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JP2001513982A - フォリスタチン−３ - Google Patents

フォリスタチン−３

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JP2001513982A
JP2001513982A JP2000507690A JP2000507690A JP2001513982A JP 2001513982 A JP2001513982 A JP 2001513982A JP 2000507690 A JP2000507690 A JP 2000507690A JP 2000507690 A JP2000507690 A JP 2000507690A JP 2001513982 A JP2001513982 A JP 2001513982A
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follistatin
polypeptide
amino acid
seq
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JP2000507690A
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スティーブン エム． ルーベン，
ロクスンヌ デュアン，
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Human Genome Sciences Inc
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Human Genome Sciences Inc
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、インヒビン関連タンパク質のファミリーのメンバーである新規のフォリスタチン−３タンパク質に関する。特に、ヒトフォリスタチン−３タンパク質をコードする単離された核酸分子が提供される。フォリスタチン−３ポリペプチドもまた提供され、同様に、フォリスタチン−３ポリペプチドを産生するためのベクター、宿主細胞、および組換え方法が提供される。本発明は、さらに、フォリスタチン−３活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのスクリーニング方法に関する。生殖系関連障害ならびに細胞増殖および分化の調節の障害を検出するための診断方法、そして生殖系関連障害ならびに細胞増殖および分化の調節の障害を処置するための治療方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、インヒビン関連タンパク質のファミリーのメンバーであるポリペプ
チドをコードする新規のヒト遺伝子に関する。より詳細には、フォリスタチン−
３と命名されたヒトポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される
。フォリスタチン−３ポリペプチドもまた、このフォリスタチン−３を産生する
ための、ベクター、宿主細胞、および組換え方法と同様に提供される。生殖系に
関する障害を検出する診断方法、およびこのような障害を処置する治療方法もま
た、提供される。本発明はさらにフォリスタチン−３活性のアゴニストおよびア
ンタゴニトを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） インヒビン関連タンパク質のファミリーは現在のところ以下のメンバーの少な
くとも４つの群からなる：インヒビン、アクチビン、およびフォリスタチン−１
の２つのスプライス改変体（３１５および２８８アミノ酸）。インヒビンおよび
アクチビンはトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−βスーパーファミリー
のメンバーであり、肝臓、腎臓、副腎、骨髄、胎盤、下垂体前葉、および脳を含
む生殖器官および非生殖器官の両方のパラクリン調節およびオートクリン調節の
種々の能力中の反作用を伴って機能する（Ｙｉｎｇ，Ｓ．Ｙら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏ
ｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１４：１１４−１２２（１９９７）；Ｍａｔ
ｈｅｒ，Ｊ．Ｐら，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１５：２
０９−２２２（１９９７））。フォリスタチンはＴＦＧ−βファミリーに密接に
は関係しないが、それらはなお、エストラジオール産物の増加により、および高
親和性のアクチビン結合タンパク質として直接機能することにより卵胞刺激ホル
モン（ＦＳＨ）合成経路で主な役割を果たす。インヒビン、アクチビン、および
フォリスタチン−１は下垂体ＦＳＨ分泌の調節因子として全て最初に同定された
が、増殖因子、胚修飾因子、および免疫因子として機能するようにより最近さら
に特徴付けられた（Ｐｅｔｒａｇｌｉａ，Ｆ．Ｐｌａｃｅｎｔａ １８：３−８
（１９９７））。さらに、各これらの因子はゴナドトロピン生合成および分泌、
卵巣および胎盤のステロイド生成、ならびに卵母細胞および精子形成成熟の調製
に関与する（Ｈａｌｖｏｖｓｏｎ，Ｌ．Ｍ．ａｎｄ ＤｅＣｈｅｒｎｅｙ，Ａ．
Ｈ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ ６５：４５９−４６９（１９９６））。
【０００３】 ＦＳＨはヒト卵母細胞の発達を統制する調節カスケードの生体構成成分である
。新生児の一次卵母細胞は減数分裂（Ｍｅｉｏｓｉｓ）Ｉの分裂前期段階で停止
され、そして始原小胞（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ ｆｏｌｌｉｃｌｅ）と命名され
た構造を構成する小胞細胞の１〜２細胞の厚い層で覆われる。他の因子に呼応し
て、ＦＳＨを有する始原小胞の刺激は、発達中および腔の小胞を設計したより多
くの複合体構造に対する進行を惹起する（Ｕｅｎｏ，Ｎ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８２８２−８２８６（１９８７）；Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏ
ｍｍ．１４９：７４４−７４９（１９８７））。この腔の小胞は、増加した数の
小胞細胞、透明帯、表層顆粒、および洞と命名された液体充填腔により覆われた
肥大した卵母細胞からなる。数千の発生する卵母細胞が思春期まで維持されるの
はこの段階においてである。この時点後の各月に、幾つかのさらなるホルモンお
よび他の因子主に黄体形成ホルモン（ＬＨ）の局所的な濃度中のサージは、およ
そ１５〜２０の卵巣中で発生中の小胞の増殖を刺激し、かつ促進する。これらの
構造のうちの１つのみが、減数分裂ＩＩの中期段階に対して囲まれた卵母細胞の
発生的な進行を最終的に完了する。次に、この単一の刺激された小胞は、それが
卵巣の表面で破裂し、可能性のある受精のために、小胞細胞のコーティングでな
お囲まれたこの卵母細胞を放出するまで、増大しつづける（Ｂｏｒｎｓｌａｅｇ
ｅｒ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１１４：４５３−４６２（１９８６）
；Ｍａｓｕｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｃｌａｒｋｅ，Ｈ．Ｊ．Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏ
ｌ．５７：１８５−２８２（１９７９）；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｊ．Ｓ．Ｒｅｃｅ
ｎｔ Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．３５：３４３−３７３（１９７９））。
【０００４】 フォリスタチンはまた、小胞発生の上述のプロセスにおいて中心的な役割を果
たす。フォリスタチンは化学両論的にアクチビンと結合し、結果として、培養さ
れた下垂体細胞からのＦＳＨ放出のアクチビン誘導増加を阻害する（Ｋｏｇａｗ
ａ，Ｋ．，ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １２８：１４３４−１４４０（１
９９１））。さらにフィードバック機構を証明するときに、培養した顆粒膜細胞
はＦＨＳでの処理に対する応答においてフォリスタチンを産生し、分泌する（Ｓ
ａｉｔｏ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７
６：４１３−４２２（１９９１）；Ｋｌｅｉｎ，Ｒ．ら，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ
ｏｇｙ １２８：１０４８−１０５６（１９９１））。さらに、フォリスタチン
、アクチビン、ＦＳＨ、ＬＨ、およびその他の多くの因子は、小胞の発生を含む
多くの発生プロセスを調節するために、多様の相互関係がある機構中で一致して
機能することが、多くの研究の結果物を合成することにより決定された。例えば
、ＦＳＨの存在下で、アクチビンは、ＬＨレセプター発現およびラット顆粒膜細
胞によるプロゲステロン産物を共に増大し得る（Ｓｕｇｉｎｏ，Ｈ．ら，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５３：２８１−２８８（１９
８８））。さらに、アクチビンは、ＦＳＨレセプターを発現し、かつＦＳＨの非
存在下でさえインヒビンを産生する顆粒膜細胞の能力を有意に増大する（Ｎａｋ
ａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３５：
１０３−１０９（１９９２）；Ｓｕｇｉｎｏ，Ｈ．ら、前出；Ｈａｓｅｇａｗａ
，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５６：６６
８−６７４（１９８８））。これらおよび他の研究は、フォリスタチンおよびア
クチビンが顆粒膜細胞分化の調節において重要な役割を果たすという考えについ
ての支持を提供する。
【０００５】 フォリスタチン、アクチビン、およびインヒビンはこの生殖器官における種々
の発生プロセスの調節に関し誘発するという多くの良く特徴化された効果に加え
て、多くの研究は、種々の他の組織および系におけるこれらの分子についての調
節の役割を定義することをより最近開始した。例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅ
ｖｉｓにおける初期の胚発生間、毛様体神経節ニューロンの標的の発生中におけ
るアクチビンＡの作用は、フォリスタチンの局在化した発現により調節される（
Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａ．ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｎ
ａｔｕｒｅ ３５９：６０９−６１４（１９９２）；Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖ
ａｎｌｏｕ，Ａ．ａｎｄ Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．Ｃｅｌｌ ７７：２７３−２
８１（１９９４））。さらにフォリスタチンの過剰発現は、神経組織の誘導を導
く（Ｈｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ ７７：２８３−
２９５（１９９４））。このマウスにおいて、フォリスタチン ｍＲＮＡは、残
留物（ｄｅｃｉｄｕｕｍ）中の、および引き続いて、発生中の菱脳、大節、鼻毛
、歯、表皮、および筋肉中の５．５日胚でまず検出される（ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｉｈｎｄｅｎ−ｖａｎ Ｒａａｉｊ，Ａ．Ｊ．Ｍ．ら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１５
４：３５６−３６５（１９９２）；Ａｌｂａｎｏ，Ｒ．Ｍ．ら．，Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ １２０：８０３−８１３（１９９４）；Ｆｅｉｊｅｎ，Ａ．ら，Ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２０：３６２１−３６３７（１９９４））。フォリス
タチンのこのような種々の発現の相対的な重要性の証明は、Ｍａｔｚｕｋおよび
共同研究者らにより提供される（Ｎａｔｕｒｅ ３７４：３６０−３６３（１９
９５））が、彼等は、フォリスタチン欠乏マウスはその増殖において遅延され、
横隔膜および助間筋肉、つやのあるピンと張った皮膚、硬い口蓋の骨格の欠損、
および３０対のｆｉｂの量を減少させ、それらのひげおよび歯の発生は異常であ
り、それらは呼吸をせず、そして誕生の数時間内に死ぬことを実証する。フォリ
スタチンを欠乏したマウス中における欠損は、アクチビンを欠乏したマウス中よ
りもずっと広範囲であるので、Ｍａｔｚｕｋおよび共同研究者ら（前出）は、フ
ォリスタチンが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのさらなるメンバーの細胞増殖
および分化調節作用を調節し得ることを示唆する。
【０００６】 従って、このような調節の妨害は、生殖ならびに細胞増殖および分化の調節に
関する障害に関与し得るので、生殖発生、胚発生、ならびに細胞増殖および分化
の調節因子として機能するポリペプチドが必要である。従って、このような障害
を検出、予防、回復、または矯正する役割を果たし得るこのようなヒトポリペプ
チドの同定および性質決定が必要である。
【０００７】 （発明の要旨） 本発明は、配列番号２に示される完全なアミノ酸配列、または１９９７年８月
８日にＡＴＣＣ受託番号２０９１９９としてプラスミドＤＮＡとして寄託された
ｃＤＮＡクローンによってコードされる完全なアミノ酸配列を有するフォリスタ
チン−３ポリペプチドの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドを含む、
単離された核酸分子を提供する。寄託されたフォリスタチン−３クローンを配列
決定することにより決定されるヌクレオチド配列（これは、図１Ａ、１Ｂ、およ
び１Ｃ（配列番号１）に示される）は、２６３アミノ酸残基の完全なポリペプチ
ドをコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオチド１９〜２１位のＮ
末端メチオニンをコードする開始コドンを含み、そして約２７．７ｋＤａの推定
分子量を有する）を含む。本発明の核酸分子は、配列番号２に示されるＮ末端メ
チオニンを除く完全なアミノ酸配列、またはＡＴＣＣ受託番号２０９１９９のｃ
ＤＮＡクローンによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配
列（これらの分子はまた、フォリスタチン−３アミノ酸配列のＮ末端に融合され
たさらなるアミノ酸をコードし得る）をコードする核酸分子を含む。
【０００８】 コードされたポリペプチドは、図１Ａにおいて下線を付けた２６アミノ酸の推
定リーダー配列を有し；そして推定成熟フォリスタチン−３タンパク質のアミノ
酸配列はまた、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃにおいて、配列番号２におけるアミノ
酸残基２７〜２６３およびアミノ酸残基１〜２３７として、示される。
【０００９】 従って、本発明の１つの局面は、以下からなる群より選択されるヌクレオチド
配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する：（ａ）配
列番号２の完全なアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６位〜２３７位）
を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（
ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く配列番号２の完全アミノ配列（すなわち、配列番号
２の−２５位〜２３７位）を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列；（ｃ）配列番号２の１位〜２３７位のアミノ配列を有する
推定成熟フォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ
）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードさ
れる完全アミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクロ
ーンによってコードされるＮ末端メチオニンを除く完全アミノ酸配列を有するフ
ォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ
受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ
酸配列を有する成熟フォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列；および（ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、もしくは
（ｆ）のヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列。
【００１０】 本発明のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、（ｆ）もしくは（ｇ）のヌクレオチド配列のいずれかに対して少なくとも９
０％同一、そしてより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、
もしくは９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、またはスト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）
、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、もしくは（ｇ）のポリヌクレオチドにハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を含む。このハイブリダイ
ズするポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下
でＡ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオ
チドにハイブリダイズしない。
【００１１】 本発明のさらなる核酸の実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）
、（ｅ）または（ｆ）のアミノ酸配列を有する、フォリスタチン−３ポリペプチ
ドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む単
離された核酸分子に関する。本発明のさらなる核酸の実施態様は、少なくとも１
つのアミノ酸置換であるが５０以下アミノ酸置換、なおより好ましくは、４０以
下のアミノ酸置換、さらにより好ましくは３０以下のアミノ酸置換、およびなお
さらにより好ましくは２０以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するフォ
リスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含
む単離された核酸分子に関する。もちろん、なお強まる優先度のために、フォリ
スタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにとっ
て、１０、９、８、７、６、５、４、３、２，または１アミノ酸以下の置換を含
むアミノ酸配列を有することは、高度に好ましい。保存的置換が好ましい。
【００１２】 本発明はまた、組換えベクターに関し、これは本発明の単離された核酸分子を
含み、および組換えベクターを含む宿主細胞に関し、ならびにこのようなベクタ
ーおよび宿主細胞を作製する方法、組換え技術によるフォリスタチン−３ポリペ
プチド、またはペプチドの産生のための、それらの使用方法がある。
【００１３】 本発明のさらなる局面に従って、このタンパク質の発現およびこのタンパク質
の引き続く回収を促進する条件下で、フォリスタチン−３核酸配列を含む組換え
原核生物および／または真核生物宿主細胞を培養する工程を包含する組換え技術
によりこのようなポリペプチドを産生するプロセスを提供する。
【００１４】 本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離され
たフォリスタチン−３ポリペプチドを提供する：（ａ）配列番号２に示される完
全なアミノ酸配列を有する全長フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列
（すなわち、配列番号２の−２６〜２３７位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除去
する配列番号２に示される完全なアミノ酸配列を有する全長フォリスタチン−３
ポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２５〜２３７位）；（
ｃ）配列番号２の１〜２３７位のアミノ酸配列を有する推定成熟フォリスタチン
−３ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９中に含
まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる完全なアミノ酸配列を有する全長フ
ォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９
１９９中に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされるＮ末端メチオニンを除
去する完全なアミノ酸配列を有する全長フォリスタチン−３ポリペプチドのアミ
ノ酸配列；および（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９中に含まれるｃＤＮＡク
ローンによりコードされるアミノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−３ポリペ
プチドのアミノ酸配列。本発明のポリペプチドにはまた、上記の（ａ）、（ｂ）
、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載されるアミノ酸配列と少なくと
も８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、およびさらにより好まし
くは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、ならびに上記のアミノ酸配列と少なくとも９０％類似性、およ
びより好ましくは少なくとも９５％類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペ
プチドが挙げられる。
【００１５】 本発明のこの局面のさらなる実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（
ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載されるアミノ酸配列を有するフォリスタチン
−３ポリペプチドのエピト−プ保有部分のアミノ酸配列を含むペプチドまたはポ
リペプチドに関する。本発明のフォリスタチン−３ポリペプチドのエピト−プ保
有部分のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドには、少なくとも６
または７、好ましくは少なくとも９、およびより好ましくは少なくとも約３０ア
ミノ酸〜約５０アミノ酸を有するこのようなポリペプチドの部分が挙げられるる
が、任意の長さまでの、および上述の本発明のポリペプチドの完全なアミノ酸配
列を含むエピトープを保有するポリペプチドもまた本発明に含まれる。
【００１６】 本発明のさらなる実施態様は、少なくとも１つのアミノ酸置換だが、５０以下
のアミノ酸置換、なおより好ましくは４０以下のアミノ酸置換、さらにより好ま
しくは３０以下のアミノ酸置換、およびさらになおより好ましくは２０アミノ酸
置換をふくむアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸
配列を含むポリペプチドに関する。もちろん、好ましさをさらに高めるために、
ペプチドまたはポリペプチドが、少なくとも１つだが１０、９、８、７、６、５
、４、３、２、または１アミノ酸置換を含むフォリスタチン−３ポリペプチドの
アミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することは高度に好ましい。特定の実施態
様について、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃのアミノ酸配列あるいはそのフラグメン
ト（例えば、本明細書に記載の成熟形態および／または他のフラグメント）の付
加、置換、および／または欠失の数は１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、
１０〜５０、または５０〜１５０であり、保存的アミノ酸置換が好ましい。
【００１７】 別の実施態様について、本発明は、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、
（ｅ）、または（ｆ）に記載されるアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポ
リペプチドに特異的に結合する単離された抗体を提供する。本発明はさらに、本
明細書に記載のようなアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドに
特異的に結合する抗体を単離する方法を提供する。このような抗体は以下に記載
されるように診断上または治療上有用である。
【００１８】 本発明はまた、フォリスタチン−３ポリペプチド、特にヒトフォリスタチン−
３ポリペプチドを含む薬学的組成物を提供し、これは例えば、ガンおよび他の細
胞増殖および分化障害、ならびにこの生殖器官の障害を処置するのに使用され得
る。フォリスタチン−３ポリペプチドを必要とする個体を処置する方法も、また
提供される。
【００１９】 本発明はさらに、インビトロで細胞に、エキソビボで細胞に、およびインビボ
で細胞に、あるいは多細胞生物に投与するための、フォリスタチン−３ポリヌク
レオチドまたはフォリスタチン−３ポリペプチドを含む組成物を提供する。本発
明のこの局面の特定の特に好ましい実施態様において、この組成物は、疾患の処
置のため、宿主生物中のフォリスタチン−３ポリペプチドの発現についてのフォ
リスタチン−３ポリヌクレオチドを含む。この点について、フォリスタチン−３
の異常な内在性の活性と関連した機能障害の処置について、ヒト患者における発
現が特に好ましい。
【００２０】 本発明はまた、フォリスタチン−３ポリペプチドの生物学的活性を増強または
阻害し得る化合物を同定する方法をスクリーニングする工程を提供し、これには
フォリスタチン−３ポリペプチドの存在下でフォリスタチン−３ポリペプチドに
より阻害されるリガンドを候補化合物と接触させる工程、候補化合物およびフォ
リスタチン−３ポリペプチドの存在下でこのリガンドのレセプター結合活性をア
ッセイする工程、ならびにこのリガンド活性を標準レベルの活性と比較する工程
があり、接触がフォリスタチン−３ポリペプチドの存在下および候補化合物の非
存在下でそのリガンド自体の間で行われる場合、この標準はアッセイされる。こ
のアッセイにおいて、この標準に対するリガンド活性の増加は、この候補化合物
がフォリスタチン−３活性のアゴニストであることを示し、かつこの標準と比較
したリガンド活性における減少はこの化合物がフォリスタチン−３活性のアンタ
ゴニストであることを示す。
【００２１】 別の局面において、アゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングアッセ
イが提供され、これには候補化合物がアクチビンまたはアクチビン様分子と結合
するフォリスタチン−３に対して有する効果を決定する工程を含む。特に、この
方法には、アクチビンまたはアクチビン様分子をフォリスタチン−３ポリペプチ
ドおよび候補化合物と接触させる工程、ならびにアクチビンまたはアクチビン様
分子へのフォリスタチン−３ポリペプチドの結合が、候補化合物の存在により増
加または減少するかどうかを決定する工程に関する。このアッセイにおいて、こ
の標準の結合を越える、フォリスタチン−３の結合における増加は、この候補化
合物が、フォリスタチン−３結合活性のアゴニストであることを示し、この標準
と比較したフォリスタチン−３結合の減少は、この化合物がフォリスタチン−３
結合活性のアンタゴニストであることを示す。
【００２２】 フォリスタチン−３はホジキンリンパ腫中にだけでなく、滑膜繊維芽細胞、胆
嚢、休止および血清誘導した平滑筋、精巣、Ｍｅｒｋｅｌ細胞、ＨＥＬ細胞、海
馬、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ誘導上皮細胞、ケラチノサイト、扁桃陥凹、ＨＬ−
６０細胞、肝細胞ガン、プロゲステロン処理表皮細胞、内皮細胞、ＨＳＣ１７２
細胞、類上皮肉腫、活性化Ｔ細胞、胸部リンパ節、膵臓ガン、胎児硬膜、胎児肺
、精巣上体、胎盤、樹状細胞、拒絶腎臓、および子宮ガン中にもまた表現される
ことが発見された。従って、本発明の核酸は、生物学的サンプル中に存在する組
織または細胞型の差示的同定のためのハイブリダイゼーションプローブとして有
用である。同様に、ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドに対する抗体は、
組織または細胞型の差示的同定のための免疫学的プローブを提供するために有用
である。さらに、上記の（特に、生殖系の）組織もしくは細胞の多くの障害、ま
たは細胞増殖および分化の調節の障害については、「標準」のフォリスタチン−
３遺伝子発現レベル（すなわち、生殖系または細胞増殖および分化の調節の障害
を有さない個体からの健常組織におけるフォリスタチン−３発現レベル）に対し
て有意に高いかまたは低いレベルのフォリスタチン−３遺伝子発現は、このよう
な障害を有する個体から採取された特定の組織（例えば、ガン組織および創傷組
織）または体液（例えば、血清、血漿、尿、滑液、もしくは髄液）において検出
され得る。従って、本発明は、このような障害の診断の間に有用な診断方法を提
供し、これは、以下の工程を包含する：（ａ）個体の細胞または体液におけるフ
ォリスタチン−３遺伝子の発現レベルをアッセイする工程：（ｂ）フォリスタチ
ン−３遺伝子の発現レベルを、標準のフォリスタチン−３遺伝子の発現レベルと
比較する工程であって、それによって標準の発現レベルと比較して、アッセイさ
れたフォリスタチン−３遺伝子の発現レベルの増加または減少は、生殖系におけ
る障害または細胞増殖および分化調節の障害を示す、工程。
【００２３】 本発明のさらなる局面は、身体におけるフォリスタチン−３活性のレベルの増
加が必要な個体を処置する方法に関し、この方法は、このような個体に、本発明
の単離されたフォリスタチン−３ポリペプチドまたはそのアゴニストの治療有効
量を含有する組成物を投与する工程を含む。
【００２４】 本発明のなおさらなる局面は、身体におけるフォリスタチン−３活性のレベル
の減少が必要な個体を処置するための方法に関し、この方法は、このような個体
に、フォリスタチン−３アンタゴニストの治療有効量を含有する組成物を投与す
る工程を含む。本発明において使用するのに好ましいアンタゴニストは、フォリ
スタチン−３特異的抗体である。
【００２５】 （発明の詳細な説明） 本発明は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供し、
これは、クローン化されたｃＤＮＡを配列決定することによって決定された。図
１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（配列番号１）に示されたヌクレオチド配列は、ＨＤＴ
ＡＨ８５クローンを配列決定することによって得られ、これは、１９９７年８月
８日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、
１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、
Ｖｅｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号２０９
１９９を与えられた。寄託されたクローンは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（
−）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に含まれる
。
【００２６】 本発明のフォリスタチン−３は、フォリスタチン−１に関するヒトｍＲＮＡの
翻訳産物と配列相同性を共有する（図２；配列番号３）。フォリスタチン−１は
、生殖系の小胞発達および精子形成の調節における重要な因子であると考えられ
ている。フォリスタチン−１は、化学量論的にアクチビンと結合し、そしてアク
チビンレセプターとの相互作用を妨げることによってアクチビンのアンタゴニス
トとして作用する。アクチビンに加えて、フォリスタチン−１は、ＴＧＦ−βス
ーパーファミリーのさらなるメンバーの標的化によって同様の様式で作用し得る
と考えられる。
【００２７】 （核酸分子） 他に示されない限り、本明細書中でＤＮＡ分子を配列決定することによって決
定されたすべてのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡ配列決定機（例えば、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ
ＡからのＭｏｄｅｌ ３７３）を用いて決定され、そして本明細書中で決定され
るＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの全アミノ酸配列は、上記のよ
うに決定されるＤＮＡ配列の翻訳によって推定された。従って、この自動化アプ
ローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野において公知のよ
うに、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくらかの誤差を含み
得る。自動化によって決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分
子の実際のヌクレオチド配列に対して、代表的には少なくとも約９０％同一、よ
り代表的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際
の配列は、当該分野において周知の手動ＤＮＡ配列決定方法を含む他のアプロー
チによってさらに正確に決定され得る。当該分野においてまた公知のように、実
際の配列と比較した、決定されるヌクレオチド配列における単一の挿入または欠
失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こし、その結果
、決定されるヌクレオチド配列によってコードされる推定アミノ酸配列は、配列
決定されるＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異な
る。このような差異は、このような挿入または欠失の点で始まる。
【００２８】 核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」によって、ＤＮＡ分
子またはポリヌクレオチドについては、デオキシリボヌクレオチドの配列、およ
びＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドについては、対応するリボヌクレオチド（
Ａ，Ｇ，ＣおよびＵ）の配列（ここで、特定したデオキシリボヌクレオチド配列
中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（
Ｕ）により置換される）が、意図される。
【００２９】 本明細書中に提供した情報（例えば、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（配列番号１
）のヌクレオチド配列）を使用して、フォリスタチン−３ポリペプチドをコード
する本発明の核酸分子は、標準のクローニングおよびスクリーニング手順（例え
ば、出発物質としてｍＲＮＡを使用してｃＤＮＡをクローン化する手順）を使用
して入手され得る。本発明の例示として、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１
）に記述される核酸分子は、ホジキンリンパ腫由来のｃＤＮＡライブラリー中に
発見された。
【００３０】 同じ遺伝子のさらなるクローンはまた、以下の細胞および組織由来のｃＤＮＡ
ライブラリーにおいて同定された：滑膜繊維芽細胞、胆嚢、休止および血清誘導
平滑筋、精巣、メルケル細胞、ＨＥＬ細胞、海馬、ＴＮＦ−α−上皮細胞および
ＩＦＮ誘導上皮細胞、ケラチノサイト、扁桃、陥凹、ＨＬ−６０細胞、肝癌、プ
ロゲステロン処置表皮細胞、内皮細胞、ＨＳＣ１７２細胞、類上皮肉腫、活性化
Ｔ細胞、胸部リンパ節、膵臓癌、胎児硬膜、胎児肺、精巣上体、胎盤、樹状細胞
、拒絶腎臓（ｒｅｊｅｃｔｅｄ ｋｉｄｎｅｙ）および子宮癌。
【００３１】 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）のフォリスタチン−３ ｃＤＮＡの決
定されたヌクレオチド配列は、２６３アミノ酸残基のタンパク質をコードするオ
ープンリーディングフレームを含み、図１Ａ（配列番号１）でヌクレオチド配列
のヌクレオチド１９〜２１位における開始コドン、そして約２７．７ｋＤａの推
定分子量を有する。配列番号２に示されたフォリスタチン−３タンパク質のアミ
ノ酸配列は、フォリスタチン−１に関するヒトｍＲＮＡと約４３．２％同一であ
る（図２；Ｓｈｉｍａｓａｋｉ，Ｓ．，ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：４２１８−４２２２（１９８８）；ＧｅｎＢａｎｋ
登録番号Ｊ０３７７１）。
【００３２】 フォリスタチン−３遺伝子のオープンリーディングフレームは、フォリスタチ
ン−１についてのヒトｍＲＮＡの翻訳産物（図２；配列番号３）と配列相同性を
共有する。フォリスタチン−１とフォリスタチン−３の間の相同性は、フォリス
タチン−３がまた細胞増殖および分化、特に生殖系の細胞に関する生理学的調節
に関連し得ることを示す。
【００３３】 当業者が理解するように、上で議論した配列決定誤差の可能性のため、寄託さ
れたｃＤＮＡによりコードされる事実上完全なフォリスタチン−３ポリペプチド
（これは、約２６３のアミノ酸を含む）は、いくらか、より長いまたはより短く
あり得る。さらに一般的に、実際のオープンリーディングフレームは、±２０ア
ミノ酸の範囲で任意の場所で存在し得、±１０アミノ酸の範囲でより存在し得る
ようであり、これは、図１Ａ（配列番号１）で示されたＮ末端からのどのメチオ
ニンコドンからも推定される。種々の機能的ドメインを同定するために使用され
る分析判定基準により、フォリスタチン−３ポリペプチドの成熟形態の正確な「
位置」は上記の推定位置と僅かに異なり得ることがさらに理解される。例えば、
配列番号２に示される成熟フォリスタチン−３分子の前駆体形態の切断部位の正
確な位置は、僅かに異なり得る（例えば、この位置は、この切断部位を定義する
ために使用される判定基準で、約６の残基でシフトし得る）。この場合、シグナ
ルペプチドの末端および成熟フォリスタチン−３分子の開始は、ＨＧＳＩ Ｓｉ
ｇｎａｌＰコンピューターアルゴリズムを使用して予測された。当業者は、あり
得るポリペプチド切断部位、ＰＳＯＲＴを予想するのに使用した別の広く容認さ
れたコンピューターアルゴリズムは、ＨＧＳＩ ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムに
より予想されるところから僅かに異なる位置で、Ｎ末端シグナルペプチドのフォ
リスタチン−３ポリペプチドからの切断を予想することを認識する。それぞれの
場合において、以下により記載されるように、本発明はさらに、本明細書中に記
載される推定した成熟フォリスタチン−３ポリペプチドのそれぞれに一致するポ
リペプチドを含む、この完全なポリペプチドのＮ末端から欠失した種々の残基を
有するポリペプチドを提供する。
【００３４】 完全フォリスタチン−３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される
ような、リーダー配列および成熟タンパク質を含む。より詳細には、本発明は、
フォリスタチン−３タンパク質の成熟形態をコードする核酸分子を提供する。従
って、シグナル仮定に従って、一旦、成長するタンパク質鎖の粗面小胞体を横切
る輸送が開始されると、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、シグナ
ルまたは分泌リーダー配列を有し、これは完全ポリペプチドから切断されて、タ
ンパク質の分泌された「成熟」形態を産生する。ほとんどの哺乳動物細胞、およ
び昆虫細胞さえ、分泌されたタンパク質を同じ特異性で切断する。しかし、いく
つかの場合、分泌されたタンパク質の切断は、全体的に均一ではなく、タンパク
質の２つ以上の成熟種を生じる。さらに、分泌されたタンパク質の切断特異性は
、究極的には、完全タンパク質の一次構造によって決定されること、すなわち、
ポリペプチドのアミノ酸配列に固有であることが公知である。それゆえ、本発明
は、ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９のように定義された宿主中に含まれるｃＤＮ
Ａクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−３
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供する。「ＡＴＣＣ受託番号２
０９１９９のｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟
フォリスタチン−３ポリペプチド」によって、登録された宿主中に含まれるクロ
ーンのヒトＤＮＡ配列によってコードされる完全なオープンリーディングフレー
ムの哺乳動物細胞（例えば、以下に記載のような、ＣＯＳ細胞）中の発現によっ
て産生されるフォリスタチン−３タンパク質の成熟形態が意味される。
【００３５】 さらに、タンパク質が分泌リーダー並びにリーダー配列の切断点を有するかど
うかを推定するための方法が利用できる。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ（Ｖｉｒｕｓ
Ｒｅｓ．３：２７１−２８６（１９８５））の方法では、完全な（非切断の）
タンパク質の短いＮ末端荷電領域およびその後の非荷電領域からの情報が使用さ
れる。ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
４：４６８３−４６９０（１９８６））では、切断部位の周囲の残基（代表的に
は、残基−１３〜＋２、ここで、＋１は成熟タンパク質のアミノ末端を示す）か
らの情報が使用される。各これらの方法に関して既知の哺乳動物分泌タンパク質
の切断点を推定する精度は、７５〜８０％の範囲にある（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ
、前出）。しかしこの２つの方法は、所定のタンパク質に関して同じ推定切断点
を常に生じるとは限らない。
【００３６】 この場合、完全なフォリスタチン−３ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、Ｈ
ＧＳＩ ＳｉｇｎａｌＰアルゴリズムにより分析されたが、これはアミノ酸配列
に基づくタンパク質の細胞位置を推定するための専門システムである。局在化の
このコンピューター推定の一環として、ＭｃＧｅｏｃｈおよびｖｏｎ Ｈｅｉｎ
ｊｅの方法が取りこまれる。従って、上記のコンピューター解析は、配列番号２
の完全アミノ酸配列内で、単一の切断部位を予測した（上記議論を参照のこと）
。
【００３７】 示されるように、本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）で
、またはＤＮＡの形態（例えば、クローニングにより入手または合成的に生産さ
れるｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）であり得る。このＤＮＡは二本鎖また
は一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓ
ｔｒａｎｄ）としても知られるコード鎖（ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）であり
得、またはアンチセンス鎖（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とも呼ばれ
る非コード鎖（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）であり得る。
【００３８】 「単離された」核酸分子によって、ネイティブな環境から取り出された核酸分
子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が意図される。例えば、ベクター中に含まれる組換え
ＤＮＡ分子は、本発明の目的のために単離されていると考えられる。単離された
ＤＮＡ分子のさらなる例は、異種の宿主細胞において維持される組換えＤＮＡ分
子、または溶液中の（部分的または実質的に）精製されたＤＮＡ分子を含む。単
離されたＲＮＡ分子は、本発明のＤＮＡ分子のインビボまたはインビトロでのＲ
ＮＡ転写物を含む。本発明に従う単離された核酸分子は、合成的に生成されたよ
うな分子をさらに含む。
【００３９】 本発明の単離された核酸分子としては、図１Ａ（配列番号１）に示されるヌク
レオチド配列の１９〜２１位の開始コドンを有するオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）を含むＤＮＡ分子が挙げられる。
【００４０】 配列番号２の１〜２３７位に示される推定成熟フォリスタチン−３タンパク質
についてのコード配列を含むＤＮＡ分子もまた、含まれる。
【００４１】 さらに、本発明の単離された核酸分子としては、上記の配列とは実質的に異な
るが、遺伝コードの縮重により、なおフォリスタチン−３タンパク質をコードす
る配列を含むＤＮＡ分子が挙げられる。もちろん、遺伝コードおよび種特異的コ
ドン優先度は、当該分野で周知である。従って、例えば、特定の宿主に関してコ
ドン発現を至適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ中のコドンをＥ．ｃｏｌｉのよう
な細菌宿主に好ましいコドンに変更する）ために上記の縮重改変体を生成するこ
とは当業者にとって慣用的である。
【００４２】 別の局面において、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９（１９９７年８
月８日）として寄託されたプラスミドに含まれるｃＤＮＡクローンによりコード
されるアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードする単離
された核酸分子を提供する。
【００４３】 好ましくは、この核酸分子は、上記の寄託されたｃＤＮＡクローンによってコ
ードされる成熟ポリペプチドをコードする。
【００４４】 本発明は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配
列もしくは上記の寄託クローンに含まれるフォリスタチン−３ ｃＤＮＡのヌク
レオチド配列を有する単離された核酸分子、または上記の配列の１つに相補的な
配列を有する、単離された核酸分子をさらに提供する。このような単離された分
子、特にＤＮＡ分子は、染色体とのインサイチュハイブリダイゼーションによる
遺伝子マップ作成のための有用なプローブとして、およびヒト組織のフォリスタ
チン−３遺伝子の発現を（例えば、ノーザンブロット分析によって）検出するた
めに有用である。
【００４５】 本発明はさらに、本明細書中に記述されるヌクレオチド配列の部分をコードす
る核酸分子、ならびに本明細書中に記載される単離された核酸分子のフラグメン
トに関する。特に本発明は、配列番号１の１〜８１０位からなる配列番号１の部
分を表すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００４６】 さらに本発明は、以下の関連するｃＤＮＡクローンから決定された、配列番号
１の広範な部分に関連したヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する：ＨＨ
ＰＤＸＸ６６Ｒ（配列番号４）、ＨＤＴＡＨ６１Ｒ（配列番号５）、ＨＳＢＡＶ
５５Ｒ（配列番号６）、ＨＵＫＦＳ３２Ｒ（配列番号７）、ＨＯＯＡＤ７８Ｒ（
配列番号８）、ＨＡＱＡＧ５２Ｒ（配列番号９）、ＨＴＬＥＪ５６Ｒ（配列番号
１０）、ＨＬＭＮＸ９０Ｒ（配列番号１１）。
【００４７】 さらに本発明には、配列番号１の残基１〜５００からの少なくとも約３０ヌク
レオチド、好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチドの任意の部分を含むポリヌ
クレオチドが含まれる。より好ましくは、本発明には、ヌクレオチド残基１００
〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００、１００〜４００
、２００〜４００、３００〜４００、１００〜３００、２００〜３００、１００
〜２００、１００〜２４９５、２５０〜２４９５、５００〜２４９５、１０００
〜２４９５、１５００〜２４９５、２０００〜２４９５、１００〜２０００、２
５０〜２０００、５００〜２０００、１０００〜２０００、１５００〜２０００
、１００〜１５００、２５０〜１５００、５００〜１５００、１０００〜１５０
０、１００〜１０００、２５０〜１０００、および５００〜１０００を含むポリ
ヌクレオチドが含まれる。
【００４８】 より一般的には、寄託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ、１Ｂお
よび１Ｃ（配列番号１）に示されるヌクレオチド配列を有する単離された核酸分
子のフラグメントにより、本明細書中に議論したような診断プローブおよびプラ
イマーとしての使用を含むがそれらに限定されない、少なくとも約１５ｎｔ、よ
り好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎ
ｔ、なおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔ長のフラグメントが意図される。
もちろん、寄託したｃＤＮＡの、または図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）
に示したヌクレオチド配列の全てではないとしても、ほとんどに対応するフラグ
メントと同様に、５０〜３００ｎｔ長のより大きなフラグメントもまた、本発明
によって有用である。少なくとも２０ｎｔ長のフラグメントにより、例えば、寄
託したｃＤＮＡのヌクレオチド配列または図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１
）に示される通りのヌクレオチド配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラ
グメントが意図される。本発明の好ましい核酸フラグメントは、図３において示
しかつ以下により詳細に記述するようなフォリスタチン−３ポリペプチドのエピ
トープ保有部分をコードする核酸分子を含む。
【００４９】 特定の実施態様において、本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、フォリ
スタチン−３機能的活性を示すポリペプチドをコードする。フォリスタチン「機
能的活性」を示すポリペプチドとは、完全、成熟または活性形態のフォリスタチ
ン−３ポリペプチドに関連する、１以上の公知の機能的活性を示し得るポリペプ
チドを意味する。このような機能的活性は、生物学的活性（（例えば、卵胞刺激
ホルモン（ＦＳＨ）合成経路を調節すること、エストラジオール産生を増加させ
ること、アクチビンを結合すること、性腺刺激ホルモン生合成および分泌を刺激
すること、卵巣および胎盤のステロイド生成を調節すること、および卵母細胞お
よび精原細胞成熟因子））、抗原性（抗フォリスタチン−３抗体に対する結合（
もしくはフォリスタチン−３ポリペプチドと、結合について競合する）能力）、
免疫原性（フォリスタチン−３ポリペプチドに結合する抗体を生成する能力）、
他のフォリスタチン−３またはインヒビンまたはＴＧＦ−βポリペプチドとポリ
マーを形成する能力、およびフォリスタチン−３ポリペプチドについてレセプタ
ーまたはリガンド（例えば、インヒビン）に結合する能力を含むがそれらに限定
されない。
【００５０】 本発明の好ましい核酸フラグメントはまた、以下のフォリスタチン−３のドメ
インを１以上コードする核酸分子を含む：配列番号２のアミノ酸残基７〜１６、
３４〜４５、７８〜８６、９１〜１００、１０８〜１２２、１３１〜１４５、１
５６〜１６９、１８４〜１９２、および１９６〜２１０。
【００５１】 特定の実施態様において、本発明のポリペプチドフラグメントは、抗原性領域
をコードする。フォリスタチン−３特異的抗体を生成するために使用され得る抗
原性ポリペプチドもしくはペプチドの非限定的な例は、以下のアミノ酸残基を含
むポリペプチドを含む：配列番号２のＬｅｕ−１４〜Ａｌａ−２０、Ｓｅｒ−４
６〜Ｉｌｅ−５５、Ｇｌｙ−８８〜Ｐｒｏ−９７、Ｇｌｙ−１１３〜Ｌｅｕ−１
３３、Ａｒｇ−１３８〜Ｇｌｕ−１４６、Ｐｒｏ−１７７〜Ｔｈｒ−１９１、お
よびＧｌｙ−２１９〜Ｖａｌ−２３７。
【００５２】 さらなる実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、フォリスタチン−
３の属性をコードする。本発明の好ましい実施態様は、この点に関して、フォリ
スタチン−３のαヘリックスおよびαヘリックス形成領域（「α領域」）、βシ
ートおよびβシート形成領域（「β領域」）、ターンおよびターン形成領域（「
ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域（「コイル領域」）、親水性領域
、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可撓性領域、表面形成領域お
よび高度抗原性指標領域を含むフラグメントを含む。
【００５３】 図３および／または表Ｉに示すフォリスタチン−３の構造または属性を示すデ
ータは、上記のようなデフォルトパラメータに設定したＤＮＡ*ＳＴＡＲの種々 のモジュールおよびアルゴリズムを使用して生成した。好ましい実施態様におい
て、表Ｉの列ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、およびＸＩＶに示されるデータは、抗
原性について高い程度を示すフォリスタチン−３の領域を決定するのに使用され
得る。列ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩＩ、および／またはＩＶにおいて示すデータか
ら、抗原認識が免疫応答の開始のプロセスにおいて生じ得る環境においてそのポ
リペプチドの表面に暴露されるようであるそのポリペプチドの領域を示す値を選
択することによって、高い抗原性の領域が決定される。
【００５４】 これらの点において特定の好ましい領域は図３に示されるが、この領域は、表
Ｉに示されるように、図３に示されるデータの表の表示を用いることによっても
また、表現されるかまたは表され得る。図３を生成するために使用されるＤＮＡ * ＳＴＡＲコンピューターアルゴリズム（もともとのデフォルトパラメーターで 使用される）は、このような表の形式において図３でデータを表示するために使
用される（表Ｉを参照のこと）。図３におけるデータの表の形式は、好ましい領
域の特異的な境界を容易に決定するために使用され得る。
【００５５】 図３および表Ｉに示される上記の好ましい領域は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに
示されるアミノ酸配列の分析によって同定される上記のタイプの領域を含むが、
これらに限定されない。図３および表Ｉに示されるように、このような好ましい
領域は、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、および
コイル領域、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびコイル領域、Ｋ
ｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒ
ｇのα両親媒性領域およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可
撓性領域、Ｅｍｉｎｉの表面形成領域、ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高
度な抗原性指標を含む。
【００５６】 この点に関して非常に好ましいフラグメントは、とりわけ、上記および表Ｉに
示される、２、３、４、５以上の特徴のようないくつかの構造的特徴を合わせる
フォリスタチン−３の領域を含むものである。
【００５７】
【表１Ａ】
【００５８】
【表１Ｂ】
【００５９】
【表１Ｃ】
【００６０】
【表１Ｄ】
【００６１】
【表１Ｅ】 別の局面において、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条
件下で、上記の本発明の核酸分子（例えば、ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含
まれるｃＤＮＡクローン、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号２）に示すアミノ
酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
配列、またはそれらの（本明細書において記載されるような）フラグメント（す
なわち、一部））中のポリヌクレオチドの一部にハイブリダイズするポリヌクレ
オチドを含む、単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリ
ダイゼーション条件」によって、以下を含む溶液中での４２℃での一晩のインキ
ュベーション、続いて約６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄が意
図される：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭ
クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デン
ハート溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精
子ＤＮＡ、次いで６５℃での０．１×ＳＳＣ中でのそのフィルターの洗浄。
【００６２】 ポリヌクレオチドの１「部（分）」にハイブリダイズするポリヌクレオチドに
よって、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そし
てより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３
０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０（例えば５０）ｎｔにハイブ
リダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される
。これらは、上記で議論され、そして以下でより詳細に議論されるような診断用
プローブおよびプライマーとして有用である。
【００６３】 例えば、「少なくとも２０ｎｔ長」のポリヌクレオチドの部分により、参照ポ
リヌクレオチドのヌクレオチド配列（例えば、寄託されたｃＤＮＡ、または図１
Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示されるようなヌクレオチド配列）由来の
２０以上の連続したヌクレオチドが意図される。もちろん、ポリＡ配列（例えば
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示されるフォリスタチン−３ ｃＤＮ
Ａの３’末端ポリ（Ａ）付加物）に、またはＴ（もしくはＵ）残基の相補的なス
トレッチにのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本発明の核酸の部分に
ハイブリダイズするために使用される本発明のポリヌクレオチドに含まれない。
なぜなら、このようなポリヌクレオチドは、ポリ（Ａ）ストレッチを含む任意の
核酸分子またはその相補体（例えば現実的には任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）
にハイブリダイズするからである。
【００６４】 好ましい実施態様において、本明細書において開示された参照ポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番
号１）に示されるポリヌクレオチド配列、または（寄託物（ＨＤＴＡＨ８５）に
含まれるクローンによってコードされるフォリスタチン−３ポリペプチドの成熟
形態と、実質的に同じ機能的もしくは生物学的活性のいずれかを保持するポリペ
プチドをコードする。
【００６５】 別の実施態様は、参照ポリヌクレオチド（すなわち、本明細書において開示さ
れたポリヌクレオチド配列）にハイブリダイズするが生物学的活性を保持しない
ポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、生物学的活性を保持
しないが、それらは、例えば、配列番号１のポリヌクレオチドのためのプローブ
、そのポリヌクレオチドの回収、診断プローブおよびＰＣＲプライマーとしての
ような用途を有する。
【００６６】 示されるように、フォリスタチン−３ポリペプチドをコードする本発明の核酸
分子は、それ自体成熟ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子；およ
び成熟ポリペプチドおよびさらなる配列のコード配列、例えば約２６アミノ酸の
リーダーまたは分泌配列（例えばプレタンパク質、またはプロタンパク質、また
はプレプロタンパク質配列）をコードするもの；上記のさらなる配列を有するか
有さない成熟ポリペプチドのコード配列を含み得るがこれらに限定されない。
【００６７】 本発明の核酸によってはまた、例えば、イントロンおよび非コード５’および
３’配列（転写、ｍＲＮＡプロセシングにおいて役割（例えばリボソーム結合お
よびｍＲＮＡの安定性）を果たす転写非翻訳配列（例えば、スプライシングおよ
びポリアデニル化シグナルを含む）を含むがこれらに限定されない、さらなる非
コード配列；追加アミノ酸をコードするさらなるコード配列（例えばさらなる機
能性を提供するもの）とともに上記のタンパク質配列もコードされる。
【００６８】 従って、このポリペプチドをコードする配列は、マーカー配列（例えば、融合
ポリペプチドの精製を促進するペプチドをコードする配列）と融合され得る。本
発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、このマーカーアミノ酸配列
は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、とりわけｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥ
Ｎ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃ
Ａ，９１３１１）に提供されるタグを含み、多くのものは市販されている。Ｇｅ
ｎｔｚおよび共同研究者、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
６：８２１−８２４（１９８９）中に記述されるように、例えば、ヘキサヒスチ
ジンは融合タンパク質の簡便な精製のために提供される。「ＨＡ」タグは、Ｗｉ
ｌｓｏｎおよび共同研究者によりに記述されているインフルエンザ血球凝集素タ
ンパク質（Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））に由来するエピトープと対応
する、精製に有用な別のペプチドである。以下に議論するように、他のこのよう
な融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端でＦｃに融合したフォリスタチン−３を含
む。
【００６９】 本発明はさらに、本発明の核酸分子の改変体に関し、これはフォリスタチン−
３ポリペプチドの部分、アナログまたは誘導体をコードする。改変体は、天然の
対立遺伝子改変体のように天然に存在し得る。「対立遺伝子改変体」により、生
物の染色体上の所定の遺伝子座を占有する遺伝子の幾つかの代替形態のひとつが
意図される（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ
＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。天然に存在しない改変体は、
当該分野において公知の変異誘発技術を使用して産生され得る。
【００７０】 このような改変体は、ヌクレオチドの置換、欠失または付加により生成した改
変体を含む。置換、欠失または付加は１つ以上のヌクレオチドを含み得る。この
改変体は、コード領域、非コード領域または両方で変更され得る。そのコード領
域での変化は、保存性または非保存性のアミノ酸の置換、欠失または付加を生成
し得る。これらの中で特に好ましいものは、サイレントな置換、付加および欠失
であり、これはフォリスタチン−３タンパク質またはその部分の特性および活性
を変化させない。この関連で特に好ましいものもまた、保存的置換である。
【００７１】 最も高度に好ましいものは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する成熟
タンパク質、または寄託したｃＤＮＡクローンによりコードされる成熟フォリス
タチン−３アミノ酸配列をコードする核酸分子である。
【００７２】 さらなる実施態様は、以下からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対し
て、少なくとも９０％同一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、
９７％、９８％もしくは９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを含む単離された核酸分子を含む：（ａ）配列番号２の完全アミノ酸配列を有
するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち
、配列番号２の−２６〜２３７）；（ｂ）Ｎ末端メチオニンを除く、配列番号２
の完全アミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列（すなわち、配列番号２の−２５〜２３７位）；（ｃ）配列番号２
の１〜２３７位のアミノ酸配列を有する推定成熟フォリスタチン−３ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列；（ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含ま
れるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列を有するフォリス
タチン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番
号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる、Ｎ末端メチ
オニンを除く完全アミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列；（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤ
ＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−
３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および（ｇ）上記の（ａ）、（
ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のヌクレオチド配列のいずれかに
対して相補的なヌクレオチド配列。
【００７３】 本発明のさらなる実施態様には、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（
ｅ）、（ｆ）もしくは（ｇ）の任意のヌクレオチド配列に、少なくとも９０％同
一、およびより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは
９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、または上記の（ａ）
、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）もしくは（ｇ）のポリヌクレオチド
にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリ
ヌクレオチドを含む単離された核酸分子が含まれる。ハイブリダイズするこのポ
リヌクレオチドは、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有
するポリヌクレオチドに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で
ハイブリダイズしない。本発明のさらなる核酸実施態様は、上記の（ａ）、（ｂ
）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）もしくは（ｆ）のアミノ酸配列を有するフォリスタ
チン−３ポリペプチドのエピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチドを含む、単離された核酸分子に関する。本発明のさらなる核酸の実施
態様は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むが、５０のアミノ酸置換よ
りは多くなく、さらにより好ましくは、４０の保存性アミノ酸置換よりは多くな
く、なおより好ましくは３０の保存性アミノ酸置換よりは多くなく、なおさらに
より好ましくは、２０の保存性アミノ酸置換よりは多くない、アミノ酸配列を有
するフォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオ
チドを含む単離された核酸分子に関する。もちろん、増大する好ましさの順に、
７〜１０、５〜１０、３〜７、３〜５、２〜５、１〜５、１〜３、１０、９、８
、７、６、５、４、３、２、または１より多くない保存性アミノ酸置換を含むア
ミノ酸配列を有することが、フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列を
コードするポリヌクレオチドにとっては非常に好ましい。
【００７４】 本発明はまた、本発明の単離された核酸分子を含む組換えベクター、およびこ
の組換えベクターを含む宿主細胞、ならびにこのようなベクターおよび宿主細胞
を作製する方法、および組換え技術によりフォリスタチン−３ポリペプチドまた
はペプチドを生成するためにそれらを使用する方法に関する。
【００７５】 フォリスタチン−３ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列に、例え
ば、少なくとも９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに
よって、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、フォリスタチン−３ポリ
ペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つ
までの点変異をポリヌクレオチド配列が含み得ることを除いて、参照配列に同一
であることが意図される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配
列における５％までのヌクレオチドが欠失され得るか、もしくは別のヌクレオチ
ドで置換され得るか、または参照配列において全ヌクレオチドの５％までの多く
のヌクレオチドが、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参
照ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位置において、またはこれらの末端
位置の間の任意の位置で、参照配列中のヌクレオチド間で個々にもしくは参照配
列内の１つ以上の連続した群としてのいずれかで散在されて生じ得る。
【００７６】 実際には、任意の特定の核酸分子が例えば図１Ａ，１Ｂおよび１Ｃに示される
ヌクレオチド配列または寄託されたｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列に少な
くとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどう
かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏ
ｎ，ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来
どおり決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，
Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４
８２−４８９ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列
間の最も相同性の高いセグメントを見出す。特定の配列が、例えば、本発明に従
う参照配列と９５％同一かどうかを決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意
の他の配列整列プログラムを使用する場合、そのパラメーターは、もちろん、全
長の参照ヌクレオチド配列にわたって同一性のパーセンテージが計算されるよう
に、そして参照配列のヌクレオチドの全体数の５％までの、相同性におけるギャ
ップが可能なように設定される。問合せ配列（本発明の配列）と対象配列（ｓｕ
ｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間で最善の全体にわたるマッチングを決定
する好ましい方法はまた、包括的配列整列と呼ばれるが、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃ
ｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５（１９９０））のアルゴリ
ズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定され得る。
配列整列において、問合せ配列および対象配列は共にＤＮＡ配列である。ＲＮＡ
配列はＵをＴに変えて比較し得る。上記の包括的配列整列の結果は同一性のパー
セントである。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列中で使用され、同一性パーセント
を計算する好ましいパラメーターは以下の通りである：マトリックス（Ｍａｔｒ
ｉｘ）＝Ｕｎｉｔａｒｙ、Ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌ
ｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏ
ｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ
Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄ
ｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか短い方。
【００７７】 対象配列が、内部欠失のためではなく、５’または３’欠失のため問合せ配列
よりも短いときは、結果に対して手動修正がなされるべきである。これは同一性
パーセントを計算する場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは対象配列の５’または３
’切断を考慮しないからである。問合せ配列と比較して、５’または３’末端で
切断された対象配列については、同一性パーセントは、対象配列の５’または３
’側であるマッチング／整列していない問合せ配列の塩基数を、問合せ配列の全
塩基のパーセントとして計算することによって修正される。ヌクレオチドがマッ
チング／整列しているかどうかは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果により決定され
る。次にこの百分率は特定パラメーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラ
ムにより計算された同一性パーセントから差し引かれる、最終同一性パーセント
スコアに達する。この修正されたスコアが、本発明の目的のために用いられるも
のである。ＦＡＳＴＤＢ整列により表されるような問合せ配列とマッチング／整
列しない、対象配列の５’および３’塩基の外側の塩基のみ、同一性パーセント
スコアを手で調整する目的で計算される。
【００７８】 例えば、９０塩基の対象配列は、同一性パーセントを決定するために、１００
塩基の問合せ配列に対して整列される。対象配列の５’末端で欠失がおこり、そ
のため、ＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基のマッチング／整列を
示さない。この１０個の対合しない塩基は、配列の１０％（５’および３’末端
でマッチングしない塩基の数／問合せ配列の全塩基数）を表し、よって１０％は
、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセントスコアから差し引
かれる。残りの９０塩基が完全に適合するなら、最終同一性パーセントは９０％
である。別の例では、９０塩基の対象配列は、１００塩基の問合せ配列と比較さ
れる。このとき欠失は内部欠失であるから、問合せ配列とマッチング／整列しな
い塩基は対象配列の５’または３’上にない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計
算された同一性パーセントは手動修正されない。繰り返すと、問合せ配列とマッ
チング／整列しない対象配列の５’および３’塩基のみ手動修正される。他の手
動修正は本発明の目的のためには行われない。
【００７９】 本出願は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示される核酸配列または
寄託されたｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、
９８％または９９％同一である核酸分子に関し、それらがフォリスタチン−３活
性を有するポリペプチドをコードするか否かとは無関係である。これは、特定の
核酸分子がフォリスタチン−３活性を有するポリペプチドをコードしない場合で
さえ、当業者はなお、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーのような核酸分子の使用方法を知っているから
である。フォリスタチン−３活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の
核酸分子の使用としては、とりわけ、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブ
ラリーにおけるフォリスタチン−３遺伝子またはその対立遺伝子改変体の単離；
（２）Ｖｅｒｍａら，Ｈｕｍａｎ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されるような、フォリスタチン−３遺伝子
の正確な染色体位置を提供するための中期染色体展開物へのインサイチュハイブ
リダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）；および特定の組織でのフォリスタ
チン−３ ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット解析。
【００８０】 しかし、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示される核酸配列または寄
託されたｃＤＮＡの核酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９
８％または９９％同一の配列を有する核酸分子であって、実際フォリスタチン−
３タンパク質活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が好ましい。「フ
ォリスタチン−３活性を有するポリペプチド」により、特定の生物学的アッセイ
によって測定した場合に、本発明の成熟フォリスタチン−３タンパク質の活性に
類似するが同一である必要はない活性を提示するポリペプチドが意図される。例
えば、本発明のフォリスタチン−３タンパク質は、アクチビンレセプターに対す
るアクチビンの結合を阻害する。アクチビンレセプター結合阻害アッセイは、Ｈ
ａｓｈｉｍｏｔｏら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３８５５−１３８４
２（１９９７））によって記載されている。手短には、このアッセイは、ラット
下垂体細胞（５×１０5細胞）を、［125Ｉ］−アクチビンＡ（４０ｎｇ／ｍｌ；
アクチビンＡは、Ｈａｓｅｇａｗａら（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｊａｐａｎ ３
３：６４５−６５４（１９８６）に記載のようなクロラミン−Ｔ方法およびフォ
リスタチン−３またはそのムテイン（２００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、標識される
）の存在下で２４ウェルプレート中で培養することを含む。アクチビン結合のベ
ースラインは、フォリスタチン−３の非存在下で二官能性化学架橋剤ジスクシン
イミジルスベレート（ＤＳＳ）を用いた［125Ｉ］アクチビンＡの下垂体細胞へ の親和性架橋によって決定される。架橋は、結合緩衝液（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ
（ｐＨ７．４）および０．２％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭ）を用いて細
胞を一回洗浄すること、およびこの結合緩衝液中で４０ｎｇ／ｍｌの［125Ｉ］ アクチビンＡと２時間氷上でインキュベートすることによって達成される。イン
キュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳを用いて３回洗浄し、そして１ｍＭ ＤＳ
Ｓを含むＰＢＳ中で２０分間氷上でインキュベートする。次いで、この反応を、
ＰＢＳでクエンチする。この細胞を、剥離することによって培養ディッシュから
取り出し、そしてＴｒｉｓ溶液（２ｍＭ ＥＤＴＡ，５ｍＭ ベンズアミジン、
２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ），２ｍＭ Ｎ−エチ
ルマレイミド（ｅｔｈｙｌａｌｅｉｍｉｄｅ）および２ｍＭ ジイソプロピルフ
ルオロホスフェートを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２））でリン
スし、遠心分離し、可溶化緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、
５ｍＭ ベンズアミジン、２ｍＭ ＰＭＳＦ、２ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド、
２ｍＭ ジイソプロピルフルオロホスフェート、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
、および１０％グリセロールを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）
）に再懸濁する。そして１時間氷上で穏やかに攪拌する。この細胞溶解物を、２
％ ＳＤＳに導入し、そして１０分間１００℃で煮沸する。次いで、得られた親
和性標識溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％または８％のゲル）に供する。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ後に、ゲルを固定し、０．２５％のクーマシーブリリアントブル
ーＲ−２５０で染色し、風乾し、次いでオートラジオグラフィーによって可視化
した。アクチビンレセプターのアクチビン結合の阻害を、それとともにフォリス
タチン−３またはそのムテイン（２００ｎ／ｍｌ）が上記の結合緩衝液でのイン
キュベーションにおいて標識されたアクチビンとインキュベートされるサンプル
において分析する。親和性架橋アクチビン／アクチビンレセプター複合体の形成
が減少する程度は、フォリスタチン−３またはそのムテインが標識されたアクチ
ビンタンパク質に結合する能力と相関する。そのようなものとして、アクチビン
のそのレセプター対フォリスタチン−３もしくはそのムテインに対する相対的結
合親和性が定量され得る。そのような活性は、所定の系に存在するアクチビンの
有効量を調節するために有用である。
【００８１】 フォリスタチン−３は、上記に記載のアッセイにおいて用量依存的な様式でア
クチビンに結合する。本発明のポリペプチドは、用量依存性フォリスタチン−３
活性を、バイオアッセイにおいて示す必要はないが、「フォリスタチン−３活性
を有するポリペプチド」によって、上記のアッセイにおいて、用量依存的な様式
で、同じ結合活性のいずれかもまた示すポリペプチドを意味することが好ましい
。したがって、用量依存的な活性の程度は、フォリスタチン−３のものとは同一
である必要はなく、最も好ましくは、「フォリスタチン−３活性を有するポリペ
プチド」は、フォリスタチン−３と比較して、所定の活性において実質的に類似
の用量依存性を示す（すなわち、候補ポリペプチドは、参照フォリスタチン−３
と比較して、より大きな活性もしくは、約２５分の１以上の活性を示し、好まし
くは、約１０分の１以上の活性を示す）。
【００８２】 フォリスタチン−１のように、フォリスタチン−３は、ＦＳＨの分泌を阻害す
る。初代培養ラット下垂体細胞からの自発的なＦＳＨ放出の抑制を測定するため
のアッセイは、当該分野で周知である（Ｈａｓｅｇａｗａ、Ｙ．ら、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌ． Ｊｐｎ． ３３：６４５−６５４（１９８６））。手短には、新
たに単離した下垂体細胞を、ゲンタマイシン（３５μｇ／ｍＬ）、フンジゾン（
ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（１μｇ／ｍＬ）、０．０５％グルタミン、０．１％重炭
酸ナトリウム、１０％ウマ血清、および２．５％ウシ胎仔血清を含有するＤＭＥ
Ｍに、３×１０5細胞／０．２ｍＬの密度で懸濁し、そして９６ウェルの培養プ レート（６×１０4細胞／０．２ｍＬ／ウェル）にプレートする。次いで，種々 の量（０．１〜１００ｎｇ／ｍＬ）のフォリスタチン−３を培養培地に添加する
。３７℃（５％ＣＯ2）で３日間培養した後、培養した培地をＲＩＡキットを用 いて二重抗体ＲＩＡ方法によって、分泌されたＦＳＨの定量のためにアッセイし
、そしてこれを分泌されたＦＳＨ（ｎｇ／ｍｌ／７２時間）対添加したタンパク
質（ｎｇ／ｍＬ）としてプロットする。
【００８３】 もちろん遺伝コードの縮重により、当業者は寄託したｃＤＮＡの核酸配列また
は図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示される核酸配列と少なくとも９０
％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である配列を有する多数
の核酸分子が「フォリスタチン−３タンパク質活性を有する」ポリペプチドをコ
ードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重改変体
は全て同じポリペプチドをコードするので、このことは上記の比較アッセイを実
施しなくとも当業者に明らかである。縮重改変体でないこのような核酸分子につ
いても、妥当な数のものがフォリスタチン−３タンパク質活性を有するポリペプ
チドをコードすることはまた、当該分野においてさらに認識される。これは、以
下にさらに記載するように、タンパク質の機能に顕著な効果を与える可能性が低
いかまたは与えそうにないアミノ酸置換（例えば、一つの脂肪族アミノ酸を第二
の脂肪族アミノ酸で置換すること）を当業者らは十分に知っているからである。
【００８４】 （ベクターおよび宿主細胞） 本発明のフォリスタチン−３ポリペプチド（フラグメント、改変体誘導体およ
びアナログを含む）は化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１
９８３、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｎ．Ｙ．）
が、フォリスタチン−３ポリペプチドは、有利には、遺伝子配列および／または
核酸コード配列を発現するための当該分野で周知の技術を用いて、組換えＤＮＡ
技術によって産生され得る。このような方法を用いて、本発明のポリヌクレオチ
ドならびに適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築し得る
。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびイ
ンビボ遺伝子組み替えを含む。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前出；
Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９、前出；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、１９８０、Ｎｕｃ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５−２３３；Ｃｒｅａおよ
びＨｏｒｎ、１９８０、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１０）：２３３１；
ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８０、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２１：７１９；ＣｈｏｗおよびＫｅｍｐｅ、１９８１、
Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１２）：２８０７−２８１７を参照のこと。
あるいは、フォリスタチン−３配列を生成し得るＲＮＡは、例えば、合成機を用
いて化学合成され得る。例えば、「Ｏｌｉｃｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ」、１９８４、Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆ
ｏｒｄに記載される技術を参照のこと。この文献は本明細書においてその全体が
参考として援用される。
【００８５】 従って、１つの実施態様において、本発明は、本発明の単離されたＤＮＡ分子
（すなわち、ポリヌクレオチド）を含むベクター、この組換えベクターで遺伝子
操作された宿主細胞、ならびにこれらの宿主細胞または本発明のポリペプチドを
発現するための当該分野で公知の技術を用いて他の方法で遺伝子操作された宿主
細胞を用いて、組換え技術によるフォリスタチン−３ポリペプチドまたはそのフ
ラグメントの産生に関する。このベクターは、例えば、ファージベクター、プラ
スミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターであり得る
。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損であり得る。後
者の場合、ウイルス増殖は一般的に相補的な宿主細胞においてのみ起こる。
【００８６】 このポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために、選択マーカーを含むベ
クターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈
澱物のような沈澱物中か、または荷電された脂質との複合体中で導入される。ベ
クターがウイルスである場合、ベクターは、適切なパッケージング細胞株を用い
てインビトロでパッケージングされ得、次いで宿主細胞に形質導入され得る。
【００８７】 １つの実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ファージλ
ＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプ
ロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬ
ＴＲのプロモーターなどのような、適切な異種調節エレメント（例えば、プロモ
ーターもしくはエンハンサーまたはその両方）に作動可能に結合されるべきであ
る。他の適切なプロモーターは、当業者に公知である。
【００８８】 ベクターが発現構築物を含む実施態様において、これらの構築物は、転写開始
のための部位、終結のための部位、および転写された領域において翻訳のための
リボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコード部
分は、好ましくは、翻訳されるポリペプチドの最初の翻訳開始コドンおよび翻訳
されるポリペプチドの最後に適切に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたは
ＵＡＧ）を含む。
【００８９】 示されるように、発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカ
ーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ
葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、ならびにＥ．ｃｏｌｉ
および他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイ
シン耐性遺伝子、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代
表的な例としては、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞）；真
菌細胞（例えば酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細
胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞）；動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞
、ＣＯＳ細胞、２９３細胞、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞）；ならびに植物
細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培
養培地および条件は当該分野で公知である。
【００９０】 細菌における使用に好ましいベクターの中には、ｐＨＥ４−５、ｐＱＥ７０、
ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，前出）；ｐＢＳベク
ター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮ
Ｈ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。好ましい真核生物ベクター
の中には、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳ
Ｇ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およ
びｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がある。他の適切なベクターは、当業者に容
易に明らかである。
【００９１】 宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥ
ＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフ
ェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の方法によって
もたらされ得る。このような方法は、多くの標準的研究室マニュアルに記載され
ている（例えば、Ｄａｖｉｓら， Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））。
【００９２】 本明細書において議論されたベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに
加えて、本発明はまた、脊椎動物起源の一次、二次、および不死化された宿主細
胞、特に、哺乳動物起源のものを含む。これらの細胞は、内因性遺伝物質（例え
ば、フォリスタチン−３コード配列）を欠失するかもしくは置換し、そして／ま
たは本発明のフォリスタチン−３ポリヌクレオチドと作動可能に連結し、そして
内因性フォリスタチン−３ポリヌクレオチドを活性化、変更および／または増幅
する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含む。例えば、当該分野
で公知の技術を使用して、異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／または
エンハンサー）および内因性フォリスタチン−３ポリヌクレオチド配列を、相同
組換え（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行
）；国際公開第ＷＯ９６／２９４１１（１９９６年９月２６日公開）；国際公開
ＷＯ９４／１２６５０（１９９４年８月４日公開）；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２〜８９３５（１９８９
）；ならびにＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１
９８９）、これらの開示は本明細書においてその全体が参考として援用される）
によって作動可能に連結し得る。
【００９３】 このポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で発現され得、
そして分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能的領域も含み得る。例えば
、さらなるアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、宿主細胞における、精製の間
の、または続く取り扱いおよび保存の間の、安定性および持続性を改善するため
に、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易
にするためにポリペプチドへ付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの
最終調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌または排出を生じるため、安定性
を改善するため、および精製を容易にするためのペプチド部分のポリペプチドへ
の付加は、当該分野でよく知られており、そして慣用技術である。好ましい融合
タンパク質は、タンパク質の安定化および精製のために有用な免疫グロブリン由
来の異種領域を含む。例えば、ＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３３（カナダ対応出願
第２０４５８６９号）は、別のヒトタンパク質、またはその一部とともに免疫グ
ロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質を開示する。多くの
場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、治療および診断における使用に十分に有
利であり、従って、例えば改善された薬物動態学的特性を生じる（ＥＰ−Ａ ０
２３２ ２６２）。一方、いくつかの使用について、融合タンパク質が、記載さ
れる有利な様式で、発現され、検出され、そして精製された後に、Ｆｃ部分を欠
失し得ることが望ましい。これは、Ｆｃ部分が、治療および診断における使用に
対して障害となると判明する場合（例えば、融合タンパク質が免疫のための抗原
として使用されるべき場合）である。薬物探索において、例えばｈＩＬ−５のよ
うなヒトタンパク質は、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するための高処理能
力スクリーニングアッセイの目的で、Ｆｃ部分と融合されている（Ｂｅｎｎｅｔ
ｔ，Ｄ．ら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：５２−５
８（１９９５）；Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０
：９４５９−９４７１（１９９５））。
【００９４】 フォリスタチン−３タンパク質は、硫酸アンモニウム沈澱またはエタノール沈
降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロー
スクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチン
クロマトグラフィーを含む周知の方法によって組換え細胞培養物から回収され、
そして精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬ
Ｃ」）が精製のために用いられる。本発明のポリペプチドは以下を含む：天然の
供給源からの精製産物（直接的に単離されたか、または培養されたかのいずれか
の、体液、組織、および細胞を含む）；化学合成手順の産物；および原核生物宿
主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞
、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物。組換え
産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドは、グリコ
シル化されていてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、
本発明のポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として
、最初の改変されたメチオニン残基を含み得る。従って、一般的に翻訳開始コド
ンによってコードされているＮ末端メチオニンは、すべての真核細胞において翻
訳後に任意のタンパク質から高い効率で除去されることが当該分野において周知
である。大部分の原核細胞においても、大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニ
ンは効率的に除去されるが、いくつかのタンパク質では、この原核生物の除去プ
ロセスは、Ｎ末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質に依存して、非
効率的である。
【００９５】 本発明の範囲には、翻訳の間またはその後に示差的な改変（例えば、グリコシ
ル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導
体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドへの連結など
）がなされているフォリスタチン−３ポリペプチドが含まれる。多数の化学的改
変のいずれかが、公知の技術によって実施され得る。これには、臭化シアン、ト
リプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特
異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下
での代謝合成などを含むがこれらに限定されない。特定の実施態様において、本
発明の組成物は、その水溶性（例えば、ポリエチレングリコール）、半減期、ま
たは標的化組織への結合能力を増加させるために他の分子と結合させる。
【００９６】 （ポリペプチドおよびフラグメント） 本発明はさらに、寄託されたｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、も
しくは配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたフォリスタチン−３ポリ
ペプチド、または上記ポリペプチドのフラグメント（すなわち、一部）を含むペ
プチドまたはポリペプチドを提供する。
【００９７】 本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは、単離された形
態で提供され、そして好ましくは、ほぼ完全な均質性（例えば、９０％純粋を超
える）から完全な均質性（例えば、９９％を超える）の範囲の点にまで精製され
る。用語「単離された」とは、その物質が、そのもとの環境から（例えば、その
物質が天然に存在する場合には天然の環境）から取り出されたことを意味する。
例えば、生存する動物に存在する、天然に存在するポリヌクレオドまたはポリペ
プチドは、単離されていないが、天然の系において同時に存在する材料のいくつ
かまたはすべてから分離されている同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは
単離されている。「単離されたポリペプチド」として意図されるのは、組換え宿
主細胞から部分精製または実質的に精製されたポリペプチドである。例えば、フ
ォリスタチン−３の組換え産生されたバージョンは、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎ
ｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９８８））によって記載される１工程
方法によって実質的に精製され得る。このようなポリヌクレオチドは、ベクター
の部分であり得、そして／またはこのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドは、組成物の部分であり得、そしてなおこのようなベクターまたは組成物が天
然の環境の部分ではないという点で単離され得る。本発明に従う、単離されたポ
リペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、天然にまたは合成的に生成されたこ
のような分子を含む。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドはまた、天
然または組換え供給源から、当該分野で公知の方法を用いて慣用的に生成および
利用され得る、本発明の抗フォリスタチン−３抗体を用いて精製され得る。
【００９８】 本発明はまた、上記のフォリスタチン−３ポリペプチドのフラグメントを含む
。本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２に含まれるアミノ酸配列、
寄託クローンに含まれるｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列、または寄
託クローンに含まれるヌクレオチド配列に（例えば、ストリンジェントなハイブ
リダイゼーション条件下で）ハイブリダイズする核酸によってコードされるアミ
ノ鎖配列、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号１）に示されるもの、もしくはそ
の相補鎖によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００９９】 本発明のポリヌクレオチドフラグメントは、機能的な活性を示すポリペプチド
をコードする。「機能的活性」を示すポリペプチドとは、完全、成熟または活性
形態のフォリスタチン−３ポリペプチドに関連する、１以上の公知の機能的活性
を示し得るポリペプチドを意味する。このような機能的活性は、生物学的活性（
（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）合成経路を調節すること、エストラジオ
ール産生を増加させること、アクチビンを結合すること、性腺刺激ホルモンの生
合成および分泌を刺激すること、卵巣および胎盤のステロイド生成を調節するこ
と、および卵母細胞および精原細胞成熟因子））、抗原性（抗フォリスタチン−
３抗体に対する結合（もしくはフォリスタチン−３ポリペプチドと、結合につい
て競合する）能力）、免疫原性（フォリスタチン−３ポリペプチドに結合する抗
体を生成する能力）、他のフォリスタチン−３またはインヒビンまたはＴＧＦ−
βポリペプチドとポリマーを形成する能力、およびフォリスタチン−３ポリペプ
チドについてレセプターまたはリガンド（例えば、アクチビン）に結合する能力
を含むがそれらに限定されない。
【０１００】 ポリペプチドフラグメントは、「遊離のまま」であり得るか、またはそのフラ
グメントが部分もしくは領域を形成するより大きなポリペプチド内に、最も好ま
しくは、単一の連続する領域として含まれ得る得、本発明のポリペプチドフラグ
メントの代表例は、例えば、以下のおよそのアミノ段残基を含むかまたはそれか
らなる、フラグメントを含む：配列番号２の１〜２０、２１〜４０、４１〜６０
、６１〜８３、８４〜１００、１０１〜１２０、１２１〜１４０、１４１〜１６
０、１６１〜１８０、１８１〜２００、２０１〜２２０、２０１〜２２４、２１
０〜２３１、２２１〜２４０、または２４１〜２６３。さらに、ポリペプチドフ
ラグメントは、少なくともおよそ２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、
９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１
８０．１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０アミ
ノ酸長であり得る。この文脈で、「およそ（約）」は、特に陳述した範囲、いく
つかの（例えば、５、４、３、２または１）アミノ酸より大きいまたはより小さ
いか、それらの片端またはその両端を含む。
【０１０１】 他の実施態様において、本発明のフラグメントまたはポリペプチド（すなわち
、本明細書において記載されているもの）は、２５０、２２５、２００、１８５
、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５
，１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９０、８０、７
５、６０、５０、４０、３０または２５アミノ酸残基長より大きくない。
【０１０２】 さらなる実施態様は、本明細書において使用される場合、において記載される
ように図３および表１において開示されるとおり、本発明のフォリスタチン−３
ポリペプチドの１、２、３、４、５以上の機能属性、例えば、１以上の、Ｇａｒ
ｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎのα領域、β領域、ターン領域、およびコイル領域、Ｃ
ｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎのα領域、β領域、およびコイル領域、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏ
ｌｉｔｔｌｅの親水性領域および疎水性領域、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇのα両親媒性
領域およびβ両親媒性領域、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｚの可撓性領域、Ｅｍ
ｉｎｉの表面形成領域、ならびにＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆの高度な抗原性指標
、あるいはそれらの任意の組合せを含む。
【０１０３】 本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基７〜１６、３４
〜４５、７８〜８６、９１〜１００、１０８〜１２２、１３１〜１４５、１５６
〜１６９、１８４〜１９２、および／または１９６〜２１０を含むかまたは代替
的にそれらからなる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはま
た、高度にストリンジェントな条件（例えば、本明細書において記載されるよう
に）でこれらのコードポリヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズするポリヌク
レオチド、およびこれらのハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコード
されるポリペプチドと同様に本発明に包含される。
【０１０４】 特定の実施態様において、本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号２
のアミノ酸残基Ｌｅｕ−１４〜Ａｌａ−２０、Ｓｅｒ−４６〜Ｉｌｅ５５、Ｇｌ
ｙ−８８〜Ｐｒｏ−９７、Ｇｌｙ−１１３〜Ｌｅｕ−１３３、Ａｒｇ−１３８〜
Ｇｌｕ−１４６、Ｐｒｏ−１７７〜Ｔｈｒ−１９１、および／またはＧｌｙ−２
１９〜Ｖａｌ−２３７を含むか、または代替的にそれらからなる。これらのポリ
ペプチドフラグメントは、上記の図３および表Ｉにおいて示されるように、Ｊａ
ｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原指標の分析によってフォリスタチン−３の抗原性エピ
トープを有することが決定された。これらのポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドもまた、高度にストリンジェントな条件（例えば、本明細書において記
載されるように）でこれらのコードポリヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズ
するポリヌクレオチド、およびこれらのハイブリダイズするポリヌクレオチドに
よってコードされるポリペプチドと同様に本発明に包含される。
【０１０５】 以下に詳細に記載されるように、本発明のポリぺプチドはまた、以下に記載さ
れるフォリスタチン−３タンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて、ま
たはフォリスタチン−３タンパク質機能を増強もしくは阻害し得るアゴニストお
よびアンタゴニストとして有用である、ポリクローナル抗体およびモノクローナ
ル抗体を惹起するために使用され得る。さらに、このようなポリぺプチドは、酵
母ツーハイブリッド系において、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニ
ストでもあるフォリスタチン−３タンパク質結合タンパク質を「捕捉」するため
に使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇ（Ｎ
ａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６（１９８９））に記載される。
【０１０６】 別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドのエピトープ保有部分を
含むペプチドまたはポリペプチドを提供する。このポリペプチド部分のエピトー
プは、本発明のポリペプチドの免疫原性または抗原性エピトープである。「免疫
原性エピトープ」は、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を
誘発するタンパク質の一部として定義される。他方では、抗体が結合し得るタン
パク質分子の領域は、「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原
性エピトープの数は、一般には、抗原性エピトープの数よりも少ない（例えば、
Ｇｅｙｓｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８
１：３９９８−４００２（１９８３）を参照のこと）。
【０１０７】 抗原性エピトープを保有する（すなわち、抗体が結合し得るタンパク質分子の
領域を含む）ペプチドまたはポリペプチドの選択に関して、タンパク質配列の一
部を模倣する比較的短い合成ペプチドが、部分的に模倣されたタンパク質と反応
する抗血清を慣用的に誘発し得ることが当該分野で周知である（例えば、Ｓｕｔ
ｃｌｉｆｆｅ， Ｊ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：６６０−６６６（１９
８３）を参照のこと）。タンパク質反応性血清を誘発し得るペプチドは、タンパ
ク質の一次配列で頻繁に示され、一連の単純な化学的法則により特徴付けられ得
、そしてインタクトなタンパク質の免疫優性領域（すなわち、免疫原性エピトー
プ）にも、アミノ末端またはカルボキシル末端にも、制限されない。それゆえ、
本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリペ
プチドに特異的に結合する抗体（モノクローナル抗体を含む）を惹起するために
有用である（例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７７８（１９
８４）を参照のこと）。
【０１０８】 本発明の抗原性エピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、本発明のポリ
ペプチドのアミノ酸配列内に含まれる、好ましくは少なくとも７個、より好まし
くは少なくとも９個、そして最も好ましくは約１５〜約３０個の間のアミノ酸の
配列を含む。フォリスタチン−３特異的抗体を生成するために使用され得る抗原
性ポリぺプチドまたはペプチドの非限定的な例には、以下が含まれる：配列番号
２におけるアミノ酸残基Ｌｅｕ−１４〜Ａｌａ−２０、Ｓｅｒ−４６〜Ｉｌｅ５
５、Ｇｌｙ−８８〜Ｐｒｏ−９７、Ｇｌｙ−１１３〜Ｌｅｕ−１３３、Ａｒｇ−
１３８〜Ｇｌｕ−１４６、Ｐｒｏ−１７７〜Ｔｈｒ−１９１、および／またはＧ
ｌｙ−２１９〜Ｖａｌ−２３７を含むポリペプチド。これらのポリペプチドフラ
グメントは、図３および上記の表Ｉに示されるように、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌ
ｆの分析によってフォリスタチン−３の抗原性エピトープを有することが決定さ
れた。
【０１０９】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリペプチドは、任意の従来の手段に
より産生され得る（例えば、 Ｈｏｕｇｈｔｅｎ Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）；お
よびＨｏｕｇｈｔｅｎらの米国特許第４，６３１，２１１号（１９８６）を参照
のこと）。
【０１１０】 本発明のエピトープ保有ペプチドおよびポリぺプチドは、当該分野で周知の方
法に従って抗体を誘導するために使用される（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、
前出；Ｗｉｌｓｏｎら、前出；Ｃｈｏｗ， Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，
Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２３４７−２３５４（１
９８５）を参照のこと）。本発明の免疫原性エピトープ保有ペプチド（すなわち
、全体としてのタンパク質が免疫原である場合、抗体応答を誘発するタンパク質
の部分）は、当該分野で公知の方法に従って同定される（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ
ら（前出）を参照のこと）。さらになお、Ｇｅｙｓｅｎに対して発行された米国
特許第５，１９４，３９２号は、目的の抗体の特定のパラトープ（抗原結合部位
）に相補的であるエピトープ（すなわち、「ミモトープ」）の位相幾何学的等価
物であるモノマー（アミノ酸または他の化合物）の配列を検出または決定する一
般的な方法を記載する。より一般的には、Ｇｅｙｓｅｎに発行された米国特許第
４，４３３，０９２号は、目的の特定のレセプターのリガンド結合部位に相補的
なリガンドの位相幾何学的に等価物であるモノマーの配列を検出または決定する
方法を記載する。同様に、Ｐｅｒａｌｋｙｌａｔｅｄ Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｍｉｘｔｕｒｅｓに関するＨｏｕｇｈｔｅｎおよび共同研究者らに発行され
た米国特許第５，４８０，９７１号は、直線状のＣ１〜Ｃ７アルキルペルアルキ
ル化オリゴペプチドおよびこのようなペプチドのセットおよびライブラリー、な
らびにこのようなオリゴペプチドのセットおよびライブラリーを、目的のアクセ
プター分子に優先的に結合するペルアルキル化オリゴペプチドの配列を決定する
ために使用する方法を開示する。従って、本発明のエピトープ保有ペプチドの非
ペプチドアナログはまた、これらの方法によって慣用的に作製され得る。
【０１１１】 フォリスタチン−３ ポリペプチドの特徴を改善または変化させるために、タ
ンパク質工学が利用され得る。当業者に公知である組換えＤＮＡ技術が、新規な
変異体タンパク質もしくはムテイン（単一のまたは複数のアミノ酸置換、欠失、
付加を含む）、または融合タンパク質を作製するために使用され得る。このよう
な改変されたポリペプチドは、例えば、活性の増強または安定性の増加を示し得
る。さらに、それらは高収量で精製され得、そして少なくとも特定の精製および
保存条件下で、対応する天然のポリペプチドよりもより良好な可溶性を示す。
【０１１２】 例えば、膜結合タンパク質の細胞外ドメインまたは分泌タンパク質の成熟型を
含む多くのタンパク質について、生物学的な機能の実質的な損失なしにＮ末端ま
たはＣ末端から１つ以上のアミノ酸を欠失させ得ることが、当該分野において公
知である。例えば、Ｒｏｎら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８：２９
８４−２９８８；（１９９３））は、Ｎ末端の３、８、または２７アミノ酸残基
が除去された場合でさえ、ヘパリン結合活性を有した、改変ＫＧＦタンパク質を
報告した。今回の場合、本発明のタンパク質がインターロイキン−１７ポリペプ
チドファミリーのメンバーであるので、配列番号２の１２位のシステインまでの
Ｎ末端アミノ酸の欠失は、アクチビンまたはアクチビン様分子の結合のような、
いくらかの生物学的活性を保持し得る。配列番号２のシステイン−１２残基を含
む、さらなるＮ末端欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保
持することは期待されない。なぜなら、この残基は、タンパク質間相互作用に必
要である構造安定性を提供するためのジスルフィド架橋を形成するために必要で
あるようであり、そして生物学的活性に必要とされる保存されたドメインの始ま
りに存在することが公知であるからである。
【０１１３】 しかし、タンパク質のＮ末端から１つ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の１
つ以上の生物学的機能の改変または損失を生じるとしても、他の生物学的活性は
なお保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク質の完全な形
態または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合
する能力は、タンパク質の完全な形態または成熟形態の残基の大部分より少ない
残基がＮ末端から除去された場合には、一般的に保持される。完全なタンパク質
のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するか
どうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野
において公知の方法によって、容易に決定され得る。
【０１１４】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるフォリスタチン−３のアミノ
酸配列のアミノ末端から１つ以上の残基（１２位のシステイン残基まで）を欠失
したポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを提供する。特に本発明は、配列番号２の残基ｎ1〜２３７のアミノ酸配列を 含むポリペプチドを提供し、ここでｎ1は−２６〜１２の範囲の整数であり、そ して１２は、フォリスタチン−３の結合またはアクチビン様タンパク質結合活性
に必要とされると考えられる、完全フォリスタチン−３ポリペプチド（配列番号
２に示される）のＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１１５】 より詳細には、本発明は、配列番号２の、−２６〜２３７、−２５〜２３７、
−２４〜２３７、−２３〜２３７、−２２〜２３７、−２１〜２３７、−２０〜
２３７、−１９〜２３７、−１８〜２３７、−１７〜２３７、−１６〜２３７、
−１５〜２３７、−１４〜２３７、−１３〜２３７、−１２〜２３７、−１０〜
２３７、−９〜２３７、−８〜２３７、−７〜２３７、−６〜２３７、−５〜２
３７、−４〜２３７、−３〜２３７、−２〜２３７、−１〜２３７、１〜２３７
、２〜２３７、３〜２３７、４〜２３７、５〜２３７、６〜２３７、７〜２３７
、８〜２３７、９〜２３７、１０〜２３７、１１〜２３７および１２〜２３７の
残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供
する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される
。
【０１１６】 同様に、生物学的に機能的なＣ末端欠失ムテインの多くの例が公知である。例
えば、インターフェロンγは、タンパク質のカルボキシ末端から８〜１０アミノ
酸残基を欠失させることにより１０倍まで高い活性を示す（Ｄｏｂｅｌｉら、Ｊ
． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６；（１９８８））。今回
の場合、本発明のタンパク質がアクチビン関連ポリペプチドファミリーのメンバ
ーであるので、配列番号２の２１７位のシステインまでのＣ末端アミノ酸の欠失
は、アクチビンまたはアクチビン様分子の結合のような、いくらかの生物学的活
性を保持し得る。配列番号２の２１７位のシステイン残基を含むさらなるＣ末端
欠失を有するポリペプチドは、このような生物学的活性を保持することは期待さ
れない。なぜなら、この残基が、タンパク質間相互作用に必要とされ、そして生
物学的活性に必要な保存されたドメインの始まりに存在する構造安定性を提供す
るジスルフィド架橋を形成するのに必要であると思われるからである。
【０１１７】 しかし、タンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失がタンパク質の
１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じるとしても、他の生物学的活性はな
お保持され得る。従って、短縮化されたタンパク質の、タンパク質の完全な形態
または成熟形態を認識する抗体を誘導する能力および／またはその抗体に結合す
る能力は、タンパク質の完全な形態または成熟形態の残基の大部分より少ない残
基がＣ末端から除去される場合、一般的に保持される。完全なタンパク質のＣ末
端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的活性を保持するかどうか
は、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうでなければ当該分野におい
て公知の方法によって、容易に決定され得る。
【０１１８】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるフォリスタチン−３のアミノ
酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基（配列番号２の２１７位のシステイ
ン残基まで）を欠失したポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドを提供する。特に本発明は、配列番号２のアミノ酸配列の
残基−２６〜ｍ1のアミノ酸配列を有するポリペプチドを提供し、ここでｍ1は２
１７〜２３７の範囲の任意の整数であり、そして残基２１７は、フォリスタチン
−３のアクチビン結合またはアクチビン様タンパク質結合に必要とされると考え
られる、完全フォリスタチン−３ポリペプチド（配列番号２に示される）のＣ末
端からの最初の残基の位置である。
【０１１９】 より詳細には、本発明は、配列番号２の残基−２６〜２１７、−２６〜２１８
、−２６〜２１９、−２６〜２２０、−２６〜２２１、−２６〜２２２、−２６
〜２２３、−２６〜２２４、−２６〜２２５、−２６〜２２６、−２６〜２２７
、−２６〜２２８、−２６〜２２９、−２６〜２３０、−２６〜２３１、−２６
〜２３２、−２６〜２３３、−２６〜２３４、−２６〜２３５、−２６〜２３６
、および−２６〜２３７のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリ
ヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
もまた、提供される。
【０１２０】 本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１つ以上のアミノ
酸を欠失したポリペプチドを提供し、これは配列番号２の残基ｎ1〜ｍ1を有する
ものとして一般的に記載され得る。ここで、ｎ1およびｍ1は上記で述べたような
整数である。
【０１２１】 ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードさ
れる完全フォリスタチン−３アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列もまた含まれ、ここでこの部分は、ＡＴＣＣ受託番号２０
９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列の
アミノ末端からの１〜約３７アミノ酸、またはＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に
含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされる完全アミノ酸配列の、カルボキ
シ末端からの１〜約２０アミノ酸を除外し、または上記のアミノ末端およびカル
ボキシ末端の欠失の任意の組み合わせである。上記の欠失変異体ポリペプチド型
全てをコードするポリヌクレオチドもまた、提供される。
【０１２２】 上記のように、たとえタンパク質のＮ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠失が
、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でも、他の機
能的活性または生物学的活性は、まだ保持され得る。従って、タンパク質の完全
形態または成熟形態を認識する抗体を誘導するおよび／または抗体に結合する短
縮化されたフォリスタチン−３ムテインの能力は、Ｎ末端から完全または成熟タ
ンパク質の残基の大部分より少ない残基が除去された場合、一般的に保持される
。完全タンパク質のＮ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的
活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうで
なければ当該分野において公知の方法によって、容易に決定され得る。多数の欠
失Ｎ末端アミノ酸残基を伴うフォリスタチン−３ムテインがいくらかの生物学的
活性または免疫学的活性を保持し得ることは、あり得ないことではない。実際、
６程度の少ないフォリスタチン−３アミノ酸残基で構成されるペプチドは、しば
しば免疫応答を引き起こし得る。
【０１２３】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるフォリスタチン−３アミノ酸
配列のアミノ末端から１つ以上の残基（２５８位のグリシン残基まで）を欠失し
たポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
提供する。特に本発明は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号２）の残基ｎ2〜 ２６３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、ここでｎ2は２〜２５８の 範囲の整数であり、そして２５９は、フォリスタチン−３タンパク質の少なくと
も免疫学的活性に必要とされると考えられている完全フォリスタチン−３ポリペ
プチドのＮ末端からの最初の残基の位置である。
【０１２４】 より詳細には、本発明は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されるフォリスタチン
−３配列（これは、配列番号２として示される配列に同一である、但し、図１中
のアミノ酸残基は、Ｎ末端からＣ末端まで、１から２６３で連続して番号付けら
れおり、他方、配列番号２中のアミノ酸残基は、推定シグナルペプチドの位置を
反映するように、−２６から２３７で連続して番号付けられている）の
【０１２５】
【化１Ａ】
【０１２６】
【化１Ｂ】
【０１２７】
【化１Ｃ】 の残基のアミノ酸配列を含むか、またはそれらのアミノ酸配列からなるポリペプ
チドをコードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。
【０１２８】 上記のようにまた、たとえタンパク質のＣ末端からの１つ以上のアミノ酸の欠
失が、タンパク質の１つ以上の生物学的機能の損失の改変を生じる場合でも、他
の機能的活性または生物学的活性は、まだ保持され得る。従って、タンパク質の
完全または成熟形態を認識する抗体を誘導し、そして／または抗体に結合する短
縮化されたフォリスタチン−３ムテインの能力は、Ｃ末端から完全または成熟タ
ンパク質の残基の大部分より少ない残基が除去される場合、一般的に保持される
。完全タンパク質のＣ末端残基を欠く特定のポリペプチドがこのような免疫学的
活性を保持するかどうかは、本明細書中に記載される慣用的な方法およびそうで
なければ当該分野において公知の方法によって、容易に決定され得る。多数の欠
失Ｃ末端アミノ酸残基を伴うフォリスタチン−３ムテインがいくらかの生物学的
活性または免疫学的活性を保持し得ることは、あり得ないことではない。実際、
６つ程度の少ないフォリスタチン−３アミノ酸残基で構成されるペプチドは、し
ばしば免疫応答を引き起こし得る。
【０１２９】 従って、本発明はさらに、配列番号２に示されるフォリスタチン−３のアミノ
酸配列のカルボキシ末端から１つ以上の残基（６位のプロリン残基まで）を欠失
したポリペプチドおよびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。特に、本発明は、配列番号２の残基１〜ｍ2のアミノ酸配列を含む ポリペプチドを提供し、ここで、ｍ２は６〜２６２の範囲の整数であり、そして
６は、フォリスタチン−３タンパク質の免疫学的活性に少なくとも必要とされる
と考えられている完全フォリスタチン−３ポリペプチドのＣ末端からの最初の残
基の位置である。
【０１３０】 より詳細には、本発明は、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されるフォリスタチン
−３配列（これは、配列番号２として示される配列に同一である、但し、図１中
のアミノ酸残基は、Ｎ末端からＣ末端まで、１から２６３で連続して番号付けら
れおり、他方、配列番号２中のアミノ酸残基は、推定シグナルペプチドの位置を
反映するように、−２６から２３７で連続して番号付けられている）の配列の残
基
【０１３１】
【化２Ａ】
【０１３２】
【化２Ｂ】
【０１３３】
【化２Ｃ】 のアミノ酸配列を含むか、またはそれらのアミノ酸配列からなるポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドを提供する。これらのポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドもまた、提供される。
【０１３４】 本発明はまた、フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ末端およびカルボキ
シ末端の両方から１つ以上のアミノ酸を欠失したポリペプチドを提供し、これは
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃ（配列番号２）の残基ｎ2〜ｍ2を有するものとして一般
的に記載され得る。ここでｎ2およびｍ2は上記で述べたような整数である。
【０１３５】 上記で議論したタンパク質の末端欠失形態に加えて、フォリスタチン−３ポリ
ペプチドのいくつかのアミノ酸配列がタンパク質の構造または機能の顕著な効果
なしで改変され得ることもまた、当業者に認識される。配列におけるこのような
差異が意図される場合、活性を決定するタンパク質の重要な領域が存在するとい
うことは、意図されるべきである。
【０１３６】 従って、本発明はさらに、実質的なフォリスタチン−３ポリペプチド活性を示
すか、または以下で議論するタンパク質部分のようなフォリスタチン−３タンパ
ク質の領域を含む、フォリスタチン−３ポリペプチドの変異を含む。このような
変異体は、活性にほとんど効果を有さないような、当該分野において公知の一般
的な規則に従って選択された、欠失、挿入、逆位、反復、およびタイプ置換を含
む。例えば、表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイ
ダンスが提供されており、その中で著者らは、変化に対するアミノ酸配列の寛容
性を研究するための２つの主なアプローチが存在することを示す（Ｂｏｗｉｅ，
Ｊ．Ｕ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０ （１９９０））
。第１の方法は進化の過程に依存し、ここで変異は自然淘汰によって受け入れら
れるか、または拒絶されるかのいずれかである。第２のアプローチは、遺伝子操
作を使用して、クローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入
し、そして選択またはスクリーニングを使用して機能性を維持する配列を同定す
る。
【０１３７】 その著者らがいうように、これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に対し
て驚くべきほど寛容であることを明らかにしてきた。著者らはさらに、どのアミ
ノ酸変化がタンパク質の特定の位置において許容的でありそうかを示す。例えば
、大部分の埋没したアミノ酸残基は、非極性側鎖を必要とするが、一方、表面側
鎖の特徴は一般的にほとんど保存されていない。他のこのような表現型的にサイ
レントな置換は、Ｂｏｗｉｅら（前出）およびそこに引用される参考文献中に記
載される。代表的には、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの
間での１つから別のものへの置き換え；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの
交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎとの間の
置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙ
ｒの間の置き換えは、保存的置換と見なされる。
【０１３８】 従って、配列番号２のポリペプチドのフラグメント、誘導体またはアナログ、
あるいは寄託されたｃＤＮＡによってコードされるものは、（ｉ）１つ以上のア
ミノ酸残基は、保存されたアミノ酸残基または保存されていないアミノ酸残基（
好ましくは保存されたアミノ酸残基）で置換され、そしてそのような置換された
アミノ酸残基が遺伝コードによってコードされたものであってもよく、またはそ
うでなくてもよいもの、あるいは（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、置換基を
含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増
加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のような、別の化合物と融
合しているもの、あるいは（ｉｖ）ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドまたはリーダ
ーもしくは分泌配列、または上記の形態のポリペプチドの精製に利用される配列
、またはプロタンパク質配列のような、さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの上
記の形態に融合しているものであり得る。このようなフラグメント、誘導体、お
よびアナログは、本明細書中の教示からの当業者の範囲内であるとみなされる。
【０１３９】 従って、本発明のフォリスタチン−３は、天然の変異または人為的操作のいず
れか由来の、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、または付加を含み得る。示される
ように、変化は、好ましくは、マイナーな性質のものであり、例えばタンパク質
の折り畳みまたは活性に顕著な影響を与えない保存的アミノ酸置換である（表Ｉ
Ｉを参照のこと）。
【０１４０】
【表２】 本発明の実施態様は、本明細書において記載されるフォリスタチン−３のアミ
ノ酸配列を有するが、本明細書において記載されるフォリスタチン−３ポリヌク
レオチド配列と比較したときに、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むア
ミノ酸配列を有するが、５０以下の保存的アミノ酸置換、さらにより好ましくは
、４０以下の保存的アミノ酸置換、なおより好ましくは３０以下の保存的アミノ
酸置換、およびなおさらにより好ましくは２０以下の保存的アミノ酸置換を含む
アミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、
ペプチドまたはポリペプチドに関する。もちろん、好ましさをさらに増大する順
に、ペプチドまたはポリペプチドが、少なくとも１つであるが、しかし１０、９
、８、７、６、５、４、３、２、または１より多くない保存的アミノ酸置換を含
む、フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有す
ることが非常に好ましい。
【０１４１】 さらなる特定の実施態様において、図１Ａ，１Ｂおよび１Ｃのアミノ酸配列（
配列番号２）、寄託したクローンによってコードされるポリペプチドの配列、お
よび／または本明細書において記載されるポリペプチドフラグメントのいずれか
における置換、欠失または付加の数は、７５、７０、６０、５０、４０、３５、
３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１
、または１５０〜５０、１００〜５０、５０〜２０、３０〜２０、２０〜１５、
２０〜１０、１５〜１０、１０〜１、５〜１０、１〜５、１〜３、もしくは１〜
２である。
【０１４２】 フォリスタチン−３ポリペプチドの特徴を改善または変化させるために、タン
パク質工学が利用され得る。当業者に公知である組換えＤＮＡ技術が、新規な変
異体タンパク質もしくはムテイン（単一のまたは複数のアミノ酸置換、欠失、付
加を含む）、または融合タンパク質を作製するために使用され得る。このような
改変されたポリペプチドは、例えば、活性の増強または安定性の増加を示し得る
。さらに、それらは高収量で精製され得、そして少なくとも特定の精製および貯
蔵条件下で、対応する天然のポリペプチドよりもより良好な可溶性を示す。
【０１４３】 従って、本発明はまた、選択された宿主細胞において、発現、大規模化などの
ためによりよく適合化されているフォリスタチン−３を生成するために、１以上
のアミノ酸残基の欠失、付加、または置換を有するフォリスタチン−３誘導体お
よびアナログを包含する。例えば、システイン残基は、ジスルフィド架橋を除去
するために、欠失または別のアミノ酸残基で置換され得；Ｎ結合型グリコシル化
部位は、例えば、超グリコシル化Ｎ連結部位として公知である酵母宿主から、よ
り容易に回収および精製される均質な産物の発現を達成するために変更もしくは
除去され得る。この目的のために、本発明のフォリスタチン−３ポリペプチドに
おけるグリコシル化認識配列の任意の１以上での第一または第三のアミノ酸位置
の１または両方でのアミノ酸置換、および／または１以上のそのような認識配列
の第二の位置でのアミノ酸欠失の改変体は、改変されたトリペプチド配列でのフ
ォリスタチンー３のグリコシル化を妨害する（たとえば、Ｍｉｙａｊｉｍａ、Ａ
．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．５（６）：１１９３〜１１９７（１９８６）を参照のこと
）。
【０１４４】 本発明のフォリスタチン−３タンパク質の機能に必須のアミノ酸は、当該分野
で公知の方法（例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャン変異誘発（
ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−
１０８５（１９８９））により同定され得る。後者の手順は、分子のすべての残
基に単一のアラニン変異を導入する。次いで、得られた変異体分子は、生物学的
活性（例えば、レセプター結合またはインビトロでの増殖活性）について試験さ
れる。
【０１４５】 特別に興味深いのは、荷電したアミノ酸を、所望の高度に改善された特徴（例
えば、より少ない凝集）を有するタンパク質を産生し得る、他の荷電したアミノ
酸または中性アミノ酸で置換することである。凝集は、活性を低下させるだけで
はなく、薬学的処方物を調製する場合に問題ともなる。なぜなら、凝集物は免疫
原性であり得るからである（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ． ２：３３１−３４０ （１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａ
ｂｅｔｅｓ ３６： ８３８−８４５ （１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒ
ｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙ
ｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７ （１９９３））。
【０１４６】 フォリスタチン−１の２つのＮ結合型グリコシル化部位（Ａｓｎ−９５および
Ａｓｎ−２５９）の変異分析は、Ｉｎｏｕｙｅらによって実施された（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９；３５２−３５８（１９９
１））。この分析において記載されるように、Ｎ結合型グリコシル化部位のいず
れかまたは両方の破壊（Ｔｈｒ−９７およびＴｈｒ−２６１のアラニンへの変異
による）は、アクチビン結合およびＦＳＨレセプターには識別可能な効果は有さ
なかった。しかし、同じ研究の結果は、２つのアミノ酸残基（リジンおよびロイ
シン）のフォリスタチン−１のＡｓｎ−２およびＣｙｓ−３の間への挿入が、下
垂体からのＦＳＨ分泌に対する阻害的活性、およびアクチビンに結合するその能
力を完全に除去した。この分析において記載されるアスパラギンおよび周囲の残
基は、フォリスタチン−１とフォリスタチン−３との間で弱く保存されている。
しかし、フォリスタチン−３の配列において、２つの潜在的なＮ結合型グリコシ
ル化部位が存在する（Ｎ−７３およびＮ−２１５；図１Ａを参照のこと）。さら
に、アミノ末端付近の配列を構成する５アミノ酸のうち４アミノ酸（この点で、
Ｉｎｏｕｙｅらは、彼らの２アミノ酸の挿入を行った（前出））は保存されてい
る。結果として、推定成熟フォリスタチン−３のアミノ末端領域の端部は、変異
を介して、有害な効果を示すことについて高い可能性を有し得る。
【０１４７】 本発明のポリペプチドは、好ましくは、単離された形態で提供され、そして好
ましくは実質的に精製されている。フォリスタチン−３ポリペプチドの組換え産
生版は、ＳｍｉｔｈおよびＪｏｈｎｓｏｎ（Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０（１９
８８））に記載される一工程法により実質的に精製され得る。本発明のポリぺプ
チドはまた、天然の、または組換えの供給源から、本発明の抗フォリスタチン−
３抗体を、タンパク質精製の分野で周知の方法において使用して精製され得る。
【０１４８】 本発明はさらに、（ａ）配列番号２に示される完全アミノ酸配列を有する全長
フォリスタチン−３ポリぺプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２
６〜２３７位）；（ｂ）Ｎ末端メチオニン以外の配列番号２に示される完全アミ
ノ酸配列を有する全長フォリスタチン−３ポリぺプチドのアミノ酸配列（すなわ
ち、配列番号２の−２５〜２３７位）；（ｃ）配列番号２の１〜２３７位のアミ
ノ酸配列を有する推定成熟フォリスタチン−３ポリぺプチドのアミノ酸配列；（
ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコード
される完全アミノ酸配列を有する全長フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ
酸配列；（ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによ
ってコードされるＮ末端メチオニン以外の完全アミノ酸配列を有する全長フォリ
スタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列；ならびに（ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２
０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列を有
する推定成熟フォリスタチン−３ポリペプチドの完全アミノ酸配列、からなる群
から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたフォリスタチン−３ポリペプチド
を提供する。本発明のポリぺプチドにはまた、上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、
（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも８０
％同一、より好ましくは、少なくとも９０％同一、およびなおより好ましくは、
９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である、アミノ酸配列を有
するポリぺプチド、ならびに上記のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％の
類似性、およびより好ましくは少なくとも９５％の類似性を有するアミノ酸配列
を有するポリペプチドが含まれる。
【０１４９】 本発明のさらなるポリぺプチドには、上記のポリペプチドに対して、少なくと
も９０％類似性、より好ましくは、少なくとも９５％類似性、およびなおより好
ましくは、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％類似性を有するポ
リぺプチドが含まれる。本発明のポリぺプチドはまた、寄託されたｃＤＮＡによ
ってコードされるポリぺプチドもしくは配列番号２のポリぺプチドに対して、少
なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも９０％もしくは９５％同一、な
おより好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であ
るポリぺプチドを含み、そしてまた、少なくとも３０アミノ酸、そしてより好ま
しくは少なくとも５０アミノ酸を有するこのようなポリぺプチドの部分を含む。
【０１５０】 ２つのポリぺプチドについて「％類似性」によって、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラ
ム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇ
ｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐ
ｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ
， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７
１１）および類似性を決定するためのデフォルト設定を使用して２つのポリぺプ
チドのアミノ酸配列を比較することによって生成される類似性スコアが意図され
る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ
ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９， １
９８１）の局所的相同性アルゴリズムを使用して、２つの配列間の類似性の最良
のセグメントを見い出す。
【０１５１】 フォリスタチン−３ポリペプチドの参照アミノ酸配列に、少なくとも、例えば
、９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドにより、ポリぺプチ
ドのアミノ酸配列が、ポリぺプチド配列がフォリスタチン−３ポリペプチドの参
照アミノ酸の各１００アミノ酸あたり５アミノ酸変化までを含み得ることを除い
て、問合せ配列に同一であることが意図される。換言すれば、問合せアミノ酸配
列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリぺプチドを得るため
には、問合せ配列のアミノ酸残基の５％までが、欠失され得るか、または別のア
ミノ酸で置換され得るか、あるいは、参照配列の総アミノ酸残基の５％までの数
のアミノ酸が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミ
ノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端
位置の間のどこかで、参照配列中の残基の間に個々に散在してまたは参照配列内
で１つ以上の連続する群の中に散在してのいずれかで、起こり得る。
【０１５２】 実際には、任意の特定のポリペプチドが、例えば図１Ａ，１Ｂおよび１Ｃに示
されるアミノ酸配列、寄託されたｃＤＮＡクローンＨＤＴＡＨ８５によってコー
ドされるアミノ酸配列、またはそのフラグメントに対して少なくとも９０％、９
５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、Ｂｅｓｔｆ
ｉｔプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ
ａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７
１１）のような公知のコンピュータープログラムを使用して従来どおり決定され
得る。特定の配列が、例えば、本発明に従う参照配列と９５％同一かどうかを決
定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用する
場合、そのパラメーターは、もちろん、全長の参照ヌクレオチド配列にわたって
同一性のパーセンテージが計算されるように、そして参照配列のヌクレオチドの
全体数の５％までの、相同性におけるギャップが可能なように設定される。
【０１５３】 特定の実施態様において、参照（問合せ）配列（本発明の配列）と対象配列（
ｓｕｂｊｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）との間の同一性はまた、包括的配列整列と
呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ． ６：２３７−
２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープロ
グラムを使用して決定される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列中で使用される好まし
いパラメーターは以下の通りである：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ
０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティー（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎ
ａｌｔｙ）＝１、連結ペナルティー（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０
、ランダム化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇ
ｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ）＝１、ウィンドウ
サイズ（Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ）＝配列長、ギャップペナルティー（Ｇａｐ
Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティー（Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅ
ｎａｌｔｙ）＝０．０５、ウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ）＝５０
０または対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方。本実施態様によって、対象
配列が、内部欠失のためではなく、Ｎ末端欠失またはＣ末端欠失のため問合せ配
列よりも短い場合、結果に対して手動修正がなされる。これは包括的同一性パー
セントを計算する場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムは対象配列のＮ末端およびＣ末
端の切断を考慮しないという事実を考慮するためである。問合せ配列に対して、
Ｎ末端またはＣ末端で切断された対象配列については、同一性パーセントは、対
象配列のＮ末端またはＣ末端である、対応する対象残基とマッチング／整列して
いない問合せ配列の残基数を、問合せ配列の全塩基のパーセントとして計算する
ことによって修正される。残基がマッチング／整列しているかどうかの決定は、
ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果により決定される。次にこの百分率は特定のパラメ
ーターを使用して上記のＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パーセ
ントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに達する。この最終的な
同一性パーセントスコアが、本実施態様の目的のために用いられるものである。
問合せ配列とマッチング／整列しない、対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する
残基のみが、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的のために考慮される
。すなわち、対象配列の最も遠いＮ末端残基およびＣ末端残基の外側の問い合わ
せ残基位置のみである。例えば、９０アミノ酸残基の対象配列は、同一性パーセ
ントを決定するために、１００残基の問合せ配列に対して整列される。対象配列
のＮ末端で欠失がおこり、そのため、ＦＡＳＴＤＢ整列は、Ｎ末端の最初の１０
残基のマッチング／整列を示さない。この１０個の対合しない残基は、配列の１
０％（Ｎ末端およびＣ末端でマッチングしない残基の数／問合せ配列の全残基数
）を表し、よって１０％は、ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算された同一性パ
ーセントスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全にマッチングする場合
、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例では、９０残基の対象配列
は、１００残基の問合せ配列と比較される。この場合、欠失は内部欠失であるか
ら、問合せ配列とマッチング／整列しない残基は対象配列のＮ末端またはＣ末端
にない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性パーセントは手動で修
正されない。繰り返すと、問合せ配列とマッチング／整列しない、ＦＡＳＴＤＢ
整列において示されるような対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置の
み手動修正される。他の手動修正は本実施態様の目的のためには行われない。
【０１５４】 本発明はまた、完全長フォリスタチン−３ポリペプチド、またはそのフラグメ
ント、改変体、誘導体、もしくはアナログが非関連タンパク質に融合されている
融合タンパク質を含む。これらの融合タンパク質は、本明細書中に開示されるフ
ォリスタチン−３ヌクレオチド配列およびポリペプチド配列に基づいて、慣用的
に設計され得る。例えば、当業者が理解するように、本明細書中に記載されるフ
ォリスタチン−３ポリペプチドおよびそのフラグメント（エピトープ保有フラグ
メントを含む）は、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と組み合わ
せられて、キメラ（融合）ポリペプチドを生じ得る。これらの融合タンパク質は
、精製を容易にし、そしてインビボで半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒ
トＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリン
の重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質につい
て示されている（ＥＰ Ａ ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔ
ｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８））。ＩｇＧ部分によるジスルフィド結
合二量体構造を有する融合タンパク質はまた、単量体フォリスタチン−３ポリペ
プチドまたはポリペプチドフラグメント単独よりも、他の分子の結合および中和
においてより効率的であり得る（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓら、Ｊ． Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ． ２７０：３９５８−３９６４（１９９５）。本発明に含まれるフォリ
スタチン−３融合タンパク質の例には、以下が挙げられるが、これらに限定され
ない：融合タンパク質が細胞表面上に示されるのを可能にする任意のアミノ酸配
列へのフォリスタチン−３ポリペプチド配列の融合体（例えば、ＩｇＧ Ｆｃド
メイン）；またはマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、もしくは化学
発光タンパク質への融合体。
【０１５５】 本発明のポリペプチドは、以下を含むがそれらに限定されない用途を有する：
当業者に周知の方法を使用する、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル濾 過カラムの分子量マーカー。さらに、本明細書中に詳細に記載されるように、本
発明のポリペプチドはまた、下記のフォリスタチン−３発現を検出するためのア
ッセイにおいて、またはフォリスタチン−３機能を増強もしくは阻害し得るアゴ
ニストおよびアンタゴニストとして有用であるポリクローナル抗体およびモノク
ローナル抗体を惹起するために使用され得る。さらに、そのようなポリペプチド
は、本発明による候補アゴニストおよびアンタゴニストでもあるフォリスタチン
−３ポリペプチド結合タンパク質を「捕獲」するために、酵母ツーハイブリッド
系において使用され得る。酵母ツーハイブリッド系は、ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏ
ｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５〜２４６（１９８９））によって記載され
る。
【０１５６】 （抗体） 本発明における使用のためのフォリスタチン−３ポリペプチド特異的抗体は、
インタクトなフォリスタチン−３ポリペプチドまたはその抗原性ポリぺプチドフ
ラグメントに対して惹起され得、これは、アルブミンのようなキャリアタンパク
質とともに、またはそれが十分に長ければ（少なくとも約２５アミノ酸）、キャ
リアなしに、動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に対して提示され得る。
【０１５７】 本明細書中で使用される用語「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」
（Ｍａｂ）は、インタクトな分子、ならびにフォリスタチン−３に特異的に結合
し得る抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントな
ど）を含むことが意図される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、イ
ンタクトな抗体のＦｃフラグメントを欠失し、循環からより迅速に除去され、そ
してインタクトな抗体のより非特異的でない組織結合を有し得る（Ｗａｈｌら、
Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． ２４：３１６−３２５（１９８３））。従って、
これらのフラグメントが好ましい。
【０１５８】 本発明の抗体は、任意の種々の方法によって調製され得る。例えば、フォリス
タチン−３またはその抗原性フラグメントを発現する細胞は、ポリクローナル抗
体を含有する血清の産生を誘導するために動物に投与され得る。好ましい方法に
おいて、フォリスタチン−３ポリペプチドの調製物が、天然の夾雑物を実質的に
含まないようにするために調製および精製される。次いで、このような調製物は
、より比活性の大きいポリクローナル抗血清を産生するために動物に導入される
。
【０１５９】 最も好ましい方法において、本発明の抗体は、モノクローナル抗体（またはそ
のフォリスタチン−３結合フラグメント）である。このようなモノクローナル抗
体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製され得る（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕ
ｒｅ ２５６：４９５（１９７５）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ． ６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ． ６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃ
ｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍ
ａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， （１９８１）、５６３〜６８１頁）
。一般に、このような手順は、フォリスタチン−３抗原またはより好ましくはフ
ォリスタチン−３発現細胞を使用した、動物（好ましくはマウス）の免疫を含む
。適切な細胞は、抗フォリスタチン−３抗体に結合するそれらの能力によって認
識され得る。このような細胞は、任意の適切な組織培養培地において培養され得
る；しかし、１０％ウシ胎児血清（約５６℃で非働化）を補充し、そして約１０
μｇ／ｌの非必須アミノ酸、約１，０００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および約１０
０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＥａｒｌｅの改変Ｅａｇｌｅ培地
において細胞を培養することが好ましい。このようなマウスの脾細胞は、抽出さ
れ、そして適切なミエローマ細胞株と融合される。任意の適切なミエローマ細胞
株は、本発明に従って使用され得る；しかし、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａ
ｎｄから入手可能である親ミエローマ細胞株（ＳＰ２Ｏ）を使用することが好ま
しい。融合後、得られるハイブリドーマ細胞は、ＨＡＴ培地において選択的に維
持され、次いで、Ｗａｎｄｓおよび共同研究者らによって記載されるように（Ｇ
ａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２（１９８１））、限界
希釈によってクローン化される。次いで、このような選択によって得られるハイ
ブリドーマ細胞は、フォリスタチン−３抗原に結合し得る抗体を分泌するクロー
ンを同定するためにアッセイされる。
【０１６０】 あるいは、フォリスタチン−３抗原に結合し得るさらなる抗体は、抗イディオ
タイプ抗体の使用を介して２工程手順において産生され得る。このような方法は
、抗体がそれ自体抗原であり、そしてそれゆえ第２の抗体に結合する抗体を得る
ことが可能であるという事実を利用する。この方法に従って、フォリスタチン−
３特異的抗体は、動物（好ましくはマウス）を免疫するために使用される。次い
で、このような動物の脾細胞は、ハイブリドーマ細胞を産生するために使用され
、そしてそのハイブリドーマ細胞は、フォリスタチン−３特異的抗体に結合する
能力がフォリスタチン−３抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクロー
ンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、フォリスタチン
−３特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そして動物を免疫してさ
らなるフォリスタチン−３特異的抗体の形成を誘導するために使用され得る。
【０１６１】 本発明の抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに他のフラグメントは、本
明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが理解される。このような
フラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するために
）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するために）のような酵
素を使用する、タンパク質分解的切断によって生成される。あるいは、フォリス
タチン−３結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術を適用することによって、ま
たは合成化学によって産生され得る。
【０１６２】 ヒトにおける抗フォリスタチン−３のインビボでの使用のために、「ヒト化」
キメラモノクローナル抗体を使用することが好ましい場合がある。このような抗
体は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝
子構築物を使用して産生され得る。キメラ抗体を産生する方法は、当該分野で公
知である（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５
）； Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）； Ｃａ
ｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、ＥＰ
１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、ＥＰ １７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅ
ｒら、ＷＯ ８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，ＷＯ ８７０２６７１；Ｂ
ｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅ
ｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５））。
【０１６３】 （生殖系、および細胞増殖、および分化に関連する障害） （診断） 本発明者らは、フォリスタチン−３が、ホジキンリンパ腫においてだけではな
く、滑膜線維芽細胞、胆嚢、休止および血清誘導平滑筋、精巣、メルケル細胞、
ＨＥＬ細胞、海馬、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ誘導上皮細胞、ケラチノサイト、扁
桃機能低下（ａｍｙｇｄａｌａ ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、ＨＬ−６０細胞、肝
細胞ガン、プロゲステロン処理上皮細胞、内皮細胞、ＨＳＣ１７２細胞、類上皮
肉腫、活性化Ｔ細胞、胸部のリンパ節、膵臓ガン、胎児硬膜、胎児肺、精巣上体
、胎盤、樹状細胞、拒絶された腎臓、および子宮ガンにおいてもまた発現される
ことを発見した。多くの生殖系関連障害、ならびに細胞増殖および分化の調節に
関連する障害について、「標準的な」フォリスタチン−３遺伝子発現レベル、す
なわち生殖系または細胞増殖および分化障害を有さない個体からの生殖系組織ま
たは体液におけるフォリスタチン−３発現レベルと比較して、実質的に変化した
（増大または減少した）フォリスタチン−３遺伝子発現のレベルが、このような
障害を有する個体から採取した生殖系組織または他の細胞または体液（例えば、
血清、血漿、尿、滑液、または髄液）において、検出され得る。従って、本発明
は、生殖系または細胞増殖および分化の障害の診断の間に有用である診断方法を
提供し、この方法は、個体からの生殖系組織または他の細胞または体液において
、フォリスタチン−３ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定する
工程、および測定された遺伝子発現レベルを標準的なフォリスタチン−３遺伝子
発現レベルと比較する工程であって、それにより標準と比較した遺伝子発現レベ
ルの増大または減少が、生殖系または細胞増殖および分化系の障害を示す工程を
包含する。
【０１６４】 特に、生殖系または他の系の種々の細胞および組織のガンを有する哺乳動物に
おける特定の組織が、対応する「標準」レベルと比較した場合に、有意に減少し
たレベルのフォリスタチン−３ポリペプチドおよびフォリスタチン−３ポリペプ
チドをコードするｍＲＮＡを発現すると考えられている。さらに、増強されたレ
ベルのフォリスタチン−３ポリペプチドは、ガンを有さない同一の種の哺乳動物
からの血清と比較した場合、このようなガンを有する哺乳動物由来の特定の体液
（例えば、血清、血漿、尿、および髄液）において、検出され得ると考えられて
いる。
【０１６５】 従って、本発明は、生殖系または細胞増殖および分化の障害（これらの系のガ
ンを含む）の診断の間に有用である診断方法を提供し、この方法は、個体由来の
生殖系組織または他の細胞または体液においてフォリスタチン−３ポリペプチド
をコードする遺伝子の発現レベルを測定する工程、およびその測定された遺伝子
発現レベルを標準的なフォリスタチン−３遺伝子発現レべルと比較する工程であ
って、それにより標準と比較した遺伝子発現レベルにおける増大または減少が、
生殖系障害または細胞増殖および分化の調節の障害の指標である工程、を包含す
る。
【０１６６】 腫瘍の診断を含む、生殖系または他の系における障害の診断が、従来方法に従
ってすでに行われている場合、本発明は、予後的指標として有用であり、これに
より、抑制されたフォリスタチン−３遺伝子発現を示す患者が、標準的なレベル
に近いレベルで遺伝子を発現する患者に比較して、より悪い臨床的結果を経験す
る。
【０１６７】 「フォリスタチン−３ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセ
イする」により、第一の生物学的サンプルにおいて、フォリスタチン−３ポリペ
プチドのレベルまたはフォリスタチン−３ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの
レベルを、直接的に（例えば、絶対的ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベル
を決定または概算することによって）、あるいは相対的に（例えば、第二の生物
学的サンプルにおけるフォリスタチン−３ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレ
ベルに対して比較することによって）、定性的または定量的に測定するかまたは
概算することを意図する。好ましくは、第一の生物学的サンプルにおけるフォリ
スタチン−３ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルが測定または概算され、
そして標準的なフォリスタチン−３ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルに
対して比較され、標準は、障害を有さない個体から得られる第２の生物学的サン
プルから採取されるか、または生殖系障害または細胞増殖および分化の調節の障
害を有さない個体の集団からのレベルを平均化することによって決定される。当
該分野で理解されるように、一旦標準的なフォリスタチン−３ポリペプチドレベ
ルまたはｍＲＮＡレベルが知られると、それは比較のための標準として反復して
使用され得る。
【０１６８】 「生物学的サンプル」により、個体から得られる任意の生物学的サンプル、体
液、細胞株、組織培養物、またはフォリスタチン−３ポリペプチドもしくはｍＲ
ＮＡを含有する他の供給源が意図される。示されるように、生物学的サンプルは
、遊離のフォリスタチン−３ポリペプチドを含有する体液（例えば、血清、血漿
、尿、滑液、および髄液）、生殖系組織、および完全もしくは成熟フォリスタチ
ン−３またはフォリスタチン−３レセプターを発現することが見出されている他
の組織供給源を含む。哺乳動物から組織生検および体液を得るための方法は、当
該分野で周知である。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含むべきである場合には、
組織生検が好ましい供給源である。
【０１６９】 本発明は、哺乳動物（好ましくはヒト）における種々の生殖系関連障害ならび
に細胞増殖および分化の調節の障害の診断または処置のために有用である。この
ような障害には、腫瘍、癌、間質性肺疾患、および以下を含むがこれらに限定さ
れない細胞機能の増殖および分化パターンの任意の調節障害が挙げられる：自己
免疫、関節炎、白血病、リンパ腫、免疫抑制、免疫、体液性免疫、炎症性腸疾患
、骨髄抑制など。
【０１７０】 総細胞ＲＮＡは、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９（１９８７））に記載される一工程
チオシアン酸グアニジンフェノールクロロホルム法のような任意の適切な技術を
使用して生物学的サンプルから単離され得る。次いで、フォリスタチン−３ポリ
ペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の適切な方法を使用してアッセ
イされる。これらには、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写
（ＲＴ−ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣ
Ｒ）が含まれる。
【０１７１】 生物学的サンプルにおけるフォリスタチン−３ポリペプチドレベルのアッセイ
は、抗体に基づく技術を用いて行い得る。例えば、組織でのフォリスタチン−３
ポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法を用いて研究され得る（Ｊａｌ
ｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８
５（１９８５）； Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ
． １０５：３０８７−３０９６（１９８７））。フォリスタチン−３ポリペプ
チド遺伝子発現を検出するために有用な、抗体に基づく他の方法は、イムノアッ
セイ（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノア
ッセイ（ＲＩＡ））を包含する。適切な抗体アッセイ標識は、当該分野で公知で
あり、そしてグルコースオキシダーゼのような酵素標識、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ
）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ
）、およびテクネチウム（99mＴｃ）のような放射性標識、ならびにフルオレセ インおよびローダミンのような蛍光標識、ならびにビオチンを含む。
【０１７２】 個体から得た生物学的サンプルにおいてフォリスタチン−３ポリペプチドレベ
ルをアッセイするのに加えて、フォリスタチン−３ポリペプチドはまた、画像化
によってインビボで検出され得る。フォリスタチン−３ポリペプチドのインビボ
画像化のための抗体標識またはマーカーは、Ｘ線撮影法、ＮＭＲ、またはＥＳＲ
によって検出可能なものを含む。Ｘ線撮影法について、適切な標識には、検出可
能な放射線を放射するが、被験体には明白に有害ではないバリウムまたはセシウ
ムのようなラジオアイソトープが含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲのための適切な
マーカーには、関連するハイブリドーマの栄養素を標識することによって抗体中
に取り込まれ得る、検出可能な特徴的なスピンを有するもの（例えば、ジュウテ
リウム）が含まれる。
【０１７３】 ラジオアイソトープ（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99mＴｃ）、放射線不透過性 物質、または核磁気共鳴によって検出可能な物質のような適切な検出可能な画像
化部分で標識したフォリスタチン−３ポリペプチド特異的抗体または抗体フラグ
メントは、免疫系障害について検査される哺乳動物中に導入される（例えば、非
経口的に、皮下に、または腹腔内に）。被験体のサイズおよび使用される画像化
系が、診断画像を生成するために必要とされる画像化部分の量を決定することが
当該分野において理解される。ラジオアイソトープ部分の場合、ヒト被験体につ
いて、注入される放射能の量は、通常、99mＴｃの約５〜２０ミリキュリーの範 囲である。次いで、標識された抗体または抗体フラグメントは、フォリスタチン
−３ポリペプチドを含有する細胞の位置に優先的に蓄積する。インビボ腫瘍画像
化は、Ｂｕｒｃｈｉｅｌおよび共同研究者らに記載されている（第１３章、Ｔｕ
ｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．Ｗ．およびＲｈｏｄｅｓ
，Ｂ．Ａ．編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ． （１９８２）
）。
【０１７４】 （処置） 上記のように、フォリスタチン−３ポリヌクレオチドおよびポリぺプチドは、
フォリスタチン−３活性の異常に高いかまたは低い発現を含む状態の診断に有用
である。フォリスタチン−３が発現される細胞および組織ならびにフォリスタチ
ン−３によって調節された活性が与えられれば、標準的なまたは「正常な」レベ
ルに比較して、個体における実質的に変化した（増大または減少した）レベルの
フォリスタチン−３の発現は、フォリスタチン−３が発現され、および／または
活性である身体の系に関連する病理的状態を生じることが容易に明らかである。
【０１７５】 本発明のフォリスタチン−３ポリペプチドが、インヒビン関連タンパク質ファ
ミリーのメンバーであるので、そのタンパク質の成熟分泌型形態は、フォリスタ
チン−３を発現する細胞からタンパク質分解的切断によって可溶性形態において
放出され得ることがまた、当業者によって理解される。それゆえ、フォリスタチ
ン−３成熟形態が、外因的供給源から個体の細胞、組織、または身体に添加され
た場合、そのタンパク質は、その個体のその標的細胞上でその生理学的活性を発
揮する。
【０１７６】 それゆえ、個体における標準的または正常なレベルのフォリスタチン−３活性
における減少によって引き起こされる状態（特に、生殖系の障害）は、フォリス
タチン−３ポリぺプチドの（成熟タンパク質形態で）投与によって処置され得る
ことが理解される。従って、本発明はまた、増大したレベルのフォリスタチン−
３活性を必要とする個体の処置の方法を提供し、この方法は、このような個体に
、このような個体においてフォリスタチン−３活性レベルを増大させるのに有効
な量の本発明の単離されたフォリスタチン−３ポリぺプチド（特に、本発明の成
熟形態のフォリスタチン−３タンパク質）を含む薬学的組成物を投与する工程を
包含する。
【０１７７】 フォリスタチン−３は、アクチビンに結合し、その結果としてレセプターへの
アクチビン結合を妨げる固有の能力によって男性不妊を処置するために使用され
得る。アクチビンレセプター結合は、ＦＳＨ分泌の抑制を生じる。増加したレベ
ルのＦＳＨは、順に精子形成における増加を生じる（Ｙｉｎｇ、Ｓ．−Ｙ．Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｅ．Ｒｅｖ ９：２６７〜２９３（１９８８））。従って、有効な
濃度のアクチビンにおける減少は、精子形成におけるＦＳＨ媒介増加を生じる。
さらに、アクチビンは、以下を含む多くの生物学的効果を誘発する：性腺アンド
ロゲン生合成の調節（Ｈｓｕｅｈ、Ａ．Ｊ．Ｗ，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａ
ｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：５０８２〜５０８６（１９８７））、成長ホ ルモン分泌の減弱（Ｂｉｌｅｚｉｋｊｉａｎ，Ｌ．Ｍ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ １２６：２３６９〜２３７６（１９９０）、赤血球系細胞分化の促進
（Ｅｔｏ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１４
２：１０９５〜１１０３（１９８７））、中胚葉形成の誘導（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．
Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４５：７２９〜７３１（１９９０））、および神経細
胞生存の維持（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８６８〜８
７０（１９９０））；そして、フォリスタチン−３はアクチビン活性を直接的に
阻害するので、フォリスタチン−３は、先に列挙した状態および事象を治療的に
調節および診断的に評価するために使用され得る。フォリスタチン−３はまた、
濾胞性顆粒膜細胞のアクチビン誘導分化を阻害するために使用され得る（Ｎａｋ
ａｍｕｒａ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３５：
１０３〜１０９（１９９２））。フォリスタチン−３は、オートクライン内皮細
胞活性を調節し、結果として新脈管形成を誘導するために治療的に使用され得る
（Ｋｏｚｉａｎ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６：２６７〜２７６（
１９９７））。フォリスタチン−３はまた、アクチビンの活性を阻害し、それに
よって、基底およびアンドロゲン刺激増殖ならびにアポトーシス誘導の観察され
るアクチビン媒介阻害を妨げるために使用され得る（Ｗａｎｇ，Ｑ．Ｆ．ら、Ｅ
ｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：５４７６〜５４８３（１９９６））。フォ
リスタチン−３の発現または存在を増加させるための処置は、性腺刺激細胞腺腫
、骨肉腫、肝細胞ガン、ならびに他の腫瘍およびガン（骨、胸、結腸、リンパ腫
、白血病、上皮ガン、膵臓、胃、肝臓、肺、黒色腫、前立腺、卵巣、子宮、膀胱
、グリオーマ、網膜芽腫、肉腫など）の進行を阻害するために使用され得る（Ｐ
ｅｎａｂａｄ、Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ
．８１：３３９７〜３４０３（１９９６）；Ｋａｔｏ，Ｍ．Ｖ．ら、Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ １２：１３６１〜１３６４（１９９６））。フォリスタチン−３はまた
、創傷治癒を刺激するために使用され得る。この同じ様式において、フォリスタ
チン−３はまた、肝硬変、変形性関節症、および肺性線維症を含む、線維症障害
を処置するために使用され得る。フォリスタチン−３はまた、住血吸虫症、旋毛
虫症、および回虫症においてのように、組織を侵す寄生虫の幼虫を殺傷する特徴
的な機能を有する好酸球の存在を増加させる。フォリスタチン−３は種々の造血
前駆細胞の活性化および分化を調節することによって造血を調節する（例えば、
化学療法後、骨髄からの成熟白血球を放出する、すなわち幹細胞動員において）
ために使用され得る。フォリスタチン−３はまた、敗血症を処置するために使用
され得る。フォリスタチン−３はまた、アクチビン分子とのフォリスタチン−３
の禁止される相互作用を利用することによって治療的に調節され得る、当業者に
公知の多くの疾患状態を処置するために使用され得る。
【０１７８】 （処方物および投与） フォリスタチン−３ポリペプチド組成物は良好な医学的実践に一致した様式で
、個々の患者の臨床状態（特に、フォリスタチン−３ポリペプチド単独での処置
の副作用）、フォリスタチン−３ポリペプチド組成物の送達部位、投与方法、投
与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される
。従って、本明細書における目的のためのフォリスタチン−３ポリペプチドの「
有効量」は、このような考慮事項によって決定される。
【０１７９】 一般的な提案として、１用量あたりに非経口的に投与されるフォリスタチン−
３ポリペプチドの薬学的に有効な総量は、患者の体重あたり約１μｇ／ｋｇ／日
〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であるが、上記のように、これは治療上の裁量を受
ける。より好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、そし
てヒトについて最も好ましくは、ホルモンについて約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と
１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。継続的に投与される場合、フォリスタチン−３
ポリペプチドは、代表的には、約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間
の用量速度で、１日あたり１〜４回の注射によって、または、例えば、ミニポン
プを使用する継続的皮下注入によってのいずれかで投与される。静脈内点滴用バ
ッグ溶液もまた使用され得る。変化を観察するに必要な処置の長さ、および応答
が生じるための処置の後の間隔は、所望の効果に応じて異なるようである。
【０１８０】 本発明のフォリスタチン−３を含有する薬学的組成物は、経口、直腸内、非経
口、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、腟内、腹腔内、局所（粉末、軟
膏、液滴、または経皮パッチによるような）、口腔に（ｂｕｃａｌｌｙ）、また
は経口もしくは経鼻スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリ
ア」とは、非毒性固体、半固体、または液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、
または任意の型の処方補助剤を意味する。本明細書で使用される場合、用語「非
経口（的）」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａ
ｌ）、皮下、および関節内の注射および注入を包含する、投与様式をいう。
【０１８１】 フォリスタチン−３ポリペプチドもまた、徐放系によって適切に投与される。
徐放性組成物の適切な例は、成型製品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセ
ル）の形態における半透過性のポリマーマトリクスを含む。徐放性マトリクスは
、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１号）、Ｌ
−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａ
ｎ、Ｕ．ら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、
ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｂ
ｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）、および
Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））
、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）
−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）を含む。徐放性フォリスタチン−
３ポリペプチド組成物はまた、リポソームに封入されたフォリスタチン−３ポリ
ペプチドを含む。フォリスタチン−３ポリペプチドを含むリポソームは、当該分
野で公知の方法によって調製される（ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８２：３６８８−３６
９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（
ＵＳＡ）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６
，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本
国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号、および同４
，５４４，５４５号；およびＥＰ１０２，３２４）。通常、リポソームは、小さ
な（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、ここで脂質含有率は、
３０モル％コレステロールより多く、選択された比率は、最適なフォリスタチン
−３ポリペプチド治療について調整される。
【０１８２】 非経口投与について、１つの実施態様において、フォリスタチン−３ポリペプ
チドは、一般には、所望の程度の純度で、このポリペプチドを単位投薬量注入可
能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すな
わち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり
、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）と混合することによって処方さ
れる。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤およびポリペプチドにとって有害
であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１８３】 一般に、処方物は、フォリスタチン−３ポリペプチドを、液体キャリアまたは
細かく粉砕した固体キャリアまたは両方と、均一にかつしっかりと接触させるこ
とによって調製される。次いで、必要である場合、産物は、所望の処方物へと成
型される。好ましくは、キャリアは、非経口キャリアであり、より好ましくは、
レシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例
は、水、生理食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液を含む。非水性ビ
ヒクル（例えば、不揮発油およびオレイン酸エチル）もまた、本明細書において
、リポソームと同様に有用である。
【０１８４】 キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物
を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエ
ントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および
他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤
；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたは
トリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイム
ノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸
（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単
糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マン
ノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖ア
ルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナ
トリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、
ポロキサマー）、またはＰＥＧを含む。
【０１８５】 フォリスタチン−３ポリペプチドは、代表的に、このようなビヒクル中で約０
．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの
濃度で、ｐＨ約３〜８で処方される。上記の特定の賦形剤、キャリア、または安
定化剤の使用は、フォリスタチン−３ポリペプチド塩の形成をもたらすことが理
解される。
【０１８６】 治療的な投与について使用されるフォリスタチン−３ポリペプチドは、滅菌さ
れなければならない。滅菌性は、滅菌濾過メンブレン（例えば、０．２ミクロン
メンブレン）を通しての濾過により容易に達成される。治療的フォリスタチン−
３ポリペプチド組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、
皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたは
バイアルへ配置される。
【０１８７】 フォリスタチン−３ポリペプチドは、通常、単位または多用量容器、例えば、
密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液または再構成のための凍結乾燥処
方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌバイアルに、５ｍ
ｌの滅菌濾過１％（ｗ／ｖ）水性フォリスタチン−３ポリペプチド溶液を満たし
、そして得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液を、静菌注射用水（ＷＦＩ）
を用いて凍結乾燥したフォリスタチン−３ポリペプチドを再構成することによっ
て調製する。
【０１８８】 本発明はまた、本発明の薬学的組成物の１以上の成分を満たした１以上の容器
を含む薬学的パックまたはキットを提供する。薬学的製品または生物学的製品の
製造、使用または販売を規制する政府当局によって指示される形式の通知が、こ
のような容器にともない得る。この通知は、ヒトへの投与のための製造、使用ま
たは販売の当局による承認を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは、他の
治療化合物とともに使用され得る。
【０１８９】 （アゴニストおよびアンタゴニスト − アッセイおよび分子） 本発明はまた、アクチビン、アクチビン様分子、またはフォリスタチン−３レ
セプター分子のようなフォリスタチン−３結合分子との相互作用のような、細胞
に対するフォリスタチン−３の作用を増強またはブロックする化合物を同定する
化合物のスクリーニング方法を提供する。アゴニストは、フォリスタチン−３の
天然の生物学的機能を増強させるか、またはフォリスタチン−３と類似する様式
で機能する化合物であり、他方、アンタゴニストは、このような機能を減少また
は消去する。
【０１９０】 本実施態様の別の局面において、本発明は、フォリスタチン−３ポリペプチド
に特異的に結合するアクチビン様分子、またはレセプタータンパク質、または他
のリガンド結合タンパク質を同定するための方法を提供する。例えば、細胞区画
（例えば、メンブレンまたはその調製物）は、フォリスタチン−３を結合する分
子を発現する細胞から調製され得る。調製物は、標識されたフォリスタチン−３
とインキュベートされる。フォリスタチン−３がアクチビン様分子、レセプター
、もしくは他の結合タンパク質に結合した複合体は、当該分野で公知の慣用方法
に従って単離および特徴づけされる。あるいは、フォリスタチン−３ポリペプチ
ドは、固体支持体に結合され得、その結果、細胞から可溶化された結合分子は、
カラムに結合し、次いで溶出され、そして慣用方法に従って特徴づけされる。
【０１９１】 アゴニストまたはアンタゴニストについての本発明のアッセイにおいて、細胞
区画（例えば、メンブレンまたはその調製物）は、フォリスタチン−３を結合す
る分子（例えば、フォリスタチン−３によって調節されるシグナル伝達経路また
は調節経路の分子）を発現する細胞から調製され得る。調製物は、フォリスタチ
ン−３アゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在または存在
下で標識されたフォリスタチン−３とインキュベートされる。候補物質が結合分
子を結合する能力は、標識されたリガンドの結合の減少を反映する。無償に、す
なわちフォリスタチン−３結合分子との結合に対するフォリスタチン−３の効果
を誘導することなく、結合する分子が、良好なアンタゴニストである可能性が最
も高い。良好に結合し、そしてフォリスタチン−３と同一または密接に関連する
効果を惹起する分子はアゴニストである。
【０１９２】 可能性のあるアゴニストおよびアンタゴニストのフォリスタチン−３様の効果
は、例えば、細胞または適切な細胞調製物と候補分子との相互作用後にセカンド
メッセンジャー系の活性を決定すること、およびフォリスタチン−３またはフォ
リスタチン−３と同一の効果を惹起する分子と効果を比較することによって測定
され得る。この点に関して有用であり得るセカンドメッセンジャー系は、ＡＭＰ
グアニル酸シクラーゼ、イオンチャネル、またはホスホイノシチド加水分解物セ
カンドメッセンジャー系を含むがこれらに限定されない。
【０１９３】 フォリスタチン−３アンタゴニストについてのアッセイの別の例は、フォリス
タチン−３および可能性のあるアンタゴニストと、メンブレン結合フォリスタチ
ン−３レセプター分子または組換えフォリスタチン−３レセプター分子とを、競
合阻害アッセイについて適切な条件下で合わせる競合アッセイである。フォリス
タチン−３は、レセプター分子に結合したフォリスタチン−３分子の数を正確に
決定して可能性のあるアンタゴニストの有効性を評価し得るために、例えば、放
射能で標識され得る。
【０１９４】 可能性のあるアンタゴニストは、本発明のポリペプチドに結合し、それによっ
てその活性を阻害するかまたは消去する、有機低分子、ペプチド、ポリペプチド
、および抗体を含む。可能性のあるアンタゴニストはまた、有機低分子、ペプチ
ド、ポリペプチド（例えば、結合分子（例えば、レセプター分子）上の同一の部
位にフォリスタチン−３誘導性活性を誘導せずに結合し、それによりフォリスタ
チン−３が結合することを排除することによってフォリスタチン−３の作用を妨
害する、密接に関連するタンパク質または抗体）であり得る。
【０１９５】 他の可能性のあるアンタゴニストは、アンチセンス分子を含む。アンチセンス
技術を用いて、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを介して、あるいは三重らせん
形成を介して遺伝子発現を制御するために使用され得る。アンチセンス技術は、
多くの研究において考察される（例えば、Ｏｋａｎｏ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ
．５６：５６０（１９９１）；「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎ．」ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ（１９８
８））。三重らせん形成は、同様に、多数の研究においてに考察される（例えば
、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６：３０７３（
１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：４５６（１９８８）；
およびＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３６０（１９９１））。こ
の方法は、相補的ＤＮＡまたはＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく
。例えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’コー
ド部分を使用して、約１０〜４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオ
チドを設計し得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、転写に関与する遺伝子の領域
に相補的であるように設計し、それにより、フォリスタチン−３の転写および産
生を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡ
にハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子のフォリスタチン−３ポリペプチドへ
の翻訳をブロックする。上記のオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡ
またはＤＮＡがインビボで発現されてフォリスタチン−３の産生を阻害するよう
に細胞へと送達され得る。
【０１９６】 アゴニストおよびアンタゴニストは、例えば上記のような薬学的に受容可能な
キャリアとの組成物において使用され得る。
【０１９７】 フォリスタチン−３のアンタゴニストは、例えば、ＦＳＨ、エストロゲン、お
よび他のホルモンにおける欠乏を処置するために使用され得る。フォリスタチン
−１およびフォリスタチン−３は、ＦＳＨおよびエストロゲンの産生および分泌
の強力なインヒビターである。結果として、これらまたは関連するホルモンの欠
乏は、フォリスタチン−３アンタゴニストの使用を介して修正または改善され得
る。フォリスタチン−３アンタゴニストは、アクチビンとのフォリスタチン−３
の相互作用を阻害することによって、精子の産生を予防または阻害または低減さ
せるために使用され得る。フォリスタチン−３のアンタゴニストは、性腺アンド
ロゲン生合成を調整するため、成長ホルモンの分泌を減弱にするため、濾胞性顆
粒膜細胞、赤血球系細胞、および他の細胞型の分化を促進するため、中胚葉形成
を誘導するため、および神経細胞の生存を増加させるために使用され得る。フォ
リスタチン−３アンタゴニストは、腫瘍形成に関連するか、または腫瘍形成から
独立した新脈管形成を阻害するために使用され得る。フォリスタチン−３アンタ
ゴニストはまた、アクチビンの活性を増加させ、それによって基底およびアンド
ロゲン刺激増殖およびアポトーシス誘導の観察されるアクチビン媒介阻害を増加
させる際に有用であり得る。フォリスタチン−３のアンタゴニストは、特定の自
己免疫および慢性炎症および感染性疾患において、ホルモン環境および増殖因子
環境、そして結果的に、マクロファージおよびそれらの前駆体、ならびに好中球
、好塩基球、Ｂリンパ球およびいくつかのＴ細胞サブセット（例えば、活性化お
よびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）の活性を調節するた
めに使用され得る。自己免疫疾患の例としては、多発性硬化症、およびインスリ
ン依存性糖尿病が挙げられる。アンタゴニストはまた、単核食細胞の活性化状態
を変えることによる、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症を含む感染性
疾患の処置に使用され得る。これらはまた、好酸球の産生および活性化を防ぐこ
とによる、特発性好酸球増多症候群の処置のために使用され得る。内毒素性ショ
ックはまた、マクロファージの活性化を妨げることによってアンタゴニストによ
って処置され得る。上記の任意のアンタゴニストは、例えば本明細書中以後に記
載されるような薬学的に受容可能なキャリアとの組成物内において使用され得る
。
【０１９８】 （遺伝子マッピング） 本発明の核酸分子はまた、染色体同定に有用である。この配列は、個々のヒト
染色体上の特定の位置に特異的に標的化され、そしてその位置とハイブリダイズ
し得る。さらに、染色体における特定の部位を同定することへの必要性が現在存
在する。実際の配列データ（反復多型性）に基づく染色体マーキング試薬は現在
、染色体位置をマークするのにはほどんと利用可能ではない。本発明に従う染色
体へのＤＮＡのマッピングは、それらの配列を、疾患に関連した遺伝子と相関づ
けることにおいて重要な第一段階である。
【０１９９】 この点における特定の好ましい実施態様において、本明細書中で開示されるｃ
ＤＮＡは、フォリスタチン−３遺伝子のゲノムＤＮＡをクローニングするために
用いられる。これは、一般的に市販されている、種々の周知の技術およびライブ
ラリーを用いて達成され得る。次いで、この目的のための周知の技術を用いて、
インサイチュ染色体マッピングのためにゲノムＤＮＡが用られる。
【０２００】 さらに、いくつかの場合において、配列は、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（
好ましくは、１５〜２５ｂｐ）を調製することにより、染色体にマッピングされ
得る。遺伝子の３’非翻訳領域のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡに
おいて１より多いエキソンにまたがらず、従って、増幅プロセスを複雑化しない
プライマーを迅速に選択する。次いで、これらのプライマーは、個々のヒト染色
体を含有する体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングのために用いられる。
中期染色体スプレッドに対するｃＤＮＡクローンの蛍光インサイチュハイブリダ
イゼーション（「ＦＩＳＨ」）を用いて、一工程で、正確な染色体位置を提供し
得る。この技術は、５０または６０ｂｐ程度の短いｃＤＮＡ由来のプローブと共
に用いられ得る。（この技術の概説については、Ｖｅｒｍａら、Ｈｕｍａｎ Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を
参照のこと）。
【０２０１】 一旦、配列が正確な染色体位置にマッピングされると、染色体上の配列の物理
的な位置は、遺伝子マップデータと相関づけられ得る。このようなデータは、例
えば、Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ＭｃＫｕｓｉｃｋ Ｖ．， Ｍｅｎｄｅ
ｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ Ｉｎ Ｍａｎ（Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎ
ｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｅｌｃｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙか
らオンラインで入手可能である））に見出される。次いで、同じ染色体領域にマ
ッピングされた遺伝子と疾患との間の関係が、連鎖解析（物理的に隣接した遺伝
子の共遺伝）によって同定される。
【０２０２】 次に、罹患個体と非罹患個体との間でのｃＤＮＡまたはゲノム配列における差
異を決定することが必要である。変異がいくつかまたは全ての罹患個体において
認められるが、いずれの正常個体にも認められない場合、その変異は、疾患の原
因因子である可能性が高い。
【０２０３】 本発明に一般的に記載されるように、以下の実施例を参照することにより、本
発明は、より容易に理解されるが、以下の実施例は、例示の目的で提供され、限
定として意図されない。
【０２０４】 （実施例） （実施例１（ａ）：Ｅ．ｃｏｌｉにおける「Ｈｉｓタグ化」フォリスタチン
−３の発現および精製） 細菌性発現ベクターｐＨＥ−４を、本実施例において、細菌性発現のために使
用する。ｐＨＥ−４はアンピシリン抗生物質耐性（「Ａｍｐｒ」）をコードし、
そして細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソー
ム結合部位（「ＲＢＳ」）、ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出から市販され
ているニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂を使
用するアフィニティー精製を可能にするヒスチジン残基をコードする６つのコド
ン、および適切な単一の制限酵素切断部位を含む。これらのエレメントは、ポリ
ペプチドをコードする挿入されたＤＮＡフラグメントが、そのポリペプチドのア
ミノ末端に共有結合した６つのＨｉｓ残基（すなわち、「６×Ｈｉｓタグ」）を
有するそのポリペプチドを発現するように、配置される。
【０２０５】 フォリスタチン−３アミノ酸配列の成熟形態を含むフォリスタチン−３の所望
の部分をコードするＤＮＡ配列を、フォリスタチン−３の所望の部分のアミノ末
端配列およびｃＤＮＡコード配列の３’に対する寄託された構築物における配列
にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、寄託されたｃ
ＤＮＡクローンから増幅する。ｐＨＥ−４ベクターにおけるクローニングを容易
にするために制限部位を含むさらなるヌクレオチドを、それぞれ５’および３’
プライマー配列に加える。
【０２０６】 フォリスタチン−３タンパク質の成熟形態をクローニングするために、５’プ
ライマーは、下線を付したＮｄｅＩ制限部位に続いて配列番号２の成熟フォリス
タチン−３配列のアミノ末端コード配列の１６ヌクレオチド配列を含む、配列５
’ＴＣＡ ＣＧＣ ＣＡＴ ＡＴＧ ＧＧＣ ＴＣＧ ＧＧＧ ＡＡＣ Ｃ ３
’（配列番号５）を有する。当業者は、当然ながら、タンパク質コード配列にお
ける５’プライマーが開始する点が、タンパク質の成熟形態よりもより短いかま
たはより長い完全フォリスタチン−３タンパク質の任意の所望の部分をコードす
るＤＮＡセグメントを増幅するよう変化させ得ることを認識する。３’プライマ
ーは、下線を付したＡｓｐ７１８制限部位に続いて図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃの
フォリスタチン−３ ＤＮＡ配列のコード配列の３’末端に相補的な２つの終止
コドン２３ヌクレオチドを含む、配列５’ＣＡＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ Ｔ
ＴＡ ＴＴＡ ＣＡＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ Ｔ
Ｇ ３’（配列番号１３）を有する。
【０２０７】 増幅されたフォリスタチン−３ ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐＨＥ４
を、ＮｄｅＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで消化したＤＮＡを互いに連結
する。フォリスタチン−３ ＤＮＡの制限されたｐＨＥ４ベクターへの挿入は、
ＩＰＴＧ誘導性プロモーターから下流の、ならびに開始ＡＵＧおよび６つのヒス
チジンコドンにインフレームのフォリスタチン−３タンパク質コード領域を配置
する。
【０２０８】 連結混合液を、Ｓａｍｂｒｏｏｋおよび共同研究者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．
； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓ
ｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ （１９８９））に記載
のような標準的な手順を使用してコンピテントなＥ． ｃｏｌｉ細胞に形質転換
する。プラスミドｐＲＥＰ４（ｌａｃリプレッサーを発現し、そしてカナマイシ
ン耐性を付与する（「Ｋａｎｒ」））の多コピーを含むＥ． ｃｏｌｉ株Ｍ１５
／ｒｅｐ４を、本明細書に記載される例示的な実施例を実行するために使用する
。フォリスタチン−３タンパク質を発現するのに適切な多くの内の１つにすぎな
いこの株は、市販されている（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前出）。形質転換体
を、アンピシリンおよびカナマイシンの存在下でＬＢプレート上で増殖するそれ
らの能力によって同定する。プラスミドＤＮＡを、耐性コロニーから単離し、そ
してクローン化されたＤＮＡの同一性を、制限分析、ＰＣＲ、およびＤＮＡ配列
決定によって確認する。
【０２０９】 所望の構築物を含むクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびカ
ナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）の両方を補充したＬＢ培地における液体培養で一
晩（「Ｏ／Ｎ」）増殖させる。Ｏ／Ｎ培養物を用いて約１：２５〜１：２５０の
希釈率で大規模培養物に接種した。細胞を、約０．４と０．６との間の６００ｎ
ｍでの光学密度（「ＯＤ６００」）まで増殖させる。次いで、イソプロピル−β
−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を添加して１ｍＭの最終濃度に
し、ｌａｃＩリプレッサーを不活化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性
プロモーターからの転写を誘導する。細胞をさらに３時間から４時間の間、引き
続きインキュベートする。次いで細胞を遠心分離により採集する。
【０２１０】 次いで細胞を３〜４時間４℃にて、６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８中で撹拌
する。細胞細片を遠心分離によって除去し、そしてフォリスタチン−３を含む上
清を、ニッケルニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラ
ム（ＱＵＩＡＧＥＮ， ＩＮＣ．， 前出）にロードする。６×Ｈｉｓタグを有
するタンパク質は、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に高い親和性で結合し、そして簡単な一工
程の手順で精製され得る（詳細には、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ， １
９９５， ＱＵＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， 前出を参照のこと）。簡潔には、上
清を６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８中でカラムにロードし、このカラムを最初
に１０容量の６Ｍ 塩酸グアニジン、ｐＨ ８で洗浄し、次いで１０容量の６Ｍ
塩酸グアニジン、ｐＨ ６で洗浄し、そして最後にフォリスタチン−３を６Ｍ
塩酸グアニジン、ｐＨ ５で溶出させる。
【０２１１】 次いで精製したタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０
ｍＭ Ｎａ−酢酸、ｐＨ ６緩衝液および２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析す
ることによって再生させる。あるいは、タンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム上に
固定されている間に首尾よく再折り畳み得る。推奨される条件は、以下の通りで
ある：プロテアーゼインヒビターを含む、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセ
ロール、２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ７．４中での線型６Ｍ−１Ｍ尿
素勾配を用いる再生。再生を１．５時間以上の時間にわたって行うべきである。
再生後、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールの添加によって溶出し得る。イミ
ダゾールを、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ ６緩衝液および２００
ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析工程によって除去する。精製したタンパク質を
４℃で保存するか、または−８０℃にて凍結させる。
【０２１２】 以下の代替的な方法を、それが封入体の形態で存在する場合の、Ｅ． ｃｏｌ
ｉにおいて発現されたフォリスタチン−３を精製するために使用し得る。他に特
定されない限り、すべての以下の工程を４〜１０℃で行う。
【０２１３】 Ｅ． ｃｏｌｉ発酵の生産相の完了に際して、細胞培養物を、４〜１０℃に冷
却し、そして細胞を１５，０００ｒｐｍにおける連続的な遠心分離（Ｈｅｒａｅ
ｕｓ Ｓｅｐａｔｅｃｈ）によって収穫する。細胞ペーストの単位重量あたりの
タンパク質の予測される収量および必要とされる精製タンパク質の量に基づいて
、細胞ペーストの適切な量（重量による）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ
ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を含む緩衝溶液中に懸濁する。細胞を、高剪断ミキサ
ーを使用して均質な懸濁液に分散させる。
【０２１４】 次いで、ミクロフルーダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ， Ｃｏｒｐ．
またはＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ， Ｉｎｃ．）に溶液を通過させる（４０００〜
６０００ｐｓｉ、２回）ことにより、細胞を溶解させた。次いでホモジネートを
、ＮａＣｌ溶液と混合して最終濃度０．５ Ｍ ＮａＣｌにし、その後７０００
×ｇで１５分間遠心分離する。得られるペレットを、再度０．５ Ｍ ＮａＣｌ
、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４を用いて洗浄する
。
【０２１５】 得られる洗浄した封入体を、１．５Ｍ 塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）で２〜
４時間可溶化する。７０００×ｇで１５分間遠心分離後、ペレットを捨て去り、
そしてフォリスタチン−３ポリペプチドを含む上清を４℃で一晩インキュベート
し、さらなるＧｕＨＣｌ抽出を可能にする。
【０２１６】 不溶性粒子を取り除くための高速遠心分離（３０，０００×ｇ）の後、ＧｕＨ
Ｃｌ可溶化タンパク質を、ＧｕＨＣｌ抽出物と２０容量の５０ｍＭ ナトリウム
、ｐＨ ４．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液を、激
しく撹拌しながら迅速に混合することによって、再折り畳みさせる。再折り畳み
した希釈タンパク質溶液を、さらなる精製工程の前の１２時間、混合することな
く４℃に保つ。
【０２１７】 再折り畳みしたフォリスタチン−３ポリペプチド溶液を清澄化するために、あ
らかじめ準備した、適切な表面領域に０．１６μｍメンブレンフィルターを備え
る、４０ｍＭ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０で平衡化したタンジェントろ過ユニ
ット装置（例えば、Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用する。ろ過した試料を、陽イオン交
換樹脂（例えば、Ｐｏｒｏｓ ＨＳ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ）にロードする。カラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．
０、で洗浄し、そして同じ緩衝液中の２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭ、
および１５００ｍＭ ＮａＣｌで、段階的な様式で溶出する。溶出液の２８０ｎ
ｍにおける吸光度を、連続的にモニターする。画分を収集し、そしてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによってさらに分析する。
【０２１８】 次いでフォリスタチン−３ポリペプチドを含む画分をプールし、そして４容量
の水と混合する。次いで希釈した試料を、あらかじめ準備した強陰イオン交換樹
脂（Ｐｏｒｏｓ ＨＱ−５０， Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
）のカラムおよび弱陰イオン交換樹脂（Ｐｏｒｏｓ ＣＭ−２０， Ｐｅｒｓｅ
ｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカラムの直列のセットにロードする。カ
ラムを、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０で平衡化する。両方のカラムを
、４０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．０、２００ｍＭ ＮａＣｌで洗浄する。
次いで ＣＭ−２０カラムを、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、
ｐＨ ６．０から１．０Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ６．５
の範囲の１０カラム容量の線形勾配を用いて溶出する。溶出液の一定のＡ280モ ニタリング下で画分を回収する。次に、フォリスタチン−３ポリペプチドを含む
画分（例えば、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する）をプールする。
【０２１９】 得られるフォリスタチン−３ポリペプチドは、上記の再折り畳みおよび精製工
程後に９５％より高い純度を示す。５μｇの精製タンパク質をロードする場合に
、クマシーブルー染色した１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで主要な混在バンドは観
察されない。精製したタンパク質はまた、内毒素／ＬＰＳ混在についてまた試験
され、そして代表的にはＬＰＳ含量は、ＬＡＬアッセイに従って０．１ｎｇ／ｍ
ｌ未満である。
【０２２０】 （実施例２：バキュロウイルス発現系におけるフォリスタチン−３タンパク
質のクローニングおよび発現） この例示的実施例において、プラスミドシャトルベクターｐＡ２を用いて、そ
の天然に付随する分泌シグナル（リーダー）配列を含む、完全タンパク質をコー
ドするクローニングされたＤＮＡを、成熟フォリスタチン−３タンパク質を発現
するためにバキュロウイルスに、Ｓｕｍｍｅｒｓおよび共同研究者（Ａ Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏ
ｒｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｓ、Ｔｅｘａｓ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｓｔ
ａｔｉｏｎ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ 第１５５５号（１９８７））に記載のような標
準的な方法を用いて挿入する。この発現ベクターは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃ
ａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）の強力なポリヘドリ
ンプロモーターを含み、続いてＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８のよう
な都合良い制限部位を含む。シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）のポリアデ
ニル化部位を、効率的なポリアデニル化のために用いる。組換えウイルスの平易
な選択のために、プラスミドは、同じ方向で、弱いＤｒｏｓｏｐｈｉｌａプロモ
ーターの制御下で、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含み、続い
て、ポリヘドリン遺伝子のポリアデニル化シグナルを含む。挿入された遺伝子に
は、野生型ウイルスＤＮＡとの細胞媒介性相同組換えのためにウイルス配列が両
側に隣接して、クローニングされたポリヌクレオチドを発現する生存可能なウイ
ルスを産生する。
【０２２１】 当業者に容易に理解されるように、構築物が、必要ならば、シグナルペプチド
およびインフレームＡＵＧを含む、転写、翻訳、分泌などのための適切に配置さ
れたシグナルを提供する限り、多くの他のバキュロウイルスベクターを、上記の
ベクターの代わりに用い得る（例えば、ｐＡｃ３７３、ｐＶＬ９４１、およびｐ
ＡｃＩＭ１）。このようなベクターは、例えば、Ｌｕｃｋｏｗおよび共同研究者
（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１〜３９（１９８９））に記載される。
【０２２２】 寄託されたクローン中に、全長フォリスタチン−３タンパク質をコードするｃ
ＤＮＡ配列（ＡＵＧ開始コドン、および配列番号２に示される天然に付随するリ
ーダー配列を含む）を、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリ
ゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅する。５’プライマーは、下線を付した
ＢａｍＨＩ制限酵素部位、真核生物細胞における翻訳の開始のための効果的なシ
グナル（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９４７−９５０（
１９８７））、続いて、図１Ａに示される完全フォリスタチン−３タンパク質の
配列の２２ヌクレオチドを含み、ＡＵＧ開始コドンで始まる、配列５’ＣＡＴ
ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＡＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＧＧ
ＧＣＧ ＣＣＡ ＧＧＧ Ｃ ３’（配列番号１４）を有する。３’プライマー
は、下線を付したＡｓｐ７１８制限部位に続いて図１Ａの３’非コード配列に相
補的な２３ヌクレオチドを含む、配列５’ＣＡＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ Ｔ
ＣＡ ＣＡＣ ＧＡＡ ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧ ３’
（配列番号１５）を有する。
【０２２３】 増幅されたフラグメントを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」ＢＩＯ
１０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて、１％アガロースゲ
ルから単離する。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８
で消化し、そして、再度１％アガロースゲル上で精製する。このフラグメントを
本明細書において「Ｆ１」と称する。
【０２２４】 プラスミドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そして必要
に応じて、当該分野で公知の慣用手順を用いて、仔ウシ腸ホスファターゼを用い
て脱リン酸化し得る。次いで、このＤＮＡを、市販のキット（「Ｇｅｎｅｃｌｅ
ａｎ」ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ）を用いて１％
アガロースゲルから単離する。このベクターＤＮＡを、本明細書中で「Ｖ１」と
称する。
【０２２５】 フラグメントＦ１および脱リン酸化プラスミドＶ１を一緒に、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼで連結する。Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ，
ＣＡ）細胞のような他の適切なＥ．ｃｏｌｉ宿主を、連結混合物で形質転換し、
そして培養プレートに塗布する。ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８を用いて個々の
コロニーからのＤＮＡを消化すること、次いでゲル電気泳動による消化産物の分
析によってヒトフォリスタチン−３遺伝子を有するプラスミドを含む細菌を同定
する。クローニングされたフラグメントの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認
する。このプラスミドを、本明細書中で、ｐＡ２フォリスタチン−３と称する。
【０２２６】 ５μｇのプラスミドｐＡ２フォリスタチン−３を、Ｆｅｌｇｎｅｒおよび共同
研究者ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−
７４１７（１９８７））によって記載されるリポフェクション法を用いて、１．
０μｇの市販の線状化バキュロウイルスＤＮＡ（「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄTM ｂ
ａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ」， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅ
ｇｏ， ＣＡ．）とともに同時トランスフェクトする。１μｇのＢａｃｕｌｏＧ
ｏｌｄTMウイルスＤＮＡおよび５μｇのプラスミドｐＡ２フォリスタチン−３を
、５０μｌの無血清グレース培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎ
ｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を含むマイクロタイタープレート
の滅菌ウェル中で混合する。その後、１０μｌのリポフェクチンおよび９０μｌ
のグレース培地を添加し、混合し、そして室温にて１５分間インキュベートする
。次いで、このトランスフェクション混合物を、無血清グレース培地１ｍｌを有
する３５ｍｍ組織培養プレート内に播種されたＳｆ９昆虫細胞（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ １７１１）に滴下する。次いでプレートを、２７℃で５時間インキュベート
する。次いで、トランスフェクション溶液をプレートから除去し、そして１０％
ウシ胎児血清を補充した１ｍｌのグレース昆虫培地を添加する。次いで培養を、
２７℃で４日間継続する。
【０２２７】 ４日後、上清を回収し、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ（前出）に記
載されるようにプラークアッセイを行う。「Ｂｌｕｅ Ｇａｌ」（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を有するア
ガロースゲルを用いて、青色染色されたプラークを生じるｇａｌ発現クローンの
簡素な同定および単離を可能にする。（このタイプの「プラークアッセイ」の詳
細な説明はまた、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、 Ｇａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ、によって配布される昆虫細胞培養およびバキュロウイルス学
のための使用者ガイド（９〜１０頁）においても見い出され得る）。適切なイン
キュベーション後、青色染色されたプラークをマイクロピペッター（例えば、Ｅ
ｐｐｅｎｄｏｒｆ）のチップで拾う。次いで、組換えウイルスを含む寒天を、２
００μｌのグレース培地を含む微小遠心管中に再懸濁する。そして、組換えバキ
ュロウイルスを含む懸濁液を用いて、３５ｍｍディッシュに播種されたＳｆ９細
胞に感染させる。４日後、これらの培養ディッシュの上清を収集し、次いでそれ
らを４℃で保存する。この組換えウイルスをＶ−フォリスタチン−３と称する。
【０２２８】 フォリスタチン−３遺伝子の発現を確認するために、Ｓｆ９細胞を、１０％熱
非働化ＦＢＳを補充したグレース培地中で増殖させる。細胞に、約２の感染多重
度（「ＭＯＩ」）で組換えバキュロウイルスＶ−フォリスタチン−３を感染させ
る。放射標識タンパク質が所望される場合、６時間後にその培地を除去し、そし
てメチオニンおよびシステインを除いたＳＦ９００ ＩＩ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤから入手可能
）に置き換える。４２時間後、５μＣｉの35Ｓ−メチオニンおよび５μＣｉの35 Ｓ−システイン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手可能）を添加する。細胞をさらに１
６時間インキュベートし、次いで細胞を遠心分離により収集する。上清中のタン
パク質および細胞内タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて（放射性標識された
場合）オートラジオグラフィーにより分析する。
【０２２９】 精製タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列の微量配列決定を用いて、フォリ
スタチン−３タンパク質の成熟形態のアミノ末端配列、従って、天然に付随する
分泌シグナルペプチドの切断点および長さを決定し得る。
【０２３０】 フォリスタチン−３タンパク質は、バキュロウイルス発現系における上記のプ
ロセスによって産生された。得られるフォリスタチン−３ポリペプチドを単離し
、そしてＣ末端配列決定分析を使用して、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（および配
列番号２）において示されるように全長フォリスタチン−３ポリペプチドのＮ末
端２６アミノ酸が切断されること、およびフォリスタチン−３ポリペプチドの成
熟形態が、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃの番号付けスキームによるＮ末端残基のメ
チオニン−２７（これは、配列番号２の番号付けスキームによるメチオニン−１
と同一である）で始まるという予測を確認した。当然のことながら、分泌型タン
パク質の観察された成熟形態が、先に詳述するような多くの因子によって変化し
得ることを覚えておくことは重要である。
【０２３１】 （実施例３：哺乳動物細胞におけるフォリスタチン−３のクローニングおよ
び発現） 代表的な哺乳動物発現ベクターは、プロモーターエレメント（ｍＲＮＡの転写
の開始を媒介する）、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写物
のポリアデニル化に必要なシグナルを含む。さらなるエレメントとしては、エン
ハンサー、Ｋｏｚａｋ配列、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナー部位
およびアクセプター部位に隣接する介在配列が挙げられる。非常に効率的な転写
を、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（例えば、Ｒ
ＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩ）由来の長末端反復（ＬＴＲ）ならびにサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターを用いて達成し得る。しかし、細胞性
エレメント（例えば、ヒトアクチンプロモーター）もまた使用され得る。本発明
の実施における使用に適切な発現ベクターとしては、例えば、ｐＳＶＬおよびｐ
ＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶ
ｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）
、ならびにｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）のようなベクターが挙げら
れる。使用され得る哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ細胞、２９３細胞
、Ｈ９細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＣ１２７細
胞、Ｃｏｓ１細胞、Ｃｏｓ７細胞およびＣＶ１細胞、ウズラＱＣ１−３細胞、マ
ウスＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる
。
【０２３２】 あるいは、遺伝子は、染色体に組み込まれたその遺伝子を含む安定な細胞株に
おいて発現され得る。選択マーカー（例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ネオマイシン
、ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションは、トランスフェクトされ
た細胞の同定および単離を可能にする。
【０２３３】 トランスフェクトされた遺伝子はまた、増幅され、大量のコードされたタンパ
ク質を発現し得る。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、目的の
遺伝子の数百または数千ものコピーを有する細胞株を開発するのに有用である。
別の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒ
ｐｈｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）；Ｂｅ
ｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（
１９９２））。これらのマーカーを使用して、哺乳動物細胞を選択培地において
増殖させ、そして最も高い耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞株は染色
体に組み込まれた増幅された遺伝子を含む。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ
Ｏ）細胞およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生にしばしば使用される。
【０２３４】 発現ベクターｐＣ１およびｐＣ４は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモータ
ー（ＬＴＲ）（Ｃｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌ． Ｂｉｏｌ．５ ４３８−
４４７（１９８５））およびＣＭＶエンハンサーのフラグメント（Ｂｏｓｈａｒ
ｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０（１９８５））を含む。複数のクローニ
ング部位（例えば、制限酵素切断部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１
８を有する）は、目的の遺伝子のクローニングを容易にする。ベクターはさらに
、ラットプレプロインシュリン遺伝子の３'イントロン、ポリアデニル化シグナ ル、および終結シグナルを含む。
【０２３５】 （実施例３（ａ）：ＣＯＳ細胞におけるクローニングおよび発現） 発現プラスミドｐフォリスタチン−３ＨＡを、フォリスタチン−３タンパク質
の成熟形をコードするｃＤＮＡの一部を発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐまた
はｐｃＤＮＡＩＩＩ（これは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．から入手し得
る）にクローニングすることによって作製する。
【０２３６】 発現ベクターｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐは以下を含む：（１）Ｅ．ｃｏｌｉおよび
他の原核生物細胞における増殖に有効なＥ．ｃｏｌｉ複製起点；（２）プラスミ
ド含有原核生物細胞の選択のためのアンピシリン耐性遺伝子；（３）真核生物細
胞における増殖のためのＳＶ４０複製起点；（４）ＣＭＶプロモーター、ポリリ
ンカー、ＳＶ４０イントロン；（５）ｃＤＮＡが都合良くＣＭＶプロモーターの
発現制御下におかれ、そしてポリリンカーにおける制限部位によってＳＶ４０イ
ントロンおよびポリアデニル化シグナルに作動可能に連結され得るように配置さ
れた、赤血球凝集素フラグメントをコードするいくつかのコドン（すなわち、精
製を容易にするための「ＨＡ」タグ）に続く終止コドンおよびポリアデニル化シ
グナル。ＨＡタグは、Ｗｉｌｓｏｎおよび共同研究者（Ｃｅｌｌ ３７：７６７
（１９８４））によって記載されたインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由
来するエピトープに対応する。標的タンパク質へのＨＡタグの融合は、ＨＡエピ
トープを認識する抗体を用いた、組換えタンパク質の容易な検出および回収を可
能にする。ｐｃＤＮＡＩＩＩはさらに、選択可能なネオマイシンマーカーを含む
。
【０２３７】 完全フォリスタチン−３ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、組
換えタンパク質発現がＣＭＶプロモーターによって指向されるように、ベクター
のポリリンカー領域にクローンニングする。プラスミド構築戦略は、以下のとお
りである。寄託されたクローンのフォリスタチン−３ ｃＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌ
ｉにおけるフォリスタチン−３発現のためのベクターの構築について先に記載さ
れるのとほとんど同じように、都合の良い制限部位を含むプライマーを用いて増
幅する。適切なプライマーは、以下の本実施例に使用されたプライマーを含む。
５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ部位、コザック配列、ＡＵＧ開始コ
ドン、および完全フォリスタチン−３ポリペプチドの５’コード領域の２２ヌク
レオチドを含み、以下の配列を有する：５’ＣＡＴ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ
ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＣＧ ＣＣＡ ＧＧＧ
Ｃ ３’（配列番号１６）。３’プライマーは、下線を付したＡｓｐ７１８、お
よび終止コドン直前の３’コード配列に相補的な２３ヌクレオチドを含み、以下
の配列を有する：５’ＴＣＡ ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＡＣ ＧＡＡ ＧＴ
Ｔ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧ ３’（配列番号１７）。
【０２３８】 ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐを、Ｂａ
ｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次いで連結する。連結混合物を、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ株ＳＵＲＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７）に形質転換し、そして形質転換培養物
を、アンピシリン培地プレートへプレーティングし、次いで、インキュベートし
てアンピシリン耐性コロニーを増殖させる。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーか
ら単離し、そして完全フォリスタチン−３ポリペプチドをコードするフラグメン
トの存在について制限分析または他の手段によって試験する。
【０２３９】 組換えフォリスタチン−３の発現のために、ＣＯＳ細胞を、例えば、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋおよび共同研究者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ（１９８９））に記載のようにＤＥＡＥ−ｄｅｘｔｒａｎを用いて、上記
のように発現ベクターでトランスフェクトする。細胞を、ベクターによるフォリ
スタチン−３の発現のための条件下でインキュベートする。
【０２４０】 フォリスタチン−３−ＨＡ融合タンパク質の発現を、例えば、Ｈａｒｌｏｗお
よび共同研究者（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，第２版； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ（１９８８））に記載の方法を用いて放射標識化および免疫沈降法によって
検出する。この目的のため、トランスフェクションの２日後に、細胞を、35Ｓ−
システインを含む培地中で８時間インキュベートすることによって標識する。細
胞および培地を採取し、そして細胞を洗浄し、そしてＷｉｌｓｏｎおよび共同研
究者（前出）に記載されるように界面活性剤含有ＲＩＰＡ緩衝液：１５０ｍＭ
ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％ ＳＤＳ、１％ ＮＰ−４０、０．５％
ＤＯＣ、５０ｍＭ ＴＲＩＳ、ｐＨ ７．５で溶解する。タンパク質を、ＨＡ
特異的モノクローナル抗体を用いて細胞溶解物および培養培地から沈降する。次
いで、沈降されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィ
ーによって分析する。期待されるサイズの発現産物は、細胞溶解物において観察
され、これはネガティブコントロールにおいては見られない。
【０２４１】 （実施例３（ｂ）：ＣＨＯ細胞におけるクローニングおよび発現） ベクターｐＣ４を、フォリスタチン−３ポリペプチドの発現のために使用する
。プラスミドｐＣ４は、プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７
１４６）の誘導体である。このプラスミドは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御
下で、マウスＤＨＦＲ遺伝子を含む。これらのプラスミドでトランスフェクトさ
れているジヒドロ葉酸活性を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞または他
の細胞は、化学療法剤メトトレキサートを補充した選択培地（αマイナスＭＥＭ
、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で細胞を増殖させることによって選
択され得る。メトトレキサート（ＭＴＸ）に耐性である細胞におけるＤＨＦＲ遺
伝子の増幅は、十分に考証されている（例えば、 Ａｌｔ， Ｆ．Ｗ．ら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：１３５７−１３７０（１９７８）、Ｈａｍｌｉｎ
，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ． １９９０，ｅｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ． Ａｃｔａ， １０９７：１０７−１４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．
Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６
４−６８（１９９１）を参照のこと）。漸増濃度のＭＴＸにおいて増殖した細胞
は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として、標的酵素ＤＨＦＲを過剰産生すること
によって薬物への耐性を生じる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子と連鎖する場合
、通常、同時増幅され、そして過剰発現される。増幅した遺伝子の１，０００を
超えるコピーを有する細胞株を開発するためにこのアプローチを使用し得ること
は、当該分野において公知である。続いて、メトトレキサートが取り除かれると
、宿主細胞の１つ以上の染色体に組み込まれた増幅遺伝子を含む細胞株が得られ
る。
【０２４２】 プラスミドｐＣ４は、目的の遺伝子の発現のために、ラウス肉腫ウイルス（Ｃ
ｕｌｌｅｎら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．，：４３８−４４７（１９８
５））の長末端反復（ＬＴＲ）の強力なプロモーター、およびヒトサイトメガロ
ウイルス（ＣＭＶ）（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （
１９８５））の前初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメントを含む
。プロモーターの下流には、遺伝子の組み込みを可能にする以下の単一の制限酵
素切断部位が存在する：ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、およびＡｓｐ７１８。これらの
クローニング部位の後ろに、プラスミドは、ラットプレプロインスリン遺伝子の
３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含む。他の高効率プロモーター（例
えば、ヒトβアクチンプロモーター、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、
または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬＶＩ）由来の長末端反
復）もまた、発現のために使用され得る。ＣｌｏｎｔｅｃｈのＴｅｔ−Ｏｆｆお
よびＴｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系および類似する系は、哺乳動物細胞において調節
された方法でフォリスタチン−３ポリペプチドを発現するために使用され得る（
Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポ
リアデニル化のために、他のシグナル（例えば、ヒト成長ホルモンまたはグロビ
ン遺伝子由来）も、同様に使用され得る。染色体に組み込まれた目的の遺伝子を
有する安定な細胞株もまた、選択マーカー（例えば、ｇｐｔ、Ｇ４１８、または
ハイグロマイシン）との同時トランスフェクションに際して選択され得る。最初
は、１つより多い選択マーカー（例えば、Ｇ４１８およびメトトレキサート）を
使用することが、有利である。
【０２４３】 プラスミドｐＣ４を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、次い
で仔ウシ腸ホスファターゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を用いて、当該分野で公知の
手順によって脱リン酸化する。次いで、ベクターを、１％アガロースゲルから単
離する。完全フォリスタチン−３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、遺伝
子の所望の部分の５’および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ
イマーを用いて増幅する。５’プライマーは、下線を付したＢａｍＨＩ部位、コ
ザック配列、ＡＵＧ開始コドン、および完全フォリスタチン−３ポリペプチドの
５’コード領域の２２ヌクレオチドを含み、以下の配列を有する：５’ＣＡＴ
ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＧＴ ＣＣＣ ＧＧＧ
ＧＣＧ ＣＣＡ ＧＧＧ Ｃ ３’（配列番号１８）。３’プライマーは、下線
を付したＡｓｐ７１８制限部位および図１Ａ（配列番号１）に示されるような終
止コドンの直前に３’コード配列に相補的な２３ヌクレオチドを含み、以下の配
列を有する：５’ＣＡＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＧＡＡ
ＧＴＴ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＴＧ ３’（配列番号１９）。
【０２４４】 増幅させたフラグメントを、エンドヌクレアーゼであるＢａｍＨＩおよびＡｓ
ｐ７１８で消化し、次いで１％アガロースゲルで再度精製する。次いで、単離し
たフラグメントおよび脱リン酸化ベクターを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結する
。次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換
し、そして例えば制限酵素分析を用いてプラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメ
ントを含む細菌を同定する。
【０２４５】 活性なＤＨＦＲ遺伝子を欠如するチャイニーズハムスター卵巣細胞を、トラン
スフェクションのために使用する。５μｇの発現プラスミドｐＣ４を、リポフェ
クチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒら、前出）を用いて、０．５μｇのプラスミドｐＳＶ
ｎｅｏとともに同時トランスフェクトする。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、優
性選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を与える酵素をコ
ードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含む。細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８
を補充したαマイナスＭＥＭに播種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、そ
して１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサートおよび１ｍｇ／ｍｌ
Ｇ４１８を補充したαマイナスＭＥＭ中のハイブリドーマクローニングプレー
ト（Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に播種する。約１０〜１４日後、単一
のクローンをトリプシン処理し、次いで異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎ
Ｍ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて、６ウェルペ
トリ皿または１０ｍｌフラスコに播種する。次いで、最高濃度のメトトレキサー
トで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキサート（１μＭ、２μＭ、
５μＭ、１０μＭ、２０μＭ）を含む新たな６ウェルプレートに移す。同じ手順
を、１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで繰り返す。所
望の遺伝子産物の発現を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
分析または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析する。
【０２４６】 フォリスタチン−３タンパク質は、ＣＨＯ細胞発現系における上記のプロセス
によって産生された。得られたフォリスタチン−３ポリペプチドを単離し、Ｃ末
端配列決定分析を使用して、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（および配列番号２）に
おいて示されるように全長フォリスタチン−３ポリペプチドのＮ末端２６アミノ
酸が切断されること、およびフォリスタチン−３ポリペプチドの成熟形態が、図
１Ａ、１Ｂ、および１Ｃの番号付けスキームによるＮ末端残基のメチオニン−２
７（これは、配列番号２の番号付けスキームによるメチオニン−１と同一である
）で始まるという予測を確認した。当然のことながら、分泌型タンパク質の観察
された成熟形態が、先に詳述するような多くの因子によって変化し得ることを覚
えておくことは重要である。
【０２４７】 （実施例４：フォリスタチン−３ ｍＲＮＡ発現の組織分布） ノーザンブロット分析を、とりわけＳａｍｂｒｏｏｋおよび共同研究者（前出
）によって記載される方法を用いて行って、ヒト組織におけるフォリスタチン−
３遺伝子発現を調べた。フォリスタチン−３タンパク質の全ヌクレオチド配列（
配列番号１）を含むｃＤＮＡプローブを、ｒｅｄｉｐｒｉｍｅTM ＤＮＡ標識系
（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って使
用して32Ｐで標識した。標識後、プローブを、ＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ−１００ TM カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を製造
者のプロトコル番号ＰＴ１２００−１に従って使用して精製した。次いで、精製
した標識プローブを用いて、種々のヒト組織をフォリスタチン−３ ｍＲＮＡに
ついて調べる。
【０２４８】 種々のヒト組織（Ｈ）またはヒト免疫系組織（ＩＭ）を含むＭｕｌｔｉｐｌｅ
Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ＭＴＮ）ブロットを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈか
ら入手し、そしてＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂTMハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏ
ｎｔｅｃｈ）を製造者のプロトコル番号ＰＴ１１９０−１に従って使用し標識化
プローブを用いて調べた。ハイブリダイゼーションおよび洗浄後、ブロットをマ
ウントし、そして−７０℃にて一晩フィルムに曝し、そして標準的な手順に従っ
て、フィルムを現像した。フォリスタチン−３特異的プローブは、試験されたほ
とんどの組織のおいて約２．６ｋｂのｍＲＮＡ種を認識した。
【０２４９】 本発明は、前述の詳細な説明および実施例に特に記載されたものとは別に実施
され得ることが明らかである。本発明の多数の改変および変化は、上述の教示に
照らして可能であり、そしてそのために添付の請求の範囲内である。
【０２５０】 本明細書中に引用した全ての刊行物（特許、特許出願、雑誌論文、実験室マニ
ュアル、本、または他の文書を含む）の全ての開示は、本明細書中に参考として
援用される。
【０２５１】 さらに、コンピュータ形態および紙形態の両方で、本明細書とともに提出され
た配列表、および米国仮出願番号第６０／０５６，２４８号（１９９７年８月２
９日出願）（この出願に対して、本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）下で出
願日の利益を主張する）とともに提出された配列表は、本明細書中においてその
全体が参考として援用される。
【０２５２】
【表３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃは、フォリスタチン−３のヌクレオチド配列（配列番
号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。 約２６アミノ酸の推定リーダー配列に単線の下線を付す。図１Ａのリーダー配
列の始めのメチオニン残基は、位置番号＋１で示され、配列番号２の対応する配
列中のリーダー位置は、負の位置番号で称されることに注意のこと。従って、図
１Ａのリーダー配列１〜２６位は、配列番号２の−２６〜−１位に対応する。 フォリスタチン−３アミノ酸配列中で、２個の潜在的なアスパラギン結合型グ
リコシル化部位に印を付す。この部位は、図１Ａのアスパラギン−７３およびア
スパラギン−２１５（配列番号２のアスパラギン−４７およびアスパラギン−１
７９）であり、そして、図１Ａのアミノ酸配列中の太字の一文字のアスパラギン
の略号（Ｎ）と相まって、上記のヌクレオチド配列上の太字のポンド記号（＃）
で印付けられる。すなわち、潜在的にグリコシル化される実際のアスパラギン残
基が、図１Ａに太字で示される。潜在的なＮ結合化グリコシル化配列がフォリス
タチン−３アミノ酸配列における以下の位置で見出される：Ｎ−７３からＨ−７
６（Ｎ−７３、Ｌ−７４、Ｔ−７５、Ｈ−７６）およびＮ−２１５からＹ−２１
８（Ｎ−２１５、Ｖ−２１６、Ｔ−２１７、Ｔ−２１８）。潜在的なタンパク質
キナーゼＣ（ＰＫＣ）のリン酸化部位もまた、フォリスタチン−３アミノ酸配列
の太字のチロシン記号（Ｔ）およびフォリスタチン−３ヌクレオチド配列中のチ
ロシン残基をコードする第１のヌクレオチド上の星型（＊）で、図１Ａ中に印付
けられる。潜在的なＰＫＣリン酸化配列は、残基Ｔ−１４１から残基Ｒ−１４３
（Ｔ−１４１、Ｙ−１４２、Ｒ−１４３）のフォリスタチン−３アミノ酸配列中
に見出される。潜在的なカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）リン酸化部位はまた、
フォリスタチン−３アミノ酸配列中の太字のチロシンまたはセリン記号（Ｔまた
はＳ）およびフォリスタチン−３ヌクレオチド配列で適切なチロシンまたはセリ
ン残基をコードする第１のヌクレオチド上の星型（＊）で図１Ａに印付けられる
。潜在的なＣＫ２リン酸化配列は、フォリスタチン−３アミノ酸配列における以
下の位置に見出される：Ｔ−５７からＥ−６０（Ｔ−５７、Ｒ−５８、Ａ−５９
、Ｅ−６０）；Ｔ−１４１からＤ−１４４（Ｔ−１４１、Ｙ−１４２、Ｒ−１４
３、Ｄ−１４４）；Ｔ−２４６からＥ−２４９（Ｔ−２４６、Ｐ−２４７、Ｅ−
２４８、Ｅ−２４９）；およびＳ−２５５からＥ−２５８（Ｓ−２５５、Ａ−２
５６、Ｅ−２５７、Ｅ−２５８）。１０個の潜在的なミリスチル化部位は、図１
Ａで示されたフォリスタチン−３アミノ酸配列中に見出される。潜在的なミリス
チル化部位をフォリスタチン−３アミノ酸配列で各潜在的ミリスチル化部位を示
すアミノ酸残基に２重下線を付して図１Ａに印付けする。この潜在的なミリスチ
ル化部位は、フォリスタチン−３アミノ酸配列中の以下の位置に見出される：Ｇ
−４３からＣ−４８（Ｇ−４３、Ｑ−４４、Ｅ−４５、Ａ−４６、Ｔ−４７、Ｃ
−４８）；Ｇ−６５からＡ−７０（Ｇ−６５、Ｎ−６６、Ｉ−６７、Ｄ−６８、
Ｔ−６９、Ａ−７０）；Ｇ−７８からＬ−８３（Ｇ−７８、Ｎ−７９、Ｋ−８０
、Ｉ−８１、Ｎ−８２、Ｌ−８３）；Ｇ−８８からＬ−９３（Ｇ−８８、Ｌ−８
９、Ｖ−９０、Ｈ−９１、Ｃ−９２、Ｌ−９３）；Ｇ−１３６からＴ−１４１（
Ｇ−１３６、Ｓ−１３７、Ｄ−１３８、Ｇ−１３９、Ａ−１４０、Ｔ−１４１）
；Ｇ−１８８からＶ−１９３（Ｇ−１８８、Ｓ−１８９、Ａ−１９０、Ｈ−１９
１、Ｃ−１９２、Ｖ−１９３）；Ｇ−２０７からＧ−２１２（Ｇ−２０７、Ｑ−
２０８、Ｅ−２０９、Ｌ−２１０、Ｃ−２１１、Ｇ−２１２）；Ｇ−２３６から
Ｇ−２４１（Ｇ−２３６、Ｖ−２３７、Ｒ−２３８、Ｈ−２３９、Ａ−２４０、
Ｇ−２４１）；Ｇ−２４１からＴ−２４６（Ｇ−２４１、Ｓ−２４２、Ｃ−２４
３、Ａ−２４４、Ｇ−２４５、Ｔ−２４６）；およびＧ−２５２からＥ−２５７
（Ｇ−２５２、Ｇ−２５３、Ｅ−２５４、Ｓ−２５５、Ａ−２５６、Ｅ−２５７
）。
【図２】 図２は、コンピュータープログラムＢｅｓｔｆｉｔ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｖｅｒｓｉｏｎ ８
ｆｏｒ Ｕｎｉｘ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒｉｖｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ５３７１１）によってデフォールト
パラメーターを使用して決定した、フォリスタチン−３タンパク質のアミノ酸配
列とフォリスタチン−１のヒト ｍＲＮＡの翻訳産物（配列番号３）との間の同
一性の領域を示す。
【図３】 図３は、フォリスタチン−３アミノ酸配列（配列番号２）の分析を示す。列挙
したコンピュータープログラムのデフォルトパラメーターを使用して推定される
ように、α、β、ターン、およびコイル領域；親水性および疎水性；両親媒性領
域；可撓性領域；抗原性指数、および表面確率を示す。 「抗原性指数またはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ」のグラフにおいて、正のピー
クは、フォリスタチン−３タンパク質の高度に抗原性の領域（すなわち、本発明
のエピトープ保有ペプチドが得られ得る領域）の位置を示す。フォリスタチン−
３特異的抗体を生成するために使用され得る抗原性ポリペプチドまたはペプチド
の制限のない例には、以下のものが含まれる：配列番号２のアミノ酸残基、Ｌｙ
ｓ−５４からＡｓｐ−６２、Ｖａｌ−９１からＬｅｕ−９９、Ｌｙｓ−１００か
らＧｌｎ−１０８、Ｃｙｓ−１１６からＰｒｏ−１２４、Ｇｌｎ−１４０からＬ
ｅｕ−１４８、Ｔｒｐ−１５６からＳｅｒ−１６４、Ａｒｇ−１７０からＧｌｎ
−１８１、Ｃｙｓ−２１２からＰｈｅ−２２４、Ｔｈｒ−２３９からＴｈｒ−２
４７、Ｐｒｏ−２５１からＭｅｔ−２５９、およびＡｓｐ−２６３からＨｉｓ−
２７１を含むポリペプチド。 図３に示したデータをまた、表１で表の形式で示す。カラムは、表題「Ｒｅｓ
」、「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」およびローマ数字ＩからＸＩＶで名称をつける。カラ
ム表題とは、図３および表１に示すアミノ酸配列の以下の特徴をいう：「Ｒｅｓ
」：配列番号２または図１Ａのアミノ酸残基（これは、この残基を図１Ａの１か
ら２６３および配列番号４の−１８から３４８と番号付けすることを除いて、配
列番号２に示される同じ配列である）；「Ｐｏｓｉｔｉｏｎ」：配列番号２また
は図２Ａおよび２Ｂ中で対応する残基の位置（これは、この残基を図２Ａおよび
２Ｂにおける１から３６６、ならびに配列番号４における−１８から３４８と番
号付けすることを除いて、配列番号４に示す同じ配列である）；Ｉ：α領域−ガ
ーニル−ロブソン；ＩＩ：α領域−チュー−ファスマン；ＩＩＩ：β領域−ガー
ニル−ロブソン；ＩＶ：β領域−チュー−ファスマン；Ｖ：ターン領域−ガーニ
ル−ロブソン；ＶＩ：ターン領域−チュー−ファスマン；ＶＩＩ：コイル領域−
ガーニル−ロブソン；ＶＩＩＩ：親水性プロット−ケイト−ドウリトル；ＩＸ：
疎水性プロット−ホップ−ウッズ；Ｘ：α両親媒性領域−エイセンバーグ；ＸＩ
：β両親媒性領域−エイセンバーグ；ＸＩＩ：可撓性領域−カルプラス−シュル
ツ；ＸＩＩＩ：抗原性指数−ジェイムソン−ウォルフ；およびＸＩＶ：表面確率
プロット−エミニ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 1/21 33/50 Ｚ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ａ６１Ｋ 37/02 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (71)出願人 9410 Ｋｅｙ Ｗｅｓｔ Ａｖｅｎｕｅ, Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎ ｄ 20850， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ ｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ (72)発明者 デュアン， ロクスンヌ アメリカ合衆国 メリーランド 20817, ベセスダ， ノースフィールド ロード 5515 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB10 BB14 BB20 BB24 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FB02 FB05 GC10 4B024 AA01 AA11 BA01 BA55 CA04 CA07 CA09 DA02 DA06 EA04 FA15 FA18 GA11 GA18 HA01 HA03 4B065 AA26X AA90X AA92X AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA44 CA46 4C084 AA01 AA07 AA13 DB51 ZA812 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA14 BA15 BA17 CA40 DA30 DA45 DA75 DA76 DA86 EA20 EA30 EA50 FA72 FA73 FA74 HA05

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２の完全なアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプ
    チドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列番号２の−２６〜２３７位
    ）； （ｂ）Ｎ末端メチオニンを除いて配列番号２の完全なアミノ酸配列を有するフ
    ォリスタチン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（すなわち、配列
    番号２の−２５〜２３７位）； （ｃ）配列番号２の１〜２３７位のアミノ酸配列を有する推定成熟フォリスタ
    チン−３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる完全なアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコード
    するヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるＮ末端メチオニンを除く完全なアミノ酸配列を有するフォリスタチン−
    ３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列； （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−３ポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列；および （ｇ）上記の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）におけ
    るヌクレオチド配列のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、 からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記ポリヌクレオチドが、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（配列
    番号１）における完全ヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の−２６〜２３７位中
    のアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードする図１Ａ、
    １Ｂ、および１Ｃ（配列番号１）におけるヌクレオチド配列を有する、請求項１
    に記載の核酸分子。
  4. 【請求項４】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の−２５〜２３７位中
    のアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドをコードする図１Ａ、
    １Ｂ、および１Ｃ（配列番号１）におけるヌクレオチド配列を有する、請求項１
    に記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の約１〜約２３７アミ
    ノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−３ポリペプチドをコードする図１Ａ、１
    Ｂ、および１Ｃ（配列番号１）におけるヌクレオチド配列を有する、請求項１に
    記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号２の残基ｎ〜２３７のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここでｎは、−２６〜１２の範囲の整数
    である、ヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号２の残基−２６−ｍのアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここでｍは、２０７〜２３７の範囲の整
    数である、ヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号２の残基ｎ−ｍからなるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここでｎおよびｍは、上記（ａ）および
    （ｂ）にそれぞれ規定される整数である、ヌクレオチド配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる完全なフォリスタチン−３アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここで該部分は１〜約３７アミノ酸をＡ
    ＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる該
    完全なアミノ酸配列のアミノ末端から除く、ヌクレオチド配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる完全なフォリスタチン−３アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここで該部分は１〜約２０アミノ酸をＡ
    ＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコードされる該
    完全なアミノ酸配列のカルボキシ末端から除く、ヌクレオチド配列；ならびに （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる完全なフォリスタチン−３アミノ酸配列の部分からなるポリペプチドを
    コードするヌクレオチド配列であって、ここで該部分は任意の上記（ｄ）および
    （ｅ）におけるアミノ末端欠失およびカルボキシ末端欠失の組合せを含む、ヌク
    レオチド配列、 からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有
    するポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載の核酸分子であって、ここで前記ポリヌクレ
    オチドがＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンの完全なヌ
    クレオチド配列を有する、核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項１に記載の核酸分子であって、ここで前記ポリヌクレ
    オチドがＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるＮ末端メチオニンを除いて完全なアミノ酸配列を有するフォリスタチン
    −３ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載の核酸分子であって、ここで前記ポリヌクレ
    オチドがＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−３ポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列を有する、核酸分子。
  10. 【請求項１０】 ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、請求
    項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）
    のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイ
    ブリズするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子であって、ここでハイブ
    リダイズする該ポリヌクレオチドはストリンジェントなハイブリダイゼーション
    条件下で、Ａ残基のみまたはＴ残基のみからなるヌクレオチド配列を有するポリ
    ヌクレオチドにハイブイダイズしない、核酸分子。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
    ）、または（ｆ）のアミノ酸配列を有するフォリスタチン−３ポリペプチドのエ
    ピトープ保有部分のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む、単離さ
    れた核酸分子。
  12. 【請求項１２】 フォリスタチン−３ポリペプチドのエピトープ保有部分を
    コードする、請求項１１に記載の単離された核酸分子であって、ここで該部分の
    アミノ酸配列は、以下：Ｌｅｕ−１４〜Ａｌａ−２０、Ｓｅｒ−４６〜Ｉｌｅ−
    ５５、Ｇｌｙ−８８〜Ｐｒｏ−９７、Ｇｌｙ−１１３〜Ｌｅｕ−１３３、Ａｒｇ
    −１３８〜Ｇｌｕ−１４６、Ｐｒｏ−１７７〜Ｔｈｒ−１９１、およびＧｌｙ−
    ２１９〜約Ｖａｌ−２３７、からなる配列番号２の配列の群から選択される、核
    酸分子。
  13. 【請求項１３】 請求項１のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  14. 【請求項１４】 遺伝子発現を制御する調節配列と作動可能に結合した請求
    項１のポリヌクレオチドを含む、組換えベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項１のポリヌクレオチドを含む、遺伝的に操作された
    宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 遺伝子発現を制御する調節配列と作動可能に結合した請求
    項１のポリヌクレオチドを含む、遺伝的に操作された宿主細胞。
  17. 【請求項１７】 フォリスタチン−３ポリペプチドを産生する方法であって
    、以下： （ａ）該ポリペプチドを産生するための適切な条件下で請求項１６に記載の遺
    伝的に操作された宿主細胞を培養する工程；および （ｂ）該ポリペプチドを回収する工程、 を包含する、方法。
  18. 【請求項１８】 単離されたポリペプチドであって、以下： （ａ）配列番号２に示される完全なアミノ酸配列を有する全長フォリスタチン
    −３ポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番号２の−２６から２３７位
    ）； （ｂ）Ｎ末端メチオニンを除いて配列番号２に示される完全なアミノ酸配列を
    有する全長フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸配列（すなわち、配列番
    号２の−２５から２３７位）； （ｃ）配列番号２の１〜２３７位のアミノ酸配列を有する推定成熟フォリスタ
    チン−３ポリペプチドのアミノ酸配列； （ｄ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされる完全なアミノ酸配列を有する全長フォリスタチン−３ポリペプチドのア
    ミノ酸配列； （ｅ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるＮ末端メチオニンを除いて完全なアミノ酸配列を有する全長フォリスタ
    チン−３ポリペプチドのアミノ酸配列；および （ｆ）ＡＴＣＣ受託番号２０９１９９に含まれるｃＤＮＡクローンによりコー
    ドされるアミノ酸配列を有する成熟フォリスタチン−３ポリペプチドのアミノ酸
    配列、 からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む
    、単離されたポリペプチド。
  19. 【請求項１９】 フォリスタチン−３タンパク質のエピト−プ保有部分を含
    む単離されたポリペプチドであって、ここで該部分は以下： 配列番号２のアミノ酸残基Ｌｅｕ１４〜Ａｌａ２０を含むポリペプチド； 配列番号２のアミノ酸残基Ｓｅｒ４６〜Ｉｌｅ−５５を含むポリペプチド； 配列番号２のアミノ酸残基Ｇｌｙ８８〜Ｐｒｏ−９７を含むポリペプチド； 配列番号２のアミノ酸残基Ｇｌｙ１１３〜Ｌｅｕ−１３３を含むポリペプチド
    ； 配列番号２のアミノ酸残基Ａｒｇ−１３８〜Ｇｌｕ−１４６を含むポリペプチ
    ド； 配列番号２のアミノ酸残基Ｐｒｏ−１７７〜Ｔｈｒ−１９１を含むポリペプチ
    ド；および 配列番号２のアミノ酸残基Ｇｌｙ−２１９〜Ｖａｌ−２３７を含むポリペプチ
    ド、 からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
  20. 【請求項２０】 請求項１８に記載のフォリスタチン−３ポリペプチドに特
    異的に結合する、単離された抗体。
  21. 【請求項２１】 単離された核酸分子であって、以下： （ａ）配列番号４に記載のヌクレオチド配列； （ｂ）配列番号５に記載のヌクレオチド配列； （ｃ）配列番号６に記載のヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号７に記載のヌクレオチド配列； （ｅ）配列番号８に記載のヌクレオチド配列； （ｆ）配列番号９に記載のヌクレオチド配列； （ｇ）配列番号１０に記載のヌクレオチド配列； （ｈ）配列番号１１に記載のヌクレオチド配列； （ｉ）図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（配列番号１）に示される配列の部分のヌク
    レオチド配列であって、ここで該部分はヌクレオチド１〜５００の少なくとも５
    ０の連続するヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列； （ｊ）図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ（配列番号１）に示される配列の部分のヌク
    レオチド配列であって、ここで該部分は配列番号１のヌクレオチド１００〜５０
    ０、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００、１００〜４００、２０
    ０〜４００、３００〜４００、１００〜３００、２００〜３００、１００〜２０
    ０、１００〜２４９５、２５０〜２４９５、５００〜２４９５、１０００〜２４
    ９５、１５００〜２４９５、２０００〜２４９５、１００〜２０００、２５０〜
    ２０００、５００〜２０００、１０００〜２０００、１５００〜２０００、１０
    ０〜１５００、２５０〜１５００、５００〜１５００、１０００〜１５００、１
    ００〜１０００、２５０〜１０００および５００〜１０００からなる、ヌクレオ
    チド配列；ならびに （ｋ）上記（ａ）〜（ｊ）のいずれかのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオ
    チド配列、 からなる群より選択される配列と少なくとも９５％同一の配列を有するポリヌ
    クレオチドを含む、単離された核酸分子。
  22. 【請求項２２】 異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと融合す
    る請求項１に記載の単離された核酸分子。
  23. 【請求項２３】 異種ポリペプチドと融合している、請求項１８に記載の単
    離されたポリペプチド。
  24. 【請求項２４】 治療学的に有効量の請求項１８に記載のポリペプチドを哺
    乳動物被験体に投与する工程を含む、医療状態を予防、処置、または回復する方
    法。
  25. 【請求項２５】 治療学的に有効量の請求項１に記載の核酸を哺乳動物被験
    体に投与する工程を含む、医療状態を予防、処置、または回復する方法。
  26. 【請求項２６】 フォリスタチン−３の発現または活性に関する被験体の病
    理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）請求項１に記載の核酸における変異の存在または非存在を決定する工程
    ； （ｂ）該変異の存在または非存在に基づく病理学的状態または病理学的状態に
    対す感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  27. 【請求項２７】 フォリスタチンの発現または活性に関する被験体の病理学
    的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下： （ａ）生物学的サンプル中の請求項１８に記載のポリペプチドの存在または発
    現量を決定する工程； （ｂ）該ポリペプチドの存在または発現量に基づく病理学的状態または病理学
    的状態に対する感受性を診断する工程、 を包含する、方法。
  28. 【請求項２８】 フォリスタチン−３活性を増強または阻害し得る化合物を
    同定する方法であって、以下： （ａ）請求項１８に記載のポリペプチドを、候補化合物と接触させる工程；お
    よび （ｂ）活性についてアッセイする工程、 を包含する、方法。
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