JP2001513807A

JP2001513807A - Ｃ型肝炎の予防または治療用ワクチン組成物

Info

Publication number: JP2001513807A
Application number: JP53824398A
Authority: JP
Inventors: バルバン，ヴェロニク
Original assignee: Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1998-03-06
Publication date: 2001-09-04
Also published as: EP1017418B1; AU6839898A; FR2760367B1; WO1998039030A1; FR2760367A1; AU745442B2; EP1017418A1; DE69839489D1; CA2283076A1; US6284249B1; NZ337138A; US6538123B2; ATE395078T1; US20020034734A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって誘発される感染症を治療または予防するための医薬組成物に関し、この組成物は好ましい実施態様において、主な有効成分として、（ｉ）ＨＣＶキャプシドポリペプチド（Ｃ１９１）およびエンベロープポリペプチド（Ｅ１）を含む融合ポリペプチドであつて、１７３／１７４位および１９１／１９２位のうちの少なくとも１つの切断部位が変異によって作動不能にされているポリペプチド；（ｉｉ）切断部位１７３／１７４位が作動不能にされているＣ１９１ポリペプチドおよびＥ１ポリペプチドの等モル混合物（融合ポリペプチドに等価な混合物）；または（ｉｉｉ）この融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。生成物（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、Ｃ１９１エレメントが遺伝子の機能を調節し得ないこと、特に遺伝子を活性化し得ないことを特徴とする。そのような組成物はまた、上記の生成物に等価ないずれかの形態を含み得る。

Description

【発明の詳細な説明】Ｃ型肝炎の予防または治療用ワクチン組成物本発明はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により誘発される感染症の治療または予防用医薬組成物に関する。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、大部分の非Ａ非Ｂ型肝炎感染症の原因因子である。ＨＣＶ感染の血清罹患率は世界人口の０．３〜１．５％の間であり、いくつかの発展途上国では１８％に達している可能性がある。このように、何億人もの人々が世界中で感染しているものと思われる。９つのタイプおよび３０のサブタイプのＨＣＶが報告されている。サブタイプは、地理的分布が限られている場合があり、タイプ１ｂは最も世界中に分布している。１次感染の約５年後には、５０％の症例で慢性病態に進行する。持続性慢性肝炎（無症候性であるが高い循環ウイルスカ価を示す）が最初に認められ、次いで、活動性慢性肝炎が確立される。慢性肝炎の２０％は約１０年以内に肝硬変に進行する。硬変性の肝臓に肝ガンが発症する場合もある。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はプラスの１本鎖ＲＮＡウイルスである。構造的類似性に基づき、ＨＣＶはフラヴィウイルス属およびペスチウイルス属に関連付けられている。感染中、最初にＨＣＶゲノムは約３０００個のアミノ酸の前駆体ポリタンパク質に翻訳される。次いで、このポリタンパク質は翻訳後切断を受け、種々の前駆体および成熟ウイルスタンパク質を生じる。ＨＣＶの構造タンパク質は、ポリタンパク質のＮ末端領域に位置する。図１に示すように、構造タンパク質とは、より詳細にはキャプシドまたはコアタンパク質（Ｃ）、ならびにエンベロープタンパク質Ｅ１およびＥ２であり、ＮＨ₂−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２の順に存在する。この部分は宿主細胞のプロテアーゼによって切断される。下記で採用するポリタンパク質およびその誘導体のアミノ酸の番号付けは、一般に使用されているものであり、詳細にはＣｈｏｏら、ＰＮＡＳ［ｖｏｌ．８８：ｐ．２４５１（１９９１）］により示されている。このように、Ｃタンパク質はポリタンパク質の１位〜１９１位のアミノ酸に対応し、Ｅ１タンパク質は１９２位〜３８０位のアミノ酸に対応する。以下、本明細書においては、Ｅ１タンパク質の配列のアミノ酸に１９２位〜３８０、３８１、３８２または３８３位の番号を付すのが適切であるとする。以下、本明細書においては、簡単のためにＣ末端については３８０位のみについて言及する。ポリタンパク質の直接切断によって誘導されるＣタンパク質は、１９１個のアミノ酸を含有する。このＣタンパク質はＣ１９１とも呼ばれるが、酵素切断によりそれ自体Ｃ末端側が切断され、Ｃ１７３と呼ばれる１７３個のアミノ酸のタンパク質を生じる。以下、本明細書においては、「Ｃタンパク質またはポリペプチド」は好ましくはＣ１９１形態を示す。Ｃタンパク質は当然のことながらウイルスの構造タンパク質であって、このタンパク質をコードする領域は種々のＨＣＶ株によって比較的良く保存されているため、Ｃタンパク質は良好なワクチン候補とされている。高い抗体応答を生じ得るＣタンパク質の領域は最初の１２０個のアミノ酸に対応し；最初の４８個のアミノ酸は主要な抗原性ドメインを構成していることが知られている。しかし、このタンパク質は宿主細胞に属する遺伝子、詳細には、特に発ガンを誘発し得るオンコジーンのような遺伝子をトランス活性化し得ることから、このタンパク質のワクチンとしての使用が大きく妨げられている。実際に、Ｃ１７３形態は、宿主細胞の核におけるトランスロケーション能およびトランス活性化能を有することが特に明らかにされている。核におけるトランスロケーションおよび調節活性を担うＣタンパク質の領域は、Ｎ末端部分に位置すると思われる（最初の１２３個のアミノ酸）。このように、Ｃタンパク質の領域は、ワクチンの観点からは興味深いが、その一方で宿主細胞に対する毒性作用の原因となっている。この問題点を克服するために、科学分野で通常意図される解決方法は、変異によってその１７３／１７４位の切断部位を作動不能にしたＣ１９１タンパク質を用いることかもしれない。以下に示すように、そのようなタンパク質は、それにも係わらず、より低い程度ではあるが、調節活性能を示す。驚くべきことに、今回、Ｃタンパク質を修飾し、それを所定の条件下でＥ１タンパク質と結合することによって、Ｃタンパク質の調節活性を抑制し得ることを実証した。本発明は、Ｃタンパク質が核に移動するのを防止することによって、調節活性を抑制する手段を提供する。Ｅ１タンパク質の存在下では、もはやこの移動は生じない。このＥ１タンパク質は、特に細胞質において小胞体レベルで固定される特性を有し、意外にも、特定の条件が満たされれば、そこにＣタンパク質を保持する能力を有する。例えば、２つのタンパク質の融合体を作製することによってこの移動が抑制され得る。この融合体は切断可能であるかまたは切断可能ではない；融合体が切断可能である場合、生じた生成物は２つのタンパク質のいずれもが核内に漏出することがないようにそれぞれが相互作用し得るべきである；切断生成物によって形成される複合体は細胞質において固定され得る。切断可能なペプチド融合体の等価物は、融合体を構成している成分の等モル量の混合物である。従って、本発明の主題は：（ｉ）（ａ）Ｃ型肝炎ウイルスのＣポリペプチドの全体または部分に対応する第１の領域；および（ｂ）このウイルスのＥ１ポリペプチドの全体または部分に対応する第２の領域、を含有するポリペプチドであって、それ自体またはその切断生成物を介して、１つ以上の遺伝子に対する調節活性能を示さないポリペプチド；（ｉｉ）（ａ）ＨＣＶのＣポリペプチドの全体または部分に対応する領域を含有する第１のポリペプチド、および（ｂ）ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの全体または部分に対応する領域を含有する第２のポリペプチド、の（好ましくは）実質的に等モル量の混合物であって、１つ以上の遺伝子に対する調節活性能を示さない混合物；または（ｉｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子；ならびに医薬上許容される担体または希釈剤、を含む医薬組成物である。本発明の別の態様によれば、本発明の主題はまた、ＨＣＶにより誘発される感染症の治療または予防のための方法であり、この方法によれば、本発明の医薬組成物が、そのような治療を必要とする哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。「ポリペプチド」とは、相互に共有結合したアミノ酸のいずれかの鎖を意味すると理解され、鎖の長さおよび、例えば、脂質付加のような生じ得る翻訳後修飾を問わない。用語「タンパク質」を代わりに使用することもできる。「ＨＣＶのＣポリペプチド」とは、Ｃｈｏｏらによって開示されたアミノ酸配列を有するＣポリペプチドならびにいずれかの他の株（その配列はＣｈｏｏらの配列と異なっていでもよい）から得られるいずれかの他のＣポリペプチドを意味すると理解される。例えば、この用語は、ＴａｋｅｕｃｈｉＫら［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１８：４６２６（１９９０）］、ＨｏｕｇｈｔｏｎＭら［Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ１４：３８１（１９９１）］、Ｄｅｌｉｓｓｅｓら［Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１３，補遺４（１９９１）］、ＢｕｋｈＪら［ＰＮＡＳ９１：８２３９（１９９４）］およびＨｉｒｏａｋｉＯら［Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ３７：６８（１９９４）］に記載のＣポリペプチドを表し得る。「ＨＣＶのＥ１ポリペプチド」とは、特に、Ｃｈｏｏらによって開示されたアミノ酸配列を有するＥ１ポリペプチド、ならびにいずれかの他の株から得られ、その配列がＣｈｏｏらの配列と異なっていてもよいいずれかの他のＥ１ポリペプチドを意味すると理解される。例えば、この用語は、ＨｉｒｏａｋｉＯら［Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ３７：６８（１９９４）］、Ｇｒａｋｏｕｉら［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：１３８５（１９９３）］およびＳｐａｅｔｅら［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８８：８１９（１９９２）］、Ｍａｔｓｕｍｉａら［Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１４２５］またはＫｏｈａｒａら［Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２３１３（１９９２）］に記載のＥ１ポリペプチドを表し得る。このように、Ｃポリペプチドのアミノ酸配列およびＨＣＶのＥ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、対立遺伝子変異の現象を反映して、ウイルス株によって変化し得る。例えば、ウイルスは、微小な対立遺伝子特性で相互に異なる１組の株によって通常表される。異なる株において同じ生物学的機能を果たすポリペプチドは、全ての株については同一でないアミノ酸配列を有してもよい。そのような対立遺伝子変異は、ＤＮＡのレベルにおいても見出される。アミノ酸配列のレベルでは、対立遺伝子の差異は、生物学的機能を変更しない１個以上のアミノ酸の置換、欠失または付加からなり得る。本発明の医薬組成物に含まれるポリペプチドについて、２つの場合を想定しなければならない：ポリペプチドは哺乳動物細胞中でプロテアーゼによって切断され得ないか、またはそのような切断に感受性であるかのいずれかである。ポリペプチドが哺乳動物細胞中でプロテアーゼによって切断され得ない場合、ポリペプチドは有利には：（ａ）１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶウイルスのＣポリペプチドの部分に少なくとも対応する第１の領域；および（ｂ）Ｅ１ポリペプチドの細胞質固定を担うこのウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に少なくとも対応する第２の領域；を含有する。ポリペプチドが哺乳動物細胞中でプロテアーゼによって切断され得る場合、ポリペプチドは有利には：（ａ）１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶのＣポリペプチドの部分およびこのウイルスのＥ１ポリペプチドとのＣポリペプチドの相互作用を担うＣポリペプチドの部分に少なくとも対応する第１の領域；ならびに（ｂ）このウイルスのＣポリペプチドとのＥ１ポリペプチドの相互作用を担うこのウイルスのＥ１ポリペプチドの部分およびＥ１ポリペプチドの細胞質固定を担うこのウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に少なくとも対応する第２の領域；を含有する。「１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶのＣポリペプチドの部分」とは、いずれかの機構によって、いずれかの遺伝子の転写または発現を活性化、トランス活性化または抑制し得るＨＣＶのＣポリペプチドのいずれかの部分を特に意味すると理解される。この遺伝子は、真核生物遺伝子、ウイルス遺伝子、オンコジーンまたはプロトオンコジーンであってもよい。Ｃポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶのＣポリペプチドの部分は、３８位〜４３位、５８位〜６４位、６６位〜７１位、６位〜２３位、３９位〜７４位、９９位〜１０２位、１０１位〜１２１位、１０１位〜１２２位、５８位〜１２１位、１位〜１２０位、１位〜１２１位、１位〜１２２位、１位〜１２３位または１位〜１７３位のアミノ酸に特に対応し得る。好ましくは、調節活性を担うＨＣＶのＣポリペプチドの部分は、１位のアミノ酸から４８位〜１９１位のうちの１つのアミノ酸までの範囲のＣポリペプチドの部分であってもよい。この目的のために、４８位〜１９１位のうちの１つは、例えば、１１９位、１２０位、１２１位、１２３位および１７３位であってもよい。ＣポリペプチドのＨＣＶのＥ１タンパク質との相互作用を担うＨＣＶのＣポリペプチドの部分は、特に、ＨＣＶのＣポリペプチドの１５１位〜１７３位または１７３位〜１９１位のアミノ酸に対応し得る。Ｅ１ポリペプチドの細胞質固定を担うＨＣＶのＥ１ポリペプチドの部分は、Ｅ１ポリペプチドの疎水性ドメインであってもよい。そのような疎水性ドメインは、例えば、Ｅ１ポリペプチドの２６２位〜２９１位、３７０位〜３８０位および３３０位〜３８０位に位置する。ＣポリペプチドのＥ１タンパク質との相互作用を担うＨＣＶのＥ１ポリペプチドの部分は、特に、Ｅ１ポリペプチドのＣ末端ドメイン、好ましくは、３３０位〜３８０位または３７０位〜３８０位のドメインであってもよい。本発明の目的に有用なポリペプチドにおいて、第１の領域は、ポリペプチドのＮまたはＣ末端側、有利にはＮ末端側に位置し得；同様に、第２の領域はＣまたはＮ末端側、有利にはＣ末端側に位置し得る。好ましい態様によれば、第１の領域のＣ末端を、第２の領域のＮ末端にペプチド結合によって融合してもよい。本発明の医薬組成物に含有されるポリペプチドがＨＣＶのＣポリペプチドの１７２位〜１７５位のアミノ酸に少なくとも対応する領域を含む場合、このペプチドは有利には１７３／１７４位の切断部位を作動不能にする変異を含有する。好ましい態様によれば、そのような変異は、１７２位〜１７５位のうちの１つについて行われる点変異である。それは、例えば、１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換、特に、１７２位〜１７５位の１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換によって得ることができる。好ましくは、変異は１個または２個のアミノ酸の置換によって生じ；置換による二重変異は特に最も好ましい。特定の例によれば、天然には１７３位に存在する残基（セリン）が特にメチオニン残基に置換され得、天然には１７３位に存在する残基（フェニルアラニン）が特にロイシン残基に置換され得る。一般に、ＨＣＶのＣポリペプチドの１７３／１７４位の切断部位を作動不能にし得る１つ以上の変異を生じさせることは当業者の能力の範囲内にある。本発明の医薬組成物に含有されるポリペプチドがＨＣＶポリタンパク質の１９０位〜１９３位のアミノ酸に少なくとも対応する領域を含む場合、このポリペプチドは有利には、ＨＣＶポリタンパク質の１９１／１９２位の切断部位を作動不能にする変異を含有する。好ましい態様によれば、そのような変異は、１９０位〜１９３位のうちの１つにおいて生じる点変異である。それは、例えば、１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換、特に、１９０位〜１９３位のうちの１個以上のアミノ酸の欠失、付加または置換によって得ることができる。好ましくは、変異は、１または２個のアミノ酸の置換によって生じ、置換による二重変異は特に最も好ましい。特定の例によれば、天然には１９１位に存在する残基（アラニン）が特にバリン残基に置換され得、天然には１９２位に存在する残基（チロシン）が特にアスパラギン残基に置換され得る。一般に、１９１／１９２位の切断部位を作動不能にし得る１つ以上の変異を生じさせることは当業者の能力の範囲内にある。本発明の目的に有用なポリペプチドがＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９０位〜１９３位に少なくとも対応する領域およびＨＣＶのＣポリペプチドのアミノ酸１７２位〜１７５位に少なくとも対応する領域の両方を含む場合、２つの切断部位１９１／１９２および１７３／１７４のうちの１つのみを作動不能にすることができ、好ましくは、両方が作動不能にされる。部位１７３／１７４のみが作動不能にされる場合、ポリペプチドは切断され得、この特定の場合、このポリペプチドは、ＣポリペプチドのＥ１ポリペプチドとの相互作用を担うＣポリペプチドの部分に特に対応する第１の領域およびＥ１ポリペプチドのＣポリペプチドとの相互作用を担うＥ１ポリペプチドの部分に特に対応する第２の領域を有する必要がある。しかし、本発明の目的に有用なポリペプチドがプロテアーゼによって切断され得ない場合、ポリペプチドは、切断部位が機能しないという条件で、切断部位を含有してもよい。例えば、Ｅ１ポリペプチドと融合したＣ１９１ポリペプチドからなり、１９１／１９２位の切断部位を作動不能にする変異を含有するポリペプチドの特定の場合、１７３／１７４位の切断部位は変異されていなくてもよいが；１９１／１９２位の切断がもはや可能でない限り、１７３／１７４位の切断部位は機能しないか、または機能しても極僅かである。実際、１７３／１７４位の切断が生じるためには、１９１／１９２位での切断が行われなければならないことが知られている。特定の態様によれば、本発明の目的に有用なポリペプチドはプロテアーゼによって切断され得ず：（ａ）１位のアミノ酸から１２０位〜１７３位のうちの１つのアミノ酸までの範囲のＣポリペプチドのドメインに実質的に対応する第１の領域、および（ｂ）少なくとも１つの疎水性領域を含有するＥ１ポリペプチドのドメイン、例えば、１９２位のアミノ酸から３８０位のアミノ酸まで、または３３０位のアミノ酸から３８０位のアミノ酸まで、または２６０位のアミノ酸から２９０位のアミノ酸まで、または２６０位のアミノ酸から３８０位のアミノ酸までの範囲のＥ１ポリペプチドのドメインに実質的に対応する第２の領域、を含有する。別の特定の態様によれば、本発明の目的に有用なポリペプチドはプロテアーゼによつて切断され得ず：ポリペプチドが切断部位１９１／１９２を含有しないか、または切断部位が再構成されるときに、切断部位を作動不能にするための変異が導入されるという条件で、（ａ）１位のアミノ酸から１２０位〜１９１位のうちの１つのアミノ酸までの範囲のＣポリペプヂドのドメインに実質的に対応する第１の領域、および（ｂ）少なくとも１つの疎水性領域を含有するＥ１ポリペプチドのドメイン、例えば、１９２位のアミノ酸から３８０位のアミノ酸まで、または３３０位のアミノ酸から３８０位のアミノ酸まで、または２６０位のアミノ酸から２９０位のアミノ酸まで、または２６０位のアミノ酸から３８０位のアミノ酸までの範囲のＥ１ポリペプチドのドメインに実質的に対応する第２の領域、を含有する。有利には、本発明の目的に有用なポリペプチドの第１の領域はＨＣＶのＣポリペプチドの１位〜１９１位のアミノ酸に対応し、そして／またはこのポリペプチドの第２の領域はＨＣＶのＥ１ポリペプチドの１９２位〜３８０位のアミノ酸に少なくとも対応する。特に好ましい方法では、第１および第２の領域は本段落中上記で定義する通りであり、１９１位のアミノ酸は１９２位のアミノ酸にペプチド結合により融合されている。特定の態様によれば、ポリペプチドは本段落中上記で定義するように第１および第２の領域からなる。本発明の目的に有用なポリペプチドが先の段落に記載の通りである場合、ポリペプチドは、１９１／１９２位または１７３／１７４位の切断部位を作動不能にする変異を必ず含有する。好ましくは、２つの切断部位は作動不能とされる。本発明の目的に有用な混合物は有利には：（ａ）１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶウイルスのＣポリペプチドの部分およびこのウイルスのＥ１ポリペプチドとのＣポリペプチドの相互作用を担うＣポリペプチドの部分に少なくとも対応する領域を含有する第１のポリペプチド、ならびに（ｂ）Ｅ１ポリペプチドのこのウイルスのＣポリペプチドとの相互作用を担うこのウイルスのＥ１ポリペプチドの部分およびＥ１ポリペプチドの細胞質固定を担うこのウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に対応する領域を含有する第２のポリペプチド、を含む。先の段落の項目（ａ）および（ｂ）に列挙する特性を担うＣおよびＥ１ポリペプチドの部分は、融合ポリペプチドについて上記した通りであり得る。好ましくは、混合物の第１のポリペプチドは、ＨＣＶのＣポリペプチド（Ｃ１９１）の１〜１９１位のアミノ酸に対応する領域を含有するが、最も好ましくは、ＨＣＶのＣポリペプチド（Ｃ１９１）の１〜１９１位のアミノ酸に対応する領域からなる。後者の場合、１７３／１７４位の切断部位は、変異によって作動不能にされているべきである。この変異は、融合ポリペプチドについて上記したように生成され得る。好ましくは、混合物の第２のポリペプチドは、ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの１９２〜３８０位のアミノ酸に対応する領域を含有するが、最も好ましくは、ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの１９２〜３８０位のアミノ酸に対応する領域からなる。本発明の目的のために、ＤＮＡ分子は単純な直鎖状ＤＮＡフラグメント、またはプラスミドまたはポックスベクターのようなウイルスベクターであってもよい。ＨＣＶによって誘発される感染症の治療または予防を目的とした医薬品の製造のためにそれらを使用する場合、本出願に記載のポリペプチド、混合物またはＤＮＡ分子を最も意図とする。それら、特にＤＮＡ分子は、ＨＣＶにより誘発される感染症の免疫療法に特に有用である。最後に、本発明は、哺乳動物中でＨＣＶに対する免疫応答を誘導する方法に関し、この方法によれば、免疫応答を発達させるために、免疫学的有効量の本発明の組成物が哺乳動物に投与される。本発明はまた、ＨＣＶによって誘発される感染症の予防または冶療のための方法に関し、この方法によれば、予防または治療有効量の本発明の組成物が個体に投与される。本発明の方法および医薬組成物により、ＨＣＶ感染症を、そしてその結果としてそのような感染症に関連する肝疾患を治療または予防することができる。それらは特に、持続性慢性肝炎、活動性慢性肝炎、肝硬変および肝ガンである。本発明の組成物は、ワクチンの分野において使用されるいずれかの従来の経路、特に非経口（例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内）経路によって投与され得る。投与経路の選択は、有効成分、ポリペプチドまたはＤＮＡ分子の性質、ポリペプチドまたはＤＮＡ分子と組み合わせられるアジュバントのような多くのパラメータに依存する。本発明の組成物は、本発明の目的に有用なポリペプチドまたはポリペプチドの混合物に加えて、Ｅ２タンパク質または非構造タンパク質ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４もしくはＮＳ５のような他のＨＣＶ抗原あるいはこれらの抗原のサブユニット、フラグメント、ホモログ、変異体または誘導体を少なくとも１つ含んでもよい。本発明の目的に有用なポリペプチド、混合物またはＤＮＡ分子は、タンパク質またはポリペプチドのスクリーニングを促進するかまたは免疫応答を増大することを目的として、リポソーム、好ましくは中性またはアニオン性のリポソーム、マイクロスフェアＩＳＣＯＭまたはウイルス様粒子（ＶＬＰ）と共に、またはそれらの中に処方されていてもよい。当業者はこれらの化合物を容易に利用することができる；例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ．ＲＲＣＮｅｗＥＤ，ＩＲＬｐｒｅｓｓ（１９９０）を参照のこと。リポソーム以外のアジュバントを使用してもよい。当業者には多くのものが公知である。そのようなアジュバントは下記の参考文献に示される：非経口投与用として、特に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびアルミニウムヒドロキシホスフェートのようなアルミニウム化合物が挙げられる。抗原を、標準的な方法に従って、アルミニウム化合物上に吸着または沈殿させてもよい。非経口投与に有用な他のアジュバントとしては、特に、ポリホスファゼン（ＷＯ９５／２４１５）、ＤＣ−コール（３−β−［Ｎ−（Ｎ'，Ｎ'−ジメチルアミノメタン）カルバモイル］コレステロール）（ＵＳＰ５，２８３，１８５およびＷＯ９６／１４８３１）、ＱＳ−２１（ＷＯ８８／９３３６）およびＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）のＲＩＢＩが挙げられる。投与は、単回用量または所定の期間後に１回もしくは数回反復する用量で行ってもよい。適切な投与量は、種々のパラメータ、例えば、治療を受ける個体（成人または小児）、ワクチン抗原自体、投与の形態および回数、アジュバントの有無、およびアジュバントが存在する場合はそのタイプ、ならびに所望される効果（例えば、保護または治療）によって変化し、それらは当業者によって決定される。本発明の組成物は、従来通りに製造することができる。特に、本発明の組成物に含まれるポリペプチド、混合物またはＤＮＡ分子は、医薬上許容される希釈剤または担体（例えば、水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような食塩溶液）と組み合わせられる。一般に、希釈剤または担体は、投与の形態および経路ならびに標準的な調剤方法に基づいて選択される。医薬上許容される希釈剤および担体ならびに医薬処方物における使用に必要な全てのものについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（この分野における標準的な参考文献）およびＵＳＰ／ＮＰに記載されている。以下の図を参考にして本発明を例示する。図１は、ＨＣＶゲノムの模式図であり、ＨＣＶゲノムは線で示された非翻訳５ 'および３'領域を有するＲＮＡ、長方形で示される前駆体ポリタンパク質のオープンリーディングフレームからなる。図２は、プラスミドｐＲＣ中で試験するＨＣＶゲノムから誘導したインサートを示す。ＨＣＶゲノムから誘導した配列を長方形で表し、変異した残基を点で表す。図３は、構築物（そのうちのいくつかは１つ以上の切断部位のレベルで変異されている）のそれぞれについて測定したルシフェラーゼ活性を示す図である。試験したインサートをｘ軸上に示し、生成された総タンパク質量に対する生成されたルシフェラーゼの量をｙ軸上に示す。実施例１：組換えプラスミドの構築および部位特異的変異誘発ｐＲＣ／Ｅ１、ｐＲＣ／ＣＥ１Ｍ１、ｐＲＣ／ＣＥ１Ｍ２およびｐＲＣ／ＣＥ１Ｍ１Ｍ２（ｐＲＣ／ＣＥ１ＤＭとも呼ばれる）、ｐＲＣ／Ｃ１９１Ｍ１およびｐＲＣ／Ｃ１７３と呼ばれる構築物を以下の実施例２において使用しているが、これらは、ＬｉｕＱら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６５７（１９９７）に記載されている。使用したインサートを図２に示す。全ての構築物は、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎより入手されるベクターｐＲＣ（商品番号Ｖ７８０−２０）において作製する。ベクターｐＲＣはアンピシリン遺伝子を保持し、ＣＭＶプロモーターの制御下でのインサートの発現を可能にする。Ｍ１およびＭ２と呼ばれる変異は、構築物ｐＲＣ／Ｃ１９１Ｍ１、ｐＲＣ／ＣＥ１Ｍ１、ｐＲＣ／ＣＥ１Ｍ２およびｐＲＣ／ＣＥ１Ｍ１Ｍ２に存在する。それらを、ＰＣＲによって実施した部位特異的変異誘発によって作製した。Ｍ１と呼ばれる変異は、Ｃタンパク質のアミノ酸セリン¹⁷³およびフェニルアラニン¹⁷⁴をそれぞれアミノ酸メチオニンおよびロイシンで置換したものに対応する。Ｍ２と呼ばれる変異は、ＣＥ１タンパク質のアミノ酸アラニン¹⁹¹およびチロシン¹⁹²をそれぞれアミノ酸バリンおよびアスパラギンで置換したものに対応する。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼのレポーター遺伝子を発現するプラスミドを、ベクターｐＵＣ１８（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ；商品番号１６１１３１）を改変することによって構築した。遺伝子の発現は、ヒトＣＭＶの前初期プロモーター１（ｉｅｌ）の制御下にある。ｍＲＮＡを安定化するために、ウシ成長ホルモン遺伝子の３’領域由来の配列をこの遺伝子の３’側に更に付加した。これらのプラスミドは、１つより多いアンピシリン遺伝子を保持する。実施例２：プラスミドでの細胞のトランスフェクションＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、商品番号：Ａ１１１５−Ｌ）および２０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充したα−ＭＥＭ培地［Ｎａｔｕｒｅ２３０：３１０（１９７１）］中で液体窒素中で保存した。これらの細胞を３７℃で、５％ＣＯ₂および９５％空気を含む湿潤雰囲気下で培養する。継代培養を行うために、培地を除去し、細胞ローン（lawn）を５ｍｌのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でリンスする。次いで、上清を除去し、その後、７５ｃｍ²フラスコあたり１．５ｍｌのトリプシンを添加する（トリプシン０．０２５％）。インキュベーター中で３７ ℃で１０分間インキュベートした後、１０％ＦＣＳを含有する１０ｍｌのα−ＭＥＭ培地を添加することによって反応を停止する。０．０２％トリパンブルー中で１．５倍希釈した後、Ｍａｌａｓｓｅｚ細胞について細胞を計数する。次いで、５×１０⁵個の細胞を、完全培地を含む直径６ｃｍのディッシュ中に接種する。次いで、ＣＨＯ細胞を、上記の組換えプラスミド（ｐＨＣＶ）のうちの１つおよびＣＭＶプロモーターの制御下のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＣＭＶβ− ｇａｌ）またはＣＭＶプロモーターの制御下のルシフェラーゼ遺伝子（ｐＣＭＶＬｕｃ）のいずれかを含むレポータープラスミド（ｐＣＭＶ）とともに同時トランスフェクトする。そのために、５μｌｇのＤＮＡ（４．５μｇのプラスミドｐＨＣＶ／０．５μ ｇのプラスミドｐＣＭＶ）を５００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に希釈し、５００μｌの同培地中に希釈した１４μｌのリポフェクトアミンと混合する。２つの溶液を混合し、ＤＮＡ−リポソーム複合体を形成させるために室温で２０分間インキュベートする。次いで、培養培地を除去してＰＢＳ中でリンスした後、２ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭで希釈したＤＮＡリポソーム混合物を細胞に添加する。５時間インキュベートした後、再度培地を交換し、トランスフェクションの４８時間後に組換え遺伝子の一過性発現について試験することが可能である。実施例３：レポーター遺伝子に対する構築物の調節活性の実証試薬「ルシフェラーゼ細胞培養溶解試薬」（Ｐｒｏｍｅｇａ、ルシフェラーゼアッセイシステム）の補助により、トランスフェクトした細胞を溶解する。１００μｌの基質を、バイオルミノメーター（bioluminometer）インジェクター（ＬｕｍａｔＬＢ／９５０１／１６、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ製）により直接１００μｌの細胞上清に添加し、１０秒間に発せられる光の量（相対光単位）をバイオルミノメーターインジェクターにより測定する。次いで、精製したルシフェラーゼの補助により確立した標準曲線と比較することによって、発光量を、１ｍｌの細胞溶解物あたりのタンパク質のナノグラムに変換する。図２に示す結果は、構築物ＣＥ１Ｍ２におけるアミノ酸１９１での点変異が、トランス活性化作用を抑制することを示す。（構築物ＣＥ１Ｍ１における）アミノ酸１７３での点変異は、ＣをＥ１と融合した場合にのみトランス活性化作用を抑制する。アミノ酸１７３および１９１での二重変異はトランス活性化作用を抑制する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 37/04 37/04 Ｃ０７Ｋ 14/18 Ｃ０７Ｋ 14/18 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims

【特許請求の範囲】１．（ｉ）（ａ）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のキャプシドポリペプチド（Ｃ）の全体または部分に対応する第１の領域；および（ｂ）該ウイルスのエンベロープポリペプチド（Ｅ１）の全体または部分に対応する第２の領域、を含有するポリペプチドであって、それ自体またはその切断生成物を介して、１つ以上の遺伝子に対する調節活性能を示さないポリペプチド；（ｉｉ）（ａ）ＨＣＶのＣポリペプチドの全体または部分に対応する領域を含有する第１のポリペプチド、および（ｂ）ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの全体または部分に対応する領域を含有する第２のポリペプチド、の実質的に等モル量の混合物であって、１つ以上の遺伝子に対する調節活性能を示さない混合物；または（ｉｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子；ならびに医薬上許容される担体または希釈剤；を含む医薬組成物。２．（ｉ）哺乳動物細胞中でプロテアーゼによって切断され得ず：（ａ）１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶウイルスのＣポリペプチドの部分に少なくとも対応する第１の領域；および（ｂ）Ｅ１ポリペプチドの細胞質固定を担う該ウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に少なくとも対応する第２の領域、を含有する請求項１の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉ）哺乳動物細胞中でプロテアーゼによって切断され得：（ａ）１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶウイルスのＣポリペプチドの部分および該ウイルスのＥ１ポリペプチドとのＣポリペプチドの相互作用を担うＣポリペプチドの部分に少なくとも対応する第１の領域；ならびに（ｂ）該ウイルスのＣポリペプチドとのＥ１ポリペプチドの相互作用を担う該ウイルスのＥ１ポリペプチドの部分およびＥ１ポリペプチドの細胞質固定を担う該ウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に少なくとも対応する第２の領域、を含有する請求項１の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉｉ）（ａ）第１のポリペプチドの第１の領域が、１つ以上の遺伝子に対するＣポリペプチドの調節活性を担うＨＣＶウイルスのＣポリペプチドの部分に少なくとも対応し、第２の領域が該ウイルスのＥ１タンパク質とのＣポリペプチドの相互作用を担うＣポリペプチドの部分に少なくとも対応し、（ｂ）第２のポリペプチドの第１の領域が、該ウイルスのＣポリペプチドとのＥ１ポリペプチドの相互作用を担う該ウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に少なくとも対応し、第２の領域が、Ｅ１ポリペプチドの細胞質固定を担う該ウイルスのＥ１ポリペプチドの部分に少なくとも対応する、請求項１の（ｉｉ）記載の混合物；または（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子；ならびに医薬上許容される担体または希釈剤、を含む請求項１記載の医薬組成物。３．（ｉ）（ａ）ＨＣＶのＣポリペプチドの１位〜１２３位のアミノ酸に少なくとも対応する第１の領域；および（ｂ）ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの２６０位〜２９０位または３３０位〜３８０位のアミノ酸に少なくとも対応する第２の領域、を含有する請求項２の（ｉ）記載のポリペプチド；（ｉｉ）（ａ）ＨＣＶのＣポリペプチドの１位〜１２３位のアミノ酸および該ポリペプチドの１７３位〜１９１位のアミノ酸に少なくとも対応する第１の領域；および（ｂ）ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの３３０位〜３８０位のアミノ酸、および所望により該ポリペプチドの２６０位〜２９０位のアミノ酸に少なくとも対応する第２の領域、を含有する請求項２の（ｉｉ）記載のポリペプチド；（ｉｉｉ）（ａ）第１のポリペプチドの第１の領域が、ＨＣＶのＣポリペプチドの１位〜１２３位のアミノ酸に少なくとも対応し、第２の領域が、ＨＣＶのＣポリペプチドの１７３位〜１９１位のアミノ酸に対応し、（ｂ）第２のポリペプチドの第１および第２の領域が、ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの３３０位〜：３８０位のアミノ酸に少なくとも対応し、所望により該ポリペプチドの２６０位〜２９０位のアミノ酸に対応する、請求項２の（ｉｉｉ）記載の混合物；または（ｉｖ）（ｉ）または（ｉｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子；ならびに医薬上許容される担体または希釈剤、を含む請求項２記載の医薬組成物。４．（ｉ）請求項１〜３のいずれか１項の（ｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉ）記載のポリペプチドであって、第１の領域がポリペプチドのＮ末端側に位置し、第２の領域がポリペプチドのＣ末端側に位置するポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物。５．（ｉ）請求項４の（ｉ）記載のポリペプチドであって、第１の領域のＣ末端が、ペプチド結合によって第２の領域のＮ末端に融合されているポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項４記載の組成物。６．（ｉ）請求項１〜５のいずれか１項の（ｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉ）記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドがＨＣＶのＣポリペプチドのアミノ酸１７２〜１７５位に少なくとも対応する領域を含む場合、ＨＣＶのＣポリペプチドの１７３／１７４位の切断部位を作動不能にする変異を含有するポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１〜５のいずれか１項記載の組成物。７．（ｉ）１７２位〜１７５位のうちの１つで少なくとも１つの変異を含有する請求項６の（ｉ）１記載のポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項６記載の組成物。８．（ｉ）少なくとも１つの変異が置換によって得られる請求項７の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項７記載の組成物。９．（ｉ）天然には１７３位に存在する残基（セリン）がメチオニン残基によって置換され、天然には１７４位に存在する残基（フェニルアラニン）がロイシン残基によって置換されている請求項８の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項８記載の組成物。１０．（ｉ）請求項１〜９のいずれか１項の（ｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉ）記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドがＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９０〜１９３位に少なくとも対応する領域を含む場合、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のポリタンパク質の１９１／１９２位の切断部位を作動不能にする変異を含有するポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。１１．（ｉ）１９０位〜１９３位のうちの１つで少なくとも１つの変異を含有する請求項１０の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１０記載の組成物。１２．（ｉ）少なくとも１つの変異が置換によって得られる請求項１１の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１１記載の組成物。１３．（ｉ）天然には１９１位に存在する残基（アラニン）がバリン残基によって置換され、天然には１９２位に存在する残基（チロシン）がアスパラギン残基によって置換されている請求項１４の（ｉ）記載のポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１２記載の組成物。１４．（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項の（ｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉ）記載のポリペプチドであって、ＨＣＶのＣポリペプチドの１〜１９１位のアミノ酸に対応する第１の領域を含有するポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１〜１３のいずれか１項記載の組成物。１５．（ｉ）請求項１〜１４のいずれか１項の（ｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉ）記載のポリペプチドであって、ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの１９２〜３８０位のアミノ酸に少なくとも対応する第２の領域を含有するポリペプチド；（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１〜１４のいずれか１項記載の組成物。１６．請求項１４および１５記載の組成物。１７．（ｉ）請求項１４および１５の（ｉ）記載のポリペプチドであって、ＨＣＶポリペプチドの１位〜１９１位のアミノ酸に対応する第１の領域およびＨＣＶのＥ１ポリペプチドの１９２位〜３８０位のアミノ酸に対応する第２の領域を含有し、１９１位のアミノ酸がペプチド結合によって１９２位のアミノ酸に融合されているポリペプチド；または（ｉｉ）（ｉ）記載のポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子であって、哺乳動物細胞における発現に必要なエレメントの制御下に配置されているＤＮＡ分子、を含む請求項１６記載の組成物。１８．請求項６、７、８または９および１７記載の組成物。１９．請求項１０、１１、１２または１３および１７記載の組成物。２０．請求項１８および１９記載の組成物。２１．請求項１〜３のいずれか１項記載の組成物であって、請求項１の（ｉｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉｉ）記載の混合物を含み、第１のポリペプチドが、ＨＣＶＣＶＣポリペプチドの１７２位〜１７５位のアミノ酸に実質的に対応する領域を含み、１７３／１７４位の切断部位を作動不能にする変異を含有する組成物。２２．第１のポリペプチドが１７２位〜１７５位のうちの１つで少なくとも１つの置換を含有する請求項２１記載の組成物。２３．第１のポリペプチドが、天然には１７３位に存在する残基（セリン）をメチオニン残基に置換し、天然には１７４位に存在する残基（フェニルアラニン）をロイシン残基に置換することによって変異されている請求項２２記載の組成物。２４．請求項１の（ｉｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉｉ）または請求項２１〜２３のいずれか１項記載の第１のポリペプチドが、ＨＣＶのＣポリペプチドの１位〜１９１位のアミノ酸に対応する領域を含有する請求項１〜３および２１〜２３のいずれか１項記載の組成物。２５．請求項１の（ｉｉ）または請求項２もしくは３の（ｉｉｉ）または請求項２０〜２３のいずれか１項記載の第２のポリペプチドが、ＨＣＶのＥ１ポリペプチドの１９２位〜３８０位のアミノ酸に対応する領域を含有する請求項１〜３および２１〜２４のいずれか１項記載の組成物。２６．ＨＣＶによって誘発される感染症の治療（免疫療法）を目的とした医薬品の製造における、請求項１〜１９のいずれか１項記載のポリペプチドもしくはＤＮＡ分子、または請求項１〜３および２０〜２４のいずれか１項記載の混合物の使用。