JP2001512969A

JP2001512969A - 緑内障の診断および治療

Info

Publication number: JP2001512969A
Application number: JP53596398A
Authority: JP
Inventors: サルファラジ，マンズール
Original assignee: ザユニバーシティーオブコネティカット
Priority date: 1997-02-13
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2001-08-28
Also published as: CA2281000A1; US5962230A; EP0970243A1; AU6325898A; US6046009A; WO1998036098A1; DE69833104D1; EP0970243B1; KR20000071083A; NZ337351A; AU724316B2; CN1250484A; ATE315104T1

Abstract

(57)【要約】ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子等の緑内障関連遺伝子における突然変異を検出することによる、緑内障および特に原発性先天性緑内障の診断方法が開示される。該方法には、緑内障関連遺伝子への突然変異核酸プローブのハイブリッド形成を用いるサザンもしくはノーザン分析等のハイブリッド形成法；制限消化による直接突然変異分析；緑内障関連遺伝子のシーケンス；増幅させたゲノムＤＮＡと対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成；または緑内障関連遺伝子によりコードされる突然変異タンパク質の存在の同定が含まれる。また、緑内障の診断用キットも記載される。さらに、緑内障関連遺伝子によりコードされるタンパク質の投与；遺伝子、遺伝子構築物もしくはその他の核酸構築物の投与；または他の治療剤の投与を含む緑内障の治療方法も記載される。

Description

【発明の詳細な説明】緑内障の診断および治療米国政府の基金本発明は、米国国立眼研究所から与えられた契約第EY-11095号および米国国立衛生研究所から与えられた契約第MOI-RR-06192号に基づいた米国政府の援助によってなされた。米国政府は本発明に特定の権利をもっている。関連特許出願本出願は、1997年２月13日付けで出願された米国特許出願第08/800,036号の一部継続出願である1997年９月10日付けで出願された米国特許出願第08/926,492号の一部継続出願である。なおこれら出願の教示は、すべて参照により本明細書に取り込まれる。発明の背景緑内障は、視神経の変質を特徴とする一群の眼の障害である。緑内障は、全世界の失明の主要原因の一つである。緑内障を起こす主な危険因子の１つは家族歴であり、緑内障のいくつもの異なる遺伝形態が報告されている。原発性先天性緑内障すなわち乳児緑内障（遺伝子記号：GLC3）は、失明全体の 0.01〜0.04％を占める遺伝障害である。この障害は、眼の房水流出システムの不適正な発育が特徴であり、これにより眼圧が上昇し、眼球または角膜が膨大し（すなわち牛眼）、視神経が損傷して、最終的に視覚が損なわれる。GLC3の病因は、単一の解剖学的欠陥を同定しようと努力がなされているにもかかわらず不明のままである。この疾患に関連がある少なくとも二つの染色体の位置が同定されている。すなわち、2p21における１つの遺伝子座（GLC3A）（Sarfarazi，M．ら、G enomics、30巻171〜177頁、1995年）；および1p36における第二の遺伝子座（ GLC3B）（Akarsu，A.N．ら、Hum．Mol．Gen.、5(8)巻1199〜1203頁、1996年）である。6pの領域および染色体11を含む他の特定の遺伝子座は除外されている（Ak arsu，A.N．ら、Am．J．Med．Genet.、61巻290〜292頁、1996年）。原発性開放角緑内障（遺伝子記号：GLC1）は、視神経の萎縮によって視野が欠損して最終的に失明することを特徴とする通常の障害である。GLC1は、発症年齢および臨床検査の結果の差に基づいて、二つの主要グループに分割されている。若年で発症する原発性開放角緑内障（GLC1A）は、通常、小児期後期または成人期早期に出現する。GLC1Aの進行は迅速かつ重症で高い眼圧を伴い、医療処置に対する応答に乏しいので、通常、眼球の手術が必要である。GLC1Aは、染色体１のq21〜q31の領域に位置づけられており、遺伝子異質性を有している（Sheffi eld，V.C．ら、Hum．Mol．Genet.、４巻1837〜1844頁、1995年）。成人期または後期での原発性開放角緑内障（GLC1B）は、最も普通のタイプの緑内障である。この緑内障は、若年で発症する原発性開放角緑内障より軽症でかつ徐々に進行し、通常40歳以後に不定期に発症する。GLC1Bは、眼圧のわずかかないしは中程度までの上昇と関連性があり、定期的に監視された医療処置に対して満足すべき応答をすることが多い。しかし、この疾患は、徐々にかつ痛みなしで進行するので、視神経に回復不能の損傷がすでに起こってしまった後期に至るまで検出できない。連鎖、ハプロタイプおよび臨床データは、いくつかの他の遺伝子座についての証拠とともに、GLC1Bの遺伝子座を、2cen-q13領域（Stoilova ，D．ら、Genomics、36巻142〜150頁、1996年）および新しい遺伝子座3q21〜q22 （Sarfarazi，M．らの1996年の報告）に帰属させている。緑内障は潜行性であるため、視神経に対し重大な損傷が起こる前に予防また軽減する方法を取ることができるように、緑内障が発生する可能性を早期に診断または予測する一層優れた方法が要望されている。発明の要約本発明は、緑内障を診断または治療する方法に関する。個体の緑内障を診断する方法には、この疾患に関連する遺伝子に突然変異が存在することを検出するという方法がある。その突然変異としては、フレームシフト変異を生じる一つ以上のヌクレオチドの挿入または欠失；コードされているアミノ酸を変化させる少なくとも一つのヌクレオチドの変化；未成熟停止コドンを生じる少なくとも一つのヌクレオチドの変化；遺伝子のコード配列の中断をもたらす不等の組換えまたは遺伝子変換によって起こる挿入などの一つもしくは複数のヌクレオチドの挿入；遺伝子の一部の重複；遺伝子の全部もしくは一部の転位；または遺伝子の全部もしくは一部の再配列がある。緑内障に関連する遺伝子には二つ以上の突然変異部分が存在することがある。緑内障に関連する突然変異は以下の多数の方法で同定できる。例えば、ゲノムDNAのサザン分析法；ゲノムDNAを増幅し、続いて行う制限酵素の消化による直接突然変異分析法；RNAのノーザン分析法；遺伝子を単離して配列を直接決定する方法；または、緑内障に関連する遺伝子がコードするタンパク質の分析法がある。例えば、遺伝子を含有するDNAの試料を、緑内障の疑いがあるかまたは緑内障の遺伝的保因者である疑いがある個体（被検個体）から入手する。そのDNAを、少なくとも１種の突然変異核酸プローブとを、その遺伝子が突然変異核酸プローブと特異的にハイブリッドを形成するのに十分な条件下で接触させる。突然変異核酸プローブは、上記突然変異の少なくとも一つを有する遺伝子またはそのフラグメントのDNA、cDNAまたはRNA；またはかようなcDNAフラグメントに対応するRN Aフラグメントを含有している。突然変異核酸フラグメントの突然変異核酸プローブへの特異的なハイブリッド形成が存在していることは、緑内障に関連している遺伝子に突然変異があることを示している。別の実施例では、該遺伝子の、PN Aプローブへの特異的なハイブリッドを形成するのに十分な条件下で、DNAをPNA プローブと接触させる。特異的なハイブリッド形成が存在することは、緑内障に関連する遺伝子に突然変異があることを示している。あるいは、突然変異によって制限部位が生成または消失する場合は、被検個体由来のゲノムDNA、RNAまたはcDNAの試料を制限消化することによる直接突然変異分析法を実施できる。関連するDNA、RNAまたはcDNAのフラグメントの消化パターンは、緑内障に関連する突然変異の存在の有無を示す。緑内障に関連する突然変異の存在は、配列のデータによって診断することもできる。被検個体由来のゲノムDNA、RNAまたはcDNAの試料を入手し、その遺伝子または該遺伝子のフラグメントの配列を決定する。個体由来の前記遺伝子の配列を、該遺伝子の既知の配列（対照の配列）と比較する。個体の遺伝子の中での上記のような突然変異の存在は、緑内障に関連する突然変異を示している。本発明は、さらに、緑内障に関連する遺伝子がコードするタンパク質の発現の変化を検出することによる個体の緑内障の診断方法に関する。発現の変化は、発現されるタンパク質の量の変化（定量的変化）または発現されるタンパク質の組成の変化（定性的変化）またはその両者でもよい。対照試料にある、緑内障に関連する遺伝子がコードするタンパク質の発現と比較したとき、被検試料にある、緑内障に関連する遺伝子がコードするタンパク質の発現が変化していることは、緑内障を示している。該タンパク質発現の変化は、標準の方法、例えばウェスタンブロット法などを使って評価できる。本発明は、さらに、緑内障に関連する突然変異遺伝子がコードするタンパク質に対する抗体（モノクローナルまたはポリクローナルの抗体）に関する。これらの抗体も診断方法に使用できる。例えば、対象のタンパク質を含有する被検試料を、上記のような緑内障に関連する突然変異を有する遺伝子がコードするタンパク質に対して特異的な抗体と接触させる。その抗体が、対象のタンパク質と特異的に結合することは、緑内障に関連する突然変異を示している。また、本発明は、緑内障に関連する遺伝子がコードするタンパク質の活性を代替するか、まねるか、または補充するような治療薬剤を投与するなどの緑内障の治療方法、および緑内障の遺伝子治療法に関する。本発明によれば、緑内障に関連する遺伝子の突然変異の同定が容易になるので、この疾患の一層優れた早期の診断と治療を容易に行えるようになる。このような突然変異が同定されると、一つの形態の緑内障が他の形態のものから区別されるので、この疾患に冒されている個体、およびこの疾患に冒されている個体または疾患の遺伝的保因者であるかもしれない家系の他のメンバーに対し一層優れた治療計画を立てることができる。図面の簡単な説明図１は、原発性先天性緑内障に関連する遺伝子のGLC3Aの臨界候補的領域（Cri tical candidate region）の図である。図２は、CYP1B1遺伝子のゲノム構造の図であり、三つの緑内障関連突然変異が同定されている。図３は、図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃと個々に分類した一連の線図であり、五つのGLC3A家系のゲノム突然変異の分析結果を示す。図３Ａは、アクリルアミドゲル電気泳動法と配列決定によって検定された、家系17と26における13個の塩基対の欠失を示す。図３Ｂは、家系10と11における単一のシトシン塩基の挿入の分析結果を示す。図３Ｃは、家系15で観察された大きな欠失をPCRで特性評価した結果を示す。発明の詳細な説明本発明は緑内障の診断方法に関する。用語「緑内障」は、本明細書で使用する場合、遺伝性緑内障、例えば原発性先天性緑内障すなわち乳児緑内障；原発性開放角緑内障（POAG）（若年発症および成人もしくは後期発症のPOAGを含む）；続発緑内障；色素性緑内障；および低眼圧緑内障などを意味する。出願人は、本明細書で述べているように、緑内障に関連する遺伝子を同定し、すなわちその遺伝子の突然変異が疾患の存在に関連していることを同定したのである。緑内障に関連がある遺伝子を同定するため、出願人は、原発性先天性緑内障と関連がある遺伝子座GLC3Aに存在する遺伝子を研究した。候補的遺伝子を同定した後、出願人は、原発性先天性緑内障の家系のパネル内の個体由来のゲノム DNAの試料からの候補遺伝子の直接配列分析を行った。出願人は、ヒトのシトクロムP4501B1（CYP1B1）の遺伝子中の17種の異なる突然変異が原発性先天性緑内障と関連があることを同定した。CYP1B1の遺伝子はSutter，T.R．ら、J．Biol． Chem.、269巻13092頁1994年に記載されている。なおこの文献の教示はすべて、参照により本明細書に取り込まれる。そしてCYP1B1の遺伝子のヌクレオチド配列は、GenBankから受託番号U03688で入手できる。二つ以上の家系で発見されたCYP1B1の遺伝子中の一つの突然変異は、CYP1B1遺伝子のコード配列からヌクレオチド1410〜1422［GAGTGCAGGCAGA（配列番号：１）］を除去した13個の塩基対の欠失であった。この突然変異は、前記欠失の下流に、未成熟停止コドンの203個の塩基対［元の（フレームシフトを起こす前の）最後のアミノ酸Thr-354の後の68個のアミノ酸］を生成することによってオープンリーディングフレームの先端を切断したフレームシフトをもたらした。原発性先天性緑内障に関連があったCYP1B1の遺伝子の第二の突然変異は、ヌクレオチド 1209〜1214の間に位置する６個のシトシンのストレッチ中への一つの余分のシトシン塩基の挿入であった。また、この挿入は、その挿入部位から下流に未成熟停止コドンの106個の塩基対（元の最後のアミノ酸Pro-289から下流へ36個のアミノ酸）を生成するフレームシフト突然変異をもたらした。また、CYP1B1遺伝子の突然変異の第三のタイプには、イントロIIの一部およびエキソンIIIのコード配列の大部分を除いた欠失がある。第四の突然変異は、ヌクレオチド1546〜1555（TC ATGCCACC、配列番号：20）の10個の塩基対の重複であった。10個の塩基対のこの重複は、未成熟停止コドンをアミノ酸403の後に生成し、全長の（突然変異していない）タンパク質から140個のアミノ酸を除去するフレームシフト突然変異をもたらした。第五の突然変異はヌクレオチド1737におけるシトシンの単一塩基の欠失であったが、これによって、未熟の終結コドンTAGを生成して80個のアミノ酸の除去（アミノ酸463の後のすべてのアミノ酸の欠失）を起こしたフレームシフトが起こった。第六の突然変異は、ヌクレオチド1187における単一の塩基の変化（Ｇ→Ｔトランジション）であったが、未成熟TAA停止コドンが生成した。第七の突然変異は、ヌクレオチド1482における単一の塩基の変化（Ｃ→Ｔトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がプロリンからロイシンに変化した。第八の突然変異は、ヌクレオチド５１７における単一の塩基の変化（Ｇ→Ｃトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がトリプトファンからシステインに変化した。第九の突然変異は、ヌクレオチド528における単一の塩基の変化（Ｇ→Ａトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がグリシンからグルタミン酸に変化した。第十の突然変異は、ヌクレオチド846におけるチミン塩基の挿入であったが、タンパク質のカルボキシ末端から377個のアミノ酸の欠失をもたらすフレームシフト突然変異を起こした。第十一の突然変異は、ヌクレオチド1439における単一の塩基の変化（Ｇ→Ｔトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がグリシンからトリプトファンに変化した。第十二の突然変異は、ヌクレオチド1505における単一の塩基の変化（Ｇ→Ａトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がグルタミン酸からリシンに変化した。第十三の突然変異は、ヌクレオチド1515における単一の塩基の変化（Ｇ→Ａトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がアルギニンからヒスチジンに変化した。第十四の突然変異は、ヌクレオチド1656における単一塩基の変化（Ｃ→Ｔトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がプロリンからロイシンに変化した。第十五の突然変異は、ヌクレオチド1691における単一塩基（Ｇ）の欠失であったが、タンパク質のカルボキシ末端から95個のアミノ酸の欠失をもたらすフレームシフト突然変異を起こした。第十六の突然変異は、ヌクレオチド1751 における単一塩基の変化（Ｃ→Ｔトランジション）であったが、コードされるアミノ酸がアルギニンからトリプトファンに変化した。第十七の突然変異は、ヌクレオチド1749に始まる27個のヌクレオチドの重複（すなわち、ヌクレオチド1749〜 1775の重複）であったが、タンパク質のカルボキシ末端から76個のアミノ酸の欠失をもたらすフレームシフト突然変異が起こった。緑内障に関連する遺伝子のこれら突然変異が発見された結果、いまや、緑内障の診断法を利用できる。本明細書に記載されている方法または他の適当な方法を使用すると、緑内障に関連する遺伝子を同定することができる。「緑内障関連遺伝子」とは、突然変異した場合に、緑内障に関連する突然変異を有する遺伝子である。「緑内障関連遺伝子」としては、タンパク質をコードするDNA、ならびに他の要素、例えばリーダー配列とトレーラー配列、プロモーター要素、イントロンおよびエキソンがある。本明細書に記載されている「緑内障に関連する突然変異」としては、遺伝子の突然変異ならびに該遺伝子のcDNAまたはmRNAの突然変異があり、遺伝子（または該遺伝子のcDNAもしくはmRNA）の突然変異は、例えば連鎖の分析（または直接の配列決定）によって、緑内障と関連があることが決定されている。緑内障に関連する他の遺伝子を同定するため、緑内障に関連していることが分かっている遺伝子座を分析してもよい。すなわち、対象の遺伝子座（緑内障に関連していることが確認されている遺伝子座）内の遺伝子または該遺伝子座の近くに連結されている遺伝子を、以下に述べるような方法を用いて突然変異について分析することができる。例えば、2cen-q13領域（Stoilova，D．ら、Genomics、2 6巻142〜150頁1996年）；3q21〜q22領域（Sarfarazi，M．らの1996年に投稿）； 8q24（Trifanら、作成中）；および10p（Sarfarazi，M．ら、作成中）を含むいくつもの遺伝子座が、成人に発症する原発性先天性緑内障（POAG）に帰属されている。これらの遺伝子座を研究して、緑内障に関連する遺伝子を同定できる。あるいは、緑内障に冒された親族の遺伝子分析によって、新しい遺伝子座を同定することができ、次にこれらの遺伝子座を分析して、緑内障関連遺伝子を同定することができる。これらの方法は、遺伝が根拠になっているあらゆる形態の緑内障に適用できる。緑内障関連遺伝子が同定された後、診断が可能になる。緑内障の診断は、緑内障関連遺伝子内の単一もしくは複数の突然変異を検出することによって行われる。緑内障関連遺伝子の突然変異としては、フレームシフト突然変異をもたらす単一もしくは二つ以上のヌクレオチドの挿入もしくは欠失；コードされるアミノ酸を変化させる少なくとも一つのヌクレオチドの変化；未成熟停止コドンを生成する少なくとも一つのヌクレオチドの変化；ヌクレオチドがコードする一つ以上のアミノ酸の欠失を起こす複数のヌクレオチドの欠失；遺伝子のコード配列の切断を起こす、例えば不等組換えもしくは遺伝子変換による一つもしくは複数のヌクレオチドの挿入；遺伝子の全体もしくは一部の重複；遺伝子の全体もしくは一部の転位；または遺伝子の全体もしくは一部の再配列が挙げられる。単一遺伝子中に、二つ以上のかような突然変異が存在することがある。このように配列が変化すると、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質に突然変異が起こる。例えば、その突然変異がフレームシフト突然変異の場合、そのフレームシフトによって、コードされるアミノ酸が変化し、および／または未成熟停止コドンが生成して先端が切断されたタンパク質を発生させることがある。あるいは、緑内障に関連する突然変異が、一つ以上のヌクレオチドにおける同義突然変異（すなわち、緑内障に関連する遺伝子がコードするタンパク質の変化を起こさない突然変異）の場合がある。このような突然変異は、スプライシング部位を変化させることがあり、または、その他、遺伝子の転写または翻訳に影響することがある。上記突然変異のいずれかを有する緑内障関連遺伝子は、本明細書では、「突然変異遺伝子」と呼称する。緑内障の第一の診断法では、サザン分析法のようなハイブリッド形成法が用いられる［Ausubel，F．ら編「Current Protocols in Molecular Biology」（1997 年までのすべての増補を含む）John Wiley & Sons参照］。例えば、ゲノムDNA 、RNAまたはcDNAの被検試料を、緑内障の疑いがある（または緑内障に関連する欠陥を保有している疑いがある）個体（「被検個体」）から入手する。この個体は、成人、小児または胎児の場合がある。被検試料は、例えば皮膚または他の器官由来の血液もしくは組織の試料のごとき、ゲノムDNAを含有する供給源から得られる。好ましい態様で、DNAの被検試料は、線維芽細胞の皮膚の試料から、毛根から、または口腔から（例えばうがいによって）得られる細胞から入手する。別の好ましい態様では、DNAの被検試料が、羊水穿刺法または絨毛膜絨毛試料採取法などの適当な方法によって、胎児の細胞または組織から得られる。DNA、RNA またはcDNAの試料は、試験されて、緑内障に関連がある突然変異が存在するかどうか確認され、突然変異の存在は、ゲノムDNA、RNAまたはcDNA内の遺伝子と核酸プローブとのハイブリッド形成によって示される。「核酸プローブ」は、本明細書で使用する場合、DNAプローブまたはRNAプローブでもよい。この核酸プローブは、上記のように、緑内障に関連がある突然変異の少なくとも一つとハイブリッドを形成する。このような核酸プローブのフラグメントも、突然変異を含む遺伝子の一部とハイブリッドを形成するならば、使用できる。ハイブリッド形成によって緑内障を診断するため、緑内障関連遺伝子を含有する被検試料を、少なくとも一つの核酸プローブと接触させることによって、ハイブリッド形成試料を生成させる。そのハイブリッド形成試料は、核酸プローブを緑内障関連遺伝子と特異的にハイブリッドを形成させるのに十分な条件下に維持する。「特異的なハイブリッド形成」は、本明細書で使用する場合、正確なハイブリッド形成（例えば、全くミスマッチのない）を示す。特異的ハイブリッド形成は、例えば、高いストリンジェンシー条件下または中位のストリンジェンシー条件下で実施できる。ハイブリッド形成のための「ストリンジェンシー条件」とは、特定の核酸がもう一つの核酸とハイブリッドを形成できる温度と緩衝剤濃度の条件を意味する技術用語であり、その条件下では、最初の核酸が第二の核酸と完全に相補的であってもよく、または第一と第二の核酸はある程度の相補性しか共有していなくてもよい。例えば、完全に相補的な核酸を、相補性の低い核酸から識別する特定の高いストリンジェンシー条件を使用できる。核酸のハイブリッド形成のための「高いストリンジェンシー条件」と「中位のストリンジェンシー条件」は、前掲文献のCurrent Protocols in Molecular Biologyの2.10章と6.3 章、とりわけ、2.10.1-2.10.6頁および6.3.1-6頁に説明されている。なおこれらの教示は、参照により本明細書に取り込まれる。ハイブリッド形成のストリンジェンシーを決定する正確な条件は、核酸の長さ、塩基の組成、ハイブリッドを形成する配列間のミスマッチの百分率と分布、温度、イオン強度、不安定化剤の濃度および他の因子のような因子によって決まる。したがって、高いストリンジェンシー条件または中位のストリンジェンシー条件は経験に基づいて決定できる。一つの態様では、特異的ハイブリッド形成を行うためのハイブリッド形成条件は中位のストリンジェンシーである。特に好ましい態様では、特異的なハイブリッド形成を行うためのハイブリッド形成条件は、高いストリンジェンシーである。特異的ハイブリッド形成は、存在する場合、標準の方法を用いて検出される。核酸プローブと、被検試料中の緑内障関連遺伝子との間に特異的なハイブリッド形成が起こった場合、緑内障関連遺伝子は突然変異を有している。また、２種以上の核酸プローブを、この方法に同時に使用できる。これら核酸プローブのいずれか一つが特異的にハイブリッドを形成することは、緑内障関連遺伝子に突然変異があることを示しているので、緑内障の診断となる。例えば、原発性先天性緑内障を診断する場合、ヌクレオチド1410〜1422の13個の塩基対が欠失しているCYP1B1遺伝子の一部とハイブリッドを形成する核酸プローブを製造することができる。この核酸プローブが、被検試料中の緑内障関連遺伝子と特異的にハイブリッドを形成したならば、原発性先天性緑内障と診断される。あるいは、上記の他の突然変異のうちの一つ、例えばヌクレオチド1209〜12 14の間の６個のシトシンのストレッチ中に位置する余分のシトシン（Ｃ）；ヌクレオチド1546〜1555の10個の塩基対の重複；ヌクレオチド1737のシトシン（Ｃ）の欠失；ヌクレオチド1187でのＧ→Ｔトランジション：ヌクレオチド1482でのＣ →Ｔトランジション；ヌクレオチド517でのＧ→Ｃトランジション；ヌクレオチド528でのＧ→Ａトランジション；ヌクレオチド846におけるチミン（Ｔ）の挿入；ヌクレオチド1439でのＧ→Ｔトランジション；ヌクレオチド1505でのＧ→Ａトランジション；ヌクレオチド1515でのＧ→Ａトランジション；ヌクレオチド1656 におけるＣ→Ｔトランジション；ヌクレオチド1691のグアニン（Ｇ）の欠失；ヌクレオチド1751でのＣ→Ｔトランジション；またはヌクレオチド1749で始まる27 個のヌクレオチドの重複、を有するCYP1B1遺伝子とハイブリッドを形成する核酸プローブを製造することができる。このような核酸プローブが被検試料中の緑内障関連遺伝子と特異的にハイブリッドを形成することは、原発性先天性緑内障を示している。他のハイブリッド形成法では、ノーザン分析法（前掲文献の、Ausubel，F．ら編Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons参照）を用いて、緑内障と関連がある突然変異の存在を確認する。ノーザン分析の場合、RNA の試料を、被検個体から、適当な方法で得る。核酸プローブが上記のように、個体由来のRNAと特異的にハイブリッドを形成することは、緑内障と関連がある遺伝子中に突然変異があることを示しているので、緑内障の診断となる。核酸プローブの代表的な使用例については、例えば米国特許第5,288,611号と同第4,851,330号を参照されたい。あるいは、上記ハイブリッド形成法に、ペプチド核酸（PNA）プローブを、核酸プローブの代わりに用いることができる。PNAは、有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵ）が、メチレンカルボニルリンカーを介してグリシンの窒素原子に結合されているN-(2-アミノエチル)グリシン単位のようなペプチド様無機骨格を有するDNA疑似体である（例えば、Nielsen，P.E．ら、「Bioconjugate Chemistry」、1994，５，American Chemical Society １頁(1994)参照）。PNAプローブは、突然変異を有する緑内障関連遺伝子と特異的にハイブリッドを形成するように設計できる。PNAプローブが緑内障関連突然変異遺伝子とハイブリッドを形成することは、緑内障の診断となる。遺伝子の突然変異によって制限部位が生成または消失した場合、本発明の他の方法で、制限消化による突然変異分析法を用いて、突然変異遺伝子を検出できる。ゲノムDNAを含有する被検試料を被検個体から入手する。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて、被検個体由来のゲノムDNAの被検試料中の緑内障関連遺伝子（そして、必要に応じてそのフランキング配列）を増幅できる。RFLP分析を先に述べたように実施する（前掲文献のCurrent Protocols in Molecular Biology参照）。関連するDNAフラグメントの消化パターンが、緑内障に関連がある突然変異の有無を示す。また、配列分析法を利用して、遺伝子中の特別の突然変異を検出することもできる。DNAの被検試料を被検個体から入手する。PCRを用いて、その遺伝子および／またはそのフランキング配列を増幅できる。緑内障関連遺伝子またはその遺伝子のフラグメントの配列を、標準法を用いて決定する。該遺伝子（またはその遺伝子のフラグメント）の配列を、その遺伝子の既知の核酸配列と比較する。上記のような緑内障に関連がある突然変異のいずれかが存在することは、その個体が緑内障に冒されているかまたは緑内障の遺伝的保因者であることを示している。この方法の一態様で、このような配列分析法を用いて、緑内障に関連があるCYP1 B1遺伝子内の突然変異を同定できる。また、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを使用し、増幅された遺伝子産物と対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ASO）プローブとのドット−ブロットハイブリッド形成法を利用することによって、緑内障と関連がある突然変異の存在を検出できる（例えば、Saiki，R．ら、Nature(London)，324巻163〜166頁198 6年参照）。「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書では「対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドローブ」とも呼称する）は、緑内障に関連する突然変異を含有する遺伝子と特異的にハイブリッドを形成する約10〜50個の塩基対、好ましくは約15〜30個の塩基対のオリゴヌクレオチドである。緑内障関連遺伝子中の特定の突然変異に対して特異的な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準の方法を利用して製造できる（前掲文献のCurrent Protocols in Molecular Biology参照）。緑内障関連遺伝子中の突然変異を同定するため、 DNAの被検試料を被検個体から入手する。PCRを利用して、緑内障関連遺伝子の全体またはフラグメントおよびそのフランキング配列を増幅できる。緑内障関連遺伝子（またはその遺伝子のフラグメント）を増幅したものを含有するDNAを、標準法を使ってドット−ブロットし（前掲文献のCurrent Protocols in Molecular Biology参照）、次いでそのブロットを前記オリゴヌクレオチドプローブと接触させる。次に、該プローブと、緑内障と関連がある前記増幅遺伝子との特異的なハイブリッド形成の存在を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブと、個体由来DNAとの特異的ハイブリッド形成は、緑内障に関連がある、緑内障関連遺伝子中に突然変異があることを示しているので、緑内障の診断となる。また、緑内障の診断は、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の発現を検査することによっても実施できる。個体由来の被検試料を、緑内障関連遺伝子の発現の変化の存在について評価する。緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の発現の変化は、定量的タンパク質発現（すなわち、産生されるタンパク質の量）の変化；定性的タンパク質発現（すなわちそのタンパク質の組成）の変化；またはその両者でもよい。タンパク質発現の「変化」という用語は、本明細書で使用する場合、対照試料中の、緑内障関連遺伝子によるタンパク質の発現と比較したときの被検試料の変化を意味する。対照試料は、被検試料に対応する試料（例えば、同じタイプの細胞由来の試料）であり、緑内障に冒されていない個体から入手する。被検試料内でのタンパク質の発現が、対照試料と比較したとき変化しているのは緑内障を示している。緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の発現は、分光学、比色定量法、電気泳動法、等電点電気泳動法および免疫ブロッティング法を含む各種の方法を使って検査される（Current Protocols in Molecul ar Biologyの特に10章参照）。例えば、突然変異遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、または非突然変異遺伝子がコードするタンパク質に特異的に結合する抗体を使用するウェスタンブロッティング分析法を使って、緑内障関連突然変異遺伝子がコードするタンパク質が被検試料中に存在していること、または非突然変異遺伝子がコードするタンパク質が被検試料中に存在していないことを同定できる。突然変異遺伝子がコードするタンパク質が存在しているか、または非突然変異遺伝子がコードするタンパク質が存在していないことは、緑内障の診断となる。この方法の一態様で、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の被検試料中のレベルまたは量を、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の対照試料中のレベルまたは量と比較する。被検試料中のタンパク質のレベルまたは量が、対照試料中のタンパク質のレベルまたは量より、統計的に有意な差で、高いかまたは低いことは、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の発現が変化し、緑内障に関連していることを示している。あるいは、被検試料中の、緑内障関連遺伝子がコードしているタンパク質の組成を、対照試料中の、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の組成と比較する。被検試料中のタンパク質の組成が、対照試料中のタンパク質の組成と比較して異なることは、緑内障を示している。別の態様では、被検試料中と対照試料中のタンパク質のレベルもしくは量および組成を評価する。被検試料中のタンパク質の量もしくはレベルを対照試料と比較して差があるか；被検試料の組成が対照試料と比較して差があるか；または量またはレベルに差がありかつ組成に差があることは、緑内障を示している。また、本発明は、緑内障関連遺伝子がコードする突然変異タンパク質に対する抗体に関する。本明細書に引用する「突然変異タンパク質」は、緑内障関連の突然変異遺伝子がコードするタンパク質またはタンパク質フラグメントである。緑内障関連遺伝子中に、突然変異が確認されると、その突然変異した遺伝子がコードするタンパク質またはタンパク質のフラグメント（本明細書では対象のタンパク質とも呼称する）を同定することができ、そして標準の方法を使用して、前記タンパク質またはタンパク質フラグメントに対する抗体を生成させるとができる（例えば、前記文献Current Protocols in Molecular Biology参照）。用語「抗体」には、本明細書で使用する場合、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両者、および前記タンパク質またはタンパク質フラグメントに対し反応性の２種以上の抗体の混合物（例えば、前記突然変異のタンパク質またはタンパク質フラグメントに対し反応性の異なるタイプのモノクローナル抗体のカクテル）が含まれる。用語「抗体」には、さらに、全抗体および／またはその生物学的に機能性のフラグメント、２種以上の種由来の部分を含有するキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト様抗体、および二官能性抗体を含むものとする。生物学的に機能性の抗体のフラグメントは、その抗体フラグメントが対象のタンパク質と結合するのに十分なフラグメントである。緑内障関連遺伝子がコードする突然変異タンパク質に対し反応性のモノクローナル抗体（mAb）は、体細胞ハイブリッド形成法（KohlerおよびMilstein，Natur e，256巻495〜497頁1975年）などの方法を用いて産生させることができる。典型的なハイブリッド形成法において、緑内障関連遺伝子がコードする粗製のまたは精製された突然変異タンパク質は免疫原として使用できる。動物を、上記免疫原によって免疫して、抗体産生脾臓細胞を入手する。免疫する動物の種は、所望の mAbの特異性によって変わる。上記抗体産生細胞と、不死化細胞（例えば骨髄腫細胞）と融合させて、本発明の突然変異タンパク質に対する抗体を分泌できるハイブリドーマを作出する。融合していない残りの抗体産生細胞と不死化細胞は除去する。所望の抗体を産生するハイブリドーマを通常の方法を使って選択し、その選択されたハイブリドーマをクローン化し次いで培養する。ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体を製造するため先に述べたのと類似の方法で動物を免疫することによって製造することができる。その動物は、緑内障関連遺伝子がコードする突然変異タンパク質に対し反応性の抗体が産生される条件下に維持される。抗体が所望の力価に到達したならば、その動物から血液を収集する。ポリクローナル抗体を含有する血清（抗血清）を、他の血液成分から分離する。そのポリクローナル抗体含有血清を、任意に特定のタイプの抗体類（例えばIgG、IgM）の画分にさらに分離してもよい。緑内障関連突然変異遺伝子がコードするタンパク質またはタンパク質フラグメントに特異的に結合する抗体（すなわち、突然変異遺伝子がコードするタンパク質またタンパク質フラグメントに結合するが、その遺伝子の非突然変異コピーがコードするタンパク質には結合しない抗体）も、診断方法に使用できる。緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質を含有する被検試料を、その抗体と接触させる。その抗体が該タンパク質に結合することは、突然変異遺伝子がコードするタンパク質が存在することを示し、緑内障の診断となる。また、本発明には、本発明の方法に有用なキットも含まれる。そのキットには、被検試料を入手する手段；核酸プローブ、PNAプローブもしくは対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのプローブ；適当な薬剤；緑内障関連遺伝子がコードする突然変異タンパク質に対する抗体；本発明の方法を実施するための説明書；対照試料；および／または他の成分が入っている。また、本発明は、緑内障を治療する治療様式に関する。緑内障は、投与された時に、緑内障の重症度を軽減し和らげ小さくするかまたは緑内障の症状を除く薬剤を投与することによって治療できる。例えば、緑内障関連遺伝子がコードする突然変異タンパク質に特異的に結合する抗体は、突然変異タンパク質による活性を減らすかまたは除くために投与することができる。あるいはまたはさらに、緑内障関連遺伝子がコードする非突然変異タンパク質を、緑内障を治療する治療薬として投与できる。他の態様で、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質（突然変異タンパク質）の活性をまねる(mimic)薬剤を、緑内障関連突然変異遺伝子がコードするタンパク質の活性を補足する（supplement）かまたは該活性を取り替える（supplant）ため投与することができる。例えば、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質と同じ生物活性を有するペプチドを使用できる。またペプチド擬似体（peptidomimetic）（ポリペプチドではないがその構造の一面が似ている分子）も、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質の構造に基づいて設計できる。前記タンパク質と同じ官能基を有しかつ前記タンパク質と同じ機能を有する多糖類を製造できる。あるいは、コンビナトリアルケミストリーの周知の方法を用いて構築することができるような薬剤のライブラリーを検定して、追加の薬剤を得ることができる。かような薬剤は、例えば、その薬剤と、緑内障関連遺伝子がコードするタンパク質にも特異的に結合する抗体との相互作用による標準の方法で分離することができる。他の態様では、類緑遺伝子がコードするタンパク質の発現が前記突然変異タンパク質の活性を補足するかまたは該活性に取って代わるように、その類緑遺伝子の発現を誘発するかまたは高める薬剤が使用される。突然変異タンパク質の活性を代替または補足すると緑内障の生理学的原因を減らすかまたは除くので、緑内障が治療される。かような薬剤としては、タンパク質、ペプチド、ペプチド擬似体、抗体または類緑遺伝子の発現を誘発もしくは高める小分子がある。例えば、シトクロムp450ファミリーの他のタンパク質の発現を誘発または高める薬剤は、突然変異CYP1B1遺伝子の活性を補足または代替することによって先天性緑内障の治療に使用できる。あるいは、類緑遺伝子の発現を誘発しまたは高めるDNA構築物を、例えば国際公開第95/31560号パンフレットに記載されている方法で生成させることができる。あるいはまたはさらに、緑内障関連遺伝子がコードする突然変異タンパク質に特異的に結合する抗体を、突然変異タンパク質を標的としてその活性を減らすかまたは除くため、上記薬剤を投与する前、後または同時に投与してもよい。また、緑内障は、遺伝子、遺伝子導入ベクターなどの核酸構築物を投与することによって治療することができる。緑内障関連遺伝子（またはその遺伝子のcDNA ）の非突然変異コピー、または緑内障関連遺伝子（またはcDNA）非突然変異コピーのmRNAは個体に提供できる。例えば、緑内障に関連がある非突然変異遺伝子を含有する遺伝子導ベクターを投与して、緑内障に冒された個体に、前記非突然変異遺伝子を発現させることができる。また、上記遺伝子導入ベクターは、組織特異的プロモーターおよび他の要素（例えばエンハンサー要素、スプライシングシグナル、終止およびポリアデニル化のシグナル、ウイルスレプリコン、細菌のプラスミドの配列、または他のベクターの核酸配列）を含有していてもよい。ベクターの送達は、（例えば、デコレートされたリポソームを使用することによって、またはベクターを身体の特定領域に導入することによって）特定の領域または細胞型を標的として行うことができる。あるいは、国際公開第93/19183号パンフレットまたは同第90/11092号パンフレットに記載されているような精製されたDN AまたはmRNAを治療剤として使用できる。また、これらの方法を利用して、類緑遺伝子を導入し、類緑遺伝子がコードするタンパク質を発現させて該突然変異タンパク質の活性を補足するかまたは代替することができる。他の態様で、緑内障関連突然変異遺伝子を標的として、組込みまたは相同的組換えによって、突然変異を「修正」する核酸構築物が使用される。相同的組換えを利用して、治療用のタンパク質またはペプチドをコードするDNAを提供する構築物は、例えば国際公開第93/09222号パンフレットに記載されている。上記遺伝子療法は、治療剤を個体に直接投与することによって、生体内で細胞を標的とすることができる。あるいは、遺伝子療法は、個体から取り出された細胞などの細胞を生体外で標的として処理し、その処理された細胞を、個体中に再移植することができる。上記段落に引用された刊行物の全教示は、参照により本明細書に取り込まれる。上記薬剤、ならびに遺伝子療法に関連して先に述べた遺伝子導入ベクター、DN Aおよび／またはmRNAを含む治療剤は、眼科学的に、皮下に、腹腔内に、筋肉内に、局所に、経口で、直腸へ、膣へ、鼻腔へ、口腔へ、吸入スプレーによって、または移植レザバーを介して投与することができる。好ましい態様で、治療剤は、例えば局所投与によって眼に投与される（例えば点眼液または乳剤）。治療剤は、通常の非毒性で医薬として許容される担体、アジュバントおよび／または賦形剤を含有する投与剤形で投与することができる。これら薬剤が投与される形態（例えばカプセル剤、錠剤、液剤、乳剤）は、少なくともいくらかは、投与される経路によって決まる。薬剤の治療上有効な量は、緑内障に伴う症状を有意に減らすかまたは除くのに必要な量である。この治療上有効な量は、個体ベースで決定され、そして少なくとも一部は、薬剤、個体の大きさと性別、治療すべき症状の重症度、求められる結果を考慮して決定される。したがって、その治療上有効な量は、当業者が、上記因子と日常的な試験を利用して決定できる。上記の治療上有効な量は、時間、日または週などの適当な時間間隔をおいて分割した一連の服用量で投与することができる。あるいは、上記の治療上有効な量は、一回の服用量で投与してもよい。用語「一回の服用量」は、本明細書で使用する場合、単一の服用量でもよく、また、連続注入の制御放出投与剤形による徐放服用量でもよい。他の薬剤も、上記薬剤とともに投与できる。下記実施例により本発明をさらに詳細に説明する。実施例緑内障スクリーニングパネルと関連する遺伝子の同定および遺伝子座の同定原発性先天性緑内障を有する１７の家系のスクリーニングパネルを用いた（Sa rfarazi，M．ら、Genomics 30:171(1995);Turacli，M．E．ら、Int．Ophthamol ．16:359(1992)）。多くの遺伝子および候補の染色体領域を排除した後(Akarsu ，A．N．ら、Am．J．Med．Genet 61:290(1996);Akarsu，A．N．ら、Am．J．Med ．Genet 62:102(1996))、原発性先天性緑内障に関するゲノムのランダムスクリーニングにより、該状態について少なくとも１つの追加のマッピングされていない遺伝子座に対する証拠をもって、２つの遺伝子座、ＧＬＣ３Ａ(２ｐ２１、Sarfarazi，M．ら、Genomics 30:171(1995))およびＧＬＣ３Ｂ(１ｐ３６、A karsu，A．N．ら、Hum．Mol．Genetics ５:1199(1996))を割り当てた。２ｐ２１上のＧＬＣ３Ａ遺伝子座は、サウジアラビア由来の２５家系の別のパネルで最近確認されている（Bejjani，B．A．ら、Am．J．Human Genet．59補遺、A212-121 6(1996)）。また、２つの追加の家系も同定されている。したがって、ＧＬＣ３Ａ遺伝子座は、試験した家系のほとんど８５％がこの部位に関連して、この状態に関する主要な位置として明らかになる。血族家系の罹患したメンバーにおけるホモ接合性の最小の保存セグメントの臨界組換え事象および点検(Sarfarazi，M．ら、Genomics 30:171(1995))により、ＧＬＣ３Ａの臨界候補領域をマーカーＤ２Ｓ２１８６およびＤ２Ｓ１３４６に隣接する約２．５ｃＭに減少させた。この候補領域を図１に示す。動原体およびテロメアの向きを示す。第２染色体放射線ハイブリッドマップ（Hudson，T．ら、S cience 270:1945(1995)）に固定された遺伝子座をボックスで囲む。第２染色体の先端からの距離（ｃＲまたはｃＭ）を示す。灰色で影を付けた領域は、マーカーＤ２Ｓ２１８６（Bejjani，B．A．ら、Am．J．Hum．Genet．59補遺:A212/1216 (1996)）およびＤ２Ｓ１３５６(Sarfarazi，M．ら、Genomics 30:171(1995))との組換え事象で規定されたＧＬＣ３Ａ候補領域を表す。黒縁のボックスは、我々の血族家系で観察されたホモ接合性の最小セグメントを同定する。黒い水平の矢印は、特定の遺伝子がマッピングされる間隔を表す。３つの遺伝子がすでに２ｐ２１領域にマッピングされている：ベータースペクトリンまたはベーターフォドリンの非赤血球型（ＳＰＴＢＮ１）（Chang，J．G ．ら、Genomics 17:287(1993);Hu，R．J．ら、J．Biol．Chem．267:18715(1992) ）；Ｒａｓに関するグアニンヌクレオチド交換因子（ｈＳＯＳ１）（Chardin，P ．ら、Science 260:1338(1993)）；Webb，G．C．ら、Genomics 18:14(199 3)）；およびインターフェロン誘導性ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＲＫＲ）(Barber，G．N．ら、Genomics 16:765(1993);Squire，J．ら、同１6:76 8(1993);Hanash，S．M．ら、Genes Chromosom Cancer 8:34(1993))。これらの遺伝子は、この状態に関して可能な候補遺伝子として関与した。該遺伝子の位置は、GeneBridge 4 Radiation Hybrid（ＲＨ）パネルに対してそれらをスクリーニングし、ホワイトヘッド（Whitehead）Ｒｈフレームワークと比較してマッピングすることによりさらに精密にした(Hudson，T．ら、Science 270:1945(1995)) 。オリジナルのＭＩＴオーダーの９１種の細胞株を使用した。ＲＨデータの統計学的分析は、ホワイトヘッドインスティチュートフォーゲノムリサーチで、マッピングサーバー上で行なった。詳細なＲＨマップ情報は、ｈｔｔｐ：// ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕから入手することができる。ＲＨパネルのスクリーニングは、遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖発現（ＰＣＲ）アッセイにより行なった。好ましくは、ハムスターＤＮＡバックグランドの交差増幅を防止するために、イントロン配列または３−プライム非翻訳配列をアッセイした。これらの遺伝子に関するマップ位置は、下記のようにして確立した（図１を参照のこと）：ＳＰＴＢＮ１は、マーカーＷＩ−４０７７から１．５１センチＲａｙ（ｃＲ）にマッピングした（ＬＯＤ＞３．０）；ｈＳＯＳ１は、マーカーＷＩ−１０３２６から１．５１ｃＲに位置した（ＬＯＤ＞３．０）；およびＰＲＫＲは、Ｄ２Ｓ１７７から２．３ｃＲに位置した（ＬＯＤ＞３）。したがって、ＳＰＴＢＮ１は、Ｄ２Ｓ１３５６に対して動原体側に位置するので、ＧＬＣ３Ａに関する候補遺伝子としては排除された。ＧＬＣ３Ａ遺伝子座を保持する接触（ｃｏｎｔｉｇ）マップ(Hudson，T．ら、 Science 270:1945(1995);Shuler，G．D．ら、Science 274:540(1996))の検査により、マーカーＷＩ−７９３６がＤ２Ｓ１７７と非常に近接してマッピングされることが明らかになった。この配列標識部位（ＳＴＳ）は、ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１（ＣＹＰ１Ｂ１）遺伝子に相当する（Sutter，T．R．ら、J．Bio l．Chem．269:13092(1994)）。９Ｇ８スプライシング因子（ＳＦＲＳ７）をコードする第５番目の遺伝子は、ＢＬＡＳＴサーチにより、発現した配列標識（ＥＳＴ）マーカーＴＩＧＲ−Ａ００４Ｓ３９がこの遺伝子の３−プライム非翻訳領域に由来したものであると決定したときに同定された（Popielarz，M．ら、J．Bio l．Chem．270:17830(1995)）。このＥＳＴは、すでに第２染色体ＲＨマップ上でマーカーＤ２Ｓ１７７の隣りにマッピングされている(Hudson，T．ら、Science 270:1945(1995);Shuler，G．D．ら、Science 274:540(1996))。これらの遺伝子のすべてを、潜在的な候補遺伝子として考慮した；該遺伝子のいくつかのコーディング配列を、直接シーケンス法により突然変異に関してスクリーニングした。ヒト皮膚繊維芽細胞の単層を、ＣＯ₂インキュベーター内で、１０％ウシ胎児血清および抗生物質(ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン；Gibco/BRLカタログ番号15140-015)を補足したＭＥＭ培地(Gibco/BRL、カタログ番号11095-080)中、３７℃で維持した。全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬(Gibco/BRL)を用いて製造業者のプロトコールに従って調製した。第一鎖合成は、５０ｎｇのランダムヘキサマーを用いて１０μｌのＲＮＡ試料からプライムした。反応は、２０μｌの全容量中、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、４０ｍＭＫＣｌ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、各ｄＮＴＰから０．５ｍＭ、０．０１ＭＤＤＴおよび２００ＵＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔII ＲＴ(Gibco)で、４２℃で１時間行なった。ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子のコーディング配列を、ｃＤＮＡに基づくプライマーセット：ＣＹＰ１（ＣＹＰ１Ｆ５’−ＧＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＡＣＧＴＣＴＴＧ− ３’（配列番号：２）、ＣＹＰ１Ｒ５’−ＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＴＣＣＧＡＧＴＡＧ−３’（配列番号：３））；ＣＹＰ２（ＣＹＰ２Ｆ５’−ＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号：４）、ＣＹＰ２Ｒ５’−ＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣ−３’（配列番号：５））；ＣＹＰ３（ＣＹＰ３Ｆ５’−ＧＴＧＧＣＣＡＡＣＧＴＣＡＴＧＡＧＴＧ−３’（配列番号：６）、ＣＹＰ３Ｒ５’−ＴＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：７））；およびＣＹＰ４（ＣＹＰ４Ｆ５’−ＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号：８）、ＣＹＰ４Ｒ５’−ＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＧＡＴＧＧＴ−３’（配列番号：９））で増幅した。ＰＣＲ増幅は、組換えＴａｑポリメラーゼ(Gibco/BRL)を用いて、製造業者のプロトコールに従って行なった。増幅したＰＣＲ断片を直接、またはＷｉｚａｒｄＰＣＲｐｒｅｐｓＤＮＡ精製システム(Promega)でアガロースゲルから精製した。ＴａｑポリメラーゼＦＳでのダイターミネーターシーケンスを、ＡＢＩ−３７３シーケンサー（Perkin Elmer）で行なった。最初に、ｈＳＯＳ１およびＰＲＫＲ遺伝子のコーディング配列をスクリーニングした；配列改変体が観察されない場合、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の突然変異スクリーニングを行なった。このスクリーニングの結果として、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子のコーディング配列( 即ち、エキソンIII)からヌクレオチド１４１０〜１４２２（即ち、ＧＡＧＴＧＣＡＧＧＣＡＧＡ（配列番号：１））を除去した１３ｂｐのホモ接合体欠失（家系２６；罹患した個体１０）が同定された。この突然変異は、この欠失の２０３ｂｐ下流（または最後の元のアミノ酸Thr-354の後６８アミノ酸）の未成熟停止コドン（ＴＧＡ）を作出することによりオープンリーディングフレームが欠失したフレームシフトを生じた。ゲノムＤＮＡスクリーニング用アッセイを開発するために、この遺伝子のイントロン／エキソン接合点を決定した。ＣＹＰ１Ｂ１コーディング配列を含むゲノム領域を回収するために、ｃＤＮＡに基づくプライマーセットＣＹＰ１−４を、ロングレンジＰＣＲ増幅に用いた。ＹＡＣ８０６−Ｆ− ８（Hudson，T．ら、Science 270:1945(1995)）を含む株から調製した全酵母ＤＮＡを、鋳型として供した。約５０ｎｇの全酵母ＤＮＡを、６０ｍＭＴｒｉｓ −ＳＯ₄（２５℃でｐＨ９．１）、１８ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１．５ｍＭＭｇＳＯ₄、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび２μｌのｅＬＯＮＧアーゼ酵素混合物(Gibco/BRL)からなる５０μｌの全容量で、２０ｐｍｏｌの各プライマーでＰＣＲ増幅に供した。増幅条件は、最初の変性９４℃で１分の後、９４℃で３０秒間の変性、５３℃で３０秒間のアニーリングおよび６８℃で６分間の伸長の３５サイクルからなっていた。結果として、１ｋｂ〜３ｋｂのサイズにわたる４つのＰＣＲ断片が増幅された。これらの断片の精製とシーケンスは、前述のように行なった。ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子のイントロン／エキソン接合点は、参照ｃＤＮＡ配列と増幅断片の配列とを比較することにより同定した（Sutter，T．R．ら、J ．Biol．Chem．269:13092(1994)）。３つのプライマーセットを、ゲノムＤＮＡからのＣＹＰ１Ｂ１コーディング配列の増幅のために会合させた。プライマーＣＹＰ１Ｆは、長距離ＰＣＲ（１．６ｋｂ断片）について記載した条件下で、エキソンIIの増幅用に、イントロンプライマー、５’−ＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＧＣＴＴＴＡＣＣＴ−３’（配列番号：１０）と対合させた。エキソンIIIに位置するコーディング領域の増幅用には、イントロンプライマー５’−ＴＡＡＧＡＡＴＴＴＴＧＣＴＣＡＣＴＴＧＣ−３’（配列番号：１１）をプライマーＣＹＰ４Ｒと対合させた（６９３ｂｐ断片）。ＣＹＰ１Ｂ１コーディング配列の３’末端を含む１３４ｂｐ断片は、プライマー５’−ＴＣＡＡＴＧＴＣＡＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：１２）およびＣＹＰ４Ｒで増幅させた。ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子は、表１に示すように、３つのエキソンと２つのイントロンを含むことが結論付けられた。該遺伝子のゲノム構造を、図２に示す。番号は、該遺伝子のｃＤＮＡ配列を反映し、コーディング領域を黒で示す。該遺伝子の全コーディング配列は、エキソン２と３に含まれている。本明細書で決定されたＣＹＰ１Ｂ１のゲノム構造は、最近発行された結果と一致している（Tang，Y．M．ら、J．Biol．Chem．271:28324 (1996)）。家系２６における１３ｂｐのエキソンの欠失の存在と疾患表現型でのその共分離は、欠失領域を保持する１２４ｂｐのＰＣＲ断片のアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。迅速な突然変異スクリーニングのために、１３ｂｐの欠失を含む１２４ｂｐ断片を、プライマー：５’−ＣＡＡＡＣＡＧＧＴＡＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧ−３’（配列番号：１７）およびＣＹＰ３Ｒを用いてゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物を、５％アクリルアミド／Ｂｉｓ溶液（１９：１）：１５％尿素および１ＸＴＢＥからなるポリアクリルアミドミニゲル上で分析した（図３Ａを参照のこと）。また、同じ１３ｂｐの欠失を検出した後、別の家系（家系１７；図３Ａ）での疾患表現型と分離することを確認した。ヘテロ接合体個体で観察される第３のバンド（＊）は、ヘテロ二本鎖を表す。家系１７は、罹患した父と正常な母との間の血縁結婚である。この家系において、父親は１３ｂｐの欠失のホモ接合体である一方、母親は同じ欠失のヘテロ接合体であることが決定された。したがって、すべての罹患および正常子孫は、父親単独からこの欠失の単一コピーを遺伝したが、罹患した子孫は、さらに母親から１３ｂｐの欠失を遺伝した。第２の突然変異は、エキソンIIの１２０９〜１２１４のヌクレオチド位置間に位置する６つのシトシンストレッチに余分なシトシン塩基のホモ接合性挿入を示す別の２つの家系（家系１０および１１）で、前記したように迅速な突然変異のスクリーニングにより観察された（図２および３Ｂ）。また、これは、この挿入部位から１０６ｂｐ下流（または元のアミノ酸Ｐｒｏ−２８９から３６アミノ酸下流）の未成熟停止コドン（ＴＧＡ）を作出するフレームシフト突然変異であることが証明された。さらに、第３の突然変異を、別の血族家系（家系１５）で検出した。これは、イントロンIIで開始し、前記１３ｂｐの欠失を越えて伸長するエキソンIIIのコーディング配列の所定の部分を除去する非常に大きな欠失である（図２、３Ｃ）。前記したように、迅速な突然変異スクリーニング用のアッセイを用いた。エキソンIIで検出された突然変異は、プライマー：５’−ＧＡＣＡＡＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＣＡＣＴＧＣ−３’（配列番号：１８）および５’−ＡＣＧＴＴＣＴＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：１９）を用いて、ゲノムＤＮＡから増幅した。増幅した断片を、変性条件下（１Ｍ尿素、５０〜５４℃）でシーケンス型アクリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲルは、銀染色で可視化した。ＰＣＲ増幅パターンから、エキソンIIIの５−プライム末端および隣接するイントロン領域が欠失しているが、エキソンIIIの３−プライム末端はインタクトで残っていたことが示される（図３Ｃ）。最上のバンドは、全エキソンIIと隣接する５− プライムイントロンを含む１．６ｋｂ断片を表す。第２の断片は、エキソンIII に位置する全コーディング配列を含む。最小の増幅産物は、ＣＹＰ１Ｂ１のコーディング配列の３’末端から１３４ｂｐを含む。イントロンIIの３−プライムスプライスアクセプター部位が欠失しているので、この突然変異は、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子の正常なスプライシングを妨害することが予想され、先端欠失型タンパク質の合成または無意味な対立遺伝子のいずれかを生じる。第４番目の突然変異は、１つの個体で検出された。この突然変異は、未成熟の停止コドンを作出するフレームシフト変異を生じるヌクレオチド１５４６−１５５５（ＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣ、配列番号：２０）の１０ｂｐの重複である。未成熟の停止コドンは、アミノ酸４０３より後のすべてのアミノ酸の欠失（最後の１４０アミノ酸の欠失）を生じた。ランダムに選択した正常個体由来の４７０染色体の分析（３３０のトルコ人および１４０の他のカフカス人）は、前記した４つの突然変異対立遺伝子の存在の検出に失敗し、これらの配列改変体はまれな多型を表すようには思われない。これらの突然変異は、１８の罹患患者にのみ観察されたが、７つの家系（５つの血族家系を含む）全体の正常メンバーでは観察されず、これらの家系が確認される正常集団がこれらの突然変異を保有しなかったので、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子が２ｐ２１上のＧＬＣ３Ａ遺伝子座の遺伝子であることを強く示唆する。第５番目の突然変異は、ヌクレオチド１７３７でのシトシンの１塩基欠失であった。この突然変異は、同様に、未成熟停止コドンを作出するフレームシフト変異を生じる。未成熟停止コドンは、８０アミノ酸の欠失（アミノ酸４６３より後のすべてのアミノ酸）を生じた。第６番目の突然変異は、ヌクレオチド１１８８の１塩基Ｇ−−＞Ｔトランジションであった。この突然変異は、アミノ酸２８１の後に未成熟ＴＡＡ停止コドンを作出し、全長のタンパク質から２６３アミノ酸を除去する。また、ヌクレオチド１４８２の１塩基対Ｃ−−＞Ｔトランジションも検出された。この変化は、コードされるアミノ酸がプロリンからロイシンへの変化を生じる。また、１０個の追加の突然変異も同定された。これらの突然変異は、散発性または家族性のいずれかであり、種々の地理学的集団（トルコ人、米国人、パキスタン人、英国人、ヒスパニック人またはフランス系カナダ人起源の家系）由来の１以上の個体または家系に見出された。下記突然変異が見出された：ヌクレオチド５１７での１塩基変化（Ｇ−−＞Ｃトランジション）、コードされるアミノ酸がトリプトファンからシステインへの変化を生じる；ヌクレオチド５２８での１塩基変化（Ｇ−−＞Ａトランジション）、コードされるアミノ酸がグリシンからグルタミン酸への変化を生じる；ヌクレオチド８４６でのチミン塩基の挿入、該タンパク質のカルボキシ末端から３７７アミノ酸の欠失を生じるフレームシフト変異を生じさせる；ヌクレオチド１４３９での１塩基変化（Ｇ−−＞Ｔトランジション）、コードされるアミノ酸がグリシンからトリプトファンへの変化を生じる；ヌクレオチド１５０５での１塩基変化（Ｇ−−＞Ａトランジション）、コードされるアミノ酸がグルタミン酸からリジンへの変化を生じる；ヌクレオチド１５１５での１塩基変化（Ｇ−−＞Ａトランジション）、コードされるアミノ酸がアルギニンからヒスチジンへの変化を生じる；ヌクレオチド１６５６での１塩基変化（Ｃ−−＞Ｔトランジション）、コードされるアミノ酸がプロリンからロイシンへの変化を生じる；ヌクレオチド１６９１での１塩基（Ｇ）の欠失、該タンパク質のカルボキシ末端から９５アミノ酸の欠失を生じるフレームシフト変異を生じさせる；ヌクレオチド１７５１での１塩基変化（Ｃ−−＞Ｔトランジション）、コードされるアミノ酸がアルギニンからトリプトファンへの変化を生じる；または、ヌクレオチド１７４９で開始する２７ヌクレオチドの重複、該タンパク質のカルボキシ末端から７６アミノ酸の欠失を生じるフレームシフト変異を生じさせる。前記した突然変異を表２に要約する。表２において「タンパク質の位置」とは、突然変異を有するタンパク質の構造の領域を示し；「制限部位」とは、制限部位の追加または欠失を示す。制限部位における変化を用いて、例えば、前記したように、制限消化による突然変異分析を行なうことができる。最初の５つの突然変異は、エキソンII内にあり；残りの突然変異は、エキソンIIIに影響する。安定なタンパク質産物が前記した突然変異した遺伝子から産生したならば、該産物は、−ＣＯＯＨ末端から８０ないし３７７アミノ酸欠失すると予想される。このセグメントは、すべての公知のシトクロムＰ４５０アミノ酸配列の不変システイン（即ち、ＣＹＰ１Ｂ１のＣｙｓ−４７０）を保持する。この残基は、シトクロムＰ４５０タンパク質の機能的特性およびスペクトル特性の多くを規定する軸方向のヘムリガンドを提供する(Hudson，T．ら、Science 270:1945(1995);Gon zalez，F．J.，Pharmacol．Rev．40:243(1989))。隣接する残基Ｐｈｅ−４６３ないしＧｌｙ−４７２は、シトクロムＰ４５０（ＰＲＯＳＩＴＥアクセションＰＳ０００８６）のシステインヘム−鉄リガンド特性配列を同定するタンパク質配列パターンに相当する（Hudson，T．ら、Science 270:1945(1995);Bairoch，A .，Nucl．Acids Res．20(補遺):2013(1992)）。この必須領域の除去は、先端欠失型分子が正常な生理学的機能を発揮する可能性を妨害すると予想される。また、ＣＹＰ１Ｂ１のコーディング配列のヌクレオチド１６４０でのＶａｌ− ４３２をＬｅｕに変化させるＧからＣへの転換も、検出された（図２）。この変化は、Ｅｃｏ５７Ｉ制限部位を作出することがわかり、よって、迅速なスクリーニング法を提供した。全部で７０の正常個体（４７のトルコ人および２３の他のカフカス人）を、この変化の存在または不存在に関してスクリーニングした。３６の個体（５１．４％）がこの変化に関してヘテロ接合体であることがわかった。残りの３４のホモ接合体の個体（４８．６％）の内、２７名の患者がロイシンを有し、７名がバリンを有していた。この変化が起こったアミノ酸の位置は、ＣＹＰ１Ｂ１の保存配列の一部ではない；さらに、バリンとロイシンの両者は、わずか１つのＣＨ₂基が異なるだけの類似の脂肪族側鎖基を有する中性の疎水性アミノ酸である。したがって、この変化は、原発性先天性緑内障表現型とは無関係の多型を表している。均等物当業者であれば、単なる日常的な実験方法によって、本明細書に記載された発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。そのような均等物は、以下の請求の範囲の範疇に含まれることを意図されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月１２日（１９９９．３．１２）【補正内容】請求の範囲１．ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子における突然変異を検出し、該遺伝子における突然変異の存在が緑内障の指標となることを含む、個体における緑内障の診断方法。２．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が制限消化による直接の突然変異分析により検出される、請求項１記載の方法。３．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が被検試料中の緑内障関連遺伝子と核酸プローブとのハイブリッド形成により検出される、請求項１記載の方法。４．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が被検試料中の緑内障関連遺伝子とペプチド核酸プローブとのハイブリッド形成により検出される、請求項１記載の方法。５．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が緑内障関連遺伝子の配列分析により検出される、請求項１記載の方法。６．該突然変異の存在が被検試料中の緑内障関連遺伝子と対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成より検出される、請求項１記載の方法。７．緑内障が原発性開放角緑内障である請求項１記載の方法。８．緑内障が原発性先天性緑内障である請求項１記載の方法。９．該突然変異が１以上のヌクレオチドの欠失である、請求項１記載の方法。１０．該突然変異がヌクレオチド１４１０−１４２２の欠失；ヌクレオチド１７３７の欠失；イントロンIIおよびエキソンIIIの一部の欠失；ならびにヌクレオチド１６９１の欠失からなる群より選ばれた欠失である、請求項９記載の方法。１１．該突然変異が１以上のヌクレオチドの挿入である、請求項１記載の方法。１２．該突然変異がヌクレオチド１２０９−１２１４内の１つのシトシン残基の挿入；およびヌクレオチド８４６での１つのチミン残基の挿入からなる群より選ばれたものである、請求項１１記載の方法。１３．該突然変異が複数のヌクレオチドの重複である、請求項１記載の方法。１４．該突然変異がヌクレオチド１５４６−１５５５の重複；およびヌクレオチド１７４９−１７７５の重複からなる群より選ばれたものである、請求項１３記載の方法。１５．該突然変異が１以上のヌクレオチドの変化である、請求項１記載の方法。１６．該突然変異がヌクレオチド１４８２のＣからＴへの変化；ヌクレオチド１１８７のＧからＴへの変化；ヌクレオチド５１７のＧからＣへの変化；ヌクレオチド５２８のＧからＡへの変化；ヌクレオチド１４３９のＧからＴへの変化；ヌクレオチド１５０５のＧからＡへの変化；ヌクレオチド１５１５のＧからＡへの変化；ヌクレオチド１６５６のＣからＴへの変化；およびヌクレオチド１７５１のＣからＴへの変化からなる群より選ばれたものである、請求項１５記載の方法。１７．緑内障関連遺伝子における突然変異を検出し、該遺伝子が遺伝子座８ｑ２４に位置し、かつ、該遺伝子における突然変異の存在が緑内障の指標となることを含む、個体における緑内障の診断方法。１８．緑内障関連遺伝子における突然変異を検出し、該遺伝子が遺伝子座１０ｐに位置し、かつ、該遺伝子における突然変異の存在が緑内障の指標となることを含む、個体における緑内障の診断方法。１９．ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における変化を検出し、該タンパク質の発現における変化の存在が緑内障の指標となることを含む緑内障の診断方法。２０．該変化がヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における定性的変化である、請求項１９記載の方法。２１．該変化がヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における定量的変化である、請求項１９記載の方法。２２．該変化がヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における定性的変化および定量的変化の両方である、請求項１９記載の方法。２３．突然変異ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を該タンパク質の発現の評価に用いる、請求項１９記載の方法。２４．非突然変異ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を該タンパク質の発現の評価に用いる、請求項１９記載の方法。２５．突然変異ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを含有してなる、緑内障の診断用キット。２６．突然変異ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブであって、核酸プローブおよびペプチド核酸プローブからなる群より選ばれたプローブ。２７．突然変異ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体。２８．ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされるタンパク質；ヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子によりコードされる突然変異タンパク質に特異的に結合する抗体；およびヒトシトクロムＰ４５０１Ｂ１遺伝子を含有する核酸からなる群より選ばれた作用剤の、緑内障の治療用医薬製造のための使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 27/06 Ａ６１Ｐ 27/06 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/48 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．緑内障関連遺伝子における突然変異を検出し、該遺伝子における突然変異の存在が緑内障の指標となることを含む、個体における緑内障の診断方法。２．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が制限消化による直接の突然変異分析により検出される、請求項１記載の方法。３．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が被検試料中の緑内障関連遺伝子と核酸プローブとのハイブリッド形成により検出される、請求項１記載の方法。４．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が被検試料中の緑内障関連遺伝子とペプチド核酸プローブとのハイブリッド形成により検出される、請求項１記載の方法。５．緑内障関連遺伝子における突然変異の存在が緑内障関連遺伝子の配列分析により検出される、請求項１記載の方法。６．該突然変異の存在が被検試料中の緑内障関連遺伝子と対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成より検出される、請求項１記載の方法。７．緑内障が原発性開放角緑内障である請求項１記載の方法。８．原発性開放角緑内障関連遺伝子が遺伝子座８ｑ２４に位置する請求項７記載の方法。９．原発性開放角緑内障関連遺伝子が遺伝子座１０ｐに位置する請求項７記載の方法。１０．緑内障が原発性先天性緑内障である請求項１記載の方法。１１．緑内障関連遺伝子がＣＹＰ１Ｂ１である請求項１０記載の方法。１２．該突然変異が１以上のヌクレオチドの欠失である、請求項１１記載の方法。１３．該突然変異がヌクレオチド１４１０−１４２２の欠失；ヌクレオチド１７３７の欠失；イントロンIIおよびエキソンIIIの一部の欠失；ならびにヌクレオチド１６９１の欠失からなる群より選ばれた欠失である、請求項１２記載の方法。１４．該突然変異が１以上のヌクレオチドの挿入である、請求項１１記載の方法。１５．該突然変異がヌクレオチド１２０９−１２１４内の１つのシトシン残基の挿入；およびヌクレオチド８４６での１つのチミン残基の挿入からなる群より選ばれたものである、請求項１４記載の方法。１６．該突然変異が複数のヌクレオチドの重複である、請求項１１記載の方法。１７．該突然変異がヌクレオチド１５４６−１５５５の重複；およびヌクレオチド１７４９−１７７５の重複からなる群より選ばれたものである、請求項１６記載の方法。１８．該突然変異が１以上のヌクレオチドの変化である、請求項１１記載の方法。１９．該突然変異がヌクレオチド１４８２のＣからＴへの変化；ヌクレオチド１１８７のＧからＴへの変化；ヌクレオチド５１７のＧからＣへの変化；ヌクレオチド５２８のＧからＡへの変化；ヌクレオチド１４３９のＧからＴへの変化；ヌクレオチド１５０５のＧからＡへの変化；ヌクレオチド１５１５のＧからＡへの変化；ヌクレオチド１６５６のＣからＴへの変化；およびヌクレオチド１７５１のＣからＴへの変化からなる群より選ばれたものである、請求項１８記載の方法。２０．緑内障関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における変化を検出し、該タンパク質の発現における変化の存在が緑内障の指標となることを含む緑内障の診断方法。２１．該変化が緑内障関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における定性的変化である、請求項２０記載の方法。２２．該変化が緑内障関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における定量的変化である、請求項２０記載の方法。２３．該変化が緑内障関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現における定性的変化および定量的変化の両方である、請求項２０記載の方法。２４．緑内障関連突然変異遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を該タンパク質の発現の評価に用いる、請求項２０記載の方法。２５．緑内障関連非突然変異遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体を該タンパク質の発現の評価に用いる、請求項２０記載の方法。２６．緑内障関連突然変異遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを含有してなる、緑内障の診断用キット。２７．緑内障関連突然変異遺伝子に特異的にハイブリダイズする核酸プローブ。２８．緑内障関連突然変異遺伝子に特異的にハイブリダイズするペプチド核酸プローブ。２９．緑内障関連突然変異遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的に結合する抗体。３０．緑内障の治療用医薬製造のための緑内障関連遺伝子によりコードされるタンパク質の使用。３１．緑内障の治療用医薬製造のための緑内障関連遺伝子によりコードされる突然変異タンパク質に特異的に結合する抗体の使用。３２．緑内障の治療用医薬製造のための緑内障関連遺伝子を含有する核酸の使用。