JP2001510048A

JP2001510048A - 形質転換された酵母菌株と、モノターミナルおよびジターミナル脂肪族カルボキシレート生成のためのその使用

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Publication number: JP2001510048A
Application number: JP2000503220A
Authority: JP
Inventors: ロバートディー．ファーロン; マークエス．ペイン; スティーブンケー．ピカタジオ; シジュンウー
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 1997-07-21
Filing date: 1998-07-20
Publication date: 2001-07-31
Also published as: CA2293737A1; IL133931A0; WO1999004014A3; WO1999004014A2; AU8498298A; EP1003881A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、遺伝工学技術が施された生物を用いて、化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０）の脂肪族化合物をモノターミナルおよびジターミナルのカルボキシレートに変換するバイオプロセスからなる。本発明は、遺伝工学技術が施された酵母ピヒア・パストリスおよびＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃カンジダ・マルトサでアルカンヒドロキシル化活性を発現する方法に関係する。さらに、本発明は、増大されたチトクロームＰ４５０活性および／またはβ−酸化経路の遺伝子破壊を有した遺伝学的に形質転換されたカンジダ・マルトサ菌株を生成する方法について記述する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、遺伝学的に工学技術で設計された生物によって、ＣＨ₃（ＣＨ₂）_n ＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０）の化学式の脂肪族化合物をモノターミナルおよびジターミナルカルボキシレートへ変換するためのバイオプロセスである。本発
明はさらに、アルカンヒドロキシル化活性が高められおよび／またはカルボキシ
レートを生成するβ−酸化経路の遺伝子破壊を伴う酵母菌株に関する。

【０００２】（発明の背景）化学式ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＯＨ（ただし、ｎ＝７〜１６）で表さ
れる脂肪族化合物のジターミナルカルボキシレートはポリマー中間体として有用
であり（Ｕ．Ｓ．４，７６７，８２８）、防食化合物としても有用である（ＪＰ
０８１１３７７１）。化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣ（Ｏ）ＯＨ（ただし、ｎ＝７〜１６）で表される脂肪族化合物のモノターミナルカルボキシレートは界面活性
剤の中間体として有用である（米国特許第４，８６３，６１９号）。これらの化
合物は天然植物源から生成することができるが（Ｄａｌｅら、Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏ
ｏｄＡｇｒ．、６：１６２、（１９５５））、一般的にその化合物の精製によ
って多量の副産物を生じる。廃物である副産物を減少してこのような化合物が富
んだ形に合成する手段は、商業的に有用である。

【０００３】多くの酵母は、化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０）で表さ
れる脂肪族化合物を代謝することによって増殖することが知られている。例えば
、Ｋｌｕｇらの文献（Ａｄｖ．ｉｎＭｉｃｒｏｂｉａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇ
ｙ、５：１〜４３、（１９７１））を参照のこと。さらに、Ｍａｕｅｒｓｂｅｒ
ｇｅｒら（Ｎｏｎ−ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌＹｅａｓｔｓｉｎＢｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＡＨａｎｄｂｏｏｋ．ＫｌａｕｓｅＷｏｌｆ（ｅｄ．
）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９６））には、カン
ジダ・マルトサ（Ｃａｎｄｉｄａｍａｌｔｏｓａ）がＣ₆〜Ｃ₄₀の鎖長の脂肪族化合物で増殖できることが記載されている。現在までに調べられたすべての事
例において、脂肪族化合物での増殖は、一方または両方の末端メチル基をカルボ
キシレート形態に変換する特有の酵素工程に依存している。そのような変換の第
一段階は、酵母チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化系による末端メチル基のヒ
ドロキシル化である：２ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃＋Ｏ₂＋ＮＡＤＰＨ→２ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₂ＯＨ＋ＮＡＤ⁺（ただし、ｎ＝７〜１６）。

【０００４】そのようなヒドロキシル化系には、少なくとも３つの生物学的成分、すなわち
、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰ
ＨレダクターゼおよびＮＡＤＰＨが含まれている。チトクロームＰ４５０−ＮＡ
ＤＰＨレダクターゼは、ＮＡＤＰＨ（またはＮＡＤＰＨ）からチトクロームＰ４
５０モノオキシゲナーゼへ電子を移し、これを活性化する。酸素および脂肪族基
質の存在下において、活性化されたチトクロームＰ４５０は酸素と脂肪族基質と
の間の反応を触媒し、対応するアルコールを形成する。レダクターゼおよびチト
クロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ間の電子伝達には、２つの成分における適
切な構造上の配向が要求される。さらに、ＮＡＤＰＨの化学量的必要性は、ヒド
ロキシル化活性にはＮＡＤＰＨの連続的な供給が必要であることを意味している
。一般に、このＮＡＤＰＨの供給は生細胞の中央代謝プールから得られる。

【０００５】一般に、ヒドロキシル化された化合物はさらに代謝されて対応するモノターミ
ナルまたはジターミナルカルボキシレートとなり、これらは酵母増殖用のエネル
ギーおよび炭素を供給することができる（Ｋｌｕｇら、Ａｄｖ．ｉｎＭｉｃｒ
ｏｂｉａｌＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、５：１−４３、（１９７１））。二倍体酵
母であるカンジダ・マルトサは、β−酸化経路を介して炭素およびエネルギーを
取り出すことにより、単一炭素源としてのアルカンで増殖することができる。こ
の経路は非常に効率的なので、通常、野生型菌株は、アルカンで増殖している間
、ω−酸化を介してジカルボン酸を生成することはない。しかしながら、カルボ
キシレート生成率が生物の増殖必要量を超過する場合がある。適切な条件の下で
は、この過剰カルボキシレート生成物は増殖培地へ放出される。所望のカルボキ
シレート化合物を容易に分離し得るカルボキシレートに富む溶液を工業生産する
ため、脂肪族出発物質から得られるカルボキシレートの正味の生産を開発した。

【０００６】モノターミナルおよびジターミナルのカルボキシレートを生成するために酵母
を用いることは当該技術分野で知られている。ジターミナル酸の生産を行うため
、種々の天然型（「野生型」）菌株が開発されている。ＵＳ４，２７５，１５８
には、デバリオミセス・バンリジエ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓｖａｎｒｉｊ
ｉａｅ）ＡＴＣＣ２０５８８を用いて、脂肪族炭化水素または脂肪酸からＣ₁₀ 〜Ｃ₁₈のジターミナルカルボキシレートを生成することが記載されている。ＵＳ
４，２２０，７２０には、同様の目的にデバリオミセス・パフィ（Ｄｅｂａｒｙ
ｏｍｙｃｅｓｐｈａｆｆｉ）ＡＴＣＣ２０４９９を用いることが報告されて
いる。また、ＰｉｃｈｉａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａによるＣ₉〜Ｃ₁₉脂肪族炭化水素からのジターミナルカルボキシレートの生成（ＪＰ７００２４３９２）や
カンジダ・クロアシエ（Ｃａｎｄｉｄａｃｌｏａｃａｅ）によるカルボキシレ
ートの生成（ＪＰ７６００６７５０）を含むこのようなカルボキシレートの生
成に対して、他の天然の菌株を用いることが報告されている。

【０００７】カンジダ・マルトサを含むほとんどの酵母による発酵で生成されたジターミナ
ルカルボキシレートは、ほとんどの場合、１対または複数対の炭素原子だけもと
の脂肪族基質より短く、混合物が一般である（Ｏｇｉｎｏら、Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２９：１００９−１０１５（１９６５）；Ｓｈｉｉｏら、Ａｒｇ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３５：２０３３−２０１２（１９７１）；Ｈｉｌｌら
、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１６８−１７
４（１９８６））。鎖が短くなるのは、対応するアシル−ＣｏＡエステルへの活
性化の後に、ペルオキシソームβ−酸化経路によって、基質および生成物が分解
されるためである。β−酸化作用（脂肪酸）経路の最初の工程にはアシルＣｏＡ
エステルからそのエノイル−ＣｏＡへの酸化が含まれ、アシル−ＣｏＡオキシダ
ーゼにより触媒される。さらに、エノイル−ＣｏＡは、エノイル−ＣｏＡヒドラ
ターゼおよびβ−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの作用によってβ
−ケトアシル−ＣｏＡまで代謝される。β−酸化経路の第４工程および最終工程
はアシル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（より一般的にはアシル−ＣｏＡ
チオラーゼと呼ばれる）によって触媒され、β−ケトアシル−ＣｏＡと遊離コエ
ンザイムＡの分子との反応を促進し、アセチルＣｏＡのような原料脂肪酸のカル
ボキシ末端の２つの炭素断片を加水分解する。

【０００８】これら後半の反応において部分的な妨害をもたらす遺伝子突然変異により、不
飽和の副産物またはヒドロキシル化された副産物が生成される（Ｍｅｕｓｓｄｏ
ｅｒｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．− ＷｏｒｌｄＣｏｎｆ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．ＦａｔｓＯｉｌｓＩｎｄ．、１４２−１４７（１９８８））。これらの好
ましくない副産物は、ジターミナルカルボキシレートの生物学的生産に関係して
いることが多い。増殖必要量より過剰にカルボキシレートの生産を増大する典型
的突然変異誘発または遺伝工学によって生成した突然変異体が先行技術で報告さ
れている。カンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）
（ＥＰ２２９２５２、ＤＥ３９２９３３７、ＤＥ４０１９１６６）、カン
ジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（ＤＥ３９２
９３３７、ＤＥ４０１９１６６、ＥＰ２９６５０６、ＥＰ３１６０７２、
ＵＳ５，２５４，４６６）、ピヒア・カルボフェラ（Ｐｉｃｈｉａｃａｒｂ
ｏｆｅｌａｓ）（ＪＰ５７１２９６９４）、トルロプシス・カンジダ（Ｔｏｒ
ｕｌｏｐｓｉｓＣａｎｄｉｄａ）（ＪＰ５２０１８８８５）およびトルロプ
シス・ボンビコラ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓｂｏｍｂｉｃｏｌａ）（ＵＳ３，
７９６，６３０）の突然変異体が記述されている。その正常な物質代謝の一部と
して所望のカルボキシレートを消費する酵母の能力を減じた場合に、過剰のカル
ボキシレートの生産を増大することができた。アルカン、脂肪酸またはジカルボ
ン酸の基質で増殖する能力を一部に欠損している突然変異体はしばしば、ジカル
ボン酸収量の増大を示す。しかしながら、ほとんどの突然変異体は、増殖のため
の炭素源としてこれらの化合物を用いる能力が減少することの他は、特性決定さ
れていない。おそらく、ジターミナルカルボキシレートの産生能力は、β−酸化
経路の部分的な阻害より増大するのである。さらに、β−酸化を阻害することが
知られた化合物（すなわちアクリレート）も、ジターミナルカルボキシレート収
量を増加する。

【０００９】カルボキシレートを生成するための生物触媒に関しては、アシル−ＣｏＡオキ
シダーゼにより触媒される第一の反応においてβ−酸化経路を効果的に阻害する
ことが望ましい。この工程で完全に阻害することにより、β−酸化経路によるジ
ターミナルカルボキシレート生成物の再利用が防止される一方、ω−酸化経路へ
基質を再び送ることによって、ジターミナルカルボキシレートの収量が増大する
。さらに、そのような突然変異体の使用は、不飽和、水酸化または鎖短縮化など
のβ−酸化経路に関連した好ましくない鎖の修飾を防ぐ。カンジダ・マルトサで
は、アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする（Ｍａｓｕｄａら、Ｇｅｎｅ、１６
７：１５７−１６１（１９９５））双方のＰＯＸ４遺伝子を不活性化することに
よりβ−酸化経路を機能的に阻害して、代謝の流れをミクロソームのω−酸化経
路へ再び向かわせ、それにより所望のカルボキシレートの収量が増加することが
できる。

【００１０】Ｐｉｃｈｉａ属酵母の標的遺伝子を破壊する方法がＥＰ２２６７５２に開示さ
れている。さらに、ＵＳ５，２５４，４６６には、カンジダ・トロピカリス（Ｃ
ａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の遺伝工学を介してカルボキシレートの
消費を完全に阻害する方法が主張されている。市販の生物触媒としてのカンジダ
・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）およびカンジダ・マ
ルトサとの間に著しい違いがあることを立証する多くの科学的根拠がある（後掲
）。さらに、増殖のために脂肪族炭化水素を代謝するカンジダ・マルトサの多く
の菌株が記述されている（Ｂｏｓら、ＡｎｔｏｎｉｖａｎＬｅｅｕｗｅｎｈ
ｏｅｋ、３９：９９〜１０７、（１９７３））。しかしながら、先行技術には、
モノターミナルまたはジターミナルカルボキシレートを生成するために、カンジ
ダ・マルトサを用いる報告はない。

【００１１】 β−酸化経路の阻害に加えて、最近、酵母において過剰のカルボキシレートの
生成を増大する別の方法が可能なルートとして別のストラテジーが報告されてい
る。消費を阻害するのではなく、チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化活性を増
大することによってカルボキシレートの生成を増大することが行われた。ＤＥ１
９５０７５４６には、通常、脂肪族炭化水素または脂肪酸をヒドロキシル化でき
ない酵母であるＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるア
ルカンヒドロキシル化チトクロームＰ４５０系の発現が開示されている。迅速に
カルボキシレートを消費するための正常な経路が欠損している場合、この酵母で
アルカンチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を増大することにより、
カルボキシレートが当然な蓄積される。しかしながら、この菌株におけるチトク
ロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性は、酸素による毒作用に対して異常に感
受性あるようだが（Ｚｉｍｍｅｒｅｔら、ＤＮＡ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇ
ｙ、１４：６１９〜６２８、（１９９５））、このことはおそらくこの遺伝学的
に操作された菌株に必要な構造保全が欠損していることを示している。

【００１２】ＷＯ９１１４７８１には、遺伝工学によってカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎ
ｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）におけるチトクロームＰ４５０ヒドロキシル
化系を増幅する方法が説明してある。ある程度のカルボキシレート生成の増大は
確認されたが、チトクロームＰ４５０酵素の発現は不十分であり、活性の改良は
完全にはうまくいかなかった（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、１０：８９４〜８９８、（１９９２））。さらに、ドイツ特許ＤＥ３
９２９３３７には、選択的試薬であり１−ドデシンを用いてチトクロームＰ４５
０モノオキシゲナーゼ活性およびジカルボキシレート生成を改良した突然変異体
の選択の制限的な成功例が記述されている。

【００１３】野生型のカンジダ・マルトサ菌株のＩＡＭ１２２４７およびＡＴＣＣ２８１４
０は同等の生物である。それらは、応用微生物学研究所（日本、東京、東京大学
）およびアメリカ基準菌株保存機構（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）からそれぞ
れ入手可能である。菌株ＡＴＣＣ９０６２５およびＡＴＣＣ９０６７７はＩＡＭ
１２２４７に由来し、栄養性マーカ突然変異ａｄｅ１、ｈｉｓ５（９０６２５）
およびａｄｅ１、ｈｉｓ５、ｕｒａ３（９０６７７）を含んでいる。これらの菌
株はともに、アメリカ基準菌株保存機構の１９９５年酵母参照ガイド第１９版に
より入手可能である。

【００１４】最近の報告には、カンジダ・マルトサＩＡＭ１２２４７／ＡＴＣＣ２８１４
０由来のチトクロームＰ４５０レダクターゼだけでなく、多くのアルカンチトク
ロームＰ４５０モノオキシダーゼに関するＤＮＡ配列情報についての記載がある
（Ｏｈｋｕｍａら、ＤＮＡ＆ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ、１４：１６３〜１
７３、（１９９５）、およびＫａｒｇｅｌら、Ｙｅａｓｔ、１２：３３３〜３
４８、（１９９６））。カンジダ・マルトサについては、異なる基質特異性を有
する少なくとも８つの構造的に異なるチトクロームＰ４５０が同定された。これ
らの完全な膜タンパク質の各々は、モノオキシゲナーゼ反応を触媒するために、
チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼを介してＮＡＤＰＨからの電子
伝達を必要とする。

【００１５】通常、これらのような突然変異マーカー菌株を遺伝子形質転換に用いる。しか
しながら、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）
におけるＰ４５０モノオキシゲナーゼ系の相同発現についての現在までに報告さ
れた限定的な成功を考えると、カンジダ・マルトサでそのような生物触媒を開発
することができるかどうかは確かではなかった。

【００１６】カンジダ・マルトサに基づいてドデカンジオン酸（ＤＤＤＡ）を生成するため
の生物触媒はカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
）に基づくものとは明らかに異なるという証拠がたくさんある。これらの酵母は
酵母分類群の分野で異なる２つの種であり、分子レベルおよび生化学レベルにお
いて２つの種の間に顕著な違いが存在する（Ｍｅｙｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．、１０４：２２５〜２３１（１９７５））。それらの分類の重要性
のみならずこれらの違いは実用的な意味合いを持つ。

【００１７】カンジダ・マルトサはデンプンで増殖することができない。カンジダ・トロピ
カリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）はデンプンで増殖することが
可能である。カンジダ・マルトサは高濃度のシクロヘキアミドに対し通常耐性が
あるが、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）は
耐性がない。カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
）はヒト疾病に関係していることが多いが、カンジダ・マルトサは関係していな
い。

【００１８】これらの差異は、工業過程における生物触媒としての生物の有用性に影響する
。デンプンはゆるやかにグルコースを遊離する安価な原料であり、カンジダ・ト
ロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）によってＤＤＤＡを生産
するにあたって有効な共基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）である。カンジダ・
マルトサにとってはデンプンは共存基質として選択され得る物質ではない。シク
ロヘキサミドに対するカンジダ・マルトサの非感受性により、酵母遺伝工学で利
用可能な少数の抗生物質選択技術の１つを用いることができないことになる。

【００１９】分子の比較でも、２つの種は互いに異なる。種間の進化的隔たりを評価するの
に広く認められている方法の一つは、小リボソームＲＮＡサブユニット（１８Ｓ
）に対するＤＮＡ配列比較に基づくものである。現在まで、カンジダ・マルトサ
およびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）間を
比較すると、これらの配列において高い類似性（すなわち≧９４％）を示してい
た（Ｏｈｋｕｍａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７
：１７９３〜１７９４（１９９３）、Ｐｅｓｏｌｅら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４
１：９０３〜９０７（１９９５）、Ｃａｉら、ＩｎｔｅｒｎａｌＪ．Ｓｙｓ．
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．、４６：５４２〜５４９（１９９６））。しかしながら、
アルカン酸化過程の鍵となる酵素（チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼお
よびチトクロームＰ４５０レダクターゼ）のＧｅｎＢａｎｋ配列を比較すると、
１８ＳＲＮＡ遺伝子比較による相違よりこれらの遺伝子における相違の方が大
きいことがわかる。チトクロームＰ４５０レダクターゼについては、ＤＮＡ配列
類似性はわずか８３％である。チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼについ
ては、７つの遺伝子を比較による７つの遺伝子の最大ＤＮＡ配列類似性はわずか
に７７％である。チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ配列比較のほとんど
は７０％未満である。このことは、アルカン酸化過程にとって重要な遺伝子は選
択圧下にあり、これら２つの異なる種において別々に進化してきたことを示唆し
ている。実際、マイヤーら（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１０４：２２５〜
２３１（１９７５））は、２つの種が異なった生態的地位を占めるようであるこ
とを報告している。カンジダ・マルトサは炭化水素が混入している環境でしか見
つからない。カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ
）は、炭化水素が混入している環境で増殖することができるが、温血動物に関連
して発見されることが多い。最終的に、全ゲノムＤＮＡ再対合試験により、カン
ジダ・マルトサおよびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃ
ａｌｉｓ）が全部で４０％未満のＤＮＡ類似性を有していることが示された（Ｍ
ｅｙｅｒら、Ａｒｃｈ．ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ、１０４：２２５〜２３１（１９７
５））。カンジダ・マルトサおよびカンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ
ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）の分子生物学におけるそのような差異は、２つの生物由
来の遺伝子が同じ形式で作用するかどうかを不明確となものとしている。したが
って、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）でＰ
４５０系活性の増大をもたらした限定的な成功は、カンジダ・マルトサでの活性
の増大を成功に導くことを保証するものではない。いくつかのＰ４５０遺伝子の
相同的発現が増大されたことが実証されているが（Ｏｈｋｕｍａら、Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１２３６：１６３〜１６９（１９９５））
、カンジダ・マルトサにおいてＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性が増大されたと
いう報告はない。

【００２０】遺伝工学技術が施されたカンジダ・マルトサにおける活性Ｐ４５０モノオキシ
ゲナーゼ系の非常によい発現により、カルボキシレート生成のための有用な生物
触媒となり得る。現在まで、アルカンＰ４５０モノオキシゲナーゼ、脂肪酸モノ
オキシゲナーゼおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ発現を組
み合わせた発現が可能であるカンジダ・マルトサ形質転換体に関する報告は当該
技術分野では知られていない。

【００２１】（発明の概要）本発明は、遺伝学的に設計してアルカンヒドロキシル化活性を増大したことを
特徴とする形質転換されたピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ
ｓ）を、少なくとも１つの化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０
）のＣ₆〜Ｃ₂₂直鎖状炭化水素と好気条件下で接触させることによって、Ｃ₆〜Ｃ ₂₂ のモノカルボキシレートまたはジカルボキシレートをバイオプロダクションす
る方法に関する。

【００２２】本発明の別の態様は、遺伝学的に設計してアルカンヒドロキシル化活性を増大
したことを特徴とする形質転換されたカンジダ・マルトサを、少なくとも１つの
化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０）のＣ₆〜Ｃ₂₂直鎖状炭化水素と好気条件下で接触させることによって、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボキシレートまたはジカルボキシレートをバイオプロダクションする方法である。

【００２３】本発明のさらなる態様は、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード
する少なくとも１つの外来遺伝子およびチトクロームＰ４５０レダクターゼをコ
ードする少なくとも１つの外来遺伝子を含有し、該遺伝子はそれぞれアルカンヒ
ドロキシル化活性を増大するように適当な制御要素に操作可能的に結合されてい
る、形質転換されたピヒア・パストリスである。チトクロームＰ４５０をコード
する遺伝子は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５
８８１）、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６）、Ａ
ｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ７（Ｄ１
２７１９）およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）またはそれらに実質的に類似する遺
伝子からなる群から選択される。

【００２４】本発明のさらなる態様は、チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコード
する遺伝子のコピーをさらに少なくとも１つおよび／またはチトクロームＰ４５
０レダクターゼをコードする遺伝子のコピーをさらに少なくとも１つ含有し、該
遺伝子はそれぞれアルカンヒドロキシル化活性を増大するように適当な制御要素
に操作可能的に結合されている、形質転換されたカンジダ・マルトサである。さ
らに本発明は、カンジダ・マルトサホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロ
モータおよびターミネータへの正確な結合によって、主たるアルカンモノオキシ
ゲナーゼ（Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ）、脂肪酸モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０Ａｌ
ｋ３−Ａ）およびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼの発現の制御
を解除するよう設計された発現カセットの構築について記述する。

【００２５】本発明は、遺伝学的に設計してβ−酸化経路を阻害したことを特徴とする形質
転換されたカンジダ・マルトサを、少なくとも１つの化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０）のＣ₆〜Ｃ₂₂直鎖状炭化水素と好気条件下で接触さ
せることによって、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボキシレートまたはジカルボキシレートをバイオプロダクションする方法に関する。

【００２６】さらに本発明は、遺伝学的に設計してβ−酸化経路を阻害したこととアルカン
ヒドロキシル化活性を増大したこととを特徴とする形質転換されたカンジダ・マ
ルトサを、少なくとも１つの化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２
０）のＣ₆〜Ｃ₂₂直鎖状炭化水素と好気条件下で接触させることによって、Ｃ₆〜
Ｃ₂₂のモノカルボキシレートまたはジカルボキシレートをバイオプロダクション
する方法に関する。

【００２７】本発明のさらなる態様は、チトクロームＰ４５０活性を増大し、および／また
はβ−酸化経路において遺伝子破壊した、遺伝学的に設計したカンジダ・マルト
サ菌株である。

【００２８】本発明のさらなる態様は、新規のＤＮＡ断片である。これらの断片には、（ａ
）カンジダ・マルトサ由来のポリペプチドを少なくとも１つコードするＤＮＡに
操作可能的に結合された第１カンジダ・マルトサプロモータ、および（ｂ）カン
ジダ・マルトサ由来のポリペプチドを少なくとも１つコードするＤＮＡに操作可
能的に結合された第２カンジダ・マルトサプロモータが含まれる。第１カンジダ
・マルトサプロモータに結合している遺伝子はチトクロームＰ４５０モノオキシ
ゲナーゼをコードし、第２カンジダ・マルトサプロモータに結合している遺伝子
はチトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする。より好ましくは、第１カン
ジダ・マルトサプロモータはＰＧＫであり、チトクロームＰ４５０モノオキシゲ
ナーゼをコードする遺伝子はＡｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ
５５８８１）、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６）
、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ７（
Ｄ１２７１９）、またＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）である。

【００２９】（配列表記、生物学的寄託および図の簡単な説明）本発明は、以下の本明細書の一部を構成している詳細な説明、生物学的寄託、
配列表記および図面より詳しく理解することができる。

【００３０】出願人は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１１−１．８２５（「ヌクレオチド配
列および／またはアミノ酸配列の記述を含んでいる特許出願に対する要件−配列
規則（ＳｅｑｕｅｎｃｅＲｕｌｅｓ）−」）に従う、ＷＩＰＯの標準ＳＴ．２
５（１９９８）およびＰＣＴおよびＥＰＯの配列表の要件にも合致した配列リス
トを提供した。

【００３１】配列番号１は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼに対するセン
スプライマーを表わす。

【００３２】配列番号２は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼに対するアン
チセンスプライマーを表わす。

【００３３】配列番号３は、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子に対するセンスプラ
イマーを表わす。

【００３４】配列番号４は、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子に対するアンチセン
スプライマーを表わす。

【００３５】配列番号５は、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子に対するセンスプラ
イマーを表わす。

【００３６】配列番号６は、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子に対するアンチセン
スプライマーを表わす。

【００３７】配列番号７は、ＰＧＫプロモータに対するセンスプライマーを表わす。

【００３８】配列番号８は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子にＰＧＫプロモータの結合に対す
るアンチセンスプライマーを表わす。

【００３９】配列番号９は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の５’末端に対するセンスプライ
マーを表わす。

【００４０】配列番号１０は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の５’末端に対するアンチセン
スプライマーを表わす。

【００４１】配列番号１１は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の３’末端に対するセンスプラ
イマーを表わす。

【００４２】配列番号１２は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の３’末端に対するアンチセン
スプライマーを表わす。

【００４３】配列番号１３は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子へのＰＧＫターミネータの融合
に対するセンスプライマーを表わす。

【００４４】配列番号１４は、ＰＧＫターミネータに対するアンチセンスプライマーを表わ
す。

【００４５】配列番号１５は、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子へのＰＧＫプロモータの融合に
対するアンチセンスプライマーを表わす。

【００４６】配列番号１６は、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の５’末端に対するセンスプラ
イマーを表わす。

【００４７】配列番号１７は、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の５’末端に対するアンチセン
スプライマーを表わす。

【００４８】配列番号１８は、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の３’末端に対するセンスプラ
イマーを表わす。

【００４９】配列番号１９は、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の３’末端に対するアンチセン
スプライマーを表わす。

【００５０】配列番号２０は、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子へのＰＧＫターミネータの融合
に対するセンスプライマーを表わす。

【００５１】配列番号２１は、チトクロームＰ４５０−ＡＤＰＨレダクターゼ遺伝子へのＰ
ＧＫプロモータの融合に対するアンチセンスプライマーを表わす。

【００５２】配列番号２２は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ遺伝子の５
’末端に対するセンスプライマーを表わす。

【００５３】配列番号２３は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ遺伝子の５
’末端に対するアンチセンスプライマーを表わす。

【００５４】配列番号２４は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ遺伝子の３
’末端に対するセンスプライマーを表わす。

【００５５】配列番号２５は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ遺伝子の３
’末端に対するアンチセンスプライマーを表わす。

【００５６】配列番号２６は、チトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ遺伝子への
ＰＧＫターミネータの融合に対するセンスプライマーを表わす。

【００５７】配列番号２７は、カンジダ・マルトサＰＯＸ４遺伝子に対するセンスプライ
マーを表わす。

【００５８】配列番号２８は、カンジダ・マルトサＰＯＸ４遺伝子に対するアンチセンス
プライマーを表わす。

【００５９】配列番号２９は、カンジダ・マルトサＵＲＡ３遺伝子に対するセンスプライ
マーを表わす。

【００６０】配列番号３０は、カンジダ・マルトサＵＲＡ３遺伝子に対するアンチセンス
プライマーを表わす。

【００６１】配列番号３１は、カンジダ・マルトサＡＤＥ１遺伝子に対するセンスプライ
マーを表わす。

【００６２】配列番号３２は、カンジダ・マルトサＡＤＥ１遺伝子に対するアンチセンス
プライマーを表わす。

【００６３】配列番号３３は、カンジダ・マルトサＨＩＳ５遺伝子に対するセンスプライ
マーを表わす。

【００６４】配列番号３４は、カンジダ・マルトサＨＩＳ５遺伝子に対するアンチセンス
プライマーを表わす。

【００６５】出願人は、特許手続きのための微生物寄託の国際承認に関するブダペスト条約
の条項に従って、以下の生物学的寄託を行った。本明細書では、「ＡＴＣＣ」は
、米国、２０１１０−２２０９バージニア、マナッサス、大学通り１０８０１
に所在する国際寄託機関、アメリカ基準菌株保存機構（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙ
ｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のことを意味する。「ＡＴＣＣ
番号」は、ＡＴＣＣに寄託した際の培養物に対する受託番号である。

【００６６】

【００６７】ピヒア・パストリスＳＷ６４／６５は、メタノールの存在により誘導される場
合に、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のアルカンを対応する一塩基酸および二塩基酸に変換する活性アルカンチトクロームＰ４５０を生成することができる通常でない能力を有する
ピヒア・パストリス菌株として特徴付けすることができる。

【００６８】カンジダ・マルトサＳＷ８１／８２は、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のアルカンまたは単脂肪酸で増殖することができないという点で通常でないカンジダ・マルトサとして、ま
た、適当な炭素およびグリセロールのようなエネルギー源の存在下でＣ₆〜Ｃ₂₂ の一塩基酸またはアルカンから二塩基酸を生成するという能力において通常でな
いカンジダ・マルトサとして特徴付けすることができる。この菌株は破壊された
ＰＯＸ４遺伝子を含み、他の栄養要求性マーカは離れて存在する。この菌株はβ
−酸化が阻害されている。

【００６９】カンジダ・マルトサＳＷ８４／８７．２は、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のアルカンまたは単脂肪酸で増殖することができないという点で通常でないカンジダ・マルトサとして
、また、適当な炭素およびグリセロールのようなエネルギー源の存在下でＣ₆〜Ｃ₂₂の一塩基酸またはアルカンから二塩基酸を生成するという能力において通常
でないカンジダ・マルトサとして特徴付けすることができる。さらにＳＷ８４／
８７．２は、５ｇ／Ｌを越える濃度のグルコース存在下でＣ₆〜Ｃ₂₂のアルカンまたは一塩基酸を二塩基酸へ酸化する能力において通常でない。この菌株は増大
されたアルカンヒドロキシル化活性を発現し、破壊されたＰＯＸ４遺伝子を含ん
でいる。

【００７０】（発明の詳細な説明）本発明は、遺伝工学技術が施された生物を用いて、化学式ＣＨ₃（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（ただし、ｎ＝４〜２０）の脂肪族化合物をモノターミナルおよびジターミナルカルボキシレートに生物変換する方法を含む。本発明は、チトクロームＰ４
５０活性が増大し（アルカンＰ４５０モノオキシゲナーゼ、脂肪酸モノオキシゲ
ナーゼおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ発現を組み合わせ
て同時に発現することを含む）、および／または遺伝子破壊されたβ−酸化経路
を有する、形質転換されたカンジダ・マルトサ菌株について初めて記述する。さ
らに、野生型菌株の増殖およびアルカン利用の速度に基づいて、Ｐ４５０増大型
菌株またはβ−阻害型菌株いずれかの容量的生産性（ｇ生成物／Ｌ／ｈｒ）を改
良することが、経済的なバイオプロセスに求められている。したがって、これら
の２つの概念を組み合わせることによって、脂肪族基質からモノターミナルおよ
びジターミナルカルボキシレートを生成する優れた生物触媒を与える。本発明は
、所望カルボキシレートを商業的に実施し得る充分な量および変換効率で提供す
る。

【００７１】ある組み換え生物は、増大されたアルカンヒドロキシル化活性を発現する。末
端メチル基のヒドロキシル化は、アルカンヒドロキシル化活性によって起こる。
ヒドロキシル化活性の増大は、別々のまたは種々組み合わせた、アルカンモノオ
キシゲナーゼ、脂肪酸モノオキシゲナーゼまたはチトクロームＰ４５０レダクタ
ーゼの増大により生じる。さらなる酵素工程は、カルボキシレートの形態にさら
に酸化するために必要である。アルコールオキシダーゼ（Ｋｅｍｐら、Ａｐｐｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．およびＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２８：３７０（１９
８８））、およびアルコールデジドロゲナーゼによって触媒される２つのさらな
る酸化工程により、対応するカルボキシレートが生じる。

【００７２】別の組み換え生物はβ−酸化経路の遺伝子崩壊を有している。二倍体酵母であ
るカンジダ・マルトサは、β−酸化経路により炭素およびエネルギーを取り出す
ことによって、単一炭素源としてのアルカンで増殖する。この経路は非常に効率
的であるので、アルカンで増殖する間、通常、野生型菌株はω−酸化によりジカ
ルボン酸を生成することはない。ω−酸化経路への代謝の流れが増加するように
β−酸化経路を阻害すると、モノターミナルおよびジターミナルカルボキシレー
トへのアルカンの変換に関するバイオプロセスの収量および選択性が増加する。

【００７３】第３の組み換え生物は、増大されたアルカンヒドロキシル化活性およびβ−酸
化経路の遺伝子崩壊の両方を有している。ヒドロキシル化活性の増大は、別々の
または種々組み合わせた、アルカンモノオキシゲナーゼ、脂肪酸モノオキシゲナ
ーゼまたはチトクロームＰ４５０レダクターゼの増大により生じる。本発明の生
成物は、腐食防止剤化合物および界面活性剤の生成における中間体として有用で
ある。さらに詳しくは、本発明の方法および物質はドデカンジオン酸のバイオプ
ロダクションに有用である。バイオプロセスは、ポリマー等級および化学物質等
級のドデカンジオン酸への現在の化学経路に関連した中間体の製造および販売で
の融通性を良くする。特に、良好な選択性を伴って高収率が得られる。さらに、
その商業上のバイオプロセスを実施した際の環境への影響は、現在の化学プロセ
スよりも好ましいものと予想される。

【００７４】本明細書で用いた用語および略語は以下のように特定する。

【００７５】「還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド」はＮＡＤＰＨと略記する。

【００７６】「還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸」はＮＡＤＰＨと略記
する。

【００７７】「ＣａｎｄｉｄａｍａｌｌｏｓａＩＡＭ１２２４７チトクロームＰ４５
０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子」はＡｌｋ１−Ａと略記する。

【００７８】「ＣａｎｄｉｄａｍａｌｌｏｓａＩＡＭ１２２４７チトクロームＰ４５
０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子」はＡｌｋ３−Ａと略記する。

【００７９】「ＣａｎｄｉｄａｍａｌｌｏｓａチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダク
ターゼ遺伝子」はＰ４５０レダクターゼまたはＣＰＲと略記する。

【００８０】「カンジダ・マルトサアシルＣｏＡ遺伝子」はＰＯＸ４と略記する。

【００８１】「酵素オロチジン−５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼをコードする
カンジダ・マルトサＩＡＭ１２２４７ＵＲＡ３遺伝子コード」はＵＲＡ３と
略記する。

【００８２】「ホスホグリセロールキナーゼ」はＰＧＫと略記する。

【００８３】「アルコールオキシダーゼＩ」はＡＯＸ１と略記する。

【００８４】「ガスクロマトグラフィ」はＧＣと略記する。

【００８５】「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記する。

【００８６】「自律複製配列」はＡＲＳと略記する。

【００８７】「ドデカンジオン酸」はＤＤＤＡと略記する。

【００８８】「遺伝工学技術が施された」という用語は、細胞外での任意の手段により作成
または取り出した核酸分子を任意のウイルス、細菌性プラスミドまたは他のベク
ター系へ挿入ことにより遺伝物質の新しい組合わせを形成することであり、これ
らは宿主生物へ取り込まれて該宿主生物内で増殖し宿主生物の表現型を変化する
よう発現することとなる。

【００８９】「形質転換」という用語は、宿主生物のゲノムに核酸断片を移入して遺伝学的
に安定した遺伝形質を生じせさる遺伝子工学技術のことである。移入された核酸
断片を含む宿主生物は、「遺伝子組み換え」生物又は「形質転換」生物あるいは
形質転換体と称する。

【００９０】「核酸」という用語は、ヌクレオチドがリン酸塩架橋とともに結合している基
本単位である、生細胞中に存在する高分子量の複合化合物のことである。核酸は
リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の２種類に分けられる。

【００９１】「単離された核酸断片」は、合成されたまたは非天然のまたは変化しているヌ
クレオチド塩基を任意選択で含む、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの
ポリマーである。ＤＮＡポリマーの形態での単離された核酸断片は、１つ以上の
ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡからなっていてよい。

【００９２】「チトクロームＰ４５０」という用語は、多くの異なる生物学的ヒドロキシル
化反応に活性である広範囲に分布しているモノオキシゲナーゼのことであり、チ
トクロームＰ４５０ヒドロキシル化系の一成分である。

【００９３】「チトクロームＰ４５０レダクターゼ」という用語は、多くの異なる生物学的
ヒドロキシル化反応に活性である広範囲に分布しているレダクターゼのことであ
り、チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化系の一成分である。

【００９４】「阻害されたβ−酸化経路」または「β−阻害」という用語は、野生型のβ−
酸化経路の第１酵素であるアシルＣｏＡ酸化酵素を効果的に除去する遺伝子破壊
のことである。

【００９５】「変更されたレベル」とは、量または比率において、正常な生物、野生型生物
または非形質転換生物の遺伝子産物の生産とは異なる、生物での遺伝子産物の生
産のことである。生産は、正常な生物、野生型生物、非形質転換生物による生産
と相対比較して「増大」または「低下」と具体的に記載していることもある。

【００９６】「増大された」という用語は、本来的に観測されるものまたは本来的な機能を
上回る改良または増加のことである。アルカンヒドロキシル化活性の増大は、チ
トクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼおよび／またはチトクロームＰ４５０−
ＮＡＤＰＨレダクターゼをコードする遺伝子のさらなる少なくとも１つのコピー
（野生型と比較して）に関連している。

【００９７】「カセット」および「遺伝子カセット」という用語は、特有の構築物に意図的
にインビトロで接合または結合した多数のヌクレオチド配列のことである。「発
現カセット」は、プロモータ断片、選択された遺伝子産物用のＤＮＡ配列、およ
び転写ターミネータを特異的に含んでいる。

【００９８】「プラスミド」および「クローニングベクター」という用語は、通常は環状二
本鎖ＤＮＡ分子の形態をとり、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子
を持っている、染色体外要素に関する。そのような要素は、任意の起源に由来す
る一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの、直鎖状または環状の、自律複製
配列、ゲノム組み込み配列、ファージ配列であってよい。「自律複製配列」とい
う用語は、酵母中でプラスミドの自律複製を可能とする能力を有する染色体配列
のことである。

【００９９】「発現」という用語は、本発明の核酸断片に由来したセンス（ｍＲＮＡ）また
はアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積のことである。さらに、発現は
ポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳のことをさしてもよい。「過剰発現」とは、正
常な生物または非形質転換生物における生成レベルよりも過剰である遺伝子組み
換え生物での遺伝子産物の生成のことである。「共抑制」は、同一または実質的
に類似した外来遺伝子または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンス
ＲＮＡ転写産物の生成のことである（Ｕ．Ｓ．５，２３１，０２０）。

【０１００】「突然変異」という用語は、生物の遺伝形質を変化させる生物のＤＮＡの化学
変化に関する。そのような変化した特性を示す菌株を「突然変異体」と称する。

【０１０１】「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、一本鎖鋳型オリゴヌクレオ
チドの領域に対する塩基対である短いオリゴヌクレオチドに関する。プライマー
は、一本鎖ＤＮＡで相補鎖合成を生成するにあたって、ＤＮＡポリメラーゼに対
する開始点を形成するのに必要である。

【０１０２】「制限酵素」および「制限エンドヌクレアーゼ」という用語は、二本鎖ＤＮＡ
の特定のヌクレオチド配列内で加水分解性切断を触媒する酵素に関する。

【０１０３】「直鎖状炭化水素」という用語は、炭素骨格に０、１つまたは２つの二重結合
を含んでいる炭素数Ｃ₆〜Ｃ₂₂の脂肪族炭化水素、脂肪酸および脂肪酸エステルに関する。さらに、その用語は、末端炭素の一つがフェニル基で置換された上記
の任意の直鎖化合物を含んでいる。特に好ましい炭化水素は、ノナン、デカン、
ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカ
ン、ヘプタデカン、オクタデカン、またはそれら各々のモノカルボン酸である。好ましくは、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₄のアルカンである。特にドデカンが好ましい。

【０１０４】「アルカンヒドロキシル化活性」という用語は、チトクロームＰ４５０ヒドロ
キシル化系を用いて直鎖状炭化水素の末端のメチル基を酵素的にヒドロキシル化
する、酵母などの生物の能力に関する。「チトクロームＰ４５０ヒドロキシル化
系」という用語は、少なくとも以下の３つの生物学的成分からなるヒドロキシル
化系をいう：１）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ、２）チトクローム
Ｐ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ、および３）還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤＰＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドリン酸（ＮＡＤＰＨ）。

【０１０５】「遺伝子」は、コード配列より前の調節配列（５’非コード配列）およびコー
ド配列より後の調節配列（３’非コード配列）を含む、特定のタンパク質をコー
ドする核酸断片に関する。「天然遺伝子」は、それ自身の調節配列を有する天然
に見られる遺伝子に関する。「キメラ遺伝子」は、天然においては一緒には見ら
れない調節配列およびコード配列を含む、天然遺伝子でない任意の遺伝子に関す
る。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード
配列、または同一起源に由来する調節配列およびコード配列を含んでいてもよい
が、それらの配列は天然において見られる方法とは異なる方法でつくられたもの
である。「内因性遺伝子」は、生物のゲノム中において本来の位置にある天然遺
伝子に関する。「外来」遺伝子は、宿主生物で通常見つからない遺伝子に関する
が、これは遺伝子の導入によって宿主生物へ導入される。外来遺伝子は、非天然
生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含ませることができる。「
導入遺伝子」は、形質転換法によってゲノムへ導入された遺伝子である。

【０１０６】「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。「適
当な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、ま
たはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置しているヌクレオチド配列で
あって、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるい
は翻訳に作用する。調節配列は、プロモータ、翻訳リーダー配列、イントロンお
よびポリアデニル化認識配列を含んでいてもよい。

【０１０７】「プロモータ」は、コード配列の発現または機能的ＲＮＡを制御することが可
能なＤＮＡ配列に関する。一般に、コード配列は、プロモータ配列に対して３’
側に位置している。プロモータ配列は、近位およびより遠位の上流領域からなり
、後者はしばしばエンハンサーと呼ばれる。「エンハンサー」は、プロモータ活
性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、それは、プロモータの生来的な要素であって
もよいし、プロモータのレベルまたはプロモータの組織特異性を増大するように
挿入された異種の要素であってよい。プロモータは、完全に天然遺伝子に由来し
ていてもよいし、天然に見られる異なるプロモータに由来する異なる要素から構
成されていてもよいし、合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロ
モータは、異なる組織または細胞中で、または異なる成長段階で、または異なる
環境条件に応じて、遺伝子の発現を指示することができることは当業者には理解
される。ほとんどの増殖条件下でほとんどの時期に遺伝子の発現を起こさせるプ
ロモータは、一般に「構成的プロモータ」と称する。植物細胞において有用な種
々の新しいプロモータが絶えず発見されている。多数の例をＯｋａｍｕｒｏおよ
びＧｏｌｄｂｅｒｇによる編集物で確認することができる（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙｏｆＰｌａｎｔｓ１５：１−８２（１９８９））。さらに、ほとん
どの場合、調節配列の正確な境界が完全には特定されていないので、異なる長さ
のＤＮＡ断片が同一のプロモータ活性を有しているかもしれない。

【０１０８】「操作可能的に結合された」という用語は、一つの機能が他の機能に作用する
ような単一の核酸断片上における核酸配列の結合に関する。例えば、プロモータ
がそのコード配列の発現に作用する場合、プロモータはコード配列と操作可能的
に結合している（すなわち、コード配列はプロモータの転写制御下にあるという
ことである）。コード配列は、センスまたはアンチセンスの方向で、調節配列に
操作可能的に結合することができる。「成熟」タンパク質は、翻訳後に処理され
たポリペプチド、すなわち、一次翻訳産物中に存在するプレペプチドまたはプロ
ペプチドが除去されたポリペプチドである。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡ
の翻訳の一次産物、すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドがまだ存在して
いるものである。しかし、プレペプチドおよびプロペプチドは細胞内の局在シグ
ナルに制限されない。

【０１０９】組み換えピヒア・パストリスの構築本発明の別の態様は、異種起源に由来する活性Ｐ４５０系の発現を起こすピヒ
ア・パストリスの遺伝工学に関する。Ａｌｋ１−Ａ遺伝子（あるいはＡｌｋ３−
ＡまたはＰ４５０レダクターゼ遺伝子でもよい）続いて転写ターミネータ（ＡＯ
Ｘ１由来のものなど）に融合されたアルコールオキシダーゼＩ（ＡＯＸ１）の強
力なメタノール誘導性プロモータなどの（ただしこれに限定されない）プロモー
タを含むように、発現カセットを構築する。その発現カセットを、Ｚｅｏｃｉｎ
耐性（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォルニア州サンディエゴ、米国）をコー
ドするＨＩＳ４、ＡＲＧ４、ＳＵＣ２またはｓｈｂｌｅ遺伝子のなどの（ただ
しこれに制限されない）適当な形質転換マーカを含んでいるベクターへサブクロ
ーニングする。確立されている方法（Ｕ．Ｓ．４，８５５，２３１）で適当なピ
ヒア・パストリス菌株の形質転換を続けて行うと、遺伝子に対する発現カセット
がピヒア・パストリスゲノムに組みこまれる。ＰＣＲおよびサザンブロット分析
などの（ただしこれに制限されない）種々の方法によって、発現カセットの多数
のコピーを保持する形質転換体を同定することができる。

【０１１０】異種起源に由来する活性Ｐ４５０系の発現のためピヒア・パストリスを設計す
る別の態様では、１つまたは２つのプラスミド上に多数の発現カセットをサブク
ローニングすることを要する。例えば、Ａｌｋ１−ＡおよびＡｌｋ３−Ａ遺伝子
に対する発現カセットをあるプラスミド上にサブクローニングし、Ｐ４５０レダ
クターゼ遺伝子に対する発現カセットを別のプラスミド上にサブクローニングす
ることができる。あるいは、Ａｌｋ１−ＡおよびＰ４５０レダクターゼ遺伝子に
対する発現カセットをあるプラスミド上にサブクローニングし、Ａｌｋ３−Ａ遺
伝子に対する発現カセットを別のプラスミド上にサブクローニングすることがで
きる。あるいは、Ａｌｋ３−ＡおよびＰ４５０レダクターゼ遺伝子に対する発現
カセットをあるプラスミド上にサブクローニングし、Ａｌｋ１−Ａ遺伝子に対す
る発現カセットを別のプラスミド上にサブクローニングすることができる。また
は、Ａｌｋ１−ＡおよびＡｌｋ３−ＡおよびＰ４５０レダクターゼ遺伝子に対す
る発現カセットをあるプラスミド上にサブクローニングすることができる。次い
でそのプラスミドを用いて、連続してまたは同時に適当なピヒア・パストリス宿
主を形質転換する。ＰＣＲやサザンブロット分析などの（しかしこれに制限され
ない）種々の方法によって、発現カセットの多数のコピーを保持する形質転換体
を同定することができる。

【０１１１】異種起源に由来する活性Ｐ４５０系の発現のためピヒア・パストリスを設計す
るさらなる態様は、上述のようにして、Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−ＡおよびＰ４
５０レダクターゼ遺伝子に対する発現カセットを、個々にまたは多コピーで、複
製プラスミド上にサブクローニングすることを要する。次いで、複製プラスミド
を用いて、連続してまたは同時に適当なピヒア・パストリス宿主を形質転換する
。ＰＣＲやサザンブロット分析などの（しかしこれに制限されない）種々の方法
によって、発現カセットの多数のコピーを保持する形質転換体を同定することが
できる。

【０１１２】Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−ＡおよびＰ４５０レダクターゼ遺伝子に対する多数
の発現カセットのコピーを含む遺伝子工学技術が施されたピヒア・パストリス細
胞は、炭素源としてグリセロール（またはグルコース）を含む最少培地で飽和ま
で増殖させ、次いでメタノールによってＡＯＸ１プロモータの誘導を行った。こ
れによって、Ｐ４５０系成分の高レベルに生産され、ヒドロキシル化活性が高く
なる。脂肪族基質は、誘導前、誘導開始時、または誘導中の任意時間、および適
当な時間の後に添加することができ、上述のようにカルボキシレートについて培
地を分析する。

【０１１３】カンジダ・マルトサから得られたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅受託番号がそれぞれＤ１２４７５、Ｘ５５８８１およびＤ２５３２７であるカ
ンジダ・マルトサＩＡＭ１２２４７のチトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ、カ
ンジダ・マルトサＩＡＭ１２２４７のチトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ、お
よびチトクロームＰ４５０レダクターゼ遺伝子に対し、遺伝子バンク（Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）から入手可能な配列に基づいて
、オリゴヌクレオチドプライマーを調製する。遺伝子発現カセットの構築だけで
なくクローニングベクターに好都合に連結することを可能とするために、適切な
特有の制限酵素切断部位をプライマーへ設計する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ、ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、（１９８９））を参照のこと）。同様
の方法で、カンジダ・マルトサＩＡＭ１２２４７のＵＲＡ３遺伝子に対して、
オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）米
国特許第４，６８３，２０２号（１９８７、Ｍｕｌｌｉｓら）および米国特許第
４，６８３，１９５号（１９８６、Ｍｕｌｌｉｓら）を用いて、ＡＴＣＣ９０６
７７に対応するカンジダ・マルトサＩＡＭ１２２４７から得られたゲノムＤＮ
Ａ由来の適当なＤＮＡ配列を増幅する。同様の手順および適切なプライマーによ
り、チトクロームＰ４５０のＡｌｋ２−Ａ（Ｘ５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ
１２７１６）、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８
）、Ａｌｋ７（Ｄ１２７１９）およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）が含まれるがこ
れに制限されない、遺伝子バンクから入手可能な他のカンジダ・マルトサＩＡ
Ｍ１２２４７配列をＰＣＲで増幅することができる。

【０１１４】組み換えカンジダ・マルトサの構築−染色体組み込み以下の記述は、形質転換された宿主中に関心ある遺伝子の組み込みによる導入
を用いた本発明の態様である。

【０１１５】ＰＣＲによって合成されたＤＮＡ断片を、化学式Ａｌｋ１−Ａ／Ａｌｋ３−Ａ
／Ｐ４５０レダクターゼ／ＵＲＡ３／Ａｌｋ１−Ａの遺伝子カセットを含むベク
ターを生じるｐＵＣ１８またはラムダＺａｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフ
ォルニア州サンディエゴ、米国）などの好都合なクローニングベクターに続いて
挿入する。大腸菌において遺伝子カセットを含むベクターをクローニングした後
、適当な制限酵素で切断することによってカセット断片を線状にする。当該技術
分野で既知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）を用いてカンジダ・マルトサ
ＩＡＭ１２２４７（ＡＴＣＣ２８１４０に対応）を形質転換し、ＵＲＡ３遺
伝子の機能性コピーを獲得した形質転換体をヒスチジンおよびアデニン硫酸塩を
補給した最少培地で増殖させることによって選択する。当該技術分野で既知の技
術を用いて、ゲノムＤＮＡを形質転換された菌株から単離する。ゲノムＤＮＡを
適当な制限酵素を用いて切断し、続いてサザンブロット方法を用いて分析する。
この方法で、染色体に最大数の遺伝子コピーが挿入されたクローンを検出する。
多量の遺伝子コピー数では、一般に高レベルの酵素活性となる。

【０１１６】発明のさらなる態様は、カンジダ・マルトサ染色体へのＰ４５０系遺伝子の順
次的追加である。化学式Ｘ／ＵＲＡ３／Ｘ（ただし、Ｘは、上述のＡｌｋ１−Ａ
遺伝子、Ａｌｋ３−Ａ遺伝子、Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子または他のＰ４５０
系遺伝子）で表される任意のカセットを宿主ゲノムへ挿入するには、ＰＣＲ増幅
、クローニング、線状化、形質変換、最少培地選択およびサザンブロットスクリ
ーニングという同様の手順に従い、染色体中に各オリジナルコピーに対する遺伝
子Ｘのコピーをさらに少なくとも１つ含んでいるクローンを生成する。異なるチ
トクロームＰ４５０酵素は異なる基質特異性を有しているであろうので、Ａｌｋ
１−Ａ遺伝子、Ａｌｋ３−Ａ遺伝子およびＰ４５０レダクターゼ遺伝子を任意に
組み合わせて挿入することにより、または１つもしくは複数の遺伝子を代替的に
挿入することによって、９から１８の炭素数を有する任意の適当な基質からモノ
ターミナルまたはジターミナルカルボキシレートを生成するのに有用である１組
の生物触媒となる。

【０１１７】多遺伝子のコピー数は、各形質転換の際に関心ある遺伝子とともに再生可能な
マーカー遺伝子を挿入することにより、連続的な組み込み形質転換を介して増加
する。本発明の１つの態様では、ＵＲＡ３遺伝子を繰り返して用いる。各形質転
換後に、ｕｒａ３−遺伝子型は５−フルオロオロチン酸での選択的な増殖によっ
て再生し、同一のマーカー遺伝子として次の形質転換で用いることが可能である
。この方法をそれぞれのさらなる形質転換において繰り返す。本発明の別の態様
では、マーカー遺伝子として、ｈｉｓ５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１７３１０
）またはａｄｅ１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ００８５５）マーカー遺伝子を用
いる。カンジダ・マルトサ菌株ＡＴＣＣ９０６７７は、異なる３つのマーカー遺
伝子（ＵＲＡ３、ＨＩＳ５およびＡＤＥ１）に対して栄養要求性であるので、栄
養要求性突然変異を再生することが必要である前に３つまでの関心のある遺伝子
を挿入することができる。

【０１１８】組み換えカンジダ・マルトサの構築−自律複製本発明の別の態様では、チトクロームＰ４５０系をコードする遺伝子を有する
カセットを含んでいるベクターに自律複製配列（ＡＲＳ）を加える。宿主カンジ
ダ・マルトサをこの構築物で形質転換する。ウラシルが含まれていない培地での
ＡＲＳおよび選択圧の結果として、ベクターが宿主に安定して保持されている。
ベクターに保持されている関心ある遺伝子の割増のコピーの結果として、活性Ｐ
４５０系の発現が増大し、これによりより多くのカルボキシレートが産生される
。しかしながら、本発明は、本実施例における遺伝子Ａｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−
Ａ、Ｐ４５０レダクターゼおよびＵＲＡ３を使用することにより制限されると考
えるべきではない。このカンジダ・マルトサ菌株中に同定されるいずれのＰ４５
０系遺伝子も複製プラスミド構築物内に単独でまたは組み合わせて含めることが
可能であり、有用な生物触媒を生成するためカンジダ・マルトサに形質転換する
ことができる。本発明において特に有用なのは、Ａｌｋ１−Ａ遺伝子、Ａｌｋ３
−Ａ遺伝子およびＰ４５０レダクターゼ遺伝子である。適当なＰ４５０系遺伝子
の発現レベルが増加することにより、高レベルのカルボキシレートが生成する。

【０１１９】カンジダ・マルトサに対する反応条件高レベルのチトクロームＰ４５０ヒドロキシル化活性を含んでいるクローンを
、有効量の脂肪族基質を任意選択で含む適当な培地上で２〜３日間増殖させる。
この期間の最後にさらなる基質を添加し、さらに１〜２日間その細胞を培養する
。細胞を除去し、上澄を酸性化すると、モノターミナルおよびジターミナルのカ
ルボキシレートの沈澱が得られる。この沈殿物および任意の溶解したカルボキシ
レートを上澄からメチル第三級ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に抽出し、ＭＴＢＥ
溶媒の蒸発乾燥後に有意に精製された状態で回収する。

【０１２０】反応用基質カルボキシレートを生成する基質としてドデカンの使用が目的を説明するため
に含まれているが、本発明の範囲を制限するものとして考えてはならない。カル
ボキシレートの生成に適した代替の基質には、炭素数Ｃ_6s〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水
素が単一でまたは組み合わせて含まれる。炭素数Ｃ₆〜Ｃ₂₂を有する脂肪酸も、ジターミナルカルボキシレートの生成用基質として有用である。さらに、炭素骨
格に１つまたは２つの二重結合を含んでいる脂肪族炭化水素または脂肪酸は、１
つまたは２つのさらなるターミナルカルボキシレート基が生成物中に現われる場
合に、カルボキシレート生成のための基質として有用である。末端炭素の１つが
フェニル基によって置換された上述の直鎖化合物のいずれも、カルボキシレート
の生成に有用である。

【０１２１】細胞株および増殖条件カンジダ・マルトサ菌株ＡＴＣＣ９０６２５およびＡＴＣＣ９０６７７（ＡＴ
ＣＣの酵母のカタログを参照のこと）を形質転換およびアルカンヒドロキシル化
活性の発現に用いる。ピヒア・パストリス菌株ＧＴＳ１１５は、Ｉｎｖｉｔｒｏ
ｇｅｎ社（カルフォルニア州サンディエゴ、米国）から入手する。これらの菌株
は、ＹＥＰＤ培地（酵母抽出物１０ｇ／Ｌ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、グルコース２
０ｇ／Ｌ）で、２５０ｒｐｍの振盪を行いながら３０℃で普通どおりに増殖させ
る。ＵＲＡ３遺伝子の機能的コピーをさらに有するカンジダ・マルトサＡＴＣＣ
９０６７７の形質転換体を、ヒスチジンおよびアデニン硫酸塩を補給した最少培
地での増殖によって選択する。最少培地は、アミノ酸＋５０ｍｇ／Ｌのヒスチジ
ンおよび２０ｍｇ／Ｌのアデノシン硫酸塩＋１０ｇ／Ｌのグルコースを加えたＹ
ＮＢ培地（ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、Ｕ
ＳＡ）である。

【０１２２】ＧＣ条件ＳＥ５４キャピラリーカラム（１５ｍ×０．５３ｍｍ）を使用し、ＭＳＴＦＡ
＋１％ＴＭＣＳ誘導体のガスクロマトグラフィによって、ＤＤＤＡの濃度を測定
した。１．２μｍコーティング、１５０℃で１．５分間、５℃／分で２００℃ま
で、２００℃で５分間の温度プログラム；インジェクター：３１０℃；検出器：
３２０℃；ＦＩＤ検出。

【０１２３】（実施例）本発明を以下の実施例でさらに明確にするが、別の定めがなければ、すべての
割合および百分率は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例
は、本発明の好ましい態様を示すものであり、例示だけを目的として提供してい
るものと理解すべきである。上記の論述およびこれらの実施例により、当業者は
本発明の本質的特徴を確認することができ、本発明の真意および範囲から逸脱す
ることなしに種々の使用および条件に適用するために本発明に種々の改変および
修正を行うことができる。

【０１２４】一般的方法制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの酵素的消化、リン酸化反応、連結反応
および形質転換に関する方法は当該技術分野で周知である。本明細書で用いた標
準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該技術分野で周知であり、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ、
Ｔ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ− ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ
ｒｅｓｓ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）、Ｓｉｌｈａｖ
ｙ、Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ、Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ、Ｌ．Ｗ．によ
るＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｗｉｔｈＧｅｎｅＦｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ（１９８４）、並びに、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．らによるＣｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒ
ｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃ．ａｎｄＷｉｌｅｙ−ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）に詳しい記述がある。

【０１２５】細菌培養および酵母培養の管理および増殖に適した物質および方法は、当該技
術分野で周知である。後述の実施例で用いるのに適した技術は、Ｍａｎｕａｌ
ｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＧｅｎｅｒａｌＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（
ＰｈｉｌｌｉｐｐＧｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ
Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、ＥｕｇｅｎｅＷ．Ｎｅｓｔｅｒ、ＷｉｌｌｉｓＡ
．Ｗｏｏｄ、ＮｏｅｌＲ．ＫｒｉｅｇおよびＧ．ＢｒｉｇｇｓＰｈｉｌ
ｌｉｐｓによる編集）、ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ．（１９９４）、またはＴｈ
ｏｍａｓＤ．ＢｒｏｃｋｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＡＴｅｘ
ｔｂｏｏｋｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｅｃ
ｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（１９８９）ＳｉｎａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ
、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡで確認することができる。細菌細胞の
増殖および管理に用いた試薬および物質はすべて、別段の定めがない限り、Ａｌ
ｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｌ、ＵＳＡ）、ＤＩ
ＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ、ＵＳＡ）、Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）またはＳｉｇｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から入手
した。

【０１２６】略語の意味は次のとおりである。「ｈ」は時間を表し、「ｍｉｎ」は分を表し
、「ｓｅｃ」は秒を表し、「ｄ」は日を表し、「ｍＬ」はミリリットルを表し、
「Ｌ」はリットルを表し、「μＬ」はマイクロリットルを表し、また「ｍｍ」は
ミリメートルを表す。

【０１２７】実施例１アルカンヒドロキシル化活性を発現するピヒア・パストリス菌株の構築それぞれ末端のＢａｍＨＩおよびＡｖｒＩＩ部位（英小文字で示した）を組込
んだプライマー１（配列番号１）およびプライマー２（配列番号２）を用いて、
カンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７からチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ
レダクターゼをＰＣＲ増幅した。プライマー１−（配列番号１）：５’−ＡｇｇａｔｃｃＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＧ
−３’ プライマー２−（配列番号２）：５’−ＡｃｃｔａｇｇＣＴＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧ−
３’ このＤＮＡ断片をベクターｐＰＩＣ３Ｋ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォ
ルニア州サンディエゴ、米国）のＢａｍＨＩ部位およびＡｖｒＩＩ部位間にサブ
クローニングして、ＡＯＸＩプロモータがチトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺
伝子の発現を制御するｐＳＷ６４を作製した。それぞれ末端ＫｐｎＩおよびＡｐ
ａＩ部位（英小文字で示した）を組込んだプライマー３（配列番号３）およびプ
ライマー４（配列番号４）を用いて、カンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７か
らチトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−ＡをＰＣＲ増幅した。プライマー３−（配列番号３）：５’−ＣｇｇｔａｃｃＡＴＧＧＣＴＡＴＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＡ
−３’ プライマー４−（配列番号４）：５’−ＡｇｇｇｃｃｃＴＴＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣ−
３’ このＤＮＡ断片をベクターｐＰＩＣＺＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォ
ルニア州サンディエゴ、米国）のＫｐｎＩ部位およびＡｐａＩ部位間にサブクロ
ーニングして、ＡＯＸＩプロモータがチトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子
の発現を制御するｐＳＷ６５を作製した。それぞれ末端ＸｈｏＩおよびＡｐａＩ
部位（英小文字で示した）を組込んだプライマー５（配列番号５）およびプライ
マー６（配列番号６）を用いて、カンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７由来の
チトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−ＡをＰＣＲ増幅した。プライマー５−（配列番号５）：５’−ＡｃｔｃｇａｇＡＴＧＣＣＧＧＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣ
−３’ プライマー６−（配列番号６）：５’−ＡｇｇｇｃｃｃＧＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴＧＧ−３
’ このＤＮＡ断片をベクターｐＰＩＣＺＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォ
ルニア州サンディエゴ、米国）のＸｈｏＩおよびＡｐａＩ部位間にサブクローニ
ングして、ＡＯＸＩプロモータがチトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の
発現を制御するｐＳＷ７２を作製した。Ａｌｋ１−Ａ発現カセットを含んでいる
ｐＳＷ６５のＢａｍＨＩ部位へＡｌｋ３−Ａ発現カセットを含んでいるｐＳＷ７
２由来のＢｇＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片をサブクローニングし、Ａｌｋｌ−Ａおよ
びＡｌｋ３−Ａ遺伝子に対する発現カセットを含むｐＳＷ７３を作製した。

【０１２８】ゲノムへプラスミドを組み込む一工程であるスフェロプラスト法（Ｃｒｅｇｇ
ら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、５：３３７６−３３８５、（１９８５））
によって、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｅｒｉｓ）ＧＴＳ１１
５（ｈｉｓ４）をＨＩＳ原栄養性へｐＳＷ６４で形質転換した。ＳＷ６４と称す
る多コピー数形質転換体を、Ｓｃｏｒｅｒらにより記述された（Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ、１２：１８１〜１８４、（１９９４））高濃度（＞１ｍｇ／ｍ
Ｌ）のＧ４１８で増殖することによって選択した。ゲノムへプラスミドを組み込
む一工程である電気穿孔法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カルフォルニア州サンデ
ィエゴ、米国）によって、菌株ＳＷ６４をｚｅｏｃｉｎ耐性へｐＳＷ６５で再形
質転換した。ＰＣＲ分析により、二重形質転換体のゲノムへＰ４５０レダクター
ゼおよびＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の両方に対する発現カセットの組み込みが
あることを確認した。その二重形質転換体をＳＷ６４／６５と称し、ＡＴＣＣ受
託番号７４４０９として同定する。

【０１２９】二重形質転換体ＳＷ６４／６５（ＡＴＣＣ７４４０９）を、ＭＧＹ（アミノ
酸なしの１．３４％酵母窒素塩基、１％グリセロール、０．００００４％ビオチ
ン）２０ｍＬで、３０℃で振盪しながら飽和まで（４８ｈ）増殖させた。遠心分
離の後、細胞を２０ｍＬのＭＭ＋Ｆｅ（アミノ酸なしの１．３４％酵母窒素塩基
、０．５％メタノール、０．００００４％ビオチン、１ｍＭのＦｅ⁺³）中に再懸
濁して誘導し、４８時間まで３０℃で振盪して培養した。細胞を２回ＰＢＳ（Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、前掲）で洗浄し、ショ糖緩衝液（０．２５Ｍショ糖、０．０
５Ｍトリス塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ）で１回洗浄
し、０．３％ＢＳＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）を補った２ｍＬショ糖緩衝液
に再懸濁した。１分間、氷上で１分間の刻みで合計４分間、０．５ｍｍのガラス
ビーズ（約１ｍＬ）の１／２容量で細胞をボルテックスすることにより抽出物を
調製した。半透明の溶解産物がガラスビーズの遠心分離（３０００ｘｇ）によっ
て得られ、壊死組織片を１２０００ｘｇで遠心分離した。得られた上清を２５０
００ｘｇで遠心分離した。その得られた上清を４５０００ｘｇで遠心分離し、０
．３％ＢＳＡを補った１ｍＬショ糖緩衝液中にそのミクロソームのペレットを再
懸濁した。

【０１３０】ＮＡＤＰＨ／ＮＡＤＰＨ混合物（ショ糖緩衝液中、０．５ｍＭのＮＡＤＰＨお
よび０．５ｍＭのＮＡＤＰＨ）の等しい容量（１ｍＬ）をミクロソーム試料に添
加した。¹⁴Ｃ−ラウリン酸（５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅ；ＩＣＮ、ＣｏｓｔａＭ
ｅｓａ、ＣＡ、ＵＳＡ）１μＬを添加し、０〜６０分間、１５０ｒｐｍで振盪し
ながらその混合物を培養した。硫酸０．１ｍＬを添加してその反応を中止し、次
にエーテル５ｍＬで３回抽出し、収集した。その試料を風乾し、エーテル０．３
ｍＬに再懸濁し、液体シンチレーションによって２μＬを計測した。ＴＬＣプレ
ート（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）を２００，０００ｄｐ
ｍで充填し、密閉瓶中でトルエン：酢酸（９：１）を用いてＴＬＣを約２．５時
間実施した。そのプレートをＸ線に一晩さらした。遺伝子工学技術が施されたピ
ヒア・パストリス菌株ＳＷ６４／６５（ＡＴＣＣ７４４０９）から、ラウリン酸
の１２−ヒドロキシラウリン酸への変換およびＤＤＤＡへの変換を、研究室基準
（ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ．Ｗｌ、Ｕ
ＳＡ）と比較して確認した。対照のピヒア・パストリスからは、ＤＤＤＡへの変
換は確認されなかった。

【０１３１】実施例２カンジダ・マルトサＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ発現カセットの構築ＰＣＲ増幅後に主なアルカンモノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ）遺
伝子を単離し、ＰＣＲ介在のオーバーラップ・エクステンションによってカンジ
ダ・マルトサＰＧＫプロモータおよびターミネータに正確に融合した。この方法
により、ＰＧＫ介在の発現を変更し得るＤＮＡ配列を変化することなく、Ｐ４５
０Ａｌｋ１−Ａ構造遺伝子の翻訳開始コドンおよび終止コドンへそれぞれＰＧＫ
プロモータおよびターミネータを正確に融合することができた。後続のサブクロ
ーニングに必要なＳｐｅＩ制限酵素切断部位（英小文字で示した）およびＰ４５
０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子（該当のヌクレオチドに下線を付した）の５’−末端に対
応する１５ｂｐのＤＮＡ配列に導入するためにプライマー７（配列番号７）およ
びプライマー８（配列番号８）を用いて、約１００ｎｇのカンジダ・マルトサＡ
ＴＣＣ９０６７７［ａｄｅｌ、ｈｉｓ５、ｕｒａ３／ｕｒａ３］からＰＧＫ構造
遺伝子（５６〜７５６位、ただしプライマーを含まない）上流の７６６ｂｐの５
’側ＤＮＡ配列からなるＰＧＫプロモータを増幅した。プライマー７−（配列番号７）：５’−ＡａｃｔａｇｔＧＧＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＡＣＧＡＣ−３
’ プライマー８−（配列番号８）：５’−ＴＴＧＴＴＣＴＡＴＡＧＣＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡ
Ｔ−３’ ３’−末端のＰＧＫプロモータ（該当のヌクレオチドに下線を付した）に対応
する１５ｂｐのＤＮＡ配列を導入するためにプライマー９（配列番号９）および
１０（配列番号１０）を用いて、約２０ｎｇのカンジダ・マルトサＰ４５０Ａｌ
ｋ１−Ａ遺伝子を含むｐＧＥＭ−Ａｌｋ１−ＡＤＮＡからＰ４５０Ａｌｋ１−
Ａ遺伝子（４７〜９７７位）の５’−末端に対応する９９８ｂｐのＤＮＡ断片を
増幅した。プライマー９−（配列番号９）：５’−ＧＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＡＴＡＧＡＡＣＡＡＡＴＴＡＴＴ
ＧＡＡＧＡＡ−３’ プライマー１０−（配列番号１０）：５’−ＴＡＡＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＴＣＴＡＣＣＧＧＣＡ−３’ ＰＧＫターミネータに対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌクレオチドに
下線を付した）を導入するためにプライマー１１（配列番号１１）および１２（
配列番号１２）を用いて、約２０ｎｇのｐＧＥＭ−Ａｌｋｌ−ＡＤＮＡからＰ
４５０Ａｌｋｌ−Ａ遺伝子（１００４〜１５９６位）の３’−末端に対応する６
６３ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。プライマー１１−（配列番号１１）：５’−ＴＧＣＣＧＧＴＡＧＡＧＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣＡＧＧＴＴＴＡ−３’ プライマー１２−（配列番号１２）：５’−ＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＴＴＴＡＧＣＡＧＡＡＡＴＡＡＡ
ＡＡＣＡＣＣ−３’ 後続のサブクローニングに必要なＮｈｅＩ制限酵素切断部位（英小文字で示し
た）およびＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の３’−末端に対応する１５ｂｐのＤＮ
Ａ配列（該当のヌクレオチドに下線を付した）を導入するためにプライマー１３
（配列番号１３）および１４（配列番号１４）を用いて、約１００ｎｇのカンジ
ダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７ゲノムＤＮＡからＰＧＫ構造遺伝子（２０５
０〜２５７１位）の下流の３’側ＤＮＡ配列の５８８ｂｐを含むＰＧＫターミネ
ータを増幅した。プライマー１３−（配列番号１３）：５’−ＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＡ
ＣＴＴＧ−３’ プライマー１４−（配列番号１４）：５’−ＡＡＡＧＣＴＡＧＣＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＧ−３’ これらのＰＣＲは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉｔａｑｋｉｔを
使用して、５０μＬで実施した。増幅は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅ
ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００で、９４℃１分、５０℃１分、７２℃
２分からなる１サイクルを３５サイクルして実施した。最後のサイクルに続いて
、７２℃で５分間の延長時間を設け、その後、その試料を４℃で保持してからゲ
ル電気泳動による分析をした。分取ゲル電気泳動後、望みのＤＮＡ断片を単離し
、ＧｅｎｅＣｌｅａｎｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１、Ｖｉｓｔａ、ＣＡ）を使用し
て精製した。

【０１３２】ＰＧＫプロモータを含有する９９８ｂｐのＤＮＡ断片、およびＰ４５０Ａｌｋ
ｌ−Ａ遺伝子の５’−末端に対応する７６６ｂｐのＤＮＡ断片を、ＰＧＫプロモ
ータの相補的３’−末端、およびＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の相補的５’末端
をアニールする第２のＰＣＲで連結した。５’−ＰＧＫおよび３’−Ｐ４５０Ａ
ｌｋ１−Ａプライマー、プライマー７およびプライマー１０をそれぞれ添加する
ことによって、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の５’末端へのＰＧＫプロモータの
正確な融合を含む１７４９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することができた。Ｐ４５０
ＡＬＫ１Ａ遺伝子の３’−末端に対応する６６３ｂｐのＤＮＡ断片、およびＰＧ
Ｋターミネータを含む５８８ｂｐのＤＮＡ断片は、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子
の相補的３’−末端、およびＰＧＫターミネータの相補的５’末端をアニールす
る第２のＰＣＲで結合した。５’−Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａおよび３’−ＰＧＫプ
ライマー、プライマー１１およびプライマー１４をそれぞれ添加することによっ
て、ＰＧＫターミネータへのＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の３’−末端の正確な
融合を含む１２３６ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することができた。ＰＣＲは、Ｐｅ
ｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉｔａｑｋｉｔを使用して、５０μＬの体積
中で実施した。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔ
ｅｍ９６００で、９４℃１分、４５℃１分、７２℃２分からなる１サイクルを
３５サイクルして増幅を行った。最後のサイクルに続いて、７２℃で５分間の延
長時間を設け、その後、その試料を４℃で保持してからゲル電気泳動による分析
をした。分取ゲル電気泳動に続いて、望みのＤＮＡ断片を単離し、ＧｅｎｅＣ
ｌｅａｎｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製した。

【０１３３】Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ遺伝子の５’末端へのＰＧＫプロモータの正確な融合を
含む１７４９ｂｐのＤＮＡ断片をＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで消化し、同じ様に消
化されたｐＬｉｔｍｕｓ３８（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｂｅ
ｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に連結した。連結されたＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５α（Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を形質転換し、ＬＢ培地（
Ｘ−ｇａｌ（４０ｎｇ／ｍＬ）を含む、１％（ｗ／ｖ）のトリプトン、１％（ｗ
／ｖ）のＮａＣｌおよび０．５％（ｗ／ｖ）の酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ（Ｄｅｔ
ｒｏｉｔ、ＭＩ））で白色コロニー色を示すアンピシリン耐性の形質転換体から
得たプラスミドＤＮＡを分析することにより、その望みのプラスミドの存在を確
認し、それをｐＬＰＡ１と命名した。ＰＧＫターミネータへのＰ４５０ＡＬＫＩ
Ａ遺伝子の３’−末端の正確な融合を含む１２３６ｂｐＤＮＡ断片を、ＰｓｔＩ
およびＮｈｅＩで消化し、同じ様に消化したｐＬｉｔｍｕｓ３８に連結した。連
結したＤＮＡを使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含んでいる
ＬＢ培地で白色コロニー色を示すアンピシリン耐性の形質転換体から得られるプ
ラスミドＤＮＡを分析することによって、その望みのプラスミドの存在を確認し
、それをｐＬＡ１Ｔと命名した。次に、ＰｓｔＩおよびＮｈｅＩを用いた消化に
よってｐＬＰＡ１を線状とし、ｐＬＡ１Ｔ由来の１２３６ｂｐのＰｓｔＩ／Ｎｈ
ｅＩＤＮＡ断片に連結した。連結したＤＮＡを使用して大腸菌ＤＨ５αを形質
転換し、アンピシリン耐性の形質転換体から得られるプラスミドＤＮＡを分析す
ることによって望みのプラスミドの存在を確認し、それをｐＬＰＡ１Ｔと命名し
た。ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩを用いてこのプラスミドを消化し、ＰＧＫプロモー
タおよびターミネータに正確に融合したＡｌｋ１−Ａ遺伝子を含んでいる２９８
５ｂｐの発現カセットを作製した。

【０１３４】実施例３カンジダ・マルトサＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ発現カセットの構築さらに、主な脂肪酸モノオキシゲナーゼ（Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ）遺伝子を単
離し、ＰＣＲ介在のオーバーラップ・エクステンションによって、カンジダ・マ
ルトサＰＧＫプロモータおよびターミネータに正確に融合した。後続のサブクロ
ーニングに必要なＳｐｅＩ制限酵素切断部位（英小文字で示した）およびＰ４５
０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の５’末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌク
レオチドに下線を付した）を導入するためにプライマー７（配列番号７）および
プライマー１５（配列番号１５）を用い、約１００ｎｇのカンジダ・マルトサＡ
ＴＣＣ９０６７７のゲノムＤＮＡから７６６ｂｐのＰＧＫプロモータ（５６〜７
５６位、だたしプライマーを含まない）を増幅した。プライマー７−（配列番号７）：５’−ＡａｃｔａｇｔＧＧＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＡＣＧＡＣ−３
’ プライマー１５−（配列番号１５）：５’−ＡＡＡＧＧＡＡＡＣＣＧＡＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡ
Ｔ−３’ ＰＧＫプロモータの３’−末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌク
レオチドに下線を付した）を導入するためにプライマー１６（配列番号１６）お
よびプライマー１７（配列番号１７）を用いて、約２０ｎｇのカンジダ・マルト
サＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子を含んでいるｐＧＥＭ−Ａｌｋ３−ＡＤＮＡ
からＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子（６２〜６５５位）の５’−末端に対応する６
２８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。プライマー１６−（配列番号１６）：５’−ＧＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＧＧＴＴＴＣＣＴＴＴＧＴＴＣＡＣ
ＡＡＣＧＴＴ−３’ プライマー１７−（配列番号１７）：５’−ＴＣＴＴＧＧＡＴＡＴＣＧＡＡＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴＴＧＡＣ−３’ ＰＧＫターミネータ５’−末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌク
レオチドに下線を付した）を導入するためにプライマー１８（配列番号１８）お
よびプライマー１９（配列番号１９）を使用して、約２０ｎｇのｐＧＥＭ−Ａｌ
ｋ３−ＡＤＮＡからＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子（６５２〜１６３２位）の３
’−末端に対応する１０５８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。プライマー１８−（配列番号１８）：５’−ＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＡＡＣＴＴＴＣＧＡＴＡＴＣＣＡＡＧＡ−３’ プライマー１９−（配列番号１９）：５’−ＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＴＡＴＴ
ＧＧＣＡＣＣ−３’ 後続のサブクローニングに必要なＮｈｅＩ制限酵素切断部位（英小文字で示し
た）およびＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子３’−末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ
配列（該当のヌクレオチドに下線を付した）導入するためにプライマー２０（配
列番号２０）およびプライマー１４（配列番号１４）を用いて、約１００ｎｇの
カンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７ゲノムＤＮＡから５８８ｂｐのＰＧＫタ
ーミネータ（２０５０〜２５７１位）を増幅した。プライマー２０−（配列番号２０）：５’−ＡＴＣＣＡＡＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＡ
ＣＴＴＧ−３’ プライマー１４−（配列番号１４）：５’−ＡＡＡｇｃｔａｇｃＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＧ−３’ これらのＰＣＲは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉｔａｑｋｉｔを
使用して、５０μＬで実施した。増幅は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅ
ＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００で、９４℃１分、５０℃１分、７２℃
２分からなる１サイクルを３５サイクルして実施した。最後のサイクルに続いて
、７２℃で５分間の延長時間を設け、その後、その試料を４℃で保持してからゲ
ル電気泳動による分析をした。ＧｅｎｅＣｌｅａｎｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１）
を使用して、望みのＤＮＡ断片を精製した。

【０１３５】ＰＧＫプロモータからなる７６６ｂｐのＤＮＡ断片、およびＰ４５０Ａｌｋ３
−Ａ遺伝子の５’−末端に対応する６２８ｂｐのＤＮＡ断片を、ＰＧＫプロモー
タの相補的３’−末端、およびＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の５’末端がアニー
ルする第２のＰＣＲで結合した。５’−ＰＧＫプライマーおよび３’−Ｐ４５０
Ａｌｋ３−Ａプライマー、プライマー７およびプライマー１７をそれぞれ添加す
ることによって、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の５’末端へのＰＧＫプロモータ
の正確な融合を含む１３７９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することができた。Ｐ４５
０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の３’−末端に対応する１０５８ｂｐのＤＮＡ断片、およ
びＰＧＫターミネータを含む５８８ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ
遺伝子の相補的３’−末端、およびＰＧＫターミネータの５’末端をアニールす
る第２のＰＣＲで結合した。５’−Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａプライマーおよび３’
−ＰＧＫプライマー、プライマー１８およびプライマー１４をそれぞれ添加する
ことによって、ＰＧＫターミネータへＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の３’−末端
の正確な融合を含む１６３１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することができた。これら
のＰＣＲは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉｔａｑｋｉｔを使用して
、５０μＬで実施した。増幅は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐ
ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００で、９４℃１分、４５℃１分、７２℃２分から
なる１サイクルを３５サイクルして実施した。最後のサイクルに続いて、７２℃
で５分間の延長時間を設け、その後、その試料を４℃で保持してからゲル電気泳
動による分析をした。分取ゲル電気泳動の後に望みのＤＮＡ断片を単離し、Ｇｅ
ｎｅＣｌｅａｎｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製した。

【０１３６】ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＶを用いて、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の５’末端
へのＰＧＫプロモータの正確な融合を含む１３７９ｂｐのＤＮＡ断片を消化し、
同じ様に消化したｐＬｉｔｍｕｓ３８に連結した。連結したＤＮＡを使用して大
腸菌ＤＨ５αを形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含んでいるＬＢ培地で白色コロニー色
を示すアンピシリン耐性の形質転換体から得られるプラスミドＤＮＡを分析する
ことによって望みのプラスミドの存在を確認し、それをｐＬＰＡ３と命名した。
ＰＧＫターミネータへのＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ遺伝子の３’−末端の正確な融合
を含む１６３１ｂｐのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩで消化し、同じ様
に消化したｐＬｉｔｍｕｓ３８に連結した。連結したＤＮＡを使用して大腸菌
ＤＨ５αを形質転換し、Ｘ−ｇａｌを含んでいるＬＢ培地で白色コロニー色を示
すアンピシリン耐性の形質転換体から得られるプラスミドＤＮＡを分析すること
によって望みのプラスミドの存在を確認し、それをｐＬＡ３Ｔと命名した。次に
、ＥｃｏＲＶおよびＮｈｅＩで消化することによってｐＬＰＡ３を線状とし、ｐ
ＬＡ１Ｔからの１６３１ｂｐのＥｃｏＲＶ／ＮｈｅｌＤＮＡ断片に連結した。
連結したＤＮＡを使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン耐性の形
質転換体から得られるプラスミドＤＮＡを分析することによって望みのプラスミ
ドの存在を確認し、それをｐＬＰＡ３Ｔと命名した。ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩで
このプラスミドを消化することによって、ＰＧＫプロモータおよびターミネータ
に正確に融合したＡｌｋ３−Ａ遺伝子を含んでいる３０１０ｂｐの発現カセット
を作製した。

【０１３７】実施例４カンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ発現カセ
ットの構築さらにチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ（ＣＰＲ）遺伝子を単
離し、ＰＣＲ介在のオーバーラップ・エクステンションによって、カンジダ・マ
ルトサＰＧＫプロモータおよびターミネータに正確に融合した。後続のサブクロ
ーニングに必要なＳｐｅｌ制限酵素切断部位（英小文字で示した）、およびＣＰ
Ｒ遺伝子の５’末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌクレオチドに下
線を付した）を導入するためにプライマー７（配列番号７）およびプライマー２
１（配列番号２１）を用いて、約１００ｎｇのカンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０
６７７ゲノムＤＮＡから７６６ｂｐのＰＧＫプロモータ（５６〜７５６位、ただ
しプライマーを含まない）を増幅した。プライマー７−（配列番号７）：５’−ＡａｃｔａｇｔＧＧＴＡＧＡＧＣＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＡＣＧＡＣ−３
’ プライマー２１−（配列番号２１）：５’−ＴＴＴＡＴＣＴＡＡＴＧＣＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＡＴＴＧＡ
Ｔ−３’ ＰＧＫプロモータの３’−末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌク
レオチドに下線を付した）を導入するためにプライマー２２（配列番号２２）お
よびプライマー２３（配列番号２３）を用いて、約２０ｎｇのカンジダ・マルト
サＣＰＲ遺伝子を含んでいるｐＧＥＭ−ＣＰＲＤＮＡからＣＰＲ遺伝子（８
８〜１０６５位）の５’−末端に対応する１０３８ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した
。プライマー２２−（配列番号２２）：５’−ＧＣＣＴＴＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＡＴＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＧＡＴ
ＴＴ−３’ プライマー２３−（配列番号２３）：５’−ＡＡＧＴＧＧＡＡＴＣＴＡＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＧ−３’ ＰＧＫターミネータの５’−末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌ
クレオチドに下線を付した）導入するためにプライマー２４（配列番号２４）お
よびプライマー２５（配列番号２５）を用いて、約２０ｎｇのｐＧＥＭ−ＣＰＲ
ＤＮＡからＣＰＲ遺伝子（１０９０〜２０８９位）の３’−末端に対応する１
０６２ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。プライマー２４−（配列番号２４）：５’−ＣＧＡＡＴＴＡＡＡＡＧＣＴＴＴＡＧＡＴＴＣＣＡＣＴＴ−３’ プライマー２５−（配列番号２５）：５’−ＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧ
ＧＴＡ−３’ 後続のサブクローニングに必要なＮｈｅＩ制限酵素切断部位（英小文字で示した
）、およびＣＰＲ遺伝子の３’末端に対応する１５ｂｐのＤＮＡ配列（該当のヌ
クレオチドに下線を付した）を導入するために、プライマー２６（配列番号２６
）およびプライマー１４（配列番号１４）を用いて、約１００ｎｇのカンジダ・
マルトサＡＴＣＣ９０６７７のゲノムＤＮＡから５８８ｂｐのＰＧＫターミネー
タ（２０５０〜２５７１位）を増幅した。プライマー２６−（配列番号２６）：５’−ＧＡＡＧＡＴＧＴＴＴＧＧＴＡＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＣＡ
ＣＴＴＧ−３’ プライマー１４−（配列番号１４）：５’−ＡＡＡｇｃｔａｇｃＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＧ−３’ これらのＰＣＲは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）
ｋｉｔを使用して、５０μＬで実施した。増幅は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００で、９４℃１分、
５０℃１分、７２℃２分からなる１サイクルを３５サイクルして実施した。最後
のサイクルに続いて、７２℃で５分間の延長時間を設け、その後、その試料を４
℃で保持してからゲル電気泳動による分析をした。望みのＤＮＡ断片をＧｅｎｅ
Ｃｌｅａｎｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製した。

【０１３８】ＰＧＫプロモータからなる７６６ｂｐのＤＮＡ断片、およびＣＰＲ遺伝子の５
’−末端に対応する１０３８ｂｐのＤＮＡ断片を、ＰＧＫプロモータの相補的３
’−末端、およびＣＰＲ遺伝子の５’末端をアニールする第２のＰＣＲで結合し
た。５’−ＰＧＫプライマーおよび３’−ＣＰＲプライマー、プライマー７およ
びプライマー２３をそれぞれ添加することによって、ＣＰＲ遺伝子の５’末端へ
のＰＧＫプロモータの正確な融合を含む１７８９ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させた
。また、ＣＰＲ遺伝子の３’−末端に対応する１０６２ｂｐのＤＮＡ断片、およ
びＰＧＫターミネータからなる５８８ｂｐのＤＮＡ断片を、ＣＰＲ遺伝子の相補
的３’−末端、およびＰＧＫターミネータの５’末端をアニールする第２のＰＣ
Ｒで結合した。５’−ＣＰＲプライマーおよび３’−ＰＧＫプライマー、プライ
マー２４およびプライマー１４をそれぞれ添加することによって、ＰＧＫターミ
ネータへのＣＰＲ遺伝子の３’−末端の正確な融合を含む１６３５ｂｐのＤＮＡ
断片を増幅することができた。これらのＰＣＲは、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ
Ａｍｐｌｉｔａｑ（登録商標）ｋｉｔを使用して、５０μＬで実施した。増幅は
、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲＳｙｓｔｅ
ｍ９６００で、９４℃１分、４５℃１分、７２℃２分からなる１サイクルを３
５サイクルして実施した。最後のサイクルに続いて、７２℃で５分間の延長時間
を設け、その後、その試料を４℃で保持してからゲル電気泳動による分析をした
。分取ゲル電気泳動の後に望みのＤＮＡ断片を単離し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ
ｋｉｔ（Ｂｉｏ１０１）を使用して精製した。

【０１３９】ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでＣＰＲ遺伝子の５’末端へのＰＧＫプロモー
タの正確な融合を含む１７８９ｂｐのＤＮＡ断片を消化し、同じ様に消化したｐ
Ｌｉｔｍｕｓ３８に連結した。連結したＤＮＡを使用して大腸菌ＤＨ５αを形
質転換し、Ｘ−ｇａｌを含んでいるＬＢ培地で白色コロニー色を示すアンピシリ
ン耐性の形質転換体から得られるプラスミドＤＮＡを分析することによって望み
のプラスミドの存在を確認し、それをｐＬＡ１Ｔと命名した。ＰＧＫターミネー
タへのＣＰＲ遺伝子の３’−末端の正確な融合を含む１６３５ｂｐのＤＮＡ断片
をＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩで消化し、同じ様に消化したｐＬｉｔｍｕｓ
３８に連結した。連結したＤＮＡを使用して大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、Ｘ−
ｇａｌを含んでいるＬＢ培地で白色コロニー色を示すアンピシリン耐性の形質転
換体から得られるプラスミドＤＮＡを分析することによって望みのプラスミドの
存在を確認し、それをｐＬＲＴと命名した。次に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅ
Ｉで消化することによってｐＬＰＲを線状とし、ｐＬＲＴからの１６３５ｂｐの
ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩＤＮＡ断片に連結した。連結したＤＮＡを使用して
大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体から得られるプラ
スミドＤＮＡを分析することによって望みのプラスミドの存在を確認し、それを
ｐＬＰＲＴと命名した。ＳｐｅＩおよびＮｈｅＩを用いてこのプラスミドを消化
し、ＰＧＫプロモータおよびターミネータに正確に融合したＣＰＲ遺伝子を含ん
でいる３４２４ｂｐの発現カセットを作製した。

【０１４０】実施例５増大されたアルカンヒドロキシル化活性を発現するカンジダ・マルトサ菌株の
構築２つのプライマーセットを用いて、カンジダ・マルトサＡＴＣＣ２８１４
０からチトクロームＰ４５０レダクターゼをＰＣＲ増幅した。１つのセットは、
５’末端にＢａｍＨＩ部位、および３’−末端にＰｓｔＩ部位を組込み、ＤＮＡ
断片を増幅し、レダクターゼ開始コドンの上流の部位３４０塩基から２６１６塩
基を延長した。もう一つのセットは、５’末端にＰｓｔＩ部位、および３’末端
のＳｐｈＩ部位からすぐ上流のＸｈｏＩ部位を有する３’末端にＳｐｈＩ部位を
組み込み、その同一ＤＮＡ断片を増幅した。その後、ｐＵＣ１８クローニングベ
クター（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ
およびＰｓｔＩの部位間にＰ４５０レダクターゼ遺伝子を含んでいる第１のＤＮ
Ａ断片をクローニングし、プラスミドｐＲＤＦ１を得た。後者のＰ４５０レダク
ターゼ遺伝子を含んでいるＤＮＡ断片プラスミドをＰｓｔＩ部位およびＳｐｈＩ
部位の間にサブクローニングし、ＲＤＦ２を得た。さらに、５’末端のＸｈｏＩ
部位、および３’末端のＳｐｈＩ部位を組み込むプライマーを用いて、Ｃａｎｄ
ｉｄａｍａｌｌｏｓａＡＴＣＣ２８１４０からａｄｅ１遺伝子を増幅した
。これらのプライマーはＤＮＡ断片を増幅し、ホスホリボシルアミドイミダゾー
ルスクシノカルボキサミドシンセターゼ開始コドンの上流の部位２８４塩基から
部位１３９６塩基を延長した。ＸｈｏＩ部位およびＳｐｈＩ部位の間のプラスミ
ドｐＲＤＦ２へＸｈｏＩ−ａｄｅ１―ＳｐｈＩＤＮＡ断片のクローニングを行
い、プラスミドｐＲＤＦ３を作製した。その後、５’末端のＳｍａＩ部位、およ
び３’末端のＢａｍＨＩ部位を組込むプライマーを用いて、カンジダ・マルトサ
ＡＴＣＣ２８１４０からａｄｅ１遺伝子を含んでいる同一ＤＮＡセグメント
を再び増幅した。ＳｍａＩ部位およびＢａｍＨＩ部位の間のｐＲＤＦ３へこのＤ
ＮＡ断片をクローニングし、プラスミドｐＲＤＦ４を得た。

【０１４１】５’末端のＢａｍＨＩ部位、および３’末端のＸｂａＩ部位を組込むプライマ
ーを用い、ＰＣＲによるカンジダ・マルトサＡＴＣＣ２８１４０由来ＵＲＡ
３遺伝子の第１増幅によって第２プラスミド構築物を作成した。これらのプライ
マーはＤＮＡ断片を増幅し、オロチジン−５’−リン酸塩デカルボキシラーゼ開
始コドンの上流の部位２８５塩基から１１７１塩基を延長した。さらに、ＵＲＡ
３遺伝子を含む同一ＤＮＡ断片を増幅するのに５’末端のＳｐｈＩ部位、および
３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を組込むプライマーの別のセットを用いた。Ｂａ
ｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位の間のｐＵＣ１８クローニングベクター（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）へＢａｍＨＩ−ＵＲＡ３遺伝
子−ＸｂａＩ断片をクローニングし、ｐＲＤＦ５を得た。ｐＲＤＦ５のＳｐｈＩ
部位およびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にＵＲＡ３遺伝子を含む後者のＤＮＡ断片を
サブクローニングし、ｐＲＤＦ６を得た。その後、ＤＮＡ断片の５’末端のＳａ
ｌＩ部位、および３’末端のＳｐｈＩ部位を組込むプライマーを用い、カンジダ
・マルトサＡＴＣＣ２８１４０からＡｌｋ１−Ａ遺伝子を増幅した。これら
のプライマーはＤＮＡ断片を増幅し、Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ開始コドンに上流の
部位２９１塩基から１９５８塩基を延長した。ＳａｌＩ部位およびＳｐｈＩ部位
の間のプラスミドｐＲＤＦ６へＳａｌＩ−Ｐ４５０Ａｌｋ１−Ａ−ＳｐｈＩ断片
をクローニングし、ｐＲＤＦ７を得た。その後、５’末端でＸｂａＩ部位、およ
び３’末端でＳａｌＩ部位を組み込むプライマーを用い、カンジダ・マルトサ
ＡＴＣＣ２８１４０からＡｌｋ３−Ａ遺伝子を増幅した。これらのプライマー
はＤＮＡ断片を増幅し、Ｐ４５０Ａｌｋ３−Ａ開始コドンの上流の部位２７６塩
基から２０６３塩基を延長した。ＸｂａＩ部位およびＳａｌＩ部位の間のｐＲＤ
Ｆ６へこのＤＮＡ断片をクローニングし、プラスミドｐＲＤＦ８を得た。

【０１４２】スフェロプラスト方法（Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、５：
３３７６〜３３８５、（１９８５））によりカンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６
７７をアデニン原栄養性［ａｄｅ１およびｈｉｓ５］に形質転換するためプラス
ミドＲＤＦ４を用い、ゲノムへプラスミドを組込んだ。サザンブロット方法を用
いた形質転換体のスクリーニングによって、多量のコピー数の形質転換体を選択
した。最も強いシグナルを生じるクローンは、Ｐ４５０レダクターゼ遺伝子の組
み込まれたコピーの中で最も多量のコピー数を含んでいた。多コピー数の形質転
換体をプラスミドＲＤＦ８でウラシル原栄養性に再度形質転換し、ゲノムへプラ
スミドを組込んだ。１−ドデシンの量を増加していく状態で、ドデカンで増殖す
る形質転換体を選択した。高レベルのＰ４５０活性を発現するクローンは、最も
高いＩ−ドデシン濃度で増殖することができる。さらに、ＰＣＲおよび／または
サザンブロット分析を使用し、Ａｌｋ１−Ａに対する発現カセットの組み込みを
確認した。さらに、ＰＣＲおよび／またはサザンブロット分析を使用し、二重形
質転換体のゲノムへＡｌｋ１−Ａ、Ａｌｋ３−ＡおよびＰ４５０レダクターゼ遺
伝子に対する発現カセットが組み込みこまれたことを確認した。

【０１４３】二重形質転換したカンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７は、０．０５％のト
ゥイーン８０および１０ｇ／Ｌのドデカンを加えたＹＥＰ培地（１０ｇ／Ｌの酵
母エキス＋２０ｇ／Ｌのペプトン（ｐＨ８））で３０℃において２５０ｒｐｍで
振盪しながら後期対数増殖期（Å４８時間）まで増殖した。細胞を遠心分離し、
１０％ＹＥＰ、ｐＨ８で一度洗浄した。細胞を０．０５％トゥイーン８０および
１０ｇ／Ｌのドデカンを添加した１０％ＹＥＰ（ｐＨ８）に再懸濁し、３０℃で
２４時間、２５０ｒｐｍで振盪した。ドデカンの損失およびドデカンジオン酸の
生成は抽出の後ＧＣ分析によって測定した。二重形質転換菌株では、オリジナル
のＡＴＣＣ９０６７７菌株よりもドデカンジオン酸の生成が増大していたこと
を確認した。

【０１４４】実施例６ＰＯＸ４破壊カセットの構築遺伝子特異的プライマーを用いてゲノムＤＮＡからのカンジダ・マルトサＰ
ＯＸ４遺伝子を増幅するとともに、後でプラスミドへ連結するためそれらのフラ
ンキング領域に対して独自の制限酵素切断部位を加えた。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍ
ｅｒＡｍｐｌｉｔａｑｋｉｔ、および後続のサブクローニングに必要なＢａ
ｍＨＩ切断部位（英小文字で示した）を導入するためにプライマー２７（配列番
号２７）およびプライマー２８（配列番号２８）を用いて、標準ＰＣＲ混合物５
０μＬ中で、約１００ｎｇのカンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７［ａｄｅ
１、ｈｉｓ５、ｕｒａ３／ｕｒａ３］ゲノムＤＮＡから１５６７ｂｐのカンジダ
・マルトサＰＯＸ４遺伝子断片（９０８〜２４１２位）をＰＣＲ増幅した。プライマー２７−（配列番号２７）：５’−ＧＧＧＴＣＡＣｇｇａｔｃｃＡＡＴＧＴＴＧＣＴＧＧ−３’ プライマー２８−（配列番号２８）：５’−ＧＣＡＧＣＡＧＴＧＴＡＴｇｇａｔｃｃＴＴＡＧＴＧＴＴＣＴＴＴＧＧＴ
ＧＧＧ−３’ 増幅は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ
９６００で、９４℃１分、５５℃１分、７２℃２分からなる１サイクルを３５サ
イクルして実施した。最後のサイクルに続いて、７２℃で５分間の延長時間を設
け、その後、その試料を４℃で保持してからゲル電気泳動による分析をした。フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ）で
望みの１５６７ｂｐのＤＮＡ断片を含む反応物を抽出し、そのＤＮＡをエタノー
ルで沈殿させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ
）に再懸濁した。ＢａｍＨＩで１５６７ｂｐのＤＮＡ断片を消化し、ＢａｍＨＩ
消化ｐＢＲ３２２（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ．Ｂｅｖｅｒｌｙ
、ＭＡ）に連結した。その連結されたＤＮＡを使用して大腸菌ＤＭ１（Ｇｉｂｃ
ｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を形質転換し、アンピシリン耐性
、テトラサイクリン感受性形質転換体からのプラスミドＤＮＡを分析することに
よって、望みのプラスミドの存在を確認し、それをｐＢＲ−ＣＭＰＯＸ４と命名
した。

【０１４５】ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉｔａｑｋｉｔ、および後続のサブク
ローニングに必要なＢｃｌＩ切断部位（英小文字で示した）を導入するためにプ
ライマー２９（配列番号２９）およびプライマー３０（配列番号３０）を用いて
、標準ＰＣＲ混合物５０μＬで、約１００ｎｇのカンジダ・マルトサＡＴＣＣ
９０６２５［ａｄｅ１、ｈｉｓ５、ｕｒａ３／ｕｒａ３］ゲノムＤＮＡからカ
ンジダ・マルトサＵＲＡ３遺伝子（８〜１１９２位）を含んでいる１１８４ｂ
ｐのＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。プライマー２９−（配列番号２９）：５’−ＧＡＣＴＴｔｇａｔｃａＡＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＴ−３’ プライマー３０−（配列番号３０）：５’−ＡＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＧＡＣＴＣＴｔｇａｔｃａＣＴ
−３’ 増幅は、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ
９６００で、９４℃１分、５０℃１分、７２℃２分からなる１サイクルを３５サ
イクルして実施した。最後のサイクルに続いて、７２℃で５分間の延長時間を設
け、その後、その試料を４℃で保持してからゲル電気泳動による分析をした。フ
ェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１ｖ／ｖ）で
望みの１１８４ｂｐのＤＮＡ断片を含んでいる反応物を抽出し、そのＤＮＡをエ
タノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭのＥ
ＤＴＡ）に再懸濁した。

【０１４６】ＵＲＡ３選択可能マーカを含んでいる１１８４ｂｐのＰＣＲ断片をＢｃｌＩで
消化し、次いで、ＢｃｌＩＩで消化し、仔牛腸管ホスファターゼで処理したｐＢ
Ｒ−ＣＭＰＯＸ４に連結した。その連結したＤＮＡを使用して大腸菌ＤＨ５αコ
ンピテント細胞（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）を形質
転換し、アンピシリン抵抗性のプラスミドＤＮＡを分析することによって望みの
プラスミドの存在を確認し、ｐＢＲ−ｐｏｘ４：：ＵＲＡ３と命名した。Ｂａｍ
ＨＩでこのプラスミドを消化し、ＰＯＸ４標的遺伝子に相同性の５’側の７７０
ｂｐおよび３’側の７３４ｂｐに隣接したＵＲＡ３選択可能マーカを含んでいる
２．８ｋｂの直鎖状ＰＯＸ４破壊カセットを遊離した。

【０１４７】実施例７破壊したＰＯＸ４遺伝子を有するカンジダ・マルトサ菌株の構築アシルＣｏＡオキシダーゼをコードするＰＯＸ４双方の遺伝子を連続的に破壊
することによって、カンジダ・マルトサのβ−酸化阻害菌株を開発した。なお、
アシルＣｏＡオキシダーゼはβ−酸化経路の第１反応を触媒する酵素である。カ
ンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７はＵＲＡ３遺伝子産物であるオロチジン−
５’−モノホスフェートデカルボキシラーゼを欠失し、増殖にウラシルを要求す
る。ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ
ｏｆＹｅａｓｔ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（編集、Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．）ｐｐ．１２１−１３４、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９９４）の記述のように、プラスミドｐＢＲ−ｐｏｘ
４：ＵＲＡ３由来の２．８ｋｂの直鎖状ＰＯＸ４破壊カセットを使用してカンジ
ダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７を形質転換し、ウラシル原栄養性とした。０．
６７ｇ／Ｌの酵母窒素源ベース（Ｄｉｆｃｏ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、２％（
ｗ／ｖ）グルコース、２％Ｂａｃｔｏ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ）およびアデニン硫
酸塩およびＬ−ヒスチジンを各２０ｍｇ／Ｌを含む補充された最少培地において
、Ｕｒａ⁺の形質転換体を選択した。

【０１４８】独立した２０株のＵｒａ⁺形質転換体から得たＸｍｎＩ消化ゲノムＤＮＡをＰＯＸ４プローブへサザンハイブリダイゼーションすることによって、それぞれ所
望のＰＯＸ４の破壊単一コピーを含んでいることが示された（図１、Ｕｒａ⁺と記したレーンを参照のこと）。これらの結果は、直鎖状ＤＮＡの末端が高度に遺
伝子組換え誘発性であり、また、カンジダ・マルトサゲノムへの組み込みの正確
な部位を規定していることを示している。カンジダ・マルトサは二倍体酵母であ
るため、さらにこれらの形質転換体にはβ−酸化経路を不活性化するために破壊
しなければならないＰＯＸ４遺伝子の別の機能性コピーを含んでいた。引き続き
単一菌株中のＰＯＸ４遺伝子の両コピーを破壊するため、さらに、Ｕｒａ⁺細胞にのみ組み込まれるウラシル生合成経路中間体の有毒な類似体である５−フルオ
ロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を２ｍｇ／ｍＬ含む補足された最少培地でウラシル
要求性の復帰突然変異体を第一次工程とは逆に選択した。したがって、Ｕｒａ^- 細胞のみが生存し、５−ＦＯＡおよびウラシルが混在する存在下で増殖する。Ｆ
ＯＡ耐性で、ウラシル要求性のいくつかの誘導体を単離し、オリジナルのＰＯＸ
４破壊を保持しており、さらにウラシル原栄養性（図１、ＦＯＡ^Rを記載したレーン参照）に関して低い復帰突然変異頻度も示すものを、プラスミドｐＢＲ−ｐ
ｏｘ４：ＵＲＡ３由来の同じｐｏｘ４：：ＵＲＡ３破壊カセットを用いてウラシ
ル原栄養性へ２回目の形質転換をした。形質転換の後、得られたＵｒａ⁺形質転換体の約半分は単独の炭素源としてのドデカン上で増殖することができなかった
が、そのことはそれら形質転換体のβ−酸化経路が阻害されたことを示唆してい
る。これら形質転換体をサザンハイブリダイゼーションにより分析して、ＰＯＸ
４遺伝子の両ゲノムのコピーが破壊されたことを確認した（図１、β−阻害と記
載したレーンを参照のこと）。その後の分析で、これらの形質転換体に剰余のア
シルＣｏＡ酸化酵素活性およびドデカンをＤＤＤＡに変換する能力が存在しない
ことを確認した。各ＵＲＡ３介在の遺伝子破壊は、後続のチトクロームＰ４５０
モノオキシゲナーゼおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ遺伝
子の増幅において、識別の組み込み標的を提供するのに都合がよい。

【０１４９】実施例８破壊したＰＯＸ４遺伝子、および隔たった他の栄養要求性マーカを有するカン
ジダ・マルトサ菌株の構築ＮｄｅＩ部位（英小文字で示した）を組込んだプライマー３１（配列番号３１
）およびプライマー３２（配列番号３２）を用いて、ＰＣＲによってカンジダ・
マルトサＡＤＥ１遺伝子を単離し、さらにｐＵＣ１８ｍ（ＳｐｅＩおよびＮｈ
ｅＩの制限酵素切断部位がポリリンカー領域のＳａｌＩおよびＸｂａＩの間に挿
入されたｐＵＣ１８の誘導体）のＮｄｅＩ部位にサブクローニングしｐＳＷ８１
を作製した。プライマー３１−（配列番号３１）：５’−ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＴｃａｔａｔｇＡＣＡＴＴＧＴＴＴＣＧ−３
’ プライマー３２−（配列番号３２）：５’−ＣＴＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧｃａｔａｔｇＴＴＧＣＡＴＴＡＴＣ−３’ ＮｄｅＩ部位（英小文字で示した）を組込んだプライマー３３（配列番号３３）
およびプライマー３４（配列番号３４）を用いて、ＰＣＲによってカンジダ・マ
ルトサＨＩＳ５遺伝子を単離し、ｐＵＣ１８ｍのＮｄｅＩ部位へサブクローニ
ングしてｐＳＷ８２を作製した。プライマー３３−（配列番号３３）：５’−ＴＴＴＧＧＴＴＧＡＣＴｃａｔａｔｇＴＧＡＧＣＧＣＧＧＴＡＡＡＧ−３
’ プライマー３４−（配列番号３４）：５’−ＧＴＴＴＴＧＴＣＴＧＧＣｃａｔａｔｇＴＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＧ−３
’ 実施例７に記述した１つのβ−阻害カンジダ・マルトサ形質転換体（Ｃａｎｄ
ｉｄａｍａｌｌｏｓａ１１−１１と称する）を、さらに、ＡＴＣＣ９０６
７７に由来する残っている２つの栄養要求性、アデニンおよびヒスチジンを除去
するよう改変した。この除去は、実質的にＧｉｅｔｚらの記述（Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：２５５−２６９、（１９９６））の塩化
リチウム形質転換方法に基づき、ｐＳＷ８１およびｐＳＷ８２でカンジダ・マル
トサ１１−１１を同時形質転換し、アデニンまたはヒスチジンの補充のない最
小平板培地（１．３４％アミノ酸非含有の酵母窒素源ベース、２％（ｗ／ｖ）
グルコース）上で３０℃において選択して行った。得られた菌株はカンジダ・マ
ルトサＳＷ８１／８２と称し、ＡＴＣＣ受託番号７４４３１として同定する。

【０１５０】実施例９増大されたアルカンヒドロキシル化活性および破壊したＰＯＸ４遺伝子を発現
するカンジダ・マルトサ菌株の構築実施例２に記述したようなカンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０Ａｌｋ
１−Ａ発現カセットをＳｐｅＩおよびＮｈｅＩの間のｐＳＷ８１にサブクローニ
ングし（実施例８に記述）、ｐＳＷ８３を作製した（図２を参照のこと）。実施
例４に記述したカンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクタ
ーゼ発現カセットをｐＳＷ８３ＮｈｅＩへサブクローニングしてｐＳＷ８４を
作製した。それは、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−ＡおよびチトクロームＰ４
５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼの両方に対する発現カセット、さらにａｄｅ１選
択可能マーカを含んでいる（図４を参照のこと）。実施例３に記述のカンジダ・
マルトサチトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−Ａ発現カセットをＳｐｅＩおよびＮｈ
ｅＩの間のｐＳＷ８２へサブクローニングしｐＳＷ８５を作製した。実施例４に
記述のカンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ発現
カセットをｐＳＷ８５ＮｈｅＩへサブクローニングしｐＳＷ８７を作製した。
それは、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−ＡおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡ
ＤＰＨレダクターゼの両方に対する発現カセット、さらにｈｉｓ５選択可能なマ
ーカを含んでいる。

【０１５１】実質的にＧｉｅｔｚらの記述（ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ
．、５：２５５〜２６９、（１９９６））の塩化リチウム形質転換方法に基づき
、ｐＳＷ８４（図４を参照のこと）およびｐＳＷ８７（図５を参照のこと）で１
１−１１と称するカンジダ・マルトサβ−阻害株を同時形質転換し、アデニンま
たはヒスチジンを補充した最小平板培地（１．３４％アミノ酸非含有の酵母窒
素源ベース、２％（ｗ／ｖ）グルコース）、あるいは補充のない最小平板培地上
で３０℃において選択した。ＰＣＲおよび／またはサザン分析によって、チトク
ロームＰ４５０Ａｌｋ１−ＡおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクタ
ーゼ（カンジダ・マルトサＳＷ８４と称される菌株）、チトクロームＰ４５０Ａ
ｌｋ３−ＡおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨレダクターゼ（カンジダ・
マルトサＳＷ８７と称される菌株）、またはチトクロームＰ４５０Ａｌｋ１−Ａ
、チトクロームＰ４５０Ａｌｋ３−ＡおよびチトクロームＰ４５０−ＮＡＤＰＨ
レダクターゼ（カンジダ・マルトサＳＷ８４／８７と称される菌株）に対する発
現カセットの染色体組み込みを確認した。カンジダ・マルトサＳＷ８４／８７．
２と称する１つのカンジダ・マルトサＳＷ８４／８７二重形質転換体は、ＡＴ
ＣＣ受託番号７４４３０として同定する。ＹＥＰＤ（１％酵母エキス、２％ペプ
トン、２％グルコース）において３０℃で飽和（２４時間）までカンジダ・マル
トサＳＷ８４、カンジダ・マルトサＳＷ８７およびカンジダ・マルトサＳＷ８４
／８７を増殖した後、細胞を遠心分離によって収集し、実施例１に記載のように
ガラスビーズで破砕して半透明な溶解産物を生成し、また、実施例１に記載のよ
うに水酸化（ヒドロキシル化）活性について分析した。カンジダ・マルトサＳＷ
８４、カンジダ・マルトサＳＷ８７およびカンジダ・マルトサ８４／８７はそ
れぞれ、ＤＤＤＡへのラウリン酸の変換を示した。

【０１５２】実施例１０カンジダ・マルトサ菌株ＳＷ８１／８２（ＡＴＣＣ７４４３１）によるドデ
カンからのドデカンジオン酸（ＤＤＤＡ）の生成カンジダ・マルトサＳＷ８１／８２（ＡＴＣＣ７４４３１）の５ｍＬの種菌
をＹＥＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、および２０
ｇ／Ｌのグルコース）に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃下に２４時
間増殖した。得られた混合物をｐＨ５の酵母最少培地（３ｇ／Ｌの（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄、６．６ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ₄、０．６ｇ／Ｌの
無水ＭｇＳＯ₄、４ｇ／Ｌの酵母エキス、７５ｇ／Ｌのグルコース、１００μｇ／Ｌのビオチン、１３ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｕＳＯ₄ ・５Ｈ₂Ｏ、２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、６ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ₄・Ｈ₂ Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏ（ＮＯ₃）２・６Ｈ₂Ｏ、３ｍｇ／ＬのＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂ Ｏおよび１．６ｍｇ／ＬのＫＩ）３５０ｍＬへ接種し、２５０ｒｐｍで振盪しな
がら３０℃で２４時間増殖した。ｐＨ５の酵母最少培地７Ｌを含んでいる発酵槽
（Ｂｒａｕｎ）に一晩の培養物を接種した。溶存酸素が大気の２０％になるまで
、発酵槽を最小気流および撹拌で保持した。その後、大気の約８０％まで溶存酸
素を上昇させ、発酵槽を３０℃で２ｖｖｍまでエアレーションを、１４００ｒｐ
ｍまで撹拌を制御することによって保持した。１０％ｗ／ｖのＮＨ₄ＯＨを添加して細胞成増殖における窒素を供給し、また、ｐＨ５に培地を保持した。約１４
時間後に、グルコース濃度は０近くまで減少した。その後、ドデカンを最終濃度
約２０ｇ／Ｌまで添加した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨを添加することによってｐＨ
７．５に培地のｐＨを調節した。培地へ２０％ｗ／ｖのＫＯＨをさらに添加して
、残余の発酵に対してｐＨを７．５に保持した。ドデカン濃度を定期的にモニタ
ーし、３ｇ／Ｌ以上に保持した。さらに、１分間当たりグルコース０．２〜０．
８ｇの遅い速度でグルコースを供給し、グルコース濃度をモニターした。１ｇグ
ルコース／Ｌより低いグルコース濃度を保持するため、グルコース供給は遅い速
度とした。ドデカン添加後約６９時間に、発酵槽から物質を収集し、ＤＤＤＡに
ついて分析した。

【０１５３】２Ｍのリン酸でその液体をｐＨ２へ酸性化し、生じた沈殿物質を３回５ｍＬの
メチル第三級ブチルエーテルへ抽出することによって全発酵槽液体（細胞および
上清）からＤＤＤＡを回収した。エーテル抽出物の部分を蒸発乾固し、その回収
したＤＤＤＡをＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロア
セトアミド）と反応させて、上記で明示した標準状態下でＧＣによって検出可能
な誘導体を形成した。

【０１５４】発酵槽からのＤＤＤＡは２８．８ｇ／Ｌ、または全収率１８７ｇであった。平
均の生産率は２．７ｇＤＤＤＡ／時間であった。

【０１５５】実施例１１カンジダ・マルトサ８４／８７．２（ＡＴＣＣ７４４３０）によるドデカ
ンからのドデカンジオン酸（ＤＤＤＡ）の生成カンジダ・マルトサ株８４／８７．２（ＡＴＣＣ７４４３０）の１０ｍＬの
種菌を、ＹＥＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、およ
び２０ｇ／Ｌのグルコース）に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃下に
２４時間、増殖した。得られた混合物をｐＨ５の酵母最少培地（３ｇ／Ｌの（Ｎ
Ｈ₄）₂ＳＯ₄、６．６ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ₄、０．６
ｇ／Ｌの無水ＭｇＳＯ₄、４ｇ／Ｌの酵母エキス、７５ｇ／Ｌのグルコース、１００μｇ／Ｌのビオチン、１３ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣ
ｕＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、６ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ ₄ ・Ｈ₂Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏ（ＮＯ₃）２・６Ｈ₂Ｏ、３ｍｇ／ＬのＮａＭｏＯ₄ ・２Ｈ₂Ｏおよび１．６ｍｇ／ＬのＫＩ）２×３５０ｍＬへ接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間増殖した。ｐＨ５の酵母最少培地７Ｌを含ん
でいる発酵槽（Ｂｒａｕｎ）に一晩の培養物５２５ｍＬを接種した。溶存酸素が
大気の２０％になるまで、発酵槽を最小気流および撹拌で保持した。その後、大
気の約８０％まで溶存酸素を上昇させ、発酵槽を３０℃で２ｖｖｍまでエアレー
ションを、１４００ｒｐｍまで撹拌を制御することによって保持した。１０％ｗ
／ｖのＮＨ₄ＯＨを添加して細胞成増殖における窒素を供給し、また、ｐＨ５に培地を保持した。約１８時間後に、グルコース濃度は０近くまで減少した。その
後、ドデカンを最終濃度約２０ｇ／Ｌまで添加した。２０％ｗ／ｖのＫＯＨを添
加することによってｐＨ７．５に培地のｐＨを調節した。さらに２０％ｗ／ｖの
ＫＯＨを添加して、残余の発酵に対して培地のｐＨを７．５に保持した。ドデカ
ン濃度を定期的にモニターし、３ｇ／Ｌ以上に保持した。さらに、１分間当たり
０．２〜０．８ｇの遅い速度でグルコースを供給し、グルコース濃度をモニター
した。１ｇグルコース／Ｌより低いグルコース濃度を保持するため、グルコース
供給は遅い速度とした。ドデカン添加の約５１時間後に、発酵槽から物質を収集
し、ＤＤＤＡについて分析した。

【０１５６】２Ｍのリン酸でその液体をｐＨ２へ酸性化し、生じた沈殿物質を３回５ｍＬの
メチル第三級ブチルエーテルへ抽出することによって全発酵槽液体（細胞および
上清）からＤＤＤＡを回収した。エーテル抽出物の部分を蒸発乾固し、その回収
したＤＤＤＡをＭＳＴＦＡ（Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロア
セトアミド）および１％ＴＭＣＳ（トリメチルクロロシラン）と反応させて、上
記で明示した標準状態下でＧＣによって検出可能な誘導体を形成した。

【０１５７】発酵槽からのＤＤＤＡは２１．６ｇ／Ｌ、または全収率１７３ｇであった。カ
ンジダ・マルトサＳＷ８４／８７．２における平均の生産率は３．４ｇＤＤＤ
Ａ／時間であり、カンジダ・マルトサＳＷ８１／８２における生産率よりも２０
％生産が向上した。

【０１５８】実施例１２カンジダ・マルトサ菌株８４／８７．２（ＡＴＣＣ７７４３０）によるラウ
リン酸メチルエステルからのドデカンジオン酸（ＤＤＤＡ）の生成カンジダ・マルトサ株８４／８７．２（ＡＴＣＣ７４４３０）の１０ｍＬの
種菌を、ＹＥＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母エキス、２０ｇ／Ｌのペプトン、およ
び２０ｇ／Ｌのグルコース）に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃下に
２４時間、増殖した。この種培養物をｐＨ５の酵母最少培地（３ｇ／Ｌの（ＮＨ ₄ ）₂ＳＯ₄、６．６ｇ／ＬのＫＨ₂ＰＯ₄、０．４ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ₄、０．６ｇ
／Ｌの無水ＭｇＳＯ₄、４ｇ／Ｌの酵母エキス、７５ｇ／Ｌのグルコース、１００μｇ／Ｌのビオチン、１３ｍｇ／ＬのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｕ
ＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ、２０ｍｇ／ＬのＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、６ｍｇ／ＬのＭｎＳＯ₄ ・Ｈ₂Ｏ、２ｍｇ／ＬのＣｏ（ＮＯ₃）２・６Ｈ₂Ｏ、３ｍｇ／ＬのＮａＭｏＯ₄・
２Ｈ₂Ｏおよび１．６ｍｇ／ＬのＫＩ）３５０ｍＬへ２回接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３０℃で２４時間増殖した。ｐＨ５の酵母最少培地７Ｌを含んで
いる発酵槽（Ｂｒａｕｎ）に一晩の培養物５２５ｍＬを接種した。溶存酸素が大
気の２０％になるまで、発酵槽を最小気流および撹拌で保持した。その後、大気
の約８０％まで溶存酸素を上昇させ、発酵槽を３０℃で２ｖｖｍまでエアレーシ
ョンを、１４００ｒｐｍまで撹拌を制御することによって保持した。１０％ｗ／
ｖのＮＨ₄ＯＨを添加して細胞成増殖における窒素を供給し、また、培地をｐＨ５に保持した。発酵槽中のグルコース濃度が１ｇ／Ｌ未満に減少したとき、ラウ
リン酸メチルエステルを最終濃度約５ｇ／Ｌまで添加した。２０％ｗ／ｖのＫＯ
Ｈを添加することによって培地のｐＨを７．５に調節した。さらに２０％ｗ／ｖ
のＫＯＨを添加して、残余の発酵に対して培地のｐＨを７．５に保持した。ラウ
リン酸メチルエステルの濃度を定期的にモニターし、３ｇ／Ｌ以上に保持した。
さらに、１分間当たり０．２〜０．８ｇの遅い速度でグルコースを供給し、グル
コース濃度をモニターした。１ｇグルコース／Ｌより低いグルコース濃度を保持
するため、グルコース供給は遅い速度とした。４８時間後にラウリン酸メチルエ
ステル添加を中止し、ラウリン酸メチルエステルが検出できなくなるまでその反
応を優先した。発酵槽から物質を収集し、ＤＤＤＡを回収した。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＯＸ４遺伝子で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）ＸｍｎＩ消化ゲノムＤＮＡのサザ
ンブロットによるβ−酸化が阻害されたカンジダ・マルトサ菌株の系図を示す。

【図２】ｐＳＷ８３の制限地図である。

【図３】ｐＳＷ８４の制限地図である。

【図４】ｐＳＷ８５の制限地図である。

【図５】ｐＳＷ８７の制限地図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１月２１日（２０００．１．２１）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/15 (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:72）Ｃ１２Ｒ 1:72）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者ペインマークエス. アメリカ合衆国 19808 デラウェア州ウィルミントンニューウェルドライブ 2408 (72)発明者ピカタジオスティーブンケー. アメリカ合衆国 19350 ペンシルベニア州ランデンバーグメドウウッドレーン 17 (72)発明者ウーシジュンアメリカ合衆国 19720 デラウェア州ニューキャッスルコーンストークドライブ 834

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）遺伝工学技術が施された、アルカンヒドロキシル化活性
により特徴づけられる形質転換された、ピヒア・パストリスを少なくとも１つの
Ｃ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素と好気条件下で接触させることと、ｂ）Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸を回収することとを含むことを特徴とする、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸の生物学的産生方法。
【請求項２】形質転換されたピヒア・パストリスがＡＴＣＣ７４４０９と
して同定される菌株ＳＷ６４／６５であり、少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素がドデカンであり、回収された産物がドデカンジオン酸であることを
特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする
外来遺伝子の少なくとも１つのコピーと、任意選択でｂ）チトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする外来遺伝子の少なくとも１
つのコピーとを含む形質転換されたピヒア・パストリスであって、前記各遺伝子が、少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素との接触でアルカンヒドロキシル化活性が増大するように適当な制御要素に操作可能的に結合
されていることを特徴とする、ピヒア・パストリス。
【請求項４】チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする外来
遺伝子がＡｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌ
ｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６）、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ
１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ７（Ｄ１２７１９）、お
よびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）からなる群から選択されることを特徴とする、請
求項３に記載の形質転換されたピヒア・パストリス。
【請求項５】チトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする外来遺伝子
がチトクロームＰ４５０レダクターゼ（Ｄ２５３２７）であることを特徴とする
、請求項３に記載の形質転換されたピヒア・パストリス。
【請求項６】ａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ１−Ａ
およびチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡｌｋ３−ＡをコードするＤＮ
Ａ断片の群から選択される、カンジダ・マルトサＡＴＣＣ９０６７７由来の少な
くとも１つのＤＮＡ断片と、任意選択で、ｂ）チトクロームＰ４５０レダクターゼをコードするカンジダ・マルトサＡＴＣ
Ｃ９０６７７由来の少なくとも１つのＤＮＡ断片とを含む、アルカンヒドロキシル化活性の増大により特徴づけられる安定して形質
転換されたピヒア・パストリス菌株であって、前記各ＤＮＡ断片が、少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素との接触でアルカンヒドロキシル化活性が増大するように適当な制御要素に操作可能的に
結合されていることを特徴とする、ピヒア・パストリス菌株。
【請求項７】ＡＴＣＣ７４４０９として同定される形質転換されたピヒア
・パストリス菌株がＳＷ６４／６５。
【請求項８】ａ）遺伝工学技術が施されたアルカンヒドロキシル化活性の
増大により特徴づけられる形質転換されたカンジダ・マルトサを少なくとも１つ
のＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素と好気条件下で接触することと、ｂ）Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸を回収することとを含むことを特徴とする、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸の生物学的産生方法。
【請求項９】ａ）ｉ）Ａｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ（
Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６
）、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ７
（Ｄ１２７１９）、およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）からなる群から選択される
チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のさらに少なくと
も１つのコピー、または、ｉｉ）チトクロームＰ４５０レダクターゼ（Ｄ２５３２７）をコードする遺伝子
のさらに少なくとも１つのコピー、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両遺伝子のさらに少なくとも１つのコピーによって生じる遺伝工学技術が施されたアルカンヒドロキシル化活性の増大と、
ｂ）少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素がドデカンであり、ｃ）回収された産物がドデカンジオン酸であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】ａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードす
る遺伝子のさらに少なくとも１つのコピー、または、ｂ）チトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子のさらに少なくとも
１つのコピー、または、ｃ）Ｐ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびチトクロームＰ４５
０レダクターゼをコードする遺伝子双方のさらに少なくとも１つのコピーを含む形質転換されたカンジダ・マルトサであって、前記各遺伝子が、少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素との接触でアルカンヒドロキシル化活性が増大するように適当な制御要素に操作可能的に結合
されていることを特徴とする、カンジダ・マルトサ。
【請求項１１】チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺
伝子がＡｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ
３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６）、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１
２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ７（Ｄ１２７１９）および
Ａｌｋ８（Ｄ１２７１９）からなる群から選択されること特徴とする、請求項１
０に記載の形質転換されたカンジダ・マルトサ。
【請求項１２】チトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子が
チトクロームＰ４５０レダクターゼ（Ｄ２５３２７）であることを特徴とする、
請求項１０に記載の形質転換されたカンジダ・マルトサ。
【請求項１３】ａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ１
−ＡおよびチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ３−Ａをコードする
ＤＮＡ断片の群から選択されるカンジダ・マルトサ（ＡＴＣＣ９０６７７）由
来の少なくとも１つのＤＮＡ断片と、ｂ）カンジダ・マルトサ（ＡＴＣＣ９０６７７）由来のチトクロームＰ４５０
レダクターゼをコードする少なくとも１つのＤＮＡ断片とを含む形質転換されたカンジダ・マルトサであって、前記各遺伝子が、少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素と接触することでアルカンヒドロキシル化活性を増大するように適当な制御要素に操作可能的
に結合されていることを特徴とする、カンジダ・マルトサ。
【請求項１４】ａ）遺伝子工学技術が施され、β−酸化経路が阻害され
ていることにより特徴づけられる形質転換されたカンジダ・マルトサを、少なく
とも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素と好気条件下で接触させることと、ｂ）Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸を回収することとを含むことを特徴とする、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸の生物学的産生増大の方法。
【請求項１５】形質転換されたカンジダ・マルトサのβ−酸化経路がアシ
ルＣｏＡオキシダーゼをコードする両ＰＯＸ４遺伝子を破壊することによって機
能的に阻害されたことを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする両ＰＯＸ４遺伝子
を破壊することによって機能的に阻害されたβ−酸化経路により特徴づけられる
、形質転換されたカンジダ・マルトサ。
【請求項１７】単一のＵＲＡ３選択可能マーカを使用するアシルＣｏＡオ
キシダーゼをコードする両ＰＯＸ４遺伝子の破壊により機能的に阻止されるβ−
酸化経路により特徴づけられる、形質転換されたカンジダ・マルトサ。
【請求項１８】ＡＴＣＣ７４４３１として同定される形質転換されたカン
ジダ・マルトサ菌株ＳＷ８１／８２。
【請求項１９】ａ）ｉ）遺伝工学技術が施された、増大されたアルカ
ンヒドロキシル化活性と、ｉｉ）遺伝工学技術が施された、阻害されたβ−酸
化経路とにより特徴づけられる形質転換されたカンジダ・マルトサを少なくとも
１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素と好気条件下で接触させることと、ｂ）Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸を回収することとを含むことを特徴とする、Ｃ₆〜Ｃ₂₂のモノカルボン酸およびジカルボン酸の生物学的産生増大の方法。
【請求項２０】ａ）ｉ）Ａｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ
（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１
６）、Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ
７（Ｄ１２７１９）、およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）からなる群から選択され
るチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子のさらに少なく
とも１つのコピー、または、ｉｉ）チトクロームＰ４５０レダクターゼ（Ｄ２５３２７）をコードする遺伝子
のさらに少なくとも１つのコピー、または、ｉｉｉ）ｉ）およびｉｉ）の両遺伝子のさらに少なくとも１つのコピーによって生じるアルカンヒドロキシル化活性の増大と、ｂ）アシルＣｏＡオキシダーゼをコードする両ＰＯＸ４遺伝子を破壊することに
よって機能的に阻害されたβ−酸化経路とにより特徴づけられる、形質転換されたカンジダ・マルトサ。
【請求項２１】ａ）チトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ１−
ＡおよびチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼＡＬＫ３−ＡをコードするＤ
ＮＡ断片によって生じるアルカンヒドロキシル化活性の増大を特徴とする、請求
項２０に記載の形質転換されたカンジダ・マルトサ菌株。
【請求項２２】ＡＴＣＣ７４４３０として同定される、形質転換されたカ
ンジダ・マルトサ菌株ＳＷ８４／８７．２。
【請求項２３】少なくとも１つのＣ₆〜Ｃ₂₂の直鎖状炭化水素が、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン
、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、
ノナデカン、エイコサン、レネイコサン、ドコサン、ならびにこれらの各々のモ
ノカルボン酸およびエステルからなる群から選択されることを特徴とする、請求
項１、請求項８、請求項１４または請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】ａ）カンジダ・マルトサ由来の少なくとも１つのポリペ
プチドをコードするＤＮＡに操作可能的に結合された第１のカンジダ・マルトサ
プロモータと、ｂ）カンジダ・マルトサ由来の少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮ
Ａに操作可能的に結合された第２のカンジダ・マルトサプロモータとを含むことを特徴とする、ＤＮＡ断片。
【請求項２５】ａ）カンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０モノオキシ
ゲナーゼをコードする遺伝子に操作可能的に結合された第１のカンジダ・マルト
サプロモータと、ｂ）カンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子
に操作可能的に結合された第２のカンジダ・マルトサプロモータとを含むことを特徴とする、ＤＮＡ断片。
【請求項２６】ａ）Ａｌｋ１−Ａ（Ｄ１２４７５）、Ａｌｋ２−Ａ（Ｘ５
５８８１）、Ａｌｋ３−Ａ（Ｘ５５８８１）、Ａｌｋ４−Ａ（Ｄ１２７１６）、
Ａｌｋ５−Ａ（Ｄ１２７１７）、Ａｌｋ６−Ａ（Ｄ１２７１８）、Ａｌｋ７（Ｄ
１２７１９）、およびＡｌｋ８（Ｄ１２７１９）からなる群から選択されるチト
クロームＰ４５０モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子に操作可能的に結合さ
れている第１のカンジダ・マルトサＰＧＫプロモータと、ｂ）カンジダ・マルトサチトクロームＰ４５０レダクターゼをコードする遺伝子
に操作可能的に結合されている第２のカンジダ・マルトサＰＧＫプロモータとを含むことを特徴とする、ＤＮＡ断片。
【請求項２７】ｐＳＷ８４およびｐＳＷ８７からなる群から選択されるこ
とを特徴とする、プラスミド。