゴニストをコードする遺伝子のＰＣＲ作成 方法III（ホーリック（Ｈｏｒｌｉｃｋ）ら，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．５：４２７ −４３３，１９９２）を使用して、ｃ−ｍｐｌリガンド受容体アゴニストを作成 した。ダイマー鋳型、ｐＭＯＮ２８５００、２８５０１、２８５０２または２８ ５４８と、下記の合成プライマーセットの１つを使用してＰＣＲ反応を行なった （最初の数字は、元々の配列中の最初のアミノ酸の位置を示す。例えば３１−５ ’と３１−３’は、元々の配列の残基３１に対応するコドンで始まる配列につい て、それぞれ５’および３’プライマーを意味する。）。 ３１−５’（配列番号３２６）と３１−３’（配列番号３２７）、３５−５’ （配列番号３２８）と３５−３’（配列番号３２９）、３９−５’（配列番号３ ３０）と３９−３’（配列番号３３１）、４３−５’（配列番号３３２）と４３ −３’（配列番号３３３）、４５−５’（配列番号３３４）と４５−３’（配列 番号３３５）、４９−５’（配列番号３３６）と４９−３’（配列番号３３７） 、８２−５’（配列番号３３８）と８２−３’（配列番号３３９）、１０９−５ ’（配列番号３４０）と１０９−３’（配列番号３４１）、１１５−５’（配列 番号３４２）と１１５−３’（配列番号３４３）、１２０−５’（配列番号３４ ４）と１２０−３’（配列番号３４５）、１２３−５’（配列番号３４６）と１ ２３−３’（配列番号３４７）、１２６−５’（配列番号３４８）と１２６−３ ’（配列番号３４９）。 ＰＣＲ反応に使用される鋳型とオリゴヌクレオチドセットを表４に示す。作成 した生成物は約４８０塩基対であり、マジックＰＣＲクリーンアップキット（Ｍ ａｇｉｃ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ）を用いて精製した。 Ｂ．キメラの作成のための哺乳動物発現ベクターへの新規ｃ−ｍｐｌ受容体アゴ ニスト遺伝子のサブクローニング ｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト遺伝子ＰＣＲ産物を、哺乳動物発現ベクターへの 転移のために、ＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIまたはＡｆ１IIIとＨｉｎｄIII制限酵素 （約４７０塩基対）で消化した。発現ベクターｐＭＯＮ３０３０４を、ＮｃｏＩ とＨｉｎｄIII（約４２００塩基対）で消化し、ＰＣＲ産物をＮｃｏＩ−Ｈｉｎ ｄIIIまたはＡｆ１III−ＨｉｎｄIII断片として受け入れる。ＰＣＲ産物の制限 消化物と得られるプラスミドを表４に示す。 例４５ ｐＭＯＮ１５９６０の作成 新しいＮ−末端とＣ−末端を有する、Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17をコードするＤＮ Ａ配列を含有するプラスミドを作成するための中間体プラスミドｐＭＯＮ１５９ ６０の作成。プラスミドｐＡＣＹＣ１７７（エー・シー・ワイ・チャン（Ｃｈａ ｎｇ，Ａ．Ｃ．Ｙ．）とエス・エヌ・コーエン（Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．）Ｊ．Ｂ ａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１−１１５６，１９７８）ＤＮＡを、制限酵 素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨＩで消化して、３０９２塩基対の塩基対ＨｉｎｄIII、 ＢａｍＨＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３０３７（ＷＯ９５／２１２５４ ）ＤＮＡをＢｇｌIIとＦｓｐＩで消化して、６１６塩基対のＢｇｌII、ＦｓｐＩ 断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３０３７ＤＮＡの第２の試料をＮｃｏＩとＨ ｉｎｄIIIで消化して、５５６塩基対のＮｃｏＩ、ＨｉｎｄIII断片を得た。合成 ＤＮＡオリゴヌクレオチド１ＧＧＧＳｆｏｒ（配列番号３８０）と１ＧＧＧＳｒ ｅｖ（配列番号３８１）を互いにアニーリングし、次にＡｆ１IIIとＦｓｐＩで 消化して、２１塩基対のＡｆ１III、ＦｓｐＩ断片を得た。制限断片を連結し、 連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形 質転換した。形質転換体細菌を、アンピシリン含有プレート で選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析して正しい挿入体 を確認した。例４６ ｐＭＯＮ１５９８１の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９８１の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド３８終止点（配列番 号３６９）と３９開始点（配列番号３６８）をプライマーとして使用するＰＣＲ 反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した。増 幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対のＨｉ ｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨｉｎ ｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片を 得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシリ ン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析し て正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９８１は、以下のアミノ酸 配列をコードする（配列番号７８）のＤＮＡ配列を含有する： 例４７ ｐＭＯＮ１５９８２の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９８２の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド９６終止点（配列番 号３７１）と９７開始点（配列番号３７０）をプライマーとして使用するＰＣＲ 反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した。増 幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対のＨｉ ｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨｉｎ ｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片を 得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシリ ン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析し て正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９８２は、以下のアミノ酸 配列をコードする（配列番号７９）のＤＮＡ配列を含有する： 例４８ ｐＭＯＮ１５９６５の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９６５の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６ＯＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮΛオリゴヌクレオチド１４２終止点（配列 番号３７７）と１４１開始点（配列番号３７６）をプライマーとして使用するＰ ＣＲ反応において、鋳型とし-C使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した 。増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対の Ｈｉｎｄlll、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨ ｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断 片を得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピ シリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解 析して正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９６５は、以下のアミ ノ酸配列をコードする（配列番号８０）のＤＮＡ配列を含有する： 例４９ ｐＭＯＮ１５９６６の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９６６の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド１２６終止点（配列 番号３７２）と１２５開始点（配列番号３７３）をプライマーとして使用するＰ ＣＲ反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した 。増幅した断片を制限酵素ＨｉｎdIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対のＨ ｉｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨｉ ｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片 を得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシ リン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析 して正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９６６は、以下のアミノ 酸配列をコードする（配列番号８１）のＤＮＡ配列を含有する： 例５０ ｐＭＯＮ１５９６７の作成 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミド ｐＭＯＮ１５９６７の作成。プラスミドｐＭＯＮ１５９６０ＤＮＡを制限酵素Ｓ ｍａＩで消化して、これを、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド１３２終止点（配列 番号３７５）と１３３開始点（配列番号３７４）をプライマーとして使用するＰ ＣＲ反応において、鋳型として使用して、５７６塩基対のＤＮＡ断片を増幅した 。増幅した断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIとＮｃｏＩで消化して、５５８塩基対の ＨｉｎｄIII、ＮｃｏＩ断片を得た。プラスミドｐＭＯＮ１３１８１ＤＮＡをＨ ｉ ｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のＨｉｎｄIII、Ａｆ１III断片 を得た。これらの制限断片を連結し、連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１を形質転換した。形質転換体細菌を、アンピシ リン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限解析により解析 して正しい挿入体を確認した。プラスミドｐＭＯＮ１５９６７は、以下のアミノ 酸配列をコードする（配列番号８２）のＤＮＡ配列を含有する： 例５１ 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの 作成のために使用される中間体プラスミドであるｐＭＯＮ１３１８０の作成 プラスミドｐＭＯＮ１３０４６（ＷＯ９５／２１２５４）ＤＮＡを制限エンド ヌクレアーゼＸｍａＩとＳｎａＢＩで消化して、４０１８塩基対のベクター断片 を得た。４０１８塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片を、マジックＤＮＡクリー ンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅ ｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を 用いて精製した（ここで２５塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ挿入体断片は保持さ れない）。Ｘａ因子切断部位をコードする配列を除去するために、合成オリゴヌ クレオチドの相補対ｇｌｙｘａ１（配列番号３７８）とｇｌｙｘａ２ （配列番号３７９）を設計した。これらのオリゴヌクレオチドはまた、正しく組 み立てるとＸｍａＩとＳｎａＢＩ末端を与える。プライマーｇｌｙｘａ１とｇｌ ｙｘａ２を、アニーリング緩衝液（２０mMトリス−塩酸 ｐＨ７．５、１０mMＭ ｇＣｌ2、５０mMＮａＣｌ）中で７０℃で１０分加熱し静かに冷却して、アニー リングさせた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用し て、ｐＭＯＮ１３０４６からの４０１８塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片を、 組み立てたオリゴヌクレオチドと連結させた。連結反応物の一部を使用して、大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メ リーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を 選択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＰＣＲベースの測定法を 使用して解析した。選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡを配列決定して 、オリゴヌクレオチドの正しい挿入を確認した。得られるプラスミドをｐＭＯＮ １３１８０（配列番号８８）と名付けた。例５２ 多機能性造血受容体アゴニストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドの 作成のために使用される中間体プラスミドであるｐＭＯＮ１３１８１の作成 プラスミドｐＭＯＮ１３０４７（ＷＯ９５／２１２５４）ＤＮＡを制限エンド ヌクレアーゼＸｍａＩとＳｎａＢＩで消化して、４０６３塩基対のベクター断片 を得た。４０６３塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片を、マジックＤＮＡクリー ンシステムアップキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅ ｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を 用いて精製した（ここで２５塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ挿入体断片は保持さ れない）。Ｘａ因子切断部位をコードする配列を除去するために、合成オリゴヌ クレオチドの相補対ｇｌｙｘａ１（配列番号３７８）とｇｌｙｘａ２（配列番号 ３７９）を設計した。これらのオリゴヌクレオチドはまた、正しく組み立てると ＸｍａＩとＳｎａＢＩ末端を与える。プライマーｇｌｙｘａ１とｇｌｙｘａ２を 、アニーリング緩衝液中で７０℃で１０分加熱し静かに冷却して、ア ニーリングさせた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使 用して、ｐＭＯＮ１３０４７からの４０６３塩基対のＸｍａＩ−ＳｎａＢＩ断片 を、組み立てたオリゴヌクレオチドと連結させた。連結反応物の一部を使用して 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ） 、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細 菌を選択した。形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＰＣＲベースの測定 法を使用して解析した。選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡを配列決定 して、オリゴヌクレオチドの正しい挿入を確認した。得られるプラスミドをｐＭ ＯＮ１３１８１（配列番号８７）と名付けた。例５３ ｐＭＯＮ１３１８２の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８２中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［３８終止点（配列番号３６９）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。プライマー［３９開始点と３８終止点］を使用して、 アニーリングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端 Ｇ−ＶＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＮｃｏ Ｉで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコン シン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガ ーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、 インディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一 部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓ ｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形 質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入 体を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８２と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８２で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８２は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１７）のＤＮＡ配列を含有する： 例５４ ｐＭＯＮ１３１８３の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８３中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から「断片開始点」を作成し増幅した。プライマー セット［３８終止点（配列番号３６９）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。３９開始点と３８終止点を使用して、アニーリン グした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１I IIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓ ｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州 ）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデ ィアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用 いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換 体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確 認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８３と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８３で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８３は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１８）のＤＮＡ配列を含有する： 例５５ ｐＭＯＮ１３１８４の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８４中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［９６終止点（配列番号３７１）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。９７開始点と９６終止点を使用して、アニーリングし た断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦＳｅ ｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間 体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８４と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８４で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１９）のＤＮＡ配列を含有する： 例５６ ｐＭＯＮ１３１８５の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８５中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［９６終止点（配列番号３７１）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。９７開始点と９６終止点を使用して、アニーリングし た断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓ ｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８５と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８５で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２０）のＤＮＡ配列を含有する： 例５７ ｐＭＯＮ１３１８６の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８６中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７３）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１２６開始点と１２５終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１I IIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓ ｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州 ）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデ ィアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用 いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換 体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を確 認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８６と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８６で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８６は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２１）のＤＮＡ配列を含有する： 例５８ ｐＭＯＮ１３１８７の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８７中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７３）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１２６開始点と１２５終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間 体プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランドリ州を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８７と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８７で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８７は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２２）のＤＮＡ配列を含有する： 例５９ ｐＭＯＮ１３１８８の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８８中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１３３開始点と１３２終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８８と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８８で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８８は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２３）のＤＮＡ配列を含有する： 例６０ ｐＭＯＮ１３１８９の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１８９中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１３３開始点と１３２終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１I IIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡク リーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓ ｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州 ）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデ ィアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用 いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆ ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒ ｇ）、メリーランドリ州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転 換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体を 確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１８９と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１８９で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８９は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２４）のＤＮΛ配列を含有する： 例６１ ｐＭＯＮ１３１９０の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１９０中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１４２開始点と１４１終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間 体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０２３塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９０と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９０で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９０は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２５）のＤＮＡ配列を含有する： 例６２ ｐＭＯＮ１３１９１の作成 材料と方法に記載の方法Ｉを使用して、ｐＭＯＮ１３１９１中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＬ−１１開始点（配列番号３６４）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＬ−１１終止点（配列番号３６５）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。１４２開始点と１４１終止点を使用して、アニー リングした断片開始点と終止点から、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、マジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（ Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。中間体 プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ １IIIで消化して、４０６８塩基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮ Ａクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓ ｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシ ン州）を使用して精製した。精製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガー ゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、イ ンディアナポリス、インディアナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部 を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌ ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ ｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質 転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９１と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９１で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９１は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２６）のＤＮＡ配列を含有する： 例６３ ｐＭＯＮ１３１９２の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９２中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［３８終 止点（配列番号３６９）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使用して、プ ラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片終止点を作 成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片終 止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断片開始点と 終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏＩ−Ｈｉｎ ｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳ Ｆ Ｓｅｒ１７遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限 エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０２３塩基対のベクタ ー断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉ ｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製した制限断 片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用 して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲー サーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した 。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを 単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿 入を確認した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９２と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９２で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９２は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２７）のＤＮＡ配列を含有する： 例６４ ｐＭＯＮ１３１９３の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９３中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３９開始点（配列番号３６ ８）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［３８終止点（配列番号３６９）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化 し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断 片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃ ｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳ Ｆ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１８１を制限エ ンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩基対のベクタ ー断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット（Ｍａｇｉ ｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍ ｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製した制限断 片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インデイアナポリス、インディアナ州）を使用 して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５ α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲー サーズバーグ（Ｇａｌｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した 。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡを 単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られたプラスミ ドをｐＭＯＮ１３１９３と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９３で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９３は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２８）のＤＮＡ配列を含有する： 例６５ ｐＭＯＮ２５１９０の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ２５１９０中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセット［９６終 止点（配列番号３７１）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使用して、プ ラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片終止点を作 成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化し、断片終 止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断片開始点と 終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏＩ−Ｈｉｎ ｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０２３塩 基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキッ ト（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精 製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディア ナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を 形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラス ミドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得ら れたプラスミドをｐＭＯＮ２５１９０と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ２５１９０で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ２５１９０は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号２９）のＤＮＡ配列を含有する： 例６６ ｐＭＯＮ２５１９１の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ２５１９１中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９７開始点（配列番号３７ ０）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７内 のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセッ ト［９６終止点（配列番号３７１）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］を使 用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片 終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで消化 し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後、断 片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮｃｏ Ｉ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０６８塩 基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキッ ト（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精 製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディア ナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＤＨ５α細胞Ｃライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を 形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラス ミドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得ら れたプラスミドをｐＭＯＮ２５１９１と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ２５１９１で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ２５１９１は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３０）のＤＮＡ配列を含有する： 例６７ ｐＭＯＮ１３１９４の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ１３１９４中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７１）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０２３塩 基対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキッ ト（Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメ ガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精 製した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（ Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディア ナ州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｌ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）相 を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラ スミドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得 られたプラスミドをｐＭＯＮ１３１９４と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｌ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９４で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３１）のＤＮＡ配列を含有する： 例６８ ｐＭＯＮ１３１９５の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９５中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１２６開始点（配列番号３ ７２）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１２５終止点（配列番号３７３）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎdIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０６８塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９５と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９５で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３２）のＤＮＡ配列を含有する： 例６９ ｐＭＯＮ１３１９６の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９６中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色 し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔ ａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−Ｃ ＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１８０を制限 エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆ１IIIで消化して、４０２３塩基対のベク ター断片を得て、これをマジックＤＮΛクリーンアップシステムキット（Ｍａｇ ｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏ ｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製した制限 断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使 用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲ ーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換し た。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミドＤＮＡ を単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られたプラス ミドをｐＭＯＮ１３１９６と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９６で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９６は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３３）のＤＮＡ配列を含有する： 例７０ ｐＭＯＮ１３１９７の作成 材料と方法に記載の方法IIを使用して、ｐＭＯＮ１３１９７中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１３３開始点（配列番号３ ７４）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１３２終止点（配列番号３７５）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し噌幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０６８塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９７と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９７で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９７は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３４）のＤＮＡ配列を含有する： 例７１ ｐＭＯＮ１３１９８の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ１３１９８中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８０を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０２３塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞Ｃライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９８と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９８で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９８は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３５）のＤＮＡ配列を含有する： 例７２ ｐＭＯＮ１３１９９の作成 材料と方法に記載の方法11を使用して、ｐＭＯＮ１３１９９中に新しいＮ−末 端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１４２開始点（配列番号３ ７６）とＰ−ｂｌ開始点（配列番号３６６）］を使用して、ｐＭＯＮ１３０３７ 内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から断片開始点を作成し増幅した。プライマーセ ット［１４１終止点（配列番号３７７）とＰ−ｂｌ終止点（配列番号３６７）］ を使用して、プラスミドｐＭＯＮ１３０３７内のＧ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17配列から 断片終止点を作成し増幅した。断片開始点を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩで 消化し、断片終止点を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIで消化した。精製後 、断片開始点と終止点を一緒にして、ｐＭＯＮ３９３４の約３８００塩基対のＮ ｃｏＩ−ＨｉｎｄIIIベクター断片に連結させた。 上記の中間体プラスミドは、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ−末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を含有し、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消 化した。消化したＤＮＡを、１％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し 、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ （Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して、完全長の新しいＮ−末端／Ｃ− 末端Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17遺伝子を単離した。中間体プラスミドｐＭＯＮ１３１ ８１を制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄIIIとＡｆIIIで消化して、４０６８塩基 対のベクター断片を得て、これをマジックＤＮＡクリーンアップシステムキット （Ｍａｇｉｃ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ ｋｉｔ）（プロメガ （Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウィスコンシン州）を使用して精製した。精製 した制限断片を一緒にして、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂ ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ 州）を使用して連結させた。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、新しい遺伝子の正しい挿入を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ１３１９９と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ１３１９９で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９９は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３６）のＤＮＡ配列を含有する： 例７３ 縦列に複製したプラスミド鋳型Ｓｙｎｔａｎ１の作成 縦列に複製したｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６鋳型Ｓｙｎｔ ａｎ１を作成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する連結により、３つのＤＮＡを 結合させた。３つのＤＮＡは：１）ＢｓｔＥIIとＳｎａＢＩで消化した、ｈＩＬ −３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６を含有するｐＭＯＮ１３０４６；２） 合成オリゴヌクレオチドのアニーリングした相補対である、Ｌ１ｓｙｎ．ｆｏｒ （配列番号３５２）とＬ１ｓｙｎ．ｒｅｖ（配列番号３５３）（これは、元々の タンパク質のＣ−末端とＮ−末端を連結するリンカーをコードする配列と、少量 の周りのｐＭＯＮ１３４１６配列を含有し、正しく組み立てるとＢｓｔＥIIとＣ ｌａＩ末端を与える）；および３）ＣｌａＩ（ＤＮＡは、ｄａｍ−細胞ＤＭ１（ ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で増殖され ている）とＳｎａＢＩにより、ｐＭＯＮ１３０４６から消化したｈＩＬ−３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の一部、である。消化したＤＮＡを０．９ ％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃ ｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１）を使用して単離した。 連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。ミニプレップ （Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを形質転換体から単離し、ＰＣＲベースの測定法を 使用して形質転換体をスクリーニングした。選択した形質転換体からのプラスミ ドＤＮＡを配列決定して、正しい鋳型を得た。得られたプラスミドをｓｙｎｔａ ｎ１と名付け、これは（配列番号７）のＤＮＡ配列を含有する。例７４ 縦列に複製したプラスミド鋳型ｓｙｎｔａｎ３の作成 縦列に複製したｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６鋳型ｓｙｎｔ ａｎ３を作成するために、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用する連結により、３つのＤＮＡを 結合させた。３つのＤＮＡは：１）ＢｓｔＥIIとＳｎａＢＩで消化した、ｈＩＬ −３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６を含有するｐＭＯＮ１３０４６；２） 合成オリゴヌクレオチドのアニーリングした相補対である、Ｌ３ｓｙｎ．ｆｏｒ （配列番号３５４）とＬ３ｓｙｎ．ｒｅｖ（配列番号３５５）（これは、元々の タンパク質のＣ−末端とＮ−末端を連結するリンカーをコードする配列と、少量 の周りのｐＭＯＮ１３４１６配列を含有し、正しく組み立てるとＢｓｔＥIIとＳ ｎａＢＩ末端を与える）；および３）ＣｌａＩ（ＤＮＡは、ｄａｍ−細胞ＤＭ１ （ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で増殖さ れている）とＳｎａＢＩにより、ｐＭＯＮ１３０４６から消化したｈＩＬ−３受 容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の一部、である。消化したＤＮＡを０．９％ ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌ ｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１）を使用して単離した。 連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフ テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（ Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質転換した。ミニプレッ プ（Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを形質転換体から単離し、ＰＣＲベースの測定法 を使用して形質転換体をスクリーニングした。選択した形質転換体からのプラス ミドＤＮＡを配列決定して、正しい鋳型を得た。得られたプラスミドをｓｙｎｔ ａｎ３と名付け、これは（配列番号８）のＤＮＡ配列を含有する。例７５ ｐＭＯＮ３１１０４の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０４中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３５開始点（配列番号３ ５６）と３４ｒｅｖ（配列番号３５７）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏｌとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニストｐ ＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片は 、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア 州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質 転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミド ＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドを ｐＭＯＮ３１１０４と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０４で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号９）のＤＮＡ配列を含有する： 例７６ ｐＭＯＮ３１１０５の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０５中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［７０開始点（配列番号３ ５８）と６９ｒｅｖ（配列番号３５９）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製 した消化ＤＮＡ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ １３１８９ＤＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択し た。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ３１１０５と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭ０Ｎ３１１０５で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１０）のＤＮＡ配列を含有する： 例７７ ｐＭＯＮ３１１０６の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０６中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９１開始点（配列番号３ ６０）と９０ｒｅｖ（配列番号３６１）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択し た。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ３１１０６と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０６で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０６は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１１）のＤＮＡ配列を含有する： 例７８ ｐＭＯＮ３１１０７の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０７中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１０１開始点（配列番号 ３６２）と１００ｒｅｖ（配列番号３６３）］を使用して、中間体プラスミドＳ ｙｎｔａｎ１からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新 しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニストｐ ＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片は 、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア 州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形質 転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミド ＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミドを ｐＭＯＮ３１１０７と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０７で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０７は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１２）のＤＮＡ配列を含有する： 例７９ ｐＭＯＮ３１１０８の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０８中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［３５開始点（配列番号３ ５６）と３４ｒｅｖ（配列番号３５７）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。．消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離 し、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ １０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４Ｄ ＮＡリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ ｉｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮ Λ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９Ｄ ＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニスト ｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換Ｉ．た。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択 した。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得ら れたプラスミドをｐＭＯＮ３１１０８と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１−をｐＭＯＮ３１１０８で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０８は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１３）のＤＮＡ配列を含有する： 例８０ ｐＭＯＮ３１１０９の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１０９中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［７０開始点（配列番号３ ５８）と６９ｒｅｖ（配列番号３５９）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インデ．ィアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮ Ａ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９Ｄ ＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニスト ｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片 は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリー ン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニ ア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミド をｐＭＯＮ３１１０９と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１０９で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１０９は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１４）のＤＮＡ配列を含有する： 例８１ ｐＭＯＮ３１１１０の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１１０中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［９１開始点（配列番号３ ６０）と９０ｒｅｖ（配列番号３６１）］を使用して、中間体プラスミドＳｙｎ ｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新しい Ｎ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮＡ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インディアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮＡ 断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９ＤＮ ＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容 体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対の ベクター断片は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、 ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ） 、カリホルニア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｉｅｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーラ ンド州）を形質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択し た。プラスミドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られ たプラスミドをｐＭＯＮ３１１１０と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１１０で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１０は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１５）のＤＮＡ配列を含有する： 例８２ ｐＭＯＮ３１１１１の作成 材料と方法に記載の方法IIIを使用して、ｐＭＯＮ３１１１１中に新しいＮ− 末端／Ｃ−末端遺伝子を作成した。プライマーセット［１０１開始点（配列番号 ３６２）と１００ｒｅｖ（配列番号３６３）］を使用して、中間体プラスミドＳ ｙｎｔａｎ３からｈＩＬ−３受容体アゴニストｐＭＯＮ１３４１６の完全長の新 しいＮ−末端／Ｃ−末端遺伝子を作成し増幅した。 新しい遺伝子を含有する得られたＤＮΛ断片を、制限エンドヌクレアーゼＮｃ ｏＩとＳｎａＢＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、１％ＴＡＥゲルで分離し 、臭化エチジウムで染色し、ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１ ０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニア州）を使用して単離した。Ｔ４ＤＮ Ａリガーゼ（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）、インデ．ィアナポリス、インディアナ州）を使用して、精製した消化ＤＮ Ａ断片を発現ベクターｐＭＯＮ１３１８９に連結させた。ｐＭＯＮ１３１８９Ｄ ＮＡはあらかじめＮｃｏＩとＳｎａＢＩで消化して、ｈＩＬ３受容体アゴニスト ｐＭＯＮ１３４１６コード配列を除去してあり、４２５４塩基対のベクター断片 は、０．８％ＴＡＥゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した後、ジーンクリー ン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）（Ｂｉｏ１０１、ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリホルニ ア州）を使用して単離した。連結反応物の一部を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）株ＤＨ５α細胞（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ ｓ）、ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州）を形 質転換した。アンピシリン含有プレートで形質転換体細菌を選択した。プラスミ ドＤＮＡを単離し配列決定して、正しい挿入体を確認した。得られたプラスミド をｐＭＯＮ３１１１１と名付けた。 封入体からのタンパク質発現とタンパク質単離のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ ｉ）株ＪＭ１０１をｐＭＯＮ３１１１１で形質転換した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１１は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号１６）のＤＮＡ配列を含有する： 例８３ ｐＭＯＮ３１１１２の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１２の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８９ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２２２（ＷＯ９４／１２６３９ 、米国出願第０８／４１１，７９６号）をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、２ ８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１．０％アガロー スゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯＸＡ１．ＲＥＱ （配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５１）をアニーリ ングし、ｐＭＯＮ１３２２２からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を用いて、ｐＭＯ Ｎ１３１８９からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結混合物の一部を 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した。形質転換体細 菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限 解 析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定して正しい挿入体 を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１２は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３７）のＤＮＡ配列を含有する： ｐＭＯＮ３１１１３の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１３の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９７ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２３９（ＷＯ９４／１２６３９ 、米国出願第０８／４１１，７９６号）をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、２ ８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１．０％アガロー スゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯＸＡ１．ＲＥＱ （配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５１）をアニーリ ングし、ｐＭＯＮ１３２３９からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を用いて、ｐＭＯ Ｎ１３１９７からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結混合物の一部を 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した。形質転換体細 菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限 解析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定して正しい挿入 体を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１３は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３８）のＤＮＡ配列を含有する： 例８５ ｐＭＯＮ３１１１４の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１４の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１８９ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２３９（Ｗ０９４／１２６３９ 、米国出願第０８／４１１，７９６号）をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩで消化して、２ ８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１．０％アガロー スゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯＸＡ１．ＲＥＱ （配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５１）をアニーリ ングし、ｐＭＯＮ１３２３９からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を用いて、ｐＭＯ Ｎ１３１８９からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結混合物の一部を 、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した。形質転換体細 菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、制限 解析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定して正しい挿入 体を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１４は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号３９）のＤＮＡ配列を含有する： 例８６ ｐＭＯＮ３１１１５の作成 ｈＩＬ−３受容体とＧ−ＣＳＦ受容体を活性化する多機能性造血受容体アゴニ ストをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドｐＭＯＮ３１１１５の作成。 プラスミドｐＭＯＮ１３１９７ＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩとＸｍａＩで消化して 、ＮｃｏＩ、ＸｍａＩベクター断片を得て、これを、０．８％アガロースゲルで 単離し精製した。第２のプラスミドｐＭＯＮ１３２２２をＮｃｏＩとＥｃｏＲＩ で消化して、２８１塩基対のＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩ断片を得た。この断片を、１ ．０％アガロースゲルで単離し精製した。２つのオリゴヌクレオチドＳＹＮＮＯ ＸＡ１．ＲＥＱ（配列番号３５０）とＳＹＮＮＯＸＡ２．ＲＥＱ（配列番号３５ １）をアニーリングし、ｐＭＯＮ１３２２２からの２８１塩基対のＤＮＡ断片を 用いて、ｐＭＯＮ１３１９７からのＤＮＡベクター断片に連結させた。次に連結 混合物の一部を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株ＪＭ１０１に形質転換した 。形質転換体細菌を、アンピシリン含有プレートで選択した。プラスミドＤＮＡ を単離し、制限解析により解析して、ＥｃｏＲＶ断片の存在を証明し、配列決定 して正しい挿入体を確認した。 プラスミドｐＭＯＮ３１１１５は、以下のアミノ酸配列をコードする（配列番 号４０）のＤＮＡ配列を含有する： 例８７ 多機能性造血受容体アゴニストタンパク質のインビトロ活性の測定 多機能性造血受容体アゴニストタンパク質のタンパク質濃度は、アフィニティ 精製したポリクローナル抗体ベースのサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定す ることができる。あるいはタンパク質濃度は、アミノ酸組成分析により測定する ことができる。多機能性造血受容体アゴニストの生物活性は、多くのインビトロ 測定法で測定することができる。例えばｈＩＬ−３受容体やＧ−ＣＳＦ受容体に 結合する多機能性造血受容体アゴニストは、ｈＩＬ−３および／またはＧ−ＣＳ Ｆ受容体を発現する細胞株を使用する細胞増殖測定法により測定することができ る。そのような測定法の１つは、ＡＭＬ−１９３細胞増殖測定法である。ＡＭＬ −１９３細胞は、ＩＬ−３とＧ−ＣＳＦに応答し、ＩＬ−３／Ｇ−ＣＳＦ多機能 性造血受容体アゴニストの組合せ生物活性の測定を可能にする。この種の別の測 定法は、ＴＦ１細胞増殖測定法である。 さらに、マウスＩＬ−３依存性細胞株であるＭ−ＮＦＳ−６０（ＡＴＣＣ．Ｃ ＲＬ１８３８）または３２Ｄのような他の因子依存性細胞株を使用してもよい。 ＩＬ−３の活性は種特異的であるが、Ｇ−ＣＳＦはそうではなく、従ってＩＬ− ３／Ｇ−ＣＳＦ多機能性造血受容体アゴニストのＧ−ＣＳＦ成分の生物活性は独 立に測定することができる。あるリガンドに対する受容体を発現しない細胞株（ 例えば、ＢＨＫまたはマウスＢａｆ／３）は、所望の受容体をコードする遺伝 子を含有するプラスミドでトランスフェクションすることができる。そのような 細胞株の例は、ｈＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクションしたＢａＦ３である （ＢａＦ３／ｈＧ−ＣＳＦ）。これらの細胞株中の多機能性造血受容体アゴニス トの活性は、ｈＩＬ−３もしくはＧ−ＣＳＦ単独とまたは一緒に比較することが できる。ＢａＦ３／ｈＧ−ＣＳＦ細胞増殖測定法とＴＦ１細胞増殖測定法で測定 される本発明の多機能性造血受容体アゴニストの例の生物活性を、表５と表６に 示す。多機能性造血受容体アゴニストの生物活性は、ＩＬ−３およびＧ−ＣＳＦ 受容体結合活性を有する標準タンパク質ｐＭＯＮ１３０５６（ＷＯ９５／２１２ ５４）と比較して相対的活性として表す。ＢａＦ３／ｃ−ｍｐｌ細胞増殖測定法 とＴＦ１細胞増殖測定法で測定される本発明の多機能性造血受容体アゴニストの 例の生物活性を、表７と表８に示す。ｎｄ＝測定せず* 多機能性造血受容体アゴニストの生物活性は、標準タンパク質ｐＭＯＮ１３０ ５６と比較して相対活性として表す。ｎ＝３以上。ｎｄ＝測定せず+ 多機能性造血受容体アゴニストの生物活性（ｎ＝１または２）は、標準タンパ ク質ｐＭＯＮ１３０５６と比較して相対活性として表す。 「＋」は、分子がｐＭＯＮ１３０５６に匹敵することを示す。 *ｃ−ｍｐｌリガンド（１−１５３）に対する、ｃ−ｍｐｌ受容体でトランス フェクションしたＢａｆ３細胞株で測定した活性。 +ｐＭＯＮ１３０５６に対して測定した活性。 同様に、所望の多機能性造血受容体アゴニストの生物活性を測定するのに、当 業者に公知の他の因子依存性細胞株を使用することができる。メチルセルロース 測定法を使用して、造血始原細胞の拡張およびインビトロの異なる型の造血コロ ニーのパターンに及ぼす多機能性造血受容体アゴニストの効果を測定することが できる。メチルセルロース測定法は、１００，０００個の投入細胞あたりの始原 細胞の頻度を測定するため、前駆体頻度の推定値を与える。長期の間質依存性培 養物は、原始的造血始原細胞、特に幹細胞を区別するのに使用されている。この 測定法は、多機能性造血受容体アゴニストが、非常に原始的な始原細胞および／ または幹細胞の拡張を刺激するかどうかを決定するのに使用することができる。 さらに、多機能性造血受容体アゴニストにより刺激される原始的始原細胞の頻度 を示す、限界希釈培養を行うことができる。 例８８ ＷＯ９４／１２６３９およびＷＯ９４／１２６３８に記載のＰＣＲ突然変異誘 発法を使用して、単一のまたは複数のアミノ酸置換を有するＧ−ＣＳＦ変種を作 成した。これらのおよび他の変種（すなわち、アミノ酸置換、挿入、または欠失 、およびＮ−末端またはＣ−末端伸長）は、当業者により、合成遺伝子組み立て または部位特異的突然変異誘発（テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：７８６４−８７８５［１９８５］；クンケル（Ｋｕｎ ｋｅｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８− ４９２［１９８５］；サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、モレキュラークロ ーニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト リー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州［１９８９］、ＷＯ９４／１２６３９およびＷ Ｏ９４／１２６３８を参照）を含む他の種々の方法を使用して作成することがで きるであろう。これらの置換は、１回に１つ、または他のアミノ酸置換、および ／または欠失、および／または挿入および／または伸長と組合せて作成すること ができる。配列の変化を証明した後、産生のためにプラスミドＤＮＡを、適当な 哺乳動物細胞、昆虫細胞または細菌株（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））にト ランスフェクションすることができる。活性のあるＧ−ＣＳＦの公知の変種とし ては、１位（ＴｈｒからＳｅｒ、ＡｒｇまたはＧｌｙ），２位（ＰｒｏからＬｅ ｕ）、３位（ＬｅｕからＡｒｇまたはＳｅｒ）、および１７位（ＣｙｓからＳｅ ｒ）の置換、およびアミノ酸１〜１１の欠失（クガ（Ｋｕｇａ）ら、Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃｌａ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍ ．１５９：１０３−１１１（１９８９））がある。これらのアミノ酸置換変種は 、新しいＮ−末端および新しいＣ−末端が作成されるＧ−ＣＳＦ受容体アゴニス トを作成するための鋳型として使用することができる。Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換 変種の例を表９に示す。例８９ Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種の生物活性測定 Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種は、ヒトＧ−ＣＳＦ受容体でトランスフェクショ ンしたＢａｆ／３細胞株を使用して、細胞増殖活性について測定することができ る。Ｇ−ＣＳＦアミノ酸置換変種の例の生物活性を、未変性のヒトＧ−ＣＳＦに 比較して表９に示す。「＋」は、未変性のものに匹敵する活性を示し、「−」は 、有意に低下しているかまたは測定できる活性は全くないことを示す。 *未変性のｈＧ−ＣＳＦに対する活性 ｎｄ＝測定せず例９０ ｆｌｔ３リガンドをコードするｃＤＮＡの単離 ＮＣＯＦＬＴ、ＨＩＮＤ１６０、およびＨＩＤ１６５ＰＣＲプライマーを使用 してヒト骨髄ｐｏｌｙ Ａ＋ＲＮＡ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））から（ 製造業者の推奨する条件に従って）、３つのｆｌｔ３リガンドクローンを増幅し た。これらの増幅ＰＣＲ産物をゲル精製し、ＢＨＫ発現ベクターｐＭＯＮ５７２ ３中にクローン化して、ｐＭＯＮ３０２３７（ＮＣＯＦＬＴ＋ＨＩＮＤ１６ ０）、ｐＭＯＮ３０２３８（ＮＣＯＦＬＴ＋ＨＩＮＤ１６５）、および欠失コロ ニーｐＭＯＮ３０２３９（ＮＣＯＦＬＴ＋ＨＩＮＤ１６５）を作成した。ｐＭＯ Ｎ２０２３９の欠失は、アミノ酸残基８９から１０６である。例９１ いくつかの方法といくつかの型のリンカーを使用して、配列を並べ替えたｆｌ ｔ３受容体アゴニストを作成した。ムリンズ（Ｍｕｌｌｉｎｓ）らが記載した２ 工程ＰＣＲ法（各最終の配列を並べ替えた分子の前の半分と後ろの半分を第１の 工程で別々に作成し、次に第１の反応工程の対になった生成物を第２の工程で一 緒にして、外来性プライマーの非存在下で伸長する）を使用して、切断点３９／ ４０）６５／６６、および８９／９０を有するリンカーペプチド（ＳｅｒＧｌｙ ＧｌｙＡｓｎＧｌｙ）Ｘ（ここでＸ＝１、２、または３）を含有する作成体の第 １のセットを作成した。例えば、ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙ 配列番号７ ８６、およびＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙ 配列番号７８７、およびＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙ ＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＡｓｎＧｌｙ 配列番号７８８アミノ酸リンカ ーを有する８９／９０切断点前駆体分子（それぞれ、ｐＭＯＮ３２３２６、ｐＭ ＯＮ３２３２７、およびｐＭＯＮ３２３２８）を作成するために、６つの初期Ｐ ＣＲ産物を作成した。以下のプライマー対を第１の工程のＰＣＲ反応で使用した ：ａ）８９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂ；ｂ）８９Ｆｏｒ／ＬＩＯＢ；ｃ）８９Ｆｏｒ／Ｌ１ ５Ｂ；ｄ）８９Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ；ｅ）８９Ｒｅｖ／Ｌ１０Ａ；およびｆ）８９Ｒ ｅｖ／Ｌ１５Ａ。同じアプローチを使用して、ｐＭＯＮ３２３２１（３９／４０ 切断点、プライマー対３９Ｆｏｒ／Ｌ１０Ｂおよび３９Ｒｅｖ／Ｌ１０Ａ）およ びｐＭＯＮ３２３２５（６５／６６切断点、プライマー対６５Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂお よび６５Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ）前駆体を作成した。下記のもの以外は、以後のすべて のＰＣＲ反応は、ＰＣＲオプチマイザーキット（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ）（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））の成分と製造業者の推奨 するプロトコールに従う増幅条件を使用した。反応は以下のように設定した：５ ０pmolの各プライマー、１０μｌの５×緩衝液Ｂ［３００mMトリス−塩酸（ｐＨ ８．５）、１０mM ＭｇＣｌ2、７５mM（ＮＨ4）2ＳＯ4］、５Ｕの Ｔａｑポリメラーゼ、および１０Ｏngの熱変性ＤＮＡ（この例ではｐＭＯＮ３０ ２３８）鋳型を一緒にし、ｄＨ2Ｏで最終容量を４５μｌにした。反応物を８０ ℃で１〜５分プレインキュベートし、次に各反応物に１０mM ｄＮＴＰを５μｌ 加え、９４℃で２分熱変性してから、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌ ｍｅｒ）モデル４８０ＤＮＡサーマルサイクラーで増幅した。以下の条件で７回 のＤＮＡ増幅サイクルを行なった：９４℃で１分熱変性、６５℃で２分アニーリ ング、次に７２℃で３分伸長。９４℃で１分熱変性と次に７２℃で４分アニーリ ング／伸長をさらに２３サイクル行い、次に７２℃で最後の７分の伸長サイクル を行なった。ｐＭＯＮ３２３２８以外は、ＰＣＲ増幅産物は１．２％ＴＡＥアガ ロースゲルで流し、適切なサイズのバンド（主要な増幅産物）を切り出し、ジー ンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製した。試 料を１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。ウィザードＰＣＲクリーンアップキット （Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅ ｇａ））を使用して、ｐＭＯＮ３２３２８の増幅産物を直接精製し、５０μｌの ｄＨ2ＯでＤＮＡを溶出した。鋳型の量を１μｇに増加させ、ＰＣＲ増幅条件を 以下のように変化させて、ｐＭＯＮ３２３２２の前駆体（３９／４０切断点、プ ライマー対３９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂおよび３９Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ）を作成するための方 法を修飾した：９４℃１分、６５℃２分、および７２℃２．５分を６サイクル、 次に９４℃１分、７０℃２分、および７２℃２分を１５サイクル、次に７２℃で ７分伸長を１サイクル。 第２のＰＣＲ工程では、第１のＰＣＲ工程からのゲル精製した前駆体を、以下 のようにプライマー／鋳型の組合せとして使用した：各前駆体分子５μｌ（すな わち、ｐＭＯＮ３２３２８についてプライマー対８９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂおよび８９ Ｒｅｖ／Ｌ５ＡからのＰＣＲ産物）、１０μｌの５×緩衝液Ｂ、５ＵのＴａｑポ リメラーゼ、および２４μｌのｄＨ2Ｏ。反応物を８０℃で５分加熱し、５μｌ の１０mM ｄＮＴＰを加え、反応物を９４℃で２分熱変性した。ＤＮＡ増幅条件 は以下の通りであった：９４℃１分、６９℃２分を１５サイクル、次に７２℃で ３分伸長。完全に伸長させるために、最後のサイクルの後に、７２℃で７分の伸 長工程を１回行なった。８０度のインキュベーション時間を２分に短縮し、サイ クルの数をｐＭＯＮ３２３２５について１０サイクルに減らした（ＰＣＲ産物６ ５Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂと６５Ｒｅｖ／Ｌ５Ａ）。ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａ ｎ）IIを使用して、適当なサイズのＰＣＲ反応産物を、１．２％ＴＡＥアガロー スゲルでゲル精製した。ｐＭＯＮ３２３２２（３９Ｆｏｒ／Ｌ５Ｂと３９Ｒｅｖ ／Ｌ５Ａ）についてアニーリング温度を６８℃に下げ、伸長時間を２分に短縮し た。さらにＰＣＲ産物をウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用 して、供給業者の推奨するプロトコールに従って精製した。第２のＰＣＲ工程を 、ｐＭＯＮ３２３２６（８９Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｂと８９Ｒｅｖ／Ｌ１５ΛのＰＣＲ 産物）について以下のように修飾した。試料緩衝液（５×緩衝液Ｂ、Ｄ、または Ｊ−ＰＣＲオプチマイザーキット（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ））を 除いて、上記と同様にして３セットのＰＣＲ反応物を設定した。緩衝液ＤとＪの 組成は、ｐＨまたは［ＭｇＣｌ2］のみで異なる。緩衝液Ｄの［ＭｇＣｌ2］は３ ．５mMであり、緩衝液ＪのｐＨは９．５である。プロトコールを修飾して、ＰＣ Ｒサイクル数を２０に上げ、サイクル１０、１５および２０の最後に１５μｌの アリコートを取った。各アリコートの時点の５μｌを、１．２％ＴＢＥアガロー スゲルで増幅物質の存在について分析した。緩衝液Ｂ、Ｄ，およびＪのＰＣＲ反 応混合物の残りをプールし、次にウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉ ｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ）を使用して精製した。ＤＮＡは５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。 ２つの標準化消化条件の１つを使用して、第２工程ＰＣＲ反応からの精製試料 をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化した。ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）I Iで消化した試料について、１０μｌのＤＮＡを、２０μｌの反応物中で各７． ５ＵのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで３７℃で２時間反応させて消化し、１．１％Ｔ ＡＥアガロースゲルで再度ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）IIを用いてゲ ル精製した。連結の準備のできた試料を１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。ｐＭ ＯＮ３２３２２について２０μｌの試料を、５０μｌの反応容量で各２０ＵのＮ ｃｏＩとＨｉｎｄIIIで、３７℃で３時間消化した。０．１容量の３Ｍ ＮａＯ Ａｃ（ｐＨ５．５）と２．５容量のＥｔＯＨを加え、混合し、−２０℃で一晩保 存した。シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｍｋ２０２マイクロフュージ中で４℃で１３，０ ００ｒｐｍで２０分ペレット化して、ＤＮＡを回収した。ＤＮＡペレットを、冷 却した７０％ＥｔＯＨですすぎ、凍結乾燥し、１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した 。例９２ 別のアプローチを使用して、ｐＭＯＮ３２３２０（３９／４０切断点、１５ア ミノ酸リンカー）、ｐＭＯＮ３２３２３（６５／６６切断点、１５ＡＡリンカー ）、およびｐＭＯＮ３２３２４（６５／６６切断点、１０アミノ酸リンカー）を 作成した。ＢａｍＨＩ部位へのクローニングを可能にし正しい読みとり枠を維持 するためにフレーム内にあるプライマーに、ＢａｍＨＩ制限部位を取り込むため に、新しいプライマー（Ｌ１５Ｃ、Ｌ１５Ｄ、Ｌ１５Ｅ）を設計した。最初の工 程のＰＣＲ反応条件は、ｐＭＯＮ３２３２２に記載のものと同様に行なったが、 以下のセットのプライマー対を使用した：６５Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと６５Ｒｅｖ／ Ｌ１５Ｅ（ｐＭＯＮ３２３２４）；３９Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと３９Ｒｅｖ／Ｌ１５ Ｃ（ｐＭＯＮ３２３２０）；および６５Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと６５Ｒｅｖ／Ｌ１５ Ｃ（ｐＭＯＮ３２３２３）。ＰＣＲ反応生成物を、前記したようにウィザードＰ ＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ ）を使用して精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。試料を、ＮｃｏＩ／Ｂａ ｍＨＩ（３０Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄと６５Ｆｏｒ／Ｌ１５Ｄ）またはＢａｍＨＩ／Ｈ ｉｎｄIII（３９Ｒｅｖ／Ｌ１５Ｃ、６５Ｒｅｖ／Ｌ１５Ｃ、および６５Ｒｅｖ ／Ｌ１５Ｅ）で消化した。制限消化を以下のように行なった：最終反応容量３０ μｌ中の、１０μｌの精製ＰＣＲ反応生成物、３μｌの１０×汎用制限緩衝液、 １５ＵのＮｃｏＩもしくはＨｉｎｄIII、１５ＵのＢａｍＨＩ。反応物を３７℃ で９０分インキュベートし、ＰＣＲ産物をジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ）IIを使用して１．１％ＴＡＥアガロースゲルで精製した。連結の準備のできた ＤＮＡを１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。 以下のように３成分（ｐＭＯＮ３２３２０、ｐＭＯＮ３２３２３、またはｐＭ ＯＮ３２３２４）または２成分（ｐＭＯＮ３２３２１、ｐＭＯＮ３２３２２、ｐ ＭＯＮ３２３２５、ｐＭＯＮ３２３２６、ｐＭＯＮ３２３２７およびｐＭＯＮ３ ２３２８）連結反応で、エビ（ｓｈｒｉｍｐ）アルカリ性ホスファターゼ（ＳＡ Ｐ）で処理した、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ３９７７（ＢＨＫ哺 乳動物発現ベクター）に挿入体を連結させた：２．５μｌの挿入体（ｐＭＯＮ３ ２３２０、ｐＭＯＮ３２３２３、およびｐＭＯＮ３２３２４のいずれかのプライ マー対の２μｌ）を、標準的連結条件を使用して、１０μｌの反応物中で５０ng のベクターに加えた。各反応物の２μｌを、製造業者の推奨するプロトコールに 従って、１００μｌの化学的にコンピタントなＤＨ５α細胞（ギブコ／ビーアー ルエル（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）で形質転換した。２５μｌと２００μｌのアリコ ートを、５０μg/mlアンピシリン含有ＬＢプレートに蒔き、一晩インキュベート した。単離したコロニーを取り上げ、キアゲンＤＮＡミジプレップ（Ｑｉａｇｅ ｎ ＤＮＡ ｍｉｄｉｐｒｅｐ）キットを使用して、５０mlの一晩培養物からＤ ＮＡを調製した。Ａ２６０／２８０の吸光度によりＤＮＡを定量し、１μｇの鋳 型をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII制限エンドヌクレアーゼで消化した後、アガロース ゲル電気泳動により正しい挿入体のサイズを証明した。予測されたサイズの挿入 体を含有する試料を、ベクター特異的プライマーを使用して、自動蛍光ＤＮＡシ ーケンサーモデル３７３Ａ（パーキン・エルマー・エービーアイ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ）を使用して、両方の配向で配列決定した。配列決定反応 は、２０μｌの反応容量でパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）モ デル４８０ＤＮＡサーマルサイクラーを使用して、以下のように行なった：１μ ｇの鋳型、３．２pmolのプライマー、１μｌのＤＭＳＯ、９．５μｌのＴａｑタ ーミネータージデオキシプレミックス（パーキン・エルマー・エービーアイ（Ｐ ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ））を一緒にし、２５サイクルの以下の配列決 定増幅を行なった：９４℃で３０秒、５０℃で１５秒アニーリング、次に６０℃ で４分の伸長サイクル。試料をセントリセプ（Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐ）スピンカ ラム（プリンストン・セパレーションズ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｓｅｐａｒａｔ ｉｏｎｓ））を使用して製造業者の推奨するプロトコールに従って精製し、凍結 乾燥し、配列解析を行なった。予測されるアミノ酸配列を有する試料を、解析の ために選択し、ｐＭＯＮ番号を割り当てた。例９３ ｐＭＯＮ３２３２０、ｐＭＯＮ３２３２３、およびｐＭＯＮ３２３２４を作成 するのに使用したものと同じアプローチを使用して、３９／４０切断点を含有す る２つの配列を並べ替えた配列（ｐＭＯＮ３２３４８とｐＭＯＮ３２３５０）中 に、第２のタイプのリンカー（ＳｅｒＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ）Ｘ（ここで、 Ｘ＝２または３）を導入した。プライマー対は以下の通りである：ｐＭＯＮ３２ ３４８については３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３と３３９Ｒｅｖ２／３３９− １０Ｆｏｒ３の組合せ、ｐＭＯＮ３２３５０については３３９Ｆｏｒ２／３３９ Ｒｅｖ３と３３９Ｒｅｖ２／３３９−１５Ｆｏｒ３の組合せを使用して、３つの ＰＣＲ増幅産物を作成した。各ＰＣＲ増幅を以下のように設定した：１００ngの 熱変性ｐＭＯＮ３２３２０、５０pmolの各プライマー対、１０μｌの５×緩衝液 Ｂ、５ＵのＴａｑポリメラーゼおよびｄＨ2Ｏを、最終容量４５μｌななるよう に加えた。反応物を、前記したようにプレインキュベートした。以下の条件で１ ５サイクルの増幅を行なった：９４℃で１分熱変性、次に７０℃で２分のアニー リング工程、そして７２℃で３分の伸長。最後のサイクル後、７２℃の７分の伸 長工程を１回行なった。プライマー対３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３、３３９ Ｒｅｖ２／３３９−１０Ｆｏｒ３、および３３９Ｒｅｖ２／３３９−１５Ｆｏｒ ２のＰＣＲ増幅産物を、ウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用 して精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３ プライマー対のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ消化物は以下の通り：８μｌのＤＮＡ鋳型 を、２０μｌの反応容量中で２μｌの汎用制限緩衝液および各１０ＵのＮｃｏＩ とＢａｍＨＩと混合し、３７℃で９０分インキュベートした。消化産物を、ジー ンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II直接精製プロトコールを使用して精製し、 連結の準備のできたＤＮＡを１０μｌのｄＨ2Ｏに再懸濁した。３３９Ｒｅｖ２ ／３３９−１０Ｆｏｒ３と３３９Ｒｅｖ２／３３９−１５Ｆｏｒ２増幅産物につ いての制限消化と以後の精製は、３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３アンプリコン の場合と同様に行なったが、ＮｃｏＩの代わりに１０ＵのＨｉｎｄIIIを使用し た。５０ngのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理しゲル精製したｐＭＯＮ３９ ７７、０．５μｌの３３９Ｆｏｒ２／３３９Ｒｅｖ３アンプリコン、１μｌの３ ３９Ｒ ｅｖ２／３３９−１０Ｆｏｒ３（ｐＭＯＮ３２３４８）または３３９Ｒｅｖ２／ ３３９−１５Ｆｏｒ３（ｐＭＯＮ３２３５０）アンプリコン、５ＵのＴ４ＤＮＡ リガーゼ、および１μｌの１０×リガーゼ緩衝液を１０μｌの反応容量で加えて 、周囲温度で６０分で標準的連結反応を行なった。最後のＤＮＡ配列確認までの 以後の工程は前記したように行なった。例９４ 可変の（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）Ｘ繰り返しモチーフを有する第３のタイ プのリンカーを、モジュールで作成した鋳型からの配列並べ替えｆｌｔ３受容体 アゴニストの別のセットに取り込んだ。これらのリンカーの長さは以下の通りで ある：６ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９ ２）、７ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ 配列番 号７９３）、１０ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ ＳｅｒＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９４）、１３ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌ ｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ 配列番号 ７９５）、１５ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳ ｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９６）；および ２１ＡＡリンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ ＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒＧｌｙ 配列番号７９７）アミノ酸残基。これらのモジュラー鋳型（各々が、ユニーク な長さのＢａｍＨＩ含有リンカーにより分離されたｈｆｌｔ３リガンドのダイマ ーを含む）を、以下のように作成した。６つの中間体プラスミド鋳型（ＦＬ３Ｎ 、ＦＬ７Ｎ、ＦＬ１１Ｎ、ＦＬ３Ｃ、ＦＬ４Ｃ，およびＦＬ１０Ｃ）を、対にな ったプライマーと鋳型としてのｐＭＯＮ３０２３８を使用して、ｐＭＯＮ３２３ ２２について使用した条件と同様のサイクル条件を使用して、ＰＣＲにより作成 した。各反応について、５０pmolの各プライマーを、１００ngの熱変性鋳型に加 え、ｐＭＯＮ３２３２２について記載したように反応物を組み立てた。サイクル 条件は以下の通りである：９４℃１分；６５℃２分、および７２℃２．５分を７ サイクル；次に９４℃１分、７０℃２分、および７２℃２．５分を１０サイクル 。サイクル反応の最後に７２℃で７分の伸長を１回行なった。各中間体を作成す るの に使用したプライマー対は以下の通りである：Ｎ−ｔｅｒｍ／ＦＬＮ３（ＦＬ３ Ｎ）；Ｎ−ｔｅｒｍ／ＦＬＮ７（ＦＬ７Ｎ）；Ｎ−ｔｅｒｍ／ＦＬＮ１１（ＦＬ １１Ｎ）；Ｃ−ｔｅｒｍ／ＦＬＣ３（ＦＬ３Ｃ）；Ｃ−ｔｅｒｍ／ＦＬＣ４（Ｆ Ｌ４Ｃ）；およびＣ−ｔｅｒｍ／ＦＬＣ１０（ＦＬ１０Ｃ）。ＰＣＲ増幅産物を ウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製し、５０μｌの ｄＨ2Ｏに溶出した。第１のサブセット（ＦＬ３Ｎ、ＦＬ７Ｎ、およびＦＬ１１ Ｎ）の精製ＤＮＡをＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化し、前記したようにゲル精製し 、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ／Ｓａｐ処理したｐＳＥ４２０ベクターＤＮＡ（インビ トロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）に連結させた。第２のサブセット（ＦＬ３Ｃ 、ＦＬ４Ｃ、およびＦＬ１０Ｃ）の中間体鋳型を同一の方法で作成したが、Ｎｃ ｏＩの代わりにＨｉｎｄIIIを使用した。最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の 工程は前記したように行なった。例９５ 最終的な６つの鋳型を作成するために、ｐＳＥ４２０中の中間体の２つのサブ セットを、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ（ＦＬ３Ｎ、ＦＬ７Ｎ、ＦＬ１１Ｎ−サブセッ ト１）またはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII（ＦＬ３Ｃ、ＦＬ４Ｃ、およびＦＬ１０ Ｃ−サブセット２）で消化し、前記したようにジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅ ａｎ）IIを使用してゲル精製した。各サブセットから１つの中間体アンプリコン を、反応あたりＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３９７７に連 結させ、以下の組合せを使用して前記したようにＤＨ５α細胞中で形質転換して 特定のリンカー長さを作成する：６ＡＡリンカー（ＦＬ３ＮとＦＬ３Ｃ）、７Ａ Ａリンカー（ＦＬ３ＮとＦＬ４Ｃ）、１０ＡＡリンカー（ＦＬ７ＮとＦＬ３Ｃ） 、１３ＡＡリンカー（ＦＬ３ＮとＦＬ１０Ｃ）、１５ＡＡリンカー（ＦＬ１１Ｎ とＦＬ４Ｃ）、および２１ＡＡリンカー（ＦＬ１１ＮとＦＬ１０Ｃ）。前記の６ つの組合せのそれぞれからの単一のコロニーから、５０ml一晩培養物でＤＮＡを 調製し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII制限解析により正しい挿入体サイズについて解 析し、鋳型として使用した。プライマー対３０Ｆｏｒ／３９Ｒｅｖ（３９／４０ 切断点）；６５Ｆｏｒ／６５Ｒｅｖ（６５／６６切断点）およ び８９Ｆｏｒ／８９Ｒｅｖ（８９／９０切断点）を使用して、ｐＭＯＮ３２３２ ２について記載したように各鋳型をＰＣＲ増幅したが、各プライマー７５pmolを 使用した。増幅条件は以下のように変更した：９４℃１分、７０℃２分、７２℃ ２．５分を６サイクル；次に９４℃１分、７２℃３分を９サイクル。サイクル反 応の最後に７２℃で６分の伸長を行い、生成物の完全な伸長の充分な時間を与え た。試料をウィザードＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃ ｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製し、 ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで２重消化した。これらの増幅産物を、再度ウィザード ＰＣＲクリーンアップキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉ ｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して精製した。さらに、３９／４０ 切断点についてのすべての６つの異なるリンカー長の分子を、ＮｃｏＩ／Ｈｉｎ ｄIII／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３９７７に単一のタンパク質としてクローン化 した（ｐＭＯＮ３２３６５、ｐＭＯＮ３２３６６、ｐＭＯＮ３２３６７、ｐＭＯ Ｎ３２３６８、ｐＭＯＮ３２３６９および３２３７０）。最終的なＤＮＡ配列確 認までの以後の工程は前記したように行なった。例９６ ＩｇＧ２ｂリンカーを介して未変性のｆｌｔ３リガンドまたは配列並べ替えｆ ｌｔ３受容体アゴニスト（例９１〜９３）に結合したｐＭＯＮ１３４１６（ＷＯ ９４／１２６３８）の、ＩＬ−３受容体アゴニストからなる多機能性キメラ受容 体アゴニスト分子をコードする遺伝子を作成した。所望の配列並べ替えｆｌｔ３ 受容体アゴニスト分子を含有する挿入体を、親プラスミドからＮｃｏＩ／Ｈｉｎ ｄIII制限断片として単離し、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰで消化したｐＭ ＯＮ３０３０４に連結させた。最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程は前記 したように行なった。ＩＬ−３受容体アゴニスト（ｐＭＯＮ１３４１６から）お よび配列並べ替えｆｌｔ３受容体アゴニストを含む多機能性キメラ分子をコード するＤＮＡ配列を含有する、得られたプラスミドを表９に示す。 例９７ ＩｇＧ２ｂリンカーを介して未変性のｆｌｔ３リガンドまたは配列並べ替えｆ ｌｔ３受容体アゴニスト（例９１〜９３）に連結したｐＭＯＮ１３２８８（ＷＯ ９４／１２６３８）の、ＩＬ−３受容体アゴニストからなる多機能性キメラ受容 体アゴニスト分子をコードする遺伝子を作成した。所望の配列並べ替えｆｌｔ３ 受容体アゴニスト分子を含有する挿入体を、親プラスミドからＮｃｏＩ／Ｈｉｎ ｄIII制限断片として単離し、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰで消化したｐＭ ＯＮ３０３１１に連結させた。最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程は前記 したように行なった。ＩＬ−３受容体アゴニスト（ｐＭＯＮ１３２８８から）お よび配列並べ替えｆｌｔ３受容体アゴニストを含む多機能性キメラ分子をコード するＤＮＡ配列を含有する、得られたプラスミドを表１０に示す。 例９８ 鋳型としてｐＭＯＮ３２３６０とｐＭＯＮ３２３６２プラスミドＤＮＡを使用 して、プライマー対Ｎ−ｔｅｒｍ／１３４ｒｅｖとＮ−ｔｅｒｍ／１３９ｒｅｖ を使用して、未変性のｆｌｔ３リガンド分子のＣ−末端の終止コドンをフレーム 内ＳｎａＢＩ制限部位で置換することにより、キメラ分子のＮ−末端に配列並べ 替えｈｆｌｔ３受容体アゴニスト成分を有する２つのキメラ分子を作成した。反 応混合物を、ｐＭＯＮ３２３２２について前記したように準備した。サイクル条 件は以下の通りである：９４℃１分、６５℃２分、および７２℃２．５分を７サ イクル、そしてアニーリング温度を６５℃から７０℃にあげてさらに１０サイク ルの増幅サイクルを行なった。試料をウィザードＰＣＲクリーンアップキット（ Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）とプロトコールを使用し て精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出し、各試料の２０μｌをＮｃｏＩとＳｎａ ＢＩで消化した。プラスミドｐＭＯＮ２６４３１ＤＮＡをＮｃｏＩとＳｎａＢＩ で消化し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化ＰＣＲ反応物と連結させた。コンピタント なＤＨ５α細胞の形質転換と、、最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程は前 記したように行なった。例９９ 記載のプライマー２８／２９（２８Ｆｏｒ／２８Ｒｅｖ）、３４／３５（３４ Ｆｏｒ／３４Ｒｅｖ）、６２／６３（６２Ｆｏｒ／６２Ｒｅｖ）、９４／９５（ ９４Ｆｏｒ／９４Ｒｅｖ）、および９８／９９（９８Ｆｏｒ／９８Ｒｅｖ）を使 用して、前記したように１０および１５アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ Ｓｅｒ）ｘを増幅して、５つの追加のｈｆｌｔ３リガンド切断点を作成した。得 られたＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化して、前記のようにＡｆ１I II／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰで消化したｐＭＯＮ３０３１１に連結させた。コンピ タントなＤＨ５α細胞の形質転換と、最終的なＤＮＡ配列確認までの以後の工程 は前記したように行なった。例１００ 大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での配列並べ替えｈｆｌｔ３受容体アゴニストの発 現の増強のために、縮重コドンをコードするＮ−末端特異的プライマーを使用し て、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＯＮ５７２３中で１−１３４およ び１−１３９型の未変性のｈｆｌｔ３リガンドを再操作した。プライマー対ＦＨ ３ＡＦｏｒ／ＳＣＦ．ｒｅｖ（Ａｌａ２）およびＦｌｔ２３Ｆｏｒ／ＳＣＦ（Ｇ ｌｙ２）を使用して、ｐＭＯＮ２３２２２について記載した反応条件を使用して 、未変性のｆｌｔ３リガンドをコードする配列のＮ−末端縮重混合物をＰＣＲ増 幅したが、増幅サイクルの数は１５サイクルの９５℃１分、５５℃２分、および ７２℃２．５分に減らした。アンプリコンをウィザードＰＣＲクリーンアップキ ット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ ｕｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏ ｍｅｇａ））を使用して精製し、５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出した。ＮｃｏＩ／Ｈ ｉｎｄIIIを用いる制限消化とジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）IIを用い る以後のゲル精製は、前記したように行なった。挿入体は、ＮｃｏＩ／ ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理したゲル精製したｐＭＯＮ５７２３プラスミドＤＮＡ に連結させ、前記したようにコンピタントなＤＨ５α細胞に形質転換した。形質 転換細胞のアリコートを、７５μg/mlのスペクチノマイシンを含有するＬＢ寒天 培地に蒔いて、３７℃で１４〜１６時間インキュベートし、コロニー数を数えた 。コロニーを確認した後、各形質転換混合物の残りを、７５μg/mlのスペクチノ マイシンを含有するＬＢ培地２×５ml中で３７℃で一晩（１４〜１６時間）イン キュベートした。ウィザードＤＮＡ３７３ΛミニプレップＫｉｔ（Ｗｉｚａｒｄ ＤＮＡ ３７３Ａ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ ）を、推奨されるプロトコールに従って使用して、ミニプレップＤＮＡを調製し た。精製したミニプレップＤＮＡを５０μｌのｄＨ2Ｏに溶出し、１〜２μｌを 使用して、化学的にコンピタントなＭＯＮ２Ｏ７細胞を形質転換した。２５μｌ および２００μｌのアリコートを、７５μg/mlのスペクチノマイシンを含有する ＬＢ培地プレートに蒔き、３７℃で１２〜１５時間インキュベートした。元々の 各プライマー対である４０〜５０ウェルの単離したコロニーを選択し、ＬＢ／ス ペクチノマイシンマスタープレート上に画線し、３７℃でさらに４〜６時間イン キュベートした。 個々の配列並べ替えｈｆｌｔ３受容体アゴニストクローンを、９６ウェルマイ クロタイターフォーマット中で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のためにスクリーニ ングして、改良された発現レベルについて選択した。ウェルあたり１００μｌの 最小Ｍ９培地（１％カザミノ酸を含む）を、単一コロニーにより接種し（各ｈｒ ｌｔ３ＰＣＲプライマー対について４０〜５０単離体を解析した）、３７℃で２ ００ｒｐｍで３〜４時間インキュベートし、新たに調製した１mg/mlのナリジキ シン酸（０．１Ｎ ＮａＯＨ中）５μｌ／ウェル加えて誘導した。３７℃でさら に４時間インキュベーション（Ｉ＝４）後、各ウェルから約５〜１０μｌのアリ コートを採取し、屈折体（ｒｅｆｒａｃｔｉｌｅ ｂｏｄｉｅｓ）について光学 顕微鏡により分析し、結果を、細胞の総数に対する屈折体を含有する細胞のおよ そのパーセントとしてスコア化した。最も高い発現レベルを有するクローンを、 以下のように１０mlのベンチトップスケール発現試験のために選択した。一晩培 養物５mlを、３７℃で７５μg/mlのスペクチノマイシンの存在下でＬＢ培地中で 増殖させた。１２５mlの振盪フラスコ中の１０mlの新たに調製した最小Ｍ９（１ ％カザミノ酸を含む）に、充分な一晩細胞を接種して初期の読み値２０クレット （Ｋｌｅｔｔ）単位を達成し、次に約１１０〜１５０クレット（Ｋｌｅｔｔ）単 位の密度に達する（Ｉ＝０）まで振盪しながら３７℃で約３〜４時間インキュベ ートし、５０μｌの新たに調製したナリジキシン酸（０．１Ｎ ＮａＯＨ中１０ mg/ml）で誘導した。１mlのアリコートを採取し、細胞をミクロフュージ中で１ 分間ペレット化した。吸引して上清を除去し、ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析 するまで−２０℃で保存した。誘導した細胞の残りを、３７℃で振盪しながらさ らに４時間インキュベートし、この時点（Ｉ＝４）で、細胞密度（クレット（Ｋ ｌｅｔｔ）単位）を測定した。各試料から１mlのアリコートを採取し、ペレット 化し、前記したように保存した。各フラスコから別の５〜１０μｌアリコートを 採取し、屈折体の存在について光学顕微鏡により分析した。ペレット化した試料 を、Ｉ＝４クレット（Ｋｌｅｔｔ）価に等しい容量（μｌ）の２×添加緩衝液（ １％β−メルカプトエタノールを含む）に再懸濁し、５分間沸騰させ、６〜７μ ｌを１２％または１４％トリスーグリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ノベ ックス（Ｎｏｖｅｘ））に添加し、９０ボルトで９０分電気泳動した。ゲルを固 定し、染色し、推奨プロトコール（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ））に従って乾燥の ために調製した。この時点で、Ｉ＝０試料と比較した時予測されるサイズに対応 する単一の誘導タンパク質バンド（Ｉ＝４）の増強発現レベルに基づくスケール アップ発酵のために、クローンを選択した。 ミジプレップ（Ｍｉｄｉｐｒｅｐ）ＤＮＡを、前記したように高レベルの誘導 タンパク質を発現する選択されたクローンからも調製し、ＤＮＡ配列確認までの 工程は、前記した通りに行なった。これらのクローンを、ｐＭＯＮ３２３２９、 ｐＭＯＮ３２３３０、ｐＭＯＮ３２３４１、およびｐＭＯＮ３２３４２と名付け た。例１０１ ＩＬ−３受容体アゴニスト（ｐＭＯＮ１３２８８から）と未変性のｆｌｔ３リ ガンドを含む多機能性受容体アゴニストキメラ分子のセットを、ＥｃｏＲＩ中の 発現についても作成した。ｐＭＯＮ３２３６４とｐＭＯＮ３２３７７からの多機 能性受容体アゴニストキメラ分子をコードする遺伝子を、親ベクターからＮｃｏ Ｉ／ＨｉｎｄIIIで消化して放出させ、ｐＭＯＮ５６７７ベクターに連結させ、 ＭＯＮ２０７細胞に形質転換し、前記したように単一の単離体を取り上げた。こ れらの作成体を、ｐＭＯＮ３２３９４（ｐＭＯＮ３２３６４からの挿入体）およ びｐＭＯＮ３２３９５（ｐＭＯＮ３２３７７からの挿入体）と名付けた。例１０２ 約１０ngのプラスミドｐＭＯＮ２７１８４を鋳型として用いて５０pmolのプラ イマーＦＬＴＡＦＬＳＩとＦＬＴＲＩＮを使用して、端を切り取ったＦｌｔ３受 容体を１．４ＫｂのＰＣＲ産物として単離した。成熟コード配列の最初のＡｓｎ コドンのすぐ５’にＡｆ１III制限部位を、ならびに推定トランスメンブラン領 域のすぐ５’のＥｃｏＲＩ制限部位を、得るためにプライマーを設計した。反応 物を、標準的反応条件を使用してＡｆ１IIIとＥｃｏＲＩで消化し、ＮｃｏＩ／ ＥｃｏＲＩ消化プラスミドｐＭＯＮ２６４５８中に連結させた。このプラスミド は、以下のＤＮＡ配列を含有する：ＩＬ−３シグナル配列をコードする、５’− ＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＧ ＣＴＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＡＡＧＣＴ Ｔ−３’ 配列番号８５７。この配列は、５’末端にＢａｍＨＩ制限部位を含有 し、ＢａｍＨＩ部位の３’にシグナル配列の最初のアミノ酸としてＡＴＧメチオ ニンを有する。このシグナル配列は細胞により切断され、シグナル配列のＮｃｏ Ｉ部位を、ＰＣＲ反応で産生した受容体のＡｆ１III部位に融合して作成された ５’Ｍｅｔ／Ａｌａが残る。受容体のすべての端を切り取った型はＩＬ−３シグ ナル配列とともに、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化物（ｈＩＬ３Ｌ／ｈＦｆｌｔ３ Ｒ）としてベクターから切り出すすることができた。 ｐＭＯＮ３０２９８（ｈＧ−ＣＳＦＲ）の触媒性ドメインを再操作して、以下 のようにＰＣＲによりトランスメンブラン／細胞質結合で、フレーム内制限部位 を作成する。０．５μｇの熱変性ｐＭＯＮ３０２９８に、１００pmolの各プライ マーＨＧＣＦｆｏｒとＨＧＣＦｒｅｖ、１０μｌの５×緩衝液Ｊ、５ＵのＴａｑ ポリメラーゼ、およびｄＨ2Ｏを、前記したように最終容量４５μｌになるよう に加えた。ＰＣＲ増幅は以下のように行なった：６サイクル（９４℃１分、６４ ℃２分、および７０℃３分）、次に９サイクル（９４℃１分、７０℃４分）。７ ０℃で７分の最後の１分間の伸長を行なった。各ＰＣＲ反応物１０μｌを、前記 したようにジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）IIを使用してゲル精製し、ｄ Ｈ2Ｏ中に溶出した。試料を、２０μｌの反応物中で１０ＵずつのＥｃｏＲＩと ＨｉｎｄIIIで３７℃で９０分間消化した。前記したように再度試料をゲル精製 （ジーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II）し、１０μｌのｄＨ2Ｏ中に溶出 した。２μｌの挿入体を、前記したように１０μｌの反応物中のＮｃｏＩ／Ｈｉ ｎｄIII／ホスファターゼ処理したｐＳＥ４２０ベクター５０ngに連結させた。 コンピタントなＤＨ５α細胞の形質転換と、最後のＤＮＡ配列確認までの以後の 工程は前記したものと同様に行なった。次に選択したクローンを配列決定して、 フレーム内のＥｃｏＲＩ部位の存在ならびに正しいＧ−ＣＳＦＲ触媒性ドメイン ＤＮＡ配列の確認を証明した。予測された配列を含有するクローンを、前記した ようにＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ゲル精製した。ｈＧ−ＳＣＦＲ（Ｅ ｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII）とｈＩＬ３Ｌ／ｈＦｌｔ３Ｒ（ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲ Ｉ）断片の精製した挿入体を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII／ホスファターゼ処理 したｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ ））に連結させた。コンピタントなＤＨ５α細胞の形質転換と、最後のＤＮＡ配 列確認までの以後の工程は前記したものと同様に行なった。例１０３ 前記したダイマー鋳型中間体を使用して、配列並べ替えＦｌｔ３リガンドをコ ードする追加の遺伝子を作成した。１５アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ Ｓｅｒ）3ＧｌｙＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９５を有する配列並べ替えｆｌｔ３ 受容体アゴニストについて、ダイマー中間体Ｆｌｔ４Ｃ．ｓｅｑとＦｌｔ１１Ｎ ．ｓｅｑを鋳型として使用した。Ｆｌｔ３３リガンドアミノ酸残基２９／２９、 ３４／３５、６２／６３、９４／９５、および９８／９９に対応する切断点を、 ＰＣＲベースのアプローチにより、ＰＣＲオプチマイザーキット（ＰＣＲ Ｏｐ ｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））と以下 のプライマー対を使用して作成した：例９４に記載のように、Ｆｌ２９Ｆｏ ｒ／ＦＬ２９Ｒｅｖ、ＦＬ３５Ｆｏｒ／ＦＬ３５Ｒｅｖ、ＦＬ６３Ｆｏｒ／ＦＬ ６３Ｒｅｖ、ＦＬ９５Ｆｏｒ／ＦＬ９５Ｒｅｖ、ＦＬ９９Ｆｏｒ／ＦＬ９９Ｒｅ ｖ。増幅条件は以下の通りである：７サイクルの９４℃１分、６２℃２分、およ び７０℃２．５分；１２サイクルの９４℃１分、６８℃２分、および７０℃２． ５分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。予測される挿入体サイズに対応する ＰＣＲ産物をＮｃｏＩとＨｉｎｄIIIで消化し、前記したようにジーンクリーン （Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）II（Ｂｉｏ１０１）を使用して製造業者の推奨するプロ トコールに従ってゲル精製した。試料を、最終容量１０μｌでｄＨ2Ｏに再懸濁 した。挿入体を単一の遺伝子として哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ３９３４（Ｎ ｃｏＩ／ＨｉｎｄIII／ＳＡＰ処理した）中にクローン化し、それぞれｐＭＯＮ ３５７１２、ｐＭＯＮ３５７１３、ｐＭＯＮ３５７１４、ｐＭＯＮ３５７１５、 ｐＭＯＮ３５７１６、ｐＭＯＮ３５７１７、およびｐＭＯＮ３５７１８と名付け た。 ２８／２９、３４／３５、６２／６３、９４／９５、および９８／９９切断点 プライマー対の、精製した制限消化したＰＣＲ産物を、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII ／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３０３１１中にクローニングして、ｐＭＯＮ１３２８ ８（ＷＯ９４／１２６３８）によりコードされるＩＬ−３受容体アゴニスト（本 明細書において「ＩＬ−３受容体アゴニストＩ」と呼ぶ）を含むキメラタンパク 質をコードする遺伝子、および配列並べ替えＦｌｔ３リガンドを、調製した。得 られたプラスミドを、それぞれｐＭＯＮ３２３９８、ｐＭＯＮ３５７００、ｐＭ ＯＮ３５７０２、ｐＭＯＮ３５７０４、およびｐＭＯＮ３５７０６と名付けた。 さらに、同じプライマー対をダイマー鋳型中間体Ｆｌｔ７Ｎ．ｓｅｑとＦｌｔ３ Ｃ．ｓｅｑとともに使用して、１０アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅ ｒ）2ＧｌｙＧｌｙ 配列番号７９３を作成した、これらのＩＬ−３受容体アゴ ニストＩ／Ｆｌｔ３Ｌキメラタンパク質の型：それぞれｐＭＯＮ３２３９７、ｐ ＭＯＮ３２３９９、ｐＭＯＮ３５７０１、ｐＭＯＮ３５７０３、およびｐＭＯＮ ３５７０５。例１０４ ２１アミノ酸残基リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）5Ｇｌｙ 配列番号 ７９６を含有するＩＬ−３受容体アゴニストＩ／Ｆｌｔ３Ｌキメラタンパク質を コードする遺伝子を、同様のＰＣＲアプローチにより、ダイマー鋳型中間体Ｆｌ ｔ１１Ｎ．ｓｅｑとＦｌｔ１０Ｃ．ｓｅｑおよび以下のプライマー対を使用して 作成した：Ｆｌｔ３６／３６Ｒｅｖ、Ｆｌｔ３７／３７Ｒｅｖ、Ｆｌｔ３８／３ ８Ｒｅｖ、Ｆｌｔ３９／３９Ｒｅｖ、Ｆｌｔ４１／４１Ｒｅｖ、Ｆｌｔ４２／４ ２Ｒｅｖ、およびＦｌｔ４３／４３Ｒｅｖ。これらのプライマー対は、以下のＦ ｌｔ３リガンド切断点３５／３６；３６／３７；３７／３８；３８／３９；４０ ／４１；４１／４２；および４２／４３（３９／４０切断点はすでにｐＭＯＮ３ ２３７６として作成された）に対応し、以下のサイクル条件を使用してＰＣＲ増 幅のために使用した：インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）ＰＣＲオプチマ イザーキット（ＰＣＲ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ Ｋｉｔ）（緩衝液Ｂ）を使用して 、７サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および７０℃２．５分；１５サイクル の９４℃１分、７０℃４分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。ＤＮＡ配列確 認後に、これらの作成体をそれぞれｐＭＯＮ３５７３３、ｐＭＯＮ３５７３４、 ｐＭＯＮ３５７３５、ｐＭＯＮ３５７３６、ｐＭＯＮ３５７３８、ｐＭＯＮ３５ ７３９、ｐＭＯＮ３５７４０、ｐＭＯＮ３５７４１、ｐＭＯＮ３５７４２、およ びｐＭＯＮ３５７４３と名付けた。ＰＣＲ取り込みエラーにより、配列並べ替え Ｆｌｔ３キメラパートナーの２つのアミノ酸置換（ｐＭＯＮ３５７４１、３５／ ３６切断点；およびｐＭＯＮ３５７４３、４２／４３切断点）およびこのシリー ズの一部として作成され試験された、Ｆｌｔ３Ｌ残基中の、２つのアミノ酸置換 Ｑ133からＲ133およびＱ100からＲ100およびＬ112から112を含有する１つの作成 体（ｐＭＯＮ３５７４２、３８／３９切断点）の、２つの単一のアミノ酸置換を 引き起こした。 交互のＦｌｔ３Ｌ切断点が、前記したＦｌｔ３リガンドアミノ酸残基２８／２ ９、３４／３５、６２／６３、６５／６６、８９／９０、９４／９５、および９ ８／９９に対応する、追加のＦｌｔ３Ｌ／１１−３受容体アゴニストＩキメラタ ンパク質をまた、１５アミノ酸リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）3Ｇｌｙ ＧｌｙＧｌｙ鋳型Ｆｌｔ４ＣおよびＦｌｔ１１Ｎを用いて作成した。ＰＣＲ反応 混合物は例１０３に記載したものと同様であったが、配列並べ替えＦｌｔ３残基 のＣ−末端をコードする逆プライマーは、ＳｎａＢＩ認識配列を有するＨｉｎｄ III制限部位で置換して修飾した。ＰＣＲ増幅サイクルパラメータは以下の通り である：７サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および７０℃２．５分；１４サ イクルの９４℃１分、７０℃４分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。ＰＣＲ クリーンアップ、制限消化、および精製は、前記したように行なった。挿入体は 、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ２６４３１（ＩｇＧ２ｂリン カー／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ残基を含有するＢＨＫ発現ベクター）に以下 のように連結させた：１０μｌの反応容量中、５０ngの処理したベクター、挿入 体（１０：１ 挿入体：ベクター）、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ギブコビー アールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））、および１μｌの１０×リガーゼ緩衝液。 連結物を、周囲温度で１時間インキュベートし、次に２μｌの各連結物を取り、 これを使用して１００μｌの化学的にコンピタントなＤＨ１０Ｂ（あるいは、Ｄ Ｈ５α）細胞（ギブコビーアールエル（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を製造業者の推奨 するプロトコールに従って形質転換した。各形質転換混合物の５分の１および２ ５分の１容量を、適当な抗生物質マーカーを補足したＬＢ寒天プレートに蒔いて 、３７℃で一晩（１４〜１６時間）インキュベートした。単離したコロニーを取 り上げ、前記したようにキアゲンミジプレップ（Ｑｉａｇｅｎ ｍｉｄｉｐｒｅ ｐ）プロトコールを使用してＤＮＡを調製した。 選択したクローンの配列解析を、２８／２９切断点（ｐＭＯＮ３５７１９）、 ３４／３５切断点（ｐＭＯＮ３５７２０）、６２／６３切断点（ｐＭＯＮ３５７ ２１）、６５／６６切断点（ｐＭ０Ｎ３５７２２）、８９／９０切断点（ｐＭＯ Ｎ３５７２３）、および９８／９９切断点（ｐＭＯＮ３５７２５）切断点につい て確認した。ｐＭＯＮ３５７２６は、９４／９５切断点について１つのアミノ酸 置換（Ｌｅｕ９４からＰｈｅ９４）を有する。３９／４０のＦｌｔ３Ｌ切断点お よび１０、１５、および２１ＡＡの異なるアミノ酸リンカー長さを有するＦｌｔ ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメラ作成体は、ｐＭＯＮ３５７０７、ｐＭ ＯＮ３５７０８、ｐＭＯＮ３５７０９、ｐＭＯＮ３５７１０、およびｐＭＯＮ３ ５７１１により示される。これらの作成体は、以下の鋳型の１つのＰＣＲ増幅に より生成した：ｐＭＯＮ３２３７３、ｐＭＯＮ３２３７５、またはｐＭＯＮ３２ ３７６、およびＦｌｔ３Ｌ特異的プライマー対３９Ｎ ＴＥＲＭ-１／ＳＮＡＢ ＩＣ ＴＥＲＭ。前記したように標準的ＰＣＲ反応混合物を設定し、ＤＮＡ生成 物を以下のパラメータを使用して増幅した：７サイクルの９４℃１分、６２℃２ 分、および７０℃２．５分；１２サイクルの９４℃１分、６８℃、２分、および ７０℃２．５分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。予測される挿入体サイズ に対応するＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩとＳｎａＢＩで完全に消化し、ゲル精製し、 前記したようにＦｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ２ｂ／Ｉ１−３受容体アゴニストＩキメラタ ンパク質として、哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ２６４３１（ＮｃｏＩ／Ｓｎａ ＢＩ／ＳＡＰ処理した）中にクローン化した。これらの作成体の２つは、配列並 べ替えＦｌｔ３キメラパートナー中にＰＣＲ取り込みエラーを有し、このためア ミノ酸置換Ｆ96からＬ96、Ｅ58からＧ58が起きた（ｐＭＯＮ３５７１０とｐＭＯ Ｎ３５７１１）。例１０５ 別のシリーズのキメラタンパク質である、前記したＦｌｔ３Ｌリガンドアミノ 酸残基３５／３６、３６／３７、３８／３９、４０／４１、４１／４２、４２／ ４３、および６５／６６に対応する切断点と２１アミノ酸リンカーを有する配列 並べ替えＦｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩもまた、選択されたＩＬ−３ 受容体アゴニストＩ／配列並べ替えＦｌｔ３Ｌ作成体を鋳型として使用して作成 した（下記表１１を参照）。１つの例外は、１５アミノ酸リンカー鋳型（ｐＭＯ Ｎ３５７１５）を使用して６５／６６切断点、ｐＭＯＮ３５７１１を作成したこ とである。 表１１ Ｆｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ ＩＬ−３受容体アゴニストＩ／Ｆｌ ｔ３Ｌ ｐＭＯＮ３５７１９−３５７２５を作成するのに使用したものと同じ制限部位 をコードするプライマー対を使用した。逆プライマー３６Ｒｅｖ’、３７Ｒｅｖ ’、３８Ｒｅｖ’、３９Ｒｅｖ’、４１Ｒｅｖ’、４２Ｒｅｖ’、および４３Ｒ ｅｖ’を使用して、フレーム内ＳｎａＢＩ部位を作成した。同じ前進プライマー ＦＬｔ３６、ＦＬｔ３７、ＦＬｔ３８、ＦＬｔ３９、ＦＬｔ４１、ＦＬｔ４２、 およびＦＬｔ４３を使用した。ＰＣＲ反応混合物は、前記したものと同じである が、ｐＭＯＮ３５７１１を除いて、増幅条件は以下のように修飾した：１８サイ クルの９４℃１分、６８℃２分、および７０℃２．５分；次に７２℃７分の伸長 を１サイクル。。ｐＭＯＮ３５７７１については、増幅条件は以下の通りである ：６サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および７０℃２．５分；１５サイクル の９４℃１分、および７０℃４分；次に最後に７２℃７分を１サイクル。例１０ ４に記載のように、Ｆｌｔ３特異的ＰＣＲ増幅産物を制限消化し、精製し、ｐＭ ＯＮ２６４３１（ＩｇＧ２ｂ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ残基を含有するＢＨ Ｋ発現ベクター）中にクローン化した。 １つの変種ｐＭＯＮ３２１７９を、ＰＣＲプライマー対Ｆｌｔ４０／３４Ｒｅ ｖとダイマー鋳型中間体Ｆｌｔ１１Ｎ．ｓｅｑとＦｌｔ１０Ｃ．ｓｅｑを使用し て３４／４０切断点として作成した。ＰＣＲ増幅条件と以後のクローニングは、 ｐＭＯＮ３５７１１をクローン化するのに使用したものと同一である。 ３つの追加のＦｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメラ（３８／３９切 断点）を設計し作成して、交互のリンカー長さと組成の影響を試験した。ｐＭＯ Ｎ３５７０９を鋳型として使用して、ＧｌｙＳｅｒリンカー長を拡張して、プラ イマー対ＢａｍＦｏｒ１／３８Ｒｅｖ（反応生成物をＰＣＲ Ａと呼ぶ）とＦｌ ｔ３８／ＢａｍＲｅｖ１（反応生成物をＰＣＲ Ｂと呼ぶ）を使用してモチーフ （ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）7Ｇｌｙを有する２９アミノ酸残基を包含させた 。増幅条件は以下の通りである：６サイクルの９４℃１分、６６℃２分、および ７０℃２．５分；１５サイクルの９４℃１分、および７０℃４分；次に最後に７ ２℃７分を１サイクル。得られたＰＣＲ産物を、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ク リーンアップキットを使用してクリーンアップし、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ（ＰＣ ＲＡ）またはＢａｍＨＩ／ＳｎａＢＩ（ＰＣＲ Ｂ）で消化し、ゲル精製し、前 記したようにｐＭＯＮ２６４３１（ＩｇＧ２ｂリンカー／ＩＬ−３受容体アゴニ ストＩ残基を有するＢＨＫ発現ベクター）に連結させた。得られた作成体を配列 決定して確認し、ｐＭＯＮ３５７７４と呼んだ。これと比較して、ＧｌｙＳｅｒ リンカーは、単一のアミノ酸置換を有する未変性のＦｌｔ３Ｌアミノ酸残基１４ ０−１５４（ｐＭＯＮ３５７７５）または１４０−１６０（ｐＭＯＮ３５７７６ ）により置換されているという点で、ｐＭＯＮ３５７７５と３５７７６は異なっ ていた。ＰＣＲ反応条件はｐＭＯＮ３５７７４について記載したものと同じであ るが、以下のプライマー対を使用した：３８Ｆｏｒ／Ｎａｖｆｏｒおよび３８Ｒ ｅｖ／ＮａｖＲｅｖＳ（ｐＭＯＮ３５７７５）；および３８Ｆｏｒ／Ｎａｖｆｏ ｒおよび３８Ｒｅｖ／ＮａｖＲｅｖＬ（ｐＭＯＮ３５７７６）。ＢａｍＨＩの代 わりにＫａｓＩを使用したが、それ以外はこれらのＰＣＲ増幅産物のクローニン グ工程は、ｐＭＯＮ３５７７４について使用したものと同一であった。配列解析 により、ｐＭＯＮ３５７７５と３５７７６の両方について、複数の単離体中でＰ ＣＲに誘導されたエラーが明らかになった。最終的な正しい配列を得るために、 選択されたサブクローンをＮａｒＩ／ＳｎａＢＩとＮｃｏＩ／ＮａｒＩで再消化 し、 これらのゲル精製断片を使用して、所望の作成体を再クローニングすることが必 要であった。ＢＨＫ一過性物質として試験するために、いくつかのＦｌｔ３Ｌキ メラ分子も作成した。ＩｇＧ２ｂリンカーにより連結された２つの未変性のＦｌ ｔ３Ｌ分子からなるｐＭＯＮ３２１７３を、以下のようにして２つの既存の分子 から組み立てた：ｐＭＯＮ３２３９３からのＮｃｏｌ／ＳｎａＢＩ Ｆｌｔ３Ｌ 含有挿入体を、ゲル精製したＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで切断したｐＭＯＮ３２３７ ７（ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメラパートナーは分離されている）に連結さ せた。同様に、ｐＭＯＮ３５７２７（３９／４０切断点、１５アミノ酸リンカー ）を、ｐＭＯＮ３５７０８からのＦｌｔ３Ｌ挿入体（ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入 体として）を使用して、ゲル精製したｐＭＯＮ３２３７５（ＩＬ−３受容体アゴ ニストＩキメラパートナーは分離されている）に組み立てた。第３のＦｌｔ３Ｌ ダイマーｐＭＯＮ３２１６８（３９／４０切断点、２１アミノ酸リンカー）を以 下のように組み立てた：ｐＭＯＮ３２１６５からのＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入体 （ｐＭＯＮ３２１６３のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ断片とｐＭＯＮ３５７０９のＢａ ｍＨＩ／ＨｉｎｄIII断片を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ５７２３ にサブクローニングすることにより組み立てた、ｐＭＯＮ３５７０９の大腸菌（ Ｅ．ｃｏｌｉ）相当物）。ｐＭＯＮ３２１６５からのＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入 体（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）とｐＭＯＮ３２３７６から のＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIII挿入体（ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３ ９／４０）Ｌ２１）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生ベクターｐＭＯＮ５７２３ 中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１６７を作成した。次にｐＭＯＮ３２ １６７からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体をｐＭＯＮ３０３０４にサブクロー ニングし、ｐＭＯＮ３２１６８と呼んだ。例１０６ 制限消化しゲル精製した断片を使用して、既存の分子から、一連の３量体分子 ［それぞれが２つのＦｌｔ３Ｌ残基とＩＬ−３受容体アゴニストＩまたはＩＬ− ３受容体アゴニストII（ｐＭＯＮ１３４１６（ＷＯ９４／１２６３８）によりコ ードされるＩＬ−３受容体アゴニストであり、本明細書において「ＩＬ−３受容 体アゴニストII」と呼ぶ）の１つのコピーからなる］を作成した。ｐＭＯＮ３５ ７２８は、ｐＭＯＮ３２３７５からＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ（Ｆｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ ２ｂ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ）挿入体を使用し、ｐＭＯＮ３５７０８から ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII（ＩＬ−３受容体アゴニストＩ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ ３Ｌ）挿入体を使用して、組み立てた。次に２つの断片をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄII I／ＳＡＰ処理した哺乳動物発現ベクターｐＭＯＮ３９３４に再連結させ、前記 したようにサブクローニングした。ｐＭＯＮ３２１７３からのＮｃｏｌ／Ｈｉｎ ｄIII断片をｐＭＯＮ３０３０４のＡｆｌIII／ＨｉｎｄIII部位に連結させて、 ｐＭＯＮ３２２０５（ＩＬ−３受容体アゴニストII／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３１− １３９／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３ １−１３９）を組み立てた。同様のアプローチ を使用して、ｐＭＯＮ３２２０６（ＩＬ−３受容体アゴニストII／ＩｇＧ２ｂ／ Ｆｌｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２ １）を作成した。ｐＭＯＮ３２１６７からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片をゲル 精製し、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII消化ｐＭＯＮ３０３０４（これは、ＩＬ−３受 容体アゴニストII／ＩｇＧ２ｂ残基を有する）中にサブクローニングした。ｐＭ ＯＮ３２１７０からのゲル精製したＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体を中間体ｐＭ ＯＮ３２１９８（Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII）中にサブクローニングして、プラス ミドｐＭＯＮ３２２０７（Ｆｌｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌ ｔ３Ｌ（３９／４０）Ｌ２１））／Ｇ−ＣＳＦ）を組み立てた。ｐＭＯＮ３０３ ２０（ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦとして）からのゲル精製したＳｎａＢＩ挿入体を 、ＳｎａＢＩ消化した／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３２１７３中にサブクローニン グして、ｐＭＯＮ３２２０８（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳ Ｆ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９）を組み立てた。ｐＭＯＮ３２１７３ からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体を、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII消化したｐＭ ＯＮ３Ｏ３Ｏ９（これはＧ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂを含有する）中にサブクローニ ングして、ｐＭＯＮ３２２０４を組み立てた。ｐＭＯＮ３２１９０からのＮｃｏ Ｉ／ＳａｃＩ挿入体とｐＭＯＮ３２１７１からのＳａｃＩ／ＨｉｎｄIII挿入体 を、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ３０３０４中にサブクローニング して、ｐＭＯＮ３２１９５（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／Ｉ ｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ／Ｆｌｔ３ １−１３９（３９／４０）Ｌ ２１）を組み立てた。ｐＭＯＮ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂとして）か らのＮｃｏＩ／Ａｆ１III断片を、ＮｃｏＩ／ＳＡＰ処理したｐＭＯＮ３２１６ ８（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ１ −１３９）中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１９６（Ｇ−ＣＳＦ／Ｉｇ Ｇ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３ Ｌ １−１３９）を組み立て、ＤＮＡ配列と制限解析により配向を確認した。ｐ ＭＯＮ３２１６７（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）／Ｌ２１／ＩｇＧ２ ｂ／Ｆ１ｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII 挿入体を、ｐＭＯＮ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ）のＡｆ１III／Ｈｉ ｎｄIII部位中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１９７（Ｇ−ＣＳＦ／Ｉ ｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）を作成した。例１０８ ＩＬ−３受容体アゴニストＩまたはＩＬ−３受容体アゴニストIIをキメラパー トナーとしてＧ−ＣＳＦで置換することにより、ＢＨＫ一過性物質として一連の Ｆｌｔ３Ｌ含有分子を作成した。ＢＨＫベクターｐＭＯＮ３９３４を使用して一 過性に発現され作成されたキメラタンパク質について、Ｇ−ＣＳＦ残基は、１７ 位でＳｅｒまたはＣｙｓをコードすることができた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発 現について使用したかまたは哺乳動物発現系で非一過性に発現された分子につい て、Ｇ−ＣＳＦパートナーの１７位はＳｅｒのみをコードした。ＢＨＫ発現作成 体として両方の配向で未変性のＦｌｔ３ＬとＧ−ＣＳＦのキメラを作成した：Ｇ −ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ（ｐＭＯＮ３０２３９）およびＦｌｔ３Ｌ／ ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ（ｐＭＯＮ３２１７５）。ｐＭＯＮ３０２３９は、ｐＭ ＯＮ３０２３８（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化物として）からのＦｌｔ３Ｌ １ −１３９挿入体を、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIIIで消化したｐＭＯＮ３０３０９（こ れはＧ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂを含有する）中にサブクローニングして組み立て、 ｐＭＯＮ３２１７５は、ｐＭＯＮ３２３９３からのゲル精製したＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩ挿入体から、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ２６４２０（これは ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する）を使用して作成した。第３の未 変性のＧ−ＣＳＦ／Ｆｌｔ３Ｌキメラ分子であるｐＭＯＮ３２１９１は、ＩｇＧ ２ｂキメラリンカーの代わりにＧｌｙＳｅｒリンカーを有し、大腸菌（Ｅ．ｃｏ ｌｉ）発現のために設計されている点で、ｐＭＯＮ３２１７５とは異なる。ｐＭ ＯＮ３２１９１は、ｐＭＯＮ３２３９３からの同じゲル精製したＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩ挿入体を使用して、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３１１２３（ これはＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する）中に、組み立てた。ＢＨＫ 相当物であるｐＭＯＮ３５７６７は、ｐＭＯＮ３２１９１からのゲル精製したＮ ｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIキメラ遺伝子を、ＢＨＫベクターｐＭＯＮ３９３４中にサ ブクローニングすることにより組み立てた。例１０９ ＩＬ−３受容体アゴニストＩ成分をＧ−ＣＳＦで置換することにより、２つの シリーズの配列並べ替えＦｌｔ３Ｌキメラを作成した。配向Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ ２Ｂ/配列並べ替えＦｌｔ３Ｌを有する第１のセットは、基本的に以下のように 組み立てた：ｐＭＯＮ３０２３９（Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １− １３９）をＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ベクター含有Ｇ−ＣＳＦ残基を 前記のようにゲル精製した。以下の表１２に示す適切なＩＬ−３受容体アゴニス トＩ／Ｆｌｔ３Ｌ作成体からのＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIII消化した挿入体を、ｐ ＭＯＮ３０２３９（ＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄIII）中にサブクローニングした。 表１２ Ｇ−ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ作成体とそのＩＬ−３受容体アゴニストＩ 類似体 ｐＭＯＮ３２１６３からのＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ挿入体とｐＭＯＮ３２７３０ からのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIII挿入体を使用して、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII消 化したｐＭＯＮ３０３０９中にサブクローニングして、ｐＭＯＮ３２１６９（Ｇ −ＣＳＦ／ＩｇＧ２ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）を組み 立てた。このシリーズの３つの分子は、直接のＩＬ−３受容体アゴニストＩに対 応するものを持たない。第１のｐＭＯＮ３９９１４は、Ａｆ１III／ＨｉｎｄIII で消化したＢＨＫ発現ベクターｐＭＯＮ３０３０９（これはＧ−ＣＳＦ／ＩｇＧ ２ｂを含有する）と、ｐＭＯＮ３２２４３（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIとして）か らのＦｌｔ３ １−１３９（３９／４０）Ｌ２９挿入体を使用して組み立てた。 ｐＭＯＮ３９９１５について、ｐＭＯＮ３２２４２からのＦｌｔ３Ｌ １−１５ ４（３９／４０）遺伝子（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿入体として）を、親ベクタ ーｐＭＯＮ３０３０９中にサブクローニングした。ｐＭＯＮ３９９１６はｐＭＯ Ｎ３９９１５と全く同様に組み立てたが、ｐＭＯＮ３２２５２からのＦｌｔ３Ｌ １−１６０（３９／４０）挿入体を使用した。ｐＭＯＮ３２２４２、３２２４ ３、および３２３５２は、非キメラ、配列並べ替えＦｌｔ３Ｌ遺伝子（ＮｃｏＩ ／ＨｉｎｄIIIとして）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現作成体である。 最後に、ｐＭＯＮ３５７９９からの挿入体を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現 のためにｐＭＯＮ５７２３（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片として）中にサブクロ ーニングした。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生プラスミドを、ｐＭＯＮ３９９ ０４と名付けた。例１１０ 配向Ｆｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦを有する多くの第２シリーズのＧ− ＣＳＦキメラはまた、表１３に示すようにそのＩＬ−３受容体アゴニストＩ類似 体として作成した。 表１３ Ｆｌｔ３Ｌ／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ作成体とそのＩＬ−３受容体アゴニストＩ 類似体 これらの作成体は、上記表中のＦｌｔ３Ｌ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩキメ ラタンパク質からのＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化ｐＭＯＮ３６１１３（ＩｇＧ２ｂ ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有するＢＨＫベクター）と特異的ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ 消化配列並べ替えＦＩｔ３Ｌ挿入体を使用して、組み立てた。得られたプラスミ ドを、ｐＭＯＮ３２１７０、ｐＭＯＮ３２８７１、ｐＭＯＮ３２２７１、ｐＭＯ Ｎ３２１７２、ｐＭＯＮ３２１７４、ｐＭＯＮ３５７５１、ｐＭＯＮ３５７５２ 、ｐＭＯＮ３５７５３、ｐＭＯＮ３５７５４、ｐＭＯＮ３５７５５、ｐＭＯＮ３ ５７５６、ｐＭＯＮ３５７５７、ｐＭＯＮ３５７５８、ｐＭＯＮ３５７５９、ｐ ＭＯＮ３５７６０、ｐＭＯＮ３５７６１、ｐＭＯＮ３５７６２、ｐＭＯＮ３５７ ６３、ｐＭＯＮ３５７６４、ｐＭＯＮ３５７６５、ｐＭＯＮ３５７６６、ｐＭＯ Ｎ３５７６７、ｐＭＯＮ３５７６８、ｐＭＯＮ３５７７０、ｐＭＯＮ３５７７２ 、ｐＭＯＮ３５７７３、ｐＭＯＮ３５７７７、ｐＭＯＮ３５７７８、ｐＭＯＮ３ ５７７９、ｐＭＯＮ３５７８０、ｐＭＯＮ３５７８２、およびｐＭＯＮ３９９０ ８と名付けた。 ｐＭＯＮ３５７７７とｐＭＯＮ３５７８８はＰＣＲにより作成し、ｐＭＯＮ３ ５７７５とｐＭＯＮ３５７７６について記載したものと同じＮｃｏＩ／ＮａｒＩ とＮａｒＩ／ＳｎａＢＩ挿入体から組み立てたが、ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝 子を含有する親ベクターとしてＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３５７５ １を使用した。ｐＭＯＮ３５７７８の３９／４０切断点相当物を作成するために 、プライマー対Ｆｌｔ４０／ＳｎａＢＩ Ｃ−ｔｅｒｍを使用してｐＭＯＮ３５ ７７８鋳型を再増幅した。増幅条件は、ｐＭＯＮ３５７７１について記載したも のと同様であるが、最初のＴannealを６６から５５℃に下げた。得られた作成体 をｏｐＭＯＮ３５７８２（Ｆｌｔ３ １−１６０（３９／４０）／ＩｇＧ２ｂ／ Ｇ−ＣＳＦ）と名付けた。 ｐＭＯＮ３２１７０（Ｆｌｔ３ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ Ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ２６４３０（これ はＩｇＧ２Ｂ／Ｇ−ＣＳＦを含有する）中に連結させた、ｐＭＯＮ３２１６５か らＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ挿入体を使用して組み立てた。ｐＭＯＮ３５７６４（Ｆ ｌｔ３Ｌ（３８／３９）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は以下のようにクロ ーン化した：配列並べ替えＦｌｔ３Ｌ挿入体を、鋳型としてｐＭＯＮ３５７３６ とプライマー対Ｆｌｔ３９／３９Ｒｅｖを使用してＰＣＲ増幅した。増幅条件は 、ｐＭＯＮ３５７７１について使用したものと同じであるが、最初のＴannealを ６６から５６℃に下げた。ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したＰＣＲ増幅物を、Ｉｇ Ｇ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有する、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ ３５７５４中にサブクローニングした。ｐＭＯＮ３５７６８（Ｆｌｔ３Ｌ（３８ ／３９）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は、Ｆｌｔ３キメラパートナーの残 基１５に突然変異（ＳｅｒからＰｈｅ）を有する。ｐＭＯＮ３５７６２（Ｆｌｔ ３鋳型ｐＭＯＮ３５７３９）、ｐＭＯＮ３５７６３（Ｆｌｔ３鋳型３５７３８） 、ｐＭＯＮ３５７５８（Ｆｌｔ３鋳型３５７４０）、ｐＭＯＮ３５７７０（Ｆｌ ｔ３Ｌ鋳型としてｐＭＯＮ３５７４３）は、ｐＭＯＮ３５７６４について記載し たものと全く同様にして作成した。ｐＭＯＮ３５７６０中の配列並べ替えＦｌｔ ３遺伝子のＳ125からＦ125への突然変異体であるｐＭＯＮ３５７７２を、Ｆｌｔ ３鋳型としてのｐＭＯＮ３５７１５とプライマー対６５Ｆ ｏｒ／６５ＳｎａＢＩを使用して、ＰＣＲによりクローン化した。ＰＣＲサイク ル条件は、前記したｐＭＯＮ３５７３３、ｐＭＯＮ３５７３４、ｐＭＯＮ３５７ ３５およびｐＭＯＮ３５７３６からのＦｌｔ３遺伝子を増幅するのに使用したも のと同一である。ｐＭＯＮ３５７６１は、ｐＭＯＮ３５７５８中の配列並べ替え Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子のＱ133からＲ133への突然変異体である。ｐＭＯＮ３５７７３ （Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３８／３９）Ｌ２９／ＩｇＧ２Ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）は 、ｐＭＯＮ３５７７４について前記したようにクローン化したが、ＩｇＧ２ｂ／ Ｇ−ＣＳＦ遺伝子を含有するｐＭＯＮ２６４３０（ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ／ＳＡ Ｐ処理した）を親ベクターとして使用した。 ３９／４０切断点相当物を作成するために、ＰＣＲ増幅反応でプライマー対Ｆ ｌｔ４０／ＳｎａＢＩ Ｃ−ｔｅｒｍとともにｐＭＯＮ３５７７３を鋳型として 使用した。増幅は、ｐＭＯＮ３５７７１について前記したものと全く同様に行な った。ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化した増幅産物をｐＭＯＮ２６４３０（ＮｃｏＩ ／ＳｎａＢＩ／ＳＡＰ処理した）中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ３５７７９ （Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２９／ＩｇＧ２Ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）を 得た。ｐＭＯＮ３５７８０はｐＭＯＮ３５７７９の変種であり、配列並べ替えＦ ｌｔ３キメラパートナー中の単一のアミノ酸突然変異（Ｌ60からｐ60へ）をコー ドする。ｐＭＯＮ３２１９０（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ ＧＳ／Ｇ−ＣＳＦ）は、交互のＧｌｙＳｅｒキメラリンカーを有し、これはｐＭ ＯＮ３２１７０のＩｇＧ２ｂリンカーを置換している。ｐＭＯＮ３２１６５（大 腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＯＮ５７２３中のＦｌｔ３Ｌ １−１３ ９（３９／４０）Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／ＩＬ−３受容体アゴニストＩ）からのＮ ｃｏＩ／ＳｎａＢＩ断片Ｆｌｔ３Ｌ遺伝子を、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐ ＭＯＮ３１１２３中にサブクローニングした。ＢＨＫ発現相当物であるｐＭＯＮ ３５７６６は、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片として全Ｆｌｔ３Ｌ／ＧｌｙＳｅｒ ／Ｇ−ＣＳＦキメラ挿入体をサブクローニングすることにより作成した。 ｐＭＯＮ３９９０８はｐＭＯＮ３５７７９に類似しているが、Ｆｌｔ３Ｌアミ ノ酸残基１３３−１６０は、アミノ酸配列ＶＥＴＶＦＨＲＶＳＱＤＧＬＤＬＬＴ Ｓ 配列番号７９８（これは、Ｆｌｔ３Ｌ（ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受 け入れ番号ＨＳＵ２９８７４）の交互のスプライス変種と相同的である）により 置換されている。ｐＭＯＮ３２１９０は、以下のセットのプライマー対Ｆｌｔ４ ０／ＸｂａＲｅｖとＳｎａＢＩＣｔｅｒｍ／ＸｂａＦｏｒとともにＰＣＲ鋳型と して使用した。増幅条件は、ｐＭＯＮ３５７７１について前記したように行なっ たが、最初のＴannealを６６から６４℃に下げた。ゲル精製したＰＣＲ増幅産物 を、ＮｃｏＩ／ＸｂａＩ（Ｆｌｔ４０／ＸｂａＲｅｖ ＰＣＲ産物）またはＸｂ ａＩ／ＳｎａＢＩ（ＳｎａＢＩＣｔｅｒｍ／ＸｂａＦｏｒ ＰＣＲ産物）で消化 し、ｐＭＯＮ２６４３０（ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ／ＳＡＰ処理した）中にサブク ローニングした。ｐＭＯＮ３２２７３（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０） Ｌ２１／ＩｇＧ２ｂ／Ｇ−ＣＳＦ）を、プライマー対ＦｌｔＣｏｎＮｃｏ／Ｇｒ ｅｖとともにｐＭＯＮ３５７７７のＰＣＲにより作成して、３８／３９Ｆｌｔ３ Ｌ残基を３９／４０として再増幅した。精製したアンプリコンをＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩで消化し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３２１９１中にサブク ローニングし、ｐＭＯＮ３２２５９と名付けた（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生用 ）。ＢＨＫ発現のために、ｐＭＯＮ３２２５９からのＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII挿 入体をｐＭＯＮ３９３４（ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII）中にサブクローニングした 。例１０３ 別のシリーズのキメラタンパク質を作成し、ここでＦｌｔ３Ｌパートナーは１ つまたは２つのＣｙｓ突然変異を有した（表ＸＩＡとＸＩＢ）。鋳型としてのｐ ＭＯＮ３２１９１とプライマー対Ｃ１Ｆｏｒ／Ｃ３ＲｅｖとＣ３Ｆｏｒ／１３９ Ｒｅｖを使用してＰＣＲにより２つの反応で、ｐＭＯＮ３５７９０（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ4→Ｓ4、Ｃ85→Ｓ85）／ＧＳ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））を作 成した。鋳型としてのｐＭＯＮ３２１９１とプライマー対Ｃ５Ｆｏｒ／Ｃ６Ｒｅ ｖとＣ５Ｒｅｖ／Ｎ−ｔｅｒｍを使用してＰＣＲにより、ｐＭＯＮ３５７９１（ Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ93→Ｓ93、Ｃ132→Ｓ132）／ＧＳ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓ ｅｒ１７））を作成した。増幅条件は、ｐＭＯＮ３５７７１について前記したよ うに行なったが、最初のＴannealを６６から６４℃に下げた。第１ラウンドのア ンプリコン（各１０μｌ）を使用して第２ラウンドのＰ ＣＲを行い、次にＰＣＲ産物を精製し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで消化し、Ｎｃｏ Ｉ／ＳｎａＢＩ消化したｐＭＯＮ３２１９１中にサブクローニングした。第２ラ ウンドのＰＣＲ増幅条件は、以下のように修飾した：最初のＴannealを６８℃に 上げ、サイクル数を６から１５に上げた。追加の増幅は必要なかった。これらの 作成体ｐＭＯＮ３５７８７（Ｃ4→Ｓ4、Ｃ85→Ｓ85）とｐＭＯＮ３５７８８（Ｃ93 →Ｓ93、Ｃ132→Ｓ132）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現のために使用した。 正しく突然変異したＦｌｔ３Ｌ／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦキメラ挿入体をＮｃ ｏＩ／ＨｉｎｄIII断片としてｐＭＯＮ３９３４中にサブクローニングして、Ｂ ＨＫ発現相当物ｐＭＯＮ３５７９０と３５７９１を作成した。鋳型としてのｐＭ ＯＮ３２１９１とプライマー対ＦＬＤ１Ｒｅｖ／ＦｌｔＮＴｅｒｍを使用してＰ ＣＲにより、ｐＭＯＮ３５７９２（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３２（Ｃ132→Ｓ132）／ ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））を作成した。鋳型としてのｐＭＯＮ ３２１９１とプライマー対ＦＬＭ１Ｒｅｖ／ＦｌｔＮＴｅｒｍを使用してＰＣＲ により、ｐＭＯＮ３９９０５（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ132→Ｓ132）／Ｇｌ ｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））を作成した。ｐＭＯＮ３９９０６（Ｆｌ ｔ３Ｌ １−１３９（Ｃ127→Ｓ127／Ｃ32→Ｓ132）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳ Ｆ（Ｓｅｒ１７））は、配列並べ替えＦｌｔ３Ｌパートナーの残基１２７に１つ のアミノ酸置換を含有し、これはｐＭＯＮ３９９０５のＰＣＲ増幅中のＰＣＲ誘 導性のエラーの結果である。ｐＭＯＮ３２２７６（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３ ９／４０）Ｌ２１（Ｃ4→Ｓ4、Ｃ85→Ｓ85）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅ ｒ１７））は、２ラウンドのＰＣＲにより作成した。３つの初期アンプリコンを 作成した：ＰＣＲ１（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／８５Ｎ ）；ＰＣＲ７（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対４Ｎ／８５Ｓ）；および ＰＣＲ４（ｐＭＯＮ３２１９８鋳型とプライマー対４Ｓ／３６０５Ｒｅｖ）。第 ２ラウンドのために、ＰＣＲ１、４、および７を、組合せ混合物中で再増幅し、 ＰＣＲ Ａを得た。ＰＣＲＡを精製し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで消化し、ｐＭＯ Ｎ３０２７７（ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ）にサブクローニングした。次に３つ の作成体を、同様の方法で作成した。ｐＭＯＮ３２２７７（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ １７）／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌ ｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１（Ｃ4→Ｓ4／Ｃ85→Ｓ85））第１ラウ ンドＰＣＲは、３つの初期アンプリコンを生成した：ＰＣＲ１（ｐＭＯＮ３２１ ９０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／８５Ｎ）；ＰＣＲ７（ｐＭＯＮ３２１９０鋳 型とプライマー対４Ｎ／８５Ｓ）；およびＰＣＲ６（ｐＭＯＮ３２１６９鋳型と プライマー対４Ｓ／３６０５Ｒｅｖ）。第２ラウンドのために、ＰＣＲ１、６、 および７を、組合せ混合物中で再増幅し、ＰＣＲ Ｂを得た。ＰＣＲ Ｂを精製 し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）／ＩｇＧ２Ｂ）にサブクローニングした 。ｐＭＯＮ３２２７８（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１（Ｃ93→ Ｓ93／Ｃ132→Ｓ132）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７））第１ラウン ドＰＣＲは、３つの初期アンプリコンを生成した：ＰＣＲ２（ｐＭＯＮ３２１９ ０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／９３Ｎ）；ＰＣＲ８（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型 とプライマー対１３２Ｎ／９３Ｓ）；およびＰＣＲ３（ｐＭＯＮ３２１９８鋳型 とプライマー対１３２Ｓ／３６０５Ｒｅｖ）。第２ラウンドのために、ＰＣＲ２ 、３、および８を、組合せ混合物中で再増幅し、ＰＣＲ Ｃを得た。ＰＣＲ Ｃ を精製し、ＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩで消化し、ｐＭＯＮ３０２７７（ＧｌｙＳｅｒ ／Ｇ−ＣＳＦ）にサブクローニングした。ｐＭＯＮ３２２７９ Ｇ−ＣＳＦ（Ｓ ｅｒ１７）／ＩｇＧ２Ｂ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１（Ｃ93 →Ｓ93／Ｃ132→Ｓ132）第１ラウンドＰＣＲは、３つの初期アンプリコンを生成 した：ＰＣＲ２（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対Ｇ１０Ｌ／９３Ｎ）； ＰＣＲ８（ｐＭＯＮ３２１９０鋳型とプライマー対１３２Ｎ／９３Ｓ）；および ＰＣＲ５（ｐＭＯＮ３２１６９鋳型とプライマー対１３２Ｓ／３６０５Ｒｅｖ） 。第２ラウンドのために、ＰＣＲ２、５、および８を、組合せ混合物中で再増幅 し、ＰＣＲ Ｄを得た。ＰＣＲ Ｄを精製し、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIIIで消化し 、ＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII消化したｐＭＯＮ３０３０９（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１ ７）／ＩｇＧ２Ｂ）にサブクローニングした。例１１２ ｐＭＯＮ３９９０９（Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＧＳ／ Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２））は、両方のタンパク質で配列が 並べ替えられている２つのＦｌｔ３／Ｇ−ＣＳＦキメラタンパク質の１つである 。Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１／ＧｌｙＳｅｒ遺伝子を含むｐ ＭＯＮ３２１９８からのＮｃｏＩ／Ａｆ１III断片を、ＮｃｏＩ／ＳＡＰ処理し たｐＭＯＮ２５１８７（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２）の単一の コピーを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生プラスミド）中にサブクローニン グした。ＤＮＡ配列確認後、キメラ挿入体をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄIII断片として ｐＭＯＮ３９３４中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ３９９０９と名付けた。ｐ ＭＯＮ３９９１０（Ｇ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２／ＩｇＧ２Ｂ／ Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１）を、鋳型としてのｐＭＯＮ２５ １８７とプライマー対ＧＰＦｏｒ１／ＧＰＲｅｖ２を使用して作成した。増幅条 件は、ｐＭＯＮ３９９０８について使用したものと同一である。ＮｃｏＩ／Ｓｎ ａＢＩ消化したＧ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）（１３３／１３２）を、ＩｇＧ２Ｂ／ Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１遺伝子を含有するｐＭＯＮ３２３ ７６のＮｃｏＩ／ＳｎａＢＩ部位にサブクローニングした。例１１３ ｐＭＯＮ４００００は、ＮＳ０細胞中で発現するためのＧ−ＣＳＦ（Ｓｅｒ１ ７）／ＧｌｙＳｅｒ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１を含有する ｐＣ１ｎｅｏ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））から修飾した産生プラスミドであ る（ｐＭＯＮ３２１６９はＢＨＫ相当物である）。ｐＭＯＮ４００００は、ＣＭ Ｖ ＩＥプロモーター／エンハンサー成分、ＣＳＦ（Ｓｅｒ１７）／ＧｌｙＳｅ ｒ／Ｆｌｔ３Ｌ １−１３９（３９／４０）Ｌ２１のすぐ上流にＩＬ−３リーダ ー配列、端を切り取ったチミジンキナーゼプロモーター、ＳＶ４０後期ｐｏｌｙ Ａシグナル配列、およびいくつかのＤＮＡｓｅ１高感受性領域（ＩｇＨ３ｍｉｎ ＬＣＲの一部）を含有する。例１１４ 多機能性キメラ造血受容体アゴニストの生物活性 表１４ インビトロ多機能性キメラ造血受容体アゴニストバイオアッセイ凡例：+ ：対照と比較して力価の低下（右へシフト）++ ：対照と同等の力価（２倍以内）+++ ：対照と比較して力価の上昇（左へシフト） １対照と比較して：ｐＭＯＮ３０２４７ ２対照と比較して：ｐＭＯＮ３２３５２ ３適当な同時添加対照と比較して ４クローンｐＭＯＮ４００００とｐＭＯＮ４０００２のプール中で分析例１１５ 生物活性測定 表１５ エクスビボ多機能性キメラ造血受容体アゴニストバイオアッセイ 表１５続き１凡例：+ ：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦと比較して活性の低下（文献の対 照）++ ：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦと比較して同等の活性（（文献の 対照）（２０％以内））+++ ：ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦと比較して活性の上昇（文献の 対照） 培養条件：Ｘ−Ｖｉｖｏ１０培地、３７℃、５％ＣＯ2、１１日間インキュベー ション ２凡例：+ ：ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＮＦａ、ＳＣＲと比較して活性の低下（文献の対照）++ ：ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦａ、ＳＣＲと比較して同等の活性（（文献の対照）（ ２０％以内））+++ ：ＧＭ-ＣＳＦ、ＴＮＦａ、ＳＣＲと比較して活性の上昇（文献の対照） 培養条件：１００ng／mlのＧＭ-ＣＳＦ、１００ng／mlのＴＮＦａ、２０ng／ml のＳＣＦ補足ＩＭＤＭ−２０培地、３７℃、５％ＣＯ2で１８〜２２日間ＭＦＲ アゴニストＩ＝ｐＭＯＮ３１１４０（ＷＯ９５／２１１９７） ＭＦＲアゴニストII＝ｐＭＯＮ２８５７１（ＷＯ９７／１２９８５） 造血エクスビボ拡張測定法 ヒト骨髄のＣＤ３４+濃縮始原細胞を単離し、サイトカイン拡張能力の評価の ために、Ｘ−Ｖｉｖｏ１０＋１％ＨＳＡ中５×１０4細胞／mlで、試験サイトカ インおよび対照とともに培養した。細胞を拡張し、細胞増殖に依存してほぼ５日 目に５×１０4細胞／mlで新しい培地とサイトカインで再度プレートに蒔いた。 １０日目に細胞を採取し、性状解析した。プレートから細胞を採取し、１×１０6 細胞／mlの濃度に希釈した。総細胞拡張を測定し、細胞を、メチルセルロース 中で拡張前および後ＣＦＵ（ステムセルテクノロジーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メトカルト（Ｍｅｔｈｏｄｃｕｌｔ）ＨＣＣ３５３ ４）により造血始原細胞について性状解析した。拡張した細胞はまた、フローサ イトメトリーによりリガーゼ特異的フェノタイピングについて性状解析した：Ｃ Ｄ１１ｂ（ＰＥ）／ＣＤ１５（ＦＩＴＣ）、ＣＤ３４（ＦＩＴＣ）、ＣＤ４１ａ （ＦＩＴＣ）。 樹状細胞エクスビボ拡張測定法 ヒト骨髄のＣＤ３４+濃縮始原細胞を単離し、拡張能力の評価のために、ＩＭ ＤＭ／２０％ＦＣＳ中２×１０5細胞／mlで、試験サイトカインおよび対照とと もに培養した。細胞を拡張し、細胞増殖に依存してほぼ５日目に５×１０4細胞 ／mlで新しい培地とサイトカインで再度プレートに蒔いた。１８〜２２日目に細 胞を採取し、性状解析した。総細胞拡張を測定した。拡張した細胞を、系統特異 的フェノタイピングについてフローサイトメトリーにより性状解析した：ＨＬＡ −ＤＲ＋（ＰＥ）／ＣＤ１ａ＋（ＦＩＴＣ）、ＣＤ８６＋（ＰＥ）／ＣＤ１ａ＋ （ＦＩＴＣ）、ＣＤ１９−（ＦＩＴＣ）。樹状細胞拡張倍率を、総細胞拡張×％ ＨＬＡ−ＤＲ＋／ＣＤ１ａ＋として測定した。細胞の機能活性は、１元混合リン パ球反応を使用して測定した。、洗浄し照射した培養樹状細胞を、９６ウェルマ イクロタイタープレート中の同種レスポンダー末梢血単核細胞に段階的な量で添 加した。抗原提示細胞として作用する樹状細胞の能力を、3Ｈチミジン取り込み により測定した応答性細胞調製物中の刺激された増殖の程度により測定した。例１１６ 受容体結合 表１６ 受容体結合解析： データは、３重測定で測定した少なくとも３つの実験からの平均”ＳＥＭとして 表すが、ｐＭＯＮ３２３６０では実験は（２）回しか行わなかった。 キメラ分子を含有するＦｌｔ−３アゴニストのアフィニティを、受容体結合測 定法で評価した。Ｆｌｔ３−Ｆｃを直接固定化してＢＩＡＣＯＲＥ解析を行ない 、会合定数および解離定数を測定してＫd値を計算した。キメラ分子と、ＢａＦ ３細胞中でトランスフェクションしたＧ−ＣＳＦ受容体との、またはＢＨＫ細胞 中で発現されるＩＬ−３受容体の”サブユニットとの、相互作用を評価するため に、競合結合測定法を利用した。これらの細胞を使用する競合測定法は、アゴニ スト特異的放射性リガンドを使用し、用量応答曲線のロジット−ログ解析を使用 して、競合キメラについてのＩＣ50値を得た。例１１７ インビボ生物活性 表１７ マウスインビボ多機能性キメラ造血受容体アゴニスト測定データ Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｐＭＯＮ３０２４７、ｐＭＯＮ３２３４２またはｐ ＭＯＮ３２３６０（１５０μｇ／日）またはｐＭＯＮ３２１９１（２００μｇ／ 日）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、２００μｇ／日）を、１０日間皮下 注射した。１１日目に、心臓穿刺により致死出血を行なった。全血にっいて白血 球数を得た。末梢血白血球は、勾配遠心分離（ヒストペーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑ ｕｅ））と次に塩化アンモニウム溶解を行い、さらに赤血球を除去して、得た。 直接フルオレセインまたはフィコエリトリン結合モノクローナル抗体（ファルミ ンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用するフローサイトメトリーのために、 細胞を染色した。染色前に非特異Ｆｃ受容体結合を、ＦｃＢｌｏｃｋ（ファルミ ンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ））を使用してブロックした。ＦａｃＳｃａｎフ ローサイトメトメーター（ベクトン／ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ／Ｄｉｃｋ ｉｎｓｏｎ））で細胞を解析した。陽性細胞のパーセントを、積分により決定し 、ＷＢＣ計測に基づき表現型の数を計測した。処理した動物の牌臓を無菌的に採 取し、針でＲＰＭＩ培地中で細かく切断した。５ｃｃシリンジのプランジャーの 平らな端を使用し、次に綿栓で濾過して固まりを除去 して、細胞懸濁液を得た。塩化アンモニウム溶解により赤血球を除去し、細胞を 洗浄し、再懸濁し、コールターカウンター（コールターエレクトロニクス（Ｃｏ ｕｌｔｅｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ））を使用して計測した。前記したように 細胞をフローサイトメトリーのために調製した。表現型は、陽性表現型と総脾臓 ＷＢＣ数のパーセントに基づく細胞／脾臓の数として表した。１．５×１０5脾 臓細胞／１mlを、メチルセルロースの３重測定のウェルにマウスサイトカインｗ ／ｏエリスロポエチン（ステムセルテクノロジーズ（Ｓｔｅｍ ＣｅｌｌＴｅｃ ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で蒔いて、ＣＦＵ培養物を得た。培養物を３７℃で１０ 日間インキュベートし、倒立顕微鏡で計測した。ＣＦＵは、＞５０細胞を有する 細胞のコロニーとして定義した。ＣＦＵ／脾臓の増加倍率を測定した（ＣＦＵ総 数／試験化合物の脾臓／ＣＦＵの総数／ＭＳＡ対照の脾臓）。末梢血のＭＳＡ対 照値は、Ｉ−Ａb+／ＣＤ１１ｃ+とＩ−Ａb+／ＣＤ８ｃ+について、それぞれ１５ および３４７細胞／μｌであった。脾臓ＷＢＣのＭＳＡ対照値は、Ｉ−Ａb+／Ｃ Ｄ１１ｃ+とＩ−Ａb+／ＣＤ８ｃ+について、２および１×１０6細胞／脾臓であ った。 さらなる説明がなくても前記説明を利用して、当業者は本発明を最大限に利用 できると考えられる。従って以後の好適な実施態様は単に例示のためのみであり 、決して本発明の開示の残りの部分を限定するものではない。 タンパク質精製およびバイオアッセイのような分子生物学的方法に関するさら なる詳細は、ＷＯ９４／１２６３９、ＷＯ９４／１２６３８、ＷＯ９５／２０９ ７６、ＷＯ９５／２１１９７、ＷＯ９５／２０９７７、ＷＯ９５／２１２５４お よびＷＯ９６／２３８８８に見い出すことができるが、これらはその全体が参照 により本明細書に組み込まれる。 本明細書に引用される全ての参考文献、特許または出願は、その全体が本明細 書に記載されているかのように参照により本明細書に組み込まれる。 種々の他の例は、本発明の開示を読んだ後に、本明細書の精神と範囲から逸脱 することなく当業者には明らかであろう。全てのそのような他の例は、添付した 請求の範囲に含まれることが意図されている。 （２）配列番号：８５８の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１７４アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝１位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒ ｇ、ＴｙｒまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２ （Ｄ）他の情報：／注＝２位置に存在するＸａａはＰｒｏまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３ （Ｄ）他の情報：／注＝３位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙ ｒまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１３ （Ｄ）他の情報：／注＝１３位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈ ｉｓ、ＴｈｒまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６ （Ｄ）他の情報：／注＝１６位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１７ （Ｄ）他の情報：／注＝１７位置に存在するＸａａはＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇ ｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１８ （Ｄ）他の情報：／注＝１８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐ ｒｏ、Ｈｉｓ、ＩｌｅまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２２ （Ｄ）他の情報：／注＝２２位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓ ｅｒ、ＴｈｒまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２４ （Ｄ）他の情報：／注＝２４位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔ ｙｒまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２７ （Ｄ）他の情報：／注＝２７位置に存在するＸａａはＡｓｐまたはＧｌｙ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３０ （Ｄ）他の情報：／注＝３０位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｌ ｅｕまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３４ （Ｄ）他の情報：／注＝３４位置に存在するＸａａはＬｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３６ （Ｄ）他の情報：／注＝３６位置に存在するＸａａはＣｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４２ （Ｄ）他の情報：／注＝４２位置に存在するＸａａはＣｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４３ （Ｄ）他の情報：／注＝４３位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＣｙｓまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４４ （Ｄ）他の情報：／注＝４４位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ａ ｒｇ、ＡＳＰ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４６ （Ｄ）他の情報：／注＝４６位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｐ ｈｅ、Ａｒｇ、ＩｌｅまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４７ （Ｄ）他の情報：／注＝４７位置に存在するＸａａはＬｅｕまたはＴｈｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４９ （Ｄ）他の情報：／注＝４９位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｐｈｅ、Ａ ｒｇまたはＳｅｒ （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５０ （Ｄ）他の情報：／注＝５０位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈ ｉｓ、ＰｒｏまたはＴｙｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５４ （Ｄ）他の情報：／注＝５４位置に存在するＸａａはＬｅｕまたはＨｉｓ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６４ （Ｄ）他の情報：／注＝５４位置に存在するＸａａはＣｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６７ （Ｄ）他の情報：／注＝６７位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌ ｅｕまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７０ （Ｄ）他の情報：／注＝７０位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌ ｅｕ、ＡｒｇまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７４ （Ｄ）他の情報：／注＝７４位置に存在するＸａａはｃｙｓまたはＳｅｒ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０４ （Ｄ）他の情報：／注＝１０４位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｇｌｙま たはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０８ （Ｄ）他の情報：／注＝１０８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＧｌｎまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１５ （Ｄ）他の情報：／注＝１１５位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｈｉｓ、 ＬｅｕまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２０ （Ｄ）他の情報：／注＝１２０位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｇｌｙ、 Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２３ （Ｄ）他の情報：／注＝１２３位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ａｒｇ、 ＰｈｅまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１４４ （Ｄ）他の情報：／注＝１４４位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｈｉｓ、 Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、ＧｌｎまたはＧｌｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１４６ （Ｄ）他の情報：／注＝１４６位置に存在するＸａａはＡｒｇまたはＧｌ ｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１４７ （Ｄ）他の情報：／注＝１４７位置に存在するＸａａはＡｒｇまたはＧｌ ｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１５６ （Ｄ）他の情報：／注＝１５６位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｇｌｙま たはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１５９ （Ｄ）他の情報：／注＝１５９位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ａｒｇ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、ＶａｌまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６２ （Ｄ）他の情報：／注＝１６２位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｌｅｕ、 ＧｌｙまたはＴｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６３ （Ｄ）他の情報：／注＝１６３位置に存在するＸａａはＶａｌ、Ｇｌｙ、 ＡｒｇまたはＡｌａ： （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１６９ （Ｄ）他の情報：／注＝１６９位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｓｅｒ、 Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１７０ （Ｄ）他の情報：／注＝１７０位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ａｒｇま たはＳｅｒ； （ｘｉ）配列：配列番号：８５８（２）配列番号：８５９の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さ：１３３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１７ （Ｄ）他の情報：／注＝１７位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇ ｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、ＧｌｎまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１８ （Ｄ）他の情報：／注＝１８位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌ ｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＡｒｇまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１９ （Ｄ）他の情報：／注＝１９位置に存在するＸａａはＭｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉ ｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２０ （Ｄ）他の情報：／注＝２０位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、ＰｒｏまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２１ （Ｄ）他の情報：／注＝２１位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌ ｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒまた はＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２２ （Ｄ）他の情報：／注＝２２位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐ ｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌまた はＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２３ （Ｄ）他の情報：／注＝２３位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＳｅｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２４ （Ｄ）他の情報：／注＝２４位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖ ａｌ、Ａｒｇ、ｓｅｒ、ｐｈｅ、Ｌｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２５ （Ｄ）他の情報：／注＝２５位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇ ｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、ＰｒｏまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２６ （Ｄ）他の情報：／注＝２６位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｔｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２７ （Ｄ）他の情報：／注＝２７位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｙ、Ａ ｒｇ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２８ （Ｄ）他の情報：／注＝２８位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｌ ｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、ＶａｌまたはＴｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：２９ （Ｄ）他の情報：／注＝２９位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｌ ｅｕ、ｐｒｏ、ＡｒｇまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３０ （Ｄ）他の情報：／注＝３０位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＬ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３１ （Ｄ）他の情報：／注＝３１位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、ＬｅｕまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３２ （Ｄ）他の情報：／注＝３２位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ａ ｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＡｌａまたはＧｌｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３３ （Ｄ）他の情報：／注＝３３位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｎ、Ａｌａ、ＴｈｒまたはＧｌｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３４ （Ｄ）他の情報：／注＝３４位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉ ｌｅまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３５ （Ｄ）他の情報：／注＝３５位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｇ ｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、ＧｌｎまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３６ （Ｄ）他の情報：／注＝３６位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｌｅｕまた はＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３７ （Ｄ）他の情報：／注＝３７位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐ ｒｏ、ＴｒｐまたはＩｌｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：３８ （Ｄ）他の情報：／注＝３８位置に存在するＸａａはＡｓｎまたはＡｌａ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｌｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４０ （Ｄ）他の情報：／注＝４０位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｔｒｐまた はＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４１ （Ｄ）他の情報：／注＝４１位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｃｙｓ、Ａ ｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、ＭｅｔまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４２ （Ｄ）他の情報：／注＝４２位置に存在するＸａａはＧｌｙ、Ａｓｐ、Ｓ ｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔ ｙｒ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４３ （Ｄ）他の情報：／注＝４３位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ａｓｎ、Ｔ ｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｙまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４４ （Ｄ）他の情報：／注＝４４位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌ ｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａ ｌａまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４５ （Ｄ）他の情報：／注＝４５位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐ ｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、ＧｌｕまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４６ （Ｄ）他の情報：／注＝４６位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓ ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔ ｙｒ、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４７ （Ｄ）他の情報：／注＝４７位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖ ａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ＰrｏまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４８ （Ｄ）他の情報：／注＝４８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃ ｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍ ｅｔ、ＶａｌまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：４９ （Ｄ）他の情報：／注＝４９位置に存在するＸａａはＭｅｔ、Ａｒｇ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、ＨｉｓまたはＡｓｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５０ （Ｄ）他の情報：／注＝５０位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈ ｉｓ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５１ （Ｄ）他の情報：／注＝５１位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｍ ｅｔ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５２ （Ｄ）他の情報：／注＝５２位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｈｉｓ、Ａ ｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５３ （Ｄ）他の情報：／注＝５３位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｔｈｒ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＭ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５４ （Ｄ）他の情報：／注＝５４位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａまた はＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５５ （Ｄ）他の情報：／注＝５５位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖ ａｌ、Ｓｅｒ、ＬｅｕまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５６ （Ｄ）他の情報：／注＝５６位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃ ｙｓ，Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５７ （Ｄ）他の情報：／注＝５７位置に存在するＸａａはＡｓｎまたはＧｌｙ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号；Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５８ （Ｄ）他の情報：／注＝５８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ａ ｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＣｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：５９ （Ｄ）他の情報：／注＝５９位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈ ｉｓ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＡｒｇ： （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６０ （Ｄ）他の情報：／注：６０位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｐ ｒｏ、Ｔｙｒ、ＡｓｎまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６１ （Ｄ）他の情報：／注＝６１位置に存在するＸａａはＰｈｅ、ＡＳｎ、Ｇ ｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６２ （Ｄ）他の情報：／注＝６２位置に存在するＸａａはＡＳｎ、Ｈｉｓ、Ｖ ａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＡｓｐまたはＩｌｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６３ （Ｄ）他の情報：／注＝６３位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔ ｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、ＰｒｏまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６４ （Ｄ）他の情報：／注＝６４位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ａｓｎ、Ｐ ｒｏ、ｓｅｒまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６５ （Ｄ）他の情報：／注＝６５位置に存在するＸａａはＶａｌ、Ｔｈｒ、Ｐ ｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６６ （Ｄ）他の情報：／注＝６６位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｉｌｅ、Ａ ｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、ＧｌｕまたはＳｅｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６７ （Ｄ）他の情報：／注＝６７位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ａｌａ、Ｐ ｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、ＰｒｏまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６８ （Ｄ）他の情報：／注＝６８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｖａｌ、Ｔ ｒｐ、Ｓｅr、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｈｒまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：６９ （Ｄ）他の情報：／注＝６９位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ａｌａ、Ｐ ｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７０ （Ｄ）他の情報：／注＝７０位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖ ａｌ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７１ （Ｄ）他の情報：／注：７１位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｍｅｔ、Ｌ ｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＴｒｐまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７２ （Ｄ）他の情報：／注＝７２位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍ ｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、ＡｒｇまたはＡｓｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７３ （Ｄ）他の情報：／注＝７３位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、ＴｈｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７４ （Ｄ）他の情報：／注＝７４位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔ ｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、ＧｌｙまたはＡｌａ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７５ （Ｄ）他の情報：／注＝７５位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇ ｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７６ （Ｄ）他の情報：／注＝７６位置に存在するＸａａはＳｅｒ、Ｖａｌ、Ａ ｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、ＧｌｙまたはＡ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７７ （Ｄ）他の情報：／注＝７７位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｓｅｒ、Ａ ｒｇ、ＴｈｒまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７８ （Ｄ）他の情報：／注＝７８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｓ ｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、ＧｌｙまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：７９ （Ｄ）他の情報：／注＝７９位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＡｓｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８０ （Ｄ）他の情報：／注＝８０位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖ ａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８１ （Ｄ）他の情報：／注＝８１位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇ ｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒp、Ａｒｇ、ＶａｌまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８２ （Ｄ）他の情報：／注＝８２位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌ ｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａ ｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ＭｅｔまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８３ （Ｄ）他の情報：／注＝８３位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８４ （Ｄ）他の情報：／注＝８４位置に存在するＸａａはＣｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｙ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＶａｌ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８５ （Ｄ）他の情報：／注＝８５位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｓｎ、Ｖ ａｌまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８６ （Ｄ）他の情報：／注＝８６位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｃｙｓ、Ａ ｒｇ、ＡｌａまたはＬｙｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８７ （Ｄ）他の情報：／注＝８７位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔ ｒｐまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８８ （Ｄ）他の情報：／注＝８８位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｌｙｓ、Ａ ｒｇ、ＶａｌまたはＴｒｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：８９ （Ｄ）他の情報：／注＝８９位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｃ ｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｔｌ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＳ……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９０ （Ｄ）他の情報：／注＝９０位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、ＩｌｅまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９１ （Ｄ）他の情報：／注＝９１位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｓ ｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、ＡｓｐまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９２ （Ｄ）他の情報：／注＝９２位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９３ （Ｄ）他の情報：／注＝９３位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ａｓｐ、Ｓ ｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９４ （Ｄ）他の情報：／注＝９４位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓ ｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、ＡｌａまたはＰｒｏ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９５ （Ｄ）他の情報：／注＝９５位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐ ｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａ ｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、ＩｌｅまたはＴｙｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９６ （Ｄ）他の情報：／注＝９６位置に存在するＸａａはＰｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔ ｙｒ、Ｇｌｙ、ＩｌｅまたはＴｈｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９７ （Ｄ）他の情報：／注＝９７位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌ ｙｓ、ＡｌａまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９８ （Ｄ）他の情報：／注＝９８位置に存在するＸａａはＨｉｓ、Ｉｌｅ、Ａ ｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍ ｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＴｙｒまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：９９ （Ｄ）他の情報：／注＝９９位置に存在するＸａａはＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＰｈｅまたはＨｉｓ ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１００ （Ｄ）他の情報：／注＝１００位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｔｙｒ、 Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎまたは……； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０１ （Ｄ）他の情報：／注＝１０１位置に存在するＸａａはＡｓｐ、Ｐｒｏ、 Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、 Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０２ （Ｄ）他の情報：／注＝１０２位置に存在するＸａａはＧｌｙ、Ｌｅｕ、 Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０３ （Ｄ）他の情報：／注＝１０３位置に存在するＸａａはＡｓｐまたはＳｅ ｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０４ （Ｄ）他の情報：／注＝１０４位置に存在するＸａａはＴｒｐ、Ｖａｌ、 Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、 ＰｈｅまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０５ （Ｄ）他の情報：／注＝１０５位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ｐｒｏ、 Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、 ＡｓｐまたはＨｉｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０６ （Ｄ）他の情報：／注＝１０６位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｓｅｒ、 Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、ＧｌｙまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０８ （Ｄ）他の情報：／注＝１０８位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、ＡｌａまたはＰｒ ｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１０９ （Ｄ）他の情報：／注＝１０９位置に存在するＸａａはＡｒｇ、Ｔｈｒ、 Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＳｅｒまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１０ （Ｄ）他の情報：／注＝１１０位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ａｌａ、 Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、ＳｅｒまたはＴｒ ｐ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１１ （Ｄ）他の情報：／注＝１１１位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、 Ａｒｇ、ＡｓｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１２ （Ｄ）他の情報：／注＝１１２位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｖａｌ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、ＳｅｒまたはＰｈｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１３ （Ｄ）他の情報：／注＝１１３位置に存在するＸａａはＰｈｅ、Ｓｅｒ、 Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、 ＶａｌまたはＡｓｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１４ （Ｄ）他の情報：／注＝１１４位置に存在するＸａａはＴｙｒ、Ｃｙｓ、 Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＬｅｕ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１５ （Ｄ）他の情報：／注＝１１５位置に存在するＸａａはＬｅｕ、Ａｓｎ、 Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１６ （Ｄ）他の情報：／注＝１１６位置に存在するＸａａはＬｙｓ、Ｌｅｕ、 Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、 Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、ＧｌｎまたはＩｌｅ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１７ （Ｄ）他の情報：／注＝１１７位置に存在するＸａａはＴｈｒ、Ｓｅｒ、 Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、ＬｙｓまたはＰｒｏ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１８ （Ｄ）他の情報：／注＝１１８位置に存在するＸａａはＬｅｕ、ｓｅｒ、 ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、ＡｓｐまたはＴｙｒ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１９ （Ｄ）他の情報：／注＝１１９位置に存在するＸａａはＧｌｕ、Ｓｅｒ、 Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｒｇ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２０ （Ｄ）他の情報：／注＝１２０位置に存在するＸａａはＡｓｎ、Ａｌａ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、ＶａｌまたはＧｌｎ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２１ （Ｄ）他の情報：／注＝１２１位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、 Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｙ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２２ （Ｄ）他の情報：／注＝１２２位置に存在するＸａａはＧｌｎ、Ｓｅｒ、 Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＣｙ ｓ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１２３ （Ｄ）他の情報：／注＝１２３位置に存在するＸａａはＡｌａ、Ｍｅｔ、 Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、ＴｙｒまたはＬｅｕ； （ｘｉ）配列：配列番号：８５９（２）配列番号：８６０の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さ：１５３アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１２ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１２は削除されているか、あるいはＬｅｕ 、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１３ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１３は削除されているか、あるいはＰｒｏ 、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１４ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１４は削除されているか、あるいはＰｒｏ 、Ｐｈｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＴｒｐまたはＭｅｔ； （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｍｏｄｉｆｉｅｄ−ｓｉｔｅ （Ｂ）存在位置：１１５ （Ｄ）他の情報：／注＝位置１１５は削除されているか、あるいはＧｌｎ 、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｙｒまたはＡｓｎ； （ｘｉ）配列：配列番号：８６０ （２）配列番号：８６１の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ）ｎの場合およ びｎが整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６１ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６２の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｅｐｔｉｄｅ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ）ｎの場 合およびｎが整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６２ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６３の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｇｌｙｓｅｒ） ｎの場合およびｎが整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６３ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６４の情報 （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ｇｌｙ ｎ ｓｅｒ）ｎの場合およびｎが 整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６４ Ｘａａ １ （２）配列番号：８６５の情報 （１）配列の特色： （Ａ）長さ：１アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：タンパク質 （ｉｘ）配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：Ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｂ）存在位置：１ （Ｄ）他の情報：／注＝ｘ＝（ａｌａｇｌｙｓｅｒ）ｎの場合およびｎが 整数である場合； （ｘｉ）配列：配列番号：８６５ Ｘａａ
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１２月１日（１９９８．１２．１） 【補正内容】 1. 下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1およびＲ2は、下記群から独立して選択され； （Ｉ）下記式で表わされる修飾ＥＰＯアミノ酸配列を包含するヒトＥＰＯレセ プターアゴニストポリペプチド： 式中、Ｎ−末端からの１〜６アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ア ミノ酸は、上記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失していてもよ く； 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩ）下記式で表わされる修飾幹細胞因子アミノ酸配列を包含する、ヒト幹 細胞因子レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜２３アミノ酸は、上記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチ ドのＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩＩ）下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を包含す る、ヒトｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜７アミノ酸は、上記ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＶ）下記式で表わされる修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり； 位置２のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＬｅｕであり； 位置３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒであり； 位置１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏであり ； 位置１６のＸａａは、Ｌｙｓ、ｐｒｏ、ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓであり ； 位置１７のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＣｙ ｓであり； 位置２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり ； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 位置２７のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置３０のＸａａは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置３６のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４２のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４３のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ ｌａ、Ａｒｇ、ｃｙｓ、またはＬｅｕであり； 位置４４のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈ ｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒであり； 位置４６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＡｌ ａであり； 位置４７のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり； 位置４９のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり； 位置５０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり ； 位置５４のＸａａは、Ｌｅｕ、またはＨｉｓであり； 位置６４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＣｙｓであり； 位置７０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり ； 位置７４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり； 位置１０８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｙであり； 位置１１５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、またはＡｌａであり； 位置１２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであ り； 位置１２３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＴｈｒであり； 位置１４４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｕであり； 位置１４６のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１４７のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１５６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置１５９のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、またはＧ ｌｙであり； 位置１６２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり； 位置１６３のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり； 位置１６９のＸａａは、Ａｒｇ、ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｙｓであ り； 位置１７０のＸａａは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＳｅｒである； 式中、Ｎ−末端からの１〜１１アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ アミノ酸は、上記修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から欠失していてもよく；そ して 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有することが できるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （Ｖ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポリペプ チド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＴｒＰ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎまた はＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、ｐｈｅ、ｓｅｒ、ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、ＡＳＰ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、ＡＳＰ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、ｓｅｒ、またはＬｙｓであ り； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはｐｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列の Ｃ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の０〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違しており；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩ）下記式で表わされる修飾ヒトｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列を包含 する、ポリペプチド： 式中、 位置１１２のＸａａは、欠失しているか、あるいはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１３のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１４のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１５のＸａａは、欠失しているか、あるいはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩＩ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ま たはＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり；位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、ま たはＬｅｕであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであり ； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ．Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであ り； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ −３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； および （ＶＩＩＩ）コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイ キンおよび造血成長因子からなる群から選択される因子； そして 各式中、Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直接に先行されていてもよい； ただしＲ1またはＲ2の少なくとも一方は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ Ｉ）で表わされるポリペプチドから選択される。 2. （補正なし） 3. （補正なし） 4. （補正なし） 5. （補正なし） 6. （補正なし） 7. （補正なし） 8. （補正なし） 9. （補正なし） 10．上記コロニイ刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ ｓｅｒ17、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ ＥＰＯ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉ Ｌ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１ ３、ＩＬ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ −細胞成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子および幹細胞因子（ＳＣＦ ）からなる群から選択される、請求項１、２または６に記載の造血タンパク質。 11．上記コロニイ刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17、Ｇ−ＣＳ Ｆ Ａｌａ17およびｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）からなる群から選択される、 請求項１０に記載の造血タンパク質。 12．上記請求項１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 13．上記請求項２の造血タンパク質をコードする核酸分子。 14．上記請求項３の造血タンパク質をコードする核酸分子。 15．上記請求項４の造血タンパク質をコードする核酸分子。 16．上記請求項５の造血タンパク質をコードする核酸分子。 17．上記請求項６の造血タンパク質をコードする核酸分子。 18．上記請求項７の造血タンパク質をコードする核酸分子。 19．上記請求項８の造血タンパク質をコードする核酸分子。 20．上記請求項９の造血タンパク質をコードする核酸分子。 21．上記請求項１０の造血タンパク質をコードする核酸分子。 22．上記請求項１１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 23．下記群から選択される、請求項１２に記載の核酸分子： 24．造血タンパク質の製造方法であって、請求項１２、１３、１４、１５、１ ６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３に記載の核酸分子を含有す る複製可能なベクターにより形質転換またはトランスフェクションされたホスト 細胞を、上記造血タンパク質の発現を可能にする方法で、適当な栄養条件下に増 殖させ、次いで上記造血タンパク質を採取する、ことを包含する製造方法。 25．請求項１、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク 質および医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。 26．患者において、造血細胞の産生を刺激する方法であって、有効量の請求項 １、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク質を、上記患 者に投与する段階を包含する方法。 27．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し；次いで （ｂ）上記培養した細胞を採取する、 工程を包含する方法。 28．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し；次いで （ｃ）上記培養した細胞を採取する； 工程を包含する方法。 29．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し； （ｃ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 30．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｅ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 31．ヒト遺伝子治療方法であって、 （ａ）患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）上記造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞中にＤＮＡを導入し； （ｅ）上記形質導入した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記形質導入した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する方法。 32．上記造血細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２７、２８、２９、３０ または３１に記載の方法。 33．上記造血細胞が、末梢血液細胞である、請求項２７、２８、２９、３０、 または３１に記載の方法。 34．樹状細胞の産生方法であって、 （ａ）造血始原細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）またはＣＤ３４＋細 胞を、他の細胞から分離し；次いで （ｂ）上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、請求項１、２、３または４ に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する； 工程を包含する方法。 35．（ｃ）上記培養する造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞に抗原を適用する 工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。 36．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項３４に記載の方法。 37．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項３５に記載の方法。 38．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、請求項 １、２、３または４に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与する段階を包含 する処置方法。 39．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ− ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパク質、および多 機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種または２種以上の 因子を投与することをさらに包含する、請求項３８に記載の方法。 40．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項３８に記載の方 法。 41．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項３９に記載の方 法。 42．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与することによって、 樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を動員し； ｂ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹 状細胞を取り出し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す、 段階を包含する処置方法。 43．段階ａ）において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合 タンパク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、 １種または２種以上の因子を投与することをさらに包含する、請求項４２に記載 の方法。 44．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４２に記載の方法。 45．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４３に記載の方法。 46．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４４に記載の方法。 47．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦＮ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タ ンパク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１ 種または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４５に記載の方法。 48．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記ヒトから造血始原細胞またはＣ Ｄ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し；次いで ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻す； 段階を包含する処置方法。 49．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記患者から上記造血始原細胞また はＣＤ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す； 段階を包含する処置方法。 50．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。 51．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。 52．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 53．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 54．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 55．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５１に記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/06 Ａ６１Ｐ 31/00 31/00 35/00 35/00 37/02 37/02 Ｃ０７Ｋ 14/475 Ｃ０７Ｋ 14/475 14/52 14/52 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 フェン，イーキン アメリカ合衆国ミズーリ，セントルイス, ミッション コート 423 (72)発明者 マッキャーン，ジョン，ピー. アメリカ合衆国ミズーリ，ワイルドウッ ド，バブラー メドウズ ドライブ 18612 (72)発明者 サマーズ，ニーナ，エル. アメリカ合衆国ミズーリ，セントチャール ズ，サドルメイカー 1203 (72)発明者 スタテン，ニコラス，アール. アメリカ合衆国ミズーリ，セントルイス, クイーン アン プレース 859 (72)発明者 ストリーター，フィリップ，アール. アメリカ合衆国ミズーリ，グレンコー，ポ ンド ロード 1555 (72)発明者 マイナリイ，ジョン，シー. アメリカ合衆国ミズーリ，セントルイス, ブリストルコーン コート 5824 (72)発明者 ミンスター，ナンシイ，アイ. アメリカ合衆国ミズーリ，チェスターフィ ールド，クラークソン ウッズ 16080 (72)発明者 ウオルフ，スーザン，エル. アメリカ合衆国ミズーリ，ボールウイン, ウッドモア オークス ドライブ 1719

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1およびＲ2は、下記群から独立して選択され； （Ｉ）下記式で表わされる修飾ＥＰＯアミノ酸配列を包含するヒトＥＰＯレセ プターアゴニストポリペプチド： 式中、Ｎ−末端からの１〜６アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ア ミノ酸は、上記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失していてもよ く、 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩ）下記式で表わされる修飾幹細胞因子アミノ酸配列を包含する、ヒト幹 細胞因子レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜２３アミノ酸は、上記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチ ドのＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ る、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリ ンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩＩ）下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を包含す る、ヒトｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜７アミノ酸は、上記ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＶ）下記式で表わされる修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり； 位置２のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＬｅｕであり； 位置３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒであり； 位置１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏであり ； 位置１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓであり ； 位置１７のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＣｙ ｓであり； 位置２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり ； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 位置２７のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置３０のＸａａは、Ａｈａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置３６のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４２のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４３のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ ｌａ、Ａｒｇ、Ｃｙｓ、またはＬｅｕであり； 位置４４のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈ ｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒであり； 位置４６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＡｌ ａであり； 位置４７のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり： 位置４９のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり； 位置５０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり ； 位置５４のＸａａは、Ｌｅｕ、またはＨｉｓであり； 位置６４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＣｙｓであり； 位置７０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり ； 位置７４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり； 位置１０８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｙであり； 位置１１５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、またはＡｌａであり； 位置１２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであ り； 位置１２３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＴｈｒであり； 位置１４４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｕであり； 位置１４６のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１４７のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１５６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置１５９のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、またはＧ ｌｙであり； 位置１６２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり； 位置１６３のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり； 位置１６９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｙｓであ り； 位置１７０のＸａａは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＳｅｒである； 式中、Ｎ−末端からの１〜１１アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ アミノ酸は、上記修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から欠失していてもよく；そ して 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有することが できるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （Ｖ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポリペ プチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｈａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎまた はＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａsn、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ，Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙs、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであ り； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり： 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｉｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｐｓ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列の Ｃ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の０〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違しており；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩ）下記式で表わされる修飾ヒトｃ−ｍｐｌリガンドアミノ酸配列を包含 する、ポリペプチド：式中 位置１１２のＸａａは、欠失しているか、あるいはＬｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、 Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１３のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１４のＸａａは、欠失しているか、あるいはＰｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｌａ、 Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１５のＸａａは、欠失しているか、あるいはＧｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、 Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、またはＡｓｎであり；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＶＩＩ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポ リペプチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ま たはＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであり ； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅt、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅr、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ,、Ｇｌｕ、 Ｈｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり： 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｉｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 ｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ −３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； および （ＶＩＩＩ）コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイ キンおよび造血成長因子からなる群から選択される因子； そして 各式中、Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されていてもよい； ただしＲ1またはＲ2の少なくとも一方は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ Ｉ）で表わされるポリペプチドから選択される、そして、 2. 下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1およびＲ2は、下記群から独立して選択され； （Ｉ）下記式で表わされる修飾ＥＰＯアミノ酸配列を包含する、ヒトＥＰＯレ セプターアゴニストポリペプチド： 式中、Ｎ−末端からの１〜６アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ア ミノ酸は、上記ＥＰＯレセプターアゴニストポリペプチドから欠失していてもよ く；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩ）下記式で表わされる修飾幹細胞因子アミノ酸配列を包含する、ヒト幹 細胞因子レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜２３アミノ酸は、上記幹細胞因子レセプターアゴニストポリペプチ ドのＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＩＩ）下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を包含す る、ヒトｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチド： 式中、１〜７アミノ酸は、ｆｌｔ−３レセプターアゴニストポリペプチドのＣ −末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： （ＩＶ）下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含する、ポリ ペプチド： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎまた はＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｒ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙs、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｇ ｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであり ； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、ま たはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、 Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列のＮ−末端か ら欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、上記修飾ヒトＩＬ −３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していてもよく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； （Ｖ）コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インターロイキンお よび造血成長因子からなる群から選択される因子； そして 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； 各式中、上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1 ）または（メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されているいてもよい ； ただしＲ1またはＲ2の少なくとも一方は、式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩ Ｉ）で表わされるポリペプチドから選択される。 3. （ＩＶ）のポリペプチドが、下記群から選択される、請求項２に記載の造 血タンパク質： 4．下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1は、下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を 包含するポリペプチドであり： 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有すること ができるリンカー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合している： 各式中、Ｒ2は、下記式で表わされる修飾ヒトＩＬ−３アミノ酸配列を包含す るポリペプチドであり： 式中、 位置１７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｍｅt、Ｇｌｎ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、ま たはＧｌｎであり； 位置１９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ま たはＣｙｓであり； 位置２０のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇ ｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、ｓｅｒ、またはＶａｌであり； 位置２２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｒp、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａ ｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＧｌｙであり； 位置２３のＸａａは、ＩＩｅ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｐ ｈｅ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、またはＡｒｇであり； 位置２４のＸａａは、ＩＩｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、ま たはＬｅｕであり； 位置２５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、ま たはＡｌａであり； 位置２６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｌａ、ま たはＴｒｐであり； 位置２７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、またはＡｌ ａであり； 位置２８のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｖ ａｌ、またはＴｒｐであり； 位置２９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、またはＶａ ｌであり； 位置３０のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｓ ｅｒ、Ｌｅｕ、またはＬｙｓであり； 位置３１のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、ま たはＧｌｎであり； 位置３２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａ、またはＧｌｕであり； 位置３３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、またはＧｌ ｕであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｓｅr、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇ ｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置３５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、ま たはＶａｌであり； 位置３６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、またはＶａｌであり； 位置３７のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、またはＩｌｅであり ； 位置３８のＸａａは、Ａｓｎ、またはＡｌａであり； 位置４０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｒｐ、またはＡｒｇであり； 位置４１のＸａａは、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、ま たはＰｒｏであり； 位置４２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｔ ｈｒ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、またはＡｌ ａであり； 位置４３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｓｐ、Ａ ｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置４４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｍ ｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置４５のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔ ｈｒ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｕ、またはＨｉｓであり； 位置４６のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ａ ｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＧｌ ｙであり； 位置４７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、ｐｒｏ、ま たはＨｉｓであり； 位置４８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐ ｈｅ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり ； 位置４９のＸａａは、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｎ、Ｈ ｉｓ、またはＡｓｐであり； 位置５０のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｌｙｓ、Ａ ｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、またはＧｌ ｎであり； 位置５１のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ま たはＨｉｓであり； 位置５２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ま たはＴｈｒであり； 位置５３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌ ｙｓ、Ｓｅｒ、またはＭｅｔであり； 位置５４のＸａａは、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ，Ｇ ｌｎ，Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＬｅｕであり； 位置５５のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、またはＧｌ ｙであり； 位置５６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅr、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａ ｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＬｙ ｓであり； 位置５７のＸａａは、Ａｓｎ、またはＧｌｙであり； 位置５８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、ま たはＣｙｓであり； 位置５９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、またはＡｒ ｇであり； 位置６０のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＴｈ ｒであり； 位置６１のＸａａは、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ま たはＳｅｒであり； 位置６２のＸａａは、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ａ ｓｐ、またはＩｌｅであり； 位置６３のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＨｉＳ、Ｐ ｒｏ、またはＶａｌであり； 位置６４のＸａａは、Ａｌａ、Ａｓｎ、ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＬｙｓであ り； 位置６５のＸａａは、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、ま たはＳｅｒであり； 位置６６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、また はＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｉ ｌｅ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓであり； 位置６８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔ ｈｒ、またはＨｉｓであり； 位置６９のＸａａは、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔ ｒｐ、Ｇｌｙ、またはＬｅｕであり； 位置７０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、またはＡｌ ａであり； 位置７１のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｎ、Ｔｒｐ、またはＡｓｎであり； 位置７２のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ａ ｒｇ、またはＡｓｐであり； 位置７３のＸａａは、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｔ ｈｒ、またはＡｒｇであり； 位置７４のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａ ｌａであり； 位置７５のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａ ｒｇ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＬｅｕであり； 位置７６のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｇｌｕ、Ｐ ｒｏ、Ｇｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置７７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、またはＬｅｕであり ； 位置７８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、ま たはＡｒｇであり； 位置７９のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｇ ｌｙ、またはＡｓｐであり； 位置８０のＸａａは、Ａｓｎ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｕ、またはＡｒｇであり； 位置８１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＴｒＰ、Ａｒｇ、Ｖ ａｌ、またはＬｙｓであり； 位置８２のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ ｌｕ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｍ ｅｔ、またはＶａｌであり； 位置８３のＸａａは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、またはＭｅ ｔであり； 位置８４のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｍｅｔ、またはＶａ ｌであり； 位置８５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、またはＧｌｎであり； 位置８６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ、Ａｒｇ、Ａｌａ、またはＬｙｓであり ； 位置８７のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、またはＧｌｙであり； 位置８８のＸａａは、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、またはＴｒｐであり ； 位置８９のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｈ ｉｓ、Ａｓｎ、またはＳｅｒであり； 位置９０のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｉ ｌｅ、またはＭｅｔであり； 位置９１のＸａａは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ａ ｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置９２のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａ ｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＬｅｕであり； 位置９３のＸａａは、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｌ ｅｕ、またはＡｒｇであり； 位置９４のＸａａは、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｇ ｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置９５のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇ ｌｙ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、ＴｒＰ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、ま たはＴｙｒであり； 位置９６のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、またはＴｈ ｒであり； 位置９７のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、またはＡｓｎであり ； 位置９８のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｔ ｈｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔ ｙｒ、またはＰｒｏであり； 位置９９のＸａａは、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇ ｌｎ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｐｈｅ、またはＨｉｓであり； 位置１００のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、 Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、またはＰｒｏであり； 位置１０１のＸａａは、Ａｓｐ、Ｐｒｏ、Ｍｅt、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、 Ｖａｌ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、 またはＧｌｎであり； 位置１０２のＸａａは、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、 またはＰｒｏであり； 位置１０３のＸａａは、Ａｓｐ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、 Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｐｈｅ、またはＧｌｙであり； 位置１０５のＸａａは、ＡｓnNＰｒo,．Ａｌａ）Ｐｈe,．Ｓｅr,．Ｔｒｐ）Ｇ ｌｎ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、またはＨｉｓであり； 位置１０６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｙ、またはＰｒｏであり； 位置１０８のＸａａは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＰｒｏであり； 位置１０９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、 Ｓｅｒ、またはＧｌｙであり； 位置１１０のＸａａは、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、 Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、またはＴｒｐであり； 位置１１１のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、またはＭｅｔであ り； 位置１１２のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、 Ｓｅｒ、またはＰｈｅであり； 位置１１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｃｙｓ、ＨｉＳ、Ｇｌｙ、Ｔｒｐ、 Ｔｙｒ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、またはＡｓｎであり； 位置１１４のＸａａは、Ｔｙｒ、Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、 またはＬｅｕであり； 位置１１５のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ａｌａ、 Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＭｅｔであり； 位置１１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、Ａｓｐ、 Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ａｌａ、Ｔｙｒ、 Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、またはＩｌｅであり； 位置１１７のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、 またはＰｒｏであり； 位置１１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、 Ａｓｐ、またはＴｙｒであり； 位置１１９のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、 Ｔｙｒ、またはＡｒｇであり； 位置１２０のＸａａは、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、 またはＧｌｎであり； 位置１２１のＸａａは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ａｓｎ、ｐｒｏ、Ｌｙｓ、 Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置１２２のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、 Ｐｒｏ、ＨｉＳ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、またはＣｙｓであり； 位置１２３のＸａａは、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、 Ｔｙｒ、またはＬｅｕである； 式中、１〜１４アミノ酸は、上記修飾ヒトインターロイキン−３アミノ酸配列 のＮ−末端から削除欠失していてもよく、および／または１〜１５アミノ酸は、 上記修飾ヒトインターロイキン−３アミノ酸配列のＣ−末端から欠失していても よく；そして 式中、Ｘａａにより表わされているアミノ酸の１〜４４は、天然（１−１３３ ）ヒトインターロイキン−３の対応するアミノ酸とは相違している； そして 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； そして 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直接に先行されているいてもよい。 5．Ｒ2が、下記群から選択される、請求項４に記載の造血タンパク質： 6．下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する、造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1は、下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を 包含するポリペプチドであり： 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合しており： 各式中、Ｒ2は、コロニイ刺激因子、サイトカイン、リンホカイン、インター ロイキンおよび造血成長因子からなる群から選択される因子であり； 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； そして 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）また は（メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されていてもよい。 7．下記式で表わされるアミノ酸配列を包含する造血タンパク質： Ｒ1−Ｌ1−Ｒ2、Ｒ2−Ｌ1−Ｒ1、Ｒ1−Ｒ2、またはＲ2−Ｒ1 各式中、Ｒ1は、下記式で表わされる修飾ｆｌｔ−３リガンドアミノ酸配列を 包含する、ポリペプチドであり： 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合しており： 各式中、Ｒ2は、下記式で表わされる修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列を包含 するポリペプチドであり： 式中、 位置１のＸａａは、Ｔｈr、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＧｌｙであり； 位置２のＸａａは、Ｐｒｏ、またはＬｅｕであり； 位置３のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、またはＳｅｒであり； 位置１３のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、またはＰｒｏであり ； 位置１６のＸａａは、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＨｉｓであり ； 位置１７のＸａａは、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ま たはＡｒｇであり； 位置１８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、またはＣｙ ｓであり； 位置２２のＸａａは、Ａｒｇ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡｌａであり ； 位置２４のＸａａは、Ｉｌｅ、ｐｒｏ、Ｔｙｒ、またはＬｅｕであり； 位置２７のＸａａは、Ａｓｐ、またはＧｌｙであり； 位置３０のXａａは、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、またはＧｌｙであり； 位置３４のＸａａは、Ｌｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置３６のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４２のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置４３のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｙｓ、Ｔｒｐ、Ａ ｌａ、Ａｒｇ、ｃｙｓ、またはＬｅｕであり； 位置４４のＸａａは、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｈ ｉｓ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、またはＴｈｒであり； 位置４６のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、Ｉｌｅ、またはＡｌ ａであり； 位置４７のＸａａは、ＬｅｕまたはＴｈｒであり； 位置４９のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり； 位置５０のＸａａは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏ、またはＴｙｒであり ； 位置５４のＸａａは、Ｌｅｕ、またはＨｉｓであり； 位置６４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置６７のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、またはＣｙｓであり； 位置７０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＳｅｒであり ； 位置７４のＸａａは、Ｃｙｓ、またはＳｅｒであり； 位置１０４のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、またはＶａｌであり； 位置１０８のＸａａは、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｙであり； 位置１１５のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、またはＡｌａであり； 位置１２０のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、またはＨｉｓであ り； 位置１２３のＸａａは、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、またはＴｈｒであり； 位置１４４のＸａａは、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、 またはＧｌｕであり； 位置１４６のＸａａは、Ａｒ−ｇ、またはＧｌｎであり； 位置１４７のＸａａは、Ａｒｇ、またはＧｌｎであり； 位置１５６のＸａａは、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、またはＳｅｒであり； 位置１５９のＸａａは、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、またはＧ ｌｙであり； 位置１６２のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、またはＴｒｐであり； 位置１６３のＸａａは、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、またはＡｌａであり； 位置１６９のＸａａは、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｌｅｕ、Ａｒｇ、またはＣｙｓであ り； 位置１７０のＸａａは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、またはＳｅｒである； 式中、Ｎ−末端からの１〜１１アミノ酸および／またはＣ−末端からの１〜５ アミノ酸は、上記修飾ヒトＧ−ＣＳＦアミノ酸配列から欠失していてもよく；そ して 式中、Ｎ−末端は、直接に、またはＮ−末端をＣ−末端に結合することができ 、そしてそれぞれ下記アミノ酸部位に新規Ｃ−末端およびＮ−末端を有するリン カー（Ｌ2）を経て、Ｃ−末端に結合しており： 各式中、上記Ｌ1は、Ｒ1をＲ2に結合させることができるリンカーであり； そして 上記造血タンパク質は所望により、（メチオニン-1）、（アラニン-1）または （メチオニン-2、アラニン-1）により直前に先行されているいてもよい。 8．上記リンカー（Ｌ2）が下記群から選択される、請求項１、２、３、４、５ 、６または７に記載の造血タンパク質： 9．上記タンパク質が、下記群から選択される、請求項１に記載の造血タンパ ク質： 11．上記コロニイ刺激因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦＮＧ−ＣＳＦｓｅｒ17 、ｃ−ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）、Ｍ−ＣＳＦ、エリスロポイエチン（ＥＰＯ ）、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７ 、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、Ｉ Ｌ−１５、ＬＩＦ、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒト成長ホルモン、Ｂ−細胞 成長因子、Ｂ−細胞分化因子、好酸球分化因子および幹細胞因子（ＳＣＦ）から なる群から選択される、請求項１、２または６に記載の造血タンパク質。 12．上記コロニイ刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ Ｓｅｒ17、Ｇ−ＣＳ Ｆ Ａｌａ17およびｃ−mplリガンド（ＴＰＯ）からなる群から選択される、請 求項１１に記載の造血タンパク質。 13．上記請求項１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 14．上記請求項２の造血タンパク質をコードする核酸分子。 15．上記請求項３の造血タンパク質をコードする核酸分子。 16．上記請求項４の造血タンパク質をコードする核酸分子。 17．上記請求項５の造血タンパク質をコードする核酸分子。 18．上記請求項６の造血タンパク質をコードする核酸分子。 19．上記請求項７の造血タンパク質をコードする核酸分子。 20．上記請求項８の造血タンパク質をコードする核酸分子。 21．上記請求項９の造血タンパク質をコードする核酸分子。 22．上記請求項１０の造血タンパク質をコードする核酸分子。 23．上記請求項１１の造血タンパク質をコードする核酸分子。 24．下記群から選択される、請求項１３に記載の核酸分子： 25．造血タンパク質の製造方法であって、請求項１３、１４、１５、１６、１ ７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４に記載の核酸分子を含有す る複製可能なベクターにより形質転換またはトランスフェクションされたホスト 細胞を、上記造血タンパク質の発現を可能にする方法で、適当な条件下に増殖さ せ、次いで上記造血タンパク質を採取する、ことを包含する製造方法。 26．請求項１、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク 質および医薬上で許容される担体を含有する医薬組成物。 27．患者において、造血細胞の産生を刺激する方法であって、有効量の請求項 １、２、３、４、５、６、７、９または１０に記載の造血タンパク質を、上記患 者に投与する段階を包含する方法。 28．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し；次いで （ｂ）上記培養した細胞を採取する、 工程を包含する方法。 29．造血細胞を、選択的にエクスビボ拡張させる方法であって、 （ａ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し；次いで （ｃ）上記培養した細胞を採取する； 工程を包含する方法。 30．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記造血細胞を 培養し； （ｃ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 31．造血障害を有する患者の処置方法であって、 （ａ）上記患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞を採取し；次いで （ｅ）上記培養した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する処置方法。 32．ヒト遺伝子治療方法であって、 （ａ）患者から造血細胞を取り出し； （ｂ）上記造血細胞を、他の細胞から分離し； （ｃ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する培養基で、上記分離した造 血細胞を培養し； （ｄ）上記培養した細胞中にＤＮＡを導入し； （ｅ）上記形質導入した細胞を採取し；次いで （ｄ）上記形質導入した細胞を上記患者に移植する； 段階を包含する方法。 33．上記造血細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２８、２９、３０、３１ または３２に記載の方法。 34．上記造血細胞が、末梢血液細胞である、請求項２８、２９、または３０、 ３１または３２に記載の方法。 35．樹状細胞の産生方法であって、 （ａ）造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、他の細胞から分離し；次いで （ｂ）上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を、請求項１、２、３または４ に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する； 工程を包含する方法。 36．（ｃ）上記培養する造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞に抗原を適用する 工程をさらに包含する、請求項３５に記載の方法。 37．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、IL−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項３５に記載の方法。 38．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項３６に記載の方法。 39．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、請求項 １、２、３または４に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与する段階を包含 する処置方法。 40．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｔ− ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパク質、および多 機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種または２種以上の 因子を投与することをさらに包含する、請求項３９に記載の方法。 41．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項３９に記載の方 法。 42．抗原を上記患者に投与する段階をさらに包含する、請求項４０に記載の方 法。 43．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）請求項１に記載の造血タンパク質を、上記ヒトに投与することによって、 樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を動員し； ｂ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹 状細胞を取り出し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す、 段階を包含する処置方法。 44．段階ａ）において、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ ＳＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タ ンパク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１ 種または２種以上の因子を投与することをさらに包含する、請求項４３に記載の 方法。 45．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４３に記載の方法。 46．段階ｂ）からの上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、請求項１、 ２、３または４に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地で培養する段階をさ らに包含する、請求項４４に記載の方法。 47．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦＮＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４５に記載の方法。 48．上記増殖培地が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（Ｓ ＣＦ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タン パク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種 または２種以上の因子をさらに含有する、請求項４６に記載の方法。 49．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記ヒトから造血始原細胞またはＣ Ｄ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し；次いで ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻す； 段階を包含する処置方法。 50．腫瘍、感染症または自己免疫疾患を患うヒトの処置方法であって、 ａ）血液掃引またはフェレーシスにより、上記患者から上記造血始原細胞また はＣＤ３４＋細胞を取り出し； ｂ）請求項１に記載の造血タンパク質を含有する増殖培地において、上記造血 始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を培養し、樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞 を産生し； ｃ）上記樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞に抗原を適用し；次いで ｄ）上記抗原適用した樹状細胞前駆細胞または成熟樹状細胞を、上記ヒトに戻 す； 段階を包含する処置方法。 51．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。 52．培養に先立ち、上記造血始原細胞またはＣＤ３４＋細胞を他の細胞から分 離する段階をさらに包含する、請求項５０に記載の方法。 53．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５１に記載の方法。 54．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５０に記載の方法。 55．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５１に記載の方法。 56．上記培養基が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α、幹細胞因子（ＳＣ Ｆ）、ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−３変種、ＩＬ−３変種融合タンパ ク質、および多機能性レセプターアゴニストからなる群から選択される、１種ま たは２種以上の因子をさらに含有する、請求項５２に記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022527322A (ja) * 2019-03-28 2022-06-01 オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｆｌｔ３ｌ）ベースキメラタンパク質

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US20020137890A1 (en) * 1997-03-31 2002-09-26 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
CA2284127A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 G.D. Searle & Co. Flt3 ligand chimeric proteins
BR9905867A (pt) * 1998-11-06 2001-01-23 Bio Sidus S A Linhagem celular produtora de eritropoietina humana recombinante e a eritropoietina humana recombinante produzida por esta célula
WO2002101047A1 (en) * 2001-06-12 2002-12-19 Smithkline Beecham Corporation Method of identifying compounds that modulate epo primary response gene 1, eprg1, activities
MXPA04000231A (es) 2001-07-11 2004-05-04 Maxygen Holdings Ltd Conjugados del factor de estimulacion de colonias de granulocitos.
ATE447611T1 (de) 2003-08-18 2009-11-15 Univ California Polypeptid-display-bibliotheken und verfahren zur herstellung und verwendung davon
US7381805B2 (en) 2005-06-01 2008-06-03 Maxygen Holdings, Ltd. Compositions comprising mixtures of positional PEG isomers of PEGylated G-CSF
US7550433B2 (en) * 2005-06-03 2009-06-23 Affymax, Inc. Erythropoietin receptor peptide formulations and uses
EP3181575B1 (en) 2005-08-31 2021-03-17 The Regents of The University of California Cellular libraries of peptide sequences (clips) and methods of using the same
WO2007098548A1 (en) * 2006-03-01 2007-09-07 Apollo Life Sciences Limited A molecule and chimeric molecules thereof
US8293685B2 (en) * 2007-07-26 2012-10-23 The Regents Of The University Of California Methods for enhancing bacterial cell display of proteins and peptides
WO2015069489A1 (en) 2013-11-06 2015-05-14 Merck Patent Gmbh Predictive biomarker for hypoxia-activated prodrug therapy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992006116A1 (en) * 1990-09-28 1992-04-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Hybrid growth factors
US5376367A (en) * 1991-11-22 1994-12-27 Immunex Corporation Fusion proteins comprising MGF and IL-3
US5738849A (en) * 1992-11-24 1998-04-14 G. D. Searle & Co. Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them
US6057133A (en) * 1992-11-24 2000-05-02 G. D. Searle Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production
US5635599A (en) * 1994-04-08 1997-06-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Fusion proteins comprising circularly permuted ligands

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2022527322A (ja) * 2019-03-28 2022-06-01 オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｆｌｔ３ｌ）ベースキメラタンパク質
JP7749186B2 (ja) 2019-03-28 2025-10-06 オリオニス バイオサイエンシズ，インコーポレイテッド Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ｆｌｔ３ｌ）ベースキメラタンパク質

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