JP2001514904A

JP2001514904A - 言語取得前非症候性難聴に関与するコネキシン２６遺伝子内の変異および検出法

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Publication number: JP2001514904A
Application number: JP2000509871A
Authority: JP
Inventors: プティ，クリスティーヌ; デノイェル−グリソン，フランソワーズ; ウェイル，ドミニーク; マルラン−デュベルノワ，サンドリーヌ; グードン，ジャン−ルーク
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1997-08-15
Filing date: 1998-08-14
Publication date: 2001-09-18
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: US6485908B1; CA2301301A1; PT1003865E; US20030170676A1; US9868989B2; JP4418587B2; EP1003865A2; WO1999009210A2; WO1999009210A3; US5998147A; ATE399860T1; US9169517B2; CA2301301C; CA2852463A1; US20120322059A1; US20140113285A1; US20160076101A1; US8143000B2; US20090104600A1; CY1108771T1

Abstract

(57)【要約】野生型では遺伝性感覚障害に関連したポリペプチドをコードする突然変異化配列に対応するヌクレオチドの鎖を有する精製ポリヌクレオチドであって、前記突然変異化精製ポリヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオチドの特異的欠失から成る群から選択される言語習得前非症候性難聴に関与する突然変異を表す精製ポリヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の背景本発明は、常染色体言語習得前非症候性難聴に関与する突然変異、ならびに同
型接合および異型接合個体に関するこの遺伝性感覚障害の検出方法に関する。本
発明は特に、コネキシン26(Cx26)遺伝子における、特にヌクレオチド２７および
３２間の特に冨グアノシン領域における少なくとも１つのヌクレオチドの特異的
欠失に関する。本発明は、例えば、Cx26遺伝子族に属する遺伝子の突然変異のin
vitro検出に有用な道具としてのポリヌクレオチドまたはその断片の使用にも向
けられる。

【０００２】完全または重症言語習得前難聴は、開発途上国の千人に一人の小児が罹ってい
る（Morton NE. Genetic epidemiology of hearing impaerment. In Genetics o
f hearing impairment. （The New York Acad Sci., New York 1991; 630:16-31
））。それは、言語習得を妨げるので、大きなハンディキャップである。

【０００３】米国の非症候性（隔離型）言語習得前難聴小児集団で実施され、明らかな環境
的原因が排除された研究により、原因の３分の２までが遺伝的基礎を有すると見
積もられている（Marazita ML, Ploughman LM, Rawlings B, Remington E, Arno
s KS, Nance WE. Genetic epidemiological studies of early-onset deafness
in the U.S. school-age population. Am J Med Genet 1993; 46:486-91 ）。こ
れらの形態は主に、感覚神経性であり、ほとんど専ら、単一遺伝子性である。主
な遺伝様式は常染色体劣性（DFNB）で、７２％〜８５％の症例を含み、完全難聴
だけを考慮すると、この分数は９０％に増大する。

【０００４】常染色体劣性言語習得前難聴は、遺伝的高異型接合性であることが知られてい
る。DFNB遺伝子座の数の概算は、３０から１００まで変化する（In Genetics an
d Hearing Impairment, Martini A, Read AP, Stephens D, eds （Whurr, Londo
n ）1996; 197-212 ）。このうちの１４個がこれまでにヒト染色体にマッピング
されている（Petit C. Genes responsible for human hereditary deafness:sym
phony of a thousand. Nature Genet 1996; 14:385-91 ）（Verhoeven K, Van C
amp G, Govaerts PJ, et al., A gene for autosomal dominant non-syndromic
hearin loss （DFNA12）maps to chromosome 11q22-24. Am J Hum Genet 1997;
60:1168-74およびCambell DA, McHale DP, Brown KA, et al. A new locus for
non-syndromal autosomal recessive sensorineural hearing loss（DFNB16）ma
ps to human chromosome 15q21-q22. J Med Genet 1997; 印刷中）。

【０００５】遺伝カウンセリングクリニックに通っている家族の大多数は、傷害の再発の危
険性を知りたい一人の難聴小児を有する正常聴覚両親で構成される。ほとんどの
場合、言語習得前難聴の環境的原因の大きい役割が示されても、通常は聴覚損失
が遺伝的原因を有するか否かを認識することさえできない。このような家族にお
ける遺伝カウンセリングは、ＤＦＮＢ突然変異を検出する能力により非常に改善
され得る。この点で、症状の高遺伝子異質性は、大きな障害を示す。

【０００６】大血縁チュニジア人家族における13q11 上のDFNB1 遺伝子座の最初の確認（Gu
ilford P, Ben Arab S, Blanchard S, et al. A non-syndromic form of neuros
ensory, recessive deafness maps to the pericentormeric region of chromos
ome 13q. Nature Genet 1994; 6:24-8）後、ニュージーランド／オーストラリア
人家族に関して（Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al. The contribut
ion of the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian populatio
n. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35 ）、そしてイタリア／スペイン人家族に関
して（Gasparini P, Estivill X, Volpini V, et al. Linkage of DFNB1 to non
-syndromic neurosensory autosomal-recessive deafness in Mediterranean fa
milies. Eur J Hum Genet 1997;5:83-8 ）実施された２つの試験は、この遺伝子
座がこれらの集団における言語習得前難聴に多大に関与し得ることを示唆したが
、しかしこれらの家族で得られた個々のロッド値は、これらの家族のサイズが小
規模であるために有意でなかった。

【０００７】近年、ギャップ結合タンパク質コネキシン２６をコードするCx26遺伝子は、DF
NB1 難聴の基礎を成すことが示された。３つのＤＦＮＢ１連鎖血縁パキスタン人
家族における早期終止コドンを生じる２つの異なるＧ−＞Ａ置換が報告された（
Kelsell DP, Dunlop J, Stevens HP, et al. Connexin 26 mutations in heredi
tary non-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997;387:80-3 ）。これ
ら２つの置換は、それぞれコドン７７およびコドン２４で同定された。この結果
は、この仮説を直接査定する機会を提供した。

【０００８】一人の難聴小児がいる家族における遺伝的難聴と非遺伝的難聴を区別すること
ができないために言語習得前非症候性難聴に関する遺伝カウンセリングが遭遇す
る困難が、常染色体劣性言語習得前難聴を有する世界のいくつかの場所からの３
５家族のCx26遺伝子に存在する突然変異の範囲および罹患率の特性化に本発明人
等が着手した理由の１つであった。

【０００９】発明の要約 Cx26遺伝子における突然変異の確定は、とりわけ、常染色体性言語習得前非症
候性難聴の特異的形態の、特に、このような家族における新規に同定された30de
lG（位置３０でのＧ欠失；位置１はイニシエーターコドンの最初の塩基である）
突然変異の有用な役割の同定のための道具として検出プローブの使用を可能にし
た。本発明は、DFNB1 遺伝子座の関与が主に、30delG突然変異に本質的に起因す
ることを確定する。30delGは、すべての劣性DFNB1 突然変異の約４分の３を占め
る、と目下考えられる。

【００１０】したがって、本発明は、野生形態で、遺伝的感覚障害に関連するポリペプチド
をコードする突然変異化配列に対応するヌクレオチドの鎖を有する精製ポリヌク
レオチドを提供するよう意図される。突然変異化精製ポリヌクレオチドは、言語
習得前非症候性難聴に関与する突然変異を示す。

【００１１】本発明は、プライマーとしてまたはプローブとして有用である突然変異化精製
ポリヌクレオチドの１５〜５０連続ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチド
も提供する。さらに、本発明は、同型接合および異型接合個体に関する遺伝性感覚障害の検
出のための方法およびキットを供給するつもりである。

【００１２】本発明によれば、野生形態で、遺伝的感覚障害に関連するポリペプチドをコー
ドする突然変異化配列に対応するヌクレオチドの鎖を有する精製ポリヌクレオチ
ドは、少なくとも１つのヌクレオチドの特異的欠失から成る群から選択される言
語習得前非症候性難聴に関与する突然変異を示す。突然変異とは、本発明によれば、少なくとも１つのヌクレオチドの特異的欠失
を意味する。したがって、突然変異化配列は、少なくとも１つの突然変異を包含
するポリヌクレオチド配列を意味する。ヌクレオチドの鎖は、本発明によれば、ポリペプチドを必ずしもコードしない
が、ともに連鎖した２７〜２３１１ヌクレオチドを示すポリヌクレオチドを意味
する。

【００１３】本発明は特に、特異的突然変異が染色体13q11 〜12のコネキシン２６をコード
する領域に位置する、好ましくは、ヌクレオチド２７で、好ましくはヌクレオチ
ド３０で開始し、ヌクレオチド３２またはヌクレオチド３５まで延びる冨グアノ
シン領域に位置する欠失である精製ポリヌクレオチドに関する（列挙したヌクレ
オチドはすべて含まれている）。特に本発明によれば、特異的欠失精製ポリヌク
レオチドは切頭型ポリペプチドをコードする。切頭型ポリペプチドとは、本発明によれば、長さ、アミノ酸組成または機能的
特性において野生形態のポリペプチドの特性を示さないポリペプチドの断片を意
味する。

【００１４】特異的欠失の好ましい実施態様は、「30delG突然変異」とも呼ばれる、位置３
０でのグアノシン欠失である。特異的欠失の別の好ましい実施態様は、位置３０
で開始する38bp欠失である。本発明は、以下の緊縮条件下で：23℃〜37℃の低温で、4xSSC 緩衝液、５ｘデ
ンハート溶液、0.05%SDSおよび100 μg/mlのサケ精子ＤＮＡの存在下で(1xSSCは
0.15M のNaClおよび0.05M のクエン酸ナトリウムに対応する；１ｘデンハート溶
液は0.02% フィコール、0.02% ポリビニルピロリドンおよび0.02% ウシ血清アル
ブミンに対応する）、前記のポリヌクレオチドのいずれかと特異的にハイブリダ
イズする精製ポリヌクレオチドも含む。

【００１５】本発明は、前記のポリヌクレオチドのいずれかによるポリヌクレオチドの１５
〜５０連続ヌクレオチドを包含するプライマーとしてまたはプローブとして有用
なオリゴヌクレオチドにも関する。オリゴヌクレオチド配列は、以下の群から選
択される： −第一組： 5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3' 5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3' PCR 生成物の長さは、285bp 長から得られた； −読取り枠の他の部分の探査を可能にする第二組： 5'-GACACGAAGATCAGCTGCAG （配列番号：３）-3' 5'-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG （配列番号：４）-3'

【００１６】 −第三組： 5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3' 5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3' −第四組 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配
列番号：１４）-3' 5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA（配列番号：１０）-3'

【００１７】プローブとして有用な別のオリゴヌクレオチドは、以下の群から選択される： 5'-AGACGATCCTGGGGGTGTGAACAAA（配列番号：５）-3' 5'-ATCCTGGGGGTGTGA（配列番号：６）-3' 5'-AGACGATCCTGGGGGCTCACCGTCCTC（配列番号：７）-3'

【００１８】さらに、本発明は、DNA を含有する生物試料における同型接合および異型接合
個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出の
ための方法であって、ａ）生物試料を前記のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、試料中に
含入されるDNA が、ハイブリダイゼーションのために、そして生物試料中に含有
されるDNA とのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、任
意に利用可能にされ；ｂ）DNA を増幅し；ｃ）増幅生成物を明示し；そしてｄ）突然変異を検出する；工程を含んで成る方法に関する。

【００１９】前記の方法の工程ｄ）は、一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル
電気泳動（DGGE）、シーケンシング（Smith, L.M., Sanders, J.Z., Kaiser, R.
J., Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 19
86; 321:674-9 ）；分子ハイブリダイゼーション捕捉プローブまたは温度勾配ゲ
ル電気泳動（TGGE）を包含し得る。前記の方法の工程ｃ）は、前記のようなオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いた増幅生成物の検出を包含し得る。

【００２０】本発明によれば、生物試料は、以下のような任意の判定基準による任意の種類
の難聴に罹患したヒトから抽出した血液試料であり得る：進行性のまたは非進行
性の、任意の重症度の、家族性のまたは散発性の、神経感覚性または混合隔離型
難聴、あるいは騒音に曝された個体、または低聴覚に罹患した個体、あるいは遺
伝子の異常または出生前診断に関する胚からの異常を保有しやすい個体。

【００２１】本発明の別の目的は、DNA を含有する生物試料における同型接合および異型接
合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出
のための方法であって、ａ）生物試料を前記のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させて、試料中に
含入されるＤＮＡが、ハイブリダイゼーションのために、そして生物試料中に含
有されるＤＮＡとのプライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で
、任意に利用可能にされ；そしてｂ）オリゴヌクレオチドプローブと生物試料中に含入されるＤＮＡとの間に形
成されるハイブリッドを検出する；工程を含んで成る方法を包含する。

【００２２】前記の方法の工程ｂ）は、一本鎖高次構造多型（SSCP）、変性剤濃度勾配ゲル
電気泳動（DGGE）または増幅およびシーケンシングにおいて存在し得る。本発明は、同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色
体性言語習得前非症候性難聴の検出のためのキットであって、ａ）本発明のオリゴヌクレオチド；ｂ）DNA 増幅の実行に必要な試薬；およびｃ）増幅断片の長さの確定を可能にし、または突然変異の検出を可能にする構
成成分；を含んで成るキットも含む。

【００２３】発明の詳細な説明言語習得前非症候性（隔離型）難聴は、小児における最も高頻度の遺伝性感覚
障害である。遺伝は、ほとんどの場合、常染色体劣性である。数ダースの遺伝子
が関与し得るが、そのうちの２つだけ、即ちDFNB1 とDFNB2 がこれまでに同定さ
れている（Kelsell, D.F., et al., Caonnexin 26 mutations in hereditary no
n-syndromic sensorineural deafness. Nature 1997; 387:80-3; Liu, X-Z, et
al., Mutations in the myosin VIIA gene cause non-syndromic recessive dea
fness, Nature Genet 1997; 16:188-90;およびWeil, D., et al., The autosoma
l recessive isolated deafness, DFNB2 and the Usher 1B syndrome are allel
ic defects of the myosin-VIIA, Nature Genet 1997; 16:191-3）。

【００２４】 DFNB1 に関与することが近年示されたコネキシン２６をコードする遺伝子Ｃｘ
２６における突然変異に関する探索を実施した。Ｃｘ２６の分析は、ゲノムDNA
に関するPCR 増幅および単一コードエキソンのシーケンシングにより実施した。

【００２５】実施例１：患者種々の地理的領域、主にフランス、ニュージーランドおよびオーストラリア、
チュニジアおよびレバノンからの３５の罹患家族を調べた。それらを３類に分類
した：（１）DFNB1 遺伝子座との有意の連鎖を各々有する血縁家族、（２）連鎖
分析がDFNB1 の関与と適合した小規模非血縁家族、そして（３）連鎖分析が成さ
れていない小規模家族。

【００２６】第一類は、地理的に隔離された領域に住んでいる６つの大家族で構成される。
５つはチュニジアからの家族で、そのうち２つは北から、そして３つは南からの
家族であった。北方チュニジアからの２家族（家族２０および６０）におけるDF
NB1 との連鎖は、以前に報告されていた（Guilford P, Ben Arab S, Blanchard
S, et al. A non-syndromic form of neurosensory, recessive deafness maps
to the pericentormeric region of chromosome 13q. Nature Genet 1994; 6:24
-8）。

【００２７】南方チュニジアからの３家族（Ｓ１５、Ｓ１９およびＳＴ）およびレバノンか
らの家族（ＬＨ）は総計３人、５人、２人および５人の難聴小児をそれぞれ包含
し、難聴程度は重症または完全難聴であった。結婚は一次いとこ間(S15、STおよ
びLH）、ならびに一次および二次いとこ間(S19) であった。これら６家族の連鎖
分析は、2.5 〜10の範囲の個々のロッド値を生じ、DFNB1 領域からの多型マーカ
ー（D13S175 、D13S141 、D13S143 およびD13S115)を有した。

【００２８】第二類の患者は、少なくとも２人の難聴同胞を有する７ニュージーランド家族
（家族51、1160、1548、1608、1773、1873、1877）、および１オーストラリア家
族（9670）を包含する。家族1608は、同一DFNB1 マーカーハプロタイプを共有す
る４人の同胞が軽度〜中等度の難聴（高頻度で重症）を有し、そのうちの１人が
完全難聴であったという点で非定型であった。家族1873では、無関係な親（個体
II.2およびII.3）が彼等の２人の子供と同様に難聴であり、したがって、我々は
これを２家族と考えて、別個の家族の総数を９とした。家族1608および1873を除
いては、何らかの聴覚障害が認められる親はいなかった。これら９家族は、難聴
とDFNB1 領域の多型マーカーとの間に共分離を示し、最大個別ロッド値は0.6 〜
1.2 の範囲であった。

【００２９】 Maw 等（Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al., The contribution o
f the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian population. Am
J Hum Genet 1995; 57:629-35）の元の試験における他の１０家族は、共分離を
示さず、共分離した他の１家族はCx26突然変異に関して試験されなかった。ニュ
ージーランド家族は、全員が白色人種起源で、既知のポリネシア人との混血は認
められなかった。祖先の家族名によって、家族内の先祖の割合は一般的白人種ニ
ュージーランド集団の先祖比率を反映し、高優勢はアングロ−ケルト形質であっ
て、小分画が欧州大陸からの移住によるものであった。親血縁性、あるいは任意
の家族間の連関はいずれも認められなかった。オーストラリア人の場合、父親は
北アイルランドからで、母親は英国のヨークシャー出身であった。

【００３０】第三類は、フランス在住の１９家族とニュージーランドの２家族で構成され、
各々、重症〜完全難聴を示す少なくとも２人の小児を有した。何らかの聴覚障害
が認められる親はいなかったが、但し、家族P16 の母親および家族P17 の父親は
中等度および進行性の高頻度聴覚損失を有した。これらのうちの５家族は、レバ
ノン（家族Ｐ３）、トルコ（家族Ｐ４）、ポルトガル（家族Ｐ９）、アルジェリ
ア（家族Ｐ１４）およびポーランド（家族Ｐ１６の父親）出身の外人先祖を有し
た。２家族（Ｐ７およびＰ１４）では、両親は遠縁であった。

【００３１】実施例２：Cx26のコードエキソンの増幅単一コードエキソンから成るCx26遺伝子の全コード配列の増幅を可能にする一
組のプライマーを用いて、ゲノムDNA に関してPCR を実施した（Kelsell DP, Du
nlop J, Stevens HP, et al., Connexin 26 mutations in hereditary non-synd
romic sensorineural deafness. Nature 1997; 387:80-3 ）。プライマー配列を
以下に示す： 5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3' 、および 5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3' PCR 条件：３５サイクル：９５℃、１分；５８℃１分；７２℃２分。得られた
PCR 生成物は長さ777bp であった。

【００３２】実施例３：DNA シーケンシング蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いたApplied Biosystems DNAシーケンサーAB
I373でのジデオキシ鎖ターミネーター法を用いて、前記（Smith, L.M., Sanders
, J.Z., Kaiser, R.J., Fluorescence detection in automated DNA sequence a
nalysis. Nature 1986; 321:674-9 ）のようにPCR 生成物のシーケンシングを実
施した。用いたプライマーは、PCR 増幅に関するものと同一のもの＋２つの内部
プライマー： 5'-GACACGAAGATCAGCTGCAG （配列番号：３）-3' および 5'-CCAGGCTGCAAGAACGTGTG （配列番号：４）-3' であった。

【００３３】実施例４：血縁チュニジア人およびレバノン人DFNB1 家族における突然変異これらの家族において、DFNB1 遺伝子座の関連を、連鎖分析により実証し得た
。チュニジア人５家族のうちの４家族(S15、S19 、20および60）およびレバノン
人家族（ＬＨ）では、両Ｃｘ２６対立遺伝子に関して全罹患小児で同一突然変異
が、即ち、位置３０から３５に延びる６つのＧの配列中のグアノシン（Ｇ）の欠
失が検出された（位置１はイニシエーターコドンの最初の塩基である）（表１）
。この突然変異を、Beaudet とTsui（Beaudet AL, Tsui L-C. A suggested nome
nclature for designating mutations, Hum Mutation 1993; 2:245-8）の提唱し
た命名法にしたがって、以後、３０ｄｅｌＧ突然変異と呼ぶ。

【００３４】それは読取り枠を作り、これがヌクレオチド位置３８での早期終止コドンを生
じる。チュニジア人の５番目の家族（ＳＴ）に分離する突然変異は、ヌクレオチ
ド位置G39 でのＧからＴへのトランスバージョンとして同定されて、コドン４７
での早期終止コドン(GAG→TAG)を生じ、これはＥ４７Ｘと命名された。各家族に
おいて、正常聴覚親は対応する突然変異に関して異型接合であることが判明した
。

【００３５】実施例５：DFNB1 連鎖と一致する小規模非血縁ニュージーランドおよびオーストラリア人家族における突然変異これらの家族においては、分離分析は、DFNB1 遺伝子座の関与と適合すると従
来報告されている（ Maw MA, Allen-Powell DR, Goodey RJ, et al. The contri
bution of the DFNB1 locus to neurosensory deafness in a Caucasian popula
tion. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35）。９家族のうち５家族（51、1160、16
08(III.20)、1873(II.3)および1877）からの難聴個体は、３０ｄｅｌＧ突然変異
に関して同型接合であった。

【００３６】家族1773からの難聴小児は、30delGに関して異型接合であった。家族1873から
の難聴個体II.2（「被験者」および表１参照）は、30del138と呼ばれるヌクレオ
チド位置G30 で開始する38bpの欠失に関して異型接合であった。家族1773の難聴
小児および家族1873の難聴個体（II.2）では、その他の突然変異は検出されなか
った。

【００３７】それにもかかわらず、この最後の個体では、Cx26遺伝子に極近位の多型マーカ
ーの欠失（遺伝子座D13S175)が従来観察されており（Maw MA, Allen-Powell DR,
Goodey RJ, et al., The contribution of the DFNB1 locus to neurosensory
deafness in a Caucasian population. Am J Hum Genet 1995; 57:629-35）、こ
れは、ＤＮＡ再配列が、シスの遺伝子の他のCx26対立遺伝子の機能を損傷したこ
とを示す。家族９６７０では、ミスセンス突然変異(R184P) および枠内単一コド
ン欠失(delE138) に関する複合異型接合性が罹患同胞で観察された。Cx26突然変
異が検出されなかったのは、１家族（1548）のみであった。結果を表１に要約す
る。

【００３８】実施例６：フランスおよびニュージーランド在住のＤＦＮＢ１連鎖に関して特性化されていない小規模家族における突然変異フランス在住の１９家族（P1〜17、L14190およびL13131）およびニュージーラ
ンドの２家族（家族1885および2254）を調べた。これらの家族においては、難聴
と多型マーカーとの共分離は分析されていなかった。２１家族のうち６家族（P1
、P3、P5、P9、P10 およびP16)からの難聴小児は、突然変異30delGに関して同型
接合であることが判明した。さらに別の５家族（P6、P11 、P14 、P17 および18
85）では、難聴小児はこの突然変異に関して異型接合であった。これらの家族に
おいては、その他の突然変異は検出されなかった。残りの１０家族では、Cx26遺
伝子における突然変異は見出されなかった。

【００３９】実施例７：対立遺伝子特異的捕捉プローブを用いた分子ハイブリダイゼーション物質ハイブリダイゼーション捕捉プローブ（例えば、D. Chevrier et al. PCR
product quantification by non-radioactive hybridization procedures usin
g an oligonucleotide covalently bound to microwells. Molecular and Cellu
lar Probes 1993; 7:187-197およびD. Chevrier et al. Rapid detection of Sa
lmonella subspecies I by PCR combined with non-radioactive hybridization
using covalently immobilized oligonucleotide on a microplate. FEMS Immu
nology and Medical Microbiology 1995; 10:245-252参照）（各記載内容は、参
照により本明細書中に含まれる）は、30delG突然変異の特異的欠失を可能にする
。

【００４０】本技法は、30delG突然変異により引き起こされる言語習得前非症候性難聴の迅
速診断を可能にするために適応された。本技法は、安定な非放射性分子を用い、
自動化が容易で、且つ大規模分析に十分適応されるために、臨床環境にある種の
利点を提供する。

【００４１】ＰＣＲ増幅のために設計されたプライマーを用いて、Cx26遺伝子の当該領域を
ゲノムＤＮＡ試料から増幅する。プライマー配列を以下に示す： CNN3: 5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3' CNN4: 5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3' CONN3(配列番号：９）およびCONN4(配列番号：１０）プライマー（各々１μＭ
）、分析されるDNA のアリコート(2μl 、100 〜300ng)、1.5mM のMgCl2 、200
μM のdNTPおよびTaq ポリメラーゼを用いて、PCR を実施する。増幅プログラム
は以下の工程から成る：１）９５℃、５分；２）酵素付加、95℃、1 分;3)60 ℃
、１分（ランプ率＝0.25℃/s);4)72℃、1 分；５）工程２〜４を４０サイクル反
復；そして６）７２℃、１０分。迅速ゲル電気泳動により、PCR 生成物を立証す
る。

【００４２】増幅PCR 生成物は、正常または突然変異Cx26配列を含有する。正常配列と突然
変異体配列とを区別するために、２つの捕捉プローブを設計する。これら２つの
捕捉プローブの配列を以下に示す：正常配列の検出のためには： CNN6: 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTG （配列番号：１１）-3' 突然変異体配列の検出のためには： CNN7: 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGTGTGA （配列番号：１２）-3'

【００４３】各捕捉プローブは２２ヌクレオチド長でなければならない。さらに、有効であ
るために、捕捉プローブはその５‘末端でＡ７スペーサーを、そして１５塩基の
ハイブリダイゼーション領域を含有しなければならない。このような捕捉プロー
ブは、突然変異体配列を正常配列から特異的に区別できる。したがって、ＣＯＮ
Ｎ６（配列番号：１１）は、正常配列と特異的にハイブリダイズするよう設計さ
れ、一方ＣＯＮＮ７（配列番号：１２）は突然変異体配列と特異的にハイブリダ
イズするよう設計される。

【００４４】微小滴定プレートに捕捉プローブを付着させる前に、それらはその５‘末端で
リン酸化される。リン酸化は、２００μｌの緩衝液（50mMのトリス−HCl 、pH7.
4;10mMのMgCl₂;5mM のジチオトレイトール；および１ｍＭのスペルミジン）中で
、20nmolのCONN6(配列番号：１１）またはCONN7(配列番号：１２）オリゴヌクレ
オチド、100 μM のATP 、10単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で、３
７℃で１時間実行する。

【００４５】混合物を６８℃で１０分間加熱してＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを不活性化
し、次に、１０ＭのCH₃COONa 145μl 、H₂O 15μl および氷冷アルコール800 μ
l を付加して、オリゴヌクレオチドを沈澱させる。氷中で３０分間インキュベー
ション後、混合物を４℃で２０分間、12,000g で遠心分離する。その結果生じた
ペレットを500 μl の氷冷アルコール（７０％）で洗浄し、800 μl のＴＥ緩衝
液中に溶解する。２６０ｎｍでの光学密度により、リン酸化オリゴヌクレオチド
濃度を確定する。

【００４６】リン酸化オリゴヌクレオチドをマイクロプレートに付着させる前に、９５℃で
１０分間加熱してそれらを変性させ、氷中で急冷して二次構造が生じないように
する。５００ｎｇのリン酸化CONN6(配列番号：１１）またはCONN7(配列番号：１
２）および１μｌの1M 1- メチルイミダゾール、ｐＨ７をマイクロプレートの各
ウエルに付加して、これを氷上で保持する。各ウエルの総容量を蒸留水で７０μ
ｌに調整した後、30μl の冷１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カ
ルボジイミド溶液（１６７ｍＭ）を付加する。

【００４７】マイクロプレートを覆い、インキュベーター（Thermomix(r), Labsystems）中
で５０℃で５時間インキュベートする。５時間インキュベーション後、マイクロ
プレートを0.25%SDSを含有する0.4NNaOHの温溶液（50℃）で３回洗浄する。マイ
クロプレートを同一温溶液で５分間インキュベートして、温NaOH/SDS（50℃）で
再び洗浄する。最後に、マイクロプレートをＴＥ緩衝液で５回洗浄する。被覆マ
イクロプレートは、ウエルがＴＥ緩衝液で満たされている場合には、４℃で数ヶ
月間保持し得る。

【００４８】ゲノムDNA 試料からの増幅配列を、被覆マイクロプレート中でビオチニル化検
出プローブとともにインキュベートする。対立遺伝子特異性である捕捉プローブ
とは異なり、検出プローブは正常および突然変異体配列の両方とハイブリダイズ
し得る。検出プローブの配列を以下に示す： CNN12: 5'-CAGCATTGGAAAGATCTGGCTCA （配列番号：１３）-3'

【００４９】増幅配列およびその５‘末端でビオチニル化される検出プローブは、各ウエル
：水95μl 、PCR 反応物5 μl 、水中に希釈した22nMのビオチニル化プローブ（
配列番号：13) 40μl および1NのNaOH 14 μl 中に連続的に付加することにより
マイクロプレート中で直ちに変性される。１０分後、1MのNaH₂PO₄および１％サ
ルコシル21μl を各ウエルに付加して、総容量を175 μl/ウエルとする。検出プ
ローブの最終濃度は５ｎＭである。マイクロプレートを被覆し、インキュベータ
ー（Thermomix(r), Labsystems）中で４０℃で一夜インキュベートし、次にTBS-
トゥイーンで大々的に洗浄して（５回）、余分のビオチニル化プローブ（配列番
号：１３）を除去する。

【００５０】免疫酵素法を用いてハイブリダイズ化プローブを検出する。各ウエルは、TBS-
BSA-トゥイーン中に1/4000希釈した100 μl の接合体（エキストラビジン−アル
カリ性ホスファターゼ、シグマＥ−２６３６）を受容する。マイクロプレートを
被覆し、２５℃で１時間インキュベートする。インキュベーション後、マイクロ
プレートをＴＢＳ−トゥイーンで５回洗浄する。次に200 μl の予熱（３７℃）
基質（下記の緩衝液：1mM のMgCl₂を含有する１ＭのジエタノールアミンpH9.8:
20ml中の7.5mg のパラ−ニトロ−フェニルホスフェート）を各ウエルに付加する
。マイクロプレートを被覆し、３７℃で３時間インキュベートする。405nm で吸
光度を測定して、特異的シグナルを確定し、630nm でバックグラウンドノイズを
確定する。

【００５１】 CONN6(配列番号：１１）プローブ（正常配列）を用いて得られたシグナルとCO
NN7(配列番号：１２）プローブ（突然変異体配列）を用いて得られたシグナルと
の間のハイブリダイゼーション比（Ｒ）を算出する。算出Ｒ値を用いて、試料DN
A の遺伝子型を以下のように確定する：正常Ｃｘ２６配列に関して同型接合（Ｒ
≧２）、30delG突然変異に関して異型接合(0.5<R<2) 、そして30delG突然変異に
関して同型接合(R≦0.5)。ハイブリダイゼーション比（Ｒ）の範囲は、試料数が
増大すると、わずかに修正され得る。下表は、３９の試料に関して得られた結果
の一例を示す。

【００５２】

【表１】

【００５３】実施例８：温度勾配ゲル電気泳動温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）は、遺伝子の所望の領域内にある任意の種類の
突然変異、例えば欠失、挿入および置換の検出を可能にする（例えば、D. Reine
r et al. Temperature-gradient gel electrophoresis of nucleic acids: Anal
ysis of conformation transitions, sequence variations and protein-nuclei
c acid interactions, Electrophoresis 1989; 10: 377-389; E.P. Lessa and G
. Applebaum Screen techniques for detecting allelic variation in DNA seq
uences. Molecular Ecology 1993; 2: 119-129およびA.L. Borresen-Dale et al
. Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis on the D code(tm) Sy
stem. Bio-Rad US/EG Bulletin 2133 参照）（これらの記載内容は、参照により
本明細書中に含まれる）。

【００５４】しかしながら、TGGEにより、突然変異の種類およびその位置を正確に確定する
ことはできない。従来記載されている分子ハイブリダイゼーション法の場合と同様に、PCR によ
り、ゲノムDNA 試料からCx26遺伝子中の当該領域を先ず増幅する。プライマー配
列を以下に示す： CONN2: 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATTCCTGTGTTGTG
TGC （配列番号：１４）-3' CONN4: 5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3'

【００５５】その５‘末端にＧＣクランプを有する１μＭのCONN2(配列番号：１４）プライ
マーおよび１μＭのCONN4(配列番号：１０）プライマー、分析されるDNA のアリ
コート(2μl 、100 〜300ng)、1.5mM のMgCl₂、200 μM のdNTP、ならびにTaq
ポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを実施する。増幅プログラムは以下の工程から成
る：１）９５℃、５分；２）酵素付加、９５℃、１分；３）６０℃、１分（ラン
プ率＝0.25℃/s);4)72℃、1 分;5) 工程２〜４を４０サイクル反復；そして６）
７２℃、１０分。

【００５６】 TGGEによるこれらのPCR 増幅断片の分析は、ゲル上に単一バンドを生じる同型
接合（正常または突然変異体）試料と、３つのバンドを生じる異型接合試料とを
区別し得る。しかしながら、正常配列に関して同型接合であるゲノム試料と30de
lG突然変異体に関して異型接合であるゲノム試料との区別には、さらなる工程を
要する。

【００５７】正常同型接合試料と突然変異体同型接合試料を区別するために、増幅PCR 生成
物のアリコートを既知の正常同型接合試料または既知の30delG突然変異体同型接
合試料と混合して、異型二重鎖形成に関して分析する。増幅PCR 生成物が正常同
型接合試料から得られる場合、それは既知の30delG突然変異体同型接合試料と異
型二重鎖を形成する。一方、増幅ＰＣＲ生成物が突然変異体同型接合試料から得
られる場合、それは既知の正常同型接合試料と異型二重鎖を形成する。これらの
混合物中での異型二重鎖形成を促すために、それらを９５℃で５分間変性し、そ
の後６５℃で４５分間再生する。

【００５８】初期増幅からのPCR 断片および異型二重鎖形成を可能にするために付加的加熱
工程を施されたモノを、７Ｍ尿素を含有する１０％ポリアクリルアミドゲル上で
分析する。実施例により、30mlゲルを以下の成分を併合することにより調製する
： −12.6g の尿素 −0.75mlの50xTAE −7.5ml のアクリルアミド：ビスアクリルアミド(37.5:1)(40%で） −容量を30mlとするための水 −30μl のTemed(臨機的に付加） −300 μl の10% 過硫酸アンモニウム（臨機的に付加）

【００５９】 Temed および過硫酸アンモニウム付加後、ゲルを２つのガラス板（Dcode Univ
ersal Mutation Detection System(r), BIORAD）間に注ぎ、１時間重合させる。
PCR 混合物のアリコート(7.5μl)を7.5 μl の２ｘ試料溶液(2mMのEDTA、pH8;
70% グリセロール；0.05% キシレンシアノール；0.05% ブロモフェノールブルー
）と混合し、ゲルウエル中に導入する。0.2 ℃／時間の比率で、61℃〜62℃の範
囲の温度勾配で、１．２５ｘＴＡＥ緩衝液中で150Vで４〜５時間、電気泳動を実
施する。電気泳動処理後、25μg/mlの臭化エチジウムを含有する1.25xTAE中で６
分間、ゲルをインキュベートする。1.25xTAE中で２０分間洗浄して、余分の臭化
エチジウムを除去し、ＵＶ透視器を用いてDNA 断片を可視化する。

【００６０】典型的TGGE結果を、図１に示す。同型接合患者（正常または突然変異体）から
の増幅ＤＮＡは、１つのバンドのみを生じる。異型接合患者からの増幅DNA は、
ポリアクリルアミドゲル中に３つの異なる断片を生じる。より迅速に移動するよ
り濃いバンドは、両同型二重鎖に対応するが、これはこのゲル中では分離され得
ない。よりゆっくり移動する他の２つのバンドは、両方の種類の異型二重鎖に対
応する。

【００６１】正常同型接合患者のDNA は、異型二重鎖形成を可能にした条件を施されたPCR
断片を分析することにより、突然変異体同型接合患者のDNA と区別され得る。異
型二重鎖は、正常同型接合ゲノムからのPCR 増幅断片が既知の突然変異体同型接
合ゲノムからの配列と混合された場合に、または突然変異体同型接合ゲノムから
のPCR 増幅断片が既知の正常同型接合ゲノムからの配列と混合された場合に、生
成する。これらの異型二重鎖は、TGGE分析により可視化される。その結果、正常
および突然変異体同型接合患者のＤＮＡは、本試験に記載したプライマーを用い
て、この技法により、容易に区別され得る。

【００６２】既知のDFNB1 家族（６／６）のすべて、推定上のDFNB1-連関家族の１家族以外
のすべて、およびDFNB1 連鎖に関して試験されなかった家族の半数(11/21) にお
いて、Cx26における突然変異が検出された。さらに、Cx26突然変異体対立遺伝子
が同定されるかまたは推定されることと無関係であるとみなされる４４の染色体
のうち、33(75%) の染色体が位置３０でのグアノシンＧの同一の欠失（30delG）
を保有することが判明した。

【００６３】Ｃｘ２６突然変異は、劣性遺伝する言語習得前難聴の主因を示し、検査した集
団における原因の約半数に関連すると考えられる。さらに、特異的一突然変異、
30delGは、Cx26突然変異体対立遺伝子の大部分を占める。 LEE S.W. et al. （1992）J. Cell Biol. 118:1213-1221 に発表された野生型
コネキシン２６遺伝子は、以下の配列を有する：

【００６４】

【化１】

【００６５】

【化２】

【００６６】 Kiang, D.T. et al.（1997）Gene 199（1-2 ）:165-171に発表された野生型コ
ネキシン２６遺伝子は、以下の配列を有する：

【化３】

【００６７】

【化４】

【００６８】（配列番号：８）。配列中の下線を施したＡＴＧは、開始コドンに対応する。
太字で印刷したグアニン残基「Ｇ」は、ヌクレオチド２７および３２（すべてを
含む）間の冨グアノシン領域の末端の印である。

【表２】

【００６９】

【表３】

【００７０】ここに報告した分析は、家族1873以外の種々の家族の難聴小児に関する（患者
および方法を参照）。＊一方の耳は中等度の、他方は重症の難聴。＊＊母親における中等度の聴覚損失（高頻度で重症）、＊＊＊ 30delG突然
変異に関して異型接合保有者である父親における軽度聴覚損失。出身地：(Alg) アルジェリア、（Aust）オーストラリア、（Fr）フランス、(L
eb) レバノン、（NZ）ニュージーランド、(Pol) ポーランド、(Por) ポルトガル
、(nTu) 北チュニジア、(sTu) 南チュニジア、(Tur) トルコ。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、突然変異の検出のための温度勾配ゲル電気泳動の結果を示す：レーン１および２：正常患者からのDNA 。レーン３および4:30delG突然変異を有する同型接合患者からのＤＮＡ。レーン５および６：異型接合患者からのDNA 。レーン７：DNA を含有しないPCR 対照。レーン８：正常DNA から増幅され、30delG突然変異を保有する標準DNA 断片と
ハイブリダイズさせたPCR 断片。レーン９：突然変異体異型接合DNA から増幅され、グアニン３０を保有する正
常標準DNA 断片とハイブリダイズさせたPCR 断片。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年２月１５日（２０００．２．１５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 28，ｒｕｅｄｕＤｏｃｔｅｕｒＲｏｕｘ／75724 ＰＡＲＩＳＣＥＤＥＸ 15／ＦＲＡＮＣＥ (72)発明者ウェイル，ドミニークフランス国，エフ−75015 パリ，リュドゥジャベル，11 (72)発明者マルラン−デュベルノワ，サンドリーヌフランス国，エフ−92000 コロンブ，アブニュジ．ビネ，18 (72)発明者グードン，ジャン−ルークフランス国，エフ−92310 セブル，グランリュ，33

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】野生型では遺伝性感覚障害に関連したポリペプチドをコード
する突然変異配列に対応するヌクレオチドの鎖を有する精製ポリヌクレオチドで
あって、前記突然変異精製ポリヌクレオチドが少なくとも１つのヌクレオチドの
特異的欠失から成る群から選択される言語習得前非症候性難聴に関与する突然変
異を表す精製ポリヌクレオチド。
【請求項２】特異的欠失が染色体13q11 〜12のコネキシン２６をコードす
る領域に位置する請求項１の精製ポリヌクレオチド。
【請求項３】特異的欠失がヌクレオチド２７で、好ましくはヌクレオチド
３０で開始してヌクレオチド３２またはヌクレオチド３５に延びる（位置１はイ
ニシエーターコドンの最初の塩基である）冨グアノシン領域に位置する請求項１
または２の精製ポリヌクレオチド。
【請求項４】特異的欠失ポリヌクレオチドが切頭型ポリペプチドをコード
する請求項１〜３のいずれかの精製ポリヌクレオチド。
【請求項５】特異的欠失が位置３０でのグアノシン欠失である請求項１〜
３のいずれかの精製ポリヌクレオチド。
【請求項６】特異的欠失が位置３０で開始する３８ｂｐ欠失である請求項
１〜３のいずれかの精製ポリヌクレオチド。
【請求項７】緊縮条件下で請求項１〜６のいずれかのポリヌクレオチドと
ハイブリダイズする精製ポリヌクレオチド。
【請求項８】請求項７のポリヌクレオチドの１５〜５０連続ヌクレオチド
から成るプライマーとしてまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチド。
【請求項９】以下の配列： 5'-TCTTTTCCAGAGCAAACCGCC（配列番号：１）-3' 5'-TGAGCACGGGTTGCCTCATC （配列番号：２）-3' から成る請求項８の一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】 5'-AGACGATCCTGGGGGTGTGAACAAA（配列番号：５）-3' 5'-ATCCTGGGGGTGTGA（配列番号：６）-3' 5'-AGACGATCCTGGGGGCTCACCGTCCTC（配列番号：７）-3' から成る群から選択される配列を有する請求項８のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】 5'-CTAGTGATTCCTGTGTTGTGTGC（配列番号：９）-3' 5'-ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA （配列番号：１０）-3' である請求項８記載の一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTAGTGATT
CCTGTGTTGTGTGC（配列番号：１４）-3' 5'- ATAATGCGAAAAATGAAGAGGA（配列番号：１０）-3' である請求項８記載の一対のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】ＤＮＡを含有する生物試料における同型接合および異型接
合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出
のための方法であって、ａ）生物試料を請求項８〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプ
ライマーと接触させて、試料中に含入されるDNA が、ハイブリダイゼーションの
ために、そして生物試料中に含有されるDNA とのプライマーのハイブリダイゼー
ションを可能にする条件下で、任意に利用可能にされ；ｂ）DNA を増幅し；ｃ）増幅生成物を明示し；そしてｄ）適切な技法により突然変異を検出する；工程を含んで成る方法。
【請求項１４】工程ｄ）において、以下の技法： −一本鎖高次構造多型（SSCP）、または −変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（DGGE）、または −シーケンシング、または −温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）のうちの１つにより突然変異を検出する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】工程ｃ）が、請求項８、９または１０のいずれかに記載の
オリゴヌクレオチドプローブを用いた増幅生成物の検出を包含する請求項１３ま
たは１４の方法。
【請求項１６】ＤＮＡを含有する生物試料における同型接合および異型接
合個体に関する遺伝的感覚障害、即ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出
のための方法であって、ａ）生物試料を請求項８〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドプ
ライマーと接触させて、試料中に含入されるＤＮＡが、ハイブリダイゼーション
のために、そして生物試料中に含有されるDNA とのプライマーのハイブリダイゼ
ーションを可能にする条件下で、任意に利用可能にされ；そして、ｂ）オリゴヌクレオチドプローブと生物試料中に含入されるＤＮＡとの間に形
成されるハイブリッドを検出する；工程を含んで成る方法。
【請求項１７】工程ａ）の前に、生物試料中に含有されるＤＮＡが一対の
プライマーを用いて増幅される請求項１３〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】工程ｄ）が：ａ）正常Cx26配列および30delG突然変異体配列の両方とハイブリダイズする標
識化検出プローブ、および前記正常Cx26配列とハイブリダイズするが前記30delG
突然変異体配列とはハイブリダイズしない一次捕捉プローブとともに増幅生成物
をインキュベートし；ｂ）前記標識化検出プローブ、および前記30delG突然変異体配列とハイブリダ
イズするが前記正常Ｃｘ２６配列とはハイブリダイズしない二次捕捉プローブと
ともに増幅生成物をインキュベートし；ｃ）前記検出プローブと、ならびに前記一次または二次捕捉プローブと増幅生
成物をハイブリダイズし；そしてｄ）前記一次捕捉プローブから得られるハイブリダイゼーションシグナルを前
記二次捕捉プローブから得られるハイブリダイゼーションシグナルと比較する；
工程をさらに包含する請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】工程ａ）において、生物試料を請求項１２記載のオリゴヌ
クレオチドプライマー対と接触させる請求項１８の方法。
【請求項２０】前記一次捕捉プローブが 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGGTGTG（配
列番号：１１）-3' であり、前記二次捕捉プローブが 5'-AAAAAAAATCCTGGGGGTGT
GA（配列番号：１２）-3' である請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】前記検出プローブが 5'-CAGCATTGGAAAGATCTGGCTCA （配列
番号：１３）-3' である請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】前記検出プローブが非放射性標識される請求項１８〜２１
のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】前記検出プローブがビオチンで標識される請求項２２に記
載の方法。
【請求項２４】前記一次および二次捕捉プローブがマイクロプレートに結
合される請求項１８〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】工程ａ）において、生物試料を請求項１２のオリゴヌクレ
オチドプライマー対と接触させる請求項１３に記載の方法。
【請求項２６】工程ｂ）と工程ｃ）の間に、既知の正常同型接合Cx26試料からの一次ヌクレオチド配列または既知の突然変
異体Ｃｘ２６試料からの二次ヌクレオチド配列とともに増幅ＤＮＡをインキュベ
ートし；そして増幅ＤＮＡを前記一次ヌクレオチド配列または前記二次ヌクレオチド配列とハ
イブリダイズさせる；工程をさらに含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】工程ｄ）が正常同型接合Cx26個体からのDNA と突然変異体
同型接合Cx26個体からのDNA を区別するためにハイブリダイズ化DNA を分析する
ことを包含する請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】同型接合および異型接合個体に関する遺伝的感覚障害、即
ち常染色体性言語習得前非症候性難聴の検出のためのキットであって、ａ）請求項８、９、１０、１１または１２のいずれかに記載のオリゴヌクレオ
チド；ｂ）ＤＮＡ増幅の実行に必要な試薬；およびｃ）増幅断片の長さの確定を可能にし、または突然変異の検出を可能にする構
成成分；を含んで成るキット。