JP2001514483A - 核酸増幅法：分枝―伸長増幅方法（ｒａｍ） - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 サンプル中の病原性微生物またはウイルスまたは正常若しくは異常な遺伝子由来の標的核酸の迅速高感度かつ標準化された検出を可能とする改良された方法が提供される。本方法は標的核酸を、標的核酸中の隣接領域にハイブリダイズするいくつかの非-重複オリゴヌクレオチドプローブ（このプローブを各々捕獲／増幅プローブおよび増幅プローブと呼ぶ）と、リガンド結合部分で被覆された常磁性ビーズの存在下でハイブリダイズさせることを含む。捕獲／増幅プローブ１端に結合したリガンドの結合と、そのプローブの一部の標的核酸中の隣接配列への特異的ハイブリダイゼーションにより、標的核酸、プローブおよび常磁性ビーズの複合体が形成される。このプローブは一緒に連結されて、ビーズに結合した隣接連結増幅配列を形成することがあり、この複合体は変性されて標的核酸及び未連結のプローブが除去されることがある。また、連続した完全長の、または環状のプローブを形成する別々の捕獲および増幅プローブを用いてもよく、直接に検出してもよく、または例えばPCR、RAMまたはHSAMなどの検出のための適切な増幅技術によって増幅してもよい。連結増幅配列の検出は、直接またはその後の連結増幅配列の増幅のいずれによるものも、サンプル中の標的核酸の存在を示すものである。ハイブリダイゼーションシグナル増幅および分枝-伸長増幅法を含む、

Description

【発明の詳細な説明】 核酸増幅法： 分枝−伸長増幅方法(RAM) 発明の背景 本件出願は1995年６月14日に出願された審査中の国際出願PCT/US95/07617（審 査中の米国特許出願第08/596,331号（この出願は1994年６月22日に出願された審 査中の米国特許出願第08/263,937号の一部継続出願である）に相当する）の一部 継続出願である。技術分野 本発明は感染性病原性物質並びに正常な遺伝子及び異常な遺伝子の迅速な自動 化検出のためのアッセイ及び前記アッセイを実施するためのキットに関する。発明の背景 最近、感染性物質、例えば、ウィルス、バクテリア及び菌類の迅速かつ正確な 検出、並びに正常な遺伝子及び異常な遺伝子の検出に対する要望を満たすために 、幾つかの技術が開発されている。一般に試験サンプル中の少量の標的核酸（Ｄ ＮＡまたはＲＮＡ）の増幅及び検出（そしてその後の測定）を伴うこのような技 術として、とりわけ、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saikiら，Science 230:1350 ，1985;Saikiら，Science 239:487，1988;PCR Technology，Henry A.Erlich編集 ，Stockton Press，1989;Pattersonら，Science 260:976，1993)、リガーゼ連鎖 反応(LCR)(Barany，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 88:189，1991)、鎖置換増幅(SDA) (Walkerら，Nucl.Acids Res．20:1691，1992)、Ｑβレプリカーゼ増幅(ＱβRA)( Wuら，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:11769，1992;Lomeliら，Clin． Chem．35: 1826，1989)及び自己持続複製(3SR)(Guatelliら，Proc.Natl.Acad．Sci．USA 87 :1874-1878，1990)が挙げられる。これらの技術の全てがサン プル中の少量の標的核酸の検出及び同定に強力な手段であるが、それらの全てが 種々の問題をかかえており、これらがルーチン診断技術に使用されるための臨床 実験セッティングにおいてそれらの一般的な適用可能性を妨げていた。 最も難しい問題の一つは増幅及び検出を行う前の標的核酸の調製である。この プロセスは時間及び労力集中的であり、こうして、迅速かつ正確な結果が必要と される臨床セッティングには一般に不適である。特にPCR及びSDAに関する別の問 題は、その後の検出及び任意の定量のための標的核酸を増幅する条件が夫々の試 験により変化し、即ち、試験標準化を有利にする一定の条件がないことである。 この後者の問題が競合PCRによる標的核酸の定量及び多種標的核酸の同時検出に 特に重要である。 上記問題の回避が上記の種々の技術を利用する迅速な標準化アッセイの開発を 可能にし、これが疫学的研究の実施、並びに患者サンプル中の病原微生物及びウ ィルスを検出するための臨床実験セッティングに特に有益であろう。このような 微生物はヒトの健康に脅威の重大事に相当する感染症を引き起こす。感染症物質 に特異性の標的核酸の迅速かつ感度の良い同定に基く、標準化かつ自動化分析技 術及びそのためのキットの開発がバクテリア及びウィルスの免疫学的検出または 培養検出を伴う技術に対し利点を与えるであろう。 試薬は特別の生物またはある範囲の関連生物に特異性であるように設計されて もよい。これらの試薬は疾患をもたらす種々の抗生物質及びビルレンス因子に対 する耐性を与える微生物遺伝子を直接分析するのに利用し得る。迅速な標準化分 析技術の開発は適当な治療の選択を助けるであろう。 或る場合には、適度の感度（高い特異性の他に）を有するアッセイは、例えば 、初期スクリーニング試験に問題があり得る。他の場合には、高い感度（並びに 特異性）が必要とされ、例えば、感染した血液中のHIVゲノムの検出は10〜100,0 00のヒトゲノム均等物当たり１部のサンプル中に存在するウィルス核酸配列を見 い出すことを必要とし得る(Harperら，Proc.Nat'l.Acad．Sci.，USA 83:772，19 86)。 とりわけ、HIV、HTLV-I、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎を含む血液汚染物は輸血患者 にとって重大な脅威に相当し、このような物質の迅速かつ感度の良い検出のため のこれらの物質の核酸を伴うルーチン診断試験の開発が臨床診断同意実験に大い に有益であろう。例えば、PCR技術を使用して、HIVゲノムが血液サンプル中で遊 離ウィルス粒子に相当するＲＮＡ分子または組込みプロウィルスに相当するＤＮ Ａ分子として検出し得る(Ouら，Science 239:295，1988;Murakawaら，DNA 7:287 ，1988)。 加えて、古典的培養技術を使用する疫学的研究は、播種性マイコバクテリウム アビウム−イントラセルレア(MAI)（mycobacterium avium-intracellulaire）感 染症が幼児及び成人の後期後天性免疫不全症候群（エイズ）の合併症であること を示していた。しかしながら、その問題の正確な程度は明らかではない。何とな らば、マイコバクテリアを検出するための現行の培養方法が面倒であり、遅く、 しかも感度が疑わしいからである。こうして、HIVに感染した個体及びその他の 免疫抑制した個体中のその関与の明確な臨床像を得るためにMAI検出に関する迅 速な、感度の良く、かつ特異的な技術を考案することが望ましく、かつ高度に有 益であろう。このような研究は標的核酸の検出に基く分子生物学的方法を伴う必 要があり、これらが通常の培養系よりも感度が良いことがルーチンで示されてい た(Boddinghausら，J.Clin.Med．28:1751，1990)。このような技術に関するその 他の適用として、個体及び集団中の単一の遺伝子遺伝的疾患の検出及び特性決定 が挙げられる（例えば、点突然変異を含む単一の遺伝子異常を検出するための連 結反応技術を開示するLandergrenら，Science 241:1077，1988を参照のこと）。 このような技術は疾患（例えば、鎌状細胞貧血）並びに欠失もしくは重複された 遺伝子配列（例えば、地中海貧血）をもたらし得る単一ヌクレオチドの相違（点 突然変異）を明らかに区別することができるべきである。 上記方法は、注目されるように、感染性疾患及び遺伝子異常のルーチン診断及 び疫学的研究のために臨床診断実験にそれらを使用することを困難にする欠点を 問題とする比較的複雑な操作である。上記方法の全てが検出すべき標的核酸の増 幅を伴う。標的核酸調製に必要とされる多大の時間及び労力、並びに増幅鋳型（ 例えば、検出が測定される特定の標的核酸）及び条件の変動がこのような操作を 臨床実験セッティングに必要とされる標準化及び自動化に不適にする。 本発明は病原性生物の検出及びモニタリング、並びに個体中の異常な遺伝子の 検出に有益な迅速な感度の良いアッセイの開発に関する。更に、本発明の方法は 臨床実験セッティングに使用するために容易に標準化でき、自動化し得る。発明の要約 感染症の患者からのサンプルからの病原性微生物からの核酸の迅速な、感度の 良い標準化された検出及び定量を可能にする改良された方法が今開発された。ま た、改良された方法は遺伝子疾患または腫瘍形成を患う患者からのサンプル中の 核酸中の遺伝的変化の迅速かつ感度の良い検出及び定量を可能にする。 この方法は従来技術の方法に対し幾つかの利点を与える。その方法は標的核酸 単離操作を簡素化し、これが所望によりミクロチューブ、ミクロチップまたはミ クロウェルプレート中で行い得る。その方法は同じサンプルレセプタクル、例え ば、チューブまたはミクロウェルプレート中で行われる関係する標的核酸に相当 する核酸配列の単離、増幅及び検出を可能にする。また、その方法は条件の標準 化を可能にする。何とならば、汎用の増幅プローブの対のみが種々の標的核酸を 検出するのに本方法に利用され、こうして有効な多重増幅を可能にし得るからで ある。また、その方法はＤＮＡ鋳型生成を必要としないでプローブ増幅によりＲ ＮＡの直接検出を可能にする。増幅プローブ（これらはその方法で末端間で共有 結合されてもよい）は連続のつながれた増幅配列を形成する。連結反応による増 幅可能なＤＮＡの集合が特異性を増大し、標的中の単一突然変異の検出を可能に する。標的核酸ではなく、このつながれた増幅配列が直接検出または増幅され、 実質的に同じ増幅条件が種々の異なる感染性因子に使用されることを可能にし、 こうして、更に制御され、かつ一致した結果が得られることをもたらす。加えて 、開示された多重増幅方法を使用して、単一サンプル中の多種の感染性因子が検 出し得る。 本発明の付加的な利点として、開示された方法のプロトコルを自動化すること ができること、（これは特に臨床実験でルーチンアッセイを行うのに重要である ）及び本方法は種々の核酸増幅系、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、鎖置 換増幅(SDA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)及び自己持続配列複製(3SR)を利用するこ とができることが挙げられる。 本方法は、基礎となる病因物質の検出を促進するために、オリゴヌクレオチド 捕獲プローブのリガンドを認識し、それに結合して、例えば、推測される病原性 微生物または遺伝子異常を含む臨床標本のサンプルから標的核酸（ＤＮＡまたは ＲＮＡ）を単離するリガンド結合部分で被覆された常磁性粒子またはビーズを使 用する磁気分離技術を含む。 本発明の一局面において、標的核酸はリガンド結合部分、例えば、ストレプト アビジンで被覆された常磁性ビーズの存在下で非オーバーラップオリゴヌクレオ チド増幅プローブの対にハイブリッド形成されて複合体を形成する。これらのプ ローブは夫々捕獲／増幅プローブ及び増幅プローブと称される。捕獲／増幅プロ ーブは、常磁性ビーズのリガンド結合部分により認識され、それに結合するリガ ンド、例えば、ビオチンを含む。これらのプローブは、夫々が汎用の配列（即ち 、標的核酸特異性ではない）及び標的核酸中のヌクレオチド配列に相補性の特定 の配列を含むように設計される。プローブの特定の配列は標的核酸の隣接領域に 相補性であり、互いに重ならない。続いて、二つのプローブが連結試薬を使用し て一緒に結合されて連続の結合された増幅配列を形成する。連結試薬は酵素、例 えば、ＤＮＡリガーゼまたは化学薬品であってもよい。サンプル中の未結合反応 体及びその他の物質の洗浄及び除去後に、元のサンプル中の標的核酸の検出が結 合された増幅配列の検出により測定される。充分な量（例えば、10⁶-10⁷の分子 ）の標的核酸が初期のサンプル中に存在した場合、結合された増幅配列が直接検 出し得る。不十分の量の標的核酸（<10⁶の分子）がサンプル中に存在した場合、 検出に好適な増幅技術、例えば、PCRを使用して、結合された増幅配列（標的核 酸ではない）が増幅し得る。また、捕獲機能及び増幅機能は別個かつ独立のプロ ーブにより遂行されてもよい。例えば、二つの増幅プローブが結合されて増幅す べき連続配列を形成し得る。未結合プローブ、並びに標的核酸はこの技術では増 幅されない。更に別の別型は標的にハイブリッド形成し、その結果、その3'末端 及び5'末端が並置される単一増幅プローブである。次いでこれらの末端がＤＮＡ リガーゼにより結合されて増幅により同定し得る共有結合された環状プローブを 形成する。図面の簡単な説明 図１は標的核酸の捕獲、連結反応依存性増幅及び検出の本方法に使用される種 々の成分を示す概略図である。 図２は本方法における種々の工程を一般に示すフロー図である。 図３はHIV-1 RNAを検出するPCR増幅プローブの検出を示すオートラジオグラフ である。レーンＡは本発明に従って結合された増幅配列である。レーンＢ（これ は対照である）はPCR増幅ナノ変異体ＤＮＡであり、これはHIV-1特異性配列を含 まない。 図４は標的核酸、例えば、HCV RNAの捕獲及び連結反応依存性検出、並びに結 合されたビオチン部分を含む二つの捕獲／増幅プローブ及び二つの連結反応依存 性増幅プローブを使用する、その配列のその後の増幅に使用される種々の成分を 示す本発明の実施態様の略図である。 図５は単一捕獲／増幅プローブ及び二つの増幅プローブを使用するHCV RNAの 検出のための磁気単離、標的特異性連結反応及びPCR増幅を示すフロー図である 。 図６は夫々が結合されたビオチン部分を含む二つの捕獲／増幅プローブ、並び に単一増幅プローブを使用して、標的核酸、例えば、HCV RNAを増幅し、検出す るのに使用される種々の成分を示す略図である。 図７は夫々が結合されたビオチン部分を含む二つの捕獲／増幅プローブ、並び に標的核酸へのハイブリダイゼーション及び遊離末端の連結反応後に環化する単 一増幅プローブを使用して、標的核酸、例えば、HCV RNAを検出するのに使用さ れる種々の成分を示す略図である。 図８はサンプル中のHCV RNAを検出するのに使用されるPCR増幅プローブを示す 臭化エチジウム染色ＤＮＡの写真である。サンプル中のHCV RNAの量がサンプル バンド密度をHCV転写産物の通常の連続希釈液のバンド密度と比較することによ り測定される。 図９はサンプル中のHCV RNAを検出するのに使用されるPCR増幅単一完全長連結 反応依存性かつ環化可能なプローブを示す臭化エチジウム染色ＤＮＡの写真であ る。サンプル中のHCV RNAの量がサンプルバンド密度をHCV転写産物の通常の連続 希釈液のバンド密度と比較することにより測定される。 図10はハイブリダイゼーションシグナル増幅方法(HSAM)による標的核酸の捕獲 及び検出を示す略図である。 図11は抗原をビオチン化抗体及びビオチン化シグナルプローブで検出するため のHSAMの使用を示す略図である。 図12A及びBはホルマリン固定中に形成されたＲＮＡ−タンパク質架橋を示す略 図である。図12Aは逆転写PCR(RT-PCR)の方法における架橋によるプライマー伸長 の阻止を示す。図12Bは本発明のプローブのハイブリダイゼーション及び連結反 応がタンパク質−ＲＮＡ架橋により阻止されないことを示す。 図13は多重PCRの略図である。夫々HIV-1及びHCVに対し特異性を有する捕獲／ 増幅プローブの二つの組が標的捕獲に使用されるが、汎用PCRプライマーの唯一 の対が結合されたプローブを増幅するのに使用される。夫々の標的の存在が増幅 産物のサイズまたは酵素結合免疫吸着検定法により測定し得る。 図14は環状標的プローブ及び三つの環状シグナルプローブを使用するHSAMの略 図である。AB、CD及びEFは環状シグナルプローブの3'ヌクレオチド配列及び5'ヌ クレオチド配列に相補性であるリンカー領域中のヌクレオチド配列を示す。AB’ 、CD’及びEF’は別の環状シグナルプローブのリンカー領域の相補配列に結合す ることにより並置されたシグナルプローブの3'ヌクレオチド配列及び5'ヌクレオ チド配列を示す。 図15は環状標的プローブ及び線状シグナルプローブを利用するHSAMの略図であ る。 図16はプライマー伸長／置換及びPCRによる環化されたプローブの増幅の略図 である。 図17はT3プロモーターが伸長プライマー２にとり込まれて転写により環状プロ ーブの増幅を可能にするRAMの実施態様の略図である。 図18は伸長プライマー１の伸長による環状プローブの増幅を示すポリアクリル アミドゲルを示す。 図19は分枝−伸長増幅方法(RAM)による環化されたプローブの増幅の略図であ る。 図20はＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がプライマーにとり込まれている RAMアッセイの図である。発明の詳細な説明 本発明は試験サンプル中の病原性微生物を検出し、監視するためだけでなく、 個体中の異常な遺伝子を検出するために臨床アッセイにおける使用のための簡素 化されたサンプル調製及び汎用増幅系に関する。サンプル中の核酸を検出し、測 定するために磁気分離技術を連結反応／増幅技術と組み合わせる汎用増幅系が臨 床上の使用について記載される。その分離技術は、とりわけ、PCR増幅技術、LCR 増幅技術及びSDA増幅技術を含む、殆どの増幅系と組み合わされてもよい。更に 、本発明は本発明の方法に有益である分枝−伸長増幅方法(RAM)及びハイブリダ イゼーションシグナル増幅(HSAM)と称される別の増幅系を提供する。本発明の利 点として、（1）臨床実験セッティングに関する適性、（2）制御され、かつ一致 する（標準化し得る）結果を得る能力、（3）特別なサンプル中の核酸を定量す る能力、（4）試験サンプル中の多種の標的核酸を同時に検出し、定量する能力 、（5）血清サンプル中の核酸を感度良く、しかも有効にin situで検出する能力 、及び(6)標的中の単一突然変異を検出する能力が挙げられる。更に、現在開示 された方法の完全プロトコルは容易に自動化され、臨床実験セッティングにおけ るルーチン診断試験にそれを有益にし得る。RAM及びHSAMの使用について、等温 増幅が達成し得る。 本発明は、以下に記載されるオリゴヌクレオチド捕獲プローブに存在するリガ ンドを認識し、結合するリガンド結合部分で被覆された常磁性粒子、ビーズまた は球体を利用して、検出を促進するために標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を臨 床サンプルから単離する磁気分離を含む。 磁気分離は、リガンド結合部分で被覆された常磁性粒子またはビーズを使用し てサンプルから標的核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を単離する系である(Lomeliら ， Clin.Chem.35:1826-，1989)。この方法の背景にある原理はリガンドを含む捕 獲プローブと、プローブと標的の間の特定の相補配列中の標的核酸との間のハイ ブリッド形成の原理である。ハイブリダイゼーションは標的核酸中の相補配列へ のプローブの特異的結合を促進する好適なカオトロピック剤、例えば、グアニジ ンチオシアネート(GnSCN)の存在下で行われる。次いでこうして形成されたハ イブリッドがビードのリガンド結合部分への捕獲プローブのリガンドの特異的結 合により常磁性ビーズに捕獲される。 本明細書に使用される“リガンド”という用語は、ここで“リガンド結合部分 ”と称される別の成分に対するアフィニティーを有するあらゆる成分を表す。リ ガンド結合部分へのリガンドの結合は二つの成分間のアフィニティー対を形成す る。例えば、このようなアフィニティー対として、とりわけ、ビオチンとアビジ ン／ストレプトアビジン、抗原またはハプテンと抗体、重金属誘導体とチオ基、 種々のポリヌクレオチド、例えば、ホモポリヌクレオチド、例えば、ポリdGとポ リdC、ポリdAとポリdT及びポリdAとポリＵが挙げられる。互いに対する強いアフ ィニティーを有するあらゆる成分対がアフィニティー対、リガンド−リガンド結 合部分として使用し得る。また、好適なアフィニティー対が免疫学的方法に使用 されるリガンドと複合体の間に見られる。本発明に使用するのに好ましいリガン ド−リガンド結合部分はビオチン／ストレプトアビジンアフィニティー対である 。 一局面において、本発明は図１に示された標的核酸の捕獲及び検出を提供し、 図１は標的核酸の捕獲及び検出の略図を示す。リガンド結合部分(b)で被覆され た常磁性ビーズまたは粒子(a)の存在下で、標的核酸がオリゴヌクレオチド増幅 プローブの対、即ち、夫々図１中に捕獲／増幅プローブ１(d及びe)及び増幅プロ ーブ２(f及びg)と称される第一ヌクレオチドプローブ（また、捕獲／増幅プロー ブと称される）及び第二ヌクレオチドプローブ（また、増幅プローブと称される ）に同時にハイブリッド形成される。プローブはオリゴデオキシリボヌクレオチ ド分子またはオリゴリボヌクレオチド分子であってもよく、分子型の選択はその 後の増幅方法に依存する。本明細書中の“プローブ”についての言及は一般にプ ローブの多重コピーを表す。 捕獲／増幅プローブは一般の3'ヌクレオチド配列(d)を有するように設計され 、即ち、それは分析される特定の標的核酸に特異性ではなく、こうして種々の標 的核酸とともに使用し得る。換言すれば、第一プローブの3'配列は標的核酸のヌ クレオチド配列に相補性ではなく、またハイブリッド形成可能ではない。捕獲／ 増幅プローブの5'部分(e)は特定の標的核酸のヌクレオチド配列の一部に相補性 であり、かつハイブリッド形成可能であるヌクレオチド配列を含む。病原性微生 物 及びウィルスとの使用について、捕獲／増幅プローブはその3'汎用配列(d)が全 ての系について同じであるように合成されることが好ましく、5'特異的配列(e) は生物の個々の種もしくは亜種または異常な遺伝子、例えば、膵嚢胞性繊維炎ま たは鎌状細胞貧血の原因の一種以上の遺伝子の標的核酸に特異的に相補性である 。或る状況では、捕獲／増幅プローブの5'特異的部分が生物の特別な株の標的核 酸のヌクレオチド配列に特異的に相補性であることが望ましいかもしれない。捕 獲／増幅プローブ１はプローブ(d)の3'末端にリガンド(c)を更に含み、これは常 磁性ビーズ(a)に被覆されたリガンド結合部分(b)により認識され、それに結合す る。 第二プローブまたは増幅プローブ、即ち、図１中の増幅プローブ２は捕獲／増 幅プローブ１の5'末端にハイブリッド形成する標的の配列に直ぐに隣接する（し かし重ならない）標的核酸のヌクレオチド配列の部分に相補性であり、ハイブリ ッド形成する3'配列(f)を含む。また、増幅プローブ２は5'一般配列(g)を含み、 これは標的核酸に相補性ではなく、またハイブリッド形成可能ではなく、これに は必要によりその5'末端で標識またはシグナル発生部分（^***）が結合されてい てもよい。このようなシグナル発生部分として、とりわけ、放射性同位元素、例 えば、³²Pまたは³H、蛍光分子、例えば、フルオレセイン及び色素産生分子また は酵素、例えば、ペルオキシダーゼが挙げられる。このような標識は標的核酸の 直接検出に使用され、検出工程中に標的核酸に結合された増幅プローブ２の存在 を検出する。³²Pが放射性同位元素カウンティングまたは電気泳動ゲルのオート ラジオグラフィーによる検出分析に好ましい。色素産生物質が、例えば、酵素結 合色素産生アッセイによる分析に好ましい。 捕獲／増幅プローブのリガンドに対する常磁性ビーズのリガンド結合部分のア フィニティーの結果として、プローブの特異的5'部分にハイブリッド形成された 標的核酸が常磁性ビーズにより捕獲される。加えて、増幅プローブ２（これもま た標的核酸にハイブリッド形成している）がまた常磁性ビーズにより捕獲される 。 常磁性ビーズにおける標的核酸及び二つのハイブリッド形成したプローブの捕 獲後に、連結試薬を使用して、プローブが一緒につながれて（図１中の垂直の矢 印により示される部位で）、本明細書中結合された増幅配列と称される連続の一 本鎖オリゴヌクレオチド分子を形成する。連結試薬は酵素、例えば、ＤＮＡリガ ーゼまたはＲＮＡリガーゼ、または化学連結試薬、例えば、臭化シアンまたはカ ルボジイミド(Sokolovaら，FEBS Lett．232:153-155，1988)であってもよい。結 合された増幅配列は標的核酸に相補性である結合された増幅配列の領域(例えば 、図１中(e)及び(f))で標的核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）にハイブリッド形成さ れる。充分な量の標的核酸（例えば、10⁶-10⁷の分子）がサンプル中に存在する 場合、標的核酸の検出は、例えば、増幅プローブ２の5'末端の任意のシグナル発 生部分の存在を検出することにより、結合された増幅配列の更なる増幅によらな いで達成し得る。 上記の直接検出に不十分な標的核酸（例えば、<10⁶の分子）がサンプル中にあ る場合、捕獲／増幅プローブ１及び増幅プローブ２の連結反応により上記のよう にして形成された結合された増幅配列が以下に記載されるように検出のために増 幅されてもよい。 また、結合された増幅配列はハイブリダイゼーションシグナル増幅方法(HSAM) の使用により、結合された配列の核酸増幅によらないで検出し得る。HSAMが図10 に示される。HSAMについて、標的特異的核酸プローブ（例えば、増幅プローブ２ ）がリガンドで内部標識される。リガンドは核酸プローブに結合でき、かつ少な くとも２価であるリガンド結合分子の結合パートナーを与えることができる分子 である。好ましい実施態様において、リガンドはビオチンまたは抗原、例えば、 ジゴキシゲニンである。核酸プローブは当業界で知られている方法によりリガン ドで標識し得る。好ましい実施態様において、プローブがリガンド、好ましくは ビオチンまたはジゴキシゲニンの約３から約10までの分子で標識される。捕獲プ ローブ及びリガンド標識標的特異的プローブがサンプルに添加され、得られる複 合体が上記のように洗浄された後に、連結試薬が上記のように添加されてプロー ブを連結する。捕獲プローブへの標的特異的プローブの連結反応はビーズによる 標的特異的プローブの保持をもたらす。同時または続いて、過剰のリガンド結合 部分が反応に添加される。リガンド結合部分はリガンドに結合して、リガンドと アフィニティー対を形成する部分である。リガンド結合部分はリガンドに対し少 なくとも２価である。好ましい実施態様において、リガンドがビオチンであり、 かつリガンド結合部分がストレプトアピジンである。別の好ましい実施態様にお いて、リガンドが抗原であり、かつリガンド結合分子が抗原の抗体である。連結 試薬及びリガンド結合分子の添加は捕獲プローブに共有結合された標的特異的プ ローブを含む複合体をもたらし、リガンド標識標的特異的プローブはリガンドに 結合されたリガンド結合分子を有する。 次いでシグナルプローブが反応混合物に添加される。シグナルプローブはリガ ンド結合分子に結合するリガンドで内部標識される一般の核酸である。好ましい 実施態様において、リガンドは標的特異的増幅プローブを標識するのに使用され るのと同じリガンドである。シグナルプローブは標的核酸またはその他のプロー ブに相補性またはハイブリッド形成可能ではない汎用の配列を有する。好ましい 実施態様において、シグナルプローブは約30から約100までのヌクレオチドを含 み、約３分子から約10分子までのリガンドを含む。 過剰のリガンド結合分子の存在下の複合体へのシグナルプローブの添加は大き く、かつ容易に検出し得る複合体の形成をもたらす。複合体のサイズはリガンド 結合分子の多価に起因する。例えば、標的特異的増幅プローブ中のリガンドがビ オチンである場合、１分子のストレプトアビジンがプローブ中のビオチン１分子 を結合する。結合されたストレプトアビジンは更に３分子のビオチンに結合する ことができる。シグナルプローブが添加される場合、シグナルプローブのビオチ ン分子が増幅プローブに結合されたストレプトアビジンの利用可能な結合部位に 結合する。ウェブ状複合体が図10に図示されるように形成される。 前記のようにして洗浄して未結合シグナルプローブ及びリガンド結合分子を除 去した後に、複合体がその後に検出される。複合体の検出は標的核酸の存在の指 標である。こうして、HSAM方法は核酸増幅の不在下で標的核酸の検出を可能にす る。 複合体は当業界で知られており、かつ選択されたリガンド及びリガンド結合部 分に適した方法により検出し得る。例えば、リガンド結合部分がストレプトアビ ジンである場合、それはストレプトアビジン抗体によるイムノアッセイにより検 出し得る。また、リガンド結合分子が容易に検出し得る複合体として本方法に利 用されてもよい。例えば、リガンドが蛍光色素または酵素結合色素産生アッセイ により検出し得る酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼもしくはホースラデ ィッシュペルオキシダーゼと結合されてもよい。例えば、リガンド結合分子はア ルカリ性ホスファターゼ結合ストレプトアビジンであってもよく、これは色素産 生アルカリ性ホスファターゼ基質、例えば、ニトロブルーテトラゾリウムクロリ ドの添加により検出し得る。 また、HSAM方法が以下に記載される環化可能な増幅プローブとともに使用され てもよい。環化可能な増幅プローブは標的核酸中の隣接するが、連続ではない配 列に相補性であり、かつハイブリッド形成可能である3'領域及び5'領域、並びに 標的核酸に相補性ではなく、またハイブリッド形成可能ではないリンカー領域を 含む。標的核酸への環化可能なプローブの結合後に、3'領域及び5'領域が並置さ れる。連結試薬の添加による3'領域及び5'領域の結合は標的核酸に結合された閉 環分子の形成をもたらす。次いで標的／プローブ複合体が徹底的に洗浄されて未 結合プローブを除去する。 HSAMについて、リガンド分子が、例えば、プローブ合成中に環化可能なプロー ブのリンカー領域にとり込まれる。次いでHSAMアッセイが上記のように、また図 15に示されるようにリガンド結合分子及びシグナルプローブを添加して大きい複 合体を形成し、洗浄し、次いで複合体を検出することにより行われる。核酸検出 方法は当業者に知られており、例えば、Essersら(1980)，J.Clin.Microbiol.12: 641により記載されたラテックス凝集が挙げられる。HSAMと連係した環化可能な プローブの使用がin situハイブリダイゼーションに特に有益である。 HSAMはまた抗体または抗原の検出に有益である。リガンドを含む抗原または抗 体が夫々相当する抗体または抗原に結合するのに使用される。洗浄後、過剰のリ ガンド結合分子がその後にリガンド標識された一般の核酸プローブとともに添加 される。大きい複合体が生成され、上記のように検出し得る。好ましい実施態様 において、リガンドがビオチンであり、かつリガンド結合分子がストレプトアビ ジンである。ビオチン化抗体及びビオチン化シグナルプローブを利用して抗原を 検出するためのHSAMの使用が図11に示される。 本方法は臨床診断実験による試験目的のために得られたルーチン臨床サンプル とともに使用し得る。本方法に使用し得る臨床サンプルとして、とりわけ、全血 、 分離された白血球、痰、尿、組織バイーオブシー、のど用の綿棒等、即ち、分析 のために臨床研究室に通常送られるあらゆる患者サンプルが挙げられる。 この連結反応依存性増幅方法はホルマリン固定、パラフィン包埋(FFPE)試料中 の標的配列の検出に特に有益であり、FFPE試料中の標的ＲＮＡ配列の検出のため の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)の従来技術の方法の欠点を解消する。 RT-PCRは種々の検出感度を有する。何とならば、おそらくホルマリン固定中のＲ ＮＡ−ＲＮＡ架橋及びＲＮＡ−タンパク質架橋の形成がプライマーを伸長するこ とから逆転写酵素を阻止するからである。本方法において、プローブは架橋にも かかわらず標的にハイブリッド形成することができ、逆転写が必要とされず、ま た標的配列ではなくプローブが増幅される。こうして、本方法の感度は架橋の存 在により悪化されない。RT-PCRに対する本方法の利点が図12に図示される。 図２（これはサンプル中の標的核酸の磁気分離及び標的依存性検出の一般的な 図の記載を示す）を参照して、本方法のこの局面は下記の工程を伴う。 （a）第一工程は分析されるサンプル、例えば、血清中に存在する標的核酸の 捕獲または単離である。それ自体をミクロウェルプレート中で行われるのに適す るようにする分析に適したサンプルサイズは約100μlである。本方法によるサン プルの分析のためのミクロウェルプレートの使用はその方法の自動化を促進する 。推定された病原性微生物もしくはウィルスまたは異常な遺伝子を含むサンプル がカオトロピック剤（即ち、化合物中の水素結合を分断する薬剤）、安定剤及び 界面活性剤（これはサンプル中に存在するあらゆる核酸及びタンパク質の放出を 与える）を含む等容積の溶解緩衝液とともにインキュベートされる。例えば、本 方法における使用に適した溶解緩衝液は2.5-5Mのグアニジンチオシアネート(GnS CN)、10％のデキストランスルフェート、100mMのEDTA、200mMのトリス-HCl(pH8. 0)及び0.5％のNP-40(ノニオン性界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンである ノニデットP-40、シグマケミカル社、セントルイス、MO)を含む。また、緩衝液 中のGnSCN（これはカオトロピック剤である）の濃度は微生物またはウィルスの 病原性に関係するタンパク質及ひその他の分子を変性する効果を有する。これは 病原体を含むサンプルのその後の操作中に起こり得る偶発的な感染の可能性を阻 止することを助ける。 リガンド結合部分で被覆された常磁性粒子またはビーズが溶解緩衝液による処 理と同時に、またはその前にサンプルに添加される。本方法に使用される常磁性 ビーズまたは粒子はケイ素水素化物で被覆された高度に複雑な表面を有する酸化 鉄(III)粒子（一般に<1umの直径）を含む。リガンド結合部分はケイ素水素化物 に共有結合される。常磁性粒子またはビーズはそれ自体磁性ではなく、一緒に凝 集しない。しかしながら、磁場に置かれた時、それらは磁気源に吸引される。そ れ故、常磁性粒子またはビーズは、それらに結合されたものと一緒になって、磁 気分離装置により与えられた強い磁場の存在下に反応容器を置くことにより混合 物のその他の成分から分離し得る。このような装置が、例えば、プロメガ・コー ポレーションまたはストラタジーン社から市販されている。 本方法における使用に適した常磁性ビーズはストレプトアビジン（これはビオ チンに結合する）で被覆された常磁性ビーズである。このようなビーズは幾つか 性粒子がプロメガ・コーポレーションから得られ、またストレプトアビジン−磁 性ビーズ（カタログ#MB002）がアメリカン・クアレックス（ラ・ミラダ、CA）か ら得られる。 続いて、上記のように、オリゴヌクレオチド増幅プローブの対が溶解されたサ ンプル及び常磁性ビーズに添加される。その変法として、プローブ及び常磁性ビ ーズが同時に添加されてもよい。上記のように、二つのオリゴヌクレオチドプロ ーブはその3'末端にリガンドを含む第一プローブまたは捕獲／増幅プローブ（図 １中で捕獲／増幅プローブ１と称される）及び第二プローブまたは増幅プローブ （図１中で増幅プローブ２と称される）である。ストレプトアビジン被覆常磁性 ビーズとの使用について、第一プローブは3'ビオチニル化捕獲／増幅プローブで あることが好ましい。 プローブは既知の自動化オリゴヌクレオチド合成技術、例えば、核酸合成装置 を利用する通常のホスホラミダイト技術によりヌクレオシドトリホスフェートか ら合成されてもよい。このような合成装置が、例えば、アプライド・バイオシス テムズ社（フォスター・シティー、CA）から入手し得る。 オリゴヌクレオチドプローブの夫々は長さ約40-200ヌクレオチド、好ましくは 長さ約50-100ヌクレオチドであり、これはプローブの連結反応後に、長さ約80-4 00、好ましくは100-200の結合された増幅配列を与え、これはPCR反応、Ｑβレプ リカーゼ反応またはSDA反応による増幅に適している。 プローブの標的核酸特異的部分、即ち、第一捕獲／増幅プローブの5'末端及び 標的核酸のヌクレオチド配列に相補性の第二増幅プローブの3'末端は夫々長さ約 15-60ヌクレオチド、好ましくは約18-35ヌクレオチドであり、これは標的核酸へ のプローブの適切なハイブリダイゼーションに充分な長さを与える。 プローブの汎用的部分、即ち、捕獲／増幅プローブの3'末端及び増幅プローブ の5'末端（これらは標的核酸に相補性ではない）に関して、とりわけ、下記の考 慮が適用される。 （1）オリゴデオキシヌクレオチド捕獲／増幅プローブの汎用ヌクレオチド配 列は長さ約６ヌクレオチドの少なくとも一つ、好ましくは二つ〜四つの制限エン ドヌクレアーゼ認識配列を含み、これらは所望により以下に説明されるような特 異的制限エンドヌクレアーゼにより常磁性ビーズから結合された増幅配列を開裂 するのに利用し得る。好ましい制限部位として、とりわけ、EcoRI(GAATTC)、Sma I(CCCGGG)及びHindIII(AAGCTT)が挙げられる。 （2）一般ヌクレオチド配列はG-Cに富む領域を含み、これは以下に説明される ようなプライマーへのハイブリダイゼーション後に、更に安定な二重らせん分子 、例えば、変性に高温を要する二重らせん分子を与える。捕獲／増幅プローブ及 び増幅プローブのG-Cに富む汎用部分を有する結合された増幅配列は２種の温度 のPCR反応を使用して増幅されてもよく、プライマーハイブリダイゼーション及 び伸長が両方とも約60-65℃の温度で行われてもよく（PCR増幅に通常使用される 37℃でのハイブリッド形成とは反対に）、変性が以下に説明されるように約92℃ の温度で行われてもよい。２種の温度の反応の使用は夫々のPCR増幅サイクルの 長さを減少し、しかも短いアッセイ時間をもたらす。 約37℃の温度で約30-60分間の溶解緩衝液中のプローブ、磁性ビーズ及び標的 核酸のインキュベーション後に、標的核酸及びハイブリッド形成されたプローブ を含む３成分複合体が形成され、これが常磁性ビーズのリガンド結合部分（例え ば、ストレプトアビジン）への捕獲／増幅プローブのリガンド（例えば、ビオチ ン）の結合により常磁性ビーズに結合される。その方法は以下のように行われる 。 （a）標的核酸−プローブ−ビーズを含む複合体がその後に磁気装置により発 生された磁場（これがビーズを吸引する）により溶解緩衝液から分離される。磁 場は複合体を反応容器、例えば、ミクロウェルプレートまたはミクロチューブの 壁に保持するのに使用され、それにより、溶解緩衝液及び未結合反応体が、例え ば、標的核酸またはハイブリッド形成されたプローブの認められる損失を生じな いで、デカントにより除去されることを可能にする。次いで複合体が磁場の存在 下で複合体を解離しない量のカオトトピック剤及び界面活性剤を含む緩衝液で２ −３回洗浄される。本方法における使用に好適な洗浄緩衝液は約1.0-1.5MのGnSC N、10mMのEDTA、100mMのトリス-HCl(pH8.0)及び0.5％のNP-40（ノニオン性界面 活性剤であるノニデットP-40、シグマ・ケミカル社(セントルイス、MO))を含む 。また、その他のノニオン性洗剤、例えば、Triton X-100が使用されてもよい。 緩衝液洗浄は未結合タンパク質、核酸及びプローブ（これらはその後の工程を妨 害し得る）を除去する。次いで洗浄された複合体がKClの溶液で洗浄されてGnSCN 及び洗剤を除去し、また複合体を保存し得る。KClの好適な濃度は約100〜500mM のKClである。また、KCl洗浄工程はリガーゼ緩衝液による２回の洗浄の方が有利 の場合には省かれてもよい。 （b）プローブが一緒に結合される場合、本方法における次の工程は工程(a)か らの複合体を二つのプローブを連結する連結試薬で処理することを伴う。連結試 薬は酵素、例えば、ＤＮＡリガーゼもしくはＲＮＡリガーゼ、または化学剤、例 えば、臭化シアンもしくはカルボジイミドであってもよい。これは第一オリゴヌ クレオチドプローブの5'末端を第二オリゴヌクレオチドプローブの3'末端（夫々 、捕獲／増幅プローブ及び増幅プローブ）に結合して本明細書中で結合された増 幅配列と称される連続の機能性一本鎖オリゴヌクレオチド分子を形成するのに利 用することができる。検出（増幅プローブ２の5'末端でシグナル発生部分による ）された結合された増幅配列の存在はサンプル中の標的核酸の存在を間接的に示 す。また、結合された増幅配列は種々の増幅系、例えば、PCRまたはSDAのいずれ にも鋳型として利用することができる。処理後につながれないで残る第一プロー ブ及び第二プローブのいずれもがその方法のその後の工程で増幅されない。捕獲 ／ 増幅プローブ及び増幅オリゴデオキシヌクレオチドプローブはＤＮＡリガーゼま たはＲＮＡリガーゼの如き好適な連結試薬を使用してつながれてもよい。また、 連結試薬は化学薬品、例えば、臭化シアンまたはカルボジイミドであってもよい （Sokolovaら，FEBS Lett．232:153-155，1988）。好ましいＤＮＡリガーゼとし て、T₄ DNAリガーゼ及び熱安定性Taq DNAリガーゼが挙げられ、後者がPCR技術を 使用する増幅にかけられるプローブに最も好ましい。Taq DNAリガーゼを使用す ることの利点は、それが高温(65-72℃)で活性であることである。このような高 温におけるオリゴヌクレオチドプローブの連結は非特異的連結反応を減少する。 連結反応工程は高温（約65-72℃)で30-60分間にわたって行われることが好まし く、その時間後に結合されなかった第二増幅プローブ（図１中の増幅プローブ２ ）が必要により変性条件下で除去されてもよい。 変性はTE緩衝液（10mMのトリス-HClpH7.5、0.1mMのEDTA）を混合物に添加する ことにより連結反応工程後に行われる。次いで混合物の温度が約1-5分間にわた って約92-95℃に上昇されてハイブリッド形成された核酸を変性する。この処理 は標的核酸（及び結合されなかった増幅プローブ２）をハイブリッド形成された 結合された増幅配列（これらは常磁性ビーズに結合されたまま残る）から分離す る。上記の磁場の存在下で、結合された増幅配列が高温でTE緩衝液で洗浄されて 変性された標的核酸及び結合されなかった増幅プローブ２を除去し、更なる分析 のためにTE緩衝液中で再度懸濁される。 （c）その方法の第三工程は結合された増幅配列の検出であり、これは初期の 試験サンプル中の標的核酸の存在を示す。充分な標的核酸（約10⁶-10⁷の分子） がサンプル中に存在する場合、または結合された増幅配列の増幅後に、種々の増 幅技術、例えば、PCRまたはSDAの一つを使用して、これが直接行われてもよい。 例えば、直接検出が急性の感染エイズ患者からの血清サンプル中のHIV-1 RNAを 検出するのに使用し得る。このような血清サンプルはウィルスＲＮＡの約10⁶の コピー／mlを含むと考えられる。 直接検出について、結合された増幅配列の増幅プローブ２部分の5'末端に相補 であるように上記のように自動合成により調製された長さ約10-15ヌクレオチド のオリゴヌクレオチド検出プローブが常磁性ビーズに結合された結合された増幅 配列に添加されてもよい。検出プローブ（これはシグナル発生部分、例えば、放 射性同位元素、色素産生剤または蛍光物質で標識される）が検出プローブを結合 された増幅配列にハイブリッド形成させるのに充分な時間の期間にわたって充分 な条件のもとに複合体とともにインキュベートされる。そのインキュベーション 時間は約1-60分の範囲であってもよく、約4-60℃の温度で行われてもよい。標識 が蛍光原物質である場合、インキュベーション温度は約４℃であり、色素産生物 質の場合、約37℃であり、また放射性同位元素の場合、約37℃-60℃であること が好ましい。好ましいシグナル発生部分として、とりわけ、³²P(放射性同位元素 )、ペルオキシダーゼ（色素産生）及びフルオレセイン、アクリジンまたはエチ ジウム（蛍光性）が挙げられる。 また、直接検出について、先に説明したように、増幅プローブ２それ自体が必 要によりその5'末端でシグナル発生部分、例えば、³²Pで標識されてもよい。次 いでシグナル発生部分は捕獲／増幅プローブ１及び増幅プローブ２の連結反応後 に結合された増幅配列にとり込まれるであろう。こうして、標的核酸の存在を示 すための、結合された増幅配列の直接検出が連結反応及び洗浄の直後に行い得る 。 結合された増幅プローブの直接のシグナル発生部分または検出プライマーを介 してそれにハイブリッド形成されたシグナル発生部分を検出するのに好適なあら ゆる技術が利用し得る。このような技術として、シンチレーションカウンティン グ（³²Pについて）及び当業界で知られているような色素産生検出方法または蛍 光原検出方法が挙げられる。例えば、好適な検出方法が、とりわけ、Sambrookら ， Molecular Cloning-A Laboratory Manual,第２編，Cold Spring Harbor Labo- ratory，1989，Methods in Enzymology，152巻，Academic Press（1987）または Wuら，Recombinant DNA Methodology，Academic Press(1989)に見られる。 不十分な量の標的核酸（<10⁶の分子）が初期のサンプル中に存在する場合、増 幅系が検出のために結合された増幅配列を増幅するのに使用される。 例えば、本方法に使用されるプローブがオリゴデオキシリボヌクレオチド分子 である場合、既知の技術を使用して（例えば、PCR Technology，H.A.Erlich編集 ， Stockton Press，1989，Sambrookら，Molecular Cloning-A Laboratory Manu- al，第２編，Cold Spring Harbor Laboratory，1989を参照のこと）、PCR 方法が結合された増幅配列を増幅するのに使用し得る。増幅にPCRを使用する場 合、２種のプライマーが使用され、第一のプライマーは結合された増幅配列の捕 獲／増幅プローブ１領域の一般の3'末端に相補性であり、第二プライマーは結合 された増幅配列の増幅プローブ２部分の一般の5'末端に配列上一致する。これら のプライマーは、それらが結合するプローブの配列のように、汎用的であるよう に設計され、標的核酸の配列にもかかわらず、全てのアッセイに使用し得る。第 一プライマーは結合された増幅配列の3'末端の汎用の配列にアニールするように 設計され、第二プライマーは結合された増幅配列の5'末端の一般の配列に配列上 一致するので、汎用のプライマーがあらゆる結合された増幅配列を増幅するのに 利用し得る。 本方法に使用するためのPCRオリゴヌクレオチドプライマーの汎用の対は、オ リゴヌクレオチドプローブの合成について先に説明したように、既知の自動化合 成技術によりヌクレオシドトリホスフェートから合成し得る。プライマーは長さ が10-60ヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは長さが約1 8-35ヌクレオチドであることが好ましく、16-21ヌクレオチドの長さが最も好ま しい。プライマーの対は夫々第一の捕獲／増幅プローブ及び第二増幅プローブの 一般の部分に相補性であるように設計され、こうして高いG-C含量を有する。ま た、プライマーは、それらが二次構造を有しないように設計され、即ち、夫々の プライマーは自己アニーリングをもたらし得る相補領域をそれ自体中に含まない 。 一般のPCRプライマー及び連結された増幅配列の一般部分の高いG-C含量は通常 の３種の温度方法ではなく２種の温度でPCR反応を行うことを可能にする。一般 に、３種の温度方法では、増幅の夫々のサイクルが以下のように行われる。 結合された増幅配列へのプライマーのアニーリングは約37-50℃で行われる。 ヌクレオシドトリホスフェートの存在下のTaqポリメラーゼによるプライマー配 列の伸長は約70-75℃で行われ、また伸長されたプライマーを放出するための変 性工程は約90-95℃で行われる。２種の温度のPCR技術では、アニーリング工程及 び伸長工程が両方とも約60-65℃で行われてもよく、こうして夫々の増幅サイク ルの長さを減少し、しかも短いアッセイ時間をもたらす。 例えば、好適な３種の温度のPCR増幅（Saikiら，Science 239:487-491，1988 に示されるような）は以下のように行い得る。 ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は鋳型の連結された増幅配列0.01〜1.0ng、夫々の 一般のプライマー10〜100pモル、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ（プロメガ社） 、0.2mMのdATP、0.2mMのdCTP、0.21mMのdGTP、0.2mMのdTTP、15mMのMgCl₂、10mM のトリス-HCl(pH9.0)、50mMのKCl、１μg/mlのゼラチン、及び10μl/mlのトリト ンX-100を含む約25-50μlのサンプル中で行われる(Saiki，1988)。反応は94℃で １分間、約37〜55℃で２分間（プライマーの同一性に応じて）、そして約72℃で ３分間インキュベートされ、30-40サイクル、好ましくは35サイクルにわたって 繰り返される。夫々の反応の４μlのアリコートが２％のアガロースケル中の電 気泳動により分析され、サンプル中のＤＮＡ産物がゲルを臭化エチジウムで染色 することにより視覚化される。 ２種の温度のPCR技術は、先に説明したように、アニーリング／伸長工程を２ 種の温度ではなく単一温度、例えば、約60-65℃で約５分間行うことのみで上記 とは異なる。 また、図２を参照して、競合PCRアッセイを使用する標的核酸の定量的検出が また行われてもよい。このような定量的検出について、上記のように一般的に合 成されたオリゴデオキシリボヌクレオチド放出プライマーが常磁性ビードに結合 された結合された増幅配列に添加される。放出プライマーは先に説明した第一PC Rプライマーと同じであってもよく、また同じでなくてもよいが、同じであるこ とが好ましいであろう。放出プライマーは結合された増幅配列の捕獲／増幅プロ ーブ１部分の一般の3'末端にハイブリッド形成するように設計され、これは先に 説明したように少なくとも一つ、好ましくは２〜４の制限エンドヌクレアーゼに より認識されて少なくとも一つ、好ましくは２〜４の二本鎖制限酵素開裂部位、 例えば、EcoRI、SmaI及び／またはHindIII部位（一つ以上）を形成するヌクレオ チト配列を含む。 これに関して、上記のように、定量的PCR増幅及び検出系中の使用について、 捕獲／増幅プローブ１はプローブの3'末端に配置された制限酵素により認識され た少なくとも一つ、好ましくは２〜４のヌクレオチド配列で合成されることが重 要である。これは、放出プライマーが結合して一つ以上の二本鎖制限酵素開裂部 位を形成するヌクレオチド配列を与える。 第一プローブ及び第二プローブを連結して連結された増幅配列を形成した後、 放出プライマーが結合された増幅配列にハイブリッド形成される。次いで少なく とも一種の制限酵素、例えば、EcoRI、SmaI及び／またはHindIIIがハイブリッド 形成されたプライマー及び結合された増幅配列に添加される。結合された増幅配 列が制限酵素、例えば、EcoRI部位における開裂によりピーズから放出される。 ビーズからのその放出後に、結合された増幅配列が連続希釈され、次いで先に 説明したような好適なPCR増幅技術を使用して、DNA Taqポリメラーゼにより定量 的に増幅される。 サンプル中の初期の標的核酸の定量は、例えば、Sambrookら，Molecular Clo- ning-A Laboratory Manual，第２編，Cold Spring Harbor Laboratory，1989に 示されるような競合PCR方法により行われて、連結された増幅配列を定量的に増 幅し得る。 一般に、その方法は一連の増幅反応に既知の量で添加された２種の鋳型：結合 された増幅配列及び対照（例えば、結合された増幅配列の一般の部分または標的 核酸の配列に無関係のヌクレオチド配列をそれに挿入した一般の部分）の同時増 幅を伴う。対照及び結合された増幅配列は一般のPCRプライマーの同じ対により 増幅されるが、対照鋳型は、例えば、サイズを異にすることにより、結合された 増幅配列とは区別される。対照鋳型及び結合された増幅配列鋳型は同じ増幅反応 中に存在し、同じプライマーを使用するので、増幅反応の効率に影響し得る幾つ かの変数の効果が実質的に無効にされる。このような変数として、とりわけ、（ 1）試薬(Taq DNAポリメラーゼ、プライマー、鋳型、dNTP)の性質及び濃度、（2 ）変性、アニーリング及びプライマー伸長に使用される条件、（3）反応温度の 変化の速度及び(4)オリゴヌクレオチドプライマーのプライミング効率が挙げら れる。２種の増幅産物--即ち、連結された増幅配列及び対照鋳型--の相対量が出 発鋳型の相対濃度を反映する。 定量的PCR方法は一般の以下のようにして行い得る。 1. 対照鋳型、例えば、Ｑβレプリカーゼ(Schaffnerら，J.Mol.Biol．117: 877-907，1977)の天然産鋳型であるナノ変異体ＲＮＡに相当するＤＮＡ配列が自 動化オリゴヌクレオチド合成により合成され、その濃度が、例えば、分光光度計 または臭化エチジウム媒介蛍光により測定される。 2. 10ng/ml〜１fg/mlの対照鋳型を含む一連の10倍希釈液（TE緩衝液中）がつ くられ、使用まで-70℃で貯蔵される。 3. 遊離の連結された増幅配列の一連のPCR増幅反応が計画される。通常のPCR 成分に加えて、反応はまた約10μl/反応の対照鋳型の10倍希釈液及び約10μCi/ 反応の［α-³²P］dCTP（比活性3000Ci/ミリモル）を含む。 4. PCR増幅反応が所望の回数のサイクル、例えば、30-40にわたって行われる 。 5. 次いで反応生成物がアガロースゲル電気泳動及びオートラジオグラフィー にかけられて２種の増幅産物（異なるサイズの）を分離し得る。好適な技術を使 用して、対照及び連結された増幅配列の増幅バンドがケルから回収され、夫々の バンド中に存在する放射能がシンチレーションカウンター中の計測により測定さ れる。２種の生成物の相対量が夫々のバンド中の放射能の量に基いて計算される 。２種のサンプル中の放射能の量は２種の生成物の分子量の相違について修正さ れる必要がある。 6. 狭い範囲の濃度の対照鋳型を使用して、反応が繰り返されて連結された増 幅配列の濃度を良く推定し得る。 本発明の別の局面において、２種より多いプローブ、即ち、単一の捕獲／増幅 プローブ、及び単一の増幅プローブが使用されてもよい。例えば、一種以上の捕 獲／増幅プローブ、及び一種以上の増幅プローブが図４及ひ５に図示されるよう に標的核酸の検出及び捕獲、並びに標的配列の任意の増幅に使用されてもよい。 本発明のこの局面によれば、捕獲／増幅プローブは標的核酸に相補性の3'末端及 びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと相互作用することができる5'末端にあ るビオチン部分を有してもよい。また、捕獲／増幅プローブは標的核酸に相補性 の5'配列及び3'末端にあるビオチン部分を有してもよい。 更に、本発明のこの局面によれば、夫々のプローブが標的核酸に特異的に相補 性であり、かつ標的核酸とハイブリッド形成可能であるような一種以上の増幅プ ローブが利用される。例えば、一種の増幅プローブ、例えば、図４中の増幅プロ ーブ２(HCV A)の5'末端が標的核酸中の特有の部分に相補性の配列を含む。第二 増幅プローブ、例えば、図４中の増幅プローブ2A(HCV A)の3'末端が第一増幅プ ローブにハイブリッド形成可能な標的のその部分に直ぐに隣接する標的核酸の領 域に相補性の特定の配列を含む。捕獲／増幅プローブ及び増幅プローブの対が上 記のGnSCNの存在下で標的核酸とハイブリッド形成する。こうして形成されたこ の複合体が捕獲／増幅プローブのビオチン部分によりストレプトアビジン被覆常 磁性ビーズに結合され、複合体が上記の磁気分離により未反応成分から分離され る。次に、増幅プローブが、例えば、リガーゼ酵素により連結し得る。これはPC Rによる増幅反応中にTaq DNAポリメラーゼの鋳型として利用することができる連 結された増幅配列を生じる。 本発明の特別な局面において、２種以上の捕獲／増幅プローブ及び増幅プロー ブの二つの対が標的核酸の検出に利用される。 多種の捕獲／増幅プローブの使用は更に良好な捕獲効率を与え、一般の捕獲プ ローブによる多種標的の捕獲を可能にする。これは単一反応中で多種標的が検出 し得る多重PCR反応に特に望ましい。 例えば、本方法に使用するための捕獲／増幅プローブは細胞ｍＲＮＡのpoly-A テール領域に結合するように設計されてもよく、それにより全てのこのようなｍ ＲＮＡが単一の捕獲かつ洗浄工程により単離し得る。その後のPCR増幅はこのよ うなｍＲＮＡプールから特定の標的病原体または疾患遺伝子配列を検出し、増幅 するように設計されてもよい。このような遺伝子として、とりわけ、膵嚢胞性繊 維炎トランスメンブラン調節タンパク質(CFTR)もしくはヘモグロビンまたは遺伝 子疾患に関係するその他のタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。 本発明の更に別の局面において、多種の捕獲／増幅プローブは、例えば、特別 な病原体、例えば、Ｃ型肝炎ウィルス(HCV)の全ての株を標的とすることができ 、増幅プローブは病原体(例えば、HCV)の個々のHCV遺伝子型を検出し、更に同定 するように適応されてもよい。 更に別の実施態様において、例えば、図４に示されるような２種の捕獲／増幅 プローブが利用される。これは単一の捕獲／増幅プローブの長さの２倍であって もよい標的核酸に相補性かつハイブリッド形成可能な捕獲／増幅プローブの完全 な特定の配列を与え、それにより更に高い捕獲効率を与える。 例えば、図４に示されるような捕獲／増幅プローブの対は夫々が標的核酸に相 補性の3'配列、及びストレプトアビジン被覆常磁性ビーズと相互作用することが できるその5'末端にあるビオチン部分を有してもよい。また、捕獲／増幅プロー ブの対は夫々が標的核酸に相補性の5'配列、及びストレプトアビジン被覆常磁性 ビーズと相互作用することができるその3'末端にあるビオチン部分を有してもよ い。 更に、結合された標的プローブがPCRにより増幅される本方法は図13に示され 、また多重LD-PCRと称される、単一反応中の多種標的の検出を可能にする。標的 核酸のPCR増幅の従来技術の方法では、単一反応器中で多種標的を多種プライマ ー対で検出しようとする試みはプライマー効率及びプライマー対間の競合を変化 することにより制限されていた。対照的に、本方法では、夫々の捕獲／増幅プロ ーブは標的特異性領域及び一般の領域を有する。本発明の多重LD-PCRでは、PCR プライマーが結合する一般の領域が全ての捕獲／増幅プローブに共通であっても よい。こうして、多種標的に対し特異性を有する捕獲／増幅プローブの多種の対 が使用されてもよいが、一般のPCRプライマーの唯一の対が結合された捕獲／増 幅プローブを増幅することを必要とされる。捕獲／増幅プローブの標的特異性領 域の長さを変えることにより、特別な標的に相当する増幅されたPCR産物がサイ ズにより同定し得る。 PCR産物はまた酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)により同定し得る。PCR産物は 抗原、例えば、ジゴキシゲニンにより増幅中に標識し得る。次いで標識PCR産物 が増幅プローブの標的特異的領域（その領域は増幅産物中に存在する）にハイブ リッド形成する核酸プローブをその上に有するミクロタイタ・プレートに捕獲さ れる。次いで抗原標識の酵素結合抗体、例えば、ホースラディッシュペルオキシ ダーゼ抗ジゴキシゲニン抗体、及び着色指示薬をミクロタイタ・プレートの夫々 のウェルに添加することにより、捕獲された標識産物が検出し得る。夫々のウェ ルの光学密度がPCR産物の量の目安を与え、これは順に初期のサンプル中の標的 核酸の存在を示す。 更に別の実施態様において、本発明は図６に示されるように単一の増幅可能な “完全長プローブ”及び一種以上の捕獲／増幅プローブを利用し得る。更に、標 的核酸、例えば、HCV RNA、並びに捕獲／増幅プローブ及び完全長増幅プローブ （また、増幅配列と称される）を含むハイブリッド形成された核酸二重らせんが ハイブリッド形成された二重らせん分子をRNAase Hで処理することにより磁性ビ ーズから放出し得る。また、標的核酸、例えば、ＤＮＡ、並びに捕獲／増幅プロ ーブ及び完全長増幅プローブを含むハイブリッド形成された二重らせんがハイブ リッド形成された二重らせん分子を上記の適当な制限酵素で処理することにより 磁性ビーズから放出し得る。 完全長増幅プローブが標的核酸配列を検出するのに使用される場合、上記連結 反応工程を使用することを必要としないで、プローブがPCRの如き増幅反応に使 用されてもよい。特に、この後者のアプローチはアッセイを簡素化し、しかも少 なくとも10⁴の標的核酸分子が試験サンプル中で利用可能である場合に特に有益 であり、その結果、連結反応非依存性検出反応中の非特異的結合の機会が減少さ れる。殆どの臨床検出アッセイでは、標的核酸（例えば、病原体）が>10⁵の分子 ／mlのサンプルで存在し、こうしてこの方法による検出及び増幅を受け易いであ ろう。 本発明の更に別の局面は、図７に示されるように、夫々がビオチン部分を含む 、一種以上の捕獲／増幅プローブ、及び標的核酸にハイブリッド形成し、その自 由末端の連結反応後に環化する単一増幅プローブ（また、増幅配列と称される） を利用する。増幅プローブは、標的核酸配列にハイブリッド形成可能であるプロ ーブの相補領域（例えば、図７中で太字で示された領域を参照のこと）がプロー ブの夫々の末端に配置されるように設計されてもよい（Nilssonら，1994，Scien ce 265:2085-2088に記載されているように）。プローブが標的とハイブリッド形 成する場合、その末端が互いに隣接して配置され、リガーゼ酵素の如き連結試薬 との連結反応後に閉環分子の形成をもたらす。次いで図７に示されたようなプラ イマーを使用して、この環状分子が増幅工程、例えば、PCR中に鋳型として利用 し得る。また、環状分子は以下に記載されるようなRAMにより増幅されてもよく 、または以下に記載されるような改良HSAMアッセイにより検出されてもよい。 例えば、上記プローブは血清標本からの病原体、例えば、HCVの異なる遺伝子 型の異なる遺伝子型を検出するのに使用し得る。遺伝子型特異性プローブは、標 的核酸中の突然変異が検出可能であるように、公表されたHCV配列(Stuyverら，1 993，J.Gen.Virol．74:1093-1102)に基いて設計し得る。何とならば、このよう な突然変異が(1)標的核酸へのプローブの適当なハイブリダイゼーション及び（2 ）環状分子へのプローブのその後の連結反応を妨害するようであるからである。 以下に説明するように、環化プローブの性質のために、未結合プローブがストリ ンジェント洗浄条件下で除去し得る。 その方法に利用された単一の完全長の連結反応依存性環化可能なプローブは標 的核酸配列の検出及び増幅の大きな効率を与える。二本鎖核酸分子のらせんの性 質のために、環化プローブが標的核酸鎖のまわりに巻かれる。連結反応工程の結 果として、プローブは連環化により標的分子に共有結合されてもよい。これは標 的分子のプローブの固定化をもたらし、ストリンジェント洗浄条件に対し実質的 に耐性であるハイブリッド分子を形成する。これはアッセイ中の非特異的シグナ ルの有意な減少、低いバックグラウンドノイズ及びアッセイの特異性の増大をも たらす。 本発明の別の実施態様は環状プローブを利用する増幅方法におけるキャリーオ ーバー汚染及びバックグラウンドの低下方法を提供する。本連結反応依存性増幅 方法は、通常の増幅方法と違って、標的核酸ではなく一種以上の連結されたプロ ーブの増幅を伴う。連結されたプローブが閉環分子である場合、それはエキソヌ クレアーゼ消化を受け易い遊離末端を有しない。プローブ連結反応、即ち、環化 後に、エキソヌクレアーゼによる反応混合物の処理が“クリーン−アップ”工程 を与え、こうして、閉環分子ではなく未結合プローブまたは線状ＤＮＡフラグメ ントを消化することによりバックグラウンド及びキャリーオーバー汚染を減少す る。共有結合された環状分子はその後の増幅及び検出について無傷で残る。通常 のPCRでは、一本鎖プライマーまたはキャリーオーバーＤＮＡフラグメントを排 除するためのエキソヌクレアーゼの使用は、標的核酸がまた分解されるリスクを もたらす。本発明はこのリスクを問題としない。何とならば、標的核酸が増幅さ れないからである。好ましい実施態様において、エキソヌクレアーゼはエキソヌ クレアーゼIII、エキソヌクレアーゼVII、ブンドウ(mung bean)ヌクレアーゼま たはヌクレアーゼBAL-31である。エキソヌクレアーゼは連結反応後かつ増幅前に 反応に添加され、例えば、37℃で30分間にわたってインキュベートされる。 連結されて単一の共有結合閉環されたプローブを形成し得る多種プローブを使 用することが更に意図されている。例えば、第一プローブが標的の領域にハイブ リッド形成するように選択される。第二プローブは、その3'末端及び5'末端が第 一プローブの5'末端及び3'末端に隣接するが、連続ではない標的の領域にハイブ リッド形成する。次いで二つの連結反応イベントが共有結合閉環されたプローブ を得るのに必要とされる。２種のリガーゼ、例えば、酵素リガーゼ及び化学リガ ーゼを使用してプローブを共有結合閉環することにより、連結反応の順序が調節 し得る。この実施態様は単一標的中の二つの直ぐ近くにある突然変異を同定する のに特に有益である。 また、環化されたプローブは大きなポリマーの生成により増幅され、検出し得 る。ポリマーは環化プローブに沿ったプライマー１のローリングサークル伸長及 び下流の配列の置換により生成される。この工程は、図９及び16に示されるよう に、その後のPCRの鋳型として利用することができる多重単位を含む一本鎖ＤＮ Ａを生成する。そこに示されるように、プライマー２は一本鎖ＤＮＡポリマーに 結合し、同時に伸長して、上流プライマーによる下流プライマーの置換をもたら す。プライマー伸長／置換及びPCRの両方を使用することにより、更に検出可能 な生成物が同じサイクル数で生成される。 また、環化プローブはHSAMアッセイの改良により検出されてもよい。図14に示 されたこの方法では、環化可能な増幅プローブが、上記のように、標的核酸の隣 接領域に相補性である3'領域及び5'領域を含む。更に、環化可能なプローブは非 相補性、または一般のリンカー領域を含む。本シグナル増幅方法において、環化 可能なプローブのリンカー領域は第一の一般の環化可能なシグナルプローブ(CS- プローブ）の3'領域及び5'領域に相補性である隣接領域の少なくとも一つの対を 含む。第一CSプローブは、その3'領域及び5'領域中に、環化可能な増幅プローブ のリンカー領域の隣接領域に相補性である配列を含む。標的核酸への環化可能な 増幅プローブの結合、続いて連結反応により第一CSプローブの3'末端及び5'末端 への結合に利用できるリンカー中の領域を有する共有結合された環状プローブが 生じる。第一CSプローブの添加は環状増幅プローブのリンカーの相補性領域への その3'領域及び5'領域の結合をもたらす。CSプローブの3'領域及び5'領域が連結 試薬により連結されて閉環増幅プローブに結合された閉環CSプローブを形成する 。第一CSプローブは第二CSプローブの3'領域及び5'領域に相補性であるように設 計された隣接の連続領域の少なくとも一つの対を含むリンカー領域を更に含む。 第二CSプローブは、その3'領域及び5'領域中に、第一CSプローブのリンカー領 域の隣接領域に相補性である配列を含む。第二CSプローブの添加は、第一CSプロ ーブのリンカーの相補領域へのその3'領域及び5'領域の結合をもたらす。第二CS プローブの3'領域及び5'領域は連結試薬により連結されて閉環CSプローブを形成 し、これが順に閉環増幅プローブに結合される。 上記方法を相補領域の多種の対を有するCSプローブの多様性により行うことに より、連鎖分子の大きいクラスターが標的核酸に形成される。好ましい実施態様 において、３種のCSプローブが利用される。3'領域及び5'領域に加えて、CSプロ ーブの夫々が第二CSプローブの3'領域及び5'領域に相補性である相補領域の一つ の対と、第三CSプローブの3'領域及び5'領域に相補性である相補領域の別の対と を有する。これらの“３価”のCSプローブを本発明の方法に利用することにより 、図14に示されたような連鎖分子のクラスターが生成される。 徹底的に洗浄して標的に結合されない非特異的連鎖反応を除去した後、連鎖分 子のクラスターを検出することにより標的核酸がその後に検出される。連鎖分子 は複合体を制限エンドヌクレアーゼ（その認識配列が夫々のCSプローブのリンカ ー領域に特異的にとり込まれていた）で消化することにより容易に検出し得る。 制限エンドヌクレアーゼ消化はポリアクリルアミドゲルで視覚化し得る直線状モ ノマーをもたらす。検出のその他の方法は、検出可能な分子、例えば、ジゴキシ ケニン、ビオチン、または蛍光分子をCSプローブにとり込み、抗ジゴキシゲニン 、ストレプトアビジン、または蛍光検出で検出することにより行い得る。例えば 、Essersら(1980)J.Clin.Microbiol．12，641により記載されたようなラテック ス凝集がまた使用されてもよい。このような核酸検出方法が当業者に知られてい る。 更に、特別な用途において、上記の増幅プローブ及び／または増幅配列がin situ LD-PCRアッセイに使用し得る。in situ PCRが標的ウィルス核酸の直接局在 化及び視覚化に利用されてもよく、ウィルス感染を組織病理学的知見と相関関係 付けるのに更に有益であり得る。 標的ウィルスＲＮＡ配列について分析する現行の方法はこの目的にRT PCR技術 を利用していた(Nuovoら，1993，Am.J.Surg.Pathol．17(7):683-690)。この方法 では、標的ウィルスＲＮＡからin situ逆転写により得られたｃＤＮＡがPCR方法 により増幅される。増幅されたｃＤＮＡのその後の細胞内局在化が標識プローブ による増幅されたｃＤＮＡのin situハイブリダイゼーションまたは増幅反応中 のＤＮＡへの標識ヌクレオチドのとり込みにより行い得る。 しかしながら、RT PCR方法は本発明により解消される欠点を問題とする。例え ば、サンプル組織を処理するのに使用される種々の組織固定剤が細胞の核酸及び タンパク質、例えば、タンパク質−ＲＮＡ複合体及びＲＮＡ−ＲＮＡ複合体の架 橋に影響し、RT PCRの主要工程である逆転写を阻害する。更に、標的ＲＮＡ中の 二次構造がまた逆転写を妨害し得る。更に、単一細胞中の多種の標的配列の検出 のためのRT PCRへの多重PCRの適用は夫々のプライマー対の異なる効率のために 重大な問題を呈し得る。 本発明の方法は上記の一種以上の増幅プローブ及び／または増幅配列と、標的 核酸を配置し、in situで検出するためのLD-PCR技術（これはRT-PCR方法に対し 或る利点を与える）とを利用する。第一に、標的核酸へのプローブのハイブリダ イゼーション及びプローブ配列のその後の増幅はRT-PCR方法の逆転写工程を省く ので、標的ＲＮＡの二次構造がアッセイの結果に影響しない。更に、組織固定剤 による標的核酸及び細胞タンパク質の架橋は、先に説明したように、プローブ配 列の増幅を妨害しない。何とならば、RT-PCR方法のような標的ＲＮＡのプライマ ー伸長がないからである。 特に、本発明の増幅プローブは、標的病原体の異なる遺伝子型変異体を検出す るプローブ内に共通のプライマー結合配列があるように設計されてもよい。これ はアッセイが単一サンプル中の多種標的を検出することを可能にする。例えば、 限定のためではなく、アッセイは本発明の２種以上の増幅プローブを利用してHC V RNA及びβ−アクチンＲＮＡを検出でき、それによりβ−アクチンプローブ がアッセイの内部対照として利用することができる。 更に、プローブ中のプライマー結合配列は(1)非特異的プライマーオリゴマー 化を最小にし、かつ(2)優れたプライマー結合及びPCR産物の増大された収率を得 、それによりアッセイの感度を増大するように設計されてもよい。 増幅プローブは標的核酸への結合後に環化して環状分子になるので、多量体生 成物が重合中に生成されることがあり、その結果、増幅産物が上記のように図９ 及び16に示されるように容易に検出し得る。 本発明に従って組織標本中の標的核酸を検出するためのin situ LD-PCRアッセ イは連結反応依存性完全長増幅プローブを利用し、下記の工程を伴う。 サンプル組織、例えば、肝臓（これは凍結され、またはホルマリン固定され、 パラフィン中に封入されてもよい）が切開され、シラン被覆スライドの上に置か れる。切片はキシレン及びエタノールで洗浄されてパラフィンを除去してもよい 。次いで切片がトリプシンの如きタンパク質分解酵素で処理されて膜透過性を増 大し得る。切片はRNAaseを含まないDNAaseで更に処理されて環状ＤＮＡを排除し 得る。 増幅プローブは好適な緩衝液中で懸濁され、スライド上のサンプル切片に添加 され、標的配列とハイブリッド形成し得る。プローブは20％のホルムアミドを含 む2xSSCに溶解され、スライドに添加され、その混合物が37℃で２時間インキュ ベートされてハイブリダイゼーションが起こる。スライドは2xSSCで１回そして1 xリガーゼ緩衝液で２回洗浄されてもよく、その後にＤＮＡリガーゼがサンプル に適用されてもよい。1U/20μlのリガーゼ酵素が夫々のスライドに添加されるこ とが好ましく、その混合物が37℃で２時間インキュベートされてプローブの環化 を可能にする。スライドは0.2 x SSC(高ストリンジェンシー緩衝液)及び1xPCRで 洗浄されてPCRによる増幅の次の工程の前に未結合プローブを除去してもよい。 増幅プライマー及び一種以上の標識ヌクレオチドを含むPCR反応混合物が標的配 列の増幅のためにスライド上のサンプルに今添加される。一種以上のヌクレオチ ドの標識は、とりわけ、先に記載されたような放射性同位元素、例えば、³²Pま たは³H、蛍光分子、例えば、フルオレセイン及び色素産生分子または酵素、例え ば、ペルオキシダーゼを含むあらゆるシグナル発生部分であってもよい。 色素産生物質が、例えば、酵素結合色素産生アッセイによる検出分析に好ましい 。 更に好ましい局面において、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドが利用される。 このような場合、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドで標識されたPCR産物は抗ジ ゴキシゲニン抗体−アルカリ性ホスファターゼ複合体とともにインキュベートさ れた時に検出可能である。アルカリ性ホスファターゼに基く比色検出はニトロブ ル−テトラゾリウムを利用し、これは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルホスフェートの存在下で、プローブの増幅部位で紫−青色の沈殿を生じる。 本発明の一局面において、in situ LD-PCR検出方法の連結反応及びPCR増幅工 程は、熱安定性リガーゼ酵素を使用することにより同時に高温で行われて増幅プ ローブを環化し得る。 本発明によれば、in situ LD-PCRの更なる実施態様は、病原体、例えば、HCV の種々の遺伝子型変異体を検出するように設計され、これらの変異体の既知のHC V配列(Stuyverら，1993，J.Gen.Vir．74:1093-1102)に基く増幅プローブを利用 し得る。例えば、異なる型特異性プローブがサンプルに一緒に添加され、HCV配 列の検出及びプローブ配列の増幅が上記のin situ LD-PCRにより行われる。次に 、増幅されたプローブ配列が検出を促進するために標識される型特異性内部プロ ーブによるin situハイブリダイゼーションにより個々の変異体遺伝子型の存在 について分析される。 本発明の或る局面において、標的核酸配列は、これらの配列を増幅しないで、 上記の種々の増幅プローブ及び／または増幅配列を使用して直接検出し得る。こ のような局面において、増幅プローブ及び／または増幅配列は、それらが検出可 能であるように標識されてもよい。 連結反応依存性環化可能なプローブを利用する本発明の実施態様において、得 られる環状分子は図19に示されるような分枝−伸長増幅方法(RAM)により共有結 合増幅されてもよい。RAMによる環化プローブの増幅は、等温条件下で環化プロ ーブの100万倍までの増幅を可能にすることにより本発明の方法に更なる利点を 加える。RAMが図19に示される。 RAMに有益な単一の完全長の連結反応依存性の環化可能なプローブは標的分子 の隣接するが、連続ではない領域にハイブリッド形成可能である領域をその3'末 端及び5'末端に含む。環化可能なプローブは、標的核酸の一部に相補性であり、 かつハイブリッド形成可能である5'領域と、プローブの5'領域に相補性である標 的の一部に隣接する標的核酸の一部に相補性であり、かつハイブリッド形成可能 である3'領域とを含むように設計される。環化可能なプローブの5'領域及び3'領 域は夫々長さ約20ヌクレオチドから約35ヌクレオチドまでであってもよい。好ま しい実施態様において、環化可能なプローブの5'領域及び3'領域は長さ約25ヌク レオチドである。環化可能なプローブはリンカー領域と称される領域を更に含む 。好ましい実施態様において、リンカー領域は長さ約30ヌクレオチドから約60ヌ クレオチドまでである。リンカー領域は標的配列に相補性ではなく、またハイブ リッド形成可能ではない一般の配列を含む。 RAMによる増幅に適した環化可能なプローブは、上記の一種以上の捕獲／増幅 プローブとともに本方法に利用される。環化可能なプローブが標的核酸とハイブ リッド形成する場合、その5'末端及び3'末端が並置されるようになる。連結試薬 による連結反応は閉環分子の形成をもたらす。 閉環分子の増幅は、第一伸長プライマー（伸長プライマー１）を反応に添加す ることにより行われる。伸長プライマー１は環化可能なプローブのリンカー領域 の一部に相補性であり、かつハイブリッド形成可能であり、長さ約15ヌクレオチ ドから約30ヌクレオチドまでであることが好ましい。伸長プライマー１は充分な 濃度のdNTP及びＤＮＡポリメラーゼを添加することにより伸長されてプライマー を閉環分子のまわりに伸長する。サークルの１回転後に、即ち、ＤＮＡポリメラ ーゼが伸長プライマー１結合部位に達する時に、ポリメラーゼがプライマー及び その伸長された配列を置換する。こうして、ポリメラーゼは閉環プローブを連続 的に“ロールオーバー”して図19に示されるような長い一本鎖ＤＮＡを生成する 。 RAMによる環化プローブの増幅に有益なポリメラーゼは3'→5'エキソヌクレア ーゼ活性を欠き、鎖置換活性を有し、かつ少なくとも約1000の塩基のプライマー 伸長可能であるあらゆるポリメラーゼであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼの（ エキソ−）クレノーフラグメント、テルモコッカス・リトラリスＤＮＡポリメラ ーゼ（Vent（エキソ^-）ＤＮＡポリメラーゼ、ニュー・イングランド・バイオラ ブズ）及びphi29ポリメラーゼ（Blancoら，1994，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 91:12198）が好ましいポリメラーゼである。テルムス・アクアチクス(Taq)ＤＮ Ａポリメラーゼがまた本発明によれば有益である。その文献中の論文とは逆に、 Taq DNAポリメラーゼが鎖置換活性を有することが本発明により見い出された。 ポリメラーゼによる伸長プライマー１の伸長は環化可能なプローブの配列に相 補性の配列を有する反復単位の長い一本鎖ＤＮＡをもたらす。一本鎖ＤＮＡは10 Kbまでであってもよく、例えば、約20単位から約100単位までを含んでもよく、 夫々の単位は環化可能なプローブの長さ、例えば、約100塩基に長さが等しい。R AMの別法として、標的が多量であり、または一本鎖ＤＮＡが長い場合、検出がこ の工程で行われてもよい。例えば、得られる生成物をポリアクリルアミドゲルで 大きい分子として視覚化することにより、長い一本鎖ＤＮＡがこの段階で検出し 得る。 RAMによる増幅の次の工程では、第二伸長プライマー（伸長プライマー２）が 添加される。伸長プライマー２は長さ約15ヌクレオチドから約30ヌクレオチドま でであることが好ましい。伸長プライマー２は、伸長プライマー１が相補性であ るリンカー領域の部分に重ならないリンカー領域の一部と同じである。こうして 、長い一本鎖ＤＮＡの夫々の反復単位は、伸長プライマー２がハイブリッド形成 する結合部位を含む。こうして、伸長プライマー２の多重コピーが図19に示され るように長い一本鎖ＤＮＡに結合し、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。プ ライマー伸長産物は下流のプライマーをそれらの相当する伸長産物で置換して図 19に示されるように多重置換された一本鎖ＤＮＡ分子を生成する。置換された一 本鎖は伸長プライマー１の結合部位を含み、こうして更なるプライマー伸長反応 の鋳型として利用することができて図19に示される多重分枝分子を生成する。全 てのＤＮＡが二本鎖になる時、反応が終了する。 次いでRAMにより増幅されたＤＮＡがＤＮＡの検出について当業界で知られて いる方法により検出される。RAMは指数的増幅をもたらすので、得られる多量の ＤＮＡが、例えば、ゲル電気泳動及び、例えば、臭化エチジウムによる視覚化に より都合良く検出し得る。RAM伸長産物は閉環ＤＮＡから伸長された単位の数に 応じてサイズを異にするので、RAM産物は電気泳動された時にスミアまたはラダ ーとして現れる。別の実施態様において、環化可能なプローブは特異な制限部位 を含むように設計され、RAM産物が相当する制限エンドヌクレアーゼで消化され て１単位の長さ、即ち、環化可能なプローブの長さの多量の単一サイズのフラグ メントを与える。フラグメントはゲル電気泳動により単一バンドとして容易に検 出し得る。また、ビオチンまたはジゴキシゲニンの如きリガンドがプライマー伸 長中にとり込まれ、リガンド標識一本鎖生成物が上記のように検出し得る。 RAM伸長産物は、例えば、PCR産物の検出について上記されたようなELISAを含 む、当業界で知られているその他の方法により検出し得る。 本発明の別の実施態様において、RAMアッセイは増幅を増大するように改良さ れる。一実施態様において、伸長プライマー２の添加後に、反応温度が周期的に 約95℃まで上昇される。温度の上昇は二本鎖ＤＮＡの変性をもたらし、伸長プラ イマー１及び２の付加的な結合並びに付加的な伸長産物の生成を可能にする。こ うして、PCRはRAMと有効に組み合わされて図16に示されるように増幅を増大し得 る。 別の実施態様において、伸長プライマー２（ひいては環化可能なプローブのリ ンカー領域の同じ部分）がＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列 を含むように設計される。ＲＮＡポリメラーゼ及び相当するプロモーター配列が 当業界で知られており、例えば、Milliganら(1987)Nucleic Acid Res．15:8783 により開示されている。好ましい実施態様において、ＲＮＡポリメラーゼはバク テリオファージT3、T7、またはSP6 RNAポリメラーゼである。プロモーター配列 を含む伸長プライマー２、相当するＲＮＡポリメラーゼ及びrNTPの添加は、機能 性プロモーターを形成するための成長している一本鎖ＤＮＡへの伸長プライマー ２のハイブリダイゼーション、及びＲＮＡの多重コピーへの下流の配列の転写を 可能にする。本発明のこの実施態様が図17に示される。この実施態様において、 RAM及び転写の両方が作用してプローブの有意な増幅を生じる。ＲＮＡは当業者 に知られている方法、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、放射性標識ま たは非放射性標識兼検出方法（ベーリンガー・マンハイム）、または鮮明検出ア ッセイ（ダイジーン，Md）により検出し得る。ＲＮＡの検出は標的核酸の存在を 示す。 別の実施態様において、伸長プライマー１及び環状プローブのリンカー領域の 相当する部分はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列をその中にと り込むように設計される。こうして、伸長プライマー１が環化プローブを結合す る時、機能性プロモーターが形成され、環化されたプローブがＲＮＡポリメラー ゼ及びrNTPの添加後にＲＮＡ転写の鋳型として作用する。下流のプライマー及び そのＲＮＡ配列がＲＮＡポリメラーゼにより置換され、大きいＲＮＡポリマーが つくられる。ＲＮＡポリマーは前記のように検出し得る。また、EcoRIの如き制 限酵素を添加することにより、環状プローブが一本鎖ＤＮＡに開裂し得る。制限 部位が図20に示されるように伸長プライマー１の5'末端にとり込まれる。 本発明を実施するのに使用するための試薬は個々に用意されてもよく、または キット形態でパッケージされてもよい。例えば、一種以上の第一プローブ、例え ば、捕獲／増幅１プローブ及び一種以上の第二プローブ、例えば、増幅プローブ ２プローブを含み、好ましくはまた適当な一般のプライマーのパッケージされた 組み合わせを含むキットが調製し得る。また、一種以上の第一プローブ、例えば 、捕獲／増幅１プローブ及び一種以上の第二の完全長の連結反応非依存性プロー ブ、例えば、増幅プローブ２を含むキットが調製し得る。一種以上の第一プロー ブ、例えば、捕獲／増幅１プローブ及び一種以上の第二の完全長の連結反応依存 性の環化可能なプローブ、例えば、増幅プローブ２を含む更に別のキットが調製 し得る。このようなキットはまた適当な一般のプライマーのパッケージされた組 み合わせを含むことが好ましい。必要により、連結反応（例えば、ＤＮＡリガー ゼ）そしておそらく増幅に必要とされるその他の試薬が含まれてもよい。また、 付加的な試薬が増幅された連結された増幅配列、例えば、ナノ変異体ＲＮＡに相 当するオリゴデオキシリボヌクレオチドの如き対照鋳型の定量的検出用に含まれ てもよい。更に、キットは、例えば、組織サンプル中の標的核酸配列のin situ 検出のための試薬を含んでもよい。また、環状プローブを含むキットはキャリー オーバー防止のためのエキソヌクレアーゼを含んでもよい。 キットの容器内の試薬の配置は関係する特定の試薬に依存するであろう。夫々 の試薬が個々の容器中にパッケージし得るが、種々の組み合わせがまた可能であ り得る。 本発明が下記の実施例により説明され、これらは本発明の範囲を限定すること を目的としない。 実施例１ 試料中のHIV-1 RNAの検出 オリゴヌクレオチドプローブの調製 HIV-1 RNAのgag領域を検出する各々Capture/Amp-プローブ-1(HIV-1)とAmp-プ ローブ-2(HIV-1)と称する一組のオリゴデオキシリボヌクレオチドを既知のオリ ゴヌクレオチド合成法を用いる自動DNAシンセサイザー(Applied Biosystems，In c.)による自動合成で調製した。Capture/Amp-プローブ-1(HIV)は59ヌクレオチド 及び合成の最終工程として3'-ビオチン化ヌクレオシド三リン酸を用いることに より付加される3'ビオチン部分を含むオリゴデオキシリボヌクレオチドである。 本実施例に用いられるCapture/Amp-プローブ-1(HIV)は次のヌクレオチド配列を 有する（下記に配列番号１として示される）。 位置24-59のヌクレオチドは、該プローブの汎用的3'端を含む。この領域内の ヌクレオチド41-46、46-51と52-57に各々SmaI(CCCGGG)、EcoRI(GAATTC)とHindII I(AAGCTT)の認識配列がある。ヌクレオチド1-23を含む配列の5'部分は、HIV-1 R NAのgag領域の部分に相補的でハイブリッド形成する。 Amp-プローブ-2(HIV)は次の配列を有する92ヌクレオチドオリゴデオキシリボ ヌクレオチドである(下記に配列番号２として示される)。 位置71-92のヌクレオチドは、Capture/Amp-プローブ-1(HIV)のヌクレオチド1- 23に相補的なgag領域の部分にすぐ隣接するHIV-1 RNAのgag領域の部分に相補的 でハイブリッド形成するこのプローブの3'特定部分を含む。ヌクレオチド1- 70は、Amp-プローブ-2(HIV)の汎用的5'部分を含む。 T₄ DNAリガーゼを用いてCaptuve/Amp-プローブ-1(HIV)の5'端をAmp-プローブ- 2(HIV)の3'に結合すると次の配列を有する連結増幅配列(HIV)が作成される（下 記で配列番号３として示される）。 この連結増幅配列は151ヌクレオチドの長さであり、PCRの理想的なサイズの鋳 型を与える。 ヌクレオチド116-135(Capture/Amp-プローブ-1(HIV)のヌクレオチド24-43に由 来する）及ひヌクレオチド1-70(Amp-プローブ-2(HIV)のヌクレオチド1-70に由来 する）を含む連結増幅配列(HIV)の汎用的ヌクレオチド配列は、配列がSchaffner ら，J．Nlolec．Biol．117:877-907(1977)に記載されるWSIナノバリアントRNAの (-)鎖のヌクレアーゼ1-90に対応する。WSIは、3種の密接に関連した6S RNA種、W SI、WSII及ひWSIIIのグループの1つであり、鋳型を付加せずにQβレプリカーゼ 反応で生じる。Schaffnerらは、その3分子を“ナノバリアント”と呼んだ。 WSI(-)鎖のヌクレオチド1-90に対応する90ヌクレオチド長オリゴデオキシリボ ヌクレオチドは次の配列を有する(下記に配列番号4として示される)。 連結増幅配列のPCR増幅に用いるために２つの汎用的オリゴデオキシヌクレオ チドプライマーを合成した。長さが21ヌクレオチドであるプライマー-1は、Capt ure/Amp-プローブ-1(HIV)の3'配列(ヌクレオチド38-58)に相補的であり、次の配 列を有する(下記に配列番号5として示される)。 長さが20ヌクレオチドのプライマー-2は、配列がAmp-プローブ-2(HIV)の5'配 列(ヌクレオチド1-20)に対応し、次の配列を有する(下記に配列番号6として示さ れる)。 HIV-1 RNA の捕捉と検出 標的HIV-1 RNA(100μl)を、1.5mlミクロフュージ管中5M GnSCN、100mM EDTA、 200mMトリス-HCl(pH8.0)、0.5% NP-40(Sigma Chemical Co.,ミズーリ州セントル イス)及び0.5% BSAを含む同量の溶解緩衝液に溶解する。次に、溶解緩衝液に溶 解した試料に3'-ビオチン化Capture/Amp-プローブ-1(HIV)(配列番号1)とAmp-プ ローブ-2(HIV)(配列番号2)をストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ(Promega Cor p.から入手)と共に加えた。標的RNA/CaptuY-e/Amp-プローブ-1(HIV)/Amp-プロー ブ-2(HIV)/常磁性ビーズを含む複合体を形成し、ビーズ上で保持した。ミクロフ ュージ管のホルダーラック(Promega Corp.から入手)内の磁石によって生じる磁 場を複合体に適用して磁石に隣接している反応管の一方に保持して結合されない 物質をサイホンで吸い上げた。次に、複合体を1.5M GnSCN緩衝液で2回洗浄して 結合されないタンパク質、核酸、複合体で捕捉されるプローブを除去した。磁場 法は洗浄工程を促進した。次に、複合体を300mM KCl緩衝液(300mM KCl、50mMト リス-HCl，pH7.5、0.5% Non-IDEP-401mM EDTA)で洗浄することによりGnSCNを除 去した。 次に、2つのプローブをT₄DNAリガーゼ(Boehvinger Manheim)を用いてPCR増幅 の鋳型として働くことができる機能上の連結増幅配列(HIV)(配列番号3)に共有結 合した。連結反応を、ベーリンガーマンハイムから入手した10×T₄DNAリガーゼ 連結緩衝液(660mMトリス-HCl、50mM MgCl₂、10mMジチオエリスリトール、10mM A TP-pH7.5，20℃)の1:10希釈液を含む1×連結緩衝液の存在下に行った。 結合した連結増幅配列(HIV)を含む常磁性ビーズを1×T₄DNAリガーゼ連結緩衝 液で洗浄し、100μlの1×T₄DNAリガーゼ連結緩衝液に懸濁した。20μlのビーズ 懸濁液を連結反応のために取り出した。反応混合液に2μlT₄DNAリガーゼを加え 、37℃で60分間インキュベートした。 結合した連結増幅配列(HIV)のPCR増幅用に、Taq DNAポリメラーゼ、2つの汎用 的PCRプライマー(配列番号5と6)、デオキシヌクレオシド三リン酸と³²P-dCTPの 混合液を含む80μlのPCR反応混合液を連結反応に加えた。二温度PCR反応を30サ イクルにわたって行い、ハイブリッド形成とプライマーエクステンションを65℃ で60秒間行い、変性を92℃で30秒間行った。 30サイクル後、10μlの反応混合液を10%ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動 にかけ、オートラジオグラフィーで検出した(図3、レーンA)。対照として、ナノ バリアントDNA(配列番号4)を連結増幅配列(HIV)と同じ条件下で30サイクルの二 温度PCR、電気泳動及びオートラジオグラフィーにかけた。図3からわかるように 、増幅した連結増幅配列(HIV)は単一バンド(151ヌクレオチド)が増幅したナノバ リアントDNA(90ヌクレオチド)より遅い速度で移動した。結果から連結されない 第1プローブと第2プローブは増幅も検出もされないことが示された。実施例2 試料中のHIV-1 RNAの直接検出 試料中のHIV-1 RNAの存在を直接検出する本方法の能力を求めた。本実施例に 用いられるプローブは実施例1と同じものである(配列番号1と2)。直接検出用に 、Amp-プローブ-2(HIV)(配列番号2)の5'を³²P-γ-ATPを用いるT₄ホスホキナーゼ 反応により³²Tで標識した。種々の反応混合液は次のようにした。 1．ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、3'ビオチン化Capture/Amp-プローブ- 1(HIV)(配列番号1)、Amp-プローブ-2(HIV)(配列番号2)5'(³²P)、HIV-1 RNA転写 物。 2．ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、3'ビオチン化Capture/Amp-プローブ- 1(HIV)、Amp-プローブ-2(HIV)5'(³²P)。 3．ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、Amp-プローブ-2(HIV)5'(³²P)、HIV-1 RNA転写物。 上記の3反応混合液の各々を用いるハイブリッド形成を1M GnSCN、0.5% NP-40 （Nonidet P-40、N-ラウロイルサルコシン、Sigma Chemical Co.、ミズーリ州セ ントルイス）、80mM EDTA、400mMトリス−HCl(pH7.5)及び0.5%ウシ血清アルブミ ンを含む20μlの1M GnSCN緩衝液中で行った。 反応混合液を37℃で60分間インキュベートした。インキュベートした後、反応 混合液を実施例1に記載された磁場に供し、1M GnSCN緩衝液で(200μl/洗浄)2回 及び300mM KCL、50mMトリス-HCl(pH7.5)、0.5% NP-40及び1mM EDTAを含む300mM KCl緩衝液で3回洗浄した。洗浄後に常磁性ビーズに維持される³²P標識Amp-プロ ーブ-2(HIV)量を数/分(CPM)として表1に示す。結果から、標的HIV RNAとCapture /Amp-プローブ-1(HIV)双方の存在下にのみ著しい量のAmp-プローブ-2がビーズ上 に維持されβ-シンチレーションカウンターで計数することにより検出されるこ とが示される。 実施例3 患者試料中のマイコバクテリウム・アビウム- イントラセルレア(MAI)の検出 最近の論文(Boddinghausら，J．Clin．Microbiol．28:1751，1990)にマイコバ クテリア 種の同定及び16SリボソームRNA(rRNA)の増幅による該種間の識別の成功 が報告された。増幅と同定用の標的として細菌性16S rRNAを用いることの利点が 次のようにRogallら，J．Gen．Microbiol.，136:1915，1990に示された。1)rRNA は細菌リボソームの実質的な成分であること；2)rRNA配列の比較分析により高 保存配列の伸長とかなりの量の変異性がある他の伸長が示されること；3)rRNAが 多くのコピー数、即ち、10³〜10⁴分子/細胞で存在し、感受性のある検出分析の 展開を容易にすること；4)16S rRNAのヌクレオチド配列がクローニング操作を含 まずに迅速に求められ、たいていのマイコバクテリア16S rRNAの配列が既知であ ること。 BoddinghausらとRogallらによって発表された16S rRNA配列に基づき、自動オ リゴヌクレオチド合成(上記)により3組のCapture/Amp-プローブ-1とAmp-プロー ブ-2のプローブを調製する。第1組のプローブ(MYC)は汎用的であり、第1プロー ブと第2プローブの特定の部分が全マイコバクテリア種の16S RNAに対してハイブ リッド形成可能である。これは、試料中のマイコバクテリアの存在を検出するた めに用いられる。第2組のプローブ(MAV)はM.アビウムの16S rRNAに特異的であり 、第3組のプローブ(MIN)はM.イントラセルレアの16S rRNAに特異的である。本方 法の非常に特異的な連結反応は、単一ヌクレオチドレベルでそれらの2つ種の識 別を可能にする。 A．全マイコバクテリア種の汎用的検出に用いられるプローブは、実施例1のよう に第1プローブと第2プローブを含む。第1プローブは、3'ビオチン化Capture/Amp -プローブ-1(MYC)、次の配列を有する長さが54ヌクレオチドのオリゴデオキシリ ボヌクレオチドである(下記に配列番号7として示される)。 該プローブの5'端のヌクレオチド1-18は、マイコバクテリア16S rRNA、即ち、 全マイコバクテリア種に存在する16S rRNA配列の共通部分に相補的である。ヌク レオチド19-54を含む該プローブの3'部分は、配列が実施例1のCapture/Amp-プロ ーブ-1(HIV)の汎用的部分を含む36ヌクレオチドと同一である。 第2プローブは、次の配列を有するAmp-プローブ-2(MYC)、長さが91ヌクレオチ ドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである(下記に配列番号8として示される) 。 プローブの3'端のヌクレオチド71-91は、全マイコバクテリア種に共通のヌク レオチド1-18又は上記Capture/Amp-プローブ-1(MYC)に相補的な領域に隣接して いる16S rRNAの共通部分に相補的である。プローブの5'端のヌクレオチド1-70は 、実施例1のAmp-プローブ-2(HIV)と同じ汎用的配列を含む。 実施例1のように２つのプローブの端と端をつないで結合すると、次の配列を 有する全マイコバクテリア種の検出用の長さが145ヌクレオチドの連結増幅配列( MYC)が得られる(下記に配列番号9として示される)。 B．M. アビウムの特定の検出のための一組のプローブは次の通りである。 第1プローブは次の配列を有する3'ビオチン化Capture/Amp-プローブ-1(MAV)、 長さが56ヌクレオチドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである(下記に配列番 号10として示される)。 5'端のヌクレオチド1-20は、M. アビウムに特異的な16S rRNAの部分に相補的で ある。ヌクレオチド21-56は、上記と同じ汎用的配列を含む。 第2プローブは、次の配列を有するAmp-プローブ-2(MAV)、長さが90ヌクレオチ ドのオリゴデオキシリボヌクレオチドである(下記に配列番号11として示される) 。 該プローブの3'のヌクレオチド71-90は、Capture/Amp-プローブ-1(MAV)によっ て認識される特定の配列に隣接しているM. アビウムに特異的な16S rRNAの領域に 相補的な特定のヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド1-70は、上記と同じ汎用 的配列を含む。 2つのプローブの端と端をつないで結合すると、次の配列を有するM. アビウム の検出用146ヌクレオチド長連結増幅配列(MAV)が得られる(下記に配列番号12と して示される)。 C．M. イントラセルレアの特定の検出用の一組のプローブは次の通りである。 第1プローブは、次の配列を有する3'ビオチン化Capture/Amp-プローブ-1(MIN) 、長さが56ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドである(下記に配列番号13として 示される)。 5'端のヌクレオチド1-20は、M. イントラセルレアに特異的な16S rRNAの部分に 相補的である。ヌクレオチド21-56は、上記と同じ汎用的配列を含む。 第2プローブは、次の配列を有するAmp-プローブ-2(MIN)、90ヌクレオチドのオ リゴデオキシリボヌクレオチドである(下記に配列番号14として示される)。 該プローブの3'端のヌクレオチド71-90は、Capture/Amp-プローブ-1(MIN)によ って認識された特定の配列に隣接しているM. イントラセルレア16S rRNAの領域に 相補的な特定のヌクレオチド配列を含む。 ２つのプローブの端と端をつないで結合すると、次の配列を有するM. イントラ セルレア の検出用の146ヌクレオチド長連結増幅配列(MIN)が得られる(下記に配 列番号15として示される)。 D．上記マイコバクテリア種の存在を検出するために、患者の血液試料をペディ アトリックアイソレーターチューブ(Wampole Laboratories、ニュージャージー 州)で採取する。アイソレーターの溶解遠心分離法は、血液成分の分離に続いて 白血球を溶解して細胞内微生物の回収を改善することを可能にする(Shansonら， J．Clin．Pathol．41:687，1988)。溶解後、約120μlの潰縮した物質を同量の実 施例1の5M GnSCN緩衝液に溶解する。混合液を、マイコバクテリア細胞壁の性 質のためにマイコバクテリア種の溶解に必要とされる30分間煮沸する。続いての 操作(即ち、捕捉、連結、PCR及ひ検出)は実施例1と同じである。 PCR増幅前に、磁気ビーズに捕捉した³²P-5'-AMP-プローブ-2を示す放射能を測 定することにより直接の検出を行う。結合されない放射能標識Amp-プローブ-2を 広範囲の洗浄によって除去した後、10⁶/反応を超える濃度で存在する標的16S rR NA分子が検出可能である。直接検出されない標的16S rRNAを実施例1のように連 結増幅配列のPCR増幅に供する。増幅に使用するためのプライマーは、実施例1と 同じ2つの汎用的プライマーである(配列番号5と6)。 実施例4 試料中のHCV RNAの検出 C型肝炎ウイルス(HCV)、RNAウイルスは輸血後肝炎の原因物質である。HCVは、 フラビウイルスとペストウイルスに少し関係があるのでそのゲノムが5'と3'非翻 訳領域(UTR)をもち単一の大きなオープンリーディングフレームをコードするこ とがわかった(Leeら，J．Clin．Microbiol．30:1602-1604，1992)。本方法は、 試料中のHCVの存在を検出するために有効である。 HCV RNAの5'UTRを標的にする各々Capture/Amp-プローブ-1(HCV)とAmp-プロー ブ−2(HCV)と称する一組のオリゴデオキシヌクレオチドプローブを実施例１のよ うに調製する。 3'端でビオチン化されるCapture/Amp-プローブ-1(HCV)は、次のヌクレオチド 配列を有する55ヌクレオチド長オリゴデオキシリボヌクレオチドである(下記に 配列番号16として示される)。 Capture/Amp-プローブ-1(HCV)の5'端のヌクレオチド1-19は、HCVゲノムの5'UT Rの部分に相補的な特定の配列を含む。該プローブの3'端のヌクレオチド20-55は 、実施例1のCapture/Amp-プローブ-1(HIV)と同じ36ヌクレオチド汎用的配列を含 む。 Amp-プローブ−2(HCV)は、次のヌクレオチド配列を有する90ヌクレオチド長オ リゴデオキシリボヌクレオチドである(下記に配列番号17として示される)。 ヌクレオチド71-90は、Capture/Amp-プローブ-2(HCV)のヌクレオチド1-19にハ イブリッド形成可能なHCVゲノム部分にすぐ隣接しているHCV5’UTRの部分に相補 的でハイブリッド形成可能なプローブの特定の3'部分を含む。ヌクレオチド1-70 は、実施例1のAmp-プローブ−2(HIV)と同じ汎用的配列を含む。 実施例1のように２つのプローブの端と端をつないで結合すると、次の配列を 有する試料中のHCV検出用の145ヌクレオチド長連結増幅配列(HCV)が得られる（ 下記に配列番号18として示される）。 連結増幅配列(HCV)を実施例1のように二温度PCR反応を用いて増幅する。増幅 に用いられるPCRプライマーは実施例1と同じ２つの汎用的プライマーである(配 列番号5と6)。 実施例5 試料中のHCV RNAを検出する多重捕捉増幅プローブの使用 一組の増幅プローブと２つの捕捉/増幅プローブを用いて試料中のHCV RNAを分 析及び検出し、よって分析の捕捉効率が高められた。 配列番号22を有する捕捉/増幅プローブCapture/Amp-プローブ−1(HCV A)(本 実施例に記載されるオリゴマーは全て“（HCV A”）と称し実施例４のプローブ “（HCV）”から区別する）と配列番号23を有するCapture/Amp-プローブ−1A(HC V A)を設計及び合成する。5'末端がビオチン化されかつプローブの3'領域がHCV RNAの5'UTRの配列と相補的でハイブリッド形成可能な配列を含む(図4)。標的核 酸配列に対してハイブリッド形成可能でないプローブの5'領域の汎用的ヌクレオ チド配列を設計及び合成する。ランダム配列がありGC含量が少なくとも60%であ りかつ最小二次構造、例えば、ヘアピン又は折り返し構造を示す。 5'末端でビオチン化されるCapture/Amp-プローブ-1(HCV A)は45ヌクレオチドD NAオリゴマーであり、3'領域のヌクレオチド5〜45が標的HCV RNAの5'UTRの配列 に相補的でハイブリッド形成可能でありかつオリゴマーが次のヌクレオチド配列 を有する(下記に配列番号22として示される)。 5'末端でビオチン化されるCaptuve/Amp-プローブ-1A(HCV A)は45ヌクレオチド DNAオリゴマーであり、Capture/Amp-プローブ-1(HCV A)とハイブリッド形成可能 なHCVRNAの5'UTRの領域にすぐ隣接しているHCV RNAの5'UTRの配列と相補的でハ イブリッド形成可能でありかつオリゴマーが次のヌクレオチド配列を有する(下 記に配列番号23として示される)。 2つの増幅プローブAmp-プローブ-2(HCV A)とAmp-プローブ-2A(HCV A)は各々HC V RNAの保存5'UTRと相補的でハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列を含む。 Amp-プローブ-2(HCV A)は51ヌクレオチドオリゴマーであり、5'領域のヌクレ オチド1〜30がHCVRNAの5'UTRの配列と相補的でハイブリッド形成可能でありかつ オリゴマーが次のヌクレオチド配列を有する(下記に配列番号24として示される) 。 Amp-プローブ-2A(HCV A)は69ヌクレオチドオリコマーであり、3'領域のヌクレ オチド40〜69がAmp-プローブ-2(HCV A)のヌクレオチド1-30に対してハイブリッ ド形成可能なHCV RNAゲノム部分にすぐ隣接しているHCV RNAゲノムの5'UTRの配 列と相補的でハイブリッド形成可能でありかつ5'末端のヌクレオチド1〜18がPCR プライマー-4に結合及びハイブリッド形成しかつ5'末端のヌクレオチド19〜36が PCRプライマー-5に結合及びハイブリッド形成しかつオリゴマーが次のヌクレオ チド配列を有する(下記に配列番号25として示される)。 2つのプローブの端と端をつないで結合すると、120ヌクレオチド連結産物、HC Vの検出可能な配列及び増幅反応の鋳型として働く連結-増幅配列(HCV A)が得ら れ，次の配列を有する(下記に配列番号26として示される)。 連結増幅配列、配列番号26(HCV A)の最初の一連のPCR増幅に用いられ長さが18 ヌクレオチドであるプライマー-3は、Amp-プローブ-2(HCV A)の3'末端にヌクレ オチド34〜51を含む配列に相補的であり、連結増幅配列、配列番号26(HCV A)の ヌクレオチド103〜120を含む配列にも相補的であり、次の配列を有する(下記に 配列番号27として示される)。 連結増幅配列(HCV A)、配列番号26の最初の一連のPCR増幅に用いられ長さが18 ヌクレオチドであるプライマー-4は、Amp-プローブ-2A(HCV A)の5'末端にヌクレ オチド1-18を含む配列に相補的であり、連結増幅配列、配列番号26(HCV A)のヌ クレオチド1〜18を含む配列にも相補的であり、次の配列を有する(下記に配列番 号28として示される)。 プライマー-5、18ヌクレオチドのDNAオリゴマーを連結増幅配列(HCV A)、配列 番号26の第2の一連のPCR増幅に用い、該プライマーはAmp-プローブ-2A(HCV A)のヌクレオチド19-36を含む配列に相補的であり、連結増幅配列、配列番号26 （HCV A）のヌクレオチド19-36を含む配列にハイブリッド形成可能であり、次の 配列を有する(下記に配列番号29として示される)。 上記プローブとプライマーを用いる分析を用いて使用するまで-70℃で保存し た24個のヒト血清試料中のHCV RNAを検出した。分析用に180μl血清試料を濃縮 溶解緩衝液(5M GnSCN、0.5％ウシ血清アルブミン、80mM EDTA、400mMトリス-HCl (pH7.5)及び0.5%ノニデットP-40を含む250μlの溶解液を濃縮することにより調 製され、血清と溶解緩衝液の混合液の最終濃度が5M GnSCNである)に加え、よく 混合し、37℃で1時間インキュベートしてHCV粒子から標的RNAを遊離した。次に 、80μlの溶解混合液を120μlのハイブリッド形成緩衝液[0.5%ウシ血消アルブミ ン、80mM EDTA、400mMトリス-HCl(pH7.5)、0.5%ノニデット-P40]に各々10¹⁰分子 の増幅プローブ、Amp-プローブ-2(HCV A)とAmp-プローブ-2A(HCV A)オリゴマー 及び各々10¹¹分子の捕捉/増幅プローブ、Capture/Amp-プローブ-1(HCV A)とCapt ure/Amp-プローブ-1A(HCV A)と共に移した。ハイブリッド形成緩衝液を加えてグ アニジウムイソチオシアネート(GnSCN)の濃度を5Mから2Mに下げてハイブリッド 形成を起こした。混合液を37℃で１時問インキュベートして種々のプローブを標 的RNAとハイブリッド形成させ、そのハイブリッド形成混合液に30μlのストレプ トアビジン被覆常磁性ビーズ(Promega)を加えた後に37℃で20分間インキュベー トしてリガンド結合を可能にした。次に、そのビーズを150μlの2M GnSCNと洗浄 して遊離したプローブ、タンパク質、無関係の核酸と潜在的PCR阻害剤をハイブ リッド形成混合液から除去した。これに続いて150μlリガーゼ緩衝液[66mMトリ ス-HCl(pH7.5)、1mM DTT、1mM ATP、0.5%ノニデットP-40及ひ1mM MnCl₂]で2回洗 浄することによりGnSCNを除去した。各洗浄工程で、結合した複合体の上清から の磁気分離を実施例1に記載された磁場法で行った。 次に、標的RNAに結合した増幅プローブ、Amp-プローブ-2(HCV A)とAmp-プロー ブ-2A(HCV A)を共有結合してPCR増幅の鋳型として用いられる連結増幅配列(HCV A)を作成した。ハイブリッド複合体を5単位のT₄DNAリガーゼ(Boehvinge r)を含む20μlリガーゼ緩衝液に懸濁し、連結反応のために37℃で1時間インキュ ベートした。以後“第IPCR反応”と呼ばれる後続のPCR反応用に、該ビーズを含 む10μlの連結混合液を20μlのPCR混合液[各0.06μMのプライマー-3とプライマ ー-4、1.5単位Taq DNAポリメラーゼ、各0.2mMのdATP、dCTP、dGTPとdTTP、1.5mM MgCl₂、10mMトリス-HCl(pH8.3)、50mM KCl]に加え、その混合液を95℃で30秒、 55℃で30秒、72℃で１分間35サイクルにわたってインキュベートした。第IPCR反 応後、5μlの産物を第1PCR反応と同じ条件下で行われる“第2PCR反応”(分析の 感受性を高める半繰り込みPCR法)用の第2PCR混合液[プライマー-4をプライマー- 5で置き換える以外は第1PCR混合液と同じ成分]に移した。10μ1の第2反応の産物 を6%ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動にかけ、臭化エチジウムで染色し、 紫外線で可視化した。 本方法の感受性と特異性を確かめるために、HCV陰性血清中合成HCV RNAの10倍 連続希釈液を上記プロトコールに従って分析し、HCV RNAの濃度は10〜10⁷分子/ 反応の範囲であった。連結及び増幅した後、PCR産物をポリアクリルアミドゲル 電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色し、超紫外線下で可視化した。図8に 示される結果から、本方法の特異性が示されることは明らかである。HCV RNAが 存在しないときはシグナルがなく、PCR産物を生成するためにプローブが標的RNA を捕捉するにちがいないことが示される。100分子程度のHCV RNA/試料が半繰り 込みPCR法で検出可能であり(図8)、本方法の感受性が少なくとも従来のRT-PCR(C lementiら，1993，PCR 2:191-196)と匹敵することが示された。 更に、図８で可視化されたバンドの強度によって示されるPCR産物の相対量は 、標的RNA(HCV RNA転写物)の量に比例した。従って、分析は少なくとも10²〜10⁵ 標的分子の範囲にわたって定量的である。 2つの捕捉プローブによって与えられる高捕捉効率を求めるために、³²P標識HC V RNAについてCapture/Amp-プローブ-1(HCV A)又はCapture/Amp-プローブ-1A(HC V A)又はその双方を用いて常磁性ビーズ上の捕捉と保持を分析した。2M-GnSCN緩 衝液とリガーゼ緩衝液で広範囲に洗浄した後に常磁性ビーズ上に保持された放射 能量によって捕捉を測った。結果からCapture/Amp-プローブ-1(HCV A)単独で捕 捉された場合に25.7%の標識HCV RNAが保持され、Capture/Amp-プローブ-1 A(HCV A)単独においては35.8%が保持され、双方の捕捉プローブを用いる場合に は41.5%の標的RNAが保持されることがわかった。従って、二重捕捉法は、単一捕 捉プローブの使用より効率がよかった。 実施例6 試料中のHIV-1 RNAを検出する多重捕捉増幅プローブの使用 実施例1に示したものの別法は、HIV-1 RNAの存在を検出するために捕捉/増幅 プローブと一組の増幅プローブを用いるものである。Capture/Amp-プローブ-1（ HIV）、配列番号１と一組の増幅プローブAmp-プローブ-2(HIV A)(本実施例に記 載されるオリゴマーは全て“(HIV A)”と称し実施例1のプローブ“(HIV)”から 区別する)(配列番号19)とAmp-プローブ-2A(HIV A)(配列番号20)を用いてAmp-プ ローブ-2(HIV A)のヌクレオチド1-26由来のヌクレオチド1-26及びAmp-プローブ- 2A(HIV A)のヌクレオチド40-65由来のヌクレオチド86-112を含む連結増幅配列(H IV A)(配列番号21)の汎用的ヌクレオチド配列を設計及び合成する。ランダム配 列がありGC含量が少なくとも60%でりかつ最小二次構造、例えば、ヘアピン又は 折り返し構造を示す。 増幅プローブAmp-プローブ-2(HIV A)は47ヌクレオチドDNAオリゴマーであり、 3'領域のヌクレオチド27-47が標的HIV-1 RNAのgag領域の配列に相補的でハイブ リッド形成可能でありかつオリゴマーが次のヌクレオチド配列を有する(下記に 配列番号19として示される)。 増幅プローブAmp-プローブ-2A(HIV A)は65ヌクレオチドDNAオリゴマーであり 、5'領域のヌクレオチド1〜39がAmp-プローブ-2(HIV A)のヌクレオチド27-47に 対してハイブリッド形成可能なHIV-1 RNAゲノム部分にすぐ隣接している標的HIV -1 RNAのgag領域の配列と相補的でハイブリッド形成可能でありかつオリゴマー が次のヌクレオチド配列を有する(下記に配列番号20として示される)。 2つの増幅プローブを端と端をつないで結合すると配列がHIV-1 RNAの検出可 能な配列及び増幅配列の鋳型として働く112ヌクレオチド連結増幅配列(HIV A)が 得られ、次の配列を有する(配列番号21として知られる)。 更に、HIV RNAを分析するために捕捉、検出及び場合によっては捕捉した連結 産物の増幅が実施例5に記載されるように行われる。増幅に用いられるPCRプライ マーは実施例5と同じプライマー-3、4及び5(配列番号27、28及び29)である。 実施例7 試料中のHCV RNAを検出する 別個の捕捉/増幅プローブと連結非依存性単一増幅プローブの使用 本分析は、試料中のHCV RNAを検出するために連結非依存性単一増幅プローブ と2つの捕捉/増幅プローブを用いるものである。 本方法に用いられる捕捉/増幅プローブCapture/Amp-プローブ-1(HCV A)とCapt ure/Amp-プローブ-1A(HCV A)は実施例５と同じものである。 増幅プローブ、Amp-プローブ-2(HCV B)(本実施例に記載されるオリゴマーは全 て“(HCV B)”と称し実施例４のプローブ“(HCV)”から区別する)、配列番号30 は100ヌクレオチドDNA分子であり、オリゴマーの中央領域のヌクレオチド39〜79 によって示される配列がHCV RNAの5'UTRの領域に相補的でハイブリッド形成可能 でありかつ5'末端のヌクレオチド1-38と3'末端のヌクレオチド80-100にわたる配 列を設計及び合成する。ランダム配列がありGC含量が少なくとも60%であり、最 小二次構造、例えば、ヘアピン又は折り返し構造を示す。増幅配列と呼ばれるAm p-プローブ-2(HCV B)は次の配列を有する(下記に配列番号30として示される)。 プライマー-3とプライマー-4のみを単一PCR増幅工程で用い、第2PCR工程を省 略し、連結工程を省略する以外は捕捉、検出及び場合によってはプローブ配列の 増幅を実施例5に記載されるように行った。実施例8 試料中のHCV RNAを検出する 別個の捕捉/増幅プローブと連結依存性単一増幅プローブの使用 本実施例の方法は、実施例5に記載した2つの捕捉/増幅プローブCapture/Amp- プローブ-1(HCV A)とCapture/Amp-プローブ-1(HCV A)及び標的核酸に対してハイ ブリッド形成しかつ図7に示される遊離末端の連結時に環化する単一増幅プロー ブ、Amp-プローブ-2(HCV C)(本実施例に記載されるオリゴマーは全て“(HCVC)” と称し実施例4のプローブ“(HCV)”から区別する)を用いるものである。 Amp-プローブ−2(HCV C)は増幅配列と呼ばれる108ヌクレオチド増幅プローブ であり、オリゴマーの5'末端のヌクレオチド1-26が標的HCVRNAの5'UTRの配列（ 図7の(a)で示される）に相補的でハイブリッド形成可能でありかつ標的HCV RNA の5'UTRの配列(図7の(b)に示される)に相補的でハイブリッド形成可能である。 更に、プローブが標的HCV RNAとハイブリッド形成する場合、プローブの3'末端 と5'末端が相互にすぐ隣接して配置され、DNAリガーゼのような結合剤による連 結時に閉環分子の形成がもたらされる。Amp-プローブ-2(HCV C)の配列は次のよ うに示される(配列番号31として示される)。 連結及び環化Amp-プローブ-2(HCV C)の最初の一連のPCR増幅に用いられるプラ イマー-3(配列番号27)は、Amp-プローブ-2(HCV C)のヌクレオチド27〜45を含む 配列に相補的である18ヌクレオチド長オリゴマーである。 連結及び環化Amp-プローブ-2の最初の一連のPCR増幅に用いられるプライマー- 4(配列番号28)は、Amp-プローブ-2(HCV C)のヌクレオチド46〜63を含む配列に相 補的である18ヌクレオチド長オリゴマーである。 標的HCV RNAに対する2つの捕捉/増幅プローブと増幅プローブのハイブリッド 形成、末端連結時の増幅プローブの環化及びプローブ配列の増幅を、プライマー -3とプライマー-4のみを単一PCR増幅工程に用い、第2PCR工程を省略し、実施例5 に用いられる一組の増幅プローブ、Amp-プローブ-2(HCV A)(配列番号24)と Amp-プローブ-2A(HCV A)(配列番号25)をAmp-プローブ-2(HCV C)(配列番号31)に 置き換える以外は実施例5に記載されるように行った。 本方法の感受性と特異性を確かめるために、HCV陰性血清中合成HCV RNAの10倍 連続希釈液を上記プロトコールに従って分析し、10³〜10⁷分子/試料の範囲のHCV RNAの標準濃度を得た。連結及び増幅した後、PCR産物をポリアクリルアミドゲ ル電気泳動で分離し、臭化エチジウムで染色し、超紫外線によって可視化した。 結果(図9、(-):対照、試料なし)から本方法の特異性が示される。本分析は高 度に特異的であり、標的HCV RNAが存在しないときは目に見えるシグナルがなく 、PCR産物を生成するためにプローブが標的RNAを捕捉するにちがいないことが示 される。図9からわかるように、10⁴分子程度のHCV RNA/試料が検出可能であるこ とが明らかである。 更に、バンド(図9)の強度によって示されるPCR産物の相対量は、標的RNA(HCV RNA転写物)の量に比例した。従って、本分析は少なくとも10⁴〜10⁷標的分子の範 囲にわたってかなり定量的である。 実施例9 LD-PCR 分析を用いる組織試料中のHCV標的配列の検出 本実施例は、本発明の連結依存性PCR(LD-PCR)とホルマリン固定パラフィン包 埋(FFPE)肝試料中のHCV配列の検出用の逆転写酵素PCR(RT-PCR)との比較を示すも のである。本実験用にマウントシナイメディカルセンター、ニューヨーク州ニュ ーヨークで1992年1月〜1995年3月に肝切除又は同所性肝移植を受けた患者からの 肝細胞がんの記録保管所の21人の肝試料を選定した。これらの患者のうち13人は 2世代酵素結合イムノアッセイ(EIA II)(Abbott Diagnostic、イリノイ州シカゴ) で求めた抗HCVが陽性であり、8人は陰性であった。胆道閉鎖症に続発する肝硬変 に罹った抗HCV陰性患者からの体外移植肝組織を対照として用いた。手術後、肝 試料を4℃で貯蔵し、12時間以内に切片した。試料を10%緩衝ホルマリンで8〜12 時間固定し、通常はパラフィンに包埋した。FFPE試料を室温で3ヶ月から3年まで の期間保存した。更に、-70℃で保存した22人のうち13人からの急冷凍肝組織を 用いてLD-PCRとRT-PCRの結果間の不一致を分けた。 FFPE試料(約2〜4cm²)を使い捨て刃でミクロトームにより10μmの厚さまで切片 にし、各切片を1.5mlのミクロ遠心管に入れた。交差混入を避けるために、刃を 替え、ホルダーを各試料の間に10%クロロックス液で洗浄した。切片を1mlのキシ レン(Sigma)の存在下に60℃で10分間インキュベートすることにより脱パラフィ ン化した。無水エタノールで2回洗浄してキシレンを除去した。次に、試料を真 空遠心分離により又はホットブロック上に65℃で30分間置くことにより乾燥した 。 LD-PCR用に、5Mチオシアン酸グアニジニウム(GnSCN)(Fluka)、0.5%ウシ血清ア ルブミン(Sigma)、80mM EDTA、400mMトリス-HCl(pH7.5)及び0.5%ナトリウム-N- ラウロイルサルコシン(Sigma)を含む250μlの溶解緩衝液中100℃で30分間インキ ュベートし、続いて65℃で30分間インキュベートすることにより、脱パラフィン 化組織を溶解した。溶解した試料を使用まで-20℃で貯蔵した。偏りを避けるた めに全試料のHCV血清学的状態を研究所の職損に分からなくした。 RT-PCR用に、10mMトリス-HCl(pH8.0)、0.1mM EDTA(pH8.0)、2%ドデシル硫酸ナ トリウム及び500μg/mlプロテイナーゼKを含む200μlの溶解緩衝液に60℃で5時 間インキュベートすることにより脱パラフィン化組織を溶解した。フェノールと クロロホルムの抽出に続いて0.1容量の3M酢酸ナトリウムの存在下に同量のイソ プロパノールで沈殿することによりRNAを精製した。RNA沈降物を70%エタノール で1回洗浄し、乾燥し、30μlのジエチルピロカーボネート処理滅菌水に懸濁した 。Chomczynskiら(1987)Anal ．Biochem．162:156に記載された一段RNA抽出法を用 いて対応する患者から得られた凍結肝組織の切片(厚さ10nm)からRNAを抽出した 。 LD-PCRを次のように行った。概要としては、10¹⁰分子のホスホリル化Amp-プロ ーブ-2、10¹⁰分子のAmp-プローブ2A及び10¹¹分子の捕捉Amp-プローブ1と捕捉Amp -プローブ1Aを含む120μlのハイブリッド形成緩衝液[0.5%ウシ血清アルブミン、 80mM EDTA、400mMトリス-HCl(pH7.5)及び0.5%ナトリウム-N-ラウロイルサルコシ ン]に80μlの溶解混合液を加えた。(プローブは実施例5に記載される通りである 。)GnSCN濃度を5Mから2Mに下げたハイブリッド形成緩衝液を加えるとハイブリッ ド形成を生じた。この混合液を1時間インキュベートして２つの DNA捕捉プローブ及びHCV RNA標的に結合した２つのDNAヘミプローブからなるハ イブリッドの生成を可能にした。混合液に30μlのストレプトアビジン被覆常磁 性ビーズ(Promega)を加え、37℃で20分間インキュベートしてハイブリッドをビ ーズ表面に結合した。次に、そのビーズを150μlの洗浄緩衝液[10mMトリス-HCl( pH7.5)、0.5%ノニデットP-40、1.5mM MgCl₂及び50mM KCl]で2回洗浄してハイブ リッド形成されないプローブ並びにGnSCN、タンパク質、核酸及び潜在的PCR阻害 剤を除去した。各洗浄中、分析管をマグネチックセパレーションスタンド(Prome ga)上に置くことによりビーズを分析管壁に引きつけ、上清を吸引により除去す ることを可能にした。次に、ハイブリッドを20μlリガーゼ液[66mMトリスHCl(pH 7.5)、1mMジチオトレイトール、1mM ATP、1mM MnCl₂、5mM MgCl₂及び5単位のT4 DNAリガーゼ(Boehringer Mannheim)]に懸濁し、37℃で1時間インキュベートして ハイブリッド形成されるプローブをRNA標的上の隣接位置に共有結合し、実施例5 に記載される連結増幅プローブを生成した。次に、10μlの連結反応混合液(ビー ズを含む)を実施例5に記載される0.66μMのPCRプライマー3と0.66μMのPCRプラ イマー4、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、0.2mM dATP、0.2mM dCTP、0.2mM dGT P、0.2mM dTTP、1.5mM MgCl₂、10mMトリス-HCl(pH8.3)及び50mM KClを含む20μl のPCR混合液に移した。第1PCR反応液を90℃で30秒、55℃で30秒及び72℃で1分間 GeneAmp PCRシステム9600サーモサイクラー(Perkin-Elmer、コネチカット州ノー スウォーク)中35サイクルにわたってインキュベートした。第1PCR後、5μlの各 反応混合液を0.66μMのPCRプライマー3と0.66μMのPCRプライマー5が半繰り込み PCRに用いられる以外は同じ成分を含む30μlの第2PCR混合液に移した。第2PCR反 応を第1PCR反応と同じプロトコールによって行った。10μlの第2PCR反応液を6% ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動で分析し、臭化エチジウムで染色した後 に紫外蛍光によって可視化した。第2PCR産物の102塩基対バンドの存在を正の結 果とみなした。全試験を2回実験し、試料の血清学的状態(正又は負の抗HCV)に対 して分からないように行った。 Abeら(1994)Intermational Hepatology Communication 2:352の方法に従ってR T-PCRを行った。概要としては、各試料の15μlのRNA懸濁液を鋳型として用い てHCV RNAとβアクチンRNAを検出じた。βアクチンRNAを細胞RNAの正の内部対照 に用いた。RT-PCRに用いられる外部プライマーの配列は、HCV RNAについては5'- GCGACACTCCACCATAGAT-3'(センス)(配列番号32)と5'-GCTCATGGTGCACGGTCTA-3'(ア ンチセンス)(配列番号33)であり、βアクチンRNAについては5'-CTTCTACAATGAGCT GCGTGTGGCT-3'(センス)(配列番号34)と5'-CGCTCATTGCCAATGGTGATGACCT-3'(アン チセンス)(配列番号35)である。内部プライマーの配列は、HCV RNAについてはCT GTGAGGAACTACTGTCT-3'(センス)(配列番号36)と5'-ACTCGCAAGCACCCTATCA-3'(アン チセンス)(配列番号37)及びβアクチンRNAについては5'-AAGGCCAACCGCGAGAAGAT- 3'(センス)(配列番号38)と5'-TCACGCACGATTTCCCGC-3'(アンチセンス)(配列番号3 9)である。次のように調製した50μlの反応緩衝液:20単位のRNase阻害剤(Promeg a)、100単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Gibco BRL)、100ngの 各外部プライマー、各200μMの4デオキシヌクレオチド、１単位のTaq DNAポリメ ラーゼ(Boehringer Mnnheim)及び1.5mM MgCl₂を含む1×Taq緩衝液を含む同じ管 で第1PCR反応と逆転写工程とを組合わせた。最初の逆転写酵素工程のために37℃ で50分間試料をまずインキュベートし、次に94℃1分間、55℃1分間及び72℃2分 間からなる35サイクルを行うようにサーモサイクラーをプログラムした。第2PCR については、5μlの第IPCR産物を第２セットの各内部プライマー、デオキシヌク レオチド、Taq DNAポリメラーゼ及び第1PCR反応のようなTaq緩衝液を含むが逆転 写酵素とRnase阻害剤を含まない管に加えた。37℃での最初の50分インキユベー ション以外は第1PCR反応と同じプロトコールで第2PCR反応を行った。20μlのPCR 産物を2%アガロースゲルによる電気泳動で調べた。HCV RNAとβアクチンRNAの正 の結果を第2PCR産物の各々268塩基対と307塩基対バンドとしての存在で示した。 LD-PCRとRT-PCRの結果を下記表２に示す。ａ FFPE--ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織 ｂ 末固定--FFPE試料に対応する急速冷凍肝臓組織 ｃ 連結反応依存PCRによって陽性（＋）または陰性（−）と評価されたFFPE試 料の数 ｄ 逆転写PCRによって陽性（＋）または陰性（−）と評価されたFFPE試料の数 ｅ 未固定凍結組織を用いてRT-PCRによって確認した試料の数 ｆ 確認用のRT-PCRテストのために７つの末固定試料しか手に入らなかった ｇ 確認用のRT-PCRテストのために7つの未固定試料しか手に入らなかった 22のFFPE試料のうち、13はEIAアッセイでHCV陽性であった患者から得られたも のであり９つはHCV陰性であった患者からのものである（表２）。HCV RNAはセロ ポジティブ(seropositive)な13のFFPE試料すべてでLD-PCRによって検出され、一 方RT-PCRによっては５つしか陽性でなかった。確認のため、７つのケースから得 られた未固定の凍結肝臓試料をRT-PCRでテストした。これらの７つのケースのう ち、HCV-RNAは同じ試料のFFPE組織を用いた場合はLD-PCRにより７つ全てにおい て検出可能であったが、RT-PCRによれば１つでしか検出できなかった。しかしな がら、凍結組織についてのRT-PCRではすべてのケースにおいてHCV-RNAの存在が 確認された。ベータアクチンmRNAは対応する全ての試料において検出され、こ のことは最小限のRNA分解を示すものである。これらの結果はホルマリン固定、 加熱パラフィン包埋処理および３年までの保存期間の間、HCV RNAが保存されて いることを確認するものである。FFPE試料についてのRT-PCRの全体的な感度は本 研究においては23.8％（5/21）であったが、El-Batononyら(1994)J.Med.Virol．43 :380およびAbeらの先行する研究においては58.6％および84％であった。これ らの値における大きな相違は、これらの研究における試料の選び方の違いによる ものである（この研究にはFFPE組織について８つのRT-PCR陰性および５つの陽性 のものが選ばれている）。８つのHCVセロネガティブ(seronegative)肝臓試料の なかで、HCCを伴う７つは２人の原発胆汁性肝硬変(PBC)の患者、２人のアルコー ル性肝硬変の、２人のＢ型肝炎ウイルス(HBV)肝硬変、１人の原因不明の肝硬変 の患者から取り出されたものであり、HCCを伴わないひとつは朋道閉塞の子供か ら取り出されたものである（表３）。７つのHCC肝臓試料のうち５つがLD-PCRに よりHCVについて陽性と評価されたが、RT-PCRではひとつもなかった。胆道閉塞 の試料は両方のPCRテストで陰性のままであった。この食い違いを解くために、 ７つの未固定凍結組織試料でRT-PCRを行った。結果を以下の表３に記載する。 ａ 種々の臨床的診断の患者からの肝臓試料：PBC--原発胆汁性肝硬変、アルコ ール性--アルコール性肝硬変、HBV--HBsAgに対して陽性、原因不明--原因不明の 肝硬変 ｂ FFPE--ホルマリン固定パラフィン包埋肝臓組織 ｃ 未固定--FFPE試料に対応する急速凍結未固定肝臓組織 ｄ LD-PCRまたはRT-PCRによりHCV RNAに対して陽性と評価されたFFPE試料の 数 ｅ 未固定凍結組織を用いてRT-PCRによって確認された試料の数 ｇ 確認的RT-PCRテストのために２つの未固定試料しか手に入らなかった N/D：未実施--生の凍結試料が手に入らなかった 未固定組織に対するRT-PCRの結果はLD-PCRの結果を確認するものであり、血清 学的テストによる偽陰性結果を示すものである。さらに、FFPE試料についてのLD -PCRおよびRT-PCRの両方により陰性と評価されたPBC試料の一つは未固定凍結試 料についてのRT-PCRにより陽性であったが、これはFFPE試料についての双方のPC Rによる偽陰性結果を示すものである。これらの結果はHCVセロネガティブHCCに おいてHCV RNAが高い率で検出され（6/8、75％）（表３）、HCVセロポジティブ およびセロネガティブ双方のHCC試料において全体的な陽性率が86％である（18/ 21）（表２）ことを示す。FFPEおよび未固定試料のカッティングおよびPCRアッ セイは２つの別々の実験室で行ったのでコンタミネーション(contamination)は ありそうもない。さらに、試料調製には非常な注意を払い、PCRテストは適切な 負対照と共に行った。FEPP試料のLD-PCRと生の凍結試料上のRT-PCRとの間の全体 的な一致は非常に大きく、LD-PCRの感度は95％（18/19）である。 前述の結果はホルマリン固定によって起こる架橋は逆転写酵素による新生DNA の鎖伸長を中断し、その結果FFPE組織におけるRT-PCRの感度が低くなることを示 唆するものである。これに対して、LC-PCRは、架橋された鋳型に沿ったプライマ ー伸長ステップをバイパスしてプローブ配列を増幅する。さらに、増幅プローブ は30ヌクレオチド長の相補領域しか有さないことがあり、従って、非架橋領域に より近づきやすくなる。LD-PCRはこのようにしてFFPE試料中のHCV RNAの検出に おける高感度を達成することができる。この鋭敏なアッセイの価値は、セロネガ ティブ試料においてさえもHCV RNAの高い検出率を明らかにする前述の結果によ り確かめられる。実施例10 環状増幅配列(circular amplification sequence)におけるプライマー伸長-置換 本実施例はDNAポリメラーゼのクレノウ断片（Klenow fragment）が下流の鎖を 置換してポリマーを生成することができることを示すものである。 10¹²分子の配列番号31を有するリン酸化した環状化可能なプローブを10μlの １ｘ連結反応バッファー中の10¹³分子の合成HCV DNA標的と混合し、65℃にて２ 分間加熱し、10分間室温まで冷却することによって合成DNA標的を検出した。こ の混合物に１μlのリガーゼを加え37℃にて1時間インキュベーションし、続いて 配列番号27を有する10¹³分子の³²Ｐ-ラベルの伸長プライマーを加えた。この混 合物を5分間100℃に加熱し、20分間室温まで冷却した。40μlのクレノウミック スとdNTPを反応液に加え37℃でインキュベーションした。10μlずつを０、１、 ２および３時間後に取り出し８％ポリアクリルアミドゲルで解析した。その結果 を図１８に示してある。左のレーンはリガーゼが存在しないときの結果を示して いる。右のレーンは連結反応後の伸長を示している。105から600塩基にわたるバ ンドを右のレーンで見ることができる。この結果はクレノウが伸長プライマーか ら伸長させることができ、下流の鎖を置換してポリマーを生成することができる ことを示すものである。 実施例１１ 耳下腺多型性腺種(parotid pleomorphic adenomas)における EBV 初期RNA(EBER-1)依存PCRによる検出 唾液腺良性混合腫瘍(salivary benign mixed tumors)(BMT)におけるエプスタ インバールウイルス初期RNA（EBER-1）を検出するために環状化可能プローブを 利用するLD-PCRを行なった。BMTの６つの試料および隣接する耳下腺組織、およ び３つの正常耳下腺組織（２つは包嚢(cysts)から取り、１つは過形成リンパ節 から取った）の試料を凍結組織試料用の包埋培地(OCT、Miles，Inc.，Elkhart， In.)と液体窒素中で急速冷凍し、-70℃に保存した。組織の対応するホル マリン固定パラフィン包埋（FFPE）ブロックを得、生の組織と並行して調べた。 全ての組織をミクロトームで切断し、その刃はクロスコンタミネーション(cross contamination)を避けるためケース間で10％クロロックス（Chlorox）で洗浄し た。各試料の２〜３切片を1.5ml微量遠心チューブに入れた。FFPE組織を60℃で1 0分間、1mlキシレン（Sigma）とインキユベーションして脱パラフィンし、続い て純粋エタノールで２回洗浄することによりパラフィンを取り除いた。これらの 試料を65℃、30分間熱ブロック上に置いて乾燥させた。脱パラフィン組織を100 ℃で30分間、続いて65℃で30分間、250μlの溶解バッファー（５Ｍグアニジウム チオシアネート(GTC)(Fluka)、0.5％ウシ血清アルブミン(Sigma)、80mM EDTA、4 00mM Tris HCl（ｐＨ7.5）、および0.5％N-ラウロイルサルコシンナトリウム(Si gma)）中でインキュベーションすることによって溶解した。生の凍結組織を同じ 溶解バッファー中で37℃で60分間インキュベーションすることにより溶解した。 溶解した試料は使用するまで-20℃で保存した。 EBER-1領域の外側を伸ばして設計した２つの捕獲／増幅プローブを標的RNAを 捕獲するために使用した。捕獲プローブ１（配列番号40）および捕獲/増幅プロ ーブ２（配列番号41）の配列を表４に示した。環状増幅プローブ（配列番号42） は選択した標的配列に相補的な３’および５’領域を有するように設計した（表 ４）。これらの２つの領域間には非相補的なリンカー配列を挿入した。この環状 増幅プローブは標的ハイブリダイゼーションに際して５’および３’末端が隣接 するような形で環状化する。半入れ子（seminested）PCRをこのリンカー配列に 対するプライマー対（これも表４に示した）を用いて行なった。（小文字--EBER-1に相補的、大文字--汎用的に設計） LD-PCRは以下のように行なった。簡単に言えば、80μlの溶解混合液を120μl のハイブリダイゼーションバッファー(10¹⁰分子のリン酸化標的プローブおよび1 0¹¹分子の捕獲プローブ１および捕獲プローブ２を含む、0.5％ウシ血清アルブミ ン、80mM EDTA、400mM Tris-HCl（ｐＨ7.5）、および0.5％N-ラウロイルサルコ シンナトリウム（Sigma）)に加えた。ハイブリダイゼーションバッファ ーの添加はGnSCN濃度を5Mから2Mに低下させハイブリダイゼーションが起こるよ うになる。この混合物を１時間インキュベーションし、標的RNAにハイブリダイ ズした２つのDNA捕獲/増幅プローブと１つのDNA環状増幅プローブからなるハイ ブリッドが形成されるようにした。30μlのストレプトアビジン-被覆常磁性ビー ズ（Promega）を混合物に加え37℃で20分間インキュベーションし、ハイブリッ ドがビーズ表面に結合できるようにした。このビーズを150μlの洗浄バッファー （10mM Tris-HCl(ｐＨ7.5)、0.5％ノニデットP-40、および1.5mM MgCl₂および50 mM KCl）で2回洗浄し、ハイブリダイズしなかったプローブおよび、存在し得るP CRの阻害物質（GTC、タンパク質）、および、非特異的PCR産物の源となるかもし れないもの（細胞の核酸）を除去した。各洗浄において、チューブを磁器分離ス タンド（Magnetic Separation Stand）(Promega)上に置くことによりアッセイチ ューブの管壁に引き寄せ、上清を吸引で取り除けるようにした。環状増幅プロー ブの３’および５’端は標的RNA上で互いに直接隣接するようにハイブリダイズ し、20μlのリガーゼ溶液（66mM Tris HCl（ｐＨ7.5）、1mMジチオスレイトール 、1mM ATP、1mM MnCl₂、および５ユニットのＴ４リガーゼ（Boehringer））で37 ℃にて1時間インキュベーションすることにより共有結合的に結合させ、これに より環化させた。常磁性ビーズを含んだ10μlの連結反応反応混合物を、0.66μM のPCRプライマー、0.5ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、0.2mM dATP、0.2mM dCT P、0.2mM dGTP、0.2mM dTTP、1.5mM Mg₂、および10mM Tris-HCl（ｐＨ8.3）およ び50mM KClを含む20μlのPCR混合液に移した。 第１段のPCR反応は、GeneAmp PCRシステム9600サーモサイクラー（Perkin Elm er,CT）で、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分インキュベーションを35サイク ル行った。第１段のPCRの後、各反応混合物の５μlを、0.66μMのPCRプライマー １除いて同じ組成の第2段PCR混合液25μlに移し、0.66μMのPCRプライマー３を 半入れ子PCRのために使用した。これは増幅特異性を損なわずに信号検出感度を 上げる。共有結合的に環化したプローブに沿ったPCRプライマーの伸長は大きな マルチ-ユニットポリマー（ローリングサークルポリメリゼーション）を生じさ せる。実際、モノマーユニットに消化しないとPCRポリマー産物は ポリアクリルアミドゲル中に泳動されない。第2段PCR反応の10μlを、50mM NaCl 、100mM Tris-HCl（ｐＨ7.5）、10mM MgCl₂、0.025％Triton X-100の存在下で制 限エンドヌクレアーゼEcoRIで消化し、６％ポリアクリルアミドゲルによるゲル 電気泳動で解析し、エチジウムブロミドで染色後に紫外蛍光により視覚化した。 90塩基対のバンド（第2段PCR産物）および108塩基対産物（第１段PCR）が存在す ることは陽性の結果として判断される。この結果を表５に要約した。 注−ケース１および２は多型性腺腫以外の理由で除去された耳下腺組織からのも のである。ケース３〜８は多型性腺腫を有していた。 FFPE--ホルマリン固定パラフィン包埋組織 凍結−液体窒素中で急速冷凍した組織 ＮＤ−組織が入手できなかったため行なわなかった 要するに、EBER-1配列は８つの耳下腺サンプルの６つにおいて検出された。調 べた６つの多型腺腫のうち４つはEBER-1について陽性であった。EBERが腫瘍中で 検出されなかった２つのケースについて、周辺の耳下腺組織に配列が存在してい た。対応するホルマリン固定パラフィン包埋組織中のEBER-1配列の検出はかなり 感度が劣った−８つの試料のうち２つだけが陽性であった。 要約すると、環状プローブを利用した連結反応依存PCRのこの結果は、調べた 大部分の多型性腺腫においてEBV-関連配列が存在することを示すものである。本 方法は、Tairaら(1992)J ．of Otorhinolaryngol Soc．Jap．95:860で行なわれた ようなEBV DNA検出のための標準的PCRに対して驚くほど上昇した検出効率を提示 するものである。本方法においては、環状化可能なプローブの３’および５’端 が標的配列にハイブリダイズし、隣接(juxtaposition)することになる。隣接し た配列を次に連結して標的配列上に固着した環化共有結合プローブを生じさせた 。これによりストリンジェントな洗浄に対して耐性となる。環状プローブについ てのPCRはローリングサークルポリマーを作り出す。これをモノマーユニットに 消化し、ゲル上で視覚化した。環状プローブによる連結反応依存PCRの使用、そ れに続くローリングサークルモデルによるプローブの増幅による検出は、生凍結 組織における標的検出を非常に高感度にする。 種々の文献を引用したが、その内容は完全に本明細書に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 シュイ テランス シー エイチ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク イースト セヴンティー ス ストリート 435 アパートメント 26ビー (72)発明者 ザン ディヴィド ワイ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11432 ジャマイカ ワンハンドレッドアンドシ ックスティフィフス ストリート 82―24 (72)発明者 ブランドワイン マーガレット アメリカ合衆国 ニューヨーク州 11432 ジャマイカ エステータス ホーヴェン デン ロード 182―20 (72)発明者 シュイ テランス シー エイチ アメリカ合衆国 ニューヨーク州 10021 ニューヨーク イースト セヴンティー ス ストリート 435 アパートメント 26ビー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中の標的核酸を検出するための方法において、 （ａ）核酸中の相補的配列間で核酸ハイブリダイゼーションが起こるような条件 下で、前記サンプル中の前記核酸を、リガンド結合部分で被覆された常磁性粒子 の存在下でオリゴヌクレオチドプローブに反応容器内で接触させるステップであ って、前記オリゴヌクレオチドプローブが１以上の捕獲／増幅プローブを含み、 各々は標的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でも ない３’ヌクレオチド配列と標的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でハイブリ ダイズ可能な５’ヌクレオチド配列とを有する、または、標的核酸中のヌクレオ チド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもない５’ヌクレオチド配列と 標的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でハイブリダイズ可能な３’ヌクレオチ ド配列とを有するものであり、各捕獲／増幅プローブは更にプローブの非-相補 的配列に結合したリガンドを有するものであって、前記リガンドは前記常磁性粒 子上に被覆された前記リガンド結合部分に結合してアフィニティー対を形成する ことができるものであり；前記オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸中で隣 接するが、連続していない配列に相補的な３’および５’領域を有する環状化可 能な増幅プローブを更に含み、前記３’および５’領域は標的核酸中のヌクレオ チド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもないリンカー領域で隔てられ ているものであり、前記接触の結果、標的核酸、環状化可能なプローブ、捕獲／ 増幅プローブおよび常磁性粒子を含む複合体であって、前記捕獲／増幅プローブ が標的核酸中の相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ、捕獲／増幅 プローブ上のリガンドが常磁性粒子上のリガンド結合部分へ結合することにより 前記捕獲／増幅プローブは常磁性粒子に結合しており、環状化可能なプローブが 標的核酸上の隣接するが、連続していない配列に３’および５’末端で結合して いる複合体が形成される、前記接触ステップ； （ｂ）前記複合体を未結合反応物から分離し、前記複合体を洗浄するステップ； （ｃ）前記環状化可能なプローブの３’および５’末端を、ヌクレオチド配列を 連結する連結反応試薬で連結して環状増幅プローブを形成させるステップ； （ｄ）前記複合体を、環状増幅プローブのリンカー領域の一部と相補的でこれに ハイブリダイズ可能な第１の伸長プライマーおよび、第１の伸長プローブが相補 的であるリンカー領域部分と重ならない、環状増幅プローブのリンカー領域の一 部と実質的に同一である第２の伸長プライマーと、dNTPおよび鎖置換活性を有す るDNAポリメラーゼとに接触させることによって前記環状増幅プローブを増幅す るステップであって、接触が、第１の伸長プライマーが環に沿って多回転して伸 長して環状プローブの配列に相補的な繰り返し単位である１本鎖DNAが形成され 、第２の伸長プライマーの多コピーが１本鎖DNAの相補的領域にハイブリダイズ してDNAポリメラーゼによって伸長され伸長産物が生成され、かつ、第２の伸長 プライマーの伸長産物が第２の伸長プライマーの下流コピーおよび対応する伸長 産物を置換し、置換された１本鎖が生成されて前記第１の伸長プライマーが結合 してDNAポリメラーゼによって伸長される条件下で行なわれる、前記増幅ステッ プ； （ｅ）種々の長さの、増幅された２本鎖DNAの多コピーが生成されるまで前記増 幅を進行させるステップ； （ｆ）検出が臨床サンプル中の標的核酸の存在を示すものである、前記増幅され たDNAを検出するステップ、 を含む、前記方法。 ２．サンプル中の標的核酸を検出する方法において、 （ａ）前記サンプル中の前記核酸を、核酸中の相補的配列間で核酸ハイブリダイ ゼーションが起こるような条件下で、リガンド結合部分で被覆された常磁性粒子 の存在下でオリゴヌクレオチドプローブと反応容器内で接触させるステップであ って、前記オリゴヌクレオチドプローブが１以上の捕獲増幅プローブを含み、各 々は標的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもな い３’ヌクレオチド配列と標的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でハイブリダ イズ可能な５’ヌクレオチド配列とを有する、または、標的核酸中のヌクレオチ ド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもない５’ヌクレオチド配列と標 的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でハイブリダイズ可能な３’ヌクレオチド 配列とを有するものであり、各捕獲／増幅プローブが更にプローブの非-相補的 配列に結合したリガンドを有するものであって、前記リガンドは前記常磁性粒子 上に被覆された前記リガンド結合部分に結合してアフィニティー対を形成するこ とができるものであり；前記オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸中で隣接 するが、連続していない配列に相補的な３’および５’領域を有する環状化可能 な増幅プローブを更に含み、前記３’および５’領域は標的核酸中のヌクレオチ ド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもないリンカー領域で隔てられて いるものであり、前記接触の結果、標的核酸、環状化可能なプローブ、捕獲／増 幅プローブおよび常磁性粒子を含む複合体であって、前記捕獲／増幅プローブが 、標的核酸中の相補的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ、捕獲／増幅 プローブ上のリガンドが常磁性粒子上のリガンド結合部分へ結合することにより 前記捕獲／増幅プローブが常磁性粒子に結合しており、環状化可能なプローブが その３’および５’端で、標的核酸上の隣接するが連続していない配列に結合し ている複合体が形成される、前記接触ステップ； （ｂ）前記複合体から未結合反応物を分離し、前記複合体を洗浄するステップ； （ｃ）前記環状化可能なプローブの３’および５’末端を、ヌクレオチド配列を 連結する連結反応試薬で連結して、環状増幅プローブを形成させるステップ； （ｄ）前記複合体を、環状増幅プローブのリンカー領域の一部に相補的でこれに ハイブリダイズ可能な伸長プライマー、dNTP、および鎖置換活性を有するDNAポ リメラーゼに、前記伸長プライマーが環に沿って多回転して伸長して環状プロー ブの配列に相補的な繰り返し単位である１本鎖DNAが形成される条件で接触させ ることによって、前記環状増幅プローブを増幅するステップ；および、 （ｅ）検出が臨床サンプル中の標的核酸の存在を示すものである、前記増幅され たDNAを検出するステップ、 を含む、前記方法。 ３．サンプル中の標的核酸のin situ検出のための方法において、 （ａ）標的核酸の存在に関して解析すべき組織学的試料から組織サンプルを調製 するステップ； （ｂ）前記組織サンプルを洗浄するステップ； （ｃ）標的核酸中の隣接するが、連続していない配列に相補的な３’および５’ 領域を有する環状化可能な増幅プローブであって、前記３’および５’領域が標 的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもないリン カー領域で隔てられているプローブを添加し、標的核酸と環状化可能プローブと を含む複合体を形成させるステップ； （ｄ）前記環状化可能なプローブの３’および５’末端を、ヌクレオチド配列を 連結する連結反応試薬で連結して、環状増幅プローブを形成させるステップ； （ｅ）前記複合体を洗浄するステップ； （ｆ）前記複合体を、環状増幅プローブのリンカー領域の一部に相補的でこれに ハイブリダイズ可能な第１の伸長プライマーおよび、第１の伸長プローブが相補 的であるリンカー領域部分と重ならない、環状増幅プローブのリンカー領域の一 部と実質的に同一である第２の伸長プライマーと、dNTPおよび鎖置換活性を有す るDNAポリメラーゼとに接触させることによって前記環状増幅プローブを増幅す るステップであって、接触が、第１の伸長プライマーが環に沿って多回転して伸 長して環状プローブの配列に相補的な繰り返し単位である１本鎖DNAが形成され 、第２の伸長プライマーの多コピーが１本鎖DNAの相補的領域にハイブリダイズ してDNAポリメラーゼによって伸長され伸長産物が生成され、かつ、第２の伸長 プライマーの伸長産物が第２の伸長プライマーの下流コピーおよび対応する伸長 産物を置換し、置換された１本鎖が生成されて前記第１の伸長プライマーの多コ ピーが結合してDNAポリメラーゼによって伸長される条件下で行なわれる、前記 増幅ステップ； （ｇ）種々の長さの、増幅された２本鎖DNAの多コピーが生成されるまで前記増 幅を進行させるステップ；および、 （ｈ）検出が臨床サンプル中の標的核酸の存在を示すものである、前記増幅され たDNAを検出するステップ、 を含む、前記方法。 ４．サンプル中の標的核酸のin situ検出のための方法において、 （ａ）標的核酸の存在に関して解析すべき組織学的試料から組織サンプルを調製 するステップ； （ｂ）前記組織サンプルを洗浄するステップ； （ｃ）標的核酸中の隣接するが、連続していない配列に相補的な３’および５’ 領域を有する環状化可能な増幅プローブであって、前記３’および５’領域が標 的核酸中のヌクレオチド配列に相補的でもなくハイブリダイズ可能でもないリン カー領域で隔てられているプローブを添加し、標的核酸と環状化可能プローブと を含む複合体を形成させるステップ； （ｄ）前記環状化可能なプローブの３’および５’末端を、ヌクレオチド配列を 連結する連結反応試薬で連結して、環状増幅プローブを形成させるステップ； （ｅ）前記複合体を洗浄するステップ； （ｆ）前記複合体を、環状増幅プローブのリンカー領域の一部に相補的でこれに ハイブリダイズ可能な伸長プライマー、dNTP、および鎖置換活性を有するDNAポ リメラーゼに、前記伸長プライマーが環に沿って多回転して伸長して環状プロー ブの配列に相補的な繰り返し単位である１本鎖DNAが形成される条件で接触させ ることによって、前記環状増幅プローブを増幅するステップ；および、 （ｇ）検出が臨床サンプル中の標的核酸の存在を示すものである、前記１本鎖DN Aを検出するステップ、 を含む、前記方法。 ５．第２の伸長プライマーがDNA-依存性RNAポリメラーゼに対するプロモーター 配列を含んでおり、ステップ（ｄ）がDNA-依存性RNAポリメラーゼおよびrNTPを 、１本鎖DNAのRNAコピーが作られる条件で添加することを更に含む、請求項１に 記載の方法。 ６．DNAポリメラーゼが、DNAポリメラーゼの（エキソ-）クレノウ断片、テルモ コックス ・リトラリス（エキソ-）DNAポリメラーゼ、および、テルムス・アクア チクス DNAポリメラーゼからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。 ７．DNAポリメラーゼが、DNAポリメラーゼの（エキソ-）クレノウ断片、テルモ コックス ・リトラリス（エキソ-）DNAポリメラーゼ、および、テルムス・アクア チクス DNAポリメラーゼからなる群より選ばれる、請求項２記載の方法。 ８．DNA-依存性RNAポリメラーゼがバクテリオファージT3 RNAポリメラーゼまた はバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼまたはバクテリオファージSP6 RNAポ リメラーゼである、請求項５に記載の方法。 ９．サンプルをステップ（ｃ）の後で、かつ、ステップ（ｄ）の前にエキソヌク レアーゼと接触させることをさらに含む、請求項１記載の方法。 10．標的核酸が病原性微生物またはウイルスに特異的である、請求項１記載の方 法。 11．標的核酸が正常または異常なヒト遺伝子である、請求項１記載の方法。 12．標的核酸がRNAまたはDNA分子である、請求項１記載の方法。 13．リガンドが、ビオチン、抗原、ハプテン、抗体、重金属誘導体および、ポリ ｄＧ、ポリｄＴ、ポリｄＣ、ポリｄＡおよびポリＵを含むポリヌクレオチドから なる群より選ばれる、請求項１記載の方法。 14．リガンド結合部分がストレプトアビジン、アビジン、抗体、抗原、チオ基お よび、ポリｄＣ、ポリｄＡ、ポリｄＧ、ポリｄＴおよびポリＵを含むポリヌクレ オチドからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。 15．リガンドがビオチンであり、リガンド結合部分がストレプトアビジンである 、請求項１記載の方法。 16．連結反応試薬が酵素または化学試薬である、請求項１記載の方法。 17．酵素がDNAリガーゼまたはRNAリガーゼである、請求項16記載の方法。 18．DNAリガーゼがT4 DNAリガーゼまたはTaq DNAリガーゼである、請求項16記載 の方法。 19．化学試薬が臭化シアンまたはカルボジイミドである、請求項16記載の方法。 20．分離及び洗浄ステップの間に反応容器からの粒子の損失を防ぐために充分な 磁場に常磁性粒子をさらすことを更に含む、請求項１記載の方法。 21．標的核酸がHIV-1 RNA、マイコバクテリアリボゾームRNA、HCV、RNA、および EBV RNAからなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。 22．リボゾームRNAが、マイコバクテリア種である、Ｍ．ツベルクロシス、Ｍ． アビウム 、およびＭ．イントラセルレアからなる群より選ばれる16S rRNAであ る、請求項21記載の方法。