JP2001510052A - 高レベルのアビジン発現による植物の雄性不稔の誘発 - Google Patents
高レベルのアビジン発現による植物の雄性不稔の誘発Info
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Abstract
(57)【要約】
植物組織において、アビジンの内因性濃度を増すことにより、雄性不稔の植物を製造することが可能である。この効果は、プロモーターがアビジンをコードするDNA配列に機能的に結合されている発現ベクターを保持するトランスジェニック植物を製造することにより達成できる。雄性稔性を回復する方法についても、同様に開示される。さらに、望ましい穀粒形質を一つ以上有する種子の製造方法も開示する。
Description
【０００１】発明の背景 本発明は、アビジンをコードするDNA分子を用いて、植物の稔性を制御する方 法に関するものである。特に、本発明は、アビジンを発現する、トランスジェニ
ックの雄性不稔植物を作出する方法についてのものである。更に本発明は、雄性
不稔植物の子孫において、雄性稔性を回復する方法にも関する。本発明はまた、
アビジンを発現する雄性不稔植物を用いて、ハイブリッド種子、特に望ましい穀
粒または種子形質を１つ以上有するハイブリッド種子を製造する方法にも関する
。
ックの雄性不稔植物を作出する方法についてのものである。更に本発明は、雄性
不稔植物の子孫において、雄性稔性を回復する方法にも関する。本発明はまた、
アビジンを発現する雄性不稔植物を用いて、ハイブリッド種子、特に望ましい穀
粒または種子形質を１つ以上有するハイブリッド種子を製造する方法にも関する
。
【０００２】発明の背景 花粉の稔性を制御することは、雑種作物の作出には不可欠である。例えば参照
として本明細書に組み入れられる「J.M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS （野
外作物の育成）第３版（Van NorstrandおよびReinhold, New York, NY, 1987） 」参照のこと。例えば雑種トウモロコシの作出にあたっては、典型的には、花粉
がこぼれ落ちる前に、雄性の花序または房毛を物理的に除去することにより、花
粉の稔性を制御することができる。人手で房毛を除去することは、非常な重労働
である。機械を用いて房毛を除去すれば、人手によるよりも手間は省けるが、信
頼性はより低く、後で作物の検査、および通常、人手による補足的な房毛除去を
行わねばならない。どちらの方法による房毛除去でも、雌性親の生存性が低下す
る。
として本明細書に組み入れられる「J.M. Poehlman, BREEDING FIELD CROPS （野
外作物の育成）第３版（Van NorstrandおよびReinhold, New York, NY, 1987） 」参照のこと。例えば雑種トウモロコシの作出にあたっては、典型的には、花粉
がこぼれ落ちる前に、雄性の花序または房毛を物理的に除去することにより、花
粉の稔性を制御することができる。人手で房毛を除去することは、非常な重労働
である。機械を用いて房毛を除去すれば、人手によるよりも手間は省けるが、信
頼性はより低く、後で作物の検査、および通常、人手による補足的な房毛除去を
行わねばならない。どちらの方法による房毛除去でも、雌性親の生存性が低下す
る。
【０００３】 しかしながら、主に関心の対象となる作物としての植物は、ほとんどが、同一
の花の中に、機能的な雄性および雌性両方の器官を有している；このため、除雄
を行うことは単純な過程ではない。花粉がこぼれ落ちる前に花粉を形成する器官
を人手で除去することは可能であるが、この方式による雑種作出は、非常に重労
働および高価である。
の花の中に、機能的な雄性および雌性両方の器官を有している；このため、除雄
を行うことは単純な過程ではない。花粉がこぼれ落ちる前に花粉を形成する器官
を人手で除去することは可能であるが、この方式による雑種作出は、非常に重労
働および高価である。
【０００４】 花粉の稔性はまた、雄性配偶子の特徴を持つスプレーを葉にかけることによっ
ても制御できる。Crossら、Sex Plant Reprod. 4: 235 (1991) 。例えば、2-ク ロロエチルスルホン酸（エスレル）を葯にかけると、コムギでは余分に花粉の有
糸分裂が起き、オオムギではタペート細胞の変性が起き、およびカゼクサでは花
粉の低形成や発育不全が起きる。Bennetら、Nature 240: 566 (1972)、Colhoun ら、Plant Cell Environ. 6: 21 (1983)；Bertheら、Crop Sci. 18: 35 (1978) 。しかしながら、化学的アプローチは重労働で、環境へ化学物質の毒性が持ち込
まれるという潜在的な問題も存在しており、且つ適用の時期に非常に感受性があ
る場合がある。
ても制御できる。Crossら、Sex Plant Reprod. 4: 235 (1991) 。例えば、2-ク ロロエチルスルホン酸（エスレル）を葯にかけると、コムギでは余分に花粉の有
糸分裂が起き、オオムギではタペート細胞の変性が起き、およびカゼクサでは花
粉の低形成や発育不全が起きる。Bennetら、Nature 240: 566 (1972)、Colhoun ら、Plant Cell Environ. 6: 21 (1983)；Bertheら、Crop Sci. 18: 35 (1978) 。しかしながら、化学的アプローチは重労働で、環境へ化学物質の毒性が持ち込
まれるという潜在的な問題も存在しており、且つ適用の時期に非常に感受性があ
る場合がある。
【０００５】 更に、配偶子撲滅剤を用いて雑種種子を商業的に生産することは、化学物質を
利用した場合の信頼性および実効期間と同様に、化学物質の価格および有効性の
点からも、限度がある。配偶子撲滅剤の重大な限界は、遺伝子型により強さが異
なる植物への毒性の影響があることである。他の限界としては、これらの化学物
質は、花期の長い作物には効果的ではない可能性があることで、その理由は、新
しく産生される花々はその影響を受けないと考えられるからである。 結果とし て、化学物質を繰り返し与えることが必要となる。
利用した場合の信頼性および実効期間と同様に、化学物質の価格および有効性の
点からも、限度がある。配偶子撲滅剤の重大な限界は、遺伝子型により強さが異
なる植物への毒性の影響があることである。他の限界としては、これらの化学物
質は、花期の長い作物には効果的ではない可能性があることで、その理由は、新
しく産生される花々はその影響を受けないと考えられるからである。 結果とし て、化学物質を繰り返し与えることが必要となる。
【０００６】 野外作物に関する現行の商業的な雑種種子生産システムは、多くの場合、受粉
制御という遺伝的手段に立脚するものである。雌性として用いられる植物は、花
粉を散らすことが出来ないか、生化学的には自家受粉できない花粉を産生するか
、または花粉を産生できないものかのいずれかである。自家受粉できない植物は
、「自家不和合性」と呼ばれる。自家不和合性システムを用いる際には、自家不
和合性の雌性株の有用性および繁殖性、ならびに自家和合性の安定性が問題とな
る。ある場合には、化学的に、または、花粉を阻害する生化学的な機構が活性化
する前に、人手で未熟な蕾に授粉することにより、自家不和合性を解消すること
ができる。脱活性化できる自家不和合性機構は、しばしば、自家受粉の生化学的
阻害の有効性を喪失または減少させるような、抑圧的な気候状態の害を、非常に
被りやすい。
制御という遺伝的手段に立脚するものである。雌性として用いられる植物は、花
粉を散らすことが出来ないか、生化学的には自家受粉できない花粉を産生するか
、または花粉を産生できないものかのいずれかである。自家受粉できない植物は
、「自家不和合性」と呼ばれる。自家不和合性システムを用いる際には、自家不
和合性の雌性株の有用性および繁殖性、ならびに自家和合性の安定性が問題とな
る。ある場合には、化学的に、または、花粉を阻害する生化学的な機構が活性化
する前に、人手で未熟な蕾に授粉することにより、自家不和合性を解消すること
ができる。脱活性化できる自家不和合性機構は、しばしば、自家受粉の生化学的
阻害の有効性を喪失または減少させるような、抑圧的な気候状態の害を、非常に
被りやすい。
【０００７】 商業的な種子生産に際して、もっと広範に注目されているのは、雄性不稔を引
き起こす、遺伝的な花粉制御に基づく諸システムである。これらのシステムは、
２つのタイプに大別される：(1) 核性雄性不稔、即ち、一つまたはそれ以上の核
内遺伝子の変異によって、花粉形成ができないもの、または(2) 細胞質遺伝性雄
性不稔、即ち、しばしば「細胞質性雄性不稔」（CMS）とよばれ、細胞質小器官 に起きた変化（一般的にはミトコンドリアの場合が多い）により、花粉形成が阻
害または不全となるもの。
き起こす、遺伝的な花粉制御に基づく諸システムである。これらのシステムは、
２つのタイプに大別される：(1) 核性雄性不稔、即ち、一つまたはそれ以上の核
内遺伝子の変異によって、花粉形成ができないもの、または(2) 細胞質遺伝性雄
性不稔、即ち、しばしば「細胞質性雄性不稔」（CMS）とよばれ、細胞質小器官 に起きた変化（一般的にはミトコンドリアの場合が多い）により、花粉形成が阻
害または不全となるもの。
【０００８】 核性不稔性は、優性または劣性のいずれの場合もあり得る。典型的に、優性不
稔性は、雌性株の無性または単為増殖が可能である場合に、雑種種子を形成する
ためにのみ用いることができる。劣性不稔性は、不稔性および稔性の植物をたや
すく区別できる場合には、用いることができる。しかしながら、優性および劣性
不稔性システムは、各々、単為増殖が高価につくこと、および自家受粉可能な植
物の雌性株を間引くことのために、商業的有用性には限りがある。
稔性は、雌性株の無性または単為増殖が可能である場合に、雑種種子を形成する
ためにのみ用いることができる。劣性不稔性は、不稔性および稔性の植物をたや
すく区別できる場合には、用いることができる。しかしながら、優性および劣性
不稔性システムは、各々、単為増殖が高価につくこと、および自家受粉可能な植
物の雌性株を間引くことのために、商業的有用性には限りがある。
【０００９】 CMSの使用を含めた雑種化の計画もあるが、その商業的な価値には限度がある 。CMSシステムの一例として、細胞質にあるミトコンドリアが、適切な核のバッ クグラウンドがあれば、成熟した花粉を形成することができなくなるような、特
異的な変異を持っている場合があげられる。場合によっては、核のバックグラウ
ンドが細胞質性の変異を補って、正常な花粉形成を起こさせることができる。核
の特異的な「回復遺伝子」は、CMSミトコンドリアを持つ植物の、花粉形成を可 能にする。一般的に、商業的な種子生産にCMSを利用することには、３種の交配 株を用いることが含まれる：雄優性不稔性株（雌性親株）、完全な機能を有する
ミトコンドリアを持つ以外は雄性不稔株と同じ遺伝子型をもつ維持株、および雄
性親株である。雄性親株には、細胞質に、特異的な回復遺伝子を持つ場合と持た
ない場合がある。
異的な変異を持っている場合があげられる。場合によっては、核のバックグラウ
ンドが細胞質性の変異を補って、正常な花粉形成を起こさせることができる。核
の特異的な「回復遺伝子」は、CMSミトコンドリアを持つ植物の、花粉形成を可 能にする。一般的に、商業的な種子生産にCMSを利用することには、３種の交配 株を用いることが含まれる：雄優性不稔性株（雌性親株）、完全な機能を有する
ミトコンドリアを持つ以外は雄性不稔株と同じ遺伝子型をもつ維持株、および雄
性親株である。雄性親株には、細胞質に、特異的な回復遺伝子を持つ場合と持た
ない場合がある。
【００１０】 雑種から種子を回収することは重要ではない野菜のような作物には、回復性の
ないCMSシステムを用いることができる。雑種の果実または種子が商業生産物と なるような作物には、雄性親株の持つ回復遺伝子により雑種種子の稔性を回復す
るか、または雄性不稔雑種を授粉してやるかすることが必要である。回復されて
いない雑種の授粉は、授粉させるために、少数の雄性稔性の植物をいれてやるこ
とで達成できる。殆どの種において、すべての細胞質小器官は通常、卵細胞から
のみ遺伝するため、CMS特性は、母系性に遺伝する。
ないCMSシステムを用いることができる。雑種の果実または種子が商業生産物と なるような作物には、雄性親株の持つ回復遺伝子により雑種種子の稔性を回復す
るか、または雄性不稔雑種を授粉してやるかすることが必要である。回復されて
いない雑種の授粉は、授粉させるために、少数の雄性稔性の植物をいれてやるこ
とで達成できる。殆どの種において、すべての細胞質小器官は通常、卵細胞から
のみ遺伝するため、CMS特性は、母系性に遺伝する。
【００１１】 CMSシステムには、不稔植物を生産するための唯一の解決法として、雄性植物 を製造しなければならないという限界がある。例えば、トウモロコシのある特殊
なCMSタイプ（T-細胞質）は、特定の真菌が感染して産生する毒素に対する感受 性を与える。多くの作物で今なお利用されているが、CMSシステムは、特定の環 境条件のもとでは、破壊される可能性がある。
なCMSタイプ（T-細胞質）は、特定の真菌が感染して産生する毒素に対する感受 性を与える。多くの作物で今なお利用されているが、CMSシステムは、特定の環 境条件のもとでは、破壊される可能性がある。
【００１２】 以上のことから、手動、機械、化学物質および伝統的な遺伝的手法以外で、花
粉の生産を制御する手段の必要性が大きいことは、明らかである。
粉の生産を制御する手段の必要性が大きいことは、明らかである。
【００１３】発明の概要 このため、本発明の目的は、アビジンの異種性発現により、不稔性となる雄性
不稔植物を作出する方法を提供することである。
不稔植物を作出する方法を提供することである。
【００１４】 植物性プロモータ配列の支配下に接続した、アビジンをコードするDNA配列を 含むキメラ遺伝子を提供することもさらに、本発明の目的である。
【００１５】 アビジンの発現によって引き起こされた雄性不稔を回復する方法を提供するこ
とも、本発明の更なる目的である。
とも、本発明の更なる目的である。
【００１６】 本発明のもう一つの目的は、望ましい穀粒または種子形質を１つ以上有する種
子を製造する方法を提供することである。
子を製造する方法を提供することである。
【００１７】 これらおよびその他の目的は、植物性プロモーター配列の支配下に接続された
アビジンをコードする塩基配列を含む単離されたDNA分子を調製することにより 、本発明の態様の一つに従って、達成される。好ましい態様において、単離され
たDNA配列は、発現ベクターに含まれる。また別の好ましい態様において、植物 性プロモーター配列は、構成的プロモーターであり、また別の好ましい態様にお
いては、この構成的プロモーターはユビキチンプロモーターである。別の好まし
い態様において、アビジン遺伝子はエクスポートシグナル配列に機能的に結合さ
れている。
アビジンをコードする塩基配列を含む単離されたDNA分子を調製することにより 、本発明の態様の一つに従って、達成される。好ましい態様において、単離され
たDNA配列は、発現ベクターに含まれる。また別の好ましい態様において、植物 性プロモーター配列は、構成的プロモーターであり、また別の好ましい態様にお
いては、この構成的プロモーターはユビキチンプロモーターである。別の好まし
い態様において、アビジン遺伝子はエクスポートシグナル配列に機能的に結合さ
れている。
【００１８】 本発明のまた別の好ましい態様に従って、アビジン遺伝子、および、植物組織
内のアビジン濃度を増加させて雄性不稔を引き起こす異種性の塩基配列を含む、
トランスジェニック植物が提供される。好ましい態様において、トランスジェニ
ック植物は、トウモロコシ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物、またはひまわり
植物である。また別の好ましい態様において、異種性DNA分子は、更に構成的プ ロモーター配列を含み、それはひとつの好ましい態様においては、ユビキチンプ
ロモーター配列である。別の好ましい態様において、異種性DNA分子は、組織特 異的プロモーターをさらに含む。特に好ましい組織特異的プロモーターは、葯特
異的プロモーターである。
内のアビジン濃度を増加させて雄性不稔を引き起こす異種性の塩基配列を含む、
トランスジェニック植物が提供される。好ましい態様において、トランスジェニ
ック植物は、トウモロコシ植物、ダイズ植物、キャノーラ植物、またはひまわり
植物である。また別の好ましい態様において、異種性DNA分子は、更に構成的プ ロモーター配列を含み、それはひとつの好ましい態様においては、ユビキチンプ
ロモーター配列である。別の好ましい態様において、異種性DNA分子は、組織特 異的プロモーターをさらに含む。特に好ましい組織特異的プロモーターは、葯特
異的プロモーターである。
【００１９】 本発明の更にまた別の局面に従って、アビジン遺伝子の発現を制御してアビジ
ン遺伝子の発現により雄性不稔が引き起こされるようなプロモーターおよびアビ
ジン遺伝子を含む発現ベクターを、植物細胞に導入することを含む、トランスジ
ェニックの雄性不稔植物を作出する方法が提供される。好ましい態様において、
トランスジェニック植物は植物細胞から再生される。別の好ましい態様において
、プロモーターはユビキチンプロモーター、組織特異的プロモーター、または誘
導性プロモーターを含む。
ン遺伝子の発現により雄性不稔が引き起こされるようなプロモーターおよびアビ
ジン遺伝子を含む発現ベクターを、植物細胞に導入することを含む、トランスジ
ェニックの雄性不稔植物を作出する方法が提供される。好ましい態様において、
トランスジェニック植物は植物細胞から再生される。別の好ましい態様において
、プロモーターはユビキチンプロモーター、組織特異的プロモーター、または誘
導性プロモーターを含む。
【００２０】 本発明の更に異なる局面に従って、アビジンの発現が雄性不稔を引き起こす上
述したDNA分子を含む第１の親株である雄性不稔植物の作出、第２の外来遺伝子 を発現する第２のトランスジェニックの親植物の作出、および、第１の親株と第
２の親株とを他家授粉させて雑種植物においてアビジンの発現を抑制し、このた
め雄性稔性の雑種植物が作出されるような第２の外来精遺伝子を発現する雑種植
物を作出することを含め、雄性不稔の雑種植物を作出するためにアビジン遺伝子
を用いる方法が提供される。
述したDNA分子を含む第１の親株である雄性不稔植物の作出、第２の外来遺伝子 を発現する第２のトランスジェニックの親植物の作出、および、第１の親株と第
２の親株とを他家授粉させて雑種植物においてアビジンの発現を抑制し、このた
め雄性稔性の雑種植物が作出されるような第２の外来精遺伝子を発現する雑種植
物を作出することを含め、雄性不稔の雑種植物を作出するためにアビジン遺伝子
を用いる方法が提供される。
【００２１】 本発明のこの局面の好ましい態様において、第２の外来遺伝子は、アンチセン
ス遺伝子、リボザイム遺伝子および外部ガイド配列（external guide sequence ）遺伝子からなる群より選択される。また別の好ましい態様において、アンチセ
ンス遺伝子は、更に別の好ましい態様において誘導性プロモーターの制御下にあ
る、アビジンmRNA配列を含む。更にまた別の好ましい態様において、リボザイム
遺伝子は、アビジンmRNA配列を含む。更にまた異なる好ましい態様において、外
部ガイド配列遺伝子は、アビジンmRNA配列を含む。更にまた異なる好ましい態様
において、第１の親植物のDNA分子はさらに、第２の外来遺伝子がLexAリプレッ サー遺伝子である場合、該プロモーター支配下に接続したLexAオペレーターを含
む。別の好ましい態様において、プロモーター配列は、配列番号：４の塩基配列
；配列番号：５の塩基配列；配列番号：６の塩基配列；およびそれらに由来する
機能的断片からなる群より選択される葯ボックスを含む、葯特異的プロモーター
配列である。
ス遺伝子、リボザイム遺伝子および外部ガイド配列（external guide sequence ）遺伝子からなる群より選択される。また別の好ましい態様において、アンチセ
ンス遺伝子は、更に別の好ましい態様において誘導性プロモーターの制御下にあ
る、アビジンmRNA配列を含む。更にまた別の好ましい態様において、リボザイム
遺伝子は、アビジンmRNA配列を含む。更にまた異なる好ましい態様において、外
部ガイド配列遺伝子は、アビジンmRNA配列を含む。更にまた異なる好ましい態様
において、第１の親植物のDNA分子はさらに、第２の外来遺伝子がLexAリプレッ サー遺伝子である場合、該プロモーター支配下に接続したLexAオペレーターを含
む。別の好ましい態様において、プロモーター配列は、配列番号：４の塩基配列
；配列番号：５の塩基配列；配列番号：６の塩基配列；およびそれらに由来する
機能的断片からなる群より選択される葯ボックスを含む、葯特異的プロモーター
配列である。
【００２２】 本発明のこの局面の更にまた別の好ましい態様において、葯ボックスは配列番
号：４、配列番号：５、または配列番号：６の塩基配列を持ち、葯特異的プロモ
ーター配列は更に、CaMV 35Sコアプロモーター；配列番号：７の塩基配列；配列
番号：８の塩基配列；配列番号：９の塩基配列；およびそれらに由来する機能的
断片をからなる群より選択されるコアプロモーターを含む。
号：４、配列番号：５、または配列番号：６の塩基配列を持ち、葯特異的プロモ
ーター配列は更に、CaMV 35Sコアプロモーター；配列番号：７の塩基配列；配列
番号：８の塩基配列；配列番号：９の塩基配列；およびそれらに由来する機能的
断片をからなる群より選択されるコアプロモーターを含む。
【００２３】 本発明の更に別な局面に従って、ビオチン溶液を植物に噴霧することを含む、
アビジンの発現により雄性不稔となった植物の稔性を回復する方法が提供される
。
アビジンの発現により雄性不稔となった植物の稔性を回復する方法が提供される
。
【００２４】 本発明のさらにもう一つの局面に従って、目的とする穀粒または種子形質を１
つ以上有する種子を製造する方法が提供される。本発明の好ましい態様において
、雄性不稔であってアビジン遺伝子のコピーを１つ以上有する第一の親植物を雌
性の親として、雄性稔性であって目的とする穀粒または種子形質を１つ以上有す
る第二の親植物と交雑させる。雄性の親の穀粒または種子形質を有する種子が産
生される。好ましい態様において、親植物はトウモロコシ、ダイズ、キャノーラ
、またはヒマワリである。本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、ア
ビジン遺伝子はストレプトアビジン遺伝子である。
つ以上有する種子を製造する方法が提供される。本発明の好ましい態様において
、雄性不稔であってアビジン遺伝子のコピーを１つ以上有する第一の親植物を雌
性の親として、雄性稔性であって目的とする穀粒または種子形質を１つ以上有す
る第二の親植物と交雑させる。雄性の親の穀粒または種子形質を有する種子が産
生される。好ましい態様において、親植物はトウモロコシ、ダイズ、キャノーラ
、またはヒマワリである。本発明のさらにもう一つの好ましい態様において、ア
ビジン遺伝子はストレプトアビジン遺伝子である。
【００２５】好ましい態様の詳細な説明 1. 定義 以下の記載において、多くの用語が広範に用いられている。以下の定義は、本
発明の理解を容易にするため、規定されている。
発明の理解を容易にするため、規定されている。
【００２６】 構造遺伝子は、メッセンジャーRNA（mRNA）に転写された後、特異的なポリペ プチドに特徴的なアミノ酸配列に翻訳されるDNA配列である。
【００２７】 外来遺伝子は、本記載においては、少なくとも一つの異種性の調節要素の支配
下に接続されたDNA配列を意味する。例えば、トウモロコシの5126構造遺伝子以 外のどんな遺伝子でも、その遺伝子の発現が、5126遺伝子の葯特異的調節要素に
よって制御されている場合には、外来遺伝子とみなされる。
下に接続されたDNA配列を意味する。例えば、トウモロコシの5126構造遺伝子以 外のどんな遺伝子でも、その遺伝子の発現が、5126遺伝子の葯特異的調節要素に
よって制御されている場合には、外来遺伝子とみなされる。
【００２８】 プロモーターは、構造遺伝子、アンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子または
外部ガイド配列遺伝子のような遺伝子の転写を支配するDNA配列である。典型的 には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位付近の5'側領域に位置する。プロ
モーターが誘導性プロモーターである場合には、転写の割合は誘導剤に応じて増
加する。これに対し、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写
の割合は誘導剤による制御を受けない。植物性プロモーターは、植物組織におい
て、遺伝子の転写を支配するようなプロモーター配列である。
外部ガイド配列遺伝子のような遺伝子の転写を支配するDNA配列である。典型的 には、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位付近の5'側領域に位置する。プロ
モーターが誘導性プロモーターである場合には、転写の割合は誘導剤に応じて増
加する。これに対し、プロモーターが構成的プロモーターである場合には、転写
の割合は誘導剤による制御を受けない。植物性プロモーターは、植物組織におい
て、遺伝子の転写を支配するようなプロモーター配列である。
【００２９】 コアプロモーターは、TATAボックスおよび転写開始部位を含む、プロモーター
機能に必須の塩基配列を含む。この定義により、コアプロモーターは、その活性
を促進するか、または組織特異的な活性に関与する、特異的な配列が欠如した場
合には、検出できるような活性を持つことも持たないこともある。例えば、SGB6
コアプロモーターは、SGB6遺伝子の転写開始部位5'側の、約38塩基を含むが、カ
リフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35sコアプロモーターは、35Sゲノムの転
写開始部位5'側の、約33塩基を含む。
機能に必須の塩基配列を含む。この定義により、コアプロモーターは、その活性
を促進するか、または組織特異的な活性に関与する、特異的な配列が欠如した場
合には、検出できるような活性を持つことも持たないこともある。例えば、SGB6
コアプロモーターは、SGB6遺伝子の転写開始部位5'側の、約38塩基を含むが、カ
リフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35sコアプロモーターは、35Sゲノムの転
写開始部位5'側の、約33塩基を含む。
【００３０】 組織特異的プロモーターは、その支配下に遺伝子が接続された場合、ある生物
の特定の組織において、その他のいくつか、またはすべての組織におけるよりも
高いレベルで、その遺伝子の発現を引き起こすDNA配列である。例えば、葯特異 的プロモーターは、植物の葯組織における関連する遺伝子の転写を高レベルにさ
せるDNA配列である。たとえば、SGB6の葯特異的プロモーターは、葯組織におい て外来遺伝子の発現を引き起こすことができるが、根組織または子葉鞘組織にお
いては、発現を引き起こさない。
の特定の組織において、その他のいくつか、またはすべての組織におけるよりも
高いレベルで、その遺伝子の発現を引き起こすDNA配列である。例えば、葯特異 的プロモーターは、植物の葯組織における関連する遺伝子の転写を高レベルにさ
せるDNA配列である。たとえば、SGB6の葯特異的プロモーターは、葯組織におい て外来遺伝子の発現を引き起こすことができるが、根組織または子葉鞘組織にお
いては、発現を引き起こさない。
【００３１】 本明細書において用いられているように、「葯特異的プロモーター」は、２つ
の機能要素を含む：「葯ボックス」およびコアプロモーターである。特定の葯ボ
ックスは、古典的なエンハンサーの機能的特徴を有している可能性がある。一つ
の葯ボックスおよび一つのコアプロモーターの組み合わせは、コアプロモーター
単独の場合よりも高い程度で、遺伝子発現を促進することができる。このことは
、異なる遺伝子に由来する葯ボックスおよびコアプロモーターを含む、キメラの
葯特異的プロモーターの場合についてさえも正しい。そのようなキメラの葯特異
的調節要素については、以下で述べる。
の機能要素を含む：「葯ボックス」およびコアプロモーターである。特定の葯ボ
ックスは、古典的なエンハンサーの機能的特徴を有している可能性がある。一つ
の葯ボックスおよび一つのコアプロモーターの組み合わせは、コアプロモーター
単独の場合よりも高い程度で、遺伝子発現を促進することができる。このことは
、異なる遺伝子に由来する葯ボックスおよびコアプロモーターを含む、キメラの
葯特異的プロモーターの場合についてさえも正しい。そのようなキメラの葯特異
的調節要素については、以下で述べる。
【００３２】 オペレーターとは、遺伝子の5'方向に位置するDNA分子であり、抑制蛋白質に よって認識および結合されるヌクレオチド配列を含むDNA分子である。リプレッ サー蛋白質がその同族のオペレーターと結合することにより、その遺伝子の転写
の抑制が引き起こされる。例えば、LexA遺伝子は、LexAオペレーターに結合する
抑制蛋白質をコードする。
の抑制が引き起こされる。例えば、LexA遺伝子は、LexAオペレーターに結合する
抑制蛋白質をコードする。
【００３３】 単離DNA分子とは、生物体のDNAから分離されたDNA断片である。例えば、アビ ジン遺伝子をコードする、クローンされたDNA分子は、単離されたDNA分子である
。単離されたDNA分子のその他の例としては、化学合成されたDNA分子、または酵
素により産生された、生物のゲノムDNAには組み込まれていないcDNAがある。
。単離されたDNA分子のその他の例としては、化学合成されたDNA分子、または酵
素により産生された、生物のゲノムDNAには組み込まれていないcDNAがある。
【００３４】 エンハンサーとは、転写の効率を増加させることのできるDNA調節要素である 。
【００３５】 相補的DNA（cDNA）は、逆転写酵素という酵素によってmRNAを鋳型として形成 された、単鎖DNA分子である。典型的には、逆転写を開始させるために、mRNAの 一部に相補的なプライマーを用いる。当技術分野において熟練した人々は、また
、「cDNA」という用語を、そのような単鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からな
る二本鎖DNAを意味する場合にも用いる。
、「cDNA」という用語を、そのような単鎖DNA分子およびその相補的DNA鎖からな
る二本鎖DNAを意味する場合にも用いる。
【００３６】 発現という用語は、遺伝子産物の生合成を意味する。例えば、構造遺伝子の場
合、発現には、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAの一つまたはそれ以上の
ポリペプチドへの翻訳が含まれる。
合、発現には、構造遺伝子のmRNAへの転写、およびmRNAの一つまたはそれ以上の
ポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００３７】 クローニングベクターは、宿主細胞内において自律的に複製する能力を持つ、
プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどのDNA分子である。クロ ーニングベクターは、そのベクターの本質的な生物機能を失うことなく、確定で
きる様式で外来のDNAを挿入することができる制限酵素認識部位を典型的には一 つまたは少数含んでおり、また、クローニングベクターによって形質転換された
細胞の同定および選択における利用に適したマーカー遺伝子を含む。マーカー遺
伝子は、典型的には、テトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性を提供
する遺伝子を含む。
プラスミド、コスミド、またはバクテリオファージなどのDNA分子である。クロ ーニングベクターは、そのベクターの本質的な生物機能を失うことなく、確定で
きる様式で外来のDNAを挿入することができる制限酵素認識部位を典型的には一 つまたは少数含んでおり、また、クローニングベクターによって形質転換された
細胞の同定および選択における利用に適したマーカー遺伝子を含む。マーカー遺
伝子は、典型的には、テトラサイクリン抵抗性またはアンピシリン抵抗性を提供
する遺伝子を含む。
【００３８】 発現ベクターは、宿主細胞において発現される遺伝子を含むDNA分子である。 典型的には、遺伝子の発現は、構成的または誘導性のプロモーター、組織特異的
な調節性要素、およびエンハンサーを含む特定の調節性要素の制御の下に置かれ
ている。このような遺伝子は、調節性要素と「機能的に連結している」と呼ばれ
る。
な調節性要素、およびエンハンサーを含む特定の調節性要素の制御の下に置かれ
ている。このような遺伝子は、調節性要素と「機能的に連結している」と呼ばれ
る。
【００３９】 組換え宿主という用語は、クローニングベクターまたは発現ベクターのいずれ
かを含む原核および真核細胞のすべてにあてはまる可能性がある。この用語はま
た、遺伝子操作を受けて、宿主細胞の染色体またはゲノムにクローン遺伝子（一
つまたは複数）を含む、原核または真核細胞をも含む。
かを含む原核および真核細胞のすべてにあてはまる可能性がある。この用語はま
た、遺伝子操作を受けて、宿主細胞の染色体またはゲノムにクローン遺伝子（一
つまたは複数）を含む、原核または真核細胞をも含む。
【００４０】 トランスジェニック植物は、外来遺伝子を含む一つまたはそれ以上の植物細胞
を持つ植物である。
を持つ植物である。
【００４１】 真核生物では、RNAポリメラーゼIIが、構造遺伝子を転写してmRNAを産生する 過程を触媒する。RNA転写産物が特定のmRNAに相補的な配列を持つような、RNAポ
リメラーゼIIの鋳型を含むDNA分子を、設計することができる。このRNA転写産物
をアンチセンスRNAと名付け、および、アンチセンスRNAをコードするDNA配列を 、アンチセンス遺伝子と名付ける。アンチセンスRNA分子は、mRNAに結合するこ とができ、この結果、mRNAの翻訳は阻害される。
リメラーゼIIの鋳型を含むDNA分子を、設計することができる。このRNA転写産物
をアンチセンスRNAと名付け、および、アンチセンスRNAをコードするDNA配列を 、アンチセンス遺伝子と名付ける。アンチセンスRNA分子は、mRNAに結合するこ とができ、この結果、mRNAの翻訳は阻害される。
【００４２】 リボザイムは、触媒活性中心を含むRNA分子である。この用語は、RNA酵素、自
己スプライシングRNA、および自己切断RNAを含む。リボザイムをコードするDNA 配列を、リボザイム遺伝子と名付ける。
己スプライシングRNA、および自己切断RNAを含む。リボザイムをコードするDNA 配列を、リボザイム遺伝子と名付ける。
【００４３】 外部ガイド配列（external guide sequence)は、内在生リボザイム、RNアーゼ
Pを特定の細胞内mRNA分子種へ導き、この結果、RNアーゼ PがmRNAを切断する。
外部ガイド配列をコードするDNA配列を、外部ガイド配列遺伝子と名付ける。
Pを特定の細胞内mRNA分子種へ導き、この結果、RNアーゼ PがmRNAを切断する。
外部ガイド配列をコードするDNA配列を、外部ガイド配列遺伝子と名付ける。
【００４４】 穀粒または種子形質は、好ましくは農産物としてのタイプに有意な影響を及ぼ
す優性遺伝子によって制御される種子の栄養または生理的特徴である。穀粒また
は種子形質には、蛋白質の性質およびデンプンタイプと共に、油、蛋白質および
デンプン含有量のような特徴が含まれる。
す優性遺伝子によって制御される種子の栄養または生理的特徴である。穀粒また
は種子形質には、蛋白質の性質およびデンプンタイプと共に、油、蛋白質および
デンプン含有量のような特徴が含まれる。
【００４５】 単交雑は、２つの同系繁殖系間の交雑である。
【００４６】 複交雑は、２つの単交雑間の交雑である。
【００４７】 ３系交雑は、単交雑と同系繁殖系との交雑の子孫である。
【００４８】 ハイブリッドは、遺伝子１つ以上が異なる２つの個体間の交雑の第一代子孫で
ある。
ある。
【００４９】 同系繁殖系は、通常、自家受粉および選択に由来する純粋な系である。
【００５０】 合成系は、一定数の世代にわたって放任受粉によって維持された株、クローン
、同系繁殖系またはそれらの間のハイブリッドの混合体である。成分単位を繁殖
させて、合成系を一定間隔で再構築する。
、同系繁殖系またはそれらの間のハイブリッドの混合体である。成分単位を繁殖
させて、合成系を一定間隔で再構築する。
【００５１】 特定組合せ能力は、全ての組合せの平均的な能力に対する、交雑における遺伝
子系統の特定の組合せの能力である。
子系統の特定の組合せの能力である。
【００５２】 授粉植物は、雄性不稔の雌性親に花粉を提供する雄性稔性の親である。授粉植
物は、多くの異なる遺伝的背景のいずれか１つを有してもよく、したがって同系
繁殖系、ハイブリッド、合成放任授粉系または遺伝的母株であってもよい。授粉
植物はトランスジェニック株であってもよい。授粉植物は目的とする種子または
穀粒形質を１つ以上有してもよい。
物は、多くの異なる遺伝的背景のいずれか１つを有してもよく、したがって同系
繁殖系、ハイブリッド、合成放任授粉系または遺伝的母株であってもよい。授粉
植物はトランスジェニック株であってもよい。授粉植物は目的とする種子または
穀粒形質を１つ以上有してもよい。
【００５３】 2.概観 本発明は、アビジンを発現するトランスジェニック植物を用意することにより
、雄性不稔植物を作出する方法について提供する。アビジンは、組織特異性なし
に、または葯特異的な様式で、構成的に発現させることができる。雄性稔性を回
復する方法も提供する。
、雄性不稔植物を作出する方法について提供する。アビジンは、組織特異性なし
に、または葯特異的な様式で、構成的に発現させることができる。雄性稔性を回
復する方法も提供する。
【００５４】 目的とする穀粒または種子形質を１つ以上有するハイブリッド種子を製造する
方法も同様に提供される。本発明の好ましい態様において、雄性不稔であってア
ビジン遺伝子のコピーを１つ以上有する第一のハイブリッドを雌性親として、雄
性稔性であって目的とする穀粒または種子形質を１つ以上有する第二のハイブリ
ッドと交雑させる。雄性親の穀粒または種子形質を１つ以上有するハイブリッド
種子が産生される。
方法も同様に提供される。本発明の好ましい態様において、雄性不稔であってア
ビジン遺伝子のコピーを１つ以上有する第一のハイブリッドを雌性親として、雄
性稔性であって目的とする穀粒または種子形質を１つ以上有する第二のハイブリ
ッドと交雑させる。雄性親の穀粒または種子形質を１つ以上有するハイブリッド
種子が産生される。
【００５５】 アビジン遺伝子を単離して、植物組織に導入するために適当な発現ベクターに
挿入する。発現ベクターは、更に、ユビキチンプロモーターのような、組織非特
異的プロモーター、および葯特異的プロモーターのような組織特異的プロモータ
ーといったような構成的プロモーター、または、誘導性プロモーターを含む。発
現ベクターは輸送シグナル配列を含んでもよい。遺伝子産物が高レベルで発現さ
れ、それが後に細胞質に蓄積されると、植物細胞に毒性を示す可能性がある。こ
のように、細胞質から遺伝子産物を除去すれば、細胞毒性が減少する可能性があ
る。植物遺伝子およびその輸送シグナル配列は既知である。ジョーンズ＆ロビン
ソン（Jones and Robinson）、Tansley Review 17：567〜597（1989）を参照の こと。標準的な方法によって発現ベクターを植物の組織に導入し、トランスジェ
ニック植物を選択して増殖させる。アビジンを発現するトランスジェニック植物
は、雄性不稔である。アビジン遺伝子の転写を阻害する、またはアビジンmRNAの
翻訳を阻害する第２の遺伝子を、トランスジェニック植物において同時に発現さ
せることにより、雄性稔性を回復することができる。この態様に従い、抑制遺伝
子が誘導性プロモーターに機能的に結合されている場合、アビジン遺伝子の一時
的な抑制が達成される。または、ビオチン溶液を成長途上の植物に噴霧すること
により、雄性稔性を回復することができる。
挿入する。発現ベクターは、更に、ユビキチンプロモーターのような、組織非特
異的プロモーター、および葯特異的プロモーターのような組織特異的プロモータ
ーといったような構成的プロモーター、または、誘導性プロモーターを含む。発
現ベクターは輸送シグナル配列を含んでもよい。遺伝子産物が高レベルで発現さ
れ、それが後に細胞質に蓄積されると、植物細胞に毒性を示す可能性がある。こ
のように、細胞質から遺伝子産物を除去すれば、細胞毒性が減少する可能性があ
る。植物遺伝子およびその輸送シグナル配列は既知である。ジョーンズ＆ロビン
ソン（Jones and Robinson）、Tansley Review 17：567〜597（1989）を参照の こと。標準的な方法によって発現ベクターを植物の組織に導入し、トランスジェ
ニック植物を選択して増殖させる。アビジンを発現するトランスジェニック植物
は、雄性不稔である。アビジン遺伝子の転写を阻害する、またはアビジンmRNAの
翻訳を阻害する第２の遺伝子を、トランスジェニック植物において同時に発現さ
せることにより、雄性稔性を回復することができる。この態様に従い、抑制遺伝
子が誘導性プロモーターに機能的に結合されている場合、アビジン遺伝子の一時
的な抑制が達成される。または、ビオチン溶液を成長途上の植物に噴霧すること
により、雄性稔性を回復することができる。
【００５６】 3. アビジンをコードするDNA分子の単離 アビジンをコードする塩基配列は、既知の方法により単離できる。例えば、ス
トレプトアビジン遺伝子の塩基配列が知られている（Argaranaら、Nucleic Acid
s Res., 14(4): 1871-1882 (1986)）。または、ニワトリ卵白アビジンをコード するcDNAは、トリ輸卵管のcDNAライブラリーから、参照として本明細書組み入れ
られる「Gopeら、Nucleic Acids Res., 15: 3595 (1987)」に記載された方法に より、単離することができる。
トレプトアビジン遺伝子の塩基配列が知られている（Argaranaら、Nucleic Acid
s Res., 14(4): 1871-1882 (1986)）。または、ニワトリ卵白アビジンをコード するcDNAは、トリ輸卵管のcDNAライブラリーから、参照として本明細書組み入れ
られる「Gopeら、Nucleic Acids Res., 15: 3595 (1987)」に記載された方法に より、単離することができる。
【００５７】 アビジン遺伝子のゲノムクローンは、アビジンを産生することが知られている
生物のゲノムDNAから得ることができる。例えば、トリのアビジン遺伝子「は、K
einanenら、Eur. J. Biochem., 220: 615 (1994)」に記載された方法によって、
トリのゲノムDNAからクローンすることができる。
生物のゲノムDNAから得ることができる。例えば、トリのアビジン遺伝子「は、K
einanenら、Eur. J. Biochem., 220: 615 (1994)」に記載された方法によって、
トリのゲノムDNAからクローンすることができる。
【００５８】 アビジン遺伝子はまた、標準的手法のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて も、単離することができる。Erlich, PCR TECHNOLOGY: Principles and Applica
tions for DNA Amplification （PCR技法：原理およびDNA増幅への応用）（Sto
ckton Press, NY, 1989）、および、Innisら、PCR Protocols: A GUIDE TO METH
ODS AND APPLICATIONS（PCRプロトコール集：方法および応用へのガイド）（Aca
demic Press, San Diego, 1990）参照。ELONGASEＴＭシステム（Life Technolog
ies, Inc., Gaithersburg, MD）のような、長い塩基配列のPCRによる増幅の方法
もまた、アビジンをコードするゲノムクローンのような、より長い塩基配列を得
るために、用いることができる。既知のアビジン遺伝子塩基配列の5'および3'末
端に相補的なPCRプライマーは、Applied Biosystems（Foster City, CA）が提供
しているような、市販のオリゴヌクレオチド合成機により、合成することができ
る。好ましい態様においてプライマーには、制限酵素切断部位を含む余分の塩基
配列も含まれる。このような部位が存在することにより、PCR産物を適切な制限 酵素で処理した後、適切なクローニングベクターへ、一方向性にクローニングす
ることができる。Finney「Molecular Cloning of PCR Products（PCR産物分子の
クローニング）」CURRENT PROTOCOLS IN MOLECUTAR BIOLOGY（分子生物学の現行
プロトコール集）Ausubel ら編、（John Wiley & Sons, New York, 1987）より 、p.15.7.1.。
tions for DNA Amplification （PCR技法：原理およびDNA増幅への応用）（Sto
ckton Press, NY, 1989）、および、Innisら、PCR Protocols: A GUIDE TO METH
ODS AND APPLICATIONS（PCRプロトコール集：方法および応用へのガイド）（Aca
demic Press, San Diego, 1990）参照。ELONGASEＴＭシステム（Life Technolog
ies, Inc., Gaithersburg, MD）のような、長い塩基配列のPCRによる増幅の方法
もまた、アビジンをコードするゲノムクローンのような、より長い塩基配列を得
るために、用いることができる。既知のアビジン遺伝子塩基配列の5'および3'末
端に相補的なPCRプライマーは、Applied Biosystems（Foster City, CA）が提供
しているような、市販のオリゴヌクレオチド合成機により、合成することができ
る。好ましい態様においてプライマーには、制限酵素切断部位を含む余分の塩基
配列も含まれる。このような部位が存在することにより、PCR産物を適切な制限 酵素で処理した後、適切なクローニングベクターへ、一方向性にクローニングす
ることができる。Finney「Molecular Cloning of PCR Products（PCR産物分子の
クローニング）」CURRENT PROTOCOLS IN MOLECUTAR BIOLOGY（分子生物学の現行
プロトコール集）Ausubel ら編、（John Wiley & Sons, New York, 1987）より 、p.15.7.1.。
【００５９】 PCRに用いる鋳型DNAは、cDNAまたはゲノムDNAのどちらでも可能であり、当技 術分野における既知の方法を用いて、適切な生物から用意することができる。Sa
mbrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL（分子クローニング：実験
室指針）第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, NY 1989）参照。ゲノムDNAは、TriazolＴＭ（Life Technologies, Inc., Gai
thersburg,）のような市販の薬剤を用いて、鳥類、は虫類、または両生類の組織
から直接回収することができる。または、アビジンをコードするcDNAは、市販の
利用可能なキット（Pharmacia, Piscataway, NJ）を使って、トリ輸卵管組織か ら抽出したmRNAを用いて用意することもできる。mRNA標品を、ポリdTまたはラン
ダムヘキサマー（無作為の６塩基配列）プライマーを用いた、標準的な技術によ
るcDNA合成の鋳型として用いる。Sambrookら、前記、参照。その後、市販の利用
可能なキット（Pharmacia）を用いてcDNA合成を行い、そのcDNAを「Saikiら、Sc
ience 239: 487 (1988)」の方法によって、直接PCRに用いる。
mbrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL（分子クローニング：実験
室指針）第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, NY 1989）参照。ゲノムDNAは、TriazolＴＭ（Life Technologies, Inc., Gai
thersburg,）のような市販の薬剤を用いて、鳥類、は虫類、または両生類の組織
から直接回収することができる。または、アビジンをコードするcDNAは、市販の
利用可能なキット（Pharmacia, Piscataway, NJ）を使って、トリ輸卵管組織か ら抽出したmRNAを用いて用意することもできる。mRNA標品を、ポリdTまたはラン
ダムヘキサマー（無作為の６塩基配列）プライマーを用いた、標準的な技術によ
るcDNA合成の鋳型として用いる。Sambrookら、前記、参照。その後、市販の利用
可能なキット（Pharmacia）を用いてcDNA合成を行い、そのcDNAを「Saikiら、Sc
ience 239: 487 (1988)」の方法によって、直接PCRに用いる。
【００６０】 上記の方法により単離したゲノムDNAまたはcDNA断片は、制限酵素で切断して 適当な断端を作る、DNA分子が好ましくない結合をしないようアルカリホスファ ターゼで処理する、および、適当なリガーゼで結合させるといったような、従来
の技法に従って、バクテリオファージまたはコスミドのようなベクターに、挿入
することができる。そのようなベクターを取り扱う技術に関しては「Ausubelら （編）、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（分子生物学の現行プロトコ
ール集）,ページ 3.0.5〜3.17.5 (1990)」[「Ausubel」]に記載されている。
の技法に従って、バクテリオファージまたはコスミドのようなベクターに、挿入
することができる。そのようなベクターを取り扱う技術に関しては「Ausubelら （編）、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（分子生物学の現行プロトコ
ール集）,ページ 3.0.5〜3.17.5 (1990)」[「Ausubel」]に記載されている。
【００６１】 または、アビジンをコードする塩基配列は、相互にプライミングし合う長いオ
リゴヌクレオチドを用いてアビジンをコードするDNA分子を合成することにより 、得ることもできる。例えば、Ausubelのページ8.2.8〜8.2.13参照。また、Wosn
ickら、Gene 60: 115 (1987)も参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる現行
の技術により、長さ1.8キロベースまでの遺伝子を合成することができる。Adang
ら、Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993)；Bambotら、PCR Methods and Applic
ations 2 （PCR法およびその応用 2）: 226 (1993)。アビジンをコードする既 知のどんなDNA分子の塩基配列に基づいても、アビジン遺伝の塩基配列を合成す ることができる。例えば、Gopeら、前記、参照。
リゴヌクレオチドを用いてアビジンをコードするDNA分子を合成することにより 、得ることもできる。例えば、Ausubelのページ8.2.8〜8.2.13参照。また、Wosn
ickら、Gene 60: 115 (1987)も参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応を用いる現行
の技術により、長さ1.8キロベースまでの遺伝子を合成することができる。Adang
ら、Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993)；Bambotら、PCR Methods and Applic
ations 2 （PCR法およびその応用 2）: 226 (1993)。アビジンをコードする既 知のどんなDNA分子の塩基配列に基づいても、アビジン遺伝の塩基配列を合成す ることができる。例えば、Gopeら、前記、参照。
【００６２】 これらのクローンは、制限酵素による解析、サザンブロット法による解析、プ
ライマー伸長法による解析、およびDNA塩基配列の解析といったような様々な標 準的技法を用いて、解析することができる。例えば、プライマー伸長法による解
析またはS1ヌクレアーゼ防御法による解析は、クローンした遺伝子の転写開始部
位を推定するのに用いることができる。Ausubelらの文献のページ4.8.1〜4.8.5 ；Walmsleyら、「S1ヌクレアーゼ防御アッセイ法による外来遺伝子の発現の定量
的及び定性的解析（Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gen
e Expression by the S1 Nuclease Protection Assay）」、METHODS IN MOLECUL
AR BIOLOGY（分子生物学の方法）第７巻：GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTO
COLS（遺伝子の伝達および発現プロトコール集）、Murray（編）、ページ271〜2
81（Humana Press Inc. 1991）。これらの技術および当業者に周知の関連技術を
、目的の他の遺伝子を単離し、それらをクローニングおよび発現させるために用
いる。
ライマー伸長法による解析、およびDNA塩基配列の解析といったような様々な標 準的技法を用いて、解析することができる。例えば、プライマー伸長法による解
析またはS1ヌクレアーゼ防御法による解析は、クローンした遺伝子の転写開始部
位を推定するのに用いることができる。Ausubelらの文献のページ4.8.1〜4.8.5 ；Walmsleyら、「S1ヌクレアーゼ防御アッセイ法による外来遺伝子の発現の定量
的及び定性的解析（Quantitative and Qualitative Analysis of Exogenous Gen
e Expression by the S1 Nuclease Protection Assay）」、METHODS IN MOLECUL
AR BIOLOGY（分子生物学の方法）第７巻：GENE TRANSFER AND EXPRESSION PROTO
COLS（遺伝子の伝達および発現プロトコール集）、Murray（編）、ページ271〜2
81（Humana Press Inc. 1991）。これらの技術および当業者に周知の関連技術を
、目的の他の遺伝子を単離し、それらをクローニングおよび発現させるために用
いる。
【００６３】 4. 発現ベクターへのアビジン遺伝子のクローニング及びトランスジェニック植
物の製造 一旦アビジン遺伝子を単離すれば、それを標準的な方法によって発現ベクター
に組み込む。Sambrookら、前記、参照。適切な発現ベクターを選択するには、宿
主細胞に発現ベクターを導入する事が必要となる。典型的には、発現ベクターは
以下のものを含む：(1)細菌での複製開始点、及び、細菌宿主内で発現ベクター が増殖し選択されるために必要な抗生物質抵抗性遺伝子をコードする、原核生物
のDNA要素；(2)例えばアビジン遺伝子のような外因性のDNA配列を挿入するため のクローニング部位；(3)プロモーターのような、外因性の遺伝子の発現開始を 調節する、真核生物のDNA要素；(4)転写終結／ポリアデニル基付加配列のような
、転写産物の処理を調節するDNA要素；及び(5)転写開始を調節するDNA要素の支 配下に接続された、マーカー蛋白の遺伝子（例えばレポーター遺伝子）。さらに
、発現ベクターは、外因性DNA配列に機能的に結合されたエクスポートシグナル 配列をコードするDNA配列を含んでいてもよい。植物の発現ベクター及びレポー ター遺伝子に関する一般的な記述は、Gruberら、「植物の形質転換のためのベク
ター（Vectors for Plant Transformation）」、METHODS IN PLANT MOLECULAR B
IOLOGY AND BIOTECHNOLOGY（植物の分子生物学および生物工学の方法）Glick ら
（編）、ページ89〜119 (CRC Press, 1993)参照。
物の製造 一旦アビジン遺伝子を単離すれば、それを標準的な方法によって発現ベクター
に組み込む。Sambrookら、前記、参照。適切な発現ベクターを選択するには、宿
主細胞に発現ベクターを導入する事が必要となる。典型的には、発現ベクターは
以下のものを含む：(1)細菌での複製開始点、及び、細菌宿主内で発現ベクター が増殖し選択されるために必要な抗生物質抵抗性遺伝子をコードする、原核生物
のDNA要素；(2)例えばアビジン遺伝子のような外因性のDNA配列を挿入するため のクローニング部位；(3)プロモーターのような、外因性の遺伝子の発現開始を 調節する、真核生物のDNA要素；(4)転写終結／ポリアデニル基付加配列のような
、転写産物の処理を調節するDNA要素；及び(5)転写開始を調節するDNA要素の支 配下に接続された、マーカー蛋白の遺伝子（例えばレポーター遺伝子）。さらに
、発現ベクターは、外因性DNA配列に機能的に結合されたエクスポートシグナル 配列をコードするDNA配列を含んでいてもよい。植物の発現ベクター及びレポー ター遺伝子に関する一般的な記述は、Gruberら、「植物の形質転換のためのベク
ター（Vectors for Plant Transformation）」、METHODS IN PLANT MOLECULAR B
IOLOGY AND BIOTECHNOLOGY（植物の分子生物学および生物工学の方法）Glick ら
（編）、ページ89〜119 (CRC Press, 1993)参照。
【００６４】 本発明の好ましい態様においては、植物のユビキチンプロモーターシステムを
用いる。植物のユビキチンプロモーターは、当技術分野においては、良く知られ
ている。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、欧州特許出願第0 342
926号参照。ユビキチンプロモーターは、構成的プロモーターである。
用いる。植物のユビキチンプロモーターは、当技術分野においては、良く知られ
ている。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、欧州特許出願第0 342
926号参照。ユビキチンプロモーターは、構成的プロモーターである。
【００６５】 本発明の別の好ましい態様においては、アビジンの発現を誘発的に制御するた
め、誘発性プロモーターを用いている。そのような誘発的プロモーターの例とし
ては、トウモロコシのグルタチオンS-転移酵素システムがあげられる。Wiegand ら、Plant Mol. Biol. 7:235 (1986)参照。この方法はまた、雄性不稔を逆転的 に誘導することもできる。このため、アビジンおよびこれに伴う雄性不稔の発現
は、プロモーターの活性化により、意のままに制御できる。プロモーターが活性
化されていない場合には、アビジンは発現されず、従って植物は雄性稔性である
。
め、誘発性プロモーターを用いている。そのような誘発的プロモーターの例とし
ては、トウモロコシのグルタチオンS-転移酵素システムがあげられる。Wiegand ら、Plant Mol. Biol. 7:235 (1986)参照。この方法はまた、雄性不稔を逆転的 に誘導することもできる。このため、アビジンおよびこれに伴う雄性不稔の発現
は、プロモーターの活性化により、意のままに制御できる。プロモーターが活性
化されていない場合には、アビジンは発現されず、従って植物は雄性稔性である
。
【００６６】 発現は選択可能な、またはスクリーニング可能なマーカーを含んでもよい。植
物の形質転換に一般的に用いられる陽性選択マーカー遺伝子の多くは細菌から単
離され、抗生物質または除草剤であってもよい選択的化学物質を代謝的に解毒す
る酵素をコードする。他の陽性選択マーカー遺伝子は、阻害剤に対して感受性を
示さない変化した標的をコードする。
物の形質転換に一般的に用いられる陽性選択マーカー遺伝子の多くは細菌から単
離され、抗生物質または除草剤であってもよい選択的化学物質を代謝的に解毒す
る酵素をコードする。他の陽性選択マーカー遺伝子は、阻害剤に対して感受性を
示さない変化した標的をコードする。
【００６７】 植物の形質転換に一般的に用いられる選択的マーカー遺伝子は、Tn 5から単離
されたネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子であり、こ れを植物の調節シグナルの制御下に置くと、カナマイシンに対する耐性が得られ
る。フラレーら（Fraley）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：4803（1983）
。もう一つの一般的に用いられる選択可能なマーカーは、抗生物質であるヒグロ
マイシンに対する耐性を付与するヒグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子である。バンデン・エルツェンら（Vanden Elzen）、Plant Mol. Biol. 5：
299（1985）。抗生物質に対する耐性を付与する細菌起源のさらなる陽性選択マ ーカー遺伝子には、ゲンタマイシン・アセチルトランスフェラーゼ、ストレプト
マイシン・ホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド-3'-アデニルトランス
フェラーゼ、およびブレオマイシン耐性決定因子が含まれる。ヘイフォードら（
Hayford）、Plant Physiol. 86：1216（1988）；ジョーンズら（Jones）、Mol.
Gen. Genet. 210：86（1987）；スバブら（Svab）、Plant Mol. Biol. 14：197 （1990）、ヒレら（Hille）、Plant Mol. Biol. 7：171（1986）。
されたネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子であり、こ れを植物の調節シグナルの制御下に置くと、カナマイシンに対する耐性が得られ
る。フラレーら（Fraley）、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80：4803（1983）
。もう一つの一般的に用いられる選択可能なマーカーは、抗生物質であるヒグロ
マイシンに対する耐性を付与するヒグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子である。バンデン・エルツェンら（Vanden Elzen）、Plant Mol. Biol. 5：
299（1985）。抗生物質に対する耐性を付与する細菌起源のさらなる陽性選択マ ーカー遺伝子には、ゲンタマイシン・アセチルトランスフェラーゼ、ストレプト
マイシン・ホスホトランスフェラーゼ、アミノグリコシド-3'-アデニルトランス
フェラーゼ、およびブレオマイシン耐性決定因子が含まれる。ヘイフォードら（
Hayford）、Plant Physiol. 86：1216（1988）；ジョーンズら（Jones）、Mol.
Gen. Genet. 210：86（1987）；スバブら（Svab）、Plant Mol. Biol. 14：197 （1990）、ヒレら（Hille）、Plant Mol. Biol. 7：171（1986）。
【００６８】 植物の形質転換に用いられる他の陽性選択マーカー遺伝子は、細菌起源の遺伝
子ではない。これらの遺伝子には、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物の
5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼおよび植物のアセトラクテー ト・シンターゼが含まれる。アイヒホルツら（Eichholz）、Somatic Cell Mol.
Genet. 13：67（1987）；シャーら（Shah）、Science 233：478（1986）；チャ レストら（Charest）、Plant Cell Rep. 8：643（1990）。
子ではない。これらの遺伝子には、マウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物の
5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼおよび植物のアセトラクテー ト・シンターゼが含まれる。アイヒホルツら（Eichholz）、Somatic Cell Mol.
Genet. 13：67（1987）；シャーら（Shah）、Science 233：478（1986）；チャ レストら（Charest）、Plant Cell Rep. 8：643（1990）。
【００６９】 植物の他の一般的な選択可能マーカー遺伝子は、グルタミン・シンテターゼの
除草性阻害剤に対する耐性を付与する。クマダら（Kumada）に対する欧州特許出
願第0 333 033号、およびグッドマンら（Goodman）に対する米国特許第4,975,37
4号は、L-ホスフィノトリシンのような除草剤に対する耐性を付与するグルタミ ン・シンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ホスフィノトリシン- アセチル-トランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、リーマンスら（Lee
mans）に与えられた欧州特許出願第0 242 246号に提供されている。ドグリーフ ら（De Greef）、Bio/Technology 7：61（1989）は、ホスフィノトリシン・アセ
チルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラバー遺伝子を発現するトランス
ジェニック植物の産生について記述している。
除草性阻害剤に対する耐性を付与する。クマダら（Kumada）に対する欧州特許出
願第0 333 033号、およびグッドマンら（Goodman）に対する米国特許第4,975,37
4号は、L-ホスフィノトリシンのような除草剤に対する耐性を付与するグルタミ ン・シンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する。ホスフィノトリシン- アセチル-トランスフェラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、リーマンスら（Lee
mans）に与えられた欧州特許出願第0 242 246号に提供されている。ドグリーフ ら（De Greef）、Bio/Technology 7：61（1989）は、ホスフィノトリシン・アセ
チルトランスフェラーゼ活性をコードするキメラバー遺伝子を発現するトランス
ジェニック植物の産生について記述している。
【００７０】 植物の形質転換に用いられるもう一つのクラスのマーカー遺伝子は、形質転換
した細胞を抗生物質のような毒性物質に対する耐性に関して直接遺伝子選択する
よりむしろ、形質転換したと思われる植物細胞のスクリーニングを必要とする。
これらの遺伝子は、特定の組織において遺伝子発現の空間的パターンを定量また
は可視化するために特に有用であり、それらは遺伝子発現の研究のために遺伝子
または遺伝子調節配列と融合させることができることから、しばしばリポーター
遺伝子と呼ばれている。
した細胞を抗生物質のような毒性物質に対する耐性に関して直接遺伝子選択する
よりむしろ、形質転換したと思われる植物細胞のスクリーニングを必要とする。
これらの遺伝子は、特定の組織において遺伝子発現の空間的パターンを定量また
は可視化するために特に有用であり、それらは遺伝子発現の研究のために遺伝子
または遺伝子調節配列と融合させることができることから、しばしばリポーター
遺伝子と呼ばれている。
【００７１】 形質転換したと思われる細胞をスクリーニングするために一般的に用いられる
遺伝子には、β-グルクロニダーゼ（GUS）、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラ ーゼおよびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼが含まれる。ジ
ェファーソン（Jefferson）、Plant Mol. Biol. Rep. 5：387（1987）；ターリ ら（Teeri）、EMBO J. 8：343（1989）；コンクスら（Koncz）、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 84：131（1987）；ドブロックら（De Block）、EMBO J. 3：16
81（1984）。比較的まれな形質転換事象を同定するためのもう一つのアプローチ
は、トウモロコシ（Zea mays）のアントシアニン色素沈着経路の支配的な構成的
調節因子をコードする遺伝子を使用することであった。ルドウィグら（Ludwig）
、Science 247：449（1990）。
遺伝子には、β-グルクロニダーゼ（GUS）、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラ ーゼおよびクロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼが含まれる。ジ
ェファーソン（Jefferson）、Plant Mol. Biol. Rep. 5：387（1987）；ターリ ら（Teeri）、EMBO J. 8：343（1989）；コンクスら（Koncz）、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 84：131（1987）；ドブロックら（De Block）、EMBO J. 3：16
81（1984）。比較的まれな形質転換事象を同定するためのもう一つのアプローチ
は、トウモロコシ（Zea mays）のアントシアニン色素沈着経路の支配的な構成的
調節因子をコードする遺伝子を使用することであった。ルドウィグら（Ludwig）
、Science 247：449（1990）。
【００７２】 発現ベクターは、ペプチド輸送シグナル配列をコードするDNA配列に機能的に 結合されたアビジン遺伝子を含んでもよい。ホーンズ＆ロビンソン（Hones and
Robinson）、上記を参照のこと。ベクターは、シグナル配列が成熟したアビジン
蛋白質配列のN-末端と融合して、蛋白質分子を正確に開裂し、成熟した活性なア
ビジンを生じる正常な細胞のプロセシングが行われるように作製される。特に好
ましい態様において、シグナル配列はオオムギのαアミラーゼシグナル配列であ
る。ロジャース（Rogers）、J. Biol. Chem. 260：3731〜3738（1985）。
Robinson）、上記を参照のこと。ベクターは、シグナル配列が成熟したアビジン
蛋白質配列のN-末端と融合して、蛋白質分子を正確に開裂し、成熟した活性なア
ビジンを生じる正常な細胞のプロセシングが行われるように作製される。特に好
ましい態様において、シグナル配列はオオムギのαアミラーゼシグナル配列であ
る。ロジャース（Rogers）、J. Biol. Chem. 260：3731〜3738（1985）。
【００７３】 アビジン遺伝子を含む発現ベクターは、プロトプラスト（原形質体）、もしく
は未熟性胚および分裂組織のような完全な組織、もしくはカルス培養、もしくは
単離された細胞に導入することができる。好ましくは、発現ベクターは、完全な
組織に導入される。植物組織を培養する一般的な方法については、例えばMikiら
、「植物への外因性DNAの導入手順（Procedures for Introducing Foreign DNA
into Plants）」、METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY （
植物の分子生物学および生物工学の方法）Glick ら（編）、ページ67〜88 (CRC
Press, 1993)、および、Phillipsら、「細胞／組織培養およびインビトロ操作（
Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation）」、CORN AND DORN IMPROBE
MENT（穀物及び穀物の改良）第３版、Spragueら（編）、ページ345〜387 (Ameri
can Society of Agronomy, Inc.ら、1988)に記載されている。
は未熟性胚および分裂組織のような完全な組織、もしくはカルス培養、もしくは
単離された細胞に導入することができる。好ましくは、発現ベクターは、完全な
組織に導入される。植物組織を培養する一般的な方法については、例えばMikiら
、「植物への外因性DNAの導入手順（Procedures for Introducing Foreign DNA
into Plants）」、METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY （
植物の分子生物学および生物工学の方法）Glick ら（編）、ページ67〜88 (CRC
Press, 1993)、および、Phillipsら、「細胞／組織培養およびインビトロ操作（
Cell/Tissue Culture and In Vitro Manipulation）」、CORN AND DORN IMPROBE
MENT（穀物及び穀物の改良）第３版、Spragueら（編）、ページ345〜387 (Ameri
can Society of Agronomy, Inc.ら、1988)に記載されている。
【００７４】 植物の組織に発現ベクターを導入する方法には、直接感染または植物組織のア
グロバクテリウム土壌細菌共存下の培養が含まれる。Horxchら、Science 227: 1
229 (1985)。好ましくは、アームをはずしたTiプラスミドを、外因性DNA配列の ためのベクターとして用いる。形質転換は、例えば欧州特許出願第116 718号(19
84)および第270 822号(1988)に記載されているような手順を用いて行うことがで
きる。好ましいTiプラスミドベクターは、外因性DNA配列を、辺縁配列の間に含 むか、または少なくとも右側辺縁配列の上流に含む。
グロバクテリウム土壌細菌共存下の培養が含まれる。Horxchら、Science 227: 1
229 (1985)。好ましくは、アームをはずしたTiプラスミドを、外因性DNA配列の ためのベクターとして用いる。形質転換は、例えば欧州特許出願第116 718号(19
84)および第270 822号(1988)に記載されているような手順を用いて行うことがで
きる。好ましいTiプラスミドベクターは、外因性DNA配列を、辺縁配列の間に含 むか、または少なくとも右側辺縁配列の上流に含む。
【００７５】 他のタイプのベクターも、直接的遺伝子伝達（例えば、WO B5/01856および欧 州出願第275 069号参照）、インビトロのプロトプラスト形質転換（例えば、米 国特許第4,684,611号）、植物ウイルス媒介性形質転換（例えば、欧州特許第067
553号および米国特許第4,407,956号）、及びリポソーム媒介性形質転換（例え ば、米国特許第4,536,475号）のような手順を用いて、植物細胞を形質転換する のに用いることができる。トウモロコシの形質転換に適当な方法は、Frommら、B
io/Technology 8: 833 (1990)、およびGordon-Kammら、The Plant Cell 2: 603
(1990)により示されている。イネの形質転換の標準的な方法は、Christouら、Tr
ends in Biotechnology 10: 239 (1992)およびLeeら、Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA 88: 6389 (1991)に記載されている。コムギも、トウモロコシまたはイネを
形質転換する技術と同様の方法を用いて、形質転換することができる。さらに、
Casasら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993)では、モロコシの形 質転換の方法が記載されており、一方、Wanら、Plant Physiol. 104: 37 (1994)
では、オオムギの形質転換の方法が記載されている。
553号および米国特許第4,407,956号）、及びリポソーム媒介性形質転換（例え ば、米国特許第4,536,475号）のような手順を用いて、植物細胞を形質転換する のに用いることができる。トウモロコシの形質転換に適当な方法は、Frommら、B
io/Technology 8: 833 (1990)、およびGordon-Kammら、The Plant Cell 2: 603
(1990)により示されている。イネの形質転換の標準的な方法は、Christouら、Tr
ends in Biotechnology 10: 239 (1992)およびLeeら、Proc. Nat'l. Acad. Sci.
USA 88: 6389 (1991)に記載されている。コムギも、トウモロコシまたはイネを
形質転換する技術と同様の方法を用いて、形質転換することができる。さらに、
Casasら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993)では、モロコシの形 質転換の方法が記載されており、一方、Wanら、Plant Physiol. 104: 37 (1994)
では、オオムギの形質転換の方法が記載されている。
【００７６】 一般に、単子葉類の植物、特にイネ、トウモロコシ、モロコシ、オオムギまた
はコムギのような穀類の形質転換には、直接的伝達法が好まれる。適切な直接伝
達法には、微小パーティクルを介する伝達、DNA注入、電気穿孔法、その他同種 のものが含まれる。例えば「Gruberら、前記、Mikiら、前記、及び、Kleinら、B
io/Technology 10: 268 (1992)」参照。さらに好ましくは、発現ベクターは、パ
ーティクルガン（biolistic device）で、微小パーティクルを介する伝達を用い
て、単子葉類の植物組織に導入する。
はコムギのような穀類の形質転換には、直接的伝達法が好まれる。適切な直接伝
達法には、微小パーティクルを介する伝達、DNA注入、電気穿孔法、その他同種 のものが含まれる。例えば「Gruberら、前記、Mikiら、前記、及び、Kleinら、B
io/Technology 10: 268 (1992)」参照。さらに好ましくは、発現ベクターは、パ
ーティクルガン（biolistic device）で、微小パーティクルを介する伝達を用い
て、単子葉類の植物組織に導入する。
【００７７】 5. 雄性稔性の制御 A. 雄性不稔植物の作出 本発明に従って雄性不稔を誘発するために、アビジンをコードするDNA配列が 、植物組織における遺伝子の転写を調節するDNA配列の支配下に接続された発現 ベクターを構築する。発現ベクターの一般的な必要条件は上述してある。アビジ
ンの発現によって雄性不稔とするために、アビジンはただ単に一過性に発現する
だけでなく、植物の成体期における発達の遅い段階でアビジンが発現するような
かたちで、植物の胚組織に発現ベクターを導入する。例えば、染色体外で複製で
きるような植物ウイルスのベクターを利用して、有糸分裂での安定性を持たせる
ことができる。
ンの発現によって雄性不稔とするために、アビジンはただ単に一過性に発現する
だけでなく、植物の成体期における発達の遅い段階でアビジンが発現するような
かたちで、植物の胚組織に発現ベクターを導入する。例えば、染色体外で複製で
きるような植物ウイルスのベクターを利用して、有糸分裂での安定性を持たせる
ことができる。
【００７８】 有糸分裂での安定性を獲得するのに好ましい方法は、発現ベクターの配列を、
宿主の染色体に組み込むことである。そのような有糸分裂時の安定性は、微小パ
ーティクルで発現ベクターを植物組織に伝達することにより、またはその他の上
述した標準的な方法を用いることにより、達成できる。例えば、Frommら、Bio/T
echnology 8: 833 (1990)、Gordon-Kammら、The Plant Cell 2: 603 (1990)、お
よびWaltersら、Plant Molec. Biol. 18:189 (1992)参照。
宿主の染色体に組み込むことである。そのような有糸分裂時の安定性は、微小パ
ーティクルで発現ベクターを植物組織に伝達することにより、またはその他の上
述した標準的な方法を用いることにより、達成できる。例えば、Frommら、Bio/T
echnology 8: 833 (1990)、Gordon-Kammら、The Plant Cell 2: 603 (1990)、お
よびWaltersら、Plant Molec. Biol. 18:189 (1992)参照。
【００７９】 植物組織に導入した後のアビジン遺伝子の転写は、好ましくは、植物組織にお
いて非特異的に遺伝子発現を刺激する構成的プロモーターにより制御される。こ
の目的に適した構成的プロモーターの例は、前記に述べたように、ユビキチンプ
ロモーターである。
いて非特異的に遺伝子発現を刺激する構成的プロモーターにより制御される。こ
の目的に適した構成的プロモーターの例は、前記に述べたように、ユビキチンプ
ロモーターである。
【００８０】 アビジン遺伝子の転写はまた、組織特異的に遺伝子発現を刺激するプロモータ
ーによっても制御できる。特に好ましい葯特異的プロモーターは、トウモロコシ
の近郊系B73から単離された5126プロモーターである。5126プロモーターは、四 分子から早期の一核期小胞子段階の葯に至るまで、外因性遺伝子の発現を刺激す
る。
ーによっても制御できる。特に好ましい葯特異的プロモーターは、トウモロコシ
の近郊系B73から単離された5126プロモーターである。5126プロモーターは、四 分子から早期の一核期小胞子段階の葯に至るまで、外因性遺伝子の発現を刺激す
る。
【００８１】 もう一つの適切な葯特異的プロモーターはSGB6プロモーターで、これもまたB7
3株から単離された。SGB6プロモーターは、四分子段階から中期一核期に至る小 胞子の発達段階まで、葯タペート細胞において、外因性遺伝子の発現を誘発する
ことができる。
3株から単離された。SGB6プロモーターは、四分子段階から中期一核期に至る小 胞子の発達段階まで、葯タペート細胞において、外因性遺伝子の発現を誘発する
ことができる。
【００８２】 または、葯ボックスおよびコアプロモーターの組み合わせを用いて、葯特異的
な遺伝子発現を起こすことができる。特に好ましい葯ボックスは、以下に述べる
塩基配列を含む5126葯ボックスである：
な遺伝子発現を起こすことができる。特に好ましい葯ボックスは、以下に述べる
塩基配列を含む5126葯ボックスである：
【００８３】 もう一つの適切な葯ボックスは、SGB6の転写開始部位の上流583番目から490番
目の塩基により規定される94塩基対のDNA断片内にある。そのSGB6の94塩基対の 葯ボックスの塩基配列は下記の通りである：
目の塩基により規定される94塩基対のDNA断片内にある。そのSGB6の94塩基対の 葯ボックスの塩基配列は下記の通りである：
【００８４】 または、減数分裂から四分子段階までの発達の間、遺伝子発現を刺激する、ト
ウモロコシのG9プロモーターからも、適切な葯ボックスを得る事ができる。G9葯
ボックスは、下記の塩基配列を含む：
ウモロコシのG9プロモーターからも、適切な葯ボックスを得る事ができる。G9葯
ボックスは、下記の塩基配列を含む：
【００８５】 5126、SGB6およびG9の葯ボックスは、上述したように、オリゴヌクレオチドを
合成することにより、得ることができる。当技術分野において熟練した人々は、
欠損変異による解析を用いて、ここで示した葯ボックス内にさらに、ひとつまた
はそれ以上の葯特異的調節配列を位置づける事ができる可能性がある。そのよう
な葯ボックスの「機能的断片」もまた、葯特異的な様式で、アビジン遺伝子の発
現を制御するのに用いることができる。
合成することにより、得ることができる。当技術分野において熟練した人々は、
欠損変異による解析を用いて、ここで示した葯ボックス内にさらに、ひとつまた
はそれ以上の葯特異的調節配列を位置づける事ができる可能性がある。そのよう
な葯ボックスの「機能的断片」もまた、葯特異的な様式で、アビジン遺伝子の発
現を制御するのに用いることができる。
【００８６】 好ましいコアプロモーターは、5126コアプロモーター、SGB6コアプロモーター
、G9コアプロモーターおよびカリフラワーモザイクウイルスの35Sコアプロモー ターに由来する。
、G9コアプロモーターおよびカリフラワーモザイクウイルスの35Sコアプロモー ターに由来する。
【００８７】 特に好ましいプロモーターは、以下に示す塩基配列を含む5126コアプロモータ
ーである：
ーである：
【００８８】 SGB6コアプロモーターは、SGB6遺伝子の転写開始部位上流の、約38塩基含む。
適切なSGB6コアプロモーターは、以下の塩基配列を持つ：
適切なSGB6コアプロモーターは、以下の塩基配列を持つ：
【００８９】 G9遺伝子に由来する適切なコアプロモーターは、以下の塩基配列を含む：
【００９０】 5126、SGB6およびG9コアプロモーターの機能的断片もまた、適切なコアプロ モーターとなる。そのような機能的断片を獲得する方法は、上述した。
【００９１】 一つの遺伝子に由来する葯ボックス、および第二の遺伝子に由来する葯特異的
プロモーターを有するキメラの調節要素を用いることによっても、アビジン遺伝
子が発現する発生段階を拡張することができる。例えば、SGB6の調節配列は、四
分子から一核期中期までの発達段階を通じて、遺伝子発現を刺激するが、一方、
G9の調節配列は、減数分裂から四分子に至る発達段階を通じて、遺伝子の発現を
刺激する。しかし、SGB6の葯ボックスおよびG9のプロモーターを組み合わせれば
、減数分裂から一核期中期に至るまでの発達段階を通じて、外因性遺伝子の転写
を刺激する。このように、葯ボックス及び葯特異的プロモーターを様々に組み合
わせることが、本発明においては特に有用である。
プロモーターを有するキメラの調節要素を用いることによっても、アビジン遺伝
子が発現する発生段階を拡張することができる。例えば、SGB6の調節配列は、四
分子から一核期中期までの発達段階を通じて、遺伝子発現を刺激するが、一方、
G9の調節配列は、減数分裂から四分子に至る発達段階を通じて、遺伝子の発現を
刺激する。しかし、SGB6の葯ボックスおよびG9のプロモーターを組み合わせれば
、減数分裂から一核期中期に至るまでの発達段階を通じて、外因性遺伝子の転写
を刺激する。このように、葯ボックス及び葯特異的プロモーターを様々に組み合
わせることが、本発明においては特に有用である。
【００９２】 ウイルスのコアプロモーターもまた、用いることができる。適切なウイルスコ
アプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）コアプロ
モーター、Figwort モザイクウイルスコアプロモーター、および同類のものが含
まれる。Gruberら、前記。好ましくは、ウイルスのコアプロモーターは、CaMVの
35Sコアプロモーター、またはそれに由来する変異体である。
アプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）コアプロ
モーター、Figwort モザイクウイルスコアプロモーター、および同類のものが含
まれる。Gruberら、前記。好ましくは、ウイルスのコアプロモーターは、CaMVの
35Sコアプロモーター、またはそれに由来する変異体である。
【００９３】 形質転換した細胞を選択するため、発現ベクターは、除草剤抵抗性遺伝子のよ
うな、選択性マーカー遺伝子を含んでいる。例えば、そのような遺伝子は、ホス
フィノスリシン、グリホサート、スルホン酸尿素、アトラジン、またはイミダゾ
リノンに対する抵抗性に関わる可能性がある。好ましくは、選択性マーカーの遺
伝子は、ホスフィノスリシンアセチル転移酵素をコードする、bar遺伝子またはp
at遺伝子である。bar遺伝子の塩基配列は、Leemansら、欧州特許出願第0-242-24
6号(1987)、およびWhiteら、Nucleic Acids Res.18: 1062 (1990)に見出すこと ができる。Wohllebenら、Gene 70: 25 (1988)では、pat遺伝子の塩基配列が提示
されている。Barまたはpat遺伝子が発現すると、グルホシネート（他ではBasta （登録商標）及びIgnite（登録商標）として販売されている）およびビアラホス
（Herbi-ace（登録商標）及びLiberty（登録商標）として販売されている）のよ
うな除草剤に対する抵抗性を獲得する。
うな、選択性マーカー遺伝子を含んでいる。例えば、そのような遺伝子は、ホス
フィノスリシン、グリホサート、スルホン酸尿素、アトラジン、またはイミダゾ
リノンに対する抵抗性に関わる可能性がある。好ましくは、選択性マーカーの遺
伝子は、ホスフィノスリシンアセチル転移酵素をコードする、bar遺伝子またはp
at遺伝子である。bar遺伝子の塩基配列は、Leemansら、欧州特許出願第0-242-24
6号(1987)、およびWhiteら、Nucleic Acids Res.18: 1062 (1990)に見出すこと ができる。Wohllebenら、Gene 70: 25 (1988)では、pat遺伝子の塩基配列が提示
されている。Barまたはpat遺伝子が発現すると、グルホシネート（他ではBasta （登録商標）及びIgnite（登録商標）として販売されている）およびビアラホス
（Herbi-ace（登録商標）及びLiberty（登録商標）として販売されている）のよ
うな除草剤に対する抵抗性を獲得する。
【００９４】 発現ベクターは、構成的プロモーターにより制御される選択性マーカー遺伝子
と同様に、構成的プロモーターまたは葯特異的プロモーターにより制御される、
アビジンをコードするDNA配列を含むことができる。または、選択性マーカー遺 伝子を宿主細胞に伝達するのに、胚組織を、独立の選択性発現ベクターで「同時
に形質転換」することもできる。
と同様に、構成的プロモーターまたは葯特異的プロモーターにより制御される、
アビジンをコードするDNA配列を含むことができる。または、選択性マーカー遺 伝子を宿主細胞に伝達するのに、胚組織を、独立の選択性発現ベクターで「同時
に形質転換」することもできる。
【００９５】 B. 第一代雑種における雄性稔性の回復 上述した方法は、近郊系品種間で大規模に方向性のある交配を行って、トラン
スジェニックの雄性不稔植物の第１代雑種を作出する際に、用いることができる
。トランスジェニックの雄性不稔植物の卵細胞が、いずれも組換えアビジン遺伝
子を含んでいない場合には、第１代雑種の一部は、雄性稔性の表現型を持つ。一
方、組換えアビジン遺伝子が、トランスジェニックの雄性不稔植物の全ての卵細
胞に存在すれば、第１代雑種は雄性不稔の表現型を持つ。このことから、雄性稔
性の第１代雑種を作出できる、雄性稔性の回復システムを用いる方が、望ましい
と考えられる。このような稔性回復システムは、収穫産物が種子である場合、自
殖性の種においては、特に価値の高いものである。
スジェニックの雄性不稔植物の第１代雑種を作出する際に、用いることができる
。トランスジェニックの雄性不稔植物の卵細胞が、いずれも組換えアビジン遺伝
子を含んでいない場合には、第１代雑種の一部は、雄性稔性の表現型を持つ。一
方、組換えアビジン遺伝子が、トランスジェニックの雄性不稔植物の全ての卵細
胞に存在すれば、第１代雑種は雄性不稔の表現型を持つ。このことから、雄性稔
性の第１代雑種を作出できる、雄性稔性の回復システムを用いる方が、望ましい
と考えられる。このような稔性回復システムは、収穫産物が種子である場合、自
殖性の種においては、特に価値の高いものである。
【００９６】 トランスジェニックの雄性不稔植物の系統において、稔性を回復するために通
常用いられる方法では、トランスジェニック植物の第二の「回復」系を作成する
ことが必要である。例えば、バルナーゼの発現により雄性不稔となっているトラ
ンスジェニック植物を、上記で論じたように、バルナーゼ阻害剤を発現する雄性
稔性植物と交配するのである。Marianiら、Nature 357: 384 (1992)。
常用いられる方法では、トランスジェニック植物の第二の「回復」系を作成する
ことが必要である。例えば、バルナーゼの発現により雄性不稔となっているトラ
ンスジェニック植物を、上記で論じたように、バルナーゼ阻害剤を発現する雄性
稔性植物と交配するのである。Marianiら、Nature 357: 384 (1992)。
【００９７】 本件においては、類似のアプローチとして、アビジンmRNAを標的とするリボザ
イムを発現する、またはアンチセンスのアビジンを発現するトランスジェニック
植物の回復系を作成することが、必要である。例えば、mRNA分子の特定の標的配
列に対するエンドヌクレアーゼ活性を発現するように、リボザイムを設計するこ
とができる。例えば、Steineckeら、EMBO J. 11: 1525 (1992)では、タバコのプ
ロトプラストにおいて、リボザイムにより、ネオマイシン燐酸転移酵素の遺伝子
発現を、100%まで阻害している。より最近の例として、Perrimanら、Antisense
Res. & Devel. 3: 253 (1993)では、改変したハンマーヘッド型リボザイムを発 現するベクターを用いて、タバコのプロトプラストにおいて、クロラムフェニコ
ールアセチル転移酵素の活性を阻害している。本発明における状況としては、ア
ビジンmRNAが、リボザイムの標的RNA分子として適当である。
イムを発現する、またはアンチセンスのアビジンを発現するトランスジェニック
植物の回復系を作成することが、必要である。例えば、mRNA分子の特定の標的配
列に対するエンドヌクレアーゼ活性を発現するように、リボザイムを設計するこ
とができる。例えば、Steineckeら、EMBO J. 11: 1525 (1992)では、タバコのプ
ロトプラストにおいて、リボザイムにより、ネオマイシン燐酸転移酵素の遺伝子
発現を、100%まで阻害している。より最近の例として、Perrimanら、Antisense
Res. & Devel. 3: 253 (1993)では、改変したハンマーヘッド型リボザイムを発 現するベクターを用いて、タバコのプロトプラストにおいて、クロラムフェニコ
ールアセチル転移酵素の活性を阻害している。本発明における状況としては、ア
ビジンmRNAが、リボザイムの標的RNA分子として適当である。
【００９８】 同様のアプローチにおいて、アンチセンスRNAをコードする塩基配列を含む発 現ベクターを用いて、稔性を回復することができる。アンチセンスRNA分子が標 的のmRNA分子に結合すると、ハイブリダイゼーションにより翻訳が阻害される。
Patersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 4370 (1987)。本発明の状況に おいては、適切なアンチセンスRNA分子は、アビジンmRNAに相補的な配列を持つ 。本発明の好ましい態様においては、アンチセンスRNAは、誘発性プロモーター により制御を受ける。このプロモーターを活性化すると、雄性稔性を回復するこ
とができる。
Patersonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 4370 (1987)。本発明の状況に おいては、適切なアンチセンスRNA分子は、アビジンmRNAに相補的な配列を持つ 。本発明の好ましい態様においては、アンチセンスRNAは、誘発性プロモーター により制御を受ける。このプロモーターを活性化すると、雄性稔性を回復するこ
とができる。
【００９９】 さらに別のアプローチとしては、RNアーゼPが触媒するアビジンmRNA分子の切 断を、促進することができるような、RNA転写物をコードする発現ベクターを、 構築することができる。このアプローチを用いると、内因性のリボザイムである
RNアーゼPをアビジンmRNAに導き、その後続けて細胞のリボザイムにより切断さ せるための、外部ガイド配列を、構築することができる。Altmanら、米国特許第
5,168,053号；Yuanら、Science 263: 1269 (1994)。好ましくは、外部ガイド配 列は、アビジンmRNAに相補的な10〜15塩基の配列、および、Nが好ましくはプリ ンである3'-NCCA塩基配列を含む。同文献。外部ガイド配列の転写産物は、mRNA および相補的な外部ガイド配列間で塩基対を形成することによって、標的のmRNA
分子種に結合し、この結果、塩基対を形成した領域の5'側に位置する塩基のとこ
ろで、RNアーゼPによるmRNAの切断が促進される。同文献。
RNアーゼPをアビジンmRNAに導き、その後続けて細胞のリボザイムにより切断さ せるための、外部ガイド配列を、構築することができる。Altmanら、米国特許第
5,168,053号；Yuanら、Science 263: 1269 (1994)。好ましくは、外部ガイド配 列は、アビジンmRNAに相補的な10〜15塩基の配列、および、Nが好ましくはプリ ンである3'-NCCA塩基配列を含む。同文献。外部ガイド配列の転写産物は、mRNA および相補的な外部ガイド配列間で塩基対を形成することによって、標的のmRNA
分子種に結合し、この結果、塩基対を形成した領域の5'側に位置する塩基のとこ
ろで、RNアーゼPによるmRNAの切断が促進される。同文献。
【０１００】 雄性稔性を回復する別の方法では、トランスジェニックの雄性不稔植物は、ア
ビジン遺伝子を支配するよう接続されたプロモーター配列に加えて、原核生物の
調節要素をも含んだ発現ベクターを持っている。原核生物のポリペプチドを、そ
のプロモーターの制御のもとで発現する、トランスジェニックの雄性稔性植物を
作出する。第１代雑種において、原核生物のポリペプチドは原核生物の調節配列
に結合し、およびアビジンの発現を抑制する。
ビジン遺伝子を支配するよう接続されたプロモーター配列に加えて、原核生物の
調節要素をも含んだ発現ベクターを持っている。原核生物のポリペプチドを、そ
のプロモーターの制御のもとで発現する、トランスジェニックの雄性稔性植物を
作出する。第１代雑種において、原核生物のポリペプチドは原核生物の調節配列
に結合し、およびアビジンの発現を抑制する。
【０１０１】 例えば、本発明に従って、遺伝子発現を制御するために、LexA遺伝子／LexAオ
ペレーターのシステムを、用いることができる。米国特許第4,833,080号（「'08
0特許」）及びWangら、Mol.Cell. Biol. 13:1805 (1993)。より特異的には、雄 性不稔性植物の発現ベクターはLexAオペレーター配列を含み、一方で、雄性稔性
植物の発現ベクターはLexAリプレッサーをコードする配列を含む。第１代雑種に
おいては、LexAリプレッサーがLexAオペレーター配列に結合し、およびアビジン
遺伝子の転写を阻害する。
ペレーターのシステムを、用いることができる。米国特許第4,833,080号（「'08
0特許」）及びWangら、Mol.Cell. Biol. 13:1805 (1993)。より特異的には、雄 性不稔性植物の発現ベクターはLexAオペレーター配列を含み、一方で、雄性稔性
植物の発現ベクターはLexAリプレッサーをコードする配列を含む。第１代雑種に
おいては、LexAリプレッサーがLexAオペレーター配列に結合し、およびアビジン
遺伝子の転写を阻害する。
【０１０２】 LexAオペレーターのDNA分子は、たとえば、既知のLexAオペレーター配列を含 むDNA断片を合成することにより、獲得することができる。例えば、'080特許お よびGarrigaら、Mol. Gen. Genet. 236: 125 (1992)参照。LexA遺伝子は、LexA リプレッサーをコードするDNA分子を合成することにより、獲得することができ る。遺伝子合成技術については上述し、および、LexA遺伝子の塩基配列は、例え
ば、Garrigaら、前記、に提示されている。または、LexAリプレッサーをコード するDNA分子は、プラスミドpRB500、アメリカンタイプカルチャーコレクション （American Type Culture Collection）寄託番号67758から、入手することがで きる。
ば、Garrigaら、前記、に提示されている。または、LexAリプレッサーをコード するDNA分子は、プラスミドpRB500、アメリカンタイプカルチャーコレクション （American Type Culture Collection）寄託番号67758から、入手することがで きる。
【０１０３】 当技術分野において熟練した人々は、簡単に、lacリプレッサー／lacオペロン
システムまたはtrpリプレッサー／trpオペロンシステムのような原核生物の調節
システムを用いた、他の雄性稔性の回復法を設定することができる。
システムまたはtrpリプレッサー／trpオペロンシステムのような原核生物の調節
システムを用いた、他の雄性稔性の回復法を設定することができる。
【０１０４】 稔性を回復するさらにもう一つの方法は、生育途中の植物にビオチンの溶液を
噴霧することによって、ビオチンに対するアビジンの高親和性を利用することで
ある。ビオチン溶液は、ビオチンが確実に完全に溶解するように、DMSOのような
有機共溶媒の最小量を含んでもよい。しかし、ビオチン溶液は有機共溶媒を含ま
なくてもよい。噴霧は花粉の発生の減数分裂期に合わせて始めてもよい。噴霧は
また、花粉の発生の後期に開始してもよい。噴霧は一般に、花粉の飛散が認めら
れるまで定期的に繰り返す。噴霧の間隔は１〜７日の間である。本発明の好まし
い態様において、噴霧は３〜５日毎に繰り返す。
噴霧することによって、ビオチンに対するアビジンの高親和性を利用することで
ある。ビオチン溶液は、ビオチンが確実に完全に溶解するように、DMSOのような
有機共溶媒の最小量を含んでもよい。しかし、ビオチン溶液は有機共溶媒を含ま
なくてもよい。噴霧は花粉の発生の減数分裂期に合わせて始めてもよい。噴霧は
また、花粉の発生の後期に開始してもよい。噴霧は一般に、花粉の飛散が認めら
れるまで定期的に繰り返す。噴霧の間隔は１〜７日の間である。本発明の好まし
い態様において、噴霧は３〜５日毎に繰り返す。
【０１０５】 ６．望ましい穀粒形質を有するハイブリッド種子の製造 望ましい穀粒または種子形質を１つ以上有するハイブリッド種子は、本発明の
雄性不稔植物株を用いて都合よく産生することができる。アビジン遺伝子を有す
るトランスジェニック株を雄性不稔の雌性親として、望ましい穀粒または種子形
質に対する遺伝子を１つ以上有する雄性稔性の授粉植物と交雑させる。雄性稔性
の授粉植物は好ましくは、望ましい穀粒または種子形質を制御する遺伝子に関し
てホモ接合である。望ましい穀粒または種子形質を有するハイブリッド種子を本
方法によって産生して、回収する。雄性不稔の親を、望ましい穀粒または種子形
質に対する遺伝子を１つ以上有する雄性稔性授粉株と交雑させるハイブリッド種
子の製造法は、時に、トップ交雑法と呼ばれている。例えば、本明細書に参照と
して組み入れられる、米国特許第5,196,636号を参照のこと。
雄性不稔植物株を用いて都合よく産生することができる。アビジン遺伝子を有す
るトランスジェニック株を雄性不稔の雌性親として、望ましい穀粒または種子形
質に対する遺伝子を１つ以上有する雄性稔性の授粉植物と交雑させる。雄性稔性
の授粉植物は好ましくは、望ましい穀粒または種子形質を制御する遺伝子に関し
てホモ接合である。望ましい穀粒または種子形質を有するハイブリッド種子を本
方法によって産生して、回収する。雄性不稔の親を、望ましい穀粒または種子形
質に対する遺伝子を１つ以上有する雄性稔性授粉株と交雑させるハイブリッド種
子の製造法は、時に、トップ交雑法と呼ばれている。例えば、本明細書に参照と
して組み入れられる、米国特許第5,196,636号を参照のこと。
【０１０６】 本発明のハイブリッド種子を作製するために交雑させる雄性不稔および雄性稔
性株は、ハイブリッド、同系繁殖体、または合成株のいかなる適合可能な組合せ
であってもよい。構成的または誘導的プロモーターと機能的に結合されたアビジ
ン遺伝子を有するトランスジェニック株は、上記の方法を用いて作製される。雄
性不稔株はアビジン遺伝子のコピーを１つ以上有してもよい。
性株は、ハイブリッド、同系繁殖体、または合成株のいかなる適合可能な組合せ
であってもよい。構成的または誘導的プロモーターと機能的に結合されたアビジ
ン遺伝子を有するトランスジェニック株は、上記の方法を用いて作製される。雄
性不稔株はアビジン遺伝子のコピーを１つ以上有してもよい。
【０１０７】 アビジン遺伝子を有するトランスジェニック雄性不稔株は、上記の方法のいず
れか１つによって雄性不稔性を抑制することによって自家受粉させることができ
る。例えば、リボザイムは、アビジンmRNA分子において特定の標的配列を指向す
るエンドヌクレアーゼ活性を発現するようにデザインすることができる。リボザ
イムをコードする遺伝子は誘導的プロモーターに機能的に結合している。雄性不
稔植物を誘導物質で処理して、リボザイムを発現させ、アビジンmRNAを不活化す
ると、雄性稔性が回復する。または、稔性はアンチセンスRNAをコードするヌク レオチド配列を用いることによって回復する。アンチセンスRNA分子が標的mRNA 分子に結合することによって、翻訳のハイブリダイゼーション停止が起こる。本
発明の文脈において、適したアンチセンスRNA分子はアビジンmRNAと相補的な配 列を有する。本発明の好ましい態様において、アンチセンスRNAは誘導的プロモ ーターの制御下にある。このプロモーターが活性化されると、雄性稔性が回復す
る。
れか１つによって雄性不稔性を抑制することによって自家受粉させることができ
る。例えば、リボザイムは、アビジンmRNA分子において特定の標的配列を指向す
るエンドヌクレアーゼ活性を発現するようにデザインすることができる。リボザ
イムをコードする遺伝子は誘導的プロモーターに機能的に結合している。雄性不
稔植物を誘導物質で処理して、リボザイムを発現させ、アビジンmRNAを不活化す
ると、雄性稔性が回復する。または、稔性はアンチセンスRNAをコードするヌク レオチド配列を用いることによって回復する。アンチセンスRNA分子が標的mRNA 分子に結合することによって、翻訳のハイブリダイゼーション停止が起こる。本
発明の文脈において、適したアンチセンスRNA分子はアビジンmRNAと相補的な配 列を有する。本発明の好ましい態様において、アンチセンスRNAは誘導的プロモ ーターの制御下にある。このプロモーターが活性化されると、雄性稔性が回復す
る。
【０１０８】 さらにもう一つのアプローチにおいて、RNアーゼPによるアビジンmRNA分子の 開裂を促進することができるRNA転写物を、雄性不稔株において産生する。この アプローチに従って、内因性リボザイム、RNアーゼPをアビジンmRNAに指向させ る外部ガイド配列を構築することができ、これは細胞のリボザイムによってその
後開裂される。外部ガイド配列転写物は、mRNAと相補的外部ガイド配列間の塩基
対の形成によって標的とするmRNA種に結合し、このようにして、塩基対領域の5'
側に位置するヌクレオチドでRNアーゼPによってmRNAの開裂を促進する。
後開裂される。外部ガイド配列転写物は、mRNAと相補的外部ガイド配列間の塩基
対の形成によって標的とするmRNA種に結合し、このようにして、塩基対領域の5'
側に位置するヌクレオチドでRNアーゼPによってmRNAの開裂を促進する。
【０１０９】 雄性稔性を回復するさらにもう一つのアプローチにおいて、アビジン遺伝子に
機能的に結合されたプロモーター配列の他に原核細胞調節エレメントも含む発現
ベクターを含むトランスジェニック雄性不稔植物株が産生される。誘導的プロモ
ーターと機能的に結合された原核細胞遺伝子をコードする遺伝子と共にこのアビ
ジン遺伝子を含むトランスジェニック株を産生する。トランスジェニック植物株
は、原核細胞調節配列と結合して、アビジンの発現を抑制し、雄性稔性を回復す
る原核細胞ポリペプチドを産生する誘導物質で処理する。
機能的に結合されたプロモーター配列の他に原核細胞調節エレメントも含む発現
ベクターを含むトランスジェニック雄性不稔植物株が産生される。誘導的プロモ
ーターと機能的に結合された原核細胞遺伝子をコードする遺伝子と共にこのアビ
ジン遺伝子を含むトランスジェニック株を産生する。トランスジェニック植物株
は、原核細胞調節配列と結合して、アビジンの発現を抑制し、雄性稔性を回復す
る原核細胞ポリペプチドを産生する誘導物質で処理する。
【０１１０】 稔性を回復するさらにもう一つの方法は、ビオチンに対するアビジンの高親和
性を利用する。トランスジェニック雄性不稔株にビオチン溶液を噴霧する。ビオ
チンはアビジンに結合してそれを不活化し、それによって雄性稔性を回復する。
トランスジェニック雄性不稔株は一般に、花粉の発生の減数分裂が始まる時期に
ビオチンを噴霧するが、ビオチンの噴霧はより遅れて開始してもよい。好ましい
態様において、雄性不稔の抑制は植物にビオチンを噴霧することによって得られ
る。
性を利用する。トランスジェニック雄性不稔株にビオチン溶液を噴霧する。ビオ
チンはアビジンに結合してそれを不活化し、それによって雄性稔性を回復する。
トランスジェニック雄性不稔株は一般に、花粉の発生の減数分裂が始まる時期に
ビオチンを噴霧するが、ビオチンの噴霧はより遅れて開始してもよい。好ましい
態様において、雄性不稔の抑制は植物にビオチンを噴霧することによって得られ
る。
【０１１１】 本発明の方法に従って、望ましい穀粒または種子形質を有するハイブリッド種
子を産生するために利用される雄性不稔および雄性稔性授粉株は、同系繁殖株、
ハイブリッド株、合成放任授粉株または遺伝的母株である。同系繁殖株、ハイブ
リッド株、合成放任授粉株または遺伝的母株は、植物栽培の当業者に周知の方法
のいずれかによって産生される。例えば、本明細書に参照として組み入れられる
、ポールマン（J. M. Poehlman）、「農作物の育種（BREEDING FIELD CROPS）」
、第３版（ファン・ノストランド＆ラインホルト（Van Nostrand and Reinhold ）、ニューヨーク、ニューヨーク州、1987）。選択した同系繁殖株および／また
はハイブリッド株間の試験交雑を行って、特定の組合せ能力を評価する。市販の
組合せを特定する。
子を産生するために利用される雄性不稔および雄性稔性授粉株は、同系繁殖株、
ハイブリッド株、合成放任授粉株または遺伝的母株である。同系繁殖株、ハイブ
リッド株、合成放任授粉株または遺伝的母株は、植物栽培の当業者に周知の方法
のいずれかによって産生される。例えば、本明細書に参照として組み入れられる
、ポールマン（J. M. Poehlman）、「農作物の育種（BREEDING FIELD CROPS）」
、第３版（ファン・ノストランド＆ラインホルト（Van Nostrand and Reinhold ）、ニューヨーク、ニューヨーク州、1987）。選択した同系繁殖株および／また
はハイブリッド株間の試験交雑を行って、特定の組合せ能力を評価する。市販の
組合せを特定する。
【０１１２】 （1）望ましい穀粒または種子形質に対する遺伝子を１つ以上有し、（2）それ
と交雑させる雄性不稔株と適合する、雄性稔性授粉植物株を選択する。選択され
た穀粒形質または種子形質を制御する遺伝子は、ハイブリッド種子において形質
が容易に発現されるように優性であってもよい。しかし、選択した穀粒形質また
は種子形質を制御する遺伝子は劣性であってもよい。穀粒または種子形質を制御
する遺伝子が劣性である場合、雄性不稔株および雄性稔性授粉株はそれぞれ、こ
の劣性遺伝子を保有するように育種される。目的とする穀粒または種子形質を制
御する遺伝子が劣性である場合、交雑によって生じた全ての種子に望ましい表現
型が発現されるように、雄性不稔および授粉植物の双方がその遺伝子に関して好
ましくはホモ接合である。したがって、雄性不稔および雄性稔性授粉株はそれぞ
れ、子孫の種子に穀粒または種子形質を制御する遺伝子を有してもよい。望まし
い穀粒または種子形質に対する遺伝子は、従来の育種法および／または遺伝子組
換え技法によって、雄性不稔株または雄性稔性授粉株に導入される。
と交雑させる雄性不稔株と適合する、雄性稔性授粉植物株を選択する。選択され
た穀粒形質または種子形質を制御する遺伝子は、ハイブリッド種子において形質
が容易に発現されるように優性であってもよい。しかし、選択した穀粒形質また
は種子形質を制御する遺伝子は劣性であってもよい。穀粒または種子形質を制御
する遺伝子が劣性である場合、雄性不稔株および雄性稔性授粉株はそれぞれ、こ
の劣性遺伝子を保有するように育種される。目的とする穀粒または種子形質を制
御する遺伝子が劣性である場合、交雑によって生じた全ての種子に望ましい表現
型が発現されるように、雄性不稔および授粉植物の双方がその遺伝子に関して好
ましくはホモ接合である。したがって、雄性不稔および雄性稔性授粉株はそれぞ
れ、子孫の種子に穀粒または種子形質を制御する遺伝子を有してもよい。望まし
い穀粒または種子形質に対する遺伝子は、従来の育種法および／または遺伝子組
換え技法によって、雄性不稔株または雄性稔性授粉株に導入される。
【０１１３】 望ましい穀粒または種子形質は、農作物としてのタイプ、発芽、または病気へ
の抵抗性に有意な影響を及ぼす種子の栄養的または生理的特徴である。望ましい
穀粒または種子形質には、蛋白質の品質およびデンプンのタイプと共に油、蛋白
質およびデンプン含有量のような特徴が含まれる。本発明の方法は、異なる市場
において用いられる特殊な種子または穀粒タイプを産生するために用いられる。
例えば、油の含有量が高いトウモロコシは家畜の飼料に添加する動物脂肪の代用
として用いることができる。アミロース含有量が高いトウモロコシは、接着剤、
分解可能プラスチック薄膜および包装材料の製造に用いられる。ロウ状トウモロ
コシからのデンプンは、スープおよびプディングのような多くの異なる食品にお
いて用いられる。
の抵抗性に有意な影響を及ぼす種子の栄養的または生理的特徴である。望ましい
穀粒または種子形質には、蛋白質の品質およびデンプンのタイプと共に油、蛋白
質およびデンプン含有量のような特徴が含まれる。本発明の方法は、異なる市場
において用いられる特殊な種子または穀粒タイプを産生するために用いられる。
例えば、油の含有量が高いトウモロコシは家畜の飼料に添加する動物脂肪の代用
として用いることができる。アミロース含有量が高いトウモロコシは、接着剤、
分解可能プラスチック薄膜および包装材料の製造に用いられる。ロウ状トウモロ
コシからのデンプンは、スープおよびプディングのような多くの異なる食品にお
いて用いられる。
【０１１４】 雄性稔性授粉株は、デンプンおよび蛋白質特性に影響を及ぼす遺伝子を１つ以
上有してもよい。デンプンおよび蛋白質特性に影響を及ぼす遺伝子には、糖状（
su）、アミロース・エキステンダー（ae）、脆弱（bt）、鈍性（du）、粉状（fl
）、不透明（o）、角状（h）、収縮（sh）およびロウ状（wx）が含まれるがこれ
らに限定されない。例えば、ハンナら（Hannah）、Sci. Hortic. 55：177〜197 （1993）を参照のこと。ae、du、wx、aeおよびaewxに関してホモ接合劣性である
トウモロコシ植物から得られたデンプンの特性は特徴付けがなされている。ブロ
ケットら（Brockett）、Starch/Starke 40：175〜177（1988）および米国特許第
5,516,939号を参照のこと。
上有してもよい。デンプンおよび蛋白質特性に影響を及ぼす遺伝子には、糖状（
su）、アミロース・エキステンダー（ae）、脆弱（bt）、鈍性（du）、粉状（fl
）、不透明（o）、角状（h）、収縮（sh）およびロウ状（wx）が含まれるがこれ
らに限定されない。例えば、ハンナら（Hannah）、Sci. Hortic. 55：177〜197 （1993）を参照のこと。ae、du、wx、aeおよびaewxに関してホモ接合劣性である
トウモロコシ植物から得られたデンプンの特性は特徴付けがなされている。ブロ
ケットら（Brockett）、Starch/Starke 40：175〜177（1988）および米国特許第
5,516,939号を参照のこと。
【０１１５】 または授粉株は、デンプン含有量に影響を及ぼす遺伝子によって形質転換して
もよい。例えば、雄性稔性授粉株を、植物酵素を阻害する代謝物の存在下で活性
であるADPグルコース・ピロホスホリラーゼをコードする細菌遺伝子によって形 質転換してもよい。得られた種子はデンプン含有量がより高い。シバックら（Si
vak）、J. of Environ. Polymer Degradation 3(3)：145〜152（1995）。
もよい。例えば、雄性稔性授粉株を、植物酵素を阻害する代謝物の存在下で活性
であるADPグルコース・ピロホスホリラーゼをコードする細菌遺伝子によって形 質転換してもよい。得られた種子はデンプン含有量がより高い。シバックら（Si
vak）、J. of Environ. Polymer Degradation 3(3)：145〜152（1995）。
【０１１６】 授粉株は脂肪酸含有量に影響を及ぼす遺伝子を１つ以上有してもよい。例えば
、fan1遺伝子はダイズのリノレン脂肪酸が低くなるように制御する。ハモンドら
（Hammond）、Crop. Sci. 231：192（1993）。fas遺伝子はダイズのステアリン 脂肪酸含有量が高くなるように制御する。グラーフら（Graef）、Crop. Sci. 25
：1076（1985）。fap1およびfap2遺伝子はそれぞれ、ダイズにおいてパルミチン
酸含有量が低くなるように、およびパルミチン酸含有量が高くなるように制御す
る。エリクソンら（Erickson）、Crop. Sci. 18：544（1988）。
、fan1遺伝子はダイズのリノレン脂肪酸が低くなるように制御する。ハモンドら
（Hammond）、Crop. Sci. 231：192（1993）。fas遺伝子はダイズのステアリン 脂肪酸含有量が高くなるように制御する。グラーフら（Graef）、Crop. Sci. 25
：1076（1985）。fap1およびfap2遺伝子はそれぞれ、ダイズにおいてパルミチン
酸含有量が低くなるように、およびパルミチン酸含有量が高くなるように制御す
る。エリクソンら（Erickson）、Crop. Sci. 18：544（1988）。
【０１１７】 授粉株は種子の油含有量に影響を及ぼす遺伝子によって形質転換してもよい。
例えば、授粉株は、種子油生合成において第一の脱飽和段階を触媒するステアロ
イル-アシル担体蛋白質（ステアロイル-ACP）脱飽和酵素をコードする遺伝子を 有してもよい。ステアロイル-ACP脱飽和酵素遺伝子は種子特異的プロモーターに
機能的に結合してもよい。ステアロイル-ACP脱飽和酵素遺伝子によって形質転換
されたヒマワリ、トウモロコシ、キャノーラ、またはダイズのような植物では、
ステアリン酸レベルが変化しており、飽和および不飽和脂肪酸のレベルが改変ま
たは変化した種子油を産生するために用いることができる。例えば、米国特許第
5,443,974号を参照のこと。
例えば、授粉株は、種子油生合成において第一の脱飽和段階を触媒するステアロ
イル-アシル担体蛋白質（ステアロイル-ACP）脱飽和酵素をコードする遺伝子を 有してもよい。ステアロイル-ACP脱飽和酵素遺伝子は種子特異的プロモーターに
機能的に結合してもよい。ステアロイル-ACP脱飽和酵素遺伝子によって形質転換
されたヒマワリ、トウモロコシ、キャノーラ、またはダイズのような植物では、
ステアリン酸レベルが変化しており、飽和および不飽和脂肪酸のレベルが改変ま
たは変化した種子油を産生するために用いることができる。例えば、米国特許第
5,443,974号を参照のこと。
【０１１８】 または、授粉株は穀粒または種子形質の生合成経路において標的遺伝子の発現
を阻害するアンチセンス遺伝子を有してもよい。例えば、授粉株はステアロイル
・アシル脱飽和酵素の発現を阻害するアンチセンス遺伝子を有する。アンチセン
ス遺伝子は種子特異的プロモーターに機能的に結合してもよい。ステアロイル-A
CP脱飽和酵素アンチセンス遺伝子で形質転換された植物は、種子のステアリン酸
レベルが増加している。例えば、ヌトゾンら（Nutzon）、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89：2624〜2628（1992）を参照のこと。
を阻害するアンチセンス遺伝子を有してもよい。例えば、授粉株はステアロイル
・アシル脱飽和酵素の発現を阻害するアンチセンス遺伝子を有する。アンチセン
ス遺伝子は種子特異的プロモーターに機能的に結合してもよい。ステアロイル-A
CP脱飽和酵素アンチセンス遺伝子で形質転換された植物は、種子のステアリン酸
レベルが増加している。例えば、ヌトゾンら（Nutzon）、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 89：2624〜2628（1992）を参照のこと。
【０１１９】 トップ交雑法に従って、種子産生用の畑に播種した雄性不稔対雄性稔性授粉親
種子の比はそれぞれの親株の遺伝因子に依存し、収率を最適にするために変化す
る。雄性不稔対雄性稔性授粉親株の比は、約６：１〜約９：１である。好ましく
は、雄性不稔対雄性稔性授粉親株の比は、約８：１である。最も好ましくは、雄
性不稔対雄性稔性授粉親株の比は、約９：１である。
種子の比はそれぞれの親株の遺伝因子に依存し、収率を最適にするために変化す
る。雄性不稔対雄性稔性授粉親株の比は、約６：１〜約９：１である。好ましく
は、雄性不稔対雄性稔性授粉親株の比は、約８：１である。最も好ましくは、雄
性不稔対雄性稔性授粉親株の比は、約９：１である。
【０１２０】 本発明は、このために一般的に記述されており、本発明を限定する為ではなく
具体例として提示した以下に述べる実施例を参照することにより、より容易に理
解することができると考えられる。
具体例として提示した以下に述べる実施例を参照することにより、より容易に理
解することができると考えられる。
【０１２１】 実施例１：アビジンの高レベルの構成的発現による雄性不稔トランスジェニック
トウモロコシの作出 トランスジェニックのトウモロコシ植物を作出する方法は、欧州特許出願第0
442 174A1号に記載されており、このため、参照として本明細書に組み入れられ ている。その方法を、以下に簡略に記載する。
トウモロコシの作出 トランスジェニックのトウモロコシ植物を作出する方法は、欧州特許出願第0
442 174A1号に記載されており、このため、参照として本明細書に組み入れられ ている。その方法を、以下に簡略に記載する。
【０１２２】 ユビキチンプロモーターの制御下にアビジン遺伝子を持ち、およびPNINIIター
ミネーター配列をも含むベクター、PHI5168を用いて、トランスジェニックのト ウモロコシ植物を作出した。PHI5168の構造は、図１に示されている。bar遺伝子
を二重の35Sプロモーター制御下に持ち、およびさらにPINIIターミネーター配列
をも含む発現プラスミドPHI610を、アビジンを有する構築物と共に同時に形質転
換に用いて、ビアロホスを含む形質転換混合液で処理することにより、トランス
ジェニック植物を選択した。PHI610の構造は、図２に示されている。二つの発現
ベクターで、Greenら、「植物及び動物の分子遺伝学（Molecular Genetics of P
lants and Animals）」Downeyら編、Academic Press, NY, 20, 147 (1983)の方 法に従ったII型の胚形成培養に由来する、胚形成用浮遊培養を形質転換した。培
養を、Murashigeら、Physio. Plant; 15巻; pp. 453〜497; (1962)に記載された
MurashigeおよびSkoog（「MS」）培地に、2,4-二塩化フェノキシ酢酸（2,4-D）2
mg/Lおよびサッカロース30 g/Lを加えたもので維持した。浮遊培養を、実験の ７日前に710ミクロンの篩にかけ、その濾過物をMS培地中で維持した。
ミネーター配列をも含むベクター、PHI5168を用いて、トランスジェニックのト ウモロコシ植物を作出した。PHI5168の構造は、図１に示されている。bar遺伝子
を二重の35Sプロモーター制御下に持ち、およびさらにPINIIターミネーター配列
をも含む発現プラスミドPHI610を、アビジンを有する構築物と共に同時に形質転
換に用いて、ビアロホスを含む形質転換混合液で処理することにより、トランス
ジェニック植物を選択した。PHI610の構造は、図２に示されている。二つの発現
ベクターで、Greenら、「植物及び動物の分子遺伝学（Molecular Genetics of P
lants and Animals）」Downeyら編、Academic Press, NY, 20, 147 (1983)の方 法に従ったII型の胚形成培養に由来する、胚形成用浮遊培養を形質転換した。培
養を、Murashigeら、Physio. Plant; 15巻; pp. 453〜497; (1962)に記載された
MurashigeおよびSkoog（「MS」）培地に、2,4-二塩化フェノキシ酢酸（2,4-D）2
mg/Lおよびサッカロース30 g/Lを加えたもので維持した。浮遊培養を、実験の ７日前に710ミクロンの篩にかけ、その濾過物をMS培地中で維持した。
【０１２３】 ブヒャナー漏斗による吸引濾過（Whatman No. 614）で浮遊培養から細胞を回 収し、100 ml（新しい重量として）の細胞を、3.3 cmのペトリ皿に移した。細胞
を0.5 mLの新しい培養用培地に拡散させて、細胞の薄層を形成した。覆いを取っ
たペトリ皿を、Biolistics Inc. (Geneva, NY)製の遺伝子銃装置の検体チャンバ
ーに入れた。吸引ポンプを用いて、チャンバー内の圧力を0.1気圧まで下げ、空 気の摩擦により微粒子が減速するのを防いだ。平均径約1.2ミクロンのタングス テン粒子（GTE Sylvania Precision Materials Group, Towanda, Pennsylvania ）で細胞を爆撃した。pH 7.7のTE緩衝液で作成したDNA溶液（1μg DNA/100λ）5
μlを、1.5 mlのエッペンドルフチューブ中で、蒸留水1 mlあたり50 mgの濃度 のタングステン微粒子浮遊液25 μlに加えることにより、PHI5168およびPHI610 の等量混合物を、微粒子にロードした。粒子は凝集して、チューブ内に沈殿した
。
を0.5 mLの新しい培養用培地に拡散させて、細胞の薄層を形成した。覆いを取っ
たペトリ皿を、Biolistics Inc. (Geneva, NY)製の遺伝子銃装置の検体チャンバ
ーに入れた。吸引ポンプを用いて、チャンバー内の圧力を0.1気圧まで下げ、空 気の摩擦により微粒子が減速するのを防いだ。平均径約1.2ミクロンのタングス テン粒子（GTE Sylvania Precision Materials Group, Towanda, Pennsylvania ）で細胞を爆撃した。pH 7.7のTE緩衝液で作成したDNA溶液（1μg DNA/100λ）5
μlを、1.5 mlのエッペンドルフチューブ中で、蒸留水1 mlあたり50 mgの濃度 のタングステン微粒子浮遊液25 μlに加えることにより、PHI5168およびPHI610 の等量混合物を、微粒子にロードした。粒子は凝集して、チューブ内に沈殿した
。
【０１２４】 外来遺伝子を含む、形質転換された植物細胞の培養物を、560R（培地）（N6を
基本とし、1 mg/mlのビアラホスを加えた培地）中で4〜8週間培養した。この培 地は、bar遺伝子を発現する細胞を選択するものである。
基本とし、1 mg/mlのビアラホスを加えた培地）中で4〜8週間培養した。この培 地は、bar遺伝子を発現する細胞を選択するものである。
【０１２５】 その後胚形成用の培養で胚形成を誘導し、細胞を植物体へと発芽させた。カル
ス維持培地上に認められた体細胞胚を発芽させるために、二系列の培地を用いた
。カルスをまず最初に、5.0 mg/L のインドール酢酸（IAA）を含む培地（成熟培
地）に移して、カルスが増殖し続けている間、10〜14日培養した。素材の単位体
積当たりの回収量を最適化するため、カルスは50 mg/プレートで撒いた。
ス維持培地上に認められた体細胞胚を発芽させるために、二系列の培地を用いた
。カルスをまず最初に、5.0 mg/L のインドール酢酸（IAA）を含む培地（成熟培
地）に移して、カルスが増殖し続けている間、10〜14日培養した。素材の単位体
積当たりの回収量を最適化するため、カルスは50 mg/プレートで撒いた。
【０１２６】 次にカルスを、「成熟」培地から、最初の培地と比較してIAA含有量の少ない （1 mg/L）二番目の培地に移した。この時点で、光の当たる場所に培養を移した
。発芽中の体細胞胚の特徴は、緑色の芽条が、連結した根（root access）とと もに伸長していることであった。体細胞胚を、次に、培養管（150 x 25 mm）に 入れた培地に移して、さらに10〜14日培養した。この時点で、植物は約7〜10 cm
の長さがあり、温室内中の条件で活発に低温順化するのに十分な大きさであった
。
。発芽中の体細胞胚の特徴は、緑色の芽条が、連結した根（root access）とと もに伸長していることであった。体細胞胚を、次に、培養管（150 x 25 mm）に 入れた培地に移して、さらに10〜14日培養した。この時点で、植物は約7〜10 cm
の長さがあり、温室内中の条件で活発に低温順化するのに十分な大きさであった
。
【０１２７】 再生した植物を低温順化させるため、植物を無菌コンテナから取り出して、固
化した寒天培地を根から洗浄して除去し、成長用チャンバーに移した。植物の根
が過度に濡れないように相対湿度約100%を維持する、加湿装置を付けた成長用チ
ャンバーに、市販の鉢植え用ミックスを入れ、ここに苗を移した。加湿チャンバ
ー内で3〜4週間おくと、植物は、野外条件へ移植できるほど丈夫になった。
化した寒天培地を根から洗浄して除去し、成長用チャンバーに移した。植物の根
が過度に濡れないように相対湿度約100%を維持する、加湿装置を付けた成長用チ
ャンバーに、市販の鉢植え用ミックスを入れ、ここに苗を移した。加湿チャンバ
ー内で3〜4週間おくと、植物は、野外条件へ移植できるほど丈夫になった。
【０１２８】 野外に出した植物の雄性不稔を観察して解析を行った。選択した植物について
、その後さらに、PCRおよびサザンブロッティングを行って、アビジン遺伝子が 存在するかどうか解析し、ならびにアビジンの発現については標準的な方法によ
るELISAで、解析を行った。
、その後さらに、PCRおよびサザンブロッティングを行って、アビジン遺伝子が 存在するかどうか解析し、ならびにアビジンの発現については標準的な方法によ
るELISAで、解析を行った。
【０１２９】 PCRで解析した94の植物のうち、53が稔性、および41が不稔であった。各植物 ごとの稔性を、PCRで解析したアビジン遺伝子の有無と比較すると、遺伝子が存 在することおよび植物が不稔であることは、98%の相関が認められた。5つの植物
についてサザンブロッティングを行い、アビジン遺伝子の存在を詳しく解析した
。サザンブロットによる解析で、3つの植物は、アビジン遺伝子を持っているこ とが示された。3つの植物すべてが、不稔であった。アビジン遺伝子を持ってい なかった2つの植物は、完全に稔性であった。これらの結果から、アビジン遺伝 子が存在することおよび雄性不稔であることの間には、100％の相関があった。
についてサザンブロッティングを行い、アビジン遺伝子の存在を詳しく解析した
。サザンブロットによる解析で、3つの植物は、アビジン遺伝子を持っているこ とが示された。3つの植物すべてが、不稔であった。アビジン遺伝子を持ってい なかった2つの植物は、完全に稔性であった。これらの結果から、アビジン遺伝 子が存在することおよび雄性不稔であることの間には、100％の相関があった。
【０１３０】 実施例 ２：雄性不稔のトランスジェニックダイズの植物作出のためのアビジン
をコードするDNA配列を含むバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム菌 株の使用 トランスジェニックのダイズ植物体を作出する方法は、米国特許出願第07/920
,409号に記載されており、このためこれを、参照として本明細書に組み入れる。
Pioneer variety 9341のダイズ（Glycine max）種子を、釣り鐘型のガラス器内 に塩素ガスを発生させてこれに暴露させ、表面を殺菌処理する。ガスは、100 ml
の次亜塩素酸ナトリウム（5.25% w/w）に3.5 mlの塩酸（34〜37% w/w）を加えて
発生させる。暴露は、容積約１立方フィートのコンテナ内で、16〜20時間行う。
表面を殺菌処理した種子は、ペトリ皿に入れて、室温で保存する。Gamborgによ る1/10強度の寒天固化培地（0.32 gm/L最小有機物、Sigma Chemical カタログ番
号G5893、0.2%w/v サッカロース、（3.0 mM）2-（N-モルフォリノ）エタンスル フォン酸（MES）を添加したB5基本培地で、植物成長調整剤を含まないものに種 子を撒き、28℃で、約20μEm-2S-1の白色蛍光灯で照射時間16時間として培養し 、発芽させる。3〜4日後、共培養のために種子の準備を行う。種皮を除去し、伸
長している出根を子葉下3〜4 mmのところで除去する。
をコードするDNA配列を含むバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム菌 株の使用 トランスジェニックのダイズ植物体を作出する方法は、米国特許出願第07/920
,409号に記載されており、このためこれを、参照として本明細書に組み入れる。
Pioneer variety 9341のダイズ（Glycine max）種子を、釣り鐘型のガラス器内 に塩素ガスを発生させてこれに暴露させ、表面を殺菌処理する。ガスは、100 ml
の次亜塩素酸ナトリウム（5.25% w/w）に3.5 mlの塩酸（34〜37% w/w）を加えて
発生させる。暴露は、容積約１立方フィートのコンテナ内で、16〜20時間行う。
表面を殺菌処理した種子は、ペトリ皿に入れて、室温で保存する。Gamborgによ る1/10強度の寒天固化培地（0.32 gm/L最小有機物、Sigma Chemical カタログ番
号G5893、0.2%w/v サッカロース、（3.0 mM）2-（N-モルフォリノ）エタンスル フォン酸（MES）を添加したB5基本培地で、植物成長調整剤を含まないものに種 子を撒き、28℃で、約20μEm-2S-1の白色蛍光灯で照射時間16時間として培養し 、発芽させる。3〜4日後、共培養のために種子の準備を行う。種皮を除去し、伸
長している出根を子葉下3〜4 mmのところで除去する。
【０１３１】 アビジン遺伝子を含む改変したバイナリープラスミドを有するアグロバクテリ
ウム土壌細菌株LBA4404を一晩培養し、これをテトラサイクリン1 μg/mlを含む 最小A培地で対数増殖期まで増殖させ、プールして、550 nmにおける吸光度を測 定する。で沈殿して各遠心管に1〜2 x 1010細胞を回収するのに十分な量の109細
胞/mLの培養を、15 mLのコニカル遠心管に入れる。6,000 x gで10分間遠心して 細胞を沈殿させる。遠心後、上清を傾瀉し、必要時まで１時間以内の範囲で、遠
心管を室温に保存する。
ウム土壌細菌株LBA4404を一晩培養し、これをテトラサイクリン1 μg/mlを含む 最小A培地で対数増殖期まで増殖させ、プールして、550 nmにおける吸光度を測 定する。で沈殿して各遠心管に1〜2 x 1010細胞を回収するのに十分な量の109細
胞/mLの培養を、15 mLのコニカル遠心管に入れる。6,000 x gで10分間遠心して 細胞を沈殿させる。遠心後、上清を傾瀉し、必要時まで１時間以内の範囲で、遠
心管を室温に保存する。
【０１３２】 各プレートの種子を、新たに浮遊させたアグロバクテリウムのペレットで処理
できるよう、接種は一組ごとに行う。B5塩類（G5893）3.2 g/L、2.0% w/v サッ カロース、45 μm 6-ベンジルアミノプリン（BAP）、0.5 μMブチル酸インドー ル（IBA）、100μM アセトシリンゴンを含み、10 mM MESでpH 5.5に調整した接 種用培地20 mlに、各バクテリアのペレットを再浮遊させる。ボルテックスをか けて再浮遊させる。次に、接種液を、準備の整った種子を入れたペトリ皿に注ぎ
、外科用剃刀で、子葉節を損傷する。これは、子葉２つを完全なまま保護し、芽
頂を通る長軸方向で種子を二分することによって行う。２分した芽頂から、次に
外科用剃刀で各々の子葉を掘り出して折り取る。子葉節を次に、外科用剃刀で、
軸に沿って対称に繰り返し刻み目を付けることによって損傷する。移植片を、軸
側まで通して完全に切ってしまわないよう、気を付ける。約５分で移植片を用意
した後、バクテリア存在下で、室温で揺動せずに30分間接種を行う。30分後、移
植片を、0.2% w/v のGelrite（Merck & Company Inc.）で固化させた同じ培地の
プレートに移す。移植片を、向軸面を上にして、培地表面と同じ高さに埋め込み
、約20 μEm-2S-1の白色蛍光灯下で、22℃で3日間培養する。
できるよう、接種は一組ごとに行う。B5塩類（G5893）3.2 g/L、2.0% w/v サッ カロース、45 μm 6-ベンジルアミノプリン（BAP）、0.5 μMブチル酸インドー ル（IBA）、100μM アセトシリンゴンを含み、10 mM MESでpH 5.5に調整した接 種用培地20 mlに、各バクテリアのペレットを再浮遊させる。ボルテックスをか けて再浮遊させる。次に、接種液を、準備の整った種子を入れたペトリ皿に注ぎ
、外科用剃刀で、子葉節を損傷する。これは、子葉２つを完全なまま保護し、芽
頂を通る長軸方向で種子を二分することによって行う。２分した芽頂から、次に
外科用剃刀で各々の子葉を掘り出して折り取る。子葉節を次に、外科用剃刀で、
軸に沿って対称に繰り返し刻み目を付けることによって損傷する。移植片を、軸
側まで通して完全に切ってしまわないよう、気を付ける。約５分で移植片を用意
した後、バクテリア存在下で、室温で揺動せずに30分間接種を行う。30分後、移
植片を、0.2% w/v のGelrite（Merck & Company Inc.）で固化させた同じ培地の
プレートに移す。移植片を、向軸面を上にして、培地表面と同じ高さに埋め込み
、約20 μEm-2S-1の白色蛍光灯下で、22℃で3日間培養する。
【０１３３】 3日後、3.2 g/l B5塩類（G5893）、2% w/v サッカロース、5 μM BAP、0.5 μ
M IBA、200 μg/mlバンコマイシン、500 μg/mlセホタキシムを含み、3 mM MES でpH 5.7に調整した、液体逆選択培地に、移植片を移す。移植片を入れた各ペト
リ皿を、継続的に緩やかに旋回揺動し、室温で4日間洗浄する。 逆選択培地は、
4回交換する。
M IBA、200 μg/mlバンコマイシン、500 μg/mlセホタキシムを含み、3 mM MES でpH 5.7に調整した、液体逆選択培地に、移植片を移す。移植片を入れた各ペト
リ皿を、継続的に緩やかに旋回揺動し、室温で4日間洗浄する。 逆選択培地は、
4回交換する。
【０１３４】 その後、3.2 g/l B5塩類（G5893）、2% w/v サッカロース、5.0 μM BAP、0.5
μM IBA、50 μg/ml硫酸カナマイシン、100 μg/mlバンコマイシン、30 μg/ml
セホタキシム、30 μg/mlティメンチンを含み、3 mM MESでpH 5.7に調整し、寒 天で固化した選択培地に、移植片を移す。 選択培地は、0.3% w/v のSeakem Aga
roseで固化する。移植片を、向軸面を下にして培地に埋め込み、28℃で、60〜80
μEM-2S-1の白色蛍光灯下、照射時間16時間で培養する。
μM IBA、50 μg/ml硫酸カナマイシン、100 μg/mlバンコマイシン、30 μg/ml
セホタキシム、30 μg/mlティメンチンを含み、3 mM MESでpH 5.7に調整し、寒 天で固化した選択培地に、移植片を移す。 選択培地は、0.3% w/v のSeakem Aga
roseで固化する。移植片を、向軸面を下にして培地に埋め込み、28℃で、60〜80
μEM-2S-1の白色蛍光灯下、照射時間16時間で培養する。
【０１３５】 2週間後、移植片を再度旋回揺動装置にのせて液体培地で洗浄する。洗浄は、5
0 μg/ml の硫酸カナマイシンを含む逆選択培地で、一晩行う。翌日、寒天で固 化した選択培地に移植片を移す。それらを、向軸面を下にして培地に埋め込み、
さらに2週間の間培養する。
0 μg/ml の硫酸カナマイシンを含む逆選択培地で、一晩行う。翌日、寒天で固 化した選択培地に移植片を移す。それらを、向軸面を下にして培地に埋め込み、
さらに2週間の間培養する。
【０１３６】 選択培地で1ヶ月培養した後、形質転換した組織は、脱色した不健全な組織を 背景に、緑色の扇形をした再生組織として、観察することができる。緑色扇形部
の認められない移植片は廃棄し、緑色扇形部を有する移植片を、3.2 g/l B5塩類
（G5893）、2% w/v サッカロース、3.3 μM IBA、1.7 μMジベレリン酸、100 μ
g/mlバンコマイシン、30 μg/mlセホタキシム、および30 μg/mlティメンチンを
含み、3 mM MESでpH 5.7に調整した伸長培地に移す。伸長培地は、0.2% w/v のG
elriteで固化する。緑色扇形部を、向軸面を上にして埋め込み、前と同様にして
培養する。2週間ごとに新しいプレートに移しながら、この培地で培養を続ける 。芽条が0.5 cmの長さになった時点でベースから切り取り、13 x 100 mlの試験 管に入れた出根培地に入れる。出根培地は、3.2 g/l B5塩類（G5893）、15 g/l
サッカロース、20 μMニコチン酸、900 mg/lピログルタミン酸（PGA）および10
μM IBAを含む。根付培地は3 mM MESでpH 5.7に調整し、0.2% w/vのGelriteで固
化する。10日後、IBAまたはPGAを含まない同じ培地に芽条を移す。 芽条は出根 し、前と同じ環境条件下で、これらの試験管で保管する。
の認められない移植片は廃棄し、緑色扇形部を有する移植片を、3.2 g/l B5塩類
（G5893）、2% w/v サッカロース、3.3 μM IBA、1.7 μMジベレリン酸、100 μ
g/mlバンコマイシン、30 μg/mlセホタキシム、および30 μg/mlティメンチンを
含み、3 mM MESでpH 5.7に調整した伸長培地に移す。伸長培地は、0.2% w/v のG
elriteで固化する。緑色扇形部を、向軸面を上にして埋め込み、前と同様にして
培養する。2週間ごとに新しいプレートに移しながら、この培地で培養を続ける 。芽条が0.5 cmの長さになった時点でベースから切り取り、13 x 100 mlの試験 管に入れた出根培地に入れる。出根培地は、3.2 g/l B5塩類（G5893）、15 g/l
サッカロース、20 μMニコチン酸、900 mg/lピログルタミン酸（PGA）および10
μM IBAを含む。根付培地は3 mM MESでpH 5.7に調整し、0.2% w/vのGelriteで固
化する。10日後、IBAまたはPGAを含まない同じ培地に芽条を移す。 芽条は出根 し、前と同じ環境条件下で、これらの試験管で保管する。
【０１３７】 出根のシステムが十分に確立された時点で、苗を無菌土に移す。温度、照射時
間、および光度は、前と同じに保つ。
間、および光度は、前と同じに保つ。
【０１３８】 トランスジェニックダイズ植物におけるアビジンの発現は、ELISAを用いて確 認及び定量し、ならびに遺伝子の存在は、PCRおよびサザンブロッティングによ り確認する。発現の安定性は、世代を重ね、同じ方法で評価する。不稔性は、ダ
イズにおけるアビジンの発現と相関していることがわかる。
イズにおけるアビジンの発現と相関していることがわかる。
【０１３９】 実施例 ３： アビジンの発現による雄性不稔ヒマワリ植物の作出 アビジンをコードする発現カセットを、トランスジェニックヒマワリの植物及
び種子を作出するために用いる。アビジンをコードするDNA配列を、ユビキチン プロモーターの制御下にある発現カセットに挿入する。この発現カセットを、次
に、EcoRI部位を用いて、PHI 5765のようなバイナリーベクターにサブクローン する。次にバイナリーベクターをアクロバクテリウム・ツメファシエンスのヘル
パー株に導入する。
び種子を作出するために用いる。アビジンをコードするDNA配列を、ユビキチン プロモーターの制御下にある発現カセットに挿入する。この発現カセットを、次
に、EcoRI部位を用いて、PHI 5765のようなバイナリーベクターにサブクローン する。次にバイナリーベクターをアクロバクテリウム・ツメファシエンスのヘル
パー株に導入する。
【０１４０】 ヒマワリの植物を、Bidneyら、Plant Mol. Bio.; 18巻; p.301; 1992の記載に
従って、微粒子爆撃法で処理した後、アグロバクテリウムのLBA4404株で形質転 換する。 要約すれば、Pioneer Sunflower Line SMF-3の種子から種皮を除去し 、表面を殺菌する。種子を水でしめらせた濾紙にのせ、暗所において、26℃で18
時間、水分を吸収させる。子葉および根幹を除去し、374BGA培地（MS塩類、Shep
hardビタミン類、40 mg/L硫酸アデニン、3%サッカロース、0.8%植物寒天 pH5.6 に、0.5 mg/L BAP、0.25 mg/L IAAおよび0.1 mg/L GAを加えたもの）上で、分裂
組織移植片を培養する。24時間後、初葉を除去して頂端の分裂組織を露出し、移
植片を、頂端半球を上に向けて、水性寒天を入れた20 mm のペトリ皿を用いて、
60 mmの中心に2 cmの円形に置く。TE緩衝液に浮遊させたタングステン粒子、ま たはアビジン遺伝子を含む発現プラスミドを付着させた粒子で、移植片を２回爆
撃する。分裂組織の移植片を、374BGA培地上で、光照射下、26℃でさらに72時間
共培養する。
従って、微粒子爆撃法で処理した後、アグロバクテリウムのLBA4404株で形質転 換する。 要約すれば、Pioneer Sunflower Line SMF-3の種子から種皮を除去し 、表面を殺菌する。種子を水でしめらせた濾紙にのせ、暗所において、26℃で18
時間、水分を吸収させる。子葉および根幹を除去し、374BGA培地（MS塩類、Shep
hardビタミン類、40 mg/L硫酸アデニン、3%サッカロース、0.8%植物寒天 pH5.6 に、0.5 mg/L BAP、0.25 mg/L IAAおよび0.1 mg/L GAを加えたもの）上で、分裂
組織移植片を培養する。24時間後、初葉を除去して頂端の分裂組織を露出し、移
植片を、頂端半球を上に向けて、水性寒天を入れた20 mm のペトリ皿を用いて、
60 mmの中心に2 cmの円形に置く。TE緩衝液に浮遊させたタングステン粒子、ま たはアビジン遺伝子を含む発現プラスミドを付着させた粒子で、移植片を２回爆
撃する。分裂組織の移植片を、374BGA培地上で、光照射下、26℃でさらに72時間
共培養する。
【０１４１】 アグロバクテリウム処理した分裂組織を、72時間の共培養の後、250 μg/mlセ
ホタキシムを含む374培地（1%サッカロースを含み、BAP、IAAまたはGA3を含まな
い374BGA）に移す。さらに2週間、26℃で日照時間16時間の培養条件で苗を培養 し、緑色または脱色に発色させる。苗をカナマイシンを含む培地に移し、成長さ
せる。植物中のアビジンの存在を、実施例２に記載したようにして確認および定
量する。雄性不稔が存在することは、植物にアビジンが発現していることと相関
しているのがわかる。
ホタキシムを含む374培地（1%サッカロースを含み、BAP、IAAまたはGA3を含まな
い374BGA）に移す。さらに2週間、26℃で日照時間16時間の培養条件で苗を培養 し、緑色または脱色に発色させる。苗をカナマイシンを含む培地に移し、成長さ
せる。植物中のアビジンの存在を、実施例２に記載したようにして確認および定
量する。雄性不稔が存在することは、植物にアビジンが発現していることと相関
しているのがわかる。
【０１４２】 前文は、特に好ましい態様に言及したものであるが、本発明がそれだけに限局
されるものではないことが理解されるはずである。当技術分野において通常の技
術を有する当業者は、本明細書に開示された態様に様々な改変を加えることがで
きると考えられるが、そのような改変は、以下の請求の範囲で定義する、本発明
の範囲内に含まれるものとする。本明細書に記載されている出版物および特許出
願はすべて、本発明が属する当技術分野の人々の技術レベルを示すものである。
されるものではないことが理解されるはずである。当技術分野において通常の技
術を有する当業者は、本明細書に開示された態様に様々な改変を加えることがで
きると考えられるが、そのような改変は、以下の請求の範囲で定義する、本発明
の範囲内に含まれるものとする。本明細書に記載されている出版物および特許出
願はすべて、本発明が属する当技術分野の人々の技術レベルを示すものである。
【図１】 図１は、トウモロコシのユビキチンプロモーター（その第一のエキソンプラス
第一のイントロンを含む）によってオオムギのαアミラーゼ輸送シグナル配列お
よびアビジンコード領域の発現が起こる、アビジンコードプラスミドPHI5168を 示す。
第一のイントロンを含む）によってオオムギのαアミラーゼ輸送シグナル配列お
よびアビジンコード領域の発現が起こる、アビジンコードプラスミドPHI5168を 示す。
【図２】 図２は、bar遺伝子をコードするプラスミドPHI610を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年７月１３日（２０００．７．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ハワード ジョン エイ. アメリカ合衆国 テキサス州 カレッジ ステーション スタリオン リッジ 5819 (72)発明者 マドック シェイラ アメリカ合衆国 アイオワ州 ジョンスト ン リンデン サークル 5630 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 CD13 CD17 CG01 4B024 AA08 BA79 BA80 CA02 CA07 CA09 DA01 DA05 EA04 FA02 FA07 FA18 GA11 GA17 GA27 HA13 HA14 4B065 AA11X AA88X AA90Y AC14 AC20 BA02 BA12 BA25 BA30 BB01 BC01 BC31 BC48 CA24 CA53 CA60
Claims (65)
- 【請求項１】 植物のプロモーターとアビジン遺伝子に機能的に結合された
シグナル配列をコードするヌクレオチド配列とを含む単離DNA分子。 - 【請求項２】 請求項１記載の単離DNA分子を含む発現ベクター。
- 【請求項３】 植物プロモーター配列が構成的プロモーターである、請求項
２記載の発現。 - 【請求項４】 構成的プロモーター配列がユビキチンプロモーター配列であ
る、請求項３記載の発現ベクター。 - 【請求項５】 植物が請求項２記載の発現ベクターを含む、トランスジェニ
ック植物。 - 【請求項６】 植物がトウモロコシ植物である、請求項５記載のトランスジ
ェニック植物。 - 【請求項７】 植物がダイズ植物である、請求項５記載のトランスジェニッ
ク植物。 - 【請求項８】 植物がヒマワリ植物である、請求項５記載のトランスジェニ
ック植物。 - 【請求項９】 発現ベクターが構成的プロモーター配列を含む、請求項５記
載のトランスジェニック植物。 - 【請求項10】 構成的プロモーター配列がユビキチンプロモーター配列であ
る、請求項９記載のトランスジェニック植物。 - 【請求項11】 プロモーターがアビジン遺伝子の発現を制御し、それによっ
てアビジン遺伝子発現が雄性不稔を引き起こす、植物プロモーターとアビジン遺
伝子に機能的に結合されたシグナル配列をコードするヌクレオチド配列とを含む
発現ベクターを植物細胞に導入することを含む、トランスジェニック雄性不稔植
物の製造方法。 - 【請求項12】 植物細胞からトランスジェニック植物を再生させることをさ
らに含む、請求項11記載の方法。 - 【請求項13】 プロモーターがユビキチンプロモーターを含む、請求項11記
載の方法。 - 【請求項14】 雄性稔性ハイブリッド植物を製造するためにアビジン遺伝子
を用いる方法であって、ハイブリッド植物が第二の外来遺伝子を発現し、該第二
外来遺伝子の産物がハイブリッド植物におけるアビジンの発現を減少させ、それ
によって雄性稔性ハイブリッド植物が産生される、以下の段階を含む方法： （a）アビジンの発現が雄性不稔を引き起こす、請求項１記載のDNA分子を含む、
第一の親の雄性不稔植物を産生する段階； （b）第二の外来遺伝子を発現する第二のトランスジェニック親植物を産生する 段階；および （c）ハイブリッド植物を得るために第一の親と第二の親とを交雑する段階。 - 【請求項15】 第二の外来遺伝子がアンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子
、および外部ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、請求項14記載の方法
。 - 【請求項16】 アンチセンス遺伝子がアビジンmRNA配列を含む、請求項15記
載の方法。 - 【請求項17】 リボザイム遺伝子がアビジンmRNA配列を含む、請求項16記載
の方法。 - 【請求項18】 外部ガイド配列遺伝子がアビジンmRNA配列を含む、請求項16
記載の方法。 - 【請求項19】 第一の親植物のDNA分子が、プロモーターに機能的に結合し ているLexAオペレーターをさらに含み、第二の外来遺伝子がLexAリプレッサー遺
伝子である、請求項14記載の方法。 - 【請求項20】 プロモーター配列が以下からなる群より選択される葯ボック
スを含む、葯特異的プロモーター配列である、請求項２記載の発現ベクター： （a）配列番号：４のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （b）配列番号：５のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：６のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （d）（a）、（b）または（c）の機能的断片。 - 【請求項21】 葯ボックスが配列番号；４のヌクレオチド配列であって、葯
特異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに
含む、請求項20記載の発現ベクター： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項22】 葯ボックスが配列番号：５のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項20記載の発現ベクター： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項23】 葯ボックスが配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、およ
び葯特異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさ
らに含む、請求項20記載の発現ベクター： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項24】 植物にビオチン溶液を噴霧することを含む、アビジンの発現
によって雄性不稔となった植物において稔性を回復する方法。 - 【請求項25】 プロモーターが誘導的プロモーターを含む、請求項11記載の
方法。 - 【請求項26】 アンチセンス遺伝子が誘導的プロモーターに機能的に結合し
ている、請求項15記載の方法。 - 【請求項27】 アビジン遺伝子がストレプトアビジン遺伝子である、請求項
１記載の単離DNA分子。 - 【請求項28】 アビジンをコードするヌクレオチド配列に機能的に結合され
た組織特異的プロモーターを含む単離DNA分子。 - 【請求項29】 請求項28記載の単離DNA分子を含む発現ベクター。
- 【請求項30】 請求項29記載の発現ベクターを含む、トランスジェニック植
物。 - 【請求項31】 トウモロコシ植物である、請求項30記載のトランスジェニッ
ク植物。 - 【請求項32】 ダイズ植物である、請求項30記載のトランスジェニック植物
。 - 【請求項33】 ヒマワリ植物である、請求項30記載のトランスジェニック植
物。 - 【請求項34】 プロモーターがアビジン遺伝子の発現を制御し、それによっ
て該アビジン遺伝子発現が雄性不稔を引き起こす、アビジン遺伝子に機能的に結
合された組織特異的プロモーターを含む発現ベクターを植物細胞に導入すること
を含む、トランスジェニック雄性不稔植物の製造方法。 - 【請求項35】 植物細胞からトランスジェニック植物を再生することをさら
に含む、請求項34記載の方法。 - 【請求項36】 組織特異的プロモーターが葯特異的プロモーターを含む、請
求項34記載の方法。 - 【請求項37】 雄性稔性ハイブリッド植物を製造するためにアビジン遺伝子
を用いる方法であって、ハイブリッド植物が第二の外来遺伝子を発現し、該第二
外来遺伝子の産物が該ハイブリッド植物においてアビジンの発現を減少させ、そ
れによって雄性稔性ハイブリッド植物が産生される、以下の段階を含む方法： （a）アビジンの発現が雄性不稔を引き起こす、請求項28記載のDNA分子を含む、
第一の親の雄性不稔植物を産生する段階； （b）第二の外来遺伝子を発現する第二のトランスジェニック親植物を産生する 段階；および （c）ハイブリッド植物を産生するために、該第一の親と該第二の親とを交雑さ せる段階。 - 【請求項38】 第二の外来遺伝子がアンチセンス遺伝子、リボザイム遺伝子
および外部ガイド配列遺伝子からなる群より選択される、請求項37記載の方法。 - 【請求項39】 アンチセンス遺伝子がアビジンmRNA配列を含む、請求項37記
載の方法。 - 【請求項40】 リボザイム遺伝子がアビジンmRNA配列を含む、請求項37記載
の方法。 - 【請求項41】 外部ガイド配列遺伝子がアビジンmRNA配列を含む、請求項37
記載の方法。 - 【請求項42】 第一の親植物のDNA分子が、プロモーターに機能的に結合し ているLexAオペレーターをさらに含み、第二の外来遺伝子がLexAリプレッサー遺
伝子である、請求項37記載の方法。 - 【請求項43】 組織特異的プロモーター配列が以下からなる群より選択され
る葯ボックスを含む葯特異的プロモーター配列である、請求項29記載の発現ベク
ター： （a）配列番号：４のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （b）配列番号：５のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：６のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （d）（a）、（b）または（c）の機能的断片。 - 【請求項44】 葯ボックスが配列番号；４のヌクレオチド配列であって、葯
特異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに
含む、請求項43記載の発現ベクター： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項45】 葯ボックスが配列番号：５のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項43記載の発現ベクター： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項46】 葯ボックスが配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項43記載の発現ベクター： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項47】 以下の段階を含む、望ましい穀粒形質を有する種子の製造方
法： （a）雄性不稔であって、組織特異的プロモーター配列と機能的に結合されたア ビジンをコードするヌクレオチド配列を含む、第一の親植物を産生する段階； （b）雄性稔性であって、望ましい穀粒形質を制御する遺伝子を１つ以上有する 第二の親植物を産生する段階； （c）該穀粒形質を有するハイブリッド種子を産生させるために、該第一の親と 該第二の親とを交雑させる段階；および （d）該種子を採集する段階。 - 【請求項48】 第一および第二の植物がトウモロコシ、ダイズ、キャノーラ
、およびヒマワリからなる群より選択される、請求項47記載の方法。 - 【請求項49】 第一および第二の植物がトウモロコシである、請求項48記載
の方法。 - 【請求項50】 第一および第二の植物がダイズである、請求項49記載の方法
。 - 【請求項51】 第一および第二の植物がヒマワリである、請求項50記載の方
法。 - 【請求項52】 プロモーター配列が以下からなる群より選択される葯ボック
スを含む葯特異的プロモーター配列である、請求項47記載の方法： （a）配列番号：４のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （b）配列番号：５のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：６のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （d）（a）、（b）または（c）の機能的断片。 - 【請求項53】 葯ボックスが配列番号；４のヌクレオチド配列であって、葯
特異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに
含む、請求項52記載の方法： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項54】 葯ボックスが配列番号：５のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項52記載の方法： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項55】 葯ボックスが配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項52記載の方法： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項56】 穀粒形質が油、蛋白質およびデンプン含有量からなる群より
選択される、請求項47記載の方法。 - 【請求項57】 以下の段階を含む、望ましい穀粒形質を有する種子の製造方
法： （a）雄性不稔であって、植物プロモーターとアビジン遺伝子に機能的に結合さ れたシグナル輸送配列とを含むヌクレオチド配列を含有する、第一の親植物を産
生する段階； （b）雄性稔性であって、望ましい穀粒形質を制御する遺伝子を１つ以上有する 第二の親植物を産生する段階； （c）該穀粒形質を有する種子を産生させるために、該第一の親植物と該第二の 親植物とを交雑させる段階；および （d）該種子を採集する段階。 - 【請求項58】 第一および第二の植物がトウモロコシ、ダイズ、キャノーラ
、およびヒマワリからなる群より選択される、請求項57記載の方法。 - 【請求項59】 第一および第二の植物がトウモロコシである、請求項58記載
の方法。 - 【請求項60】 第一および第二の植物がダイズである、請求項58記載の方法
。 - 【請求項61】 第一および第二の植物がヒマワリである、請求項58記載の方
法。 - 【請求項62】 プロモーター配列が以下からなる群より選択される葯ボック
スを含む葯特異的プロモーター配列である、請求項57記載の方法： （a）配列番号：４のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （b）配列番号：５のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：６のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （d）（a）、（b）または（c）の機能的断片。 - 【請求項63】 葯ボックスが配列番号；４のヌクレオチド配列であって、葯
特異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに
含む、請求項62記載の方法： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項64】 葯ボックスが配列番号：５のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項62記載の方法： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。 - 【請求項65】 葯ボックスが配列番号：６のヌクレオチド配列を有し、葯特
異的プロモーターが以下からなる群より選択されるコアプロモーターをさらに含
む、請求項62記載の方法： （a）CaMV 35Sコアプロモーター； （b）配列番号：７のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （c）配列番号：８のヌクレオチド配列を有するDNA分子； （d）配列番号：９のヌクレオチド配列を有するDNA分子；および （e）（b）、（c）または（d）の機能的断片。
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