JP2001514853A - キメラ結合ペプチドライブラリのスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ペプチドを、それをコード化する配列へ結合するＤＮＡ結合タンパクを使用して、ＤＮＡライブラリから、ターゲットペプチドをコード化するヌクレオチド配列を分離する方法を記載する。ＤＮＡライブラリは関心のあるタンパクをコード化する細胞、あるいは合成ＤＮＡから調製され、発現ベクター中でＤＮＡ結合タンパク内に、あるいはその近傍に挿入され、キメラ融合タンパクを生成する。キメラ融合タンパクの発現中に、ベクターＤＮＡをキャリアパッケージ中に取り込むことにより、ＤＮＡ結合融合タンパクをキャリアーパッケージの外面上に表示するペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）が製造される。アフィニティー精製法を使用することにより、所望のペプチドをコード化する配列を含むＰＤＣＰ粒子が選択され、それから所望のヌクレオチド配列を得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

『発明の属する技術分野』 本発明は、一般に関心のあるペプチドをコード化する配列に関して、ヌクレオ
チドライブラリをスクリーニングする方法に関する。

【０００１】 『発明の背景および従来技術の説明』 組換え型ＤＮＡライブラリから所望のペプチドをコード化する未知の遺伝子を
分離することは困難な作業であるといえる。ハイブリッド形成プローブを使用す
ることにより、このプロセスを容易にすることができるかもしれないが、それを
使用するには、一般的に少なくともこのタンパク質をコード化する遺伝子の配列
の一部がわかっていなくてはならない。この配列が知られていない場合は、ＤＮ
Ａライブラリを発現ベクター中に発現させ、抗体を使用して所望のタンパク抗原
を示しているプラークあるいはコロニーを探してスクリーニングすることができ
る。この手順は小さなライブラリをスクリーニングするのには有用であるが、頻
度の極めて低い配列、１０万個のクローンあたり約１個に満たない再現性（滅多
に出現しないｃＤＮＡ分子あるいは合成ペプチドの場合のように）は見逃しやす
く、１００万個のクローンを越える規模のライブラリのスクリーニングは骨の折
れる困難な仕事となっている。さて、１００万個のクローンのライブラリをスク
リーニングすることにより、この出現率の低い配列の分離に取り組むように設計
された方法が開発された。この方法にはファージ表示方法およびＬａｃＩ融合フ
ァージ表示とが含まれているが、詳しくは下記する。

【０００２】 ファージ表示法 糸状バクテリオファージｐＩＩＩ及びｐＶＩＩＩコートタンパクのＮ末端側に
融合したＤＮＡライブラリのメンバーは発現ベクターから発現し、その結果ファ
ージ粒子の表面で、ファージ粒子中にパッケージされた融合タンパクをコード化
するＤＮＡと共に異種ペプチドを表示する(Smith G.P., 1985, Science 228:131
5-1317)。この発現ベクターはバクテリオファージゲノム自身でもよく、またバ クテリオファージコートタンパクがその中にクローン化されているところのファ
ージミドベクターでもよい。後者の場合、成熟したファージ粒子を作り出すため
に必要なタンパクの完全な補体を提供するためには、ファージミドベクターを含
有しているホストバクテリアを、自発的に複製しているバクテリオファージ(ヘ ルパーファージと呼ばれる)とともに共感染させなくてはならない。このヘルパ ーファージは通常複製の起点において遺伝子に欠陥があり、そのためファージミ
ドゲノムの選択的なパッケージングが行われる。ヘルパーファージの感染に続く
融合タンパクの発現により、集合中に融合タンパクと野生型コートタンパクとが
ファージ粒子中に取り込まれる。ファージ中に取り込まれた融合タンパクのライ
ブラリからついで関心のあるターゲット(リガンド)に対し、結合メンバーを選択
することができる。結合したファージにより、ついで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を
再感染させ、増幅させ、さらにこの選択行程を繰り返して結合メンバーを増菌す
る(Parmley, S., F., & Smith, G. P. 1988., Gene 73 : 305-318 ; Barrett R.
W. et al., 1992, Analytical Biochemistry 204 ; 357-364 Williamson et al
., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 4141-4145; Marks et al., 1991, J. Mo
l. Biol. 222 : 581-597)。

【０００３】 いくつかの刊行物にこの方法が記載されている。例えば米国特許第５，４０３
，４８４号には、興味あるウイルスコートタンパクとペプチドからキメラ結合タ
ンパクを製造する方法が記載されている。この方法においては、ウイルスの外表
面上にキメラタンパクあるいはその加工された形が表示されるために、少なくと
もウイルスコートタンパクの機能性部分が必要となる。さらに米国特許第５，５
７１，６９８号には、結合タンパクをコード化する核酸を得るための方法が記載
されているが、その重要な要素は、遺伝子的に決定される外表面タンパクを有す
る増幅可能な遺伝子パッケージのポピュレーションを準備し、この遺伝子パッケ
ージの外表面上の潜在的な結合領域を表示させることである。この遺伝子パッケ
ージは、細胞、胞子およびウイルスからなる群から選択される。例えば、この遺
伝子パッケージがバクテリア細胞であると、外表面伝達信号はバクテリアの外表
面タンパクから生じるが、遺伝子パッケージが糸状バクテリオファージであると
きは、この外表面伝達信号は糸状ファージの遺伝子ｐＩＩＩ（マイナーコートタ
ンパク）あるいはｐＶＩＩＩ（メジャーコートタンパク）によって提供される。

【０００４】 国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号および第ＷＯ−Ａ−９２／２０７９
１号は、遺伝子ｐＩＩＩ タンパクなどのウイルスコートタンパクに融合した第
１のポリペプチド鎖を発現し、この多量体の第２のポリペプチド鎖を発現し、こ
の二つの鎖がＲＧＤＰの一部として一緒に現れるようにすることによって、パッ
ケージの表面でポリペプチドを表示する、分泌された複製可能な遺伝子表示パッ
ケージ（ＲＧＤＰ）の多量体特異性結合ペアを製造する方法を記載している。

【０００５】 ＬａｃＩ融合プラスミド表示 この方法はラクトースリプレッサーのＤＮＡ結合能力に基づくものである。ラ
ンダムペプチドのライブラリはこのＬａｃＩリプレッサータンパク、通常そのＣ
末端に、融合遺伝子運搬プラスミドベクターからの発現を通じて融合している。
このＬａｃＩ−ペプチド融合のエンコーディングＤＮＡへの結合はプラスミド上
のｌａｃ０配列を通じて生じ、安定なペプチド−ＬａｃＩ−ペプチド複合体を形
成する。これらの複合体はそのホストバクテリアから溶菌によって放出され、関
心のあるペプチドがアフィニティー精製によって固定化されたターゲット上に分
離される。このように分離されたプラスミドは、ついで大腸菌の中にエレクトロ
ポレーションによって再度導入され、さらに、スクリーニングを行うために選択
されたポピュレーションを増幅する(Cull, M.G. et al. 1992. Proc. Natl. Aca
d. Sci. U.S.A. 89:1865-1869)。

【０００６】 米国特許第５，４９８，５３０号には、適当なホスト細胞中のＤＮＡ結合タン
パクへ融合されたランダムペプチドのライブラリを構築し、ホスト細胞の原形質
中で、細胞内融合タンパク発現に適した条件下でホスト細胞を培養する方法が記
載されている。この方法は、またランダムペプチドが融合タンパクのカルボキシ
末端に位置しており、融合タンパク−ＤＮＡ複合体が溶菌によってホスト細胞か
ら放出されることを教示している。この溶菌細胞から放出された後のＤＮＡを分
解から守るための方法は何ら記載されていない。いくつかのＤＮＡ結合タンパク
がクレームされているが、ｌａｃＩを除いて実例は示されていない。

【０００７】 前述した方法以外のペプチドライブラリを構築する方法が必要とされている。
例えば、前述した方法では、遊離カルボキシル末端を持つ分泌されたペプチドの
製造を行うことはできない。

【０００８】 『発明の概要』 本発明は、関心のあるペプチドをライブラリから分離する別の方法を述べるも
のであり、従来の方法に比べて大きな利点を有するものである。

【０００９】 大まかに言うと、本発明は関心のあるターゲットペプチドをコード化するヌク
レオチド配列を求めてヌクレオチドライブラリ（通常ＤＮＡライブラリ）をスク
リーニングする方法を提供する。本発明の方法は、ペプチドをコード化する特定
のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドへ、それぞれのペプチドを物理的に
結合することを含有する。ペプチドのそのコード化ヌクレオチド配列への結合は
このペプチドをヌクレオチド結合領域へと結合することによって達成される。ヌ
クレオチド結合領域を有する二官能性キメラタンパクとライブラリメンバーすな
わちターゲットペプチド（好ましくは関心のある機能を有する）とはこのように
して得ることができる。関心のあるペプチドはキメラタンパクのヌクレオチド結
合領域を通じてこのペプチドをコード化するポリヌクレオチドに結合される。

【００１０】 その後、このポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体はポリヌクレオチドを
その後に生じる分解から保護するペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）
内に、ターゲットペプチドの部分がペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ
）の外表面上に表示されるようにして取り込まれる。

【００１１】 このように、１つの局面において、本発明は、つぎのようなペプチド表示キャ
リアパッケージ（ＰＤＣＰ）を提供する。このパッケージはポリヌクレオチド−
キメラタンパク複合体を含有し、ここでキメラタンパクはヌクレオチド結合部分
とターゲットペプチド領域とを有し、前記ポリヌクレオチドは特異的に前記ヌク
レオチド結合部分によって特異的に結合されるヌクレオチド配列モチーフを含有
し、ここで少なくともキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって結合され
ていないポリヌクレオチドのキメラタンパクコード化領域は保護されている。

【００１２】 １つの実施例において、このポリヌクレオチドは裸のポリヌクレオチドに非特
異的に結合するタンパクによって保護されている。例としてはウイルスコートタ
ンパクをあげることができるが、その多くはすでに当該分野でよく知られている
。選択されたウイルスコートタンパクが、ポリヌクレオチドへの一般的な結合を
開始するための開始配列を必要とする場合、これはポリヌクレオチド上の適当な
部位で提供することができる。好ましいコートタンパクはバクテリオファージ、
特にＭ１３由来のコートタンパクである。

【００１３】 一般的には、キメラタンパクの核酸結合領域はキメラタンパクをコード化する
組換え型ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド配列モチーフに対するその
特異性によって選択される。

【００１４】 あるいは、ヌクレオチド配列モチーフはポリヌクレオチドのタンパクコード化
領域全体であってもよい。別法として、さらにより一般的には、このモチーフは
ポリヌクレオチドの非コード化領域中に存在していてもよい。本発明の目的のた
めに必要なことはキメラタンパクのヌクレオチド結合部分による認識と、結合が
行えるように、このモチーフがポリヌクレオチド上に位置することである。ポリ
ヌクレオチドーキメラタンパク複合体が少なくとも１時間の溶解定数を有するこ
とが望ましい。

【００１５】 あるいは、組換え型ポリヌクレオチドは、それぞれキメラタンパク分子と結合
する、２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを含有してもよい。こ
のモチーフは結合されたキメラタンパク同士の立体障害を避けるよう、ポリヌク
レオチドの長さ方向に沿って位置していることが好ましい。

【００１６】 このヌクレオチド配列モチーフは、その５’および／または３’末端にさらに
ヌクレオチド配列（例えばコード化配列）が存在しても、影響されないことが好
ましい。したがって、キメラ融合タンパクはそのＮ末端、そのＣ末端にターゲッ
トペプチド部分を含有してもよく、あるいはヌクレオチド結合部分のそれぞれの
端、すなわちキメラタンパクのＮ末端とＣ末端で２つのターゲットペプチド領域
（同一であっても異なっていてもよい）を含んでいてもよい。例えば１つのター
ゲットペプチドが既知の特異性を有する抗体で、他のペプチドが重要である可能
性のあるペプチドであってもよい。

【００１７】 キメラタンパクのターゲットペプチド部分がペプチド表示キャリアパッケージ
の外部に表示され、したがって、検知、反応および／または結合に利用できるこ
とが望ましい。

【００１８】 さらに詳しくは、このペプチド表示キャリアパッケージは二つの別個の要素か
ら構成することができる。

【００１９】 ａ． ポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体。これは表示されたターゲッ
トペプチド部分をそのペプチド部分をコード化するポリヌクレオチドへと特異的
ポリヌクレオチド結合部分を通じて結合する。キメラタンパクをコード化するこ
のヌクレオチド配列およびキメラタンパクのヌクレオチド結合部分によって認識
される特異的ヌクレオチド配列モチーフは、ペプチド表示キャリアパッケージ（
ＰＤＣＰ）に取り入れることのできる、ポリヌクレオチドのセグメント上に存在
しなくてはならない；および、 ｂ． 保護コート。これは独立して存在する、複製可能キャリアーあるいはヘ
ルパーパッケージによって提供される。あるいは、別法として、コートタンパク
は本発明の組換え型ポリヌクレオチドによってコード化することもできる。この
ポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体用保護コートは、タンパクあるいは脂
質などの生物材料から構成されていてもよいが、保護コートはターゲットペプチ
ドをそのペプチドをコード化するポリヌクレオチドへ結合するために必要ではな
い。この保護コートはキメラタンパクのターゲットペプチド部分をその外部表面
上に表示させなくてはならない。キャリアーあるいはヘルパーパッケージはまた
無傷のペプチド表示キャリアパッケージを必要に応じてホスト細胞から放出する
機構を提供する。例をあげると、バクテリオファージがこの複製可能なキャリア
パッケージである場合、このバクテリオファージのタンパクコートがポリヌクレ
オチド−キメラタンパク複合体の周りを取り囲んでペプチド表示キャリアパッケ
ージを形成し、それが、その後ホストバクテリア細胞から排出される。

【００２０】 ここに記載する本発明では、ヌクレオチド結合領域に融合されたペプチドが、
表示ペプチドをコード化するポリヌクレオチドに結合したままで、バクテリオフ
ァージキャリアパッケージタンパクコートを通してであっても、外面に表示され
得ることを明らかにする。

【００２１】 本発明は、また、ターゲットペプチド部分に操作によって結合されるヌクレオ
チド結合部分を有するキメラタンパクをコード化するヌクレオチド配列を含有す
る組換え型ポリヌクレオチドを提供する。ここで前記ポリヌクレオチドは前記キ
メラタンパクのヌクレオチド結合部分に結合され、さらに配列非特異性ヌクレオ
チド結合タンパクをコード化する特定のヌクレオチド配列モチーフを含有する。

【００２２】 組換え型ポリヌクレオチドは、適当な環境、例えば適合性のホスト細胞に置か
れると、キメラタンパクを発現することのできる組換え型発現システムであるこ
とが望ましい。発現の後、キメラタンパクはキメラタンパクをコード化するヌク
レオチド配列を含有するポリヌクレオチド中に存在する特定のヌクレオチド配列
（モチーフ）と結合する。

【００２３】 あるいはヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列とこの構成の
制限酵素部位へ挿入されたポリヌクレオチドとの間にリンカー配列が存在しても
よい。

【００２４】 このヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプター
のＤＮＡ結合領域、あるいはその機能的同等物であることが望ましい。このよう
なヌクレオチド結合部分をコード化する配列の例は、配列番号１１と配列番号１
３に記載されている。

【００２５】 ここで「発現システム」とは、タンパクコード化領域を含む遺伝子配列のこと
を指称し、かかる領域の発現を達成するのに必要な遺伝信号すべてに対して操作
によって結合される。あるいは別法として、この発現システムは、またタンパク
コード化領域の転写および／または翻訳を増大する、あるいは発現を制御する、
プロモータやエンハンサーなどの調整要素を含有してもよい。この調整要素はタ
ンパクコード化領域の上流側あるいは下流側のどちらに位置してもよく、あるい
はタンパクコード化領域そのものの中にあってもよい。２つ以上の別個のタンパ
クコード化領域が存在するとき、これらは共通の調整要素を使用してもよく、あ
るいは異なる調整要素を使用してもよい。

【００２６】 前述した組換え型ポリヌクレオチドは一般にはＤＮＡである。この発現システ
ムがＭ１３ベクターに基づいているとき、通常発現されたキメラタンパクのポリ
ヌクレオチド結合部分は一本鎖ＤＮＡである。しかしながら、その他のベクター
システムを使用してもよく、都合に応じてヌクレオチド結合部分が二本鎖ＤＮＡ
と、あるいは二本、または一本鎖ＲＮＡと選択的に結合するように選択すること
ができる。

【００２７】 さらに、本発明は、かかる組換え型発現システムを含有するベクター、および
かかる組換え型発現システムにより形質変換されたホスト細胞を（オプションと
してベクターの形で）提供する。

【００２８】 前述した組換え型ポリヌクレオチドが本発明の重要な部分を形成する一方で、
我々はまた遺伝子材料の大規模な（例えば少なくとも１０万以上のメンバー、例
えば１００万、あるいは１０００万に達するメンバー）ライブラリをスクリーニ
ングする能力にも関心を持っている。したがって、１つの主な考えは、前記組換
え型ポリヌクレオチドを形成するために、前記ライブラリの各メンバーを個別に
含有し、それによってコード化されたキメラタンパクが発現できるような組換え
型遺伝子構成体を供給することである（そのターゲットペプチドはこの構成体に
含められたヌクレオチドライブラリメンバーによってコード化される）。

【００２９】 したがって、さらにもう１つの局面から見ると、本発明は、 ｉ） 特異的配列モチーフを認識することができ、それに結合することのでき
るヌクレオチド結合部分をコード化する配列と、 ｉｉ） ｉ）によってコード化されたヌクレオチド結合部分によって認識され
、結合された配列モチーフと、 ｉｉｉ） ポリヌクレオチドの挿入を行う制限酵素部位と、ここで前記部位は
前記ポリヌクレオチドをヌクレオチド結合部分コード化配列に操作によって結合
するよう設計されており、それによって操作によって結合されたポリヌクレオチ
ド配列がキメラタンパクを製造し、さらに、 ｉｖ） 非特異的に裸のポリヌクレオチドへ結合するヌクレオチド結合タンパ
クをコード化する配列と、 を含有する配列を有するポリヌクレオチドを含有する遺伝子構成体あるいは遺伝
子構成体のセットを提供する。

【００３０】 オプションとして、構造体の制限酵素部位へと挿入されたライブラリからのポ
リヌクレオチドの配列とヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列
との間にリンカー配列が位置してもよい。

【００３１】 このヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲステロンレセプター
のＤＮＡ結合領域、あるいはその機能的同等物であることが望ましい。このよう
なヌクレオチド結合部分をコード化する配列の例は、配列番号：１１と１３に記
載されている。

【００３２】 本発明において適当な遺伝子構成体としては、１９９８年８月２８日にＮＣＩ
ＭＢにてそれぞれ番号ＮＣＩＭＢ ４０９７０、ＮＣＩＭＢ ４０９７１および
ＮＣＩＭＢ ４０９７２として供託されたｐＤＭ１２、ｐＤＭ１４、およびｐＤ
Ｍ１６をあげることができる。

【００３３】 これまで製造された遺伝子ライブラリもまた前述した遺伝子構成体に付すこと
ができるものと考えられる。したがって、遺伝子ライブラリの各個別のメンバー
は別々に遺伝子構成体へ含められ、そして、このライブラリは（前述したように
）各組換え型ポリヌクレオチドがライブラリメンバーとして含まれる組換え型ポ
リヌクレオチドのライブラリの形で、通常はベクターの形で提示される。

【００３４】 したがって、さらに別の局面から見ると、本発明は、組換え型ポリヌクレオチ
ドのライブラリ（前述したように規定したとおり）を提供し、ここで各ポリヌク
レオチドは遺伝子ライブラリから得られたポリヌクレオチドを含有し、さらにこ
のポリヌクレオチドが組換え型ポリヌクレオチドによって発現されるキメラタン
パクのターゲットペプチド部分をコード化するものである。

【００３５】 オプションとして、キメラタンパクはさらに、ヌクレオチド結合部分とターゲ
ットペプチド部分との間に位置するリンカー配列を含有してもよい。このリンカ
ー配列はタンパクの２つの部分の間の立体障害を減少させる。このリンカー配列
がある程度柔軟性をもつことが望ましい。

【００３６】 関心のあるペプチドの結合活性に基づくアフィニティー技法によって、ペプチ
ド表示キャリアパッケージ粒子のライブラリを構築、スクリーニングし、多くの
異なるペプチドを表示し、特定のペプチドの分離と同定を行うための方法がさら
に開示されている。得られるポリヌクレオチド配列は、したがってより簡単に同
定、再クローン化および発現を行うことができる。

【００３７】 ａ） 特異的配列モチーフを認識し、この配列モチーフと結合することのでき
るヌクレオチド結合部分をコード化するポリヌクレオチド配列を含有する組換え
型ベクターの複数のコピーを構築し（およびオプションとしてこの特定の配列モ
チーフを含有し）、 ｂ） 前記ベクターそれぞれを下記の操作によって結合されたベクターの発現
が前記ターゲットペプチドと前記ヌクレオチド結合部分とを含有するキメラタン
パクの発現をもたらすように、ターゲットポリペプチドをコード化するポリヌク
レオチドへ操作によって結合し、ここで前記操作により結合されるベクターの前
記複数コピーがターゲットペプチド部分のライブラリを表し、 ｃ） ホスト細胞をステップｂ）のベクターによって形質変換し、 ｄ） ステップｃ）のホスト細胞を前記のキメラタンパクの発現に適した条件
のもとで培養し、 ｅ） ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されるヌクレオチド配列モ
チーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドを
ステップｄ）のキメラタンパクへ露出してポリヌクレオチド−キメラタンパク複
合体を生じさせ、さらに、 ｆ） キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドの保護されていない部
分に結合することのできる配列非特異性部分の生産を生じさせて、ペプチド表示
キャリアパッケージを形成するステップと、 を含有する遺伝子ライブラリを構築する方法。

【００３８】 本発明は、さらに、 ａ） 前記ライブラリのポリヌクレオチドメンバーを、前記ライブラリのポリ
ヌクレオチドがそれぞれ前記遺伝子構成体の１つのコピーと結合し、組換え型ポ
リヌクレオチドのライブラリを形成するのに適した条件の下で、特定の配列モチ
ーフを認識でき、この配列モチーフに結合できるヌクレオチド結合部分をコード
化するヌクレオチド配列を含有する遺伝子構成体の複数のコピーに露出し、 ｂ） 前記組換え型ポリヌクレオチドを前記ホスト細胞が前記組換え型ポリヌ
クレオチドにより形質変換されるのに適した条件の下でホスト細胞のポピュレー
ションに露出し、 ｃ） 形質変換されたホスト細胞を選択し、 ｄ） 前記形質変換されたホスト細胞を前記組換え型ポリヌクレオチドが発現
し、キメラタンパクを生じるのに適した条件に付し、 ｅ） ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されたヌクレオチド配列モ
チーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドを
ステップｄ）のキメラタンパクに露出し、ポリヌクレオチドキメラタンパク複合
体を生じさせ、 ｆ） ステップｅ）の複合体中のポリヌクレオチドの露出部分を保護してペプ
チド表示キャリアパッケージを形成し、 ｇ） 要求される特徴を有するターゲットペプチド部分を表示するパッケージ
のみを選択するために前記ペプチド表示キャリアパッケージをスクリーニングす
るステップと、 を含有する遺伝子ライブラリのスクリーニングを行う方法を提供する。

【００３９】 ステップａ）において前記の遺伝子構成体がｐＤＭ１２、ｐＤＭ１４あるいは
ｐＤＭ１６であることが望ましい。

【００４０】 ステップｆ）において、ペプチド表示パッケージキャリアが形質変換されたホ
スト細胞からホスト細胞の溶菌を行わずに排出されることが望ましい。

【００４１】 一般に、形質変換されたホスト細胞は形質変換の後、キメラタンパクの発現に
先立ち、培養などにより単一のコロニーへ分割される。

【００４２】 前述したステップｇ）のスクリーニングでは特定のターゲットペプチドを機能
（例えば酵素活性）あるいは構造（例えば特定の抗体への結合性）に基づいて探
すことができる。ひとたびペプチド表示キャリアパッケージが所望の特徴を有す
るターゲットペプチドを含有していることがわかれば、そのポリヌクレオチド部
分（もちろんキメラタンパク自身をコード化する）を増幅し、クローン化し、あ
るいは標準的遺伝子工学技法を用いてその他の操作を行うことができる。

【００４３】 本発明は、米国特許第５，４０３，４８４号および米国特許第５，５７１，６
９８号に開示されている従来技術の教示と異なり、ウイルス粒子あるいは遺伝子
パッケージの外表面上にキメラ結合タンパクを表示するために外部表面伝達信号
あるいはウイルスコートタンパクの機能性部分を必要としない。

【００４４】 本発明は、また国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号および第ＷＯ−Ａ−
９２／２０７９１号の教示と異なり、ウイルス粒子の外表面上にターゲットペプ
チドを表示するために、分泌された複製可能な遺伝子表示パッケージの成分ある
いはウイルスコートタンパクを必要としない。

【００４５】 本発明は、キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドに結合されたキメ
ラタンパクの、ホスト細胞の原形質内ではなく、細胞外の表意が可能である点で
米国特許第５，４９８，５３０号の教示と異なっている。本発明においてキメラ
タンパクは、キメラタンパクをコード化するＤＮＡを保護しているペプチド表示
キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）の外表面上に存在し、キメラタンパク−ＤＮＡ
複合体を入手するのに溶菌を必要としない。最後に、本発明はキメラタンパク−
ＤＮＡ複合体を形成するのに際しｌａｃＩ ＤＮＡ結合タンパクに依存しない。

【００４６】 本発明の１つの実施例において、キメラタンパクのヌクレオチド結合部分は１
つ以上のタンパクの核ステロイドレセプターファミリー由来のＤＮＡ結合領域、
あるいはこのような領域の機能的等価物を含有する。特に例をあげると（これに
限定するわけではないが）、エストロゲンレセプターあるいはプロゲステロンレ
セプターのＤＮＡ結合領域、あるいはその機能的同等物である。これらの領域は
、二本鎖ＤＮＡとしてでも一本鎖ＤＮＡとしてでも結合できる、ホルモン応答要
素（ＨＲＥ）と名付けられた特定のＤＮＡ配列を認識することができる。このよ
うな核ステロイドレセプタータンパクのＤＮＡ結合領域が好ましい。

【００４７】 以下に例として特にエストロゲンレセプターをあげるが、これが好都合である
理由はつぎのとおりである。

【００４８】 （ａ） エストロゲンレセプターは５９５個のアミノ酸からなる大きな多機能
ポリペプチドであり、真核細胞の原形質および核中で機能する(Green et al., 1
986, Science 231 : 1150-1154)。最小高親和性ＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ）がア ミノ酸１７６と２８２の間に規定されている(Mader et al., 1993, Nucleic Aci
ds Res. 21 : 1125-1132)。この領域の機能（すなわちＤＮＡ結合）は全長タン パク中でこの領域のＮおよびＣ末端に非ＤＮＡ結合領域が存在することによって
阻害されない。

【００４９】 （ｂ） エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域断片（アミノ酸１７６−２８
２）は大腸菌中で発現しており、親分子に類似の親和性（０．５ｎＭ）でダイマ
ーとして特定の二本鎖ＤＮＡエストロゲンレセプターターゲットＨＲＥヌクレオ
チド配列へ結合することが示されている(Murdoch et al.1990, Biochemistry 29
: 8377-8385 ; Mader et al., 1993, Nucleic Acids Research 21 : 1125-1132
)。ペプチド表示キャリアパッケージの表面でのＤＢＤダイマー化により１つの 粒子あたり２つのペプチドが表示されることになる。この２価の表示は低親和性
のペプチドならびに特定のターゲットに結合するために、あるいは、ターゲット
レセプターを活性化するために２価の構造を形成するよう求められているペプチ
ドの分離に役立つ。エストロゲンレセプターはその３８個の塩基対ターゲットＨ
ＲＥ配列、コンセンサス配列： １） 5’-TCAGGTCAGAGTGACCTGAGCTAAAATAACACATTCAG-3’ (マイナス鎖)配列 番号：1、および、 ２） 3’-AGTCCAGTCTCACTGGACTCGATTTTATTGTGTAAGTC-5’ (プラス鎖) 配列番号：2 に高親和力と特異性により、結合ペプチドを選択する際に通常必要とされる塩と
ｐＨ条件のもとで結合することができる。さらに結合親和力はＨＲＥヌクレオチ
ド配列の一本鎖コード化、すなわち「プラス」鎖（すなわち、配列番号：２）に
おいては特定のターゲットヌクレオチド配列の二本鎖形の６０倍に増加する(Pea
le et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 1038-1042 ; Lannigan & N
otides, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 863-867)。

【００５０】 ペプチド表示キャリアパッケージのＤＮＡ結合成分がエストロゲンレセプター
である本発明の実施例においては、このヌクレオチド（ＤＮＡ）結合部分はエス
トロゲンレセプタータンパクのアミノ酸１７６−２８２の最小配列を含有する。
さらに、このコンセンサスエストロゲンレセプターターゲットＨＲＥ配列はもし
一本鎖ＤＮＡが製造できれば、エストロゲンレセプターＨＲＥヌクレオチド配列
のコード化、すなわち「プラス」鎖が一本鎖ＤＮＡに取り込まれるようにしてク
ローン化される。この目的に適したベクターの例としては、ｐＵＣ１１９(Viera
et al., Methods in Enzymology, Vol 153, pages 3-11, 1987参照)がある。

【００５１】 本発明の好ましい実施例において、ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣ
Ｐ）はバクテリアのホスト細胞がバクテリオファージベクター、前述したように
組換え型ポリヌクレオチドを含有するベクターによって形質変換されるときに組
み立てることができる。発現ベクターも、また、キメラタンパクのヌクレオチド
結合部分に結合することのできる特定のヌクレオチドモチーフを含有する。組換
え型ポリヌクレオチドの発現により、ターゲットペプチドとヌクレオチド結合部
分とを含有するキメラタンパクが製造される。ホスト細胞はキメラタンパク発現
とバクテリオファージ粒子の構築、および発現ベクター内での特定のヌクレオチ
ド配列とキメラタンパクとの結合に適した条件の下で増殖される。

【００５２】 この実施例においては、ベクターが、一本鎖ＤＮＡを製造するために複製する
バクテリオファージであるので、ヌクレオチド結合領域は好ましくは一本鎖ＤＮ
Ａへの親和性を有する。このベクター一本鎖ＤＮＡ−キメラタンパク複合体のバ
クテリオファージ粒子への取り込みによりペプチド表示キャリアパッケージ（Ｐ
ＤＣＰ）の組立てが行われ、ＰＤＣＰの外表面上にターゲットペプチドが表示さ
れる。

【００５３】 本実施例においては、ペプチド表示キャリアパッケージを製造するために必要
な要素の両方が同じベクター中に含有されている。ＤＮＡ−キメラタンパク複合
体のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）への取り込みは、ＤＮＡの分
解を防ぐことができ、１つのホスト細胞あたり多数のペプチド表示キャリアパッ
ケージを製造でき、さらにペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）を溶菌
に頼らずにホスト細胞から簡単に分離できるため好ましい。

【００５４】 より好ましい実施例において、ベクターはキメラタンパクの発現が誘導性プロ
モータによって制御されているファージミドベクター（例えばｐＵＣ１１９）で
ある。この実施例において、ペプチド表示キャリアパッケージはホスト細胞のフ
ァージミドベクターとヘルパーファージ両方による感染の後でのみ構築できる。
形質移入したホスト細胞はついでキメラタンパク発現とバクテリオファージ粒子
の構築に適した条件の下で培養される。

【００５５】 この実施例において、ＰＤＣＰの要素は２つの別のベクターによって提供され
る。ファージミド派生ペプチド表示キャリアパッケージは、バクテリオファージ
コートタンパク融合タンパクを表示するパッケージの一部が融合タンパクＤＮＡ
配列ではなく、ヘルパーファージＤＮＡを含有する国際公開第ＷＯ−Ａ−９２／
０１０４７号に開示されているファージミド派生表示パッケージよりも優れてい
る。本発明において、ペプチド表示キャリアパッケージはこのパッケージがヌク
レオチド結合部分によって認識される特定のヌクレオチドモチーフを含有すると
きにのみ、キメラ融合タンパクを表示することができる。殆どの実施例において
、この配列は融合タンパクをコード化する同一のＤＮＡセグメント上に存在する
であろう。さらに、従来技術により、突然変異型および野生型のタンパクがおな
じバクテリア細胞中に共発現されるとき、この野生型タンパクが優先的に製造さ
れることが認められている。したがって、野生型ヘルパーファージ、国際公開第
ＷＯ−Ａ−９２／０１０４７号のファージ表示システムが使用されている場合、
野生型遺伝子ｐＩＩＩおよびターゲットペプチド−遺伝子ｐＩＩＩキメラタンパ
クの両者が同じ細胞中で製造される。この結果、野生型遺伝子ｐＩＩＩタンパク
はバクテリオファージ粒子中にキメラタンパクよりも優先的にパッケージされる
。本発明においては、パッケージングに際し、バクテリオファージコートタンパ
クとの競合はない。

【００５６】 ターゲットペプチドは、ペプチド表示キャリアパッケージ粒子が溶菌という手
段を取ることなくホスト細胞から放出された後、ペプチド表示キャリアパッケー
ジの外的環境へ露出される位置に表示されることが望ましい。このターゲットペ
プチドはついでリガンドと結合するために利用可能となる。したがって、ターゲ
ットペプチドはヌクレオチド結合領域のＮ−末端あるいはＣ−末端、例えばエス
トロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域、あるいはその近くに位置することができ
る。

【００５７】 本発明は、また、生物学的活性を達成するため加工、折り曲げおよびペリプラ
スム間隙中で組み立てられている１つ以上のポリペプチド鎖を発現するＤＮＡラ
イブラリをスクリーニングするための方法を提供する。ペプチド表示キャリアパ
ッケージは下記のステップによって構築することができる。

【００５８】 （ａ） Ｎ−あるいはＣ−末端ＤＢＤ キメラタンパク融合のファージ
ミドベクターにおける構築。

【００５９】 （ｉ）ターゲットペプチドがヌクレオチド結合部分のＮ−末端に位置するとき
、それぞれが潜在的ターゲットペプチドをコード化するＤＮＡ配列のライブラリ
が発現ベクターの適当な位置（すなわち適当なプロモーターおよび翻訳配列と下
流の融合タンパクのペリプラスム間隙への移送を指示する信号ペプチドリーダー
をコード化する配列の下流）であり、ヌクレオチド結合部分をコード化する配列
の上流にクローン化される。好ましい実施例においては、関心のあるＤＮＡ配列
を柔軟なアミノ酸リンカーをコード化するＤＮＡ領域によってエストロゲンレセ
プターＤＢＤの５’−末端へと連結する。

【００６０】 （ｉｉ）あるいは、別法としてターゲットペプチドがヌクレオチド結合領域の
Ｃ−末端に位置しているとき、ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチ
ド配列がクローン化されたＤＮＡターゲットペプチドコード化配列の上流となり
、前記のヌクレオチド結合部分が、適当なプロモータおよび翻訳配列ならびに下
流の融合タンパクのペリプラスム間隙への移送を指示する信号ペプチドリーダー
をコード化する配列の下流に位置するように、それぞれ潜在的ターゲットペプチ
ドをコード化しているＤＮＡ配列のライブラリが発現ベクター内にクローン化さ
れる。好ましい実施例においては、柔軟なアミノ酸リンカーエストロゲンレセプ
ターＤＢＤ ＤＮＤ配列をコード化するＤＮＡの領域によって関心のあるＤＮＡ
配列を結合する。

【００６１】 この発現ベクターの上に位置しているのはエストロゲンレセプターＤＢＤによ
って認識され結合された特定のＨＲＥヌクレオチド配列である。各ペプチド表示
キャリアパッケージ粒子上に表示されるキメラタンパクの数を変えるために、こ
の配列をベクター中で１つ以上のコピーとして存在させることができる。

【００６２】 （ｂ）ペプチド表示キャリアパッケージへの取り込み。非溶解性ヘルパーバク
テリオファージは発現ベクターを含有するホスト細胞を感染させる。好ましいバ
クテリオファージの種類には糸状バクテリオファージｆｄ、ｆｌおよびＭ１３が
ある。より好ましい実施例において、バクテリオファージはＭ１３Ｋ０７である
。

【００６３】 関心のあるタンパクは発現され、ペリプラスム間隙へと移送され、適切に構築
されたタンパクは、ＤＢＤと一本鎖の型でファージ粒子中へ自然にパッケージさ
れているファージミドベクターＤＮＡ上に存在する特定のターゲットヌクレオチ
ド配列との間の高親和性相互作用によってペプチド表示キャリアパッケージ粒子
の中に取り込まれる。このＤＢＤタンパクとその特異的ターゲットヌクレオチド
配列間の高い親和性相互作用によりバクテリオファージコートタンパクによる置
換が妨げられ、その結果、関心のあるタンパクが細胞から排出されると、それは
ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）の表面に取り込まれる。

【００６４】 （ｃ）関心のあるペプチドの選択。関心のあるペプチドを表示する粒子をつい
でアフィニティー増菌技法によって培養物から選び出す。これは関心のあるタン
パクが抗体なら抗原など、関心のあるタンパクに対して特異的なリガンドを用い
て行うことができる。このリガンドはＥＬＩＳＡプレートの表面などの固体表面
上あるいは溶液中にあってよい。このアフィニティー選択技法を繰り返すことに
より所望の配列をコード化するクローンは増菌され、ついで分離され、配列決定
、さらなるクローン化および／または発現が行われる。

【００６５】 ＤＢＤ融合ペプチドの多種のライブラリが本実施例の下でスクリーンできる。
それには下記のものが含まれる。

【００６６】 （ｉ）各種の長さの合成ＤＮＡによりコード化されたランダムペプチド配列。

【００６７】 （ｉｉ）一本鎖Ｆｖ抗体断片。これらは一本鎖抗原結合分子を形成するために
、柔軟なリンカーペプチドによって連結された抗体のＨ鎖可変領域およびＬ鎖可
変領域からなる。

【００６８】 （ｉｉｉ）関心のある活性を含有する細胞ポピュレーションから分離された天
然産出タンパクのランダム断片。

【００６９】 他の実施例において、本発明は、例えばリガンド結合のための抗体Ｆａｂ断片
によって求められるような、活性のために１つ以上の鎖が必要であるメンバーを
持つＤＮＡライブラリをスクリーニングするための方法に関する。この実施例に
おいてＨ鎖あるいはＬ鎖抗体ＤＮＡは、例えばファージミドベクター中でエスト
ロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域をコード化するヌクレオチド配列へと連結さ
れている。通常Ｈ鎖（ＶＨおよびＣＨ１）あるいはＬ鎖（ＶＬおよびＣＬ）遺伝
子のためのこの抗体ＤＮＡライブラリ配列はエストロゲンレセプターＤＢＤ Ｄ
ＮＡの５’領域中で、適当なプロモータと翻訳配列および下流の融合タンパクの
ペリプラスム間隙への移送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化する配列
の下流に挿入されている。

【００７０】 したがって、ＤＮＡライブラリメンバーコード化タンパクへ融合されたＤＢＤ
が製造されバクテリオファージによる感染の後ウイルス粒子へ組み込まれる。こ
の第２のさらにその後の鎖は、別々に、 （ａ）ＤＢＤと第１のポリペプチド融合タンパクを含有している同じファージ
ミドベクターから、または、 （ｂ）ペリプラスム間隙へと輸送され、そこで細胞中に存在するＤＢＤタンパ
クへ融合されるように第１の鎖とともに組み合わされるホスト細胞核、あるいは
第１の発現ベクターと同じホスト細胞中で共存できるバクテリオファージ発現ベ
クター、プラスミド、あるいはファージミド上に存在するかもしれないＤＮＡの
別の領域から発現される。関心のあるタンパクをコード化するペプチド表示キャ
リアパッケージを、その後このタンパクに対して特異的なリガンドによって選び
出す。

【００７１】 さらにもう１つの実施例において、本発明は関心のある２つ以上の活性が各ペ
プチド表示キャリアパッケージ上に表示されている二官能性ペプチド表示キャリ
アパッケージのライブラリスクリーニング方法に関している。この実施例におい
て第１のＤＮＡライブラリ配列は、第１のＤＮＡ結合領域（ＤＢＤ） ＤＮＡ配
列、例えばエストロゲンレセプターＤＢＤの隣に適当なベクター中で、適当なプ
ロモータおよび翻訳配列、およびこの第１のキメラタンパクのペリプラスム間隙
への輸送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化する配列の下流に挿入され
る。第２のキメラタンパクは第２のＤＮＡライブラリ配列を第１のＤＢＤ ＤＮ
Ａ配列とは異なる第２のＤＢＤ ＤＮＡ配列、例えばプロゲステロンレセプター
ＤＢＤの隣に、適当なプロモータおよび翻訳配列、信号ペプチドリーダーをコー
ド化する配列の下流に挿入することによって、同じあるいは別のベクターから製
造される。この第１のあるいは唯一のベクターは、エストロゲンとプロゲステロ
ンレセプターの両方に対し特異的ＨＲＥヌクレオチド配列を含有する。この２つ
のキメラタンパクの発現により表示された２つの異なるキメラタンパクをもつペ
プチド表示キャリアパッケージが生じる。例をあげると１つのキメラタンパクは
関心のある特定のリガンドに対する結合活性を持ち、一方、第２のキメラタンパ
クは酵素活性を持つことができる。ペプチド表示キャリアパッケージによる第１
のキメラタンパクのリガンドへの結合は、その後この第２のキメラタンパクに対
する適当な基質で培養することによって検出することができる。別の実施例にお
いては、二官能性ペプチド表示キャリアパッケージを１つのペプチドをＤＢＤの
５’−端でクローン化し、第２のペプチドをＤＢＤの３’−端でクローン化する
ことにより、１つのＤＢＤを用いて製造することができる。この１つの二官能性
キメラタンパクの発現から、２つの異なる活性をもつペプチド表示キャリアパッ
ケージが生じる。

【００７２】 我々は関心のある生物学活性を有する特定のペプチドに対し、ＤＮＡ結合領域
へ融合し、表示パッケージの表面に表示されたペプチドのライブラリをスクリー
ニングし、その活性をコード化するＤＮＡを回収する可能性について研究した。
驚くべきことに、エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域をＭ１３バクテリオフ
ァージとともに操作することにより、生物学的に機能的な大分子を表示する新規
の粒子が構築できた。それによって、この所望の特異性をもつ粒子を増菌するこ
とができる。

【００７３】 ここに記載する本発明は、ＤＮＡライブラリスクリーニング技法に飛躍的な進
歩をもたらすものである。

【００７４】 『好適な実施例の詳細な説明』 下記の非限定実施例ならびに図面を用いて本発明をさらに説明する。

【００７５】 物質と方法 本発明において使用した下記の手順は前述したSambrook, J., et al., 1989 に記載されている。すなわち、制限酵素の消化、連結、電気応答性細胞の調製、
エレクトロポレーション，制限酵素消化生成物のアガロースゲル上での分析、フ
ェノール／クロロホルムを用いたＤＮＡの精製、２ｘＴＹ培地とプレートの調製
、アンピシリン、カナマイシン、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト
ピラノシド）原液の調製、さらにリン酸緩衝生理食塩水の調製である。

【００７６】 制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼおよびｃＤＮＡ合成試薬（スーパースクリ
プト プラスミド ｃＤＮＡ合成キット）をイギリス、スコットランドのペーズ
リーにあるライフ・テクノロジーズ・リミテッドから購入した。オリゴヌクレオ
チドはイギリス、スコットランドのグラスゴーにあるクルアケム・リミテッド、
あるいはイギリス、ケンブリッジにあるゲノシス・バイオテクノロジーズ・リミ
テッドから入手した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ウイザードＳＶプラスミドＤ
ＮＡ分離キット、ストレプタビジン被覆のマグネティックビーズならびにｍＲＮ
Ａ分離試薬（ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ １０００）はイギリス、ハンプシャーのサ
ザンプトンにあるプロメガ・リミテッドから入手した。Ｔａｑｐｌｕｓ ＤＮＡ
ポリメラーゼはイギリス、ケンブリッジにあるストラータジーン・リミテッドか
ら入手した。ＰＢＳ、ＢＳＡ、ストレプタビジン、物質Ｐおよび抗−ｐａｎｃａ
ｄｈｅｒｉｎ抗体はイギリス、ドーセットのプールにあるシグマ・リミテッドよ
り入手した。抗−Ｍ１３−ＨＲＰ結合抗体、カナマイシン耐性Ｍ１３Ｋ０７ヘル
パーバクテリオファージおよびＲＮＡｇｕａｒｄはイギリス、ハートフォードシ
アのセントオールバンズにあるファーマシア・リミテッドから入手し、抗ヒトＩ
ｇｋ抗体はイギリス、レスターシアのラフバラにあるハーラン・セララボから入
手した。ビオチン化物質Ｐおよびビオチン化カルシトニン遺伝子関連ペプチド（
ＣＧＲＰ）はイギリス、マージサイドのセントヘレンにあるペニンシュラ・ラボ
ラトリーズから入手した。

【００７７】 本発明の特定の実施例を実施例１から９として下記する。

【００７８】 実施例１ Ｎ−末端ＰＤＣＰ表示ファージミドベクターｐＤＭ１２の構築 このｐＤＭ１２ベクターは適当なＰＣＲプライマーによって修飾したエストロ
ゲンレセプターＤＮＡ結合領域をファージミドベクターｐＤＭ６中に挿入するこ
とによって構築した。このｐＤＭ６ベクターはｐＵＣ１１９派生ファージ表示ベ
クターｐＨＥＮ１に基づいている(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Re
s. 19 : 4133-4137)。これは（Ｇｌｙ）₄ Ｓｅｒ リンカー、ファクターＸａ切
断部位、全長遺伝子ＩＩＩおよびストレプタビジン標識ペプチド配列を含有し(S
chmidt, T.G.およびSkerra, A., 1993, Protein Engineering 6 : 109-122)、そ
れらすべてがＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化とアガロースゲル電気泳動によって、ｐ
ｅｌＢリーダー配列、ＳｆｉＩ、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位を、消化され
たＮｏｔＩ部位の上流に残して除去することができる。このクローン化ＤＮＡ結
合領域はｐＵＣ１１９中に見られるｌａｃプロモータにより制御されている。

【００７９】 ｐＤＭ６の調製 ｐＤＭ１２ベクターは適当なＰＣＲプライマーによって修飾したエストロゲン
レセプターＤＮＡ結合領域をファージミドベクターｐＤＭ６中に挿入することに
よって構築した。ｐＤＭ６ベクターはｐＩＩＩファージ表示ベクターｐＨＥＮ１
に基づいており(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19 : 4133-413
7)、これ自身ｐＵＣ１１９から派生する(Viera, J. and Messing, J., 1987, Me
thods in Enzymol. 153:3-11)。これはPIII遺伝子をｐＨＥＮ１中で２つのオリ ゴヌクレオチド、 PDM6BAK : 5 -TTT TCT GCA GTA ATA GGC GGC CGC AGG GGG AGG AGG GTC CAT CGA
AGG TCG CGA AGC AGA GAC TGT TGA AAG T-3 (配列番号：19) および PDM6FOR : 5 - TTT TGA ATT CTT ATT AAC CAC CGA ACT GCG GGT GAC GCC AAG CG
C TTG CGG CCG TTA AGA CTC CTT ATT ACG CAG-3 (配列番号：20) により増幅し、ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化ＰＣＲ生成物を同様に消化したｐＨＥ
Ｎ１中へクローンｋし、それによってｃ−ｍｙｃ ｔａｇ配列とｓｕｐＥ ＴＡ
ＧコドンをｐＨＥＮ１から除去することによって構築された。このｐＤＭ６ベク
ターは（Ｇｌｙ）₄ Ｓｅｒリンカー、ファクターＸａ切断部位、遺伝子ＩＩＩ全
長およびストレプタビジン標識ペプチド配列を含有し(Schmidt, T.G.およびSker
ra, A., 1993, Protein Engineering 6 : 109-122)、それらすべてがＮｏｔＩ−
ＥｃｏＲＩ消化とアガロースゲル電気泳動によって、ｐａｌＢリーダー配列、Ｓ
ｆｉＩ、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩ制限部位を、消化されたＮｏｔＩ部位の上流に
残して除去することができる。このクローン化ＤＮＡ結合領域はｐＵＣ１１９中
に見られるｌａｃプロモータにより制御されている。

【００８０】 エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域はヒト骨髄（米国、カリフォルニア州
、パロアルトのクロンテク）から調製したｃＤＮＡより分離した。ｃＤＮＡは当
業者によく知られているさまざまな方法で調整することができる。例をあげると
、スーパースクリプトプラスミドｃＤＮＡ合成キットを用いた下記の方法を使用
することができる。

【００８１】 （ａ）第１の鎖の合成 ５μｌのＤＥＰＣ−処理水に５μｇの骨髄ｍＲＮＡを入れ氷の上で解凍し、２
μｌ（５０ｐｍｏｌ）のｃＤＮＡ合成プライマー(5’-AAAAGCGGCCGCACTGGCCTGAG
AGA(N)₆ -3’)(配列番号：21)をｍＲＮＡに加えて、混合物を７０℃で１０分間 加熱し、ついで氷上で急冷し、さっと回して内容物を管の底に集めた。下記のも
のをついでこの管へ加えた。 １０００ｕ／ｍｌ ＲＮＡｇｕａｒｄ １μｌ 第１鎖バッファー（５ｘ） ４μｌ ０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ １μｌ ２００ｕ／μｌのスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素 ５μｌ この混合物をピペット操作でゆっくりと混合し、３７℃において１時間培養し
、氷上においた。

【００８２】 （ｂ）第２の鎖の合成 下記の試薬を第１の鎖の反応液に加えた。 ＤＥＰＣ−処理水 ９３μｌ 第２鎖バッファー（５ｘ） ３０μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰ ３μｌ １０ｕ／μｌ 大腸菌ＤＮＡリガーゼ １μｌ １０ｕ／μｌ 大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ ４μｌ ２ｕ／μｌ 大腸菌 ＲＮａｓｅ Ｈ １μｌ 反応溶液はｖｏｒｔｅｘで攪拌し、１６℃において２時間保った。２μｌ（１
０ｕ）のＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを加えさらに１６℃において５分保った。反
応液を氷上におき、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えてフェノール−クロロ
フォルムにて抽出し、沈殿させて真空中において乾燥した。

【００８３】 (ｃ）Ｓａｌ Ｉアダプター連結 ｃＤＮＡペレットを２５μｌのＤＥＰＣ−処理水に再懸濁させ、連結を下記の
とおり設定した。 ｃＤＮＡ ２５μｌ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼバッファー（５ｘ） １０μｌ １ｇ／μｌ Ｓａｌ Ｉアダプター＊ １０μｌ １ｕ／μｌ Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ ５μｌ ＊Ｓａｌ Ｉアダプター : TCGACCCACGCGTCCG-3’ (配列番号：22) GGGTGCCGAGGC-5’ (配列番号：23) この連結溶液はゆっくり混合し、１６℃において１６時間保ち、フェノール−
クロロフォルムで抽出し、沈殿させて真空中において乾燥した。ｃＤＮＡ／アダ
プターペレットを４１μｌのＤＥＰＣ−処理水に再懸濁させ、３７℃において２
時間６０ユニットのＮｏｔＩを用いて消化し、ついで、フェノール−クロロフォ
ルムで抽出し、沈殿させて真空中において乾燥した。ｃＤＮＡペレットを１００
μｌのＴＥＮバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５，０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，２５ｍＭ ＮａＣｌ）中に再溶解し、連結されなかったアダプターとｃＤ
ＮＡ小断片（＜４００ｂｐ）を製造者の指示に従って除去するためにセファクリ
ルＳ−５００ ＨＲカラムを用いて粒径分画した。区分をアガロースゲル電気泳
動によりチェックし、塩基対４００未満のｃＤＮＡを含有する画分は捨て、残り
をプールした。

【００８４】 （ｄ）エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域のＰＣＲ増幅 ０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび
１ｘＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，５ｍＭ
ＫＣｌ，０．０１ ％トリトンＸ^m−１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（イギ
リス、サウサンプトンのプロメガ・リミテッド）を含有する２つの５０μｌの反
応液中でそれぞれ２５ｐｍｏｌのプライマーｐＤＭ１２ＦＯＲ（配列番号：２４
） (5’- AAAAGAATTCTGAATGTGTTATTTTAGCTCAGGTCACTCTGACCTGATTATCAAGACCCCACTTCACCCCCT
)およびｐＤＭ１２ＢＡＫ（配列番号：２５） (5’-AAAAGCGGCCGCAGGGGGAGGAGGG
TCCATGGAATCTGCCAAGGAG-3’) を用いて、５μｌ（１５０−２５０ｎｇ）の骨髄 ｃＤＮＡからエストロゲンレセプターをＰＣＲ増幅した。このｐＤＭ１２ＦＯＲ
プライマーはエストロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域の３’−端にアニールし
、２つの停止コドン、３８個の塩基対コンセンサスエストロゲンレセプターＨＲ
Ｅ配列およびＥｃｏＲＩ制限部位を含有する。ｐＤＭ１２ＢＡＫプライマーはエ
ストロゲンレセプターのＤＮＡ結合領域の５’−端にアニールし、（Ｇｌｙ）₄ ＳｅｒリンカーとＮｏｔＩ制限部位を含有する。

【００８５】 反応溶液に鉱物油を重塁し、Ｔｅｃｈｎｅ ＰＨＣ−３サーマルサイクラーで
９４℃１分、６５℃１分、７２℃１分で３０サイクルＰＣＲを行った。反応生成
物をアガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリ
ーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製
）を用いてゲルから精製した。

【００８６】 （ｅ）制限、消化および連結 このＰＣＲ反応によりＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位、（Ｇｌｙ）₄ Ｓｅ
ｒリンカー、停止コドンならびに３８個の塩基対エストロゲンレセプターターゲ
ットＨＲＥヌクレオチド配列がエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域配列（図
１参照）に付け加わった。このＤＮＡ ＰＣＲ 断片およびターゲットｐＤＭ６
ベクター（約５００ｎｇ）は１時間３７℃においてＮｏｔＩとＥｃｏＲＩ消化さ
れ、アガロースゲル電気泳動とジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カ
リフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）抽出を用いてＤＮＡが精製された。
このエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域カセットをＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消
化ｐＤＭ６ ベクター内へ１６℃において一晩連結され、フェノール／クロロフ
ォルム抽出と沈殿形成の後、ＴＧ１ 大腸菌（遺伝子型：Ｋ１２（Δｌａｃ−ｐ
ｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ⁺Ｂ⁺， Ｌ
ａｃＩ⁴， ＬａｃＺΔ１５）中へエレクトロポレートされ１％のグルコースと １００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレート上で培養した
。コロニーを３７℃において一晩増殖させた。各コロニーを５ｍｌの１％のグル
コースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹに入れ、３７℃に
おいて一晩増殖させた。二本鎖ファージミド ＤＮＡはウイザードＳＶプラスミ
ドＤＮＡ分離キットを用いて分離し、プリズム・ダイデオキシ・サイクル・配列
決定キット（イギリス、ランカシア、ウォリントンのパーキン・エルマー製）に
よりＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６） (5’-GTAAAACGACGGCCAGT)およびＭ１３Ｒ
ＥＶ（配列番号：２７） (5’-GGATAACAATTTCACACAGG)オリゴヌクレオチドを用 いて配列を確認した。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限部位間のｐＤＭ１２ Ｐ
ＤＣＰ表示ベクターＤＮＡ配列を図１に示す。

【００８７】 実施例２ ランダム感作ヒトリンパ球ｃＤＮＡをｐＤＭ１２へ挿入し、マスタ
ーＰＤＣＰストックを調製する。

【００８８】 ペプチドのライブラリは当業者に公知の様々な方法で構築することができる。
この例では部分的に精製された細胞ポピュレーションから分離されたｍＲＮＡか
ら調製されたランダム感作ｃＤＮＡからペプチドライブラリを構築する方法につ
いて述べる。

【００８９】 ｍＲＮＡはｐｏｌｙＡＴｒａｃｔ １０００ ｍＲＮＡ分離キット（イギリス
、サウサンプトンのプロメガ製）を用いて約１億個のヒト末梢血リンパ球から分
離した。この細胞粒を４ｍｌの抽出バッファー（４Ｍ グアニジンチオシアネー
ト、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ７．１、２％β−メルカプトエタノール
）に再懸濁した。８ｍｌのあらかじめ熱した（７０℃）希釈バッファー（６ｘＳ
ＳＣ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５％ ＳＤ
Ｓ、１％β−メルカプトエタノール）をこのホモジネートへ添加し、逆さまにし
て十分に混合した。１０μｌのビオチン化オリゴ−ｄＴ（５０ｐｍｏｌ／μｌ）
を加え、混合して混合物を７０℃において５分間保った。リンパ球細胞の溶解産
物を２ｍｌの無菌チューブ６本に移し、マイクロ遠心器に入れて周囲温度におい
て１０分間１３，０００ｒｐｍで回転させ透明な溶解産物を製造した。この遠心
分離の間、ストレプタビジンでコートした磁気ビーズを再懸濁し、６ｍｌを無菌
の５０ｍｌのファルコン管に移し、磁気スタンドの上にすべてのビーズが捕捉さ
れるまで水平に置いた。上澄みを注意深く取り除き、ビーズを改めて６ｍｌの０
．５ｘＳＳＣに懸濁し、捕捉を繰り返した。このようにして３回洗浄した後、ビ
ーズを最終的に６ｍｌの０．５ｘＳＳＣに再懸濁した。透明化した溶解産物をこ
の洗浄したビーズに加え、逆さまにして混合し周囲温度にて２分間保ち、ついで
磁気スタンドに水平に置いてビーズを捕捉した。ビーズをゆっくりと２ｍｌの０
．５ｘＳＳＣに再懸濁し、無菌２ｍｌねじ蓋付きチューブへ移し、ふたたび垂直
に置いてビーズを捕捉し、洗浄液を捨てた。さらに２回この洗浄を繰り返した。
１ｍｌのＤＥＰＣ−処理水をビーズに加えてゆっくりと混合した。ビーズをもう
いちど捕捉し、溶出したｍＲＮＡを無菌チューブに移した。５０μｌを電気泳動
してｍＲＮＡの質と量をチェックし、残りを１．５ｍｌの無菌ねじ蓋付きチュー
ブに入れ、０．１体積の３Ｍ酢酸ナトリウムと３体積の無水エタノールにより−
８０℃において一晩沈殿させ、４アリコートとした。

【００９０】 二本鎖ｃＤＮＡを５μｇのリンパ球ｍＲＮＡをテンプレートとして用いて実施
例１で記載したように合成した。このｃＤＮＡはすべての合成されたｃＤＮＡの
３’−端に存在し、ＮｏｔＩ制限部位を取り込んでいる、実施例１に記載のｃＤ
ＮＡ合成オリゴヌクレオチドにアニールするオリゴヌクレオチド、ＣＤＮＡＰＣ
ＲＦＯＲ （配列番号：２８） (5’ -AAAGCGGCCGCACTGGCCTGAGAGA)とＣＤＮＡ ＰＣＲＢＡＫ１、ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ２、およびＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ３の等
モル混合物を用いてＰＣＲ増幅した。 ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ１： （配列番号：２９） 5’-AAAAGGCCCAGCCGGCCATGGC
CCAGCCCACCACGCGTCCG, ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ２： （配列番号：３０） 5’-AAAAGGCCCAGCCGGCCATGGC
CCAGTCCCACCACGCGTCCG, ＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ３： （配列番号：３１） 5’-AAAAGGCCCAGCCGGCCATGG
CCCAGTACCCACCACGCGTCCG, これら３つすべてがｃＤＮＡの５’−端に見いだされるＳａｌＩアダプター配
列にアニールし、このｃＤＮＡ ５’−端でＳｆｉＩ制限部位を取り込んでいる
。実施例１に記載のように１回の反応に２μｌのｃＤＮＡ（５０ｎｇ）を用いて
ＰＣＲ反応を９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の２５サイクルで１０回行っ
た。反応物はプールし、２０μｌのアリコートをアガロースゲル電気泳動により
チェックし、残りをフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿さ
せ、１００μｌの無菌水に再懸濁した。５μｇのｐＤＭ１２ベクターＤＮＡとリ
ンパ球ｃＤＮＡ ＰＣＲ生成物をＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ消化し、フェノール／クロ
ロフォルムで抽出し、クロマスピン１０００スピンカラム（アメリカ合衆国、カ
リフォルニア州パロ・アルトのクロンテク製）上で、７００ｇ室温において２分
間遠心分離を行って分粒しＤＮＡ小断片を除去した。消化ｐＤＭ１２およびリン
パ球ｃＤＮＡはエタノールで沈殿させ、１６℃において１６時間一緒に連結した
。連結したＤＮＡを沈殿させＴＧ１大腸菌にエレクトロポレートした。細胞をキ
ュベットあたり１ｍｌのＳＯＣ培地において３７℃において１時間増殖し、１％
のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレー
ト上で培養した。ライブラリサイズを評価するために、エレクトロポレートした
バクテリアを１０^-4、１０^-5、１０^-6に希釈して培養した。コロニーは３０℃に
おいて一晩増殖した。２ｘ１０⁸ アンピシリン耐性のコロニーを寒天プレート上
で回収した。バクテリアをついでプレートから削り取り、２０％グリセロール、
１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した４０ｍｌの２
ｘＴＹブロスへと入れた。５ｍｌを１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのア
ンピシリンを追加した２０ｍｌの２ｘＴＹ培養ブロスに加え、１０¹¹のカナマイ
シン耐性ユニット（ｋｒｕ）Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを３７℃において３
０分間振盪させずに感染させ、その後２００ ｒｐｍで３０分振盪した。感染バ
クテリアを２５μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍのアンピシリンおよ
び２０μＭのＩＰＴＧを追加した２００ｍｌの２ｘＴＹのブロスに移し、３７℃
において２００ｒｐｍで振盪させながら一晩培養した。バクテリアを５０ｍｌの
ファルコンチューブで２０分間４０００ｒｐｍでペレット化し、４０ｍｌの２．
５Ｍ ＮａＣｌ／２０％ＰＥＧ６０００を２００ｍｌの粒子上澄みに加えて激し
く混合し、氷上で１時間保ちＰＤＣＰ粒子を沈殿させた。粒子は２５０ｍｌのオ
ークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃１１０００
ｒｐｍで３０分間ペレット化し、その後ピペットでＰＥＧ／ＮａＣｌのすべての
痕跡を取り除いた後、２ｍｌのＰＢＳバッファー中に再懸濁し、マイクロ遠心器
で１３５００ｒｐｍで５分間回転してバクテリアの破片を除去した。上澄みは０
．４５μｍのポリサルホンシリンジフィルターで濾過し、−２０℃において保存
した。

【００９１】 実施例３ 抗ヒトカッパ抗体に対する選択を複数回繰り返すことによってヒト
免疫グロブリンカッパＬ鎖を分離する。

【００９２】 ライブラリ選択の第一回目には、７０ｘ１１ｍｍのＮＵＮＣマキシソープイム
ノチューブ（イギリス、スコットランドのペーズリーにある、ライフ・テクノロ
ジーズ製）にＰＢＳに溶かした１０μｇ／ｍｌの抗ヒトカッパ抗体（イギリス、
サセックス、クローリーダウンにあるセララボ製）２．５ｍｌを、３７℃におい
て２時間吸着させた。このチューブをＰＢＳで３回すすぎ（満たしてから空にす
る）３ｍｌのＰＢＳ／２％ＢＳＡで３７℃において２時間ブロックし、前回と同
様に洗浄した。４ｘ１０¹³ａ．ｒ．ｕ．のＰＤＭ１２−リンパ球ｃＤＮＡ ＰＤ
ＣＰストックを２ｍｌの２％ＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に加え
、３０分間血液ミキサー上で培養し、その後９０分間周囲温度に保った。このチ
ューブをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回洗浄し、その後ＰＢＳのみを
使用しさらに１０回洗浄した。結合した粒子を周囲温度において血液ミキサーの
上で１ｍｌの新たに調製した０．１Ｍのトリエチルアミンに１０分間溶出した。
溶離した粒子をｐＨ７．４の０．５ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓへ加え、ｖｏｒｔｅｘ
で手早く攪拌し、氷上に移した。

【００９３】 中和した粒子を１０ｍｌの対数期ＴＧ１Ｅ大腸菌（吸光度：ＯＤ_600nm ０． ３−０．５）に加え、３７℃において振盪させずに３０分間培養し、つづいて２
００ｒｐｍで３０分間振盪した。感染させた培養物の１０^-3、１０^-4、および１
０^-5希釈物を調製し、回収された粒子の数を推定し、残りは４０００ｒｐｍで１
０分間回転させ、ペレットを３００μｌの２ｘＴＹ培地にｖｏｒｔｅｘで攪拌し
再懸濁した。バクテリアを１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリン
を追加した２ｘＴＹ寒天プレートに置いた。コロニーを３０℃において一晩増殖
した。

【００９４】 第１回の選択で回収したバクテリアから、実施例２に記載のように、１００ｍ
ｌの一晩の培養物を用いてＰＤＣＰストックを調製した。２５０μｌの第１回増
幅ＰＤＣＰストックをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１２回洗浄し、ついで
ＰＢＳのみで１２回洗浄したチューブを用いて、前述したように、抗ヒトカッパ
抗体に対して選択した。

【００９５】 選択されたクローンを同定するために、第２回の選択から回収された８８の個
々のクローンの抗ヒトカッパ抗体に対する結合をＥＬＩＳＡを用いて試験した。
個々のクローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと１％のグルコースを追加し
た１００μｌの２ｘＴＹに入れ、９６穴のプレート（コスター）で３７℃におい
て４時間２００ｒｐｍで振盪して培養した。それぞれの培養物２５μｌを、同じ
培地に２５μｌ／ｗｅｌｌの１０⁷ ｋ．ｒ．ｕ Ｍ１３Ｋ０７カナマイシン耐性
ヘルパーファージを加えたものを入れた新しい９６穴プレートへ移し、３７℃に
おいて振盪させずに培養し、ついで３７℃においてさらに３０分２００ｒｐｍで
振盪して培養した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、２５μｇ／ｍｌのカナマ
イシンおよび２０μＭのＩＰＴＧを追加した１６０μｌの２ｘＴＹを各井戸に加
え、３７℃において２００ｒｐｍで振盪しながら粒子の増幅を１６時間続けた。
バクテリア培養物をマイクロタイタープレートキャリアーに入れ、ベンチトップ
遠心器で２０００ｇで１０分間４℃において回転し、ＥＬＩＳＡに使用するバク
テリアと培養上澄み液をペレット化した。

【００９６】 Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／
ｗｅｌｌのＰＢＳに溶かした２００ｎｇ／ｗｅｌｌの抗ヒトカッパ抗体を１時間
の間３７℃において吸着させた。このプレートを２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰ
ＢＳで洗浄し、２００μｌ／ｗｅｌｌの２％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて３７℃に
おいて１時間ブロックし、ついで２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄した
。５０μｌのＰＤＣＰ培養物上澄みを５０μｌ／ｗｅｌｌの４％のＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む各井戸に加え、周囲温度において１時間結合
させた。このプレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２
０で３回洗浄し、２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。結合したＰＤ
ＣＰを１００μｌ／ｗｅｌｌの２％のＢＳＡ／ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０に１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（ファーマシア）
を用いて１時間周囲温度において検出し、プレートを上記のように６回洗浄した
。このプレートを周囲温度において５分間、１００μｌ／ｗｅｌｌの新しく調製
したＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質バッファー（
０．００５％Ｈ₂Ｏ₂，２４ｍＭのクエン酸に溶解した０．１ｍｇ／ｍｌ ＴＭＢ
／５２ｍＭの燐酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２）で現像した。この反応を１
００μｌ／ｗｅｌｌの１２．５％Ｈ₂ＳＯ₄を用いて停止し、４５０ｎｍで読みと
った（結合クローンのＥＬＩＳＡデータは図２に示す）。

【００９７】 これらのクローンをついでＭ１３ＲＥＶプライマー（配列番号：２７）を用い
て実施例１と同様に配列決定した。分離クローンのうちの２つの配列を図３に示
す（配列番号：７〜１０）。

【００９８】 実施例４ ｐＤＭ１４ Ｎ−末端表示ベクターの構築 第２エストロゲンレセプターＨＲＥ配列などの第２のＤＢＤ結合配列を含むベ
クターを設計し、それによってＰＤＣＰあたりの表示ペプチドの数を増加させる
ことは有用であろう。ピールその他(1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 1
038-1042)は多数のエストロゲンレセプターＨＲＥ配列を記載している。これら の配列はｐＤＭ１２にクローンされたのとは異なる１つのＨＲＥ配列を規定する
のに用いられた。それを第２Ｎ−末端表示ベクター（ｐＤＭ１４）を製造するの
に使用した。オリゴヌクレオチド：5’-AAAAGAATTCGAGGTTACATTAACTTTGTTCCGGTC
AGACTGACCCAAGTCGACCTGAATGTGTTATTTTAG-3’（配列番号：３２）を合成し、これ
を使用して、実施例１に記載のようにテンプレートとして１００ｎｇ ｐＤＭ１
２ベクターＤＮＡを使用し、ｐＤＭ１２をＰＣＲによってｐＤＭ１２ＢＡＫオリ
ゴヌクレオチドで突然変異させた。その結果得られたエストロゲンレセプターＤ
ＢＤおよびＳａｌＩ制限酵素部位で分離された２つのＨＲＥ配列を含有したＤＮ
Ａ断片をＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ制限酵素により消化し、実施例１に記載のように
、ＮｏｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化ｐＤＭ１２ベクターＤＮＡ中にクローン化し、ｐＤ
Ｍ１４を生成した。ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ制限酵素部位間のｐＤＭ１４の
配列をＤＮＡ塩基配列決定法によってチェックした。これら２つの部位間の最終
的なベクター配列を図４に示す（配列番号：１１および１２参照）。

【００９９】 実施例５ ｐＤＭ１６ Ｃ−末端表示ベクターの構築 ＰＤＣＰ上のＤＢＤのＣ−末端へ融合したペプチドの表示を示すために、適当
なベクターｐＤＭ１６を生成した。ＰＤＭ１６中で、このｐｅｌＢリーダーＤＮ
Ａ配列は、ＨＲＥ ＤＮＡ配列の上流のＤＢＤ配列のＣ−末端側に付属している
、ｐＤＭ１２とｐＤＭ１４に見られる複数のクローン化部位およびＧｌｙ₄Ｓｅ ｒ リンカーＤＮＡ配列を除去し、直接エストロゲンレセプターＤＢＤ配列へと
融合する。

【０１００】 このベクターを生成するには、Ｔｅｃｈｎｅ Ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイク
ラーを用いて９４℃において１分、６０℃において１分、７２℃において１分の
３０サイクルで２つの別々のＰＣＲ反応を行う。反応生成物はアガロースゲル上
で電気泳動し、切除し、ＭｅｒｍａｉｄあるいはＧｅｎｅｃｌｅｎ ＩＩキット
をそれぞれ製造者の指示（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤにあるビ
オロール）にしたがって使用してゲルから精製した。

【０１０１】 第１の５’−未翻訳部分およびｐｅｌＢリーダーＤＮＡ配列をそれぞれ５０
ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドｐｅｌＢＦＯＲ（配列番号：３３）(5’-CCTTGGC
AGATTCCATCTCGGCCATTGCCGGC-3’)およびＭ１３ＲＥＶ（配列番号：２７）（前記
参照）を０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓＤＮＡポリメ
ラーゼおよび１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ９．２、６０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（イギリス、ケンブ リッジのストラータジーン・リミテッド）を含有する１００μｌの反応液を用い
て１００ｎｇのｐＤＭ１２ベクターＤＮＡから増幅した。

【０１０２】 第２の、ｐｅｌＢリーダー配列の３’−末端およびエストロゲンレセプターＤ
ＢＤをそれぞれ５０ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドｐｅｌＢＢＡＫ（配列番号：
３４） (5’-CCGGCAATGGCCGAGATGGAATCTGCCAAGG-3’)およびｐＤＭ１６ＦＯＲ（
配列番号：３５）(5’-TTTTGTCGACTCAATCAGTTATGCGGCCGCCAGCTGCAGGAGGGCCGGCTG
GGCCGACCCTCCTCCCCCAGACCCCACTTCACCCC-3’)を０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ユ
ニットのＴａｑｐｌｕｓＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘハイソルトＰＣＲ反応バ
ッファー（イギリス、ケンブリッジのストラータジーン・リミテッド）を含有す
る１００μｌの反応液を用いて１００ｎｇのｐＤＭ１２ベクターＤＮＡから増幅
した。ゲル精製の後、両生成物を合わせ、前述した方法でこの２つの生成物を１
つに結合するために０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポ
リメラーゼおよび１ｘハイソルトＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ ｐＨ９．０、５ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ^m −１０ ０、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂） （イギリス、サウサンプトンのプロメガ・リミ テッド）を含有する１００μｌの反応液中で最後のＰＣＲ増幅を行った。

【０１０３】 得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ制限酵素消化し、実施例１に
記載したようにＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ消化ｐＤＭ１４ベクターＤＮＡへクロ
ーン化し、ｐＤＭ１６を生成した。ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩ制限酵素部位間の
ｐＤＭ１６の配列をＤＮＡ塩基配列決定法でチェックした。これら２つの部位の
間の最終ベクター配列を図５に示す（配列番号：１３および１４参照）。

【０１０４】 実施例６ ヒトＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＣ−末端断片のＰＤＣＰ表面上の表示
ペプチドのｃＤＮＡライブラリは当業者に公知のさまざまな方法で構築するこ
とができる。ペプチドライブラリの構築によく使用される１つの方法は、ポリＡ
＋ ｍＲＮＡから調製されるオリゴｄＴ 感作ｃＤＮＡを使用するものである。
この方法においては、ｃＤＮＡのクローン化を容易にするために第１の鎖合成は
Ｔ_n（ここでｎは通常１０から２０の塩基）およびＮｏｔＩなどの制限酵素部位 を含有するｍＲＮＡの３’−端ポリＡ末端へアニールするオリゴヌクレオチドを
用いて行われる。この方法によってクローン化されたｃＤＮＡ は通常ポリＡ末
端、３’−末端未翻訳部位、およびこのタンパクのＣ−末端コード化領域からな
る。ペプチドのＰＤＣＰ上のＣ−末端表示の例として、前述した方法によって構
築されたライブラリから分離されたヒトｃＤＮＡを示す。

【０１０５】 タンパクＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎは細胞−細胞接着に関与する細胞表面分子であ
る。ヒトタンパクのＣ−末端細胞質領域（ゲンバンク、データベース、アクセス
番号：Ｍ３４０６４）をニワトリＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＣ−末端２３アミノ酸
に対して製造された市販のモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡカタログ番号：Ｃ−
１８２１）を用いて認識した。このＣ−末端９９アミノ酸、３’−未翻訳部位お
よびポリＡ末端（ポリＡ末端の３’−端に存在するＮｏｔＩ部位）をコード化す
る１．４ｋｂのヒトｃＤＮＡ断片を約２０ｎｇ ｐＤＭ７−ＮＣＡＤ＃Ｃから、
それぞれ２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）と
ＣＤＮＰＣＲＢＡＫ１（配列番号：２９）（前記参照）を用いて０．１ｍＭのｄ
ＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓ ＮＤＡポリメラーゼ、および１ｘハ
イソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．２、６
０ｍＭ ＫＣｌおよび２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（イギリス、ケンブリッジのストラ ータジーン・リミテッド）を含有する５０μｌの反応液中、Ｔｅｃｈｎｅ Ｐｒ
ｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１分、７２℃１分の３
０サイクルで増幅した。ゲル精製とＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ制限酵素による消化
の後、ＰＣＲ生成物を実施例１に記載したものと類似の手順によってｐＤＭ１６
内にクローン化した。

【０１０６】 挿入部を含有したクローンは、実施例３に記載のように調製した９６の個々の
ＰＤＣＰ培養物によりＥＬＩＳＡで同定した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏ
ｎ４ ＥＬＩＳＡプレートに１００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに１：２５０で希釈
した抗ｐａｎ ｃａｄｈｅｒｉｎモノクローナル抗体を４℃において一晩吸着さ
せた。このプレートを３ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌ ＰＢＳで洗浄し、１時間３７
℃において２００μｌ／ｗｅｌｌの２％Ｍａｒｖｅｌ脱脂粉乳／ＰＢＳでブロッ
クし、ついで２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで洗浄した。５０μｌ ＰＤＣ
Ｐ培養物上澄みを５０μｌ／ｗｅｌｌの４％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳを含有する
各井戸に加え、周囲温度で１時間結合させた。このプレートを２００μｌ／ｗｅ
ｌｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ついで２００μｌ／ｗｅ
ｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。結合したＰＤＣＰは２％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳ
に１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰコンジュゲート（ファーマシア）１
００μｌ／ｗｅｌｌで１時間周囲温度において検出し、このプレートを前述した
のように６回洗浄した。プレートを１００μｌ／ｗｅｌｌの新しく調製したＴＭ
Ｂ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質バッファー（０．００
５％のＨ₂Ｏ₂、２４ｍＭのクエン酸に溶かした０．１ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ／５２
ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２）で１５分間周囲温度において現
像した。反応を１００μｌ／ｗｅｌｌの１２．５％のＨ₂ＳＯ₄で停止させ、４５
０ｎｍで読みとった。ＥＬＩＳＡ陽性クローン挿入部およびＤＢＤ結合のヌクレ
オチド配列をオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）（実施例１参
照）とＯＲＳＥＯＢＡＫ（配列番号：３６） (5’-TGTTGAAACACAAGCGCCAG-3’)
を使用してＤＮＡ塩基配列決定法によりチェックした。

【０１０７】 ５０倍に濃縮したＣ−末端Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ ＰＤＣＰ粒子ストックを未
感染ＴＧ１クローンを１％のグルコースと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追
加した１ｍｌの２ｘＴＹ培養物ブロスで５時間３７℃において２００ｒｐｍで振
盪させつつ培養し、１０⁸カナマイシン耐性ユニット（ｋｒｕ）Ｍ１３Ｋ０７ヘ ルパーファージによる感染を３７℃において３０分間振盪させずに行ない、つい
で３０分間２００ｒｐｍ振盪させることにより調製した。感染バクテリアを２５
μｇ／ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍのアンピシリンおよび２０μＭのＩ
ＰＴＧを追加した２０ｍｌの２ｘＴＹのブロスに移し、３０℃において２００ｒ
ｐｍで振盪させながら一晩培養した。バクテリアを５０ｍｌのファルコンチュー
ブで２０分間４０００ｒｐｍでペレット化し、４ｍｌの２．５Ｍ ＮａＣｌ／２
０％ＰＥＧ６０００を２０ｍｌのＰＤＣＰ上澄みに加えて、激しく混合し、氷上
で１時間保ち粒子を沈殿させた。

【０１０８】 粒子は５０ｍｌのオークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ遠
心器で４℃１１０００ｒｐｍで３０分間ペレット化し、その後ピペットでＰＥＧ
／ＮａＣｌのすべての痕跡を取り除いた後、ＰＢＳバッファー中に再懸濁し、マ
イクロ遠心器で１３５００ｒｐｍで５分間回転してバクテリアの破片を除去した
。上澄みは０．４５μｍのポリサルホンシリンジフィルターで濾過した。濃縮さ
れたストックは２倍階段希釈し、ＥＬＩＳＡにおいて前述したように抗ｐａｎ−
ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を吸着したプレートに対して使用した（図６参照）。

【０１０９】 この実施例はＥＬＩＳＡにおいて検出可能なＣ−末端ＤＢＤ−ペプチド融合Ｐ
ＤＣＰが製造できるというＰＤＣＰを使用したＣ−末端表示の原理を示し、この
方法によるオリゴｄＴ感作ｃＤＮＡライブラリの表示可能性を示す。

【０１１０】 実施例７ ＰＤＣＰ表面上のヒトプロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼのビオ
チン化Ｃ−末端領域のｉｎ ｖｉｖｏ表示 実施例６はＣ−末端がＤＢＤと融合するのでヒトＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎのＣ−
末端領域がＰＤＣＰの表面に発現可能であることを示している。ここではもう１
つのヒトタンパクプロピニルＣｏＡカルボキシラーゼα鎖Ｃ−末端領域（ゲンバ
ンク、アクセス番号：Ｘ１４６０８）が同様に表示できることを示す。これによ
りこの方法の一般性が示唆される。

【０１１１】 プロピニルＣｏＡカルボキシラーゼα鎖（ＰＣＣ）のαサブユニットは７０３
のアミノ酸を含有し通常ポジション６６９でビオチン化されている。このタンパ
クがバクテリア細胞中で発現するときに生じているように、このＰＤＣＰ上に表
示されるＰＣＣペプチドがビオチン化されていることは実例で明らかにされてい
る(Leon-Del-Rio & Gravel ; 1994, J. Biol. Chem. 3, 22964-22968)。

【０１１２】 Ｃ−末端９５アミノ酸、３’−未翻訳部分およびポリＡ末端（ポリＡ末端の３
’−端に存在するＮｏｔＩ部位）をコード化するＰＣＣαの０．８ｋｂヒトｃＤ
ＮＡ断片を増幅し、約２０ｎｇ ｐＤＭ７−ＰＣＣ＃Ｃからそれぞれ２５ｐｍｏ
ｌのオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯＲ（配列番号：２６）およびＣＤＮＰＣＲＢ
ＡＫ１（配列番号：２９）を用いて実施例６に記載のように、ｐＤＭ１６内へク
ローン化した。

【０１１３】 挿入部を含有したクローンは、抗ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体の代わりにストレプタ
ビジンを２５０ｎｇ／ｗｅｌｌでＥＬＩＳＡプレートに吸着させたことを除き、
実施例６に記載のようにＥＬＩＳＡによって同定された。ＥＬＩＳＡ陽性クロー
ン挿入部およびＤＢＤ結合のヌクレオチド配列をオリゴヌクレオチドＭ１３ＦＯ
Ｒ（配列番号：２６）とＯＲＳＥＯＢＡＫ（配列番号：３６）（前記参照）を使
用してＤＮＡ塩基配列決定法によりチェックした。５０倍に濃縮したＣ−末端Ｐ
ＣＣ ＰＤＣＰ粒子ストックを調製し、実施例６に記載のようにストレプタビジ
ンに対してＥＬＩＳＡで試験した（図７参照）。

【０１１４】 この実施例はペプチドがＰＤＣＰ上でＣ−末端融合として表示されうるのみな
らず、ｉｎ ｖｉｖｏ修飾ペプチドも表示されうることを示している。

【０１１５】 実施例８ ヒトｓｃＦｖ ＰＣＤＰ表示ライブラリの構築 この実施例は免疫されていないヒトからのｓｃＦｖのヒト抗体ライブラリの作
成を記載する。ＳｃＦｖ断片のＰＣＲアセンブリに対する全体的な戦略はMarks,
J. D. et al. 1991, J. Mol. Biol. 222 : 581-597によって用いられたものと 類似している。このライブラリを構築するのに使用された抗体遺伝子オリゴヌク
レオチドはMarke et al.の論文およびＫａｂａｔデータベース(Kabat, E. A. et
al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4^th edition. U.S.
Department of Health and Human Services. 1987)から得た配列データを使用 して得た。３つのリンカーオリゴヌクレオチドはZhou et al. (1994, Nucleic A
cids Res., 22 : 888-889)に記載されており、ここで使用したすべてのオリゴ ヌクレオチドは表１に列挙した。

【０１１６】 まず、ｍＲＮＡを末梢血リンパ球から分離し、４つの別々のｃＤＮＡ合成プラ
イマーを使用して４つの抗体遺伝子ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇκおよびＩｇλのレパ
ートリーのためにｃＤＮＡを調整した。ＶＨ遺伝子をＩｇＤとＩｇＭ感作ｃＤＮ
Ａから増幅し、ＶＬ遺伝子をＩｇκおよびＩｇλ感作ｃＤＮＡから増幅した。増
幅Ｈ鎖ＤＮＡ、Ｌ鎖ＤＮＡそれぞれのセットの一部を１５アミノ酸（Ｇｌｙ₄ Ｓ
ｅｒ）₃をコード化するリンカーＤＮＡの別の一片によってスプライスした(Hust
on, J.S. et al. 1989, Gene, 77 : 61)。リンカー配列がＪＨ，ＶκおよびＶλ
ファミリープライマーセット（表１）に取り込まれる結果、このＶＨ ＰＣＲ生
成物の３’−末端とＶＬ ＰＣＲ 生成物の５’−末端はリンカー配列に重なる
。各ＶＨ−リンカーあるいはリンカー−ＶＬ ＤＮＡ生成物をその後ＶＨあるい
はＶＬ ＤＮＡでスプライスし、ＶＨ−リンカー−ＶＬ構造の一次ｓｃＦｖ生成
物を製造する。このｓｃＦｖ生成物をついで増幅し、ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ断片と
してｐＤＭ１２中にクローン化して、ＴＧ１にエレクトロポレートし濃縮ＰＤＣ
Ｐストックを調整した。

【０１１７】 ｍＲＮＡ分離とｃＤＮＡ合成 ヒトリンパ球ｍＲＮＡを実施例２に記載のように精製した。ｃＤＮＡ反応を別
々にＩＧＤＣＤＮＡＦＯＲ（配列番号：３７）、ＩＧＭＣＤＮＡＦＯＲ（配列番
号：３８）、ＩＧκＣＤＮＡＦＯＲ（配列番号：３９）およびＩＧλＣＤＮＡＦ
ＯＲ（配列番号：４０）オリゴヌクレオチドを使用して行った。２０μｌのヌク
レアーゼを含まない水に入れた約５μｇのｍＲＮＡに各プライマーを５０ｐｍｏ
ｌずつ加え、７０℃において５分加熱し、急速に氷上において冷却し、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰおよび２０００ユニットのスーパースクリプトＩ
Ｉ逆転写酵素（イギリス、スコットランド、ペーズリーのライフ・テクノロジー
ズ）を含有する最終的に１００μｌの反応溶液を調製した。反応液を３７℃にお
いて２時間保ち、ついで９５℃において５分間熱した。

【０１１８】 一次ＰＣＲ 一次ＰＣＲ増幅においては、ＩｇＭとＩｇＤ ｃＤＮＡのためのＪＨＦＯＲプ
ライマーセット（配列番号：４１〜４４）の等モル混合物か、またはＩｇκある
いはＩｇλ ｃＤＮＡのためのそれぞれＳＣＦＶκＦＯＲ（配列番号：５１）あ
るいはＳＣＦＶλＦＯＲ（配列番号５２）のいずれかにより、すなわちＶＨ１Ｂ
ＡＫとＪＨＦＯＲセット；Ｖκ２ＢＡＫ（配列番号：５４）とＳＣＦＶκＦＯＲ
（配列番号：５１）；Ｖλ３ａＢＡＫ（配列番号：６６）とＳＣＦＶλＦＯＲ
（配列番号：５２）など、ファミリー特異性プライマーごとに増幅は別途設定
された。したがって、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇκ ｃＤＮＡに対しては６つの
異なる反応が設定され、Ｉｇλ ｃＤＮＡに対しては７つの異なる反応が設定さ
れた。２μｌのｃＤＮＡ、２５ｐｍｏｌの適当なＦＯＲおよびＢＡＫプライマー
、０．１ｍＭ ｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラー
ゼ、さらに１ｘハイ・ソルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ ｐＨ９．２、６０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（イギリス、ケンブ リッジのストラータージーン製）を含有する５０μｌの反応混合液を調製した。

【０１１９】 反応液はＴｅｃｈｎｅ ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分
、６０℃１分、７２℃２分の３０サイクルに付しその後７２℃において１０分増
幅した。全２５反応生成物のそれぞれ５０マイクロリットルをアガロースゲル上
で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメ
リカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精
製した。ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇκおよびＩｇλの反応生成物のすべてのセットを
プールし、前記の４つのレパートリーのそれぞれに対するＶＨあるいはＶＬ Ｄ
ＮＡセットを生成した。これらはついで約２０ｎｇ／μｌに調製した。

【０１２０】 リンカーの調製 リンカー生成物を５ｎｇのＬＩＮＫＡＭＰ３Ｔ（配列番号：７６）テンプレー
トオリゴヌクレオチド、５０ｐｍｏｌのＲＩＮＫＡＭＰ３（配列番号：７４）プ
ライマーとＬＩＮＫＡＭＰ５（配列番号：７５）プライマー、０．１ｍＭ ｄＮ
ＴＰ、２．５ユニットＴａｑｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ、および１ｘハイソ
ルトＰＣＲ反応バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．２、６０ｍ
Ｍ ＫＣｌ，２ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（イギリス、ケンブリッジのストラータジー ン・リミテッド製）を含有する８つの１００μｌ反応物から調製した。反応液は
Ｔｅｃｈｎｅ ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１
分、７２℃１分の３０サイクルに付し、その後７２℃において１０分増幅した。
全反応生成物は２％の低融点アガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者
の指示に従いＭｅｒｍａｉｄキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホー
ヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製し５ｎｇ／μｌに調整した。

【０１２１】 一段目の結合 各レパートリー用に５ｎｇのリンカーＤＮＡと２０ｎｇのＶＨあるいはＶＬ
ＤＮＡをＩｇＭまたはＩｇＤＶＨ用には５０ｐｍｏｌのＬＩＮＫＡＭＰＦＯＲお
よびＶＨ１−６ＢＡＫセットあるいは、５０ｐｍｏｌのＬＩＮＫＡＭＰＢＡＫ、
Ｉｇκ用のＳＣＦＶκＦＯＲ、あるいはＩｇλ用のＳＣＦＶλＦＯＲのいずれか
を含む、０．１ｍＭｄＮＴＰ、２．５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、
１ｘＰＣＲ 反応バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０、５
ｍＭ ＫＣｌ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ^m −１００、１．５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ₂）（イギリスのサウサンプトンのプロメガ・リミテッド製）を含有する１ ００μｌの反応混合液中で４つの結合反応を行った。反応液はＴｅｃｈｎｅ ｐ
ｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６０℃１分、７２℃２分の
３０サイクルに付し、その後７２℃において１０分増幅した。全反応生成物はア
ガロースゲル上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩ
Ｉキット（アメリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用
いてゲルから精製し、２０ｎｇ／μｌに調製した。

【０１２２】 最終結合および再増幅 最終ｓｃＦｖ ＤＮＡ生成物を調製するために、前記の４つの最終レパートリ
ー（ＩｇＭ ＶＨ−Ｖκ，ＶＨ−Ｖλ；ＩｇＤ ＶＨ−Ｖκ，ＶＨ−Ｖλ）のそ
れぞれのために、ＶＨ−リンカー プラスＶＬ ＤＮＡ用には５つの１００μｌ
の反応液、ＶＨプラスリンカー−ＶＬ ＤＮＡ用には５つの１００μｌの反応液
を前記ステップ（ｄ）に記載のように、各構成要素のＤＮＡ２０ｎｇをテンプレ
ートとして用いて、反応させた。反応生成物はアガロースゲル上で電気泳動し、
切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（アメリカ合衆国、カ
リフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから精製し、２０ｎｇ
／μｌに調整した。４つのレパートリーのそれぞれをついでそれぞれ２ｎｇの結
合生成物を、５０ｐｍｏｌ ＶＨＢＡＫ１−６（配列番号：５３〜５８）とＪＫ
ＦＯＲ（配列番号：６６〜７０）またはＪλＦＯＲ（配列番号：７１〜７３）プ
ライマーセットのいずれかを含有し、さらに０．１ｍＭのｄＮＴＰ、２．５ユニ
ットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび１ｘＰＣＲ反応バッファー（１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ９．０，５ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％トリトンＸ^m −１００、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）（イギリス、サウサンプトンのプロメガ・ リミテッド）を含有する１００μｌの反応溶液中で再増幅した。レパートリーご
とに３０の反応を行い、クローニングに十分なＤＮＡを生成した。反応液はＴｅ
ｃｈｎｅ ｐｒｏｇｅｎｅサーマルサイクラーにより９４℃１分、６５℃１分、
７２℃２分の２５サイクルに付し、その後７２℃において１０分増幅した。反応
生成物をフェノール−クロロフォルムで抽出し、エタノールで沈殿させ、真空中
で乾燥し、８０μｌのヌクレアーゼを含有しない水に再懸濁した。

【０１２３】 ｐＤＭ１２へのクローン化 ４つのレパートリーのそれぞれをＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ消化し、アガロースゲル
上で電気泳動し、切除して、製造者の指示に従いジーンクリーンＩＩキット（ア
メリカ合衆国、カリフォルニア州ラホーヤのバイオロール製）を用いてゲルから
精製した。４つのレパートリーのそれぞれを、実施例２に記載のように調整した
１０μｇのＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ切断ｐＤＭ１２と、１２ユニットのＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ（イギリス、スコットランドのペーズリーにあるライフ・テクノロジーズ
製）を含む１４０μｌ中で一晩１６℃において連結を行った。インキュベーショ
ンの後、連結反応物をヌクレアーゼを含有しない水で２００μｌに調整し、ＤＮ
Ａを１μｌ ２０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲンで沈殿させた。１００μｌの７．５
Ｍ酢酸アンモニウムと９００μｌの氷冷（−２０℃）無水エタノールをｖｏｒｔ
ｅｘで攪拌して混合し、マイクロ遠心器中で１３，０００ｒｐｍで２０分間回転
してＤＮＡをペレット化した。このペレットを５００μｌの氷冷７０％エタノー
ル中で１３，０００ｒｐｍで２分間遠心分離して洗浄し、ついで真空乾燥し、１
０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。各レパートリーの１μｌアリコートを、
８０μｌの大腸菌（ＴＧ１）中へエレクトロポレートした。細胞をキュベットあ
たり１ｍｌのＳＯＣ培地中で３７℃において１時間培養し、１％のグルコースと
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレート上で培養した
。ライブラリサイズを評価するためにエレクトロポレートしたバクテリアをさら
に１０^-1、１０^-5 および１０^-6に希釈して培養した。コロニーは３０℃におい て一晩増殖した。ＳｆｉＩ−ＮｏｔＩ消化ｐＤＭ１２へのクローン化により１．
１６ｘ１０⁹クローンのＩｇＭ−κ／λレパートリー、および１．２１ｘ１０⁹ク
ローンのＩｇＤ−κ／λレパートリーが得られた。

【０１２４】 ＰＤＣＰストックの調整 別のＰＤＣＰストックを各レパートリーライブラリのために調製した。バクテ
リアをプレートからこすりとり、２０％のグリセロール、１％のグルコースおよ
び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加した３０ｍｌの２ｘＴＹブロスに入れ
た。３ｍｌを１％のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを追加し
た５０ｍｌの２ｘＴＹ培養ブロスに加え、１０¹¹のカナマイシン耐性ユニット（
ｋｒｕ）Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージで３７℃において３０分間振盪せずに感
染させ、ついで２００ｒｐｍで３０分間振盪した。感染バクテリアを２５μｇ／
ｍｌのカナマイシン、１００μｇ／ｍのアンピシリンおよび２０μＭのＩＰＴＧ
を追加した５００ｍｌの２ｘＴＹのブロスに移し、３０℃において２００ｒｐｍ
で振盪させながら一晩培養した。バクテリアを５０ｍｌのファルコンチューブで
２０分間４０００ｒｐｍでペレット化し、８０ｍｌの２．５Ｍ ＮａＣｌ／２０
％ＰＥＧ ６０００を４００ｍｌの粒子上澄みに加えて、激しく混合し、氷上で
１時間保ちＰＤＣＰ粒子を沈殿させた。粒子は２５０ｍｌのオークリッジチュー
ブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃において１１０００ｒｐｍで
３０分間ペレット化し、その後４０ｍｌの水に再懸濁し、８ｍｌの２．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ／２０％ ＰＥＧ ６０００を加えて粒子を再度沈殿させ、氷上で２０分
間保った。粒子を再度５０ｍｌのオークリッジチューブに入れ、Ｓｏｒｖａｌｌ
ＲＣ５Ｂ遠心器で４℃において１１０００ｒｐｍで３０分間ペレット化し、５
ｍｌのＰＢＳバッファー中に再懸濁し、その後ピペットでＰＥＧ／ＮａＣｌのす
べての痕跡を取り除いた。バクテリアの破片はマイクロ遠心器で１３５００ｒｐ
ｍで５分間回転して除去した。上澄みは０．４５μｍのポリサルホンシリンジフ
ィルターで濾過し、２０％のグリセロールに調整し、−７０℃で保存した。

【０１２５】 実施例９ ヒトｓｃＦｖのＮ−末端表示ＰＤＣＰライブラリから結合活性を分
離する ヒト抗体ライブラリから関心のあるターゲットへの結合活性を選択できること
は、治療に役立つヒト抗体を製造する可能性という観点から重要である。さらに
、このようなライブラリにより、これまでの抗体製造方法には毒性、低免疫抗原
性、あるいは倫理的配慮から使用できなかったターゲットに対する抗体の分離を
行うことができる。この例では我々は免疫されていないヒトからのｓｃＦｖのＰ
ＤＣＰライブラリから、ペプチド抗体に対する特定の結合活性をどのように分離
するかを示す。

【０１２６】 本実施例において結合活性の分離に使用するライブラリの製造方法は実施例８
に記載されている。

【０１２７】 物質Ｐは生体での炎症および疼痛反応に関与する１１個のアミノ酸ニューロペ
プチドである。これはまた、とりわけ乾癬や喘息など、様々な疾患に関係してい
る(Misery, L. 1997, Br. J. Dertmatol., 137 : 843-850; Maggi, C. A. 1997,
Regul. Pept. 70 : 75-90 ; Choi, D. C. & Kwon, O.J., 1998, Curr. Opin.
Pulm. Med., 4: 16-24)。このペプチドを中和するヒト抗体は、したがっていく らかの潜在的な治療可能性を持つ。このペプチドは小さすぎて実施例３に記載の
ようにチューブ上に有効に吸着できないので、結合活性の選択は溶液中でＮ−末
端ビオチン化物質Ｐを用いて、結合したＰＤＣＰ粒子をストレプタビジン−コー
トのマグネティックビーズを用いて行った。

【０１２８】 物質Ｐ結合ＰＤＣＰ粒子の増菌 約１０¹³ａ．ｒ．ｕ．ＩｇＭおよびＩｇＤ ｓｃＦｖライブラリストックのア
リコートを８００μｌ ４％ ＢＳＡ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳに溶
かした１μｇビオチン化物質Ｐと混合し、周囲温度で２時間結合させた。結合し
たＰＤＣＰをついで１ｍｌのＢＳＡブロックストレプタビジンコートマグネティ
ックビーズの上に１０分間周囲温度で捕捉した。このビーズをマグネット（プロ
メガ）を用いてチューブの側面にて捕捉し、未結合物質を捨てた。ビーズを１ｍ
ｌのＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０／１０μｇ／ｍｌストレプタビジンにて
８回、１ｍｌのＰＢＳで２回、磁気的捕捉によって洗浄し、洗浄バッファーを除
去した。最終的に洗浄した後、結合ＰＤＣＰを１ｍｌの新しく調整した０．１Ｍ
のトリエチルアミンで１０分間溶出し、ビーズを捕捉し、溶出した粒子を０．５
ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４へ移した。中和された粒子を１０ｍｌ
の対数期のＴＧ１大腸菌バクテリアに加え、３７℃において振盪せずに３０分間
培養し、ついで２００ｒｐｍで３０分間振盪した。感染させた培養物の１０^-3、
１０^-4、および１０^-5希釈物を調製し、回収された粒子の数を推定し、残りは４
０００ｒｐｍで１０分間回転させ、ペレットを３００μｌの２ｘＴＹ培地にｖｏ
ｒｔｅｘで攪拌して再懸濁した。バクテリアを１％のグルコースと１００μｇ／
ｍｌのアンピシリンを追加した２ｘＴＹ寒天プレートで培養した。コロニーを３
０℃で一晩増殖した。前述のようにして、これらのバクテリアの２００ｍｌ増幅
培養物から１００倍に濃縮したＰＤＣＰストックを調整し、０．５ｍｌを選択の
第２回目として５００ｎｇのビオチン化物質Ｐとともに使用した。この回では１
００μｇ／ｍｌのストレプタビジンが洗浄バッファーに含有された。

【０１２９】 結合クローンのＥＬＩＳＡ同定 実施例３に記載のように調製した９６の個々のＰＤＣＰ培養物によりＥＬＩＳ
Ａで第２回目の選択が終了した後、回収されたコロニーから結合クローンを同定
した。Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ ４ ＥＬＩＳＡプレートに１００
μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに溶かした２００ｎｇ／ｗｅｌｌのストレプタビジンを
３７℃で一時間吸着した。このプレートを３ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで
洗浄し、１００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳに溶かした１０ｎｇ／ｗｅｌｌのビオチ
ン化物質Ｐで３０分間３７℃で培養した。このプレートを３ｘ２００μｌ／ｗｅ
ｌｌのＰＢＳで洗浄し、１時間３７℃において２００μｌ／ｗｅｌｌの２％Ｍａ
ｒｖｅｌ脱脂粉乳／ＰＢＳでブロックし、ついで２ｘ２００μｌ／ｗｅｌｌのＰ
ＢＳで洗浄した。５０μｌ ＰＤＣＰ培養物上澄みを５０μｌ／ｗｅｌｌの４％
のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳを含有する各井戸に加え、周囲温度で１時間結合させた
。このプレートを２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３
回洗浄し、ついで２００μｌ／ｗｅｌｌのＰＢＳで３回洗浄した。結合したＰＤ
ＣＰは２％のＭａｒｖｅｌ／ＰＢＳに１：５０００に希釈した抗Ｍ１３−ＨＲＰ
コンジュゲート（ファーマシア）１００μｌ／ｗｅｌｌで１時間周囲温度で検出
し、このプレートを前述したように６回洗浄した。プレートを１００μｌ／ｗｅ
ｌｌの新しく調製したＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）
基質バッファー（０．００５％のＨ₂Ｏ₂、２４ｍＭのクエン酸に溶かした０．１
ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ／５２ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーｐＨ５．２）で１
０分間周囲温度で現像した。反応を１００μｌ／ｗｅｌｌの１２．５％のＨ₂Ｓ Ｏ₄で停止させ、４５０ｎｍで読みとった。試験した９６クローンのうち、１０ 個からバックグラウンドの２倍以上の信号（バックグラウンド＝０．０５）を得
た。

【０１３０】 結合クローンの特性決定 前述したように、１００ｍｌのシングルＥＬＩＳＡ陽性クローンの増幅培養物
から５０倍に濃縮したＰＤＣＰストックを調製した。前述したように１０μｌ／
ｗｅｌｌのこのストックのストレプタビジン、ストレプタビジン−ビオチン化−
物質Ｐおよびストレプタビジン−ビオチン化−ＣＧＲＰ（ビオチン化Ｎ−末端）
への結合性をＥＬＩＳＡにて試験した。結合はストレプタビジン−ビオチン化−
物質Ｐ吸着井戸においてのみ観察され、これにより結合が特異的であることが示
された。さらに、ストレプタビジン−ビオチン化−物質Ｐへの結合はＰＤＣＰを
１μｇ／ｍｌの遊離物質Ｐ（図８を参照）で培養することによって完全に阻害さ
れた。このｓｃＦｖ ＶＨ（配列番号：１５および１６）およびＶＬ（配列番号
：１７および１８）ＤＮＡおよびアミノ酸配列はＤＮＡ塩基配列決定法によりオ
リゴヌクレオチドＭ１３ＲＥＶ（配列番号：２７）とＯＲＳＥＱＦＯＲ（配列番
号：３６）を用いて決定され、図９に示した。

【０１３１】 この結果からターゲット結合活性がヒトｓｃＦｖ断片のＰＤＣＰ表示ライブラ
リから分離可能であることが示された。

【０１３２】 実施例１０ もう１つの実施例において本発明は例えばリガンド結合のために抗体Ｆａｂ断
片によって要求される、活性のために１つ以上の鎖を必要とするようなメンバー
を持つＤＮＡライブラリをスクリーニングするための方法を提供する。既知のＨ
鎖およびＬ鎖配列の抗体の親和性を増加するためには、既知のＨ鎖と共発現して
いる既知のＬ鎖のライブラリがより高い親和性の抗体に対してスクリーンされる
。この既知のＨ鎖抗体ＤＮＡ配列はエストロゲンレセプターＨＲＥ配列を含有し
ないファージベクター中でエストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域をコード化す
るヌクレオチド配列に連結される。既知のＨ鎖のための抗体ＤＮＡ配列（ＶＨお
よびＣＨ１）遺伝子はエストロゲンレセプターＤＢＤ ＤＮＡの５’領域の中で
適当なプロモーターと翻訳配列、およびペリプラスム間隙へ下流融合タンパクの
移送を指示する信号ペプチドリーダーをコード化しうる配列の下流に挿入される
。未知のＬ鎖のライブラリ（ＶＬおよびＣＬ）は、エストロゲンレセプターＨＲ
Ｅ配列を含有しているファージミド発現ベクターから別々に発現する。このよう
に、Ｈ鎖とＬ鎖がともに、Ｈ鎖−ＤＢＤ融合を含有するファージによる感染のあ
とで、同じホスト細胞中に発現するとき、Ｌ鎖ファージミドベクターは、パッケ
ージング過程の間にＨ鎖−ＤＢＤ融合タンパクによって結合される、一本鎖ＤＮ
Ａとして成熟ファージ粒子中に優先的にパッケージされる。このＬ鎖タンパクは
ペリプラスムへ移送され、そこでＰＤＣＰ上の細胞を出てＤＢＤタンパクと融合
するＨ鎖とともに組み立てられる。この実施例においてＤＢＤ融合タンパクおよ
びＨＲＥ ＤＮＡ配列は同じベクター上にはコード化されておらず、未知のペプ
チド配列がＨＲＥ配列として同じベクター上に存在する。関心のあるタンパクを
コード化するペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）はついで抗体のリガ
ンド特異性によって選択される。

【０１３３】

【表１】

【０１３４】

【表２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にある、ｐｅｌＢ
リーダー分泌配列（イタリック）、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を含む複数のク
ローン化部位、フレキシブルな（グリシン）₄−セリンリンカー配列（四角く囲 んだ部分）、全分子長のアミノ酸１７６−２８２を含有するエストロゲンレセプ
ター遺伝子断片（配列番号：４）、および３８塩基対コンセンサスエストロゲン
レセプターＤＮＡ結合領域ＨＲＥ配列を含有する、ｐＤＭ１２ Ｎ末端融合エス
トロゲンレセプターＤＮＡ結合領域発現ベクターヌクレオチド配列（配列番号：
３）を示す図

【図２】 陰性対照Ｍ１３Ｋ０７ファージ、および抗ヒト免疫グロブリンカ
ッパ抗体に対するリンパ球ｃＤＮＡ−ｐＤＭ１２ライブラリの選択によって分離
したシングル−クローンペプチド表示キャリアパッケージ表示培養物上澄み（＃
１−４、実施例３参照）に対するＯＤ_450nm ＥＬＩＳＡデータを示す図

【図３】 ヒト免疫グロブリンカッパ定数領域の部分ＤＮＡ（配列番号：５
）およびアミノ酸（配列番号：６）配列(Kabat, E.A. et al., Sequences of Pr
oteins of Immunological Interest. 4^th edition. U.S. Department of Health
and Human Services. 1987)および図２のＥＬＩＳＡ陽性クローン＃２（配列番
号：７および８）と＃３（配列番号：９および１０）を示す図であり、これはヒ
トカッパ定数領域ＤＮＡがｐｅｌＢリーダー配列のフレーム内に存在することを
確認する（ｐｅｌＢリーダー配列には下線が引かれてあり、このリーダー配列の
切断部位は矢印で示されている）。５’−末端配列における差はこれらの２つの
クローンがライブラリストックから独立して選択されたことを示している。ＰＣ
Ｒプライマー配列は太字で示されており、クローン＃２は当初ＣＤＮＡＰＣＲＢ
ＡＫ１で増幅され、クローン＃３はＣＤＮＡＰＣＲＢＡＫ２で増幅されている図

【図４】 ｐｅｌＢリーダー分泌配列（イタリック）、ＳｆｉＩおよびＮｏ
ｔＩ部位を含む複数のクローン化部位、フレキシブルな（グリシン）₄ −セリン
リンカー配列（四角く囲んだ部分）、全分子長のアミノ酸１７６−２８２からな
るエストロゲンレセプター遺伝子断片（配列番号：１２）、および２つの３８塩
基対エストロゲンレセプターＤＮＡ結合領域ＨＲＥ配列（ＨＲＥ１とＨＲＥ２）
を含有する、ｐｅｌＢリーダー分泌配列（イタリック）、ＨｉｎｄＩＩＩおよび
ＥｃｏＲＩ制限部位間のｐＤＭ１４ Ｎ末端融合エストロゲンレセプターＤＮＡ
結合領域発現ベクターヌクレオチド配列（配列番号：１１）を示す図

【図５】 ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にある、ｐｅｌＢ
リーダー分泌配列（イタリック）、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を含む複数のク
ローン化部位、フレキシブルな（グリシン）₄ −セリンリンカー配列（四角く囲
んだ部分）、全分子長のアミノ酸１７６−２８２からなるエストロゲンレセプタ
ー遺伝子断片（配列番号：１４）、および３８塩基対エストロゲンレセプターＤ
ＮＡ結合領域ＨＲＥ配列を含有する、ｐＤＭ１６ Ｃ末端融合エストロゲンレセ
プターＤＮＡ結合領域発現ベクターヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す
図

【図６】 アンピシリン耐性単位（ａ．ｒ．ｕ．）として連続希釈ＥＬＩＳ
Ａ中のａｎｔｉ−ｐａｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎモノクローナル抗体へのＮ−ｃａｄ
ｈｅｒｉｎ−ｐＤＭ１６ Ｃ−末端表示ペプチド表示キャリアパッケージの結合
に対するＯＤ_450nm ＥＬＩＳＡデータを示す。陰性対照Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーフ
ァージのバックグラウンド結合もまた示す図

【図７】 アンピシリン耐性単位（ａ．ｒ．ｕ．）として連続希釈ＥＬＩＳ
Ａ中のストレプタビジンへのビオチン化ＰＣＣ−ｐＤＭ１６ Ｃ−末端表示ペプ
チド表示キャリアパッケージの結合に対する生体内でのＯＤ_450nm ＥＬＩＳＡデ
ータを示す。陰性対照Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージのバックグラウンド結合も
また示す図

【図８】 物質Ｐに対して選択されたヒトｓｃＦｖ ペプチド表示キャリア
パッケージ表示ライブラリから分離されたｓｃＦｖペプチド表示キャリアパッケ
ージのＯＤ_450nm ＥＬＩＳＡデータを示す図で、このペプチド表示キャリアパッ
ケージはストレプタビジン（１）、ストレプタビジン−ビオチン化物質Ｐ（２）
、およびストレプタビジン−ビオチン化ＣＧＲＰ（３）に対して、遊離の物質Ｐ
の存在下（Ｂ）および非存在下（Ａ）で試験されたもの

【図９】 物質Ｐに対して選択されたヒトｓｃＦｖ ペプチド表示キャリア
パッケージ表示ライブラリから分離された、物質Ｐ結合ｓｃＦｖのＤＮＡ（配列
番号：１５および１７）とアミノ酸（配列番号：１６および１８）配列を示す図
で、Ｈ鎖（配列番号：１５および１６）とＬ鎖（配列番号：１７および１８）可
変領域配列がＣＤＲとともに下線を引き太字で強調されている図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA04 CA05 CA06 CA07 CA10 DA06 EA03 EA04 4B063 QA05 QQ43 QQ79 QR33 QR48 QR79 QS32 4H045 AA10 BA10 BA41 CA40 DA50 EA50 FA74

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）であって、こ
   のパッケージは組換え型ポリヌクレオチド−キメラタンパク複合体を含有し、こ
   こでキメラタンパクはヌクレオチド結合領域とターゲットペプチド領域とを有し
   、前記組換え型ポリヌクレオチドは特異的に前記ヌクレオチド結合部分によって
   結合されるヌクレオチド配列モチーフを含有し、ここで少なくともキメラタンパ
   クのヌクレオチド結合部分によって結合されない組換え型ポリヌクレオチドのキ
   メラタンパクコード化部分が結合部分によって保護されているペプチド表示キャ
   リアパッケージ。
2. 【請求項２】 キメラタンパクヌクレオチド結合部分によって結合されてい
   ない、組換え型ポリヌクレオチドの前記キメラタンパク−コード化部分が配列非
   特異的性タンパクによって保護されている請求項１に記載のペプチド表示キャリ
   アパッケージ（ＰＤＣＰ）。
3. 【請求項３】 前記配列非特異的性タンパクがウイルスコートタンパクであ
   る請求項２に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
4. 【請求項４】 前記ターゲットペプチド部分がパッケージの外部に表示され
   ている請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパ
   ッケージ（ＰＤＣＰ）。
5. 【請求項５】 前記組換え型ポリヌクレオチドが、ヌクレオチド結合部分を
   コード化するヌクレオチド配列とターゲットペプチド部分をコード化するヌクレ
   オチド配列との間にリンカー配列を含有する請求項１ないし請求項４のいずれか
   １項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
6. 【請求項６】 前記組換え型ポリヌクレオチドが、それぞれキメラタンパク
   のヌクレオチド結合部分によって結合される、２つあるいはそれ以上のヌクレオ
   チド配列モチーフを有する請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のペプ
   チド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
7. 【請求項７】 前記ヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲス
   テロンレセプターのＤＮＡ結合領域である請求項１ないし請求項６のいずれか１
   項に記載のペプチド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
8. 【請求項８】 前記組換え型ポリヌクレオチドが前記キメラタンパクに一本
   鎖ＤＮＡとして結合する請求項１ないし請求項７のいずれか１項に記載のペプチ
   ド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
9. 【請求項９】 前記ターゲットペプチド部分がキメラタンパクのＮおよび／
   またはＣ末端に位置する請求項１ないし請求項８のいずれか１項に記載のペプチ
   ド表示キャリアパッケージ（ＰＤＣＰ）。
10. 【請求項１０】 前記組換え型ポリヌクレオチドで形質変換することによっ
    てホスト細胞中で製造され、このホスト細胞の溶菌を行うことなくそこから排出
    される請求項１ないし請求項９のいずれか１項に記載のペプチド表示キャリアパ
    ッケージ（ＰＤＣＰ）。
11. 【請求項１１】 ターゲットペプチド部分に操作によって結合されるヌクレ
    オチド結合部分を有するキメラタンパクをコード化するヌクレオチド配列を含有
    する組換え型ポリヌクレオチドであり、ここで前記ポリヌクレオチドは前記キメ
    ラタンパクのヌクレオチド結合部分に結合され、さらに配列非特異性ヌクレオチ
    ド結合タンパクをコード化する特定のヌクレオチド配列モチーフを含有する組換
    え型ポリヌクレオチド。
12. 【請求項１２】 前記配列非特異性ヌクレオチド結合タンパクがウイルスコ
    ートタンパクである請求項１１に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列と
    ターゲットペプチド部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列
    を含有する請求項１１または請求項１２に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
14. 【請求項１４】 それぞれ前記キメラタンパクのヌクレオチド結合部分によ
    って結合される２つあるいはそれ以上のヌクレオチド配列モチーフを有する請求
    項１１ないし請求項１３のいずれか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
15. 【請求項１５】 前記ヌクレオチド結合部分がエストロゲンあるいはプロゲ
    ステロンレセプターのＤＮＡ結合領域である請求項１１ないし請求項１４のいず
    れか１項に記載の組換え型ポリヌクレオチド。
16. 【請求項１６】 前記組換え型ポリヌクレオチドが前記キメラタンパクに一
    本鎖ＤＮＡとして結合する請求項１１ないし請求項１５のいずれか１項に記載の
    組換え型ポリヌクレオチド。
17. 【請求項１７】 ｉ）特異的配列モチーフを認識することができ、それに結
    合することのできるヌクレオチド結合領域をコード化する配列と、 ｉｉ） ｉ）によってコード化されたヌクレオチド結合部分によって認識され
    、結合された配列モチーフと、 ｉｉｉ） ポリヌクレオチドの挿入を行う制限酵素部位と、ここで前記部位は
    前記ポリヌクレオチドをヌクレオチド結合部分コード化配列に操作によって結合
    するよう設計されており、それによって操作によって結合されたポリヌクレオチ
    ド配列がキメラタンパクを製造し、さらに、 ｉｖ） 非特異的に裸のポリヌクレオチドへ結合するヌクレオチド結合タンパ
    クをコード化する配列と、 を含有する配列を有するポリヌクレオチドを集合的に含有する遺伝子構成体あ
    るいは遺伝子構成体のセット。
18. 【請求項１８】 ヌクレオチド結合部分をコード化するヌクレオチド配列と
    ターゲットペプチド部分をコード化するヌクレオチド配列との間にリンカー配列
    が位置している請求項１７に記載の遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット
    。
19. 【請求項１９】 それぞれ番号ＮＣＩＭＢ４０９７０、ＮＣＩＭＢ４０９７
    １およびＮＣＩＭＢ４０９７２としてＮＣＩＭＢに預託されたベクターｐＤＭ１
    ２、ｐＤＭ１４あるいはｐＤＭ１６を含有する請求項１７または請求項１８に記
    載の遺伝子構成体あるいは遺伝子構成体のセット。
20. 【請求項２０】 遺伝子ライブラリを構築する方法であって、 ａ） 特異的配列モチーフを認識し、この配列モチーフと結合することのでき
    るヌクレオチド結合部分をコード化するポリヌクレオチド配列を含有する組換え
    型ベクターの複数のコピーを構築し、 ｂ） 前記ベクターのそれぞれを、操作によって結合されたベクターの発現が
    前記ターゲットペプチドと前記ヌクレオチド結合部分を含有するキメラタンパク
    の発現をもたらすように、ターゲットポリペプチドをコード化するポリヌクレオ
    チドへ操作によって結合し、ここで前記操作により結合されるベクターの複数の
    コピーがターゲットペプチド部分のライブラリを集合的に表し、 ｃ） ホスト細胞をステップｂ）のベクターによって形質変換し、 ｄ） ステップｃ）のホスト細胞を前記キメラタンパクの発現に適した条件の
    もとで培養し、 ｅ） ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されるヌクレオチド配列モ
    チーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドを
    ステップｄ）のキメラタンパクへ露出してポリヌクレオチド−キメラタンパク複
    合体を生じさせ、さらに、 ｆ） キメラタンパクをコード化するポリヌクレオチドの保護されていない部
    分に結合することのできる配列非特異性部分の生産を生じさせてペプチド表示キ
    ャリアパッケージを形成するステップと、 を有する遺伝子ライブラリを構築する方法。
21. 【請求項２１】 遺伝子ライブラリをスクリーニングする方法であって、 ａ） 前記ライブラリのポリヌクレオチドがそれぞれ前記遺伝子構成体の一つ
    のコピーと結合し、組換え型ポリヌクレオチドのライブラリを形成する条件下で
    前記ライブラリのポリヌクレオチドメンバーを認識可能で特定の配列モチーフへ
    結合可能なヌクレオチド結合領域をコード化するヌクレオチド配列を含有する遺
    伝子構成体の複数のコピーに露出し、 ｂ） 前記組換え型ポリヌクレオチドをホスト細胞のポピュレーションに、前
    記ホスト細胞が前記組換え型ポリヌクレオチドにより形質変換されるのに適した
    条件下で露出し、 ｃ） 形質変換されたホスト細胞を選択し、 ｄ） 前記形質変換されたホスト細胞を前記組換え型ポリヌクレオチドが発現
    し、キメラタンパクを生じるのに適した条件に付し、 ｅ） ヌクレオチド結合部分によって特異的に認識されたヌクレオチド配列モ
    チーフを含有する組換え型ポリヌクレオチドを提供し、このポリヌクレオチドを
    ステップｄ）のキメラタンパクに露出し、ポリヌクレオチドキメラタンパク複合
    体を生じさせ、 ｆ） ステップｅ）の複合体中のポリヌクレオチドの露出部分を保護してペプ
    チド表示キャリアパッケージを形成し、さらに、 ｇ） 要求される特徴を持つターゲットペプチド部分を表示するパッケージの
    みを選択するために、前記ペプチド表示キャリアパッケージをスクリーニングす
    るステップと、 を有する遺伝子ライブラリのスクリーニングを行う方法。
22. 【請求項２２】 ペプチド表示キャリアパッケージがホスト細胞からその溶
    菌を行わずに排出される請求項２１に記載の方法。
23. 【請求項２３】 実質的に配列番号１５または配列番号１７に示されるヌク
    レオチド配列を含有するポリヌクレオチド。