JP2001504828A - 制御型放出システムの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、以下の工程を包含する制御型放出システムの調製方法に関する。少なくとも２種の水溶性ポリマーから水性二相系を形成する工程であって、但し、該２種の水溶性ポリマーはおのおの溶解状態において互いに非相溶であり、且つ該水溶性ポリマーの少なくとも１種が架橋性であって、該架橋性ポリマー相が他のポリマー相に乳化するものであり、水溶液中の該架橋性ポリマー相に溶解可能な少なくとも１種の放出可能な化合物を該架橋性ポリマー相に拡散させる工程、該架橋性ポリマーを架橋させて架橋構造を形成する架橋工程、但し、架橋工程は放出可能な化合物を水性二相系に加える前または後に行い、該架橋性ポリマーの架橋を、架橋構造中の孔径が該放出可能な化合物のサイズよりも実質的に小さくなる程度まで行う、及び該架橋構造を他のポリマー相より分離する工程。更に、本発明は、ミクロスフェアであって、粒径が１００ｎｍ〜１００μｍのミクロスフェアが全ミクロスフェアの重量に対して少なくとも８０重量％であり、少なくとも１種の放出可能な化合物を被包した分解可能な架橋ポリマーからなり、且つ該架橋ポリマーの孔径が放出可能な化合物の粒径よりも小さいことを特徴とするミクロスフェアに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 制御型放出システムの調製方法 技術分野 本発明は、放出挙動が良好に制御されているシステムの調製方法、及び、放出 挙動が良好に制御されているミクロスフェアに関する。 発明の背景 バイオテクノロジーの急速な発展により、薬学的に興味深い数多くの物質、特 にタンパク質、ペプチド及び遺伝子が見出されている。このような物質は、生命 を脅かす疾患、例えば癌や、数種類のウイルス性・細菌性・寄生生物性疾病の治 療薬として好適に用いることができる。 タンパク質やペプチドなどのタンパク様物質［以下、タンパク質やタンパク様 物質を「タンパク性薬物(protein drugs)」と称する］はその性質上、経口投与 が不可能である。従って、このような物質は非経口投与、即ち注射による投与を 行なわなければならない。しかし、タンパク性薬物の薬物動態学的プロファイル (pharmacokinetical profile)によれば、タンパク性薬物をそのまま注射で投与 する場合には頻回投与が必要である。言い換えれば、タンパク性薬物は胃腸管に おいて化学的及び物理的に不安定であり、一般的にヒトや 動物の体内で活性を示す期間は短いので、タンパク性薬物によって望ましい治療 効果を得るためには、短期間に複数回の注射が必要である。タンパク性薬物によ る治療を必要とする患者にとってこのような投与方法が不便なのは明らかである 。 上記のような理由から、徐放性を有するデリバリーシステム(delivery system )が必要である。当業界において種々の手段が提案されているが、生分解性の、 比較的よく知られた合成ポリマーを用い、被包した薬物の放出を制御する方法が 広く用いられている。 従来の方法の一つとして、高分子ミクロスフェア（microsphere）やナノスフ ェア（nanosphere）が使用されている。このようなミクロスフェアやナノスフェ アは、直径が約０．１μｍ〜１００μｍの球形の粒子、球形のカプセル、ナノカ プセル（nanocapsule）又は微小粒子（nanoparticle）である。本願明細書及び 請求の範囲において“ミクロスフェア”とは、微粒子(microparticle)、マイク ロカプセル(microcapsule)、ナノスフェア、微小粒子及びナノカプセルを包含す るものである。ミクロスフェアの調製には、ポリ乳酸や、乳酸とグリコール酸と の共重合体が屡々用いられる。ミクロスフェアの使用後にポリマー製のキャリア ーを除去する必要がないので、用いるポリマーは生分解性であることが好ましい 。 制御された又は持続性の薬物放出システムの従来の調製 方法は、一般的に有機溶媒の使用を必要とする。有機溶媒はタンパク質の構造、 特に二次構造及び三次構造を変化させる。このような変化は、タンパク性薬物の 変性を生じる。上記のような構造変化は、通常、タンパク性薬物の薬理学的活性 の損失と招かれざる副作用を生じるため、下記に説明するように有害である。更 に、有機溶媒の使用は環境問題の観点からも望ましいものではない。 又、調製したミクロスフェアの表面及び／またはその内部に残留する有機溶媒 を完全に除去することはほとんど不可能である。特に有毒な溶媒、例えば、広く 用いられているクロロフォルムやジクロロメタンの場合には、上記の点は問題で ある。 別の問題点としては、高分子マトリックスで再現性よくタンパク質を被包する ことは困難である。医薬としては、予め定められた量のタンパク質やその他の被 包性物質がミクロスフェアから放出され、且つこのような薬物の放出量が再現可 能であることが非常に重要である。 タンパク性薬物のデリバリーシステムの形成には、ヒドロゲルも使用されてい る。このようなシステムの１つとして、グリシジルメタクリレートを用いて誘導 体化したデキストラン(dex-GMA)をラジカル重合反応に付すことによって得られ る架橋デキストランを包含するシステムが挙げられる。これについては、Van Di jk-Wolthuisら，Macromolecules 28， (1995)，6317-6322及びDe Smedtら，Macromolecules 28，(1995)，5082-5088を 参照することができる。 これらのヒドロゲルからのタンパク質の放出は、ゲルの架橋度と初期含水率に 依存するので、これらを調節することによってヒドロゲルからのタンパク質放出 の制御が可能であることが明らかとなった[Henninkら，J．of Contr．Rel．39， (1996)，47-57を参照]。 ヒドロゲル又は高分子ミクロスフェアに内包された薬物は、高分子材料の生分 解の最中及び／又は拡散によって放出される。 ヒドロゲル又はヒドロゲルに由来するミクロスフェアに薬物を封入する方法と しては、通常、薬物含有溶液中でヒドロゲル又はミクロスフェアを平衡状態にし た後、乾燥する方法[Kimら，Pharm．Res．9(3)（1992）283-290等を参照]、ある いは、ヒドロゲル又はミクロスフェアを調製する際に薬物を封入する方法［Hell erら，Biomaterials 4（1983）262-266等を参照］が用いられる。いずれの手法 も、使用されるあらゆる有機溶媒に起因する欠点以外に、数多くの欠点を有して いる。 平衡状熊にすることよってミクロスフェアに薬物を封入すると、普通、デリバ リーシステムの薬物含有率がかなり低くなる。特に薬物が巨大分子化合物である 場合には、上記の問題点は顕著である。よって、ヒドロゲル又はミクロスフェ アの孔径が相当大きい場合を除けば、薬物の巨大分子はヒドロゲル又はミクロス フェアの外側表面にただ吸着するだけなので、投与した後にヒト又は動物の体内 でバースト放出（burst release）を起こすことも考えられる。更にこの方法で は、薬物を含有した溶媒相をデリバリーシステムに接触させることによってデリ バリーシステムに薬物を封入するので、この溶媒相をヒドロゲル又はミクロスフ ェアから除去しなければならない。このように溶媒相を除去することによって、 薬物がデリバリーシステムの表面へ移動（migration）するため、薬物の分布が 不均一になる。このような薬物の不均一な分布もまた、一般的に望ましくないバ ースト放出を起こす傾向にある。 よって、巨大分子薬物を取り込むための好適な封入方法の開発が望まれている 。 Proceed．Intern．Symp．Control．Rel．Bioact．Master，22(1995)，145-146 において、Gehrkeらは、溶液吸収によって達成される封入率よりも高い封入率、 即ち、全重量の約０．１重量％を超える量の薬物を、予め調製・精製したヒドロ ゲルに封入することができる技術について記載している。この封入技術は、ある 種のポリマーの混合物は、水に溶解するときに各ポリマーが別々の相に分かれる という事実に基いている。このような系に溶解されたタンパク質は、各ポリマー 相の間で不均等に分配する。この原理は、ポリマー相の１ つが架橋ゲルである場合にも成立する。 Gehrkeらは、特に、架橋デキストランゲル／ポリエチレングリコール系と架橋 ヒドロキシプロピルセルロースゲル／ポリビニルアルコール系について記載して いる。架橋ゲルのビーズ(beads)を含有した水溶液中に存在するタンパク質は、 ここに架橋してない第二のポリマーを添加するとビーズ上に吸着し、部分的には ビーズ表面にあるメッシュ（mesh）又は孔（pore）を通って吸収される。 この技術の欠点は、タンパク様物質の大部分がビーズ上に吸着するだけである という点であり、このことは、第二のポリマーを含んだ相を別の水性の系と置き 換えた場合には、タンパク質がビーズからすぐに取り除かれることを意味してい る。封入するタンパク様物質のサイズよりも大きい孔径を有する孔がビーズ表面 に多量に存在する場合にのみ、タンパク様物質の吸収がいくらか生じる。このよ うなタンパク様物質の吸着と、制限された吸収は、タンパク様物質をビーズから 放出させる際に好ましくない影響を与えている。 従来技術の望ましくない放出挙動については、上記の文献に記載されたプロフ ァイルが、薬理学的観点から、制御型放出システムで用いるには全く不適当であ るという点から明らかである。また、ゲルビーズが大きすぎると(例えば、１． ５ｍｍの直径を有する円柱である場合等)、ヒトや動物への投与には好適に用い ることができない。 ＥＰ−Ａ−０ ２１３ ３０３には、２つの水性液相からなる系を用いて球状 のポリマー粒子を調製する方法が記載されている。この方法では、２つの液相の １つをもう一方の液相の中に液滴として分散し、エマルションを形成する。次に 、液滴を固める。分散される相には巨大分子を溶解してもよい。さらに、薬剤、 ワクチンや殺虫剤のような低分子量の物質を、分散された相の粒子形成物質に化 学的に結合させることもできる。しかしながら、上記の公報には、溶解された物 質の放出挙動のみならず、得られた球形高分子粒子の用途や粒子のサイズに関す る記載は何もない。 ポリエチレングリコール(PEG)を含む２相系における親和 によるTopics in Applied Chemistry;Poly(ethyleneglycol)chemistry,Biotechn ological and Biochemical Applications,J.M．Harris編，Plenum Press(1992) の中の"PEG-containing Two-phase Systems"にも記載されている。この文献には 、デキストランの水溶液とポリエチレングリコール（PEG）の水溶液を混ぜるこ とによって得られる二相系について記載されている。このような系では、PEGを 多量に含む相とデキストランを多量に含む相が形成される。こういった系ではタ ンパク質は不均一に分配される。このような公知の系は、タンパク質の精製に用 いられている。 発明の概要 本発明の１つの目的は、注射による投与が可能な、患者のことを考慮した、タ ンパク性薬物のためのデリバリーシステムを提供することであり、このようなシ ステムは安全且つ生分解性であり、放出速度(delivery kinetics)の制御が容易 でなければならない。薬物の放出が保証される期間は、使用するタンパク性薬物 によって決まり、数日間から１年以上までの幅がある。更に、デリバリーシステ ムに多量の薬物の封入が可能でなければならない。それに加えて、本発明のシス テムは有機溶媒を使用することなく調製できなければならない。 上記の問題点は、制御型放出システム、例えばミクロスフェアを特定の調製方 法、具体的には、水を溶媒として用いる方法により解決することができる。水の みを溶媒として使用することは、有機溶媒の毒性を考慮すると、環境問題の観点 から有益であり、特にタンパク質の安定性を維持する上でも有利である。 発明の詳細な説明 本発明は、 （ａ）２種の水溶性ポリマーと少なくとも１種の放出可能な化合物から水性二 相系を形成する工程であって、但し、該２種の水溶性ポリマーはおのおの溶解状 態において互いに非相溶であり、且つ該水溶性ポリマーの少なくとも１種が架 橋性であって、該架橋性ポリマー相が他のポリマー相に乳化するものであり、該 少なくとも１種の放出可能な化合物は、水溶液中の該架橋性ポリマー相に溶解可 能なものであり、 （ｂ）該放出可能な化合物を該架橋性ポリマー相に溶解または拡散させる工程、 及び （ｃ）該架橋性ポリマーを架橋させて架橋構造を形成する架橋工程、 但し、工程（ｂ）は工程（ｃ）の前または後に行う、ことを包含する制御型放 出システムの調製方法に関する。 本発明の好ましい態様においては、架橋性ポリマーの架橋を、架橋反応で得ら れる架橋構造中の孔（即ち、メッシュ）の大きさがが放出可能な化合物のサイズ よりも実質的に小さくなる程度まで行う。架橋性のポリマーと相溶性を示さない ポリマーと水とからなる連続相に水溶性架橋性ポリマーを乳化し、そして不連続 相を架橋することで、以下に詳しく説明するように、架橋ポリマー粒子の粒径を 調整し、且つ粒径分布を狭くすることができる。 更に本発明は、 ミクロスフェアであって、 粒径が１００ｎｍ〜１００μｍのミクロスフェアが全ミクロスフェアの重量に 対して少なくとも８０重量％であり、 該ミクロスフェアは、少なくとも１種の放出可能な化合物を被包した分解可能 な架橋ポリマーからなり、且つ該架橋ポ リマーの孔径が放出可能な化合物の粒径と等しいか、好ましくは小さいことを特 徴とするミクロスフェアに関する。このようなミクロスフェアは本発明の方法に よって調製することが可能であり、そして有機溶媒を含んでいない。ミクロスフ ェアの用途に応じて、その粒径は、例えば１〜５０μｍ、好ましくは２〜２５μ ｍに調整すればよく、例えば５〜１５μｍにすればよい。 架橋ポリマーの孔径又はメッシュが、放出可能な成分の流体力学的な直径と等 しいかまたは小さい場合、放出可能な成分の大部分はポリマーが分解される際に 放出される。より詳細には、この態様においては、被包された放出可能な化合物 が架橋マトリックスの外に放出されるためには、架橋構造がヒトまたは動物の体 内で分解可能なことが必須である。一方、架橋ポリマーの孔径又はメッシュが放 出可能な成分のサイズよりも大きい場合、放出可能な成分の少なくとも一部分は 架橋マトリックスから拡散によって放出される。本発明の方法によって得られる 架橋ポリマーの孔径は、このようにして放出を制御するための完璧な手段となる 。更に、このようなポリマー構造は、放出可能な化合物を非常に効率よく取り込 むのと同時に、放出される化合物の封入率をその飽和濃度にまで上げることがで きる。 架橋構造の分解能は色々な方法によって調節することができる。１つの例とし て、生理的条件下で加水分解可能な結合 を架橋構造に組込む方法が挙げられる。この点に関して、本発明者のグループに よる欧州特許願第９６２０１８２１．４号を参照することができる。この特許出 願は、異なるポリマー鎖の間に加水分解されやすいスペーサーを包含するヒドロ ゲルについて教示している。上記特許出願に記載されている加水分解されやすい スペーサーは、本発明においても適切に用いることができ、上記特許出願を参照 することによってこのようなスペーサーを本発明の架橋構造に組込むことができ る。 架橋構造の分解能を制御するための他の例としては、架橋ポリマー中の結合を 切断可能な酵素または化学物質を、放出可能な化合物と共に被包する方法が挙げ られる。本発明の方法の好ましい態様において、架橋性ポリマーはデキストラン ポリマーである。この態様において、架橋工程を行う前または後に、デキストラ ン分解酵素を水性二相系に添加することができる。 デキストランポリマーは、本発明に用いられる好ましいポ (Pluronic)と共に，好適に用いることができる。 本発明の方法で目的とされる生成物は、例えば遠心やデカンテーションのよう な従来技術を用いて他のポリマー相より分離することができる。 本発明の調製方法の第１工程において、水性二相系を 形成する。この二相系は、水及び少なくとも２種の水溶性ポリマーからなるもの であり、２種のポリマーはおのおの溶解状態において互いに非相溶である。放出 される化合物は架橋工程後に加えることもできるが、この第１工程で得られた水 性二相系に存在することが好ましい。水性二相系に存在するポリマーの少なくと も一つは架橋性であり、架橋性ポリマー相は他の水性ポリマー相に乳化するもの である。 本発明で使用するポリマーは、放出される化合物の性質に応じて選択すること ができる。放出される化合物が架橋性ポリマー相に対して強い選択性を示すよう に、ポリマーを選択することが好ましい。このような場合には、最大量（理論的 には飽和濃度）の化合物を封入したミクロスフェアを調製することができる。 使用する架橋性ポリマーの種類は重要ではないが、架橋後のポリマーを包含す る制御型放出システムをヒトまたは動物の体内で使用する場合には、架橋性ポリ マーは薬剤として投与可能なものであり、好ましくは、分解可能なものである。 本発明に適した架橋性水容性ポリマーは、デキストラン及びその誘導体；デンプ ン及びその誘導体；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロー スなどのセルロース誘導体；ポリビニルピロリドン；タンパク質及び誘導体化さ れたタンパク質など が挙げられる。使用する架橋性ポリマーの分子量は、通常、1,000〜1,000,000Da である。ポリマーの分子量が大きいほど、本発明の調製方法で用いる水溶液の相 分離が良好となる。 エマルションの調製に必要な架橋性ポリマーと架橋条件の選択は、当業者の知 識に基づいて行うことができる。例えば、デキストランはアクリル酸メチルやメ タクリル酸エステルと架橋することができる。別の例としては、ＰＶＰを外相、 イソシアネートの存在下で架橋されたデキストランを乳化相として包含するシス テムが挙げられる。 次に、放射線による架橋反応について説明する。Dex-GMAは、例えば、少量の γ線（例えば、0.1Mrad以下）の照射によって重合することができる。この態様 の利点は、滅菌された微粒子を１つの工程で得られる点である。又、紫外線照射 による架橋や、物理的な架橋、例えば、ポリマーに疎水性末端を付与することに よる架橋も可能である。 本発明の好ましい態様においては、架橋性ポリマーはポリ−Ｎ−イソプロピル アクリルアミドのような温度感受性のポリマーであり、このようなポリマーは、 例えばデキストランのような他のポリマーにグラフト共重合したものでもよい。 このようなポリマーのヒドロゲルは、 温度の低下に従って膨張性を高めるので、放出可能な物質を架橋反応後のヒドロ ゲルに浸透させることは容易である。架橋反応に次いで温度を上昇させる（例え ば３７℃にする）と、ヒドロゲルのメッシュが縮み、放出可能な化合物がヒドロ ゲルに封入される。 水性連続相に存在するポリマーは、架橋性ポリマーとの相溶性を有しないもの であれば特に限定されない。連続相のポリマーも架橋性であってもよいが、当然 のことながら、不連続ポリマー相の架橋反応条件において架橋するポリマーは好 ましくない。架橋されるポリマーと相溶性を示さないポリマーの好ましい例とし ては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリビニルアルコール（ＰＶＡ） が挙げられる(いずれのポリマーも、デキストラン及びデキストラン誘導体；デ ンプン及びデンプン誘導体；ＰＶＰ及び水溶性セルロース誘導体と組み合わせて 用いることができる)。 放出可能な化合物の放出は、多数の可変因子に依存するので、所望のデリバリ ーシステムを調製する際に利用することができる。このような因子のひとつは、 ミクロスフェアのサイズである。乳化工程において、乳化条件や原料の配合にか かわるパラメーターを注意深く変えることによって、ミクロスフェアのサイズを 調整することができる。例えば、含水率、用いられるポリマーのいずれか一つ又 はポリマー混合物上の 疎水性基の存在、連続及び不連続相の粘度、そして使用する少なくとも二つのポ リマーの電荷は、生成されるミクロスフェア又は微粒子のサイズを調整する手段 となる。更に、乳化剤を加えることもできる。適当な乳化剤は、共重合体、好ま しくは、二相系を生じさせるのに用いられる二つの非相溶性ポリマー単位からな るブロック共重合体、例えばPEGとデキストランのブロック共重合体である。 更に制御された放出を保証するために、架橋ポリマーは分解可能なものが好ま しい。 上記したように、二種のポリマーのおのおのの水性溶液を混合して二相系を得 るためには、二種の水溶性ポリマーがお互いに非相溶であることが重要である。 二相系が得られるか否かは、含まれる二つのポリマーの性質に依存するだけでな く、それらを混合する際の条件にも依存する。この点に関与する因子としては、 ポリマーの分子量、ポリマーの水性溶液の濃度、ポリマー水溶液を混合する際の 温度等が挙げられる。使用できるポリマーの組み合わせについて、相ダイアグラ ムを決定し、それに基づいて相分離を得るための適当な条件を選択することは、 標準的な当業者の知識で可能である。 添付した図９に、水／ＰＥＧ／デキストランの三成分系の相ダイアグラムを例 示した。出発組成が双節曲線（binodal）（---）の下にあるときは、一つの相が 存在する。一方、出発組成が双節曲線の上にあるときは、二つの共存する相、即 ち、ポリマー１が高濃度の相（組成ｘ₁）及びポリマー２が高濃度の相（組成ｘ₂ ）が形成される。Ｘ₁及びＸ₂は連結線(tie-line)（＿）で連結されている。同一 の連結線上の組成から出発した全ての系は、一定の組成の相に分離する。ある出 発組成については、共存する相Ｘ₁／Ｘ₂の容量比は、Ｙ₂／Ｙ₁に等しい。 上記したように、放出可能な化合物はタンパク性薬物でもよいが、微小粒子又 は微粒子を含有する薬剤、例えば、リポソームや免疫剌激物質複合体(iscom；"i mmuno stimulating complex"の略)を被包することもまた可能である。この種の 粒子の被包化は、被包された化合物の早すぎる放出の発生を防止する利点がある 。別な言葉で言えば、バースト効果(burst-effect)がより確実な方法で回避でき る。 放出される化合物の分配は、主に水性二相系に存在するポリマーの性質によっ て決定される。この分配は、例えば水性系に塩類を加えることや、ｐＨを調整す ることによって影響される。 架橋工程において、反応液にタンパク質などの放出可能な化合物が存在する場 合には、放出可能な化合物の構造が完全に維持されるように注意を払われなけれ ばならない。例えば、タンパク様物質が架橋開始剤からなる系等によって酸化さ れることは避けねばならない。この点に関しては、開始剤の量を最小化したり、 重合時間を短くしたり、α−トコフェロー ル等の適当な抗酸化剤を加えることにより、好ましくない復反応を回避又は最低 減に押さえることが可能であることに留意すべきである。 他の相から放出可能な化合物を内包する架橋構造を分離するには、従来から用 いられている方法によって行うことができる。分離は、好ましくはろ過又は遠心 分離によって行われる。得られた架橋構造は、次に水洗し、乾燥される。乾燥工 程を行うことによって、二年以上の保存期間を有する、薬理学的に許容可能な製 品が決定付けられる。非常に好ましい乾燥方法はスプレー乾燥であるが、凍結乾 燥を用いても好ましく実施することができる。 本発明の調製方法について、以下に示す水中水型（water-in-water）エマルシ ョン法を使用したデキストラン・ミクロスフェアの調製と、本発明を限定するこ とのない実施例によって詳細に説明する。 実施例 実施例１ 種々の分子量のポリエチレングリコール（PEG）は、いずれもドイツ国メルク 社製のものを用いた。グリシジルメタクリレートにより誘導体化したデキストラ ン（Dex-GMA）は、Dijk-Wolthuisらの方法（Macromolecules 28,(1995)6317-632 2を参照）に実質的に基づき、N,N-ジメチルアミノピリジン（DMAP）を触媒とし て、ジメチルスルホキシド（DMSO）中でデキストランＴ４０とグリシジルメタク リレートをカップリングさせることにより合成した。尚、Dex-GMAは種々の置換 度（以下、屡々、「DS」と略記する；「置換度(DS)」とは、グルコピラノース単 位１００残基当たりのメタクリレート基の数を表わす）を有するものを用いた。 ポリエチレングリコールにより誘導体化したデキストラン（Dex-PEG）は、以 下の方法により合成した。モノメトキシポリエチレングリコール（mPEG；分子量 5000g/mol、５ｇ、水酸基として１mmolに相当）とカルボニルジイミダゾール（C DI；162mg、１mmol）を100mlの無水テトラヒドロフラン（THF）に溶解し、得ら れた溶液を室温で一晩攪拌した後、減圧下で溶媒を留去して、カルボニルイミダ ゾール（CI）活性化mPEGを得た。50mlのDMSOに1.7ｇのデキストランＴ４０と0.3 5gのDMAPを溶かした溶液に、上記で得られたCI活性化mPEGを添加し、得られた溶 液を室温で一週間攪拌して 反応混合物を得た。得られた反応混合物中のDMAPをHClで中和し、水に対する透 析を十分に行った後、凍結乾燥して生成物（Dex-PEG）を得た。生成物の特性は 、ゲル浸透クロマトグラフィーとＮＭＲによって求めた。置換度（DS）は４であ った。 Dex-lactate-HEMA(DS=3)は、欧州特許出願第96201821.4号明細書（審査中）に 記載の方法によって調製した。 ポリエチレングリコール（PEG、種々の分子量を有するものを用いた）を0.22M KCl水溶液に溶解し、含有量が12〜40重量％とのPEG溶液を調製した。上記で調 製したDex-GMAを0.22M KCl水溶液に溶解し、含有量が10〜40重量％とのDex-GMA 溶液を調製した。調製したPEG溶液とDex-GMA溶液をそれぞれ窒素ガスで１０分間 フラッシュ（flush）した。次に、PEG溶液4.75mlとDex-GMA溶液0.25mlを混合し た後、１分間ボルテックスにかけて攪拌した（vortexed）(Winn Voltex-Genie社 製の装置を最高速度で使用した)。その結果、デキストランが内相、PEGが外相と なっている水中水型エマルションが得れた。 N,N,N',N'-テトラメチルエチレンジアミン(TMEDA)を0.22M KCl水溶液（濃塩酸 によりpH７に調整）に溶解して得られた20容量％のTMEDA溶液100μｌと、ペルオ キシ二硫酸カリウム（KPS）の水溶液（濃度：50mg/ml）180μｌを、ボルテック ス終了から１０分後に水中水型エマルションに添加し、 ３７℃で３０分間インキュベートして、Dex-GMA(のメタクリレート基)を重合さ せて、ミクロスフェアを得た。得られたミクロスフェアを２回水洗した後、凍結 乾燥した。 In vitroの培養細胞を用いた実験により、Dex-GMAの細胞毒性は、デキストラ ンの細胞毒性と同様に低いことが判明した。尚、デキストランは、長年にわたり ヒト用の代用血漿（plasma replacing agent）として用いられている化合物であ る。 上記で調製したミクロスフェアの粒径[数平均粒径（=Σnd/Σn）及び体積平均 粒径（=Σnd⁴/Σnd³)][I．C.Edmonson著、Particle-size analysis、H．S．Bean 、A．H.Becket及びJ．E．Carlesら編、Advances in Pharmaceutical Sciences v ol．２(ロンドン市、Academic Press社発行、1967年)、95〜174頁を参照]と粒度 分布をレーザー遮光法(laser light blocking technique)［米国カリフォルニア 州サンタバーバラ市、パーティクルサイジングシステムズ社製のアキュサイザー （Accusizer、登録商標）７７０型を使用］により測定した。ミクロスフェアの 形状及び表面特性（多孔度）は、走査型電子顕微鏡（SEM）分析により求めた。 図１は、水中水型エマルション法によって調製したデキストラン・ミクロスフ ェアのバッチにおける粒径分布（上記アキュサイザーを用いて測定した）の典型 的な結果の一例を示す。 ＳＥＭ分析の結果、上記の方法で得られる粒子は完全な球形であり、多孔性で はないことが分かった(図２)。 図３は、デキストラン・ミクロスフェアの体積平均粒径を、デキストランミク ロスフェア調製に用いたDex-GMAの置換度（DS）及びPEGの分子量の関数としてグ ラフに示したものである。ここでは、PEG溶液におけるPEGの濃度を２４重量％と し、Dex-GMA溶液におけるDex-GMAの濃度を２０重量％とした。PEGの分子量の減 少に伴い、デキストラン・ミクロスフェアの粒径が増大することが明らかとなっ た。またPEGの分子量が一定の場合、Dex-GMAのDSの増加に伴い、デキストラン・ ミクロスフェアの粒径はわずかながら減少する。 図４は、デキストラン・ミクロスフェアの体積平均粒径を、デキストラン・ミ クロスフェア調製に用いたDex-GMAの置換度（DS）及びDex-GMA溶液におけるDex- GMAの濃度の関数としてグラフに示したものである。Dex-GMAの濃度の減少に伴い 、デキストラン・ミクロスフェアの平均粒径は減少する。 図５は、デキストラン・ミクロスフェアの体積平均粒径に対する、PEGの濃度 及び分子量の影響を示したものである。ここでは、DS=８のDex-GMAを用い、Dex- GMA溶液におけるDex-GMAの濃度（0.22M KCl水溶液中）を２０重量％とした。こ こで用いられたPEGに関しては、PEGの濃度が２４重量％前後のときに、粒径が最 大となることが判明した。 実施例２ 実施例１で用いたボルテックスの代わりに機械的攪拌器を使用し、水中水型エ マルションを調製した。２０重量％dex-GMA溶液(DS=4,7,13又は30のDex-GMAを0. 22M KCl水溶液に溶解したもの)を、２４％PEG溶液(種々の分子量のPEGを用い、0 .22M KCl水溶液に溶解したもの)に添加し、窒素ガス気流下で５分間機械的に攪 拌した(PEG相の粘度に応じて、攪拌速度は600〜1,000rpmの範囲内で調整した)。 次いで、得られた水中水型エマルションに、１mlのTEMED溶液（N,N,N',N'−テ トラメチレンジアミンの0.22M KCl水溶液、濃度：20容量％、濃塩酸によりpH7.2 に調整）と1.8mlのKPS(ペルオキシ二硫酸カリウム)の水溶液（濃度：50mg/ml） を添加し、３７℃で３０分間インキュベートしてdex-GMAを重合させ、ミクロス フェアを得た。 ボルテックス法の代わりに機械的攪拌法を用した場合、ミクロスフェアの粒径 は僅かに大きくなった(図５参照)。 実施例３ 実施例１の方法に従い、下記の表に示した組成からなるミクロスフェアをそれ ぞれ調製した。尚、ミクロスフェアの調製は、下記の原液を用いて行った： いずれの原液も0.22M KCl水溶液からなる溶液であり、濃度は重量％で示した 。 A.PEG 10，000、24% B.PEG 20,000、24% C.Dex-GMA(DS=13)、20% D.Dex-lactHEMA(DS=3)、20% E.Dex-lactHEMA(DS=3)、10% F.Dex-PEG、20%表１ 結果のまとめ ： 上記から明らかなように、好適な乳化剤（デキストランとPEGのブロック共重 合体）を用いることにより、粒径と分散度(＝体積平均粒径／数平均粒径）を小 さくすることができる。 実施例４ 非分解性のデキストラン・ミクロスフェア及び分解性のミクロスフェアからの 、モデルとなるタンパク質の放出を評価した。Dex-GMAミクロスフェアにデキス トラン分解酵素を取り込むことにより、ミクロスフェアに分解能を付与した。 Dex-GMA（DS=8）を、10mMリン酸緩衝液（pH8.0）に溶解した。この溶液2.0ml に、一定量のIgG（イムノグロブリンGを25.6mg）と種々の量のデキストラン分解 酵素（シグマ社のD1508を0、0.1及び1U；1Uは、37℃，pH6.0の条件下で、１分間 に還元オリゴ糖類を分解する活性である）を添加して混合溶液を得た。得られた 混合溶液をPEGの0.22M KCl水溶液（分子量10,000；濃度：２４重量％）中に乳化 した。次いで、TEMED（N,N,N,'N'−テトラメチレンジアミン）の0.22M KCl水溶 液（濃度：２０容量％、濃塩酸によりpH7.2に調整）100μｌと、KPS（ペルオキ シ二硫酸カリウム）の水溶液（濃度：50mg/ml）180μｌを添加してミクロスフェ アを得た。得られたミクロスフェアを水洗した後、窒素ガス気流下で乾燥させた 。 正確に秤量したミクロスフィア（0.3〜0.5g）をpH5.5のリン酸緩衝液10mlに懸 濁し、緩衝液中に放出されるタンパク質の量をBiorad protein assay[M．Bradfo rd著，Anal．Biochem．72（1976）248-254頁を参照]を用いて測定した。タンパ ク質の放出経過（releaseprofile）を図７に示す。この図から明らかなように、 デキストラン・ミクロスフェアからのIgGの放出は、デキストラン分解酵素によ って制御することができる。 実施例５ 分解性デキストランミクロスフェアからのタンパク質(IgG)の放出を評価した 。ミクロスフェアの分解は、タンパク質と共に被包したデキストラン分解酵素に よって行った。 メタクリル酸グリシジルを用いて誘導体化されたデキストラン(Ds=8、138mg) を612μｌの緩衝液（リン酸塩10mM,塩化カリウム220mM、pH8.0)に溶解した。そ の後、250μｌのIgG水溶液（50mg/ml）及び250μｌのデキストラン分解酵素水溶 液（種々の濃度で用いた）を添加した。IgGとデキストラン分解酵素はいずれも 同じ緩衝液（リン酸塩10mM、塩化カリウム220mM、pH8.0）に溶解したものを用い た。 次に、上記で得られたdexMA、IgG及びデキストラン分解酵素からなる溶液500 μｌを、上記の緩衝液を用いて調製した5mlのPEG水溶液（分子量10,000ｇ／mol ；濃度：17.5、24または30重量％）に添加し、相分離した系を得た。得られた系 を１分間ボルテックスにかけて攪拌し、次いで、180μｌの過酸化二硫酸カリウ ム溶液（50mg/ml；リン酸塩緩衝液に溶解）及びTEMED溶液（20容量％；塩酸でpH 8.0に調整）を添加した。次に、試料を３７℃で３０分間インキュベートして、d exMAを重合して粒子を得た。遠心分離により粒子を回収し、水洗した。 得られた粒子を再び緩衝液（酢酸アンモニウム5mM、pH5.5）に懸濁して、３７ ℃でインキュベートした。周期的に粒子の一部をサンプルとして取り出して、そ のタンパク量を測 定した(Biorad assayを用いた)。 図８にタンパク質の放出経過を示す。デキストラン分解酵素が存在しない場合 、累積放出量は１０％未満であり、たんぱく質の流体力学的直径はヒドロゲルの メッシュサイズより大きいことが分かった。更に、放出速度は粒子中のデキスト ラン分解酵素の量が多くなるほど速くなる。粒子中のデキストラン分解酵素の量 が多くなると、分解速度も速くなる。これは、ヒドロゲル・マトリックスの分解 速度に基づき、デキストラン粒子に取り込まれたタンパク質の放出が調整できる ことを意味する。マトリックスの分解は、酵素（デキストラン分解酵素）の添加 、または架橋中に易加水分解性のスペーサ（例えば乳酸エステル）を導入するこ とによって行うことができる。 比較例 デキストラン鎖がアクリル基で変性され、Ｍｗが40,000のデキストラン5gを水 45mlに溶解して第一の溶液を得た。次に、Ｍｗが6,000のポリエチレングリコー ル7gを水45mlに溶解して第二の溶液を調製した。 室温で第一の溶液を第二の溶液に攪拌しながら添加した。その結果、一相系が 得られ、ミクロスフェアは形成されなかった。本比較例は、二相系を得るために は、出発物質の分子量及び濃度を選択する必要があることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ 【要約の続き】 の孔径が放出可能な化合物の粒径よりも小さいことを特 徴とするミクロスフェアに関する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）少なくとも２種の水溶性ポリマーと少なくとも１種の放出可能な化合 物から水性二相系を形成する工程であって、但し、該少なくとも２種の水溶性ポ リマーはおのおの溶解状態において互いに非相溶であり、且つ該水溶性ポリマー の少なくとも１種が架橋性であって、該架橋性ポリマー相が他のポリマー相に乳 化するものであり、該少なくとも１種の放出可能な化合物は、水溶液中の該架橋 性ポリマー相に溶解可能なものであり、 （ｂ）該放出可能な化合物を該架橋性ポリマー相に溶解または拡散させる工程、 及び （ｃ）該架橋性ポリマーを架橋させて架橋構造を形成する架橋工程、 但し、工程（ｂ）は工程（ｃ）の前または後に行う、 ことを包含する制御型放出システムの調製方法。 ２．該架橋性ポリマーの架橋を、架橋構造中の孔径が上記放出可能な化合物のサ イズよりも実質的に小さくなる程度まで行うことを特徴とする、請求項１の調製 方法。 ３．架橋工程を行う前または後に、該架橋工程によって得られた架橋構造、また は該架橋工程によって得られる架橋構造 を分解できる酵素を、該水性二相系に添加することを特徴とする、請求項１また は２の調製方法。 ４．該架橋性ポリマーがデキストランポリマーであることを特徴とする、請求項 １〜３のいずれかに記載の調製方法。 ５．架橋工程を行う前または後に、デキストラン分解酵素を該水性二相系に添加 することを特徴とする、請求項４の調製方法。 ６．該水溶性ポリマーの一つがポリエチレングリコールであることを特徴とする 、請求項１〜５のいずれかに記載の調製方法。 ７．該架橋構造を他のポリマー相より分離することを特徴とする、請求項１〜６ のいずれかに記載の調製方法。 ８．ミクロスフェアであって、 粒径が１００ｎｍ〜１００μｍ、好ましくは５〜１５μｍのミクロスフェアが 全ミクロスフェアの重量に対して少なくとも８０重量％であり、 該ミクロスフェアは、少なくとも１種の放出可能な化合物を被包した分解可能 な架橋ポリマーからなり、且つ該架橋ポ リマーの孔径が放出可能な化合物の粒径よりも小さいことを特徴とするミクロス フェア。 ９．有機溶媒を含まないことを特徴とする、請求項８に記載のミクロスフェア。