JP2001524317A - 細胞内の機能的核酸分子を同定および阻害するための方法 - Google Patents
細胞内の機能的核酸分子を同定および阻害するための方法Info
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Abstract
(57)【要約】
２つの手法が提供される；第１の手法は、必須の遺伝子および機能的遺伝子を迅速かつ有効に同定する手段を提供する；そして第２の手法は、生物学的活性核酸分子（リボザイム、ＥＧＳ、およびアンチセンス）を得る手段を提供し、これは機能的遺伝子を不活性化するために使用され得る。第１の方法において、ＥＧＳのライブラリーは、全ての可能な公知の組成物に基づいて調製される。好ましい実施態様において、このＥＧＳは、基質を切断するための標的細菌ＲＮＡｓｅに対して１２−マーまたは１３−マーである。このライブラリーは、スクリーニングされる遺伝子を含む細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に添加される。ＥＧＳが生育可能性の喪失または他の表現型を引き起こす細胞は、同定される。生育可能性の喪失の原因であるＥＧＳ（複数）は、分析され、そして生じた配列情報は、公知のゲノム配列内の遺伝子を同定するために使用される。第２の方法において、最適な生物学的活性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｐによる目的の遺伝子の切断の指向）を有するヌクレオチド分子は、２つのレポーター遺伝子（第１は目的の遺伝子を有するフェーズ内、および第２は細胞にベクターが存在することを証明するため、またはそのベクターを含む細胞を選択を補助するためのコントロールとして）を含むベクターの使用を通じて迅速に同定される。次いで、目的の遺伝子が機能的オリゴヌクレオチド分子により切断されるこれらの細胞は、レポーター遺伝子１を参照することによって同定され得る。次いで、応答性機能的オリゴヌクレオチド分子は、単離され、そして特徴付けられる。これらの方法は、その配列が未知の機能を有するゲノムの一部分としてのみ知られる必須遺伝子を同定するための強力な手段、ならびに診断用試薬および治療剤として有用な、機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するための手段を提供する。
Description
【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、米国特許出願番号０８／９７６，２２０（１９９７年１１月２１日
に、Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｗ．Ｎｉｌｓｅｎ，Ｈｕｇｈ Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎお
よびＴｈｏｍａｓ Ｊ．Ｋｉｎｄｔにより出願された）および特許請求の範囲の
部分的継続であり、米国特許出願番号６０／０７９，８５１（１９９８年３月３
０日にＴｉｍｏｔｈｙ Ｗ．Ｎｉｌｓｅｎによって出願された）に対する優先権
を主張する。
に、Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｗ．Ｎｉｌｓｅｎ，Ｈｕｇｈ Ｄ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎお
よびＴｈｏｍａｓ Ｊ．Ｋｉｎｄｔにより出願された）および特許請求の範囲の
部分的継続であり、米国特許出願番号６０／０７９，８５１（１９９８年３月３
０日にＴｉｍｏｔｈｙ Ｗ．Ｎｉｌｓｅｎによって出願された）に対する優先権
を主張する。
【０００２】 （発明の背景） 本発明は通常、生物学的活性核酸分子（例えば、ＥＧＳ、リボザイム、および
アンチセンスＲＮＡ）の分野にあり、そして複合ゲノムの機能的分析の広範な分
野にあり、そしてより特異的には、生育可能のために必須のタンパク質をコード
するメッセンジャーＲＮＡの発現を特異的に下方調整するための生物学的活性核
酸（ＲＮＡ）の使用である。
アンチセンスＲＮＡ）の分野にあり、そして複合ゲノムの機能的分析の広範な分
野にあり、そしてより特異的には、生育可能のために必須のタンパク質をコード
するメッセンジャーＲＮＡの発現を特異的に下方調整するための生物学的活性核
酸（ＲＮＡ）の使用である。
【０００３】 最近の自動化ＤＮＡ配列決定技術の発展および多くの生物体のゲノムへのそれ
らの応用は、膨大な量のヌクレオチド配列情報の蓄積を生じている。現在、いく
つかの重要な病原体（最も最近では結核および梅毒を引き起こす病原体）を含む
１６種の細菌のゲノム配列が、それらの全体において決定されている。さらに、
「単純な」原核生物（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
完全な配列は、公知でありそして線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの同様の分析は簡単に
公開される。より多くのゲノム配列は、原核生物および真核生物共に、短期間に
示されるようである。
らの応用は、膨大な量のヌクレオチド配列情報の蓄積を生じている。現在、いく
つかの重要な病原体（最も最近では結核および梅毒を引き起こす病原体）を含む
１６種の細菌のゲノム配列が、それらの全体において決定されている。さらに、
「単純な」原核生物（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の
完全な配列は、公知でありそして線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの同様の分析は簡単に
公開される。より多くのゲノム配列は、原核生物および真核生物共に、短期間に
示されるようである。
【０００４】 主な挑戦は、利用可能なかつ来たるべきゲノム情報の機能的分析（すなわち、
配列決定により表される遺伝子の生物学的役割の決定）を含む。特に、生育可能
のために必須のタンパク質をコードする遺伝子を同定することが重要である。こ
のようなタンパク質は、病原性生物を標的化する有効な化学的治療薬の発展にお
いて明らかに重要である。現在、生命情報科学、発現分析、および標的遺伝子の
破壊を含む機能的ゲノム分析に対して、単独で、または組み合わせて、いくつか
の利用可能な戦略が存在する。情報科学のみでは、決定的な新しい遺伝子機能の
洞察を提供しそうではない。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉがこれまでに最も研究された
生物体であるが、そのゲノム配列は、遺伝子の約４０％の機能が未知であること
が明らかにされた。発現プロフィールは、主に推測した情報を提供し、そして標
的遺伝子の破壊は、決定的であるが集約的労働であり時間消費的である。
配列決定により表される遺伝子の生物学的役割の決定）を含む。特に、生育可能
のために必須のタンパク質をコードする遺伝子を同定することが重要である。こ
のようなタンパク質は、病原性生物を標的化する有効な化学的治療薬の発展にお
いて明らかに重要である。現在、生命情報科学、発現分析、および標的遺伝子の
破壊を含む機能的ゲノム分析に対して、単独で、または組み合わせて、いくつか
の利用可能な戦略が存在する。情報科学のみでは、決定的な新しい遺伝子機能の
洞察を提供しそうではない。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉがこれまでに最も研究された
生物体であるが、そのゲノム配列は、遺伝子の約４０％の機能が未知であること
が明らかにされた。発現プロフィールは、主に推測した情報を提供し、そして標
的遺伝子の破壊は、決定的であるが集約的労働であり時間消費的である。
【０００５】 従って、特定の生物体において全てのまたは大部分の必須遺伝子を同定する、
強力で高い処理量の方法を有することが高く所望される。
強力で高い処理量の方法を有することが高く所望される。
【０００６】 従って、生存のために必須のタンパク質をコードする細菌細胞および真核生物
細胞において遺伝子を同定するための有効な方法および組成物を提供することが
、本発明の目的である。
細胞において遺伝子を同定するための有効な方法および組成物を提供することが
、本発明の目的である。
【０００７】 このような遺伝子の発現を減少または不活性化するための方法および組成物を
提供することは、本発明のさらなる目的である。
提供することは、本発明のさらなる目的である。
【０００８】 リボ核酸（ＲＮＡ）分子は、遺伝情報のキャリア（例えば、ゲノムレトロウイ
ルスＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子）としておよびタンパ
ク質合成の必須の構造（例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボ
ゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子）としてのみならず、核酸分子を特異的に切断す
る酵素としてもまた機能し得る。このような触媒ＲＮＡ分子はリボザイムと呼ば
れる。リボザイムは、理論上ＲＮＡ分子における任意の所望される部位を切断し
得るが、実際には全ての部位が、それらの部位を切断するように設計されるリボ
ザイムによって効率的に切断されるわけではない。これは、インビボにおいて、
特に事実であり、ここで多くの実験は標的リボザイムにより非効率的に切断され
る部位が記載されている。この問題は、目的のＲＮＡ分子において欠失部位の全
体でなく、むしろ多くの可能な部位の間で、どの部位が最も効率的に切断され得
るかの決定である。これは、最も有効な切断部位、および切断され得る単なる任
意の部位ではない部位を同定することは、しばしば所望されるため、重要である
。ＲＮＡ分子における１つまたは２、３の部位を基本的にはランダムに標的化し
、次いで切断について試験するプロセスは、最も有効な部位を同定しそうではな
い。全ての部位の包括的な試験は、各リボザイムまたは外部ガイド配列（「ＥＧ
Ｓ」）の作成および試験に関与する労働量のため、実用的でない。Ｉｎｎｏｖｉ
ｒによるＷＯ９６／２１７３１には、異なる部位を標的化する８０の異なるＥＧ
Ｓを作成および試験することによりこの様式における効率的な切断部位の選択を
記載している。しかし、これは、可能な部位の部分のみを表示した。切断のため
に接近可能な部位を同定するための類似の労働集約的方法を使用する技術は、米
国特許第５，５２５，４６８号および米国特許第５，４９６，６９８号に記載さ
れる。
ルスＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子）としておよびタンパ
ク質合成の必須の構造（例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボ
ゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子）としてのみならず、核酸分子を特異的に切断す
る酵素としてもまた機能し得る。このような触媒ＲＮＡ分子はリボザイムと呼ば
れる。リボザイムは、理論上ＲＮＡ分子における任意の所望される部位を切断し
得るが、実際には全ての部位が、それらの部位を切断するように設計されるリボ
ザイムによって効率的に切断されるわけではない。これは、インビボにおいて、
特に事実であり、ここで多くの実験は標的リボザイムにより非効率的に切断され
る部位が記載されている。この問題は、目的のＲＮＡ分子において欠失部位の全
体でなく、むしろ多くの可能な部位の間で、どの部位が最も効率的に切断され得
るかの決定である。これは、最も有効な切断部位、および切断され得る単なる任
意の部位ではない部位を同定することは、しばしば所望されるため、重要である
。ＲＮＡ分子における１つまたは２、３の部位を基本的にはランダムに標的化し
、次いで切断について試験するプロセスは、最も有効な部位を同定しそうではな
い。全ての部位の包括的な試験は、各リボザイムまたは外部ガイド配列（「ＥＧ
Ｓ」）の作成および試験に関与する労働量のため、実用的でない。Ｉｎｎｏｖｉ
ｒによるＷＯ９６／２１７３１には、異なる部位を標的化する８０の異なるＥＧ
Ｓを作成および試験することによりこの様式における効率的な切断部位の選択を
記載している。しかし、これは、可能な部位の部分のみを表示した。切断のため
に接近可能な部位を同定するための類似の労働集約的方法を使用する技術は、米
国特許第５，５２５，４６８号および米国特許第５，４９６，６９８号に記載さ
れる。
【０００９】 Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１５）：３０１
０−３０１６（１９９６）には、ｐ３００ＲＮＡの部位がインビボでのハンマー
ヘッドリボザイムにより切断される効率を評価するために、アデノウイルスＥ１
Ａ随伴３００ｋＤａタンパク質（ｐ３００）およびルシフェラーゼとの間の融合
をコードする転写の使用が記載される。ＧＵＸトリプレット（これはハンマーヘ
ッドリボザイムによる切断を要求される）を有する部位を標的とする２〜３のハ
ンマーヘッドリボザイムは、細胞内のベクターより設計および発現された。個々
のベクターはｐ３００ルシフェラーゼ融合ＲＮＡを発現した。ｐ３００の転写部
分における切断部位は、ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価される。
Ｋａｗａｓａｋｉらは、各リボザイムを別々に試験した。従って、それらの方法
もまた、迅速で有効な選択過程に対する必要性を解決しない。
０−３０１６（１９９６）には、ｐ３００ＲＮＡの部位がインビボでのハンマー
ヘッドリボザイムにより切断される効率を評価するために、アデノウイルスＥ１
Ａ随伴３００ｋＤａタンパク質（ｐ３００）およびルシフェラーゼとの間の融合
をコードする転写の使用が記載される。ＧＵＸトリプレット（これはハンマーヘ
ッドリボザイムによる切断を要求される）を有する部位を標的とする２〜３のハ
ンマーヘッドリボザイムは、細胞内のベクターより設計および発現された。個々
のベクターはｐ３００ルシフェラーゼ融合ＲＮＡを発現した。ｐ３００の転写部
分における切断部位は、ルシフェラーゼ活性を測定することにより評価される。
Ｋａｗａｓａｋｉらは、各リボザイムを別々に試験した。従って、それらの方法
もまた、迅速で有効な選択過程に対する必要性を解決しない。
【００１０】 個々の切断可能な部位に対する実際的な試験の代替として、またはこのような
試験に先立って、理論上の考慮より、またはＲＮＡ分子における部位で二次構造
または三次構造の存在または非存在を経験的に試験することにより、どの部位が
利用できるかを予測する試みがまた、行われてきた。例えば、Ｒｕｆｆｎｅｒら
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１０６９５−１０７０２（１９９０）、Ｚ
ｏｕｍａｄａｋｉｓおよびＴａｂｌｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３
：１１９２−１１９６（１９９５）、Ｓｈｉｍａｙａｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３４：３６４９−３６５４（１９９５）、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧ
ｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）、およびＬ
ｉｅｂｅｒおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−
４７２（１９９５）は、切断可能な部位を予測するために、ＲＮＡの構造形成の
ルールを使用した試みを記載している。しかし、ＲＮＡ分子の構造は、理論上の
考慮より正確に予測され得ず、そしてＲＮＡ分子の実際の二次構造および三次構
造の決定は、広範な実験を要求する。また、リボザイムおよび細胞内で機能する
他の生物学的活性分子を同定することは、インビトロで機能的なこのような生物
学的活性分子全てが細胞において機能的であるとは限らないため、困難であり得
る。なぜならば、それらの分子は、例えば細胞内タンパク質によって不適切に配
置され、配列決定され、または結合されるからである。
試験に先立って、理論上の考慮より、またはＲＮＡ分子における部位で二次構造
または三次構造の存在または非存在を経験的に試験することにより、どの部位が
利用できるかを予測する試みがまた、行われてきた。例えば、Ｒｕｆｆｎｅｒら
，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１０６９５−１０７０２（１９９０）、Ｚ
ｏｕｍａｄａｋｉｓおよびＴａｂｌｅｒ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３
：１１９２−１１９６（１９９５）、Ｓｈｉｍａｙａｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３４：３６４９−３６５４（１９９５）、ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧ
ｅｒｌａｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）、およびＬ
ｉｅｂｅｒおよびＳｔｒａｕｓｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−
４７２（１９９５）は、切断可能な部位を予測するために、ＲＮＡの構造形成の
ルールを使用した試みを記載している。しかし、ＲＮＡ分子の構造は、理論上の
考慮より正確に予測され得ず、そしてＲＮＡ分子の実際の二次構造および三次構
造の決定は、広範な実験を要求する。また、リボザイムおよび細胞内で機能する
他の生物学的活性分子を同定することは、インビトロで機能的なこのような生物
学的活性分子全てが細胞において機能的であるとは限らないため、困難であり得
る。なぜならば、それらの分子は、例えば細胞内タンパク質によって不適切に配
置され、配列決定され、または結合されるからである。
【００１１】 従って、本発明の目的は、インビトロで効率的にＲＮＡ分子の発現を変化させ
る生物学的活性ＲＮＡ分子（例えば、リボザイム、リボザイムに対するＥＧＳ、
およびアンチセンスＲＮＡ）を同定するための方法および組成物を提供すること
である。
る生物学的活性ＲＮＡ分子（例えば、リボザイム、リボザイムに対するＥＧＳ、
およびアンチセンスＲＮＡ）を同定するための方法および組成物を提供すること
である。
【００１２】 本発明のさらなる目的は、ＲＮＡ、または標的ＲＮＡの発現に関与するヌクレ
オチド分子における、インビボでの発現の変更に対する標的部位として最も利用
しやすい部位を同定するための方法および組成物を提供することである。
オチド分子における、インビボでの発現の変更に対する標的部位として最も利用
しやすい部位を同定するための方法および組成物を提供することである。
【００１３】 本発明のさらなる目的は、利用しやすい部位として同定される部位に対する機
能的オリゴヌクレオチド分子を提供することである。
能的オリゴヌクレオチド分子を提供することである。
【００１４】 （発明の要旨） ２つの手法が提供される；第１の手法は、必須遺伝子および機能的遺伝子を迅
速かつ有効に同定する手段を提供する；そして第２の手法は、生物学的活性ヌク
レオチド分子（リボザイム、ＥＧＳ、およびアンチセンス）を得る手段を提供し
、これは機能的遺伝子を不活性化するために使用され得る。
速かつ有効に同定する手段を提供する；そして第２の手法は、生物学的活性ヌク
レオチド分子（リボザイム、ＥＧＳ、およびアンチセンス）を得る手段を提供し
、これは機能的遺伝子を不活性化するために使用され得る。
【００１５】 第１の方法において、ＥＧＳのライブラリーは、全ての可能な公知の組成物に
基づいて調製される。これは、標的化、およびＲＮａｓｅ Ｐおよびスクリーニ
ングされるゲノムの予測サイズに基づくＥＧＳの長さによる切断を要求される最
小の必要な配列を知ることにより容易に算出される。好ましい実施態様において
、ＥＧＳは、基質を切断するための細菌ＲＮａｓｅ Ｐを標的化するための１２
−マーまたは１３−マーである。このＥＧＳのライブラリーは、スクリーニング
するためにこの遺伝子を含む細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に添加される。さら
なる方法は、このライブラリーまたはＥＧＳに曝されたにも関わらず生き延びて
いる細胞を増幅するために、使用され得る。ＥＧＳが生育可能性または他の表現
型の喪失を引き起こす細胞は、同定される。生育可能性の喪失の原因であるＥＧ
Ｓ（複数）は、分析され、そして生じた配列情報は、公知のゲノム配列内の遺伝
子を同定するために使用される。
基づいて調製される。これは、標的化、およびＲＮａｓｅ Ｐおよびスクリーニ
ングされるゲノムの予測サイズに基づくＥＧＳの長さによる切断を要求される最
小の必要な配列を知ることにより容易に算出される。好ましい実施態様において
、ＥＧＳは、基質を切断するための細菌ＲＮａｓｅ Ｐを標的化するための１２
−マーまたは１３−マーである。このＥＧＳのライブラリーは、スクリーニング
するためにこの遺伝子を含む細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に添加される。さら
なる方法は、このライブラリーまたはＥＧＳに曝されたにも関わらず生き延びて
いる細胞を増幅するために、使用され得る。ＥＧＳが生育可能性または他の表現
型の喪失を引き起こす細胞は、同定される。生育可能性の喪失の原因であるＥＧ
Ｓ（複数）は、分析され、そして生じた配列情報は、公知のゲノム配列内の遺伝
子を同定するために使用される。
【００１６】 第２の方法において、最適な生物学的活性（例えば、ＲＮａｓｅ Ｐによる目
的の遺伝子の切断の指向）を有するヌクレオチド分子は、２つのレポーター遺伝
子（第１は目的の遺伝子を有するフレーム内、および第２は細胞におけるベクタ
ーの存在の証明またはそのベクターを含む細胞を選択を補助するためのコントロ
ールとして）を含むベクターの使用を通じて迅速に同定される。例えば、このベ
クターは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（レポーター遺伝子１）および抗生物質
耐性をコードする遺伝子（レポーター遺伝子２）を有するフレームにおいて、細
菌内に薬物耐性（目的の遺伝子）を与える任意のタンパク質をコードする遺伝子
を含み得る。好ましい実施態様において、このベクターはまた、個々のベクター
においても提供され得るが、多くの可能な機能的オリゴヌクレオチド分子（例え
ば、ＥＧＳ）の１つを含む。このベクター（複数）は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細
胞に付加される。このベクターを含む細胞は、抗生物質耐性に対する遺伝子を発
現しない全ての細胞を殺傷する抗生物質での処置により単離され得る。次いで、
目的の遺伝子が機能的オリゴヌクレオチド分子により切断されるこれらの細胞は
、レポーター遺伝子１を参照して同定され得る。次いで、同定されたこれらの細
胞は、増幅され得る。一つの好ましい実施態様において、目的の遺伝子は、生育
可能のために必須である。この場合、細菌を有するプレートが最初に複製され、
次いで目的のｍＲＮＡの切断により殺傷される細胞が同定され、そして応答性機
能的オリゴヌクレオチド分子は、二連のプレートから単離される。
的の遺伝子の切断の指向）を有するヌクレオチド分子は、２つのレポーター遺伝
子（第１は目的の遺伝子を有するフレーム内、および第２は細胞におけるベクタ
ーの存在の証明またはそのベクターを含む細胞を選択を補助するためのコントロ
ールとして）を含むベクターの使用を通じて迅速に同定される。例えば、このベ
クターは、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（レポーター遺伝子１）および抗生物質
耐性をコードする遺伝子（レポーター遺伝子２）を有するフレームにおいて、細
菌内に薬物耐性（目的の遺伝子）を与える任意のタンパク質をコードする遺伝子
を含み得る。好ましい実施態様において、このベクターはまた、個々のベクター
においても提供され得るが、多くの可能な機能的オリゴヌクレオチド分子（例え
ば、ＥＧＳ）の１つを含む。このベクター（複数）は、Ｅ．ｃｏｌｉのような細
胞に付加される。このベクターを含む細胞は、抗生物質耐性に対する遺伝子を発
現しない全ての細胞を殺傷する抗生物質での処置により単離され得る。次いで、
目的の遺伝子が機能的オリゴヌクレオチド分子により切断されるこれらの細胞は
、レポーター遺伝子１を参照して同定され得る。次いで、同定されたこれらの細
胞は、増幅され得る。一つの好ましい実施態様において、目的の遺伝子は、生育
可能のために必須である。この場合、細菌を有するプレートが最初に複製され、
次いで目的のｍＲＮＡの切断により殺傷される細胞が同定され、そして応答性機
能的オリゴヌクレオチド分子は、二連のプレートから単離される。
【００１７】 これらの方法は、その配列が未知の機能を有するゲノムの一部分としてのみ知
られる必須遺伝子を同定するための強力な手段、ならびに診断用試薬および治療
剤として有用な、機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するための手段を提供す
る。
られる必須遺伝子を同定するための強力な手段、ならびに診断用試薬および治療
剤として有用な、機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するための手段を提供す
る。
【００１８】 （発明の詳細な説明） ２つの一般的な方法を記載する。まず第１は、ＥＧＳを用いた、公知のゲノム
において必須の遺伝子または機能的な遺伝子の同定のための方法であり、そして
第２は、所望されるＲＮＡ分子上で活性であるＥＧＳ、リボザイム、およびアン
チセンスを含む機能的なオリゴヌクレオチド分子を同定するための方法である。
後者の方法の好ましい実施態様において、機能的なオリゴヌクレオチド分子は、
ＥＧＳであり、そして所望されるＲＮＡ分子は、公知の遺伝子から転写されるＲ
ＮＡである。
において必須の遺伝子または機能的な遺伝子の同定のための方法であり、そして
第２は、所望されるＲＮＡ分子上で活性であるＥＧＳ、リボザイム、およびアン
チセンスを含む機能的なオリゴヌクレオチド分子を同定するための方法である。
後者の方法の好ましい実施態様において、機能的なオリゴヌクレオチド分子は、
ＥＧＳであり、そして所望されるＲＮＡ分子は、公知の遺伝子から転写されるＲ
ＮＡである。
【００１９】 （Ｉ．方法および試薬の定義および一般的な要素） リボ核酸（ＲＮＡ）分子は、遺伝情報のキャリア（例えば、ゲノムのレトロウ
イルスのＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子）、ならびにタン
パク質合成に必須の構造（例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリ
ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子）としてだけではなく、核酸分子を特異的に切
断する酵素として、または核酸分子を特異的に切断する酵素を指示する要素とし
て働き得る。これらの任意のＲＮＡは、機能的なオリゴヌクレオチド分子による
切断または不活化のための標的となり得る。
イルスのＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子）、ならびにタン
パク質合成に必須の構造（例えば、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリ
ボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子）としてだけではなく、核酸分子を特異的に切
断する酵素として、または核酸分子を特異的に切断する酵素を指示する要素とし
て働き得る。これらの任意のＲＮＡは、機能的なオリゴヌクレオチド分子による
切断または不活化のための標的となり得る。
【００２０】 開示された方法およびベクターの鍵となる利点は、同定された機能的なオリゴ
ヌクレオチド分子、またはそのような同定されたＲＮＡ分子にもとづいたアフェ
クターオリゴマーを用いる設定に、同じかまたは類似している、インビボでの設
定における目的のＲＮＡの発現の変化の評価である。開示される方法の別の利点
は、目的のＲＮＡの接近可能な部位の全てまたは実質的な数が、１回のアッセイ
により決定され得ることである。ある型の機能的なオリゴヌクレオチド分子につ
いて接近可能であることが決定されたそのような部位が、他の型の機能的なオリ
ゴヌクレオチド分子について接近可能であり得る。リボザイムおよびＥＧＳの場
合において、開示された方法は、目的のＲＮＡの切断の評価だけではなく、その
ような切断の結果としての究極の所望される表現型（つまり、目的のＲＮＡによ
り支持される表現型の喪失）の評価を可能とする。
ヌクレオチド分子、またはそのような同定されたＲＮＡ分子にもとづいたアフェ
クターオリゴマーを用いる設定に、同じかまたは類似している、インビボでの設
定における目的のＲＮＡの発現の変化の評価である。開示される方法の別の利点
は、目的のＲＮＡの接近可能な部位の全てまたは実質的な数が、１回のアッセイ
により決定され得ることである。ある型の機能的なオリゴヌクレオチド分子につ
いて接近可能であることが決定されたそのような部位が、他の型の機能的なオリ
ゴヌクレオチド分子について接近可能であり得る。リボザイムおよびＥＧＳの場
合において、開示された方法は、目的のＲＮＡの切断の評価だけではなく、その
ような切断の結果としての究極の所望される表現型（つまり、目的のＲＮＡによ
り支持される表現型の喪失）の評価を可能とする。
【００２１】 （Ａ．目的のＲＮＡ分子） 目的のＲＮＡ分子は、転写され得る任意のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の一部
であり得る。目的のＲＮＡ分子は、その発現が阻害される目的の遺伝子の発現に
関与するＲＮＡ分子であることが好ましい。ＲＮＡ分子は、複数のイントロンま
たは１つのイントロンを含む、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡの一部、プレｍＲＮＡであり
得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、ウイルスＲＮＡであり得る。
であり得る。目的のＲＮＡ分子は、その発現が阻害される目的の遺伝子の発現に
関与するＲＮＡ分子であることが好ましい。ＲＮＡ分子は、複数のイントロンま
たは１つのイントロンを含む、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡの一部、プレｍＲＮＡであり
得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、ウイルスＲＮＡであり得る。
【００２２】 重要な病原体は以下を含む：細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈａｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄ
ａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ
ｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｅａｅ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、および真菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍａｇａｔｕｓ、
およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａｔｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ。
ｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈａｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄ
ａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ
ｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｅａｅ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎ
ｅｕｍｏｎｉａｅ、および真菌Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒ
ｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍａｇａｔｕｓ、
およびＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａｔｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ。
【００２３】 （Ｂ．機能的なオリゴヌクレオチド分子） 機能的なヌクレオチド（代表的にはＲＮＡ）分子は、目的のＲＮＡの発現を変
化させる、または好ましくは阻害するように設計される。これらの分子は、リボ
ザイム、ＲＮａｓｅ ＰのためのＥＧＳ、またはアンチセンスＲＮＡであり得る
。リボザイムおよびＥＧＳは、標的部位でＲＮＡ分子を切断するかまたはその切
断を媒介することにより、ＲＮＡ分子の発現を阻害する。アンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡは、ＲＮＡ分子との配列特異的相互作用によりＲＮＡ分子の発現を阻
害する。
化させる、または好ましくは阻害するように設計される。これらの分子は、リボ
ザイム、ＲＮａｓｅ ＰのためのＥＧＳ、またはアンチセンスＲＮＡであり得る
。リボザイムおよびＥＧＳは、標的部位でＲＮＡ分子を切断するかまたはその切
断を媒介することにより、ＲＮＡ分子の発現を阻害する。アンチセンスＲＮＡま
たはＤＮＡは、ＲＮＡ分子との配列特異的相互作用によりＲＮＡ分子の発現を阻
害する。
【００２４】 （外部ガイド配列（「ＥＧＳ」）） 原核生物または真核生物の細胞における任意のＲＮＡ配列は、ＲＮａｓｅ Ｐ
についての基質へと変換され得る。細菌では、その基質は、その５’末端に切断
されるＲＮＡ中の切断部位に対して３’側のヌクレオチドと相補的なヌクレオチ
ドを、そしてその３’末端にヌクレオチドＮＣＣＡ（Ｎは任意のヌクレオチド）
を有するＥＧＳを用いて作製される。これは、米国特許第５，１６８，０５３号
、ＷＯ９２／０３５６６そしてＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３８：４０７−４０９（１９９０）に記載される。
についての基質へと変換され得る。細菌では、その基質は、その５’末端に切断
されるＲＮＡ中の切断部位に対して３’側のヌクレオチドと相補的なヌクレオチ
ドを、そしてその３’末端にヌクレオチドＮＣＣＡ（Ｎは任意のヌクレオチド）
を有するＥＧＳを用いて作製される。これは、米国特許第５，１６８，０５３号
、ＷＯ９２／０３５６６そしてＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２３８：４０７−４０９（１９９０）に記載される。
【００２５】 ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｐ媒介切断を促進するためのＥＧＳはまた、米国特許第
５，６２４，８２４号、Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）、ＷＯ９３／２２４３４、ＷＯ
９５／２４４８９およびＷＯ９６／２１７３１によって記載されるように、真核
生物系において用いるために開発された。本明細書において用いられる「外部ガ
イド配列」および「ＥＧＳ」とは、標的ＲＮＡとの組み合わせにおいてＲＮａｓ
ｅ Ｐについての基質を形成する、任意のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドアナログをいう。ＥＧＳ技術を好首尾で用いて、細菌（Ａｌｔｍａｎら
、（１９９３））および組織培養中の哺乳動物細胞（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）；
ＬｉｕおよびＡｌｔｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．９：４７１−４８０（１９９５
））の両方において遺伝子発現のレベルを減少させた。
５，６２４，８２４号、Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）、ＷＯ９３／２２４３４、ＷＯ
９５／２４４８９およびＷＯ９６／２１７３１によって記載されるように、真核
生物系において用いるために開発された。本明細書において用いられる「外部ガ
イド配列」および「ＥＧＳ」とは、標的ＲＮＡとの組み合わせにおいてＲＮａｓ
ｅ Ｐについての基質を形成する、任意のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドアナログをいう。ＥＧＳ技術を好首尾で用いて、細菌（Ａｌｔｍａｎら
、（１９９３））および組織培養中の哺乳動物細胞（Ｙｕａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：８００６−８０１０（１９９２）；
ＬｉｕおよびＡｌｔｍａｎ、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．９：４７１−４８０（１９９５
））の両方において遺伝子発現のレベルを減少させた。
【００２６】 ＥＧＳが原核生物のＲＮａｓｅ Ｐに関して機能的であるための必要条件は、
真核生物のＥＧＳについての必要条件よりも厳しくない。原核生物のＥＧＳの決
定的な要素は、以下である：（１）標的化されたＲＮＡ基質と特異的に結合し、
基質ＲＮＡの切断部位に対して３’側に短い配列の塩基対を生産する、ヌクレオ
チド配列、および（２）末端の３’−ＮＣＣＡ（ここでＮは任意のヌクレオチド
であり、好ましくは、プリンである）。この配列は一般的に、４つより少なくは
なく、そしてよりたいてい６〜１５の、標的化されたのＲＮＡと相補的なヌクレ
オチドを有す。全てのヌクレオチドが相補的であることは、重要ではない。切断
の割合は、ＲＮａｓｅ Ｐ、標的化されたＲＮＡを含むハイブリッド基質の２次
構造、およびハイブリッド基質中の３’−ＮＣＣＡの存在に依存している。真核
生物のＥＧＳはまた、原核生物のＲＮａｓｅ Ｐによる切断を促進し、そしてこ
の目的のために用い得る。
真核生物のＥＧＳについての必要条件よりも厳しくない。原核生物のＥＧＳの決
定的な要素は、以下である：（１）標的化されたＲＮＡ基質と特異的に結合し、
基質ＲＮＡの切断部位に対して３’側に短い配列の塩基対を生産する、ヌクレオ
チド配列、および（２）末端の３’−ＮＣＣＡ（ここでＮは任意のヌクレオチド
であり、好ましくは、プリンである）。この配列は一般的に、４つより少なくは
なく、そしてよりたいてい６〜１５の、標的化されたのＲＮＡと相補的なヌクレ
オチドを有す。全てのヌクレオチドが相補的であることは、重要ではない。切断
の割合は、ＲＮａｓｅ Ｐ、標的化されたＲＮＡを含むハイブリッド基質の２次
構造、およびハイブリッド基質中の３’−ＮＣＣＡの存在に依存している。真核
生物のＥＧＳはまた、原核生物のＲＮａｓｅ Ｐによる切断を促進し、そしてこ
の目的のために用い得る。
【００２７】 真核生物のＲＮａｓｅ Ｐによる切断の促進のためのＥＧＳは、本明細書中で
真核生物のＥＧＳといわれ、標的ＲＮＡと相補的で、そしてｔＲＮＡ分子の一部
に類似した２次構造および３次構造を形成する配列を含む。真核生物のＥＧＳの
好ましい形態は、意図する切断部位に対して３’側の標的配列との塩基対合して
アミノアシル受容体ステム（Ａステム）と類似した構造を形成する少なくとも７
つのヌクレオチド、塩基対合してＴステムおよびループと類似したステムおよび
ループ構造を形成するヌクレオチド、それに続く、標的配列と塩基対合してジヒ
ドロキシウラシルステム様構造を形成する少なくとも３つのヌクレオチドを含有
する。真核生物のＥＧＳの別の好ましい形態は、本明細書中で短い外部ガイド配
列（ＳＥＧＳ）といわれ、標的の分子とハイブリダイズした場合、ＲＮａｓｅ
Ｐにより基質として認識される最小限の構造を提供する。ＳＥＧＳ／標的ＲＮＡ
複合体は、ＲＮａｓｅ Ｐの天然の基質であるｔＲＮＡのＡステムおよびＴステ
ムと類似した構造を含む。
真核生物のＥＧＳといわれ、標的ＲＮＡと相補的で、そしてｔＲＮＡ分子の一部
に類似した２次構造および３次構造を形成する配列を含む。真核生物のＥＧＳの
好ましい形態は、意図する切断部位に対して３’側の標的配列との塩基対合して
アミノアシル受容体ステム（Ａステム）と類似した構造を形成する少なくとも７
つのヌクレオチド、塩基対合してＴステムおよびループと類似したステムおよび
ループ構造を形成するヌクレオチド、それに続く、標的配列と塩基対合してジヒ
ドロキシウラシルステム様構造を形成する少なくとも３つのヌクレオチドを含有
する。真核生物のＥＧＳの別の好ましい形態は、本明細書中で短い外部ガイド配
列（ＳＥＧＳ）といわれ、標的の分子とハイブリダイズした場合、ＲＮａｓｅ
Ｐにより基質として認識される最小限の構造を提供する。ＳＥＧＳ／標的ＲＮＡ
複合体は、ＲＮａｓｅ Ｐの天然の基質であるｔＲＮＡのＡステムおよびＴステ
ムと類似した構造を含む。
【００２８】 （リボザイム） リボザイムは、任意のトランス切断触媒核酸を含む。そのようなリボザイムの
いくつかのクラスは、公知であり、そして部位特異的な様式でＲＮＡ分子の切断
のために適合または設計のいずれかがされている。イントロン由来リボザイムは
、米国特許第４，９８７，０７１号、ＷＯ８８／０４３００、およびＣｅｃｈ、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８（１９９０）に記載
されるように、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ＲＮＡにおいて見られる、自己切除イ
ントロン由来である。ハンマーヘッドリボザイムは、特定のウイルスに存在する
自己切断ＲＮＡ分子由来である（Ｂｕｚａｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８８５９−８８６２（１９６８）；Ｆｏｒｓｔｅ
ｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ ５０：９−１６（１９８７））。標的ＲＮＡ
分子の特異的な切断のためのハンマーヘッドリボザイムの設計およびそれらの使
用は、米国特許第５，２５４，６７８号、ＷＯ８９／０５８５２、ＥＰ３２１０
２１および米国特許第５，３３４，７１１号に記載される。ハンマーヘッドリボ
ザイムの誘導体は、米国特許第５，３３４，７１１号；ＷＯ９４／１３７８９；
およびＷＯ９７／１８３１２に記載される。斧頭リボザイムは、デルタ型肝炎ウ
イルスのようないくつかのウイロイドＲＮＡにおける自己切断ドメイン由来であ
る（米国特許第５，５２７，８９５号；米国特許第５，２２５，３３７号、ＷＯ
９１／０４３１９、およびＷＯ９１／０４３２４）。リボザイムはまた、インビ
トロでの進化技術（ＷＯ９５／２４４８９および米国特許第５，５８０，９６７
号）を使用して生成され得る。
いくつかのクラスは、公知であり、そして部位特異的な様式でＲＮＡ分子の切断
のために適合または設計のいずれかがされている。イントロン由来リボザイムは
、米国特許第４，９８７，０７１号、ＷＯ８８／０４３００、およびＣｅｃｈ、
Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３−５６８（１９９０）に記載
されるように、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ＲＮＡにおいて見られる、自己切除イ
ントロン由来である。ハンマーヘッドリボザイムは、特定のウイルスに存在する
自己切断ＲＮＡ分子由来である（Ｂｕｚａｙａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：８８５９−８８６２（１９６８）；Ｆｏｒｓｔｅ
ｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ ５０：９−１６（１９８７））。標的ＲＮＡ
分子の特異的な切断のためのハンマーヘッドリボザイムの設計およびそれらの使
用は、米国特許第５，２５４，６７８号、ＷＯ８９／０５８５２、ＥＰ３２１０
２１および米国特許第５，３３４，７１１号に記載される。ハンマーヘッドリボ
ザイムの誘導体は、米国特許第５，３３４，７１１号；ＷＯ９４／１３７８９；
およびＷＯ９７／１８３１２に記載される。斧頭リボザイムは、デルタ型肝炎ウ
イルスのようないくつかのウイロイドＲＮＡにおける自己切断ドメイン由来であ
る（米国特許第５，５２７，８９５号；米国特許第５，２２５，３３７号、ＷＯ
９１／０４３１９、およびＷＯ９１／０４３２４）。リボザイムはまた、インビ
トロでの進化技術（ＷＯ９５／２４４８９および米国特許第５，５８０，９６７
号）を使用して生成され得る。
【００２９】 （アンチセンス） アンチセンス分子は、普通、ワトソン−クリック塩基対合を介して標的のＲＮ
Ａと結合し得、そしてそれらのＲＮＡの翻訳を防止し得る、一本鎖ＤＮＡ分子も
しくは一本鎖ＲＮＡ分子、またはそれらの置換アナログである（Ｓｔｅｉｎ Ｃ
Ａ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ８（
２）：１２９−３２（１９９８）；Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ８（２）：１１５−２２（１９
９８）；Ａｋｈｔａｒ Ｓ、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．５（４）：２２５−
３４（１９９８）；Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８１、（１９８３）；Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ １５：１２１−５７（１９９８）；Ｚａｍｅ
ｎｉｋ、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ａｉｄｓ、Ｗｉｃｋ
ｓｔｒｏｍ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。それらは，普通
１５〜３０のヌクレオチド長であり、そして種々のタンパク質の発現を阻害する
ために広く用いられている（Ｚａｍｅｃｎｉｃｋ，Ｐ．Ｃ．およびＳｔｅｖｅｎ
ｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５、２８
０（１９７８）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８５、７０８９（１９８８））。ｍＲＮＡの翻訳の阻害に加えて、
ＤＮＡを基礎としたアンチセンスは、内因性のＲＮａｓｅＨ酵素による切断のた
めの標的としてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを提示することによりタンパク質の
発現もまた阻害し得（Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ８（２）：１３３−４（１９９８）；Ｃａｓ
ｅｌｍａｎｎら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０（５−６）：３９４−９（
１９９７）；Ｇｉｌｅｓ，Ｒ．Ｖ．およびＴｉｄｄ，Ｄ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０、７６３（１９９２））、それにより、標的ＲＮＡが
破壊される。アンチセンス分子は、２’の修飾のような化学的修飾およびホスホ
ジエステル結合の代わりの、ホスホロチオエートジエステル結合を導入すること
により、ヌクレアーゼに対してより抵抗性にされ得（Ａｇｒａｗａｌ Ｓおよび
Ｚｈａｏ Ｑ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｖ ８（２）：１３５−９（１９９８）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５、７０８９、（１９８８））、
そしてこれらの分子のＲＮＡとの二重鎖は、ＲＮａｓｅＨによって認識される。
Ａと結合し得、そしてそれらのＲＮＡの翻訳を防止し得る、一本鎖ＤＮＡ分子も
しくは一本鎖ＲＮＡ分子、またはそれらの置換アナログである（Ｓｔｅｉｎ Ｃ
Ａ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ８（
２）：１２９−３２（１９９８）；Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ８（２）：１１５−２２（１９
９８）；Ａｋｈｔａｒ Ｓ、Ｊ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．５（４）：２２５−
３４（１９９８）；Ｍｉｚｕｎｏ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ、８１、（１９８３）；Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ Ｒｅｖ １５：１２１−５７（１９９８）；Ｚａｍｅ
ｎｉｋ、Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ａｉｄｓ、Ｗｉｃｋ
ｓｔｒｏｍ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ））。それらは，普通
１５〜３０のヌクレオチド長であり、そして種々のタンパク質の発現を阻害する
ために広く用いられている（Ｚａｍｅｃｎｉｃｋ，Ｐ．Ｃ．およびＳｔｅｖｅｎ
ｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５、２８
０（１９７８）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８５、７０８９（１９８８））。ｍＲＮＡの翻訳の阻害に加えて、
ＤＮＡを基礎としたアンチセンスは、内因性のＲＮａｓｅＨ酵素による切断のた
めの標的としてＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを提示することによりタンパク質の
発現もまた阻害し得（Ｃｒｏｏｋｅ ＳＴ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ８（２）：１３３−４（１９９８）；Ｃａｓ
ｅｌｍａｎｎら、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０（５−６）：３９４−９（
１９９７）；Ｇｉｌｅｓ，Ｒ．Ｖ．およびＴｉｄｄ，Ｄ．Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０、７６３（１９９２））、それにより、標的ＲＮＡが
破壊される。アンチセンス分子は、２’の修飾のような化学的修飾およびホスホ
ジエステル結合の代わりの、ホスホロチオエートジエステル結合を導入すること
により、ヌクレアーゼに対してより抵抗性にされ得（Ａｇｒａｗａｌ Ｓおよび
Ｚｈａｏ Ｑ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄ
ｅｖ ８（２）：１３５−９（１９９８）；Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５、７０８９、（１９８８））、
そしてこれらの分子のＲＮＡとの二重鎖は、ＲＮａｓｅＨによって認識される。
【００３０】 （Ｃ．ベクター） 開示される方法は、一般的に、レポーター遺伝子、機能的なオリゴヌクレオチ
ド分子を含むか、または含まない細胞の選択のための遺伝子、およびベクターの
発現および複製のために必要な配列を含む、特定のエレメントを有するベクター
を用いる。開示されたベクターは、一般的に２つの型であり、それぞれの型は、
必須の遺伝子および機能的な遺伝子を同定するためのアッセイ、または機能的な
オリゴヌクレオチド分子を同定するアッセイのいずれにも適応する。これらを一
般的に以下に記載する。
ド分子を含むか、または含まない細胞の選択のための遺伝子、およびベクターの
発現および複製のために必要な配列を含む、特定のエレメントを有するベクター
を用いる。開示されたベクターは、一般的に２つの型であり、それぞれの型は、
必須の遺伝子および機能的な遺伝子を同定するためのアッセイ、または機能的な
オリゴヌクレオチド分子を同定するアッセイのいずれにも適応する。これらを一
般的に以下に記載する。
【００３１】 （必須の遺伝子または機能的な遺伝子の同定に用いるためのベクター） 必須の遺伝子または機能的な遺伝子の同定方法に用いるためのベクターは、縮
重した標的化配列を含む機能的なオリゴヌクレオチド分子をコードする。縮重し
た標的化配列を含むことにより、コードされる機能的なオリゴヌクレオチド分子
のセットは、すべての可能となる配列を標的とした、機能的なオリゴヌクレオチ
ド分子を含む。標的とする配列の長さは、好ましくは、アッセイされる細胞のゲ
ノムに存在する独特の配列の長さと合うように選ばれる。この関係を、以下にさ
らに詳しく記載する。その効果は、目的の細胞のゲノムにおける可能である全て
の独特な配列を標的とする機能的なオリゴヌクレオチド分子のセットを集合的に
コードするベクターのセットを得ることである。ベクターのセットは、細胞内に
形質転換またはトランスフェクトされ、そしてその細胞は、細胞死または目的の
表現型の変化ついてよりスクリーニングまたは選択される。選択された細胞は、
細胞内の必須の遺伝子または機能的な遺伝子へと標的化される機能的なオリゴヌ
クレオチド分子を含む。次いで、機能的なオリゴヌクレオチド分子は、細胞内の
ベクターの特徴づけにより同定され得る。機能的なオリゴヌクレオチド分子によ
って標的化された遺伝子は、機能的なオリゴヌクレオチド分子中の標的化された
配列を既知のゲノム配列と相関付けることにより、同定され得る。
重した標的化配列を含む機能的なオリゴヌクレオチド分子をコードする。縮重し
た標的化配列を含むことにより、コードされる機能的なオリゴヌクレオチド分子
のセットは、すべての可能となる配列を標的とした、機能的なオリゴヌクレオチ
ド分子を含む。標的とする配列の長さは、好ましくは、アッセイされる細胞のゲ
ノムに存在する独特の配列の長さと合うように選ばれる。この関係を、以下にさ
らに詳しく記載する。その効果は、目的の細胞のゲノムにおける可能である全て
の独特な配列を標的とする機能的なオリゴヌクレオチド分子のセットを集合的に
コードするベクターのセットを得ることである。ベクターのセットは、細胞内に
形質転換またはトランスフェクトされ、そしてその細胞は、細胞死または目的の
表現型の変化ついてよりスクリーニングまたは選択される。選択された細胞は、
細胞内の必須の遺伝子または機能的な遺伝子へと標的化される機能的なオリゴヌ
クレオチド分子を含む。次いで、機能的なオリゴヌクレオチド分子は、細胞内の
ベクターの特徴づけにより同定され得る。機能的なオリゴヌクレオチド分子によ
って標的化された遺伝子は、機能的なオリゴヌクレオチド分子中の標的化された
配列を既知のゲノム配列と相関付けることにより、同定され得る。
【００３２】 （機能的なオリゴヌクレオチド分子の同定に用いるためのベクター） 機能的なオリゴヌクレオチド分子アッセイに用いるためのベクターは、目的の
ＲＮＡ分子およびレポータータンパク質ＡをコードするＲＮＡを含む融合転写物
をコードするレポーター遺伝子１を含む。目的のＲＮＡ分子の不活化は、レポー
タータンパク質Ａの発現を変化させる。このベクターは、第２のレポータータン
パク質Ｂをコードする、第２のレポーター遺伝子２もまた含む。第２のレポータ
ータンパク質Ｂの発現は、細胞内へのベクターの形質転換またはトランスフェク
ションを検出するために、および目的のＲＮＡ分子の発現の阻害に起因しない第
１のレポータータンパク質の発現に対する効果のコントロールとしての両方にお
いて用いられ得る。このベクターは、目的のＲＮＡに標的化された機能的なオリ
ゴヌクレオチド分子もまた、コードする。この方法は、好ましくは、これらのベ
クターのセットを用い、ここでこのセットにおけるそれぞれのベクターは、異な
る機能的なオリゴヌクレオチド分子をコードし、目的のＲＮＡ分子の異なる部位
へとそれぞれ標的化される。ベクターのこのセットは、適切な細胞に形質転換ま
たはトランスフェクトされ、そしてその細胞は、第２のレポータータンパク質Ｂ
の発現についてスクリーニングまたは選択される。次いで、レポータータンパク
質Ｂを発現している細胞は、第１のレポータータンパク質Ａを発現していない細
胞、またはレポータータンパク質Ａを低レベルでしか発現していない細胞につい
て、スクリーニングまたは選択される。これらの細胞は、次いで細胞内のベクタ
ーを特徴付けることにより同定され得る、最も効率的な機能的なオリゴヌクレオ
チド分子を保有する。
ＲＮＡ分子およびレポータータンパク質ＡをコードするＲＮＡを含む融合転写物
をコードするレポーター遺伝子１を含む。目的のＲＮＡ分子の不活化は、レポー
タータンパク質Ａの発現を変化させる。このベクターは、第２のレポータータン
パク質Ｂをコードする、第２のレポーター遺伝子２もまた含む。第２のレポータ
ータンパク質Ｂの発現は、細胞内へのベクターの形質転換またはトランスフェク
ションを検出するために、および目的のＲＮＡ分子の発現の阻害に起因しない第
１のレポータータンパク質の発現に対する効果のコントロールとしての両方にお
いて用いられ得る。このベクターは、目的のＲＮＡに標的化された機能的なオリ
ゴヌクレオチド分子もまた、コードする。この方法は、好ましくは、これらのベ
クターのセットを用い、ここでこのセットにおけるそれぞれのベクターは、異な
る機能的なオリゴヌクレオチド分子をコードし、目的のＲＮＡ分子の異なる部位
へとそれぞれ標的化される。ベクターのこのセットは、適切な細胞に形質転換ま
たはトランスフェクトされ、そしてその細胞は、第２のレポータータンパク質Ｂ
の発現についてスクリーニングまたは選択される。次いで、レポータータンパク
質Ｂを発現している細胞は、第１のレポータータンパク質Ａを発現していない細
胞、またはレポータータンパク質Ａを低レベルでしか発現していない細胞につい
て、スクリーニングまたは選択される。これらの細胞は、次いで細胞内のベクタ
ーを特徴付けることにより同定され得る、最も効率的な機能的なオリゴヌクレオ
チド分子を保有する。
【００３３】 このベクターは、自立複製し得るベクター、ウイルスベクター、宿主の染色体
内に組込まれる核酸、および一次的に発現され得る核酸分子であり得る。レポー
ター遺伝子は、任意の適切な発現配列を用いて発現され得る。多数の発現配列は
、公知であり、そしてレポーター遺伝子の発現に用いられ得る。発現配列は、一
般的に、プロモーター、ターミネーター、および真核生物細胞に用いるためのエ
ンハンサーに分類され得る。原核生物細胞での発現はまた、適切な翻訳開始のた
めに、コード領域のすぐ上流に、シャイン−ダルガーノ配列を必要とする。誘導
性プロモーターは、第１のレポーター遺伝子と共に用いるために好ましい。なぜ
なら、第１のレポーター遺伝子の発現が、調節可能であることが好ましいからで
ある。
内に組込まれる核酸、および一次的に発現され得る核酸分子であり得る。レポー
ター遺伝子は、任意の適切な発現配列を用いて発現され得る。多数の発現配列は
、公知であり、そしてレポーター遺伝子の発現に用いられ得る。発現配列は、一
般的に、プロモーター、ターミネーター、および真核生物細胞に用いるためのエ
ンハンサーに分類され得る。原核生物細胞での発現はまた、適切な翻訳開始のた
めに、コード領域のすぐ上流に、シャイン−ダルガーノ配列を必要とする。誘導
性プロモーターは、第１のレポーター遺伝子と共に用いるために好ましい。なぜ
なら、第１のレポーター遺伝子の発現が、調節可能であることが好ましいからで
ある。
【００３４】 宿主細胞と適合性の種に由来するプロモーターおよび制御配列を含むプラスミ
ドベクターが、これらの宿主と共に用いられることが好ましい。そのベクターが
複製配列を保有することが好ましい。そのベクターは、宿主細胞を一時的にトラ
ンスフェクトまたは形質転換するのに用いられ得るか、あるいは宿主細胞染色体
へ組み込まれ得る。しかし、好ましくは、そのベクターは、ベクターの複製なら
びにベクターの安定または半ば安定（ｓｅｍｉ−ｓｔａｂｌｅ）な維持を宿主細
胞において許容する配列を含有する。種々の真核生物および原核生物の細胞中で
用いるためのこの様な多くの配列が公知であり、そしてベクター中でのそれらの
使用は慣用的である。通常、目的の宿主細胞において機能することが公知な複製
配列が用いられることが好ましい。例えば、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９のよ
うなベクター由来の複製起点の使用が原核生物細胞には好ましく、ＹＥＰ２４お
よびＹＲＰ１７のようなベクター由来の複製起点が真菌細胞には好ましく、そし
てＳＶ４０およびｐＥＧＦＰ−Ｎ由来の複製起点が真核生物細胞には好ましい。
全てのこれらの例は、市販されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。
ドベクターが、これらの宿主と共に用いられることが好ましい。そのベクターが
複製配列を保有することが好ましい。そのベクターは、宿主細胞を一時的にトラ
ンスフェクトまたは形質転換するのに用いられ得るか、あるいは宿主細胞染色体
へ組み込まれ得る。しかし、好ましくは、そのベクターは、ベクターの複製なら
びにベクターの安定または半ば安定（ｓｅｍｉ−ｓｔａｂｌｅ）な維持を宿主細
胞において許容する配列を含有する。種々の真核生物および原核生物の細胞中で
用いるためのこの様な多くの配列が公知であり、そしてベクター中でのそれらの
使用は慣用的である。通常、目的の宿主細胞において機能することが公知な複製
配列が用いられることが好ましい。例えば、ｐＢＲ３２２およびｐＵＣ１９のよ
うなベクター由来の複製起点の使用が原核生物細胞には好ましく、ＹＥＰ２４お
よびＹＲＰ１７のようなベクター由来の複製起点が真菌細胞には好ましく、そし
てＳＶ４０およびｐＥＧＦＰ−Ｎ由来の複製起点が真核生物細胞には好ましい。
全てのこれらの例は、市販されている（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。
【００３５】 原核生物細胞中で使用するのに好ましいベクターは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−
ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。真核生物細胞中で使用するのに好まし いベクターは、シャトルベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。
このベクターは、哺乳動物細胞における最大の活性に最適化されている緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）をコードし、そしてＧＦＰ融合タンパク質の発現のために
設計されている。このベクターはまた、３つのリーディングフレーム全てにおけ
る融合タンパク質の生成のために設計されたＧＦＰ配列の５’側にマルチクロー
ニング部位（ＭＣＳ）を含む。そのＭＣＳは、目的のＲＮＡをコードしているＤ
ＮＡを挿入して融合タンパク質をコードする融合転写物をコードしている遺伝子
を産生するために用いられ得る。
ＳＫ+（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。真核生物細胞中で使用するのに好まし いベクターは、シャトルベクターｐＥＧＦＰ−Ｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）である。
このベクターは、哺乳動物細胞における最大の活性に最適化されている緑色蛍光
タンパク質（ＧＦＰ）をコードし、そしてＧＦＰ融合タンパク質の発現のために
設計されている。このベクターはまた、３つのリーディングフレーム全てにおけ
る融合タンパク質の生成のために設計されたＧＦＰ配列の５’側にマルチクロー
ニング部位（ＭＣＳ）を含む。そのＭＣＳは、目的のＲＮＡをコードしているＤ
ＮＡを挿入して融合タンパク質をコードする融合転写物をコードしている遺伝子
を産生するために用いられ得る。
【００３６】 レポータータンパク質は、直接的または間接的のどちらかで検出し得る任意の
タンパク質であり得る。これらは、特異的に検出可能な産物を産生し得る酵素（
例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファター
ゼ）、ならびに直接的に検出され得るタンパク質を含む。実質的に任意のタンパ
ク質は、例えば、そのタンパク質に対する特異抗体の使用により直接的に検出さ
れ得る。直接的に検出され得る好ましいレポータータンパク質は、緑色蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰ（クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ
由来）は、基質の添加なしに紫外光に曝露されると蛍光を生じる（Ｃｈａｌｆｉ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２〜５（１９９４））。標準条件下で野生
型ＧＦＰが生じるよりも５０倍程度強い蛍光を生じる多くの改変されたＧＦＰが
、作製されている（Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ １７３：３３〜８（１９９６
）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０：４６４６〜５４（１９９
６））。このレベルの蛍光は、細胞中の低いレベルの発現の検出を許容する。
タンパク質であり得る。これらは、特異的に検出可能な産物を産生し得る酵素（
例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファター
ゼ）、ならびに直接的に検出され得るタンパク質を含む。実質的に任意のタンパ
ク質は、例えば、そのタンパク質に対する特異抗体の使用により直接的に検出さ
れ得る。直接的に検出され得る好ましいレポータータンパク質は、緑色蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰ（クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ
由来）は、基質の添加なしに紫外光に曝露されると蛍光を生じる（Ｃｈａｌｆｉ
ｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：８０２〜５（１９９４））。標準条件下で野生
型ＧＦＰが生じるよりも５０倍程度強い蛍光を生じる多くの改変されたＧＦＰが
、作製されている（Ｃｏｒｍａｃｋら、Ｇｅｎｅ １７３：３３〜８（１９９６
）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７０：４６４６〜５４（１９９
６））。このレベルの蛍光は、細胞中の低いレベルの発現の検出を許容する。
【００３７】 蛍光シグナルを生じるレポータータンパク質は有用である。なぜなら、そのよ
うなシグナルは、細胞がＦＡＣＳを用いて選別されることを許容するからである
。そのレポータータンパク質の発現に基づいて細胞を選別する別の方法は、細胞
を結合するフックとしてのレポータータンパク質の使用に関与する。例えば、レ
セプタータンパク質のような細胞表面タンパク質は、特異抗体により結合され得
る。そのようなレポータータンパク質を発現する細胞は、例えば、固体基体に結
合した抗体を使用すること、磁性ビーズに結合した抗体を使用すること、または
そのレポータータンパク質に結合した抗体を捕捉することにより捕捉され得る。
捕捉物質としての抗体の使用のための多くの技術は、公知であり、そして開示さ
れた方法と共に用いられ得る。第二レポータータンパク質がＣＤ４である場合、
第一レポータータンパク質として使用するための細胞表面タンパク質の好ましい
形態は、ＣＤ８であり、さもなければＣＤ４が好ましい。
うなシグナルは、細胞がＦＡＣＳを用いて選別されることを許容するからである
。そのレポータータンパク質の発現に基づいて細胞を選別する別の方法は、細胞
を結合するフックとしてのレポータータンパク質の使用に関与する。例えば、レ
セプタータンパク質のような細胞表面タンパク質は、特異抗体により結合され得
る。そのようなレポータータンパク質を発現する細胞は、例えば、固体基体に結
合した抗体を使用すること、磁性ビーズに結合した抗体を使用すること、または
そのレポータータンパク質に結合した抗体を捕捉することにより捕捉され得る。
捕捉物質としての抗体の使用のための多くの技術は、公知であり、そして開示さ
れた方法と共に用いられ得る。第二レポータータンパク質がＣＤ４である場合、
第一レポータータンパク質として使用するための細胞表面タンパク質の好ましい
形態は、ＣＤ８であり、さもなければＣＤ４が好ましい。
【００３８】 そのレポータータンパク質は、別の遺伝子の発現を調節するタンパク質でもあ
り得る。これは、調節された遺伝子の発現の検出により、レポータータンパク質
の発現の検出を許容する。例えば、リプレッサータンパク質は、レポータータン
パク質として使用され得る。レポータータンパク質の発現の阻害は、次にその調
節された遺伝子の抑制解除を生じる。この種類の間接的検出は、機能的オリゴヌ
クレオチド分子によるレポータータンパク質の発現の阻害の正の検出を許容する
。この種類の調節の１つの好ましい形態は、レポータータンパク質として使用さ
れるリプレッサータンパク質により調節される抗生物質耐性遺伝子の使用である
。抗生物質へのその宿主細胞の曝露により、抗生物質耐性遺伝子の発現が抑制解
除されるので、レポーター遺伝子の発現が阻止されている細胞のみが増殖する。
その第二のレポータータンパク質は、抗生物質耐性をその宿主細胞または細胞表
面タンパク質に与えるタンパク質であることが好ましい。抗生物質耐性タンパク
質の使用は、原核生物宿主細胞において好ましく、そして細胞表面タンパク質の
使用は真核生物宿主細胞において好ましい。第二レポータータンパク質としての
使用に最も好ましい細胞表面タンパク質は、ＣＤ４である。
り得る。これは、調節された遺伝子の発現の検出により、レポータータンパク質
の発現の検出を許容する。例えば、リプレッサータンパク質は、レポータータン
パク質として使用され得る。レポータータンパク質の発現の阻害は、次にその調
節された遺伝子の抑制解除を生じる。この種類の間接的検出は、機能的オリゴヌ
クレオチド分子によるレポータータンパク質の発現の阻害の正の検出を許容する
。この種類の調節の１つの好ましい形態は、レポータータンパク質として使用さ
れるリプレッサータンパク質により調節される抗生物質耐性遺伝子の使用である
。抗生物質へのその宿主細胞の曝露により、抗生物質耐性遺伝子の発現が抑制解
除されるので、レポーター遺伝子の発現が阻止されている細胞のみが増殖する。
その第二のレポータータンパク質は、抗生物質耐性をその宿主細胞または細胞表
面タンパク質に与えるタンパク質であることが好ましい。抗生物質耐性タンパク
質の使用は、原核生物宿主細胞において好ましく、そして細胞表面タンパク質の
使用は真核生物宿主細胞において好ましい。第二レポータータンパク質としての
使用に最も好ましい細胞表面タンパク質は、ＣＤ４である。
【００３９】 選択物質として使用するためのタンパク質をコードする遺伝子もまた、そのベ
クター中へ挿入され得る。例示的な物質は表１に示される。物質は、抗生物質も
しくは細胞に有毒な他の物質に対して耐性を与え得、または機能的オリゴヌクレ
オチド分子を含む細胞の選択を補助し得る。
クター中へ挿入され得る。例示的な物質は表１に示される。物質は、抗生物質も
しくは細胞に有毒な他の物質に対して耐性を与え得、または機能的オリゴヌクレ
オチド分子を含む細胞の選択を補助し得る。
【００４０】
【表１】 そのベクターは、十分に確立された組換えＤＮＡ技術を用いて構築され得る（
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）を参
照のこと）。ベースベクターが第一に調製されることが好ましい。次に、目的の
ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡが、このベースベクター中へ挿入されて第二のベ
ースベクターを形成し得る。異なる第二のベースベクターが、目的のそれぞれの
ＲＮＡ分子のために構築され得る。最後に、機能的オリゴヌクレオチド分子をコ
ードするＤＮＡのライブラリーは、適切な第二のベースベクター中へ挿入され得
る。同様のベースベクターは、目的の任意のＲＮＡ分子と共に容易に使用され得
、そして同様の第二のベースベクターは、機能的オリゴヌクレオチド分子の任意
の適切なライブラリーと共に使用され得る。例えば、同様の第二のベースベクタ
ーは、リボザイムのライブラリー、ＥＧＳのライブラリー、およびアンチセンス
ＲＮＡ分子のライブラリーのために使用され得る。
例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第二版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９０）を参
照のこと）。ベースベクターが第一に調製されることが好ましい。次に、目的の
ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡが、このベースベクター中へ挿入されて第二のベ
ースベクターを形成し得る。異なる第二のベースベクターが、目的のそれぞれの
ＲＮＡ分子のために構築され得る。最後に、機能的オリゴヌクレオチド分子をコ
ードするＤＮＡのライブラリーは、適切な第二のベースベクター中へ挿入され得
る。同様のベースベクターは、目的の任意のＲＮＡ分子と共に容易に使用され得
、そして同様の第二のベースベクターは、機能的オリゴヌクレオチド分子の任意
の適切なライブラリーと共に使用され得る。例えば、同様の第二のベースベクタ
ーは、リボザイムのライブラリー、ＥＧＳのライブラリー、およびアンチセンス
ＲＮＡ分子のライブラリーのために使用され得る。
【００４１】 宿主細胞は、任意の適した手段を用いて開示されたベクターで形質転換され得
、そしてプロモータの導入、形質転換の選択、または発現の検出のために適切に
改変された従来の栄養培地で培養され得る。宿主細胞に適した培養条件（例えば
、温度およびｐＨ）は、は周知である。細胞のトランスフェクションのために使
用されるプラスミドの濃度は、異なる機能的オリゴヌクレオチド分子をコードす
る複数のベクターの同一細胞中における発現の可能性を減らすために好ましくは
滴定される。
、そしてプロモータの導入、形質転換の選択、または発現の検出のために適切に
改変された従来の栄養培地で培養され得る。宿主細胞に適した培養条件（例えば
、温度およびｐＨ）は、は周知である。細胞のトランスフェクションのために使
用されるプラスミドの濃度は、異なる機能的オリゴヌクレオチド分子をコードす
る複数のベクターの同一細胞中における発現の可能性を減らすために好ましくは
滴定される。
【００４２】 開示された方法における使用のために好ましい原核生物宿主細胞は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞である。開示された方法における使用のために好ましい真核生物宿主細
胞は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児性腎臓株（２９３，Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅ
ｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９［１９７７］）；乳仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ
，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（ＣＨ
Ｏ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）７７：４２１６，［１９８０］）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４
，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１［１９８０］
）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎
臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚ガン細胞
（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細
胞（ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺ガン（ＭＭＴ ０６０５６２
，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ
．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ３８３：４４〜６８（１９８２））；ヒトＢ細胞（Ｄ
ａｕｄｉ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）；ヒトＴ細胞（ＭＯＬＴ−４，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５８２）；およびヒトマクロファージ細胞（Ｕ−９３７，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９３）である。
ｌｉ細胞である。開示された方法における使用のために好ましい真核生物宿主細
胞は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児性腎臓株（２９３，Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅ
ｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９［１９７７］）；乳仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ
，ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（ＣＨ
Ｏ，ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．（ＵＳＡ）７７：４２１６，［１９８０］）；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４
，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１［１９８０］
）；サル腎臓細胞（ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎
臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚ガン細胞
（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝臓細
胞（ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５）；マウス乳腺ガン（ＭＭＴ ０６０５６２
，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ Ｎ
．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ３８３：４４〜６８（１９８２））；ヒトＢ細胞（Ｄ
ａｕｄｉ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２１３）；ヒトＴ細胞（ＭＯＬＴ−４，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５８２）；およびヒトマクロファージ細胞（Ｕ−９３７，ＡＴＣＣ
ＣＲＬ １５９３）である。
【００４３】 （ＩＩ． 必須遺伝子または機能的遺伝子の同定法） 細胞の生存能力または他の機能に不可欠なタンパク質をコードするｍＲＮＡの
同定にＥＧＳの組み合わせライブラリーを採用する方法が、開発されている。そ
の例は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において使われるような方法を示す。
同定にＥＧＳの組み合わせライブラリーを採用する方法が、開発されている。そ
の例は、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において使われるような方法を示す。
【００４４】 ＥＧＳは、一般的組成Ｎn≧7ＮＡＣＣＡの短いオリゴリボヌクレオチドである
。このような配列が、第二のＲＮＡ中の相補的な配列とアニーリングした場合、
その二重鎖はＲＮａｓｅ Ｐの基質として役目を果たす。ＲＮａｓｅ Ｐは遍在
する酵素であり、その細胞代謝における通常の役割は、トランスファーＲＮＡの
５’末端の成熟である。全ての特徴付けられたＲＮａｓｅ Ｐは、ＲＮＡおよび
タンパク質成分から成る。細菌において、単一タンパク質サブユニットおよび単
一ＲＮＡサブユニットがあり；そのＲＮＡ成分は、触媒作用的である。ｔＲＮＡ
成熟において、ＲＮａｓｅ Ｐは、受容体ステム、Ｄループ、および非二重鎖化
ＣＣＡ中の決定基を認識する；実際は、そのＣＣＡは、その酵素のそのＲＮＡサ
ブユニットと塩基対を形成することが公知である。
。このような配列が、第二のＲＮＡ中の相補的な配列とアニーリングした場合、
その二重鎖はＲＮａｓｅ Ｐの基質として役目を果たす。ＲＮａｓｅ Ｐは遍在
する酵素であり、その細胞代謝における通常の役割は、トランスファーＲＮＡの
５’末端の成熟である。全ての特徴付けられたＲＮａｓｅ Ｐは、ＲＮＡおよび
タンパク質成分から成る。細菌において、単一タンパク質サブユニットおよび単
一ＲＮＡサブユニットがあり；そのＲＮＡ成分は、触媒作用的である。ｔＲＮＡ
成熟において、ＲＮａｓｅ Ｐは、受容体ステム、Ｄループ、および非二重鎖化
ＣＣＡ中の決定基を認識する；実際は、そのＣＣＡは、その酵素のそのＲＮＡサ
ブユニットと塩基対を形成することが公知である。
【００４５】 ＥＧＳは、別のＲＮＡ（その標的）と塩基対合を介して結合する。そのＲＮＡ
−ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅ Ｐの天然のｔＲＮＡ基質を模倣しそしてその酵
素を補充し、そしてそれは一本鎖／二本鎖の境界で標的ＲＮＡを切断する。らせ
ん領域では既知の配列または塩基組成の制限は存在しない；従って、ＥＧＳは、
理論上は、ｍＲＮＡを含む、細胞中の任意のＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｐ切断を指回
し得る。天然の基質以外のＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｐの能力は、以下に記
載する方法論の基礎を成す理論的根拠として役立つ。
−ＲＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅ Ｐの天然のｔＲＮＡ基質を模倣しそしてその酵
素を補充し、そしてそれは一本鎖／二本鎖の境界で標的ＲＮＡを切断する。らせ
ん領域では既知の配列または塩基組成の制限は存在しない；従って、ＥＧＳは、
理論上は、ｍＲＮＡを含む、細胞中の任意のＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｐ切断を指回
し得る。天然の基質以外のＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｐの能力は、以下に記
載する方法論の基礎を成す理論的根拠として役立つ。
【００４６】 （必須遺伝子をコードするｍＲＮＡの同定のための実験ストラテジーの概要） 実験の設計において基礎を成す仮定は、全ての（またはほとんどの）ｍＲＮＡ
が適切なＥＧＳ配列の存在下でＲＮａｓｅ Ｐにより切断され得ることである。
したがって、全ての可能なＥＧＳ配列が発現され得る場合、それらの一部は、細
胞の生存能力に必須なタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断を引き起こす。こ
れらの「活性」ＥＧＳ配列の回復および特徴付けは、種々のストラテジーを経る
その標的化ｍＲＮＡ（遺伝子）の同定を許容する。この着想の好首尾な適用のた
めに必要な必要条件は、全てまたはほとんどの可能なＥＧＳを合成および発現す
る能力、ならびに所望される表現型（例えば、細胞死）を誘発するそのＥＧＳを
単離する方法を包含する。さらに、目的のそのメッセージのほぼ完全な破壊を引
き起こすことが可能なＥＧＳが必然的に存在しなければならない。
が適切なＥＧＳ配列の存在下でＲＮａｓｅ Ｐにより切断され得ることである。
したがって、全ての可能なＥＧＳ配列が発現され得る場合、それらの一部は、細
胞の生存能力に必須なタンパク質をコードするｍＲＮＡの切断を引き起こす。こ
れらの「活性」ＥＧＳ配列の回復および特徴付けは、種々のストラテジーを経る
その標的化ｍＲＮＡ（遺伝子）の同定を許容する。この着想の好首尾な適用のた
めに必要な必要条件は、全てまたはほとんどの可能なＥＧＳを合成および発現す
る能力、ならびに所望される表現型（例えば、細胞死）を誘発するそのＥＧＳを
単離する方法を包含する。さらに、目的のそのメッセージのほぼ完全な破壊を引
き起こすことが可能なＥＧＳが必然的に存在しなければならない。
【００４７】 このことについて、どのＥＧＳがもっとも効果的であるかを予測することは今
は出来ない。合理的な設計を用いて、Ａｌｔｍａｎおよび同僚は、単一ＥＧＳ配
列を用いて特異的ｍＲＮＡのささやかな減少のみを達成し得た（Ｇｕｅｒｒｉｅ
ｒ−Ｔａｋｅｄａ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９４，８
４６８〜８４７２，１９９７）。ＥＧＳ配列が、いずれかと組み合わせ（すなわ
ち、同一のｍＲＮＡに標的化された複数のＥＧＳ）て用いられた場合、またはＥ
ＧＳ／標的の割合が、極度に高い場合、生物学的に有意な減少が観察された。単
一ＥＧＳが、特異的ｍＲＮＡの発現を厳しくダウンレギットし得ることを期待す
ることが可能であるかまたは合理的であるか確認するため、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡに標的化された５２個のＥＧＳ配列のラ
イブラリーが設計され、そして５２個のＥＧＳのうちの一つだけが、遺伝子発現
の≧９０％の減少を引き起したことを見い出した。これらの実験を、後述の実施
例４に詳細な概要を記載する。これらの実施例の結果は、必須遺伝子または機能
的遺伝子を同定する方法の設計に対して３つの重要な暗示を有する：１）単一Ｅ
ＧＳは、特異的ｍＲＮＡの完全なまたは完全に近い分解を導き得ると期待するこ
とが合理的である；２）５０個のＥＧＳ配列中ほぼ一つだけが、要求される阻害
レベルを成し遂げるようである；および３）インビボで活性でありそうな、ＥＧ
Ｓを予想する現在の方法は信頼できない。この最後の考察は、適切なＥＧＳ配列
を設計して、細菌ゲノム中の各公知の遺伝子の機能を系統的な方法で評価し得る
ことを非常に見込みがないものにしている。さらに、特定の遺伝子に標的化され
たＥＧＳの小さなサブセットのみが生物学的効果を誘発するようであるという事
実は、ゲノムの広範なスクリーニングの設計および結果の解釈に影響を与える。
は出来ない。合理的な設計を用いて、Ａｌｔｍａｎおよび同僚は、単一ＥＧＳ配
列を用いて特異的ｍＲＮＡのささやかな減少のみを達成し得た（Ｇｕｅｒｒｉｅ
ｒ−Ｔａｋｅｄａ，Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ９４，８
４６８〜８４７２，１９９７）。ＥＧＳ配列が、いずれかと組み合わせ（すなわ
ち、同一のｍＲＮＡに標的化された複数のＥＧＳ）て用いられた場合、またはＥ
ＧＳ／標的の割合が、極度に高い場合、生物学的に有意な減少が観察された。単
一ＥＧＳが、特異的ｍＲＮＡの発現を厳しくダウンレギットし得ることを期待す
ることが可能であるかまたは合理的であるか確認するため、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼｍＲＮＡに標的化された５２個のＥＧＳ配列のラ
イブラリーが設計され、そして５２個のＥＧＳのうちの一つだけが、遺伝子発現
の≧９０％の減少を引き起したことを見い出した。これらの実験を、後述の実施
例４に詳細な概要を記載する。これらの実施例の結果は、必須遺伝子または機能
的遺伝子を同定する方法の設計に対して３つの重要な暗示を有する：１）単一Ｅ
ＧＳは、特異的ｍＲＮＡの完全なまたは完全に近い分解を導き得ると期待するこ
とが合理的である；２）５０個のＥＧＳ配列中ほぼ一つだけが、要求される阻害
レベルを成し遂げるようである；および３）インビボで活性でありそうな、ＥＧ
Ｓを予想する現在の方法は信頼できない。この最後の考察は、適切なＥＧＳ配列
を設計して、細菌ゲノム中の各公知の遺伝子の機能を系統的な方法で評価し得る
ことを非常に見込みがないものにしている。さらに、特定の遺伝子に標的化され
たＥＧＳの小さなサブセットのみが生物学的効果を誘発するようであるという事
実は、ゲノムの広範なスクリーニングの設計および結果の解釈に影響を与える。
【００４８】 実施例に示すような計算に基づき、必須遺伝子または機能的遺伝子の同定にお
いて使用するためのＥＧＳ中のランダム配列または重複配列は、細菌において、
代表的にはＮ10-13の間であり；真菌において、代表的にはそれはＮ10-15の間で
あり、そして哺乳動物細胞において、代表的にはそれはＮ10-18の間であり、続 く配列は、標的化とされるＲＮＡを切断する宿主細胞のＲＮａｓｅ Ｐを標的と
する必要があった。原核生物ＲＮａｓｅ Ｐの場合、これはＡＣＣＡのように単
純である；真核生物ＲＮａｓｅ Ｐに必要とされる構造はより複雑であり、そし
て前述のように必要に応じて設計され得、ｔＲＮＡ分子の一部分の構造と似た構
造を作製する。
いて使用するためのＥＧＳ中のランダム配列または重複配列は、細菌において、
代表的にはＮ10-13の間であり；真菌において、代表的にはそれはＮ10-15の間で
あり、そして哺乳動物細胞において、代表的にはそれはＮ10-18の間であり、続 く配列は、標的化とされるＲＮＡを切断する宿主細胞のＲＮａｓｅ Ｐを標的と
する必要があった。原核生物ＲＮａｓｅ Ｐの場合、これはＡＣＣＡのように単
純である；真核生物ＲＮａｓｅ Ｐに必要とされる構造はより複雑であり、そし
て前述のように必要に応じて設計され得、ｔＲＮＡ分子の一部分の構造と似た構
造を作製する。
【００４９】 この方法は、以下の非制限的実施例を参照することにより、より理解される。
【００５０】 （実施例１：ＥＧＳ配列のライブラリーを使用する広範なゲノム機能解析の原
理の最初の証明） （ＥＧＳの設計） 最初の実験は、３’の先端の２つの位置をシトシンとして固定した１３マーＥ
ＧＳ配列を使用した。従って、このＥＧＳは、配列Ｎ11ＣＣに、ＡＣＣＡが続く
配列：５’− Ｎ11ＣＣＡＣＣＡ−３’ を有する。１３マーを選んだ。なぜなら
ば、任意の特定の１３マーが、約４×１０6塩基対、または２つの鎖が別々に考 慮される場合は、８×１０6の複雑性を有するＥ．ｃｏｌｉゲノムにおいて、統 計的に独特であるはずだからである。このゲノムの有効な複雑性は、４×１０6 であり、それはＤＮＡの１つの鎖のみが転写されるからである、ということに注
意されたい。任意の特定の１３マー配列を発見する可能性は、約１／３×１０7 である。１３マー配列を選択することに関して２番目に考えたことは、１３は、
この実験の時点で、インビボで効果を誘発することが公知である最も短いＥＧＳ
であるという事実であった。
理の最初の証明） （ＥＧＳの設計） 最初の実験は、３’の先端の２つの位置をシトシンとして固定した１３マーＥ
ＧＳ配列を使用した。従って、このＥＧＳは、配列Ｎ11ＣＣに、ＡＣＣＡが続く
配列：５’− Ｎ11ＣＣＡＣＣＡ−３’ を有する。１３マーを選んだ。なぜなら
ば、任意の特定の１３マーが、約４×１０6塩基対、または２つの鎖が別々に考 慮される場合は、８×１０6の複雑性を有するＥ．ｃｏｌｉゲノムにおいて、統 計的に独特であるはずだからである。このゲノムの有効な複雑性は、４×１０6 であり、それはＤＮＡの１つの鎖のみが転写されるからである、ということに注
意されたい。任意の特定の１３マー配列を発見する可能性は、約１／３×１０7 である。１３マー配列を選択することに関して２番目に考えたことは、１３は、
この実験の時点で、インビボで効果を誘発することが公知である最も短いＥＧＳ
であるという事実であった。
【００５１】 （ＥＧＳ配列の条件付き発現） この実験的設計の全体的目標は、生存能力に必須なタンパク質をコードするｍ
ＲＮＡの切断を誘発するＥＧＳ配列の同定である。この設計の直接かつ明白な成
果は、ＥＧＳ発現が制御可能でなければならないということである；すなわち、
もしＥＧＳ発現が構成的であったならば、この所望の配列を有する細胞は死滅し
、そして結果としてこの適切な細胞は、このライブラリーの増殖に際して失われ
るだろう。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、公知の多くの制御可能なプロモーターが存在
する。特に好ましいプロモーターは、外来配列の挿入部位での転写を開始する（
例えば、制御可能なアラビノースプロモーター）。この実施例は、ＥＧＳ配列の
条件付き発現のためにａｒａ Ｃ−ｐＢＡＤ系を使用する。これは、しっかり制
御された系であり、ここで転写はアラビノース不在下で抑制され、そして低レベ
ルのアラビノース存在下で誘導される。
ＲＮＡの切断を誘発するＥＧＳ配列の同定である。この設計の直接かつ明白な成
果は、ＥＧＳ発現が制御可能でなければならないということである；すなわち、
もしＥＧＳ発現が構成的であったならば、この所望の配列を有する細胞は死滅し
、そして結果としてこの適切な細胞は、このライブラリーの増殖に際して失われ
るだろう。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、公知の多くの制御可能なプロモーターが存在
する。特に好ましいプロモーターは、外来配列の挿入部位での転写を開始する（
例えば、制御可能なアラビノースプロモーター）。この実施例は、ＥＧＳ配列の
条件付き発現のためにａｒａ Ｃ−ｐＢＡＤ系を使用する。これは、しっかり制
御された系であり、ここで転写はアラビノース不在下で抑制され、そして低レベ
ルのアラビノース存在下で誘導される。
【００５２】 図２ａ〜ｃは、実験において使用される構築物およびプラスミドを示す。ａｒ
ａ ｃ−ｐＢＡＤプロモーターが、（転写の開始を容易にするため）変化しない
Ａに直接隣接し、ＥＧＳ−ＡＣＣＡ配列が続く。次には、この配列にＴ７ｅ転写
ターミネーターが続く。このような構築物からの転写物は、このＥＧＳ−ＡＣＣ
Ａ配列およびこのターミネーターを含む。Ａｌｔｍａｎが以前に、ＥＧＳ−ＡＣ
ＣＡの３’側の配列はＥＧＳ機能に干渉しないということを観察した。実際、付
随する３’ステムループ構造を有するこのターミネーター配列の存在は、ＥＧＳ
媒介活性を増強する。おそらく、このステムループが、この短い転写物をより消
滅しにくくするからである。従って、このターミネーターに付随するＥＧＳ配列
は、ＥＧＳ配列単独（すなわち、シス作用性リボザイムにより生成されるＥＧＳ
配列）よりも高い定常状態のレベルまで蓄積する。
ａ ｃ−ｐＢＡＤプロモーターが、（転写の開始を容易にするため）変化しない
Ａに直接隣接し、ＥＧＳ−ＡＣＣＡ配列が続く。次には、この配列にＴ７ｅ転写
ターミネーターが続く。このような構築物からの転写物は、このＥＧＳ−ＡＣＣ
Ａ配列およびこのターミネーターを含む。Ａｌｔｍａｎが以前に、ＥＧＳ−ＡＣ
ＣＡの３’側の配列はＥＧＳ機能に干渉しないということを観察した。実際、付
随する３’ステムループ構造を有するこのターミネーター配列の存在は、ＥＧＳ
媒介活性を増強する。おそらく、このステムループが、この短い転写物をより消
滅しにくくするからである。従って、このターミネーターに付随するＥＧＳ配列
は、ＥＧＳ配列単独（すなわち、シス作用性リボザイムにより生成されるＥＧＳ
配列）よりも高い定常状態のレベルまで蓄積する。
【００５３】 この発現を、種々の条件下でＥＧＳ配列のＲＮＡブロット解析により評価した
。予期したように、アラビノースを増殖培地に添加しない場合は、ＥＧＳプラス
ミドを有する細胞において、何らの発現も観察しない。アラビノース存在下で、
ＥＧＳ発現を容易に検出し、そして高い定常状態のレベルの転写産物を誘導の３
０分後に観察する。このレベルの発現は、数時間維持される。
。予期したように、アラビノースを増殖培地に添加しない場合は、ＥＧＳプラス
ミドを有する細胞において、何らの発現も観察しない。アラビノース存在下で、
ＥＧＳ発現を容易に検出し、そして高い定常状態のレベルの転写産物を誘導の３
０分後に観察する。このレベルの発現は、数時間維持される。
【００５４】 （組合せＥＧＳライブラリーの設計） 無作為化したＥＧＳのライブラリーを、適切なＤＮＡ挿入物をｐＢＡＤプラス
ミドに連結することにより作製し、全ての可能なＥＧＳ配列を発現させた。次い
で、連結したプラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。十分な量の独
立形質転換体を得、全ライブラリーが代表されることを保証した（ＥＧＳ配列の
複雑性は約４×１０6；得られた独立形質転換体は約２×１０7；この形質転換体
の数は、このライブラリーの全てのメンバーが代表されるという９５％信頼を示
す）。形質転換に続き、このライブラリー（各細菌は１つのプラスミド、それ故
１つのＥＧＳ、を含む）を、非誘導条件下での液体増殖を介して増幅した。次い
で、多く（５０個以上）の個々のプラスミドを、精製し、そして配列決定して、
その挿入物の配列が正しいことおよび無作為化した（ＥＧＳ）領域にヌクレオチ
ドの偏りが存在しないことを確認した。
ミドに連結することにより作製し、全ての可能なＥＧＳ配列を発現させた。次い
で、連結したプラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換した。十分な量の独
立形質転換体を得、全ライブラリーが代表されることを保証した（ＥＧＳ配列の
複雑性は約４×１０6；得られた独立形質転換体は約２×１０7；この形質転換体
の数は、このライブラリーの全てのメンバーが代表されるという９５％信頼を示
す）。形質転換に続き、このライブラリー（各細菌は１つのプラスミド、それ故
１つのＥＧＳ、を含む）を、非誘導条件下での液体増殖を介して増幅した。次い
で、多く（５０個以上）の個々のプラスミドを、精製し、そして配列決定して、
その挿入物の配列が正しいことおよび無作為化した（ＥＧＳ）領域にヌクレオチ
ドの偏りが存在しないことを確認した。
【００５５】 （１３マーＥＧＳライブラリーの効率の最初の試験） 発現される場合に致死性の原因となるＥＧＳ配列の同定は、通常何千もの個別
の細菌コロニーの解析を含む。従って、簡素化したアプローチを介してＥＧＳラ
イブラリーの有用性を証明するための技術を開発した。その方法は、いくつかの
化学物質が、特定の非必須遺伝子が発現される場合のみ、Ｅ．ｃｏｌｉに対して
毒性であるという事実を利用する。従って、このような物質の存在下での細菌の
生存は、機能的遺伝子産物の不在に依存する。例えば、高レベルのコバルトは、
Ｅ．ｃｏｌｉに対して致命的である。この致死性は、その細胞内のコバルトイオ
ンの蓄積から生じる。コバルトがその細胞に侵入するのを妨げられる場合（すな
わち、イオントランスポーターの不活性化による）、その細胞は生存する。いく
つかのそのような毒性物質を選択し（表１）、そして研究を行って、適切なＥＧ
Ｓが発現される場合に、かつそのような場合にのみ、この毒性処理で生存する細
胞を回収した。
の細菌コロニーの解析を含む。従って、簡素化したアプローチを介してＥＧＳラ
イブラリーの有用性を証明するための技術を開発した。その方法は、いくつかの
化学物質が、特定の非必須遺伝子が発現される場合のみ、Ｅ．ｃｏｌｉに対して
毒性であるという事実を利用する。従って、このような物質の存在下での細菌の
生存は、機能的遺伝子産物の不在に依存する。例えば、高レベルのコバルトは、
Ｅ．ｃｏｌｉに対して致命的である。この致死性は、その細胞内のコバルトイオ
ンの蓄積から生じる。コバルトがその細胞に侵入するのを妨げられる場合（すな
わち、イオントランスポーターの不活性化による）、その細胞は生存する。いく
つかのそのような毒性物質を選択し（表１）、そして研究を行って、適切なＥＧ
Ｓが発現される場合に、かつそのような場合にのみ、この毒性処理で生存する細
胞を回収した。
【００５６】 次いで、コロニーを、アラビノース（誘導物質）に特異的な生存についてスク
リーニングした。アラビノースでない誘導物質依存の生存株が、関連の遺伝子の
自然発生突然変異により生じ得た。この実験の設計の概略を図３に示す。手短に
は、細胞を対数増殖期まで増殖させ、次いでアラビノースに曝露した。この時点
で、ＥＧＳ発現を誘導した。次いでこの細胞を、毒性物質で処理する前に、数世
代の間アラビノース中に放置した。このインキュベーション時間は重要である。
なぜならば、このＥＧＳは、ｍＲＮＡレベルに影響するだけであり、そして先在
するタンパク質に影響を及ぼさないからである。従って、その先在するタンパク
質は、選別の前に消滅する（または増殖を介して希釈される）に違いない。
リーニングした。アラビノースでない誘導物質依存の生存株が、関連の遺伝子の
自然発生突然変異により生じ得た。この実験の設計の概略を図３に示す。手短に
は、細胞を対数増殖期まで増殖させ、次いでアラビノースに曝露した。この時点
で、ＥＧＳ発現を誘導した。次いでこの細胞を、毒性物質で処理する前に、数世
代の間アラビノース中に放置した。このインキュベーション時間は重要である。
なぜならば、このＥＧＳは、ｍＲＮＡレベルに影響するだけであり、そして先在
するタンパク質に影響を及ぼさないからである。従って、その先在するタンパク
質は、選別の前に消滅する（または増殖を介して希釈される）に違いない。
【００５７】 適切なインキュベーションに続き、細胞の集団を、選択物質で個々に処理し、
そして生存株を回収した。その選択物質の除去後に、細胞を、非選択培地上にプ
レーティングし、独立のコロニーを分析し得るようにした。次いで、この時点で
個々のクローンを、アラビノース存在下またはアラビノース非存在下での選択処
理を生存するその能力についてアッセイした。重要なことに、７つの異なる選択
物質各々について、いくつかのアラビノース依存（すなわち、ＥＧＳ依存）生存
株を回収した。同様に重要な、観察される抵抗性の表現型は、高度に特異的であ
った；すなわち、１つの選択物質に対して抵抗性を与えるＥＧＳは、他の任意の
このような物質に対する抵抗性を与えなかった。結局、抵抗性の表現型を特定の
ＥＧＳに結びつける明白な証拠を、適切なＥＧＳ配列を発現するプラスミドを有
する天然の細菌を再形質転換することにより得た。
そして生存株を回収した。その選択物質の除去後に、細胞を、非選択培地上にプ
レーティングし、独立のコロニーを分析し得るようにした。次いで、この時点で
個々のクローンを、アラビノース存在下またはアラビノース非存在下での選択処
理を生存するその能力についてアッセイした。重要なことに、７つの異なる選択
物質各々について、いくつかのアラビノース依存（すなわち、ＥＧＳ依存）生存
株を回収した。同様に重要な、観察される抵抗性の表現型は、高度に特異的であ
った；すなわち、１つの選択物質に対して抵抗性を与えるＥＧＳは、他の任意の
このような物質に対する抵抗性を与えなかった。結局、抵抗性の表現型を特定の
ＥＧＳに結びつける明白な証拠を、適切なＥＧＳ配列を発現するプラスミドを有
する天然の細菌を再形質転換することにより得た。
【００５８】 次いで、活性なクローン各々のヌクレオチド配列を、決定し、そしてＥ．ｃｏ
ｌｉの公開されているヌクレオチド配列と比較した。この活性ＥＧＳ配列は、こ
のゲノムの転写される領域に相補的であるということが、予想された。しかし、
いずれの場合にも、完璧な相補性（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）は観察されなか
った。これらの観察は、数ある可能性の中でとりわけ、ＥＧＳ配列の１３ヌクレ
オチドは生物学的機能に必要とされる情報量を超える情報量を有し得るというこ
とを示摘した。選択物質を用いるこれらの実験は、以下のことを明白に証明した
： １．高い浸透度、高い特異性、条件付きの表現型が、ＥＧＳ配列により誘発され
る ２．活性ＥＧＳ配列を、効率的かつ迅速に、複雑なライブラリーから単離し得る
。
ｌｉの公開されているヌクレオチド配列と比較した。この活性ＥＧＳ配列は、こ
のゲノムの転写される領域に相補的であるということが、予想された。しかし、
いずれの場合にも、完璧な相補性（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）は観察されなか
った。これらの観察は、数ある可能性の中でとりわけ、ＥＧＳ配列の１３ヌクレ
オチドは生物学的機能に必要とされる情報量を超える情報量を有し得るというこ
とを示摘した。選択物質を用いるこれらの実験は、以下のことを明白に証明した
： １．高い浸透度、高い特異性、条件付きの表現型が、ＥＧＳ配列により誘発され
る ２．活性ＥＧＳ配列を、効率的かつ迅速に、複雑なライブラリーから単離し得る
。
【００５９】 (実施例２：発現される場合に増殖の障害または致死性を引き起こすＥＧＳ配 列の単離および特徴付け） 実施例１に記載される実験は、特定の選択物質存在下におけるＥＧＳに依存の
生存を証明した。必須遺伝子の同定についてのＥＧＳ媒介アプローチの有用性を
より直接的に証明するために、発現される場合に生存能力の喪失を引き起こすＥ
ＧＳ配列を得るための研究を行った。類似しているが、これらの実験は、設計に
おいて、実施例１で概説される実験と多少異なる。すなわち、死んでいる細胞ま
たは死につつある細胞について選択するための方法が存在しない。従って、その
発現が増殖障害を導くＥＧＳについてスクリーニングする必要がある。
生存を証明した。必須遺伝子の同定についてのＥＧＳ媒介アプローチの有用性を
より直接的に証明するために、発現される場合に生存能力の喪失を引き起こすＥ
ＧＳ配列を得るための研究を行った。類似しているが、これらの実験は、設計に
おいて、実施例１で概説される実験と多少異なる。すなわち、死んでいる細胞ま
たは死につつある細胞について選択するための方法が存在しない。従って、その
発現が増殖障害を導くＥＧＳについてスクリーニングする必要がある。
【００６０】 致死性の表現型についてスクリーニングするための最も簡単な方法は、「レプ
リカ平板法」によるものである。このようなアプローチでは、個々のクローン（
単一な細菌から生じるコロニー）を任意の種々の方法でアレイにし、そして複製
アレイを生成する。その最も簡単な形式で、誘導物質（従ってＥＧＳ）の存在下
または誘導物質非存在下のいずれかのコロニーの増殖を比較することが、増殖欠
損を引き起こすＥＧＳを明らかにする。その欠損がＥＧＳに媒介されるというこ
との確認を、再形質転換を含む種々の方法でなし得る。
リカ平板法」によるものである。このようなアプローチでは、個々のクローン（
単一な細菌から生じるコロニー）を任意の種々の方法でアレイにし、そして複製
アレイを生成する。その最も簡単な形式で、誘導物質（従ってＥＧＳ）の存在下
または誘導物質非存在下のいずれかのコロニーの増殖を比較することが、増殖欠
損を引き起こすＥＧＳを明らかにする。その欠損がＥＧＳに媒介されるというこ
との確認を、再形質転換を含む種々の方法でなし得る。
【００６１】 簡単なレプリカ平板法を使用する致死性ＥＧＳ配列についてのスクリーニング
の実用性は、そのライブラリーの複雑性および予期されるポジティブの頻度に依
存する。限定された利用可能なデータを使用して、「ポジティブ」クローンの 予期される数を予測することができる。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムは、４．６×１０ 6 ｂｐの複雑性を有する。ほぼ１００％に等しい転写密度および、たとえあった としても、ほとんどない対称な転写を仮定する場合、その転写された複雑性もま
た４．６×１０6である。さらに、必須遺伝子の妥当な予測は、約１０％である 。平均サイズにおいて必須遺伝子と可欠遺伝子の間に有意な格差が存在しないと
いうことを仮定すると、致死性の表現型を誘発するＥＧＳの有効な標的サイズは
、４．６×１０5塩基または１ｋｂの約４００個の遺伝子（極性効果、およびＥ ．ｃｏｌｉにおける大多数の遺伝子はオペロンの部分として転写されるというこ
とを、考慮に入れない）である。実施例４より示されるような第２の方法を用い
て得られるデータのセットから、標的化可能なヌクレオチドの約２％だけが「利
用可能」であり、すなわちゲノム中に配置される約１０，０００個の標的である
ということが有り得る。従って、本当に無作為化されたライブラリーを用いると
、約１０，０００個の活性ＥＧＳを予期する。このＮ11ＣＣライブラリーの場合
には、可能性のある部位の１／１６だけが標的化可能であり、活性ＥＧＳの数を
数百にまで減少させる。これらの条件を仮定する（およびこの仮定を認める）と
、このＮ11ＣＣライブラリー（４．６×１０6の複雑性を有する）は、試験され る１０，０００クローンにつき１つのポジティブクローンを生ずる。
の実用性は、そのライブラリーの複雑性および予期されるポジティブの頻度に依
存する。限定された利用可能なデータを使用して、「ポジティブ」クローンの 予期される数を予測することができる。Ｅ．ｃｏｌｉのゲノムは、４．６×１０ 6 ｂｐの複雑性を有する。ほぼ１００％に等しい転写密度および、たとえあった としても、ほとんどない対称な転写を仮定する場合、その転写された複雑性もま
た４．６×１０6である。さらに、必須遺伝子の妥当な予測は、約１０％である 。平均サイズにおいて必須遺伝子と可欠遺伝子の間に有意な格差が存在しないと
いうことを仮定すると、致死性の表現型を誘発するＥＧＳの有効な標的サイズは
、４．６×１０5塩基または１ｋｂの約４００個の遺伝子（極性効果、およびＥ ．ｃｏｌｉにおける大多数の遺伝子はオペロンの部分として転写されるというこ
とを、考慮に入れない）である。実施例４より示されるような第２の方法を用い
て得られるデータのセットから、標的化可能なヌクレオチドの約２％だけが「利
用可能」であり、すなわちゲノム中に配置される約１０，０００個の標的である
ということが有り得る。従って、本当に無作為化されたライブラリーを用いると
、約１０，０００個の活性ＥＧＳを予期する。このＮ11ＣＣライブラリーの場合
には、可能性のある部位の１／１６だけが標的化可能であり、活性ＥＧＳの数を
数百にまで減少させる。これらの条件を仮定する（およびこの仮定を認める）と
、このＮ11ＣＣライブラリー（４．６×１０6の複雑性を有する）は、試験され る１０，０００クローンにつき１つのポジティブクローンを生ずる。
【００６２】 １０4中に１つというのは、直接のレプリカ平板法によるアッセイを意図する には、受容不可能なほど少ない数であり、従って、活性なクローンの頻度を、古
典的技術であるペニシリン濃縮を使用して増大させた。ペニシリン濃縮は、何十
年間も微生物学的研究において使用されており、まれな突然変異の回収における
援助となる。この技術は、ペニシリン、またはアンピシリンを含むその種々の誘
導体が、活発に増殖しつつある細胞のみを殺すという事実に基づいている；増殖
していない細胞はペニシリン殺害を逃れる。この濃縮ストラテジーを致死性ＥＧ
Ｓの単離に適用するのは、かなり簡単である。手短には、アラビノースを用いる
ＥＧＳ発現の誘導後、「有効な」ＥＧＳを有する細胞（すなわち、必須遺伝子に
対して標的される細胞）は、増殖をやめ、従ってペニシリン殺害に耐性になる。
重要なことには、個々の細胞が増殖をやめる時間は、先在する目的タンパク質が
（代謝回転または希釈を介して）活性の生存可能な閾値より下に減少するのにど
れくらいかかるかの関数である。従って、異なる必須タンパク質をコードするｍ
ＲＮＡに対して標的される致死性ＥＧＳについて濃縮するために、誘導後の種々
の時点でペニシリンを用いて処理することが必要である（図４参照のこと）。
典的技術であるペニシリン濃縮を使用して増大させた。ペニシリン濃縮は、何十
年間も微生物学的研究において使用されており、まれな突然変異の回収における
援助となる。この技術は、ペニシリン、またはアンピシリンを含むその種々の誘
導体が、活発に増殖しつつある細胞のみを殺すという事実に基づいている；増殖
していない細胞はペニシリン殺害を逃れる。この濃縮ストラテジーを致死性ＥＧ
Ｓの単離に適用するのは、かなり簡単である。手短には、アラビノースを用いる
ＥＧＳ発現の誘導後、「有効な」ＥＧＳを有する細胞（すなわち、必須遺伝子に
対して標的される細胞）は、増殖をやめ、従ってペニシリン殺害に耐性になる。
重要なことには、個々の細胞が増殖をやめる時間は、先在する目的タンパク質が
（代謝回転または希釈を介して）活性の生存可能な閾値より下に減少するのにど
れくらいかかるかの関数である。従って、異なる必須タンパク質をコードするｍ
ＲＮＡに対して標的される致死性ＥＧＳについて濃縮するために、誘導後の種々
の時点でペニシリンを用いて処理することが必要である（図４参照のこと）。
【００６３】 濃縮実験を、上記に概説したように行い、生存株の増幅に続いて、誘導後の種
々の時点で回収した細胞を、レプリカ平板法を介して誘導物質依存性の致死性に
ついてアッセイした。誘導物質存在下でのみ明白な増殖欠損を示したいくつかの
クローンを回収した。上記のように、適切なプラスミドを回収し、配列決定し、
そして天然の細菌を形質転換した。どの場合においても、表現型（遅い増殖また
は増殖がない）は、特定のＥＧＳ配列の存在および発現が原因であることが示さ
れた。上記の選択から回収されるＥＧＳに関して、そのヌクレオチド配列をＥ．
ｃｏｌｉゲノム配列と比較した。また、回収されたＥＧＳと公表された配列との
間に完璧な（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補性は存在しなかった。
々の時点で回収した細胞を、レプリカ平板法を介して誘導物質依存性の致死性に
ついてアッセイした。誘導物質存在下でのみ明白な増殖欠損を示したいくつかの
クローンを回収した。上記のように、適切なプラスミドを回収し、配列決定し、
そして天然の細菌を形質転換した。どの場合においても、表現型（遅い増殖また
は増殖がない）は、特定のＥＧＳ配列の存在および発現が原因であることが示さ
れた。上記の選択から回収されるＥＧＳに関して、そのヌクレオチド配列をＥ．
ｃｏｌｉゲノム配列と比較した。また、回収されたＥＧＳと公表された配列との
間に完璧な（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補性は存在しなかった。
【００６４】 これらの実験は、発現される場合に、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて明確な増殖欠損の
表現型を誘発する特定のＥＧＳ配列を単離することが可能であるということを、
直接証明した。さらに、これらは、活性ＥＧＳ配列について濃縮するためのペニ
シリン処理を使用するという有用性を証明した。要するに、上記の実験は、以下
のことを示す： １．ＥＧＳ配列のライブラリーを構築し得、そして厳しい調節下で発現させ得
ること、および ２．これらの複雑なライブラリーを「分類」し、致死性を含む種々の表現型を
与える特定のＥＧＳを、回収および特徴付けし得るようにし得る。
表現型を誘発する特定のＥＧＳ配列を単離することが可能であるということを、
直接証明した。さらに、これらは、活性ＥＧＳ配列について濃縮するためのペニ
シリン処理を使用するという有用性を証明した。要するに、上記の実験は、以下
のことを示す： １．ＥＧＳ配列のライブラリーを構築し得、そして厳しい調節下で発現させ得
ること、および ２．これらの複雑なライブラリーを「分類」し、致死性を含む種々の表現型を
与える特定のＥＧＳを、回収および特徴付けし得るようにし得る。
【００６５】 （実施例３：標的化（ガイド）配列が１３ヌクレオチド未満であるＥＧＳラ
イブラリーの分析） （原理） 実施例２において議論されるように、１３塩基のガイド配列およびＡＣＣＡか
らなる特定のＥＧＳは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高い浸透度の表現型を誘発するこ
とが示された。しかし、従来の（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成規則を
使用して、ＥＧＳ配列とＥ．ｃｏｌｉゲノム配列との間に完全な相補性を発見す
ることは不可能であった。これらの結果は、以下に挙げる種々の方法において説
明し得る： １．この１３マーは、「過剰な」情報を提供した。このような場合において、
このＥＧＳと標的との間のある程度のミスマッチは許容される。しかし、どの位
置がミスマッチであり得るかを区別する先験的方法は存在しない。
イブラリーの分析） （原理） 実施例２において議論されるように、１３塩基のガイド配列およびＡＣＣＡか
らなる特定のＥＧＳは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて高い浸透度の表現型を誘発するこ
とが示された。しかし、従来の（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成規則を
使用して、ＥＧＳ配列とＥ．ｃｏｌｉゲノム配列との間に完全な相補性を発見す
ることは不可能であった。これらの結果は、以下に挙げる種々の方法において説
明し得る： １．この１３マーは、「過剰な」情報を提供した。このような場合において、
このＥＧＳと標的との間のある程度のミスマッチは許容される。しかし、どの位
置がミスマッチであり得るかを区別する先験的方法は存在しない。
【００６６】 ２．最も「有効な」ＥＧＳは、その標的との非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互
作用に基づき選択される。このような相互作用は、ゆらぎ対形成および特異的３
次構造を含み得る。また、これらの型の相互作用は、その標的の予備知識なしで
は、予測または除外することが不可能だろう。
作用に基づき選択される。このような相互作用は、ゆらぎ対形成および特異的３
次構造を含み得る。また、これらの型の相互作用は、その標的の予備知識なしで
は、予測または除外することが不可能だろう。
【００６７】 このＥＧＳ配列を特定の標的に結びつけることに関するこの不確実性を仮定す
れば、インビボでのＥＧＳ活性のために必要な最小の長さを組織的に調査するこ
とが不可欠である。さらに、各特異的ライブラリーの絶対活性（すなわち選択ま
たは濃縮がない場合の）を決定することが所望され得る。活性のために選択され
るこのアッセイは、実施例２に記載される誘導可能な致死（増殖欠損）の表現型
であった。これらの実験を、完全培地において実行し、誘導可能な（ＥＧＳ依存
の）栄養要求株（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの有意な部分が最小培地において不可欠に
なる）を収集することを避けた。そのガイドの長さを９から１２まで漸進的に変
化させたＥＧＳ配列の４つのライブラリー（すなわち、Ｎ9ＡＣＣＡ、Ｎ10ＡＣ ＣＡ、Ｎ11ＡＡＣＣＡおよびＮ12ＡＣＣＡ）を調製し、インビボで必要な長さを
探求した。上記の１３マーライブラリーとは異なり、ガイド配列のどの塩基も不
変性を保持しなかった。全ての場合において、適切な代表を保証するために十分
な量の形質転換体（５×複雑性）を得た。
れば、インビボでのＥＧＳ活性のために必要な最小の長さを組織的に調査するこ
とが不可欠である。さらに、各特異的ライブラリーの絶対活性（すなわち選択ま
たは濃縮がない場合の）を決定することが所望され得る。活性のために選択され
るこのアッセイは、実施例２に記載される誘導可能な致死（増殖欠損）の表現型
であった。これらの実験を、完全培地において実行し、誘導可能な（ＥＧＳ依存
の）栄養要求株（Ｅ．ｃｏｌｉゲノムの有意な部分が最小培地において不可欠に
なる）を収集することを避けた。そのガイドの長さを９から１２まで漸進的に変
化させたＥＧＳ配列の４つのライブラリー（すなわち、Ｎ9ＡＣＣＡ、Ｎ10ＡＣ ＣＡ、Ｎ11ＡＡＣＣＡおよびＮ12ＡＣＣＡ）を調製し、インビボで必要な長さを
探求した。上記の１３マーライブラリーとは異なり、ガイド配列のどの塩基も不
変性を保持しなかった。全ての場合において、適切な代表を保証するために十分
な量の形質転換体（５×複雑性）を得た。
【００６８】 （Ｎ9ＡＣＣＡライブラリーおよびＮ10ＡＣＣＡライブラリーの分析） このＮ9ライブラリーおよびＮ10ライブラリーの活性を評価するために、各々 から約４５，０００の個々のクローンを、ＥＧＳ発現がある場合またはない場合
（すなわちアラビノースの存在下または非存在下）においてコロニーを形成する
これらライブラリーの能力についてアッセイした。Ｎ9ライブラリーの複雑性は 約２．６×１０5である；そしてＮ10ライブラリーの複雑性は約１×１０6である
。両方のライブラリーを用いて、ごく少数のポジティブクローンを発見した。Ｎ 9 ライブラリーにおける「活性な」分子の推定数は５０以上であり、そしてＮ10 ライブラリーにおける「活性な」分子の推定数は約１００であった。Ｎ9ライブ ラリーのさらなる分析は、活性クローンの回収を容易にするペニシリン濃縮を介
して行い、表現型を誘発するほとんどのクローンを、単一のヌクレオチド配列の
部分として整列し得るということを明らかにした。１０マーライブラリーは、さ
らには分析しなかった。
（すなわちアラビノースの存在下または非存在下）においてコロニーを形成する
これらライブラリーの能力についてアッセイした。Ｎ9ライブラリーの複雑性は 約２．６×１０5である；そしてＮ10ライブラリーの複雑性は約１×１０6である
。両方のライブラリーを用いて、ごく少数のポジティブクローンを発見した。Ｎ 9 ライブラリーにおける「活性な」分子の推定数は５０以上であり、そしてＮ10 ライブラリーにおける「活性な」分子の推定数は約１００であった。Ｎ9ライブ ラリーのさらなる分析は、活性クローンの回収を容易にするペニシリン濃縮を介
して行い、表現型を誘発するほとんどのクローンを、単一のヌクレオチド配列の
部分として整列し得るということを明らかにした。１０マーライブラリーは、さ
らには分析しなかった。
【００６９】 ９マーライブラリーおよび１０マーライブラリーの両方が、本質的に不活性で
あるという事実は重要である。なぜならば、これらの結果は、インビボの生物学
的に活性なＥＧＳ配列の長さの下限を決定するからである。さらに、これらの結
果は、１３マーライブラリーを用いる発見と並べられた場合、重要である。明ら
かに、１３マーは、あり得る全ての９マーおよび１０マーをその中に含むが、１
３マーライブラリーを用いて種々の表現型を与える多くの別個のクローンを回収
し得た。この２組の結果の妥当な説明は、１３マーは、多くとも２つのミスマッ
チを、活性を保持しつつ許容し得たということである。結局、かつ重要でないこ
とに、この短いＥＧＳ配列を用いた結果は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける生物学的に活
性なＥＧＳの最小の長さが、ほぼ、この細菌のゲノムにおいて統計学的に独特で
ある必要がある配列の長さであるということを示唆する。
あるという事実は重要である。なぜならば、これらの結果は、インビボの生物学
的に活性なＥＧＳ配列の長さの下限を決定するからである。さらに、これらの結
果は、１３マーライブラリーを用いる発見と並べられた場合、重要である。明ら
かに、１３マーは、あり得る全ての９マーおよび１０マーをその中に含むが、１
３マーライブラリーを用いて種々の表現型を与える多くの別個のクローンを回収
し得た。この２組の結果の妥当な説明は、１３マーは、多くとも２つのミスマッ
チを、活性を保持しつつ許容し得たということである。結局、かつ重要でないこ
とに、この短いＥＧＳ配列を用いた結果は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける生物学的に活
性なＥＧＳの最小の長さが、ほぼ、この細菌のゲノムにおいて統計学的に独特で
ある必要がある配列の長さであるということを示唆する。
【００７０】 （Ｎ11ＡＣＣＡライブラリーの分析） １１マーライブラリーの絶対的な、つまり濃縮されていない活性を、４５，０
００個の独立コロニーの分析により決定した。この集団における活性な（増殖阻
害）ＥＧＳ配列の数から推定すると、１１マーライブラリーは、合計約４×１０ 6 の複雑性の中から、約１，２００個と１，４００個との間の活性分子を含む。 ９マーライブラリーおよび１０マーライブラリーと比較した１１マーライブラリ
ーにおける活性の増加は、１１の総複雑性が、有意な生物学的活性を誘発するた
めの最小値であることを示唆した。さらに、「活性な」ＥＧＳ配列の数は、「必
須」遺伝子の全推定数より多かったが、実施例４により例示される第２の方法に
より推定される全活性ＥＧＳの数の控えめな評価よりかなり下であった。これら
を考慮したため、有意な数（５０を超える）の活性な１１マーを、ヌクレオチド
配列決定を介して分析した。多くの、しかし全てではない、これらの配列は、Ｅ
．ｃｏｌｉゲノムの転写される領域と完璧な（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補
性を有した。このような相補性を有する配列のいくつかを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけ
る生存可能性のために必須であるタンパク質をコードすることが公知であるｍＲ
ＮＡを不活性化すると推定し、他は、機能不明のｍＲＮＡを同定した（表２）。
００個の独立コロニーの分析により決定した。この集団における活性な（増殖阻
害）ＥＧＳ配列の数から推定すると、１１マーライブラリーは、合計約４×１０ 6 の複雑性の中から、約１，２００個と１，４００個との間の活性分子を含む。 ９マーライブラリーおよび１０マーライブラリーと比較した１１マーライブラリ
ーにおける活性の増加は、１１の総複雑性が、有意な生物学的活性を誘発するた
めの最小値であることを示唆した。さらに、「活性な」ＥＧＳ配列の数は、「必
須」遺伝子の全推定数より多かったが、実施例４により例示される第２の方法に
より推定される全活性ＥＧＳの数の控えめな評価よりかなり下であった。これら
を考慮したため、有意な数（５０を超える）の活性な１１マーを、ヌクレオチド
配列決定を介して分析した。多くの、しかし全てではない、これらの配列は、Ｅ
．ｃｏｌｉゲノムの転写される領域と完璧な（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）相補
性を有した。このような相補性を有する配列のいくつかを、Ｅ．ｃｏｌｉにおけ
る生存可能性のために必須であるタンパク質をコードすることが公知であるｍＲ
ＮＡを不活性化すると推定し、他は、機能不明のｍＲＮＡを同定した（表２）。
【００７１】
【表２】 観察されるこの相補性が生物学的に意味があるかどうかは、まだ公知ではない
が、少なくとも２つの考えが、１１マーはゲノムのスクリーニングにとって次善
のものであるということを示唆する。第１に、活性クローンの数が少ない。第２
に、ヌクレオチド配列分析により、活性な１１マーはその中に著しい配列の偏り
を有することを明らかになった。この事に関して、配列決定された５０個のＥＧ
Ｓの中から、２０を超えるものが共通の６ヌクレオチドを共有し、そして共有さ
れた７ヌクレオチドおよび８ヌクレオチドの多くの例が存在した。５０個の１１
マーの線形な配列複雑性は、５５０ヌクレオチドである。特定の６ヌクレオチド
が現れるのを発見する確率は１/４０９６であり、そして、より長い特異的オリ ゴマーを発見する確率は、相応じてもっと低い。これらの結果についての１つの
可能性のある説明は、短いＥＧＳの長さで、ＲＮａｓｅ Ｐは強い配列選択を有
するということである。もし真実である場合、１１マーは、受容不可能なほど厳
しい標的部位の制限を有し得る。以下に示されるように、これらの制限（低活性
および標的部位の制限）の両方は、１２マーを用いては観察されない。
が、少なくとも２つの考えが、１１マーはゲノムのスクリーニングにとって次善
のものであるということを示唆する。第１に、活性クローンの数が少ない。第２
に、ヌクレオチド配列分析により、活性な１１マーはその中に著しい配列の偏り
を有することを明らかになった。この事に関して、配列決定された５０個のＥＧ
Ｓの中から、２０を超えるものが共通の６ヌクレオチドを共有し、そして共有さ
れた７ヌクレオチドおよび８ヌクレオチドの多くの例が存在した。５０個の１１
マーの線形な配列複雑性は、５５０ヌクレオチドである。特定の６ヌクレオチド
が現れるのを発見する確率は１/４０９６であり、そして、より長い特異的オリ ゴマーを発見する確率は、相応じてもっと低い。これらの結果についての１つの
可能性のある説明は、短いＥＧＳの長さで、ＲＮａｓｅ Ｐは強い配列選択を有
するということである。もし真実である場合、１１マーは、受容不可能なほど厳
しい標的部位の制限を有し得る。以下に示されるように、これらの制限（低活性
および標的部位の制限）の両方は、１２マーを用いては観察されない。
【００７２】 （Ｎ12ＡＣＡＡライブラリーの分析） 約５０，０００個の独立クローンを、上記のように１２マーライブラリーにお
けるＥＧＳ依存活性について評価した。１１マーライブラリーと比較して活性ク
ローンにおいて劇的な増加が存在した。約１３，０００個の活性分子を、１２ｍ
ｅｒライブラリーを用いて評価した。活性クローンのこの数は有意である。なぜ
ならば、推定必須遺伝子の数より十分多く、そして第２の方法により推定される
活性の推定レベルとよく一致するからである。１４個の活性な１２マーのヌクレ
オチド配列を、表３に示す。
けるＥＧＳ依存活性について評価した。１１マーライブラリーと比較して活性ク
ローンにおいて劇的な増加が存在した。約１３，０００個の活性分子を、１２ｍ
ｅｒライブラリーを用いて評価した。活性クローンのこの数は有意である。なぜ
ならば、推定必須遺伝子の数より十分多く、そして第２の方法により推定される
活性の推定レベルとよく一致するからである。１４個の活性な１２マーのヌクレ
オチド配列を、表３に示す。
【００７３】
【表３】 最も有意な６つのこれらの配列は、完全なワトソン−クリック塩基対形成を伴
い、標的配列に結合する。これらの標的のいくつかは、他の技術によって必須遺
伝子として個々に確認されている。
い、標的配列に結合する。これらの標的のいくつかは、他の技術によって必須遺
伝子として個々に確認されている。
【００７４】 重要なことに、これらの配列は、１１マーの非ランダムな特徴を全く提示しな
い。しかし、現在までに特徴付けられる「活性」１２マーは、Ｅ．Ｃｏｌｉゲノ
ムの転写される領域に存在する、独特の１２マーの統計学的に有意な特徴を表示
しない。これらの結果は、インビボでの最適なＥＧＳ活性は、標的配列を有する
従来の（ワトソン−クリック）塩基対形成に無条件に関連付けられはしないこと
を示している。これらの結果の１つの結論は、単純な（すなわち、簡単な相同性
のマッチング）コンピューターベースの検索は、生物学的標的に関連する活性Ｅ
ＧＳにおいては決定的でありそうにないということである。
い。しかし、現在までに特徴付けられる「活性」１２マーは、Ｅ．Ｃｏｌｉゲノ
ムの転写される領域に存在する、独特の１２マーの統計学的に有意な特徴を表示
しない。これらの結果は、インビボでの最適なＥＧＳ活性は、標的配列を有する
従来の（ワトソン−クリック）塩基対形成に無条件に関連付けられはしないこと
を示している。これらの結果の１つの結論は、単純な（すなわち、簡単な相同性
のマッチング）コンピューターベースの検索は、生物学的標的に関連する活性Ｅ
ＧＳにおいては決定的でありそうにないということである。
【００７５】 （逆重畳のためのストラテジー、すなわち、活性ＥＧＳ配列とこれらの標的と
の間の明白な連関） 上述したように、１２の細菌ゲノム（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｏｃｕｓ，Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｒｉ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｃ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ １６５５，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ Ｒｄ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ １６６９５，Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｇｅｎｔｉｔａｌｉｕｍ Ｇ３７，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ Ｍ１２９，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）は完全に配列決定され、そして他の３８の細菌ゲノ
ム（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ，Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ
ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＭＣＦ−１，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｈｅ
ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂ
ｒｕｅｃｋｉｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ｓｕｂ
ｓｐ．ｊｕｇｕｒｔｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ，Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｍｙｃｏｐｌａ
ｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ，Ｐａｓｔｅｕ
ｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌ
ａ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＧＲ２３４，Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍ
ａｒｉｎｕｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，Ｒｕｍｉｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｅｒｔａ，
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ， Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ６８０３，Ｔｒｅｐｏ
ｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ，Ｚｙｍｏｍｏ
ｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は進行中である。最も簡便な実施態様において、必須
または機能的な遺伝子をコードするＲＮＡの切断を引き起こすＥＧＳは、ワトソ
ン−クリック塩基対形成によって相補領域を探す、公知の配列との比較によって
同定される。
の間の明白な連関） 上述したように、１２の細菌ゲノム（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｏｃｕｓ，Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒ
ｒｉ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｃ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＭＧ １６５５，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕ
ｅｎｚａｅ Ｒｄ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ １６６９５，Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ
ｇｅｎｔｉｔａｌｉｕｍ Ｇ３７，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ Ｍ１２９，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，Ｔｒｅｐｏｎ
ｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）は完全に配列決定され、そして他の３８の細菌ゲノ
ム（Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ，Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐ
ｙｏｇｅｎｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕ
ｂｔｉｌｉｓ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ
ａｐｈｉｄｉｃｏｌａ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ＭＣＦ−１，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｈｅ
ｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂ
ｒｕｅｃｋｉｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ｓｕｂ
ｓｐ．ｊｕｇｕｒｔｉ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ，Ｌａｃ
ｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃ
ｕｌｏｓｉｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｍｙｃｏｐｌａ
ｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ，Ｐａｓｔｅｕ
ｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｒｕｍｉｎｉｃｏｌ
ａ，Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．ＮＧＲ２３４，Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍ
ａｒｉｎｕｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，Ｒｕｍｉｎｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｅｒｔａ，
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ， Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈａｅｏｃｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｅｓ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ＰＣＣ６８０３，Ｔｒｅｐｏ
ｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ，Ｚｙｍｏｍｏ
ｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は進行中である。最も簡便な実施態様において、必須
または機能的な遺伝子をコードするＲＮＡの切断を引き起こすＥＧＳは、ワトソ
ン−クリック塩基対形成によって相補領域を探す、公知の配列との比較によって
同定される。
【００７６】 実施例は、かなりの数（例えば、表３で示される１４中の６つ）の「活性」Ｅ
ＧＳが、細菌ゲノムの独特な転写領域のホモロジー検索を通じて一致し得るが、
全てではないことを示す。しかし、この結果は、ＥＧＳ活性は塩基対形成によっ
て媒介されないことを、除外しない、または示唆さえする。おそらく「ゆらぎ」
結合（すなわちＧ：Ｕ）にかなり限定されるであろうが、いくつかは、ＥＧＳ−
標的二重鎖において許容されるようである。正確である場合、それは簡便なコン
ピューターベースの逆重畳を除外しないが複雑にする。活性ＥＧＳが、ハイブリ
ダイゼーションにとって利用可能であるｍＲＮＡの領域を明らかにすることが期
待される。これらの領域は、単一のヌクレオチドに制限されることはなさそうで
ある。従って、十分なＥＧＳが分析された場合、同一ではないが重複している活
性クローンのクラスターを観察すべきである。これらのクラスターの分析は、Ｅ
ＧＳの実際の標的ＥＧＳを明らかにすべきであり、ならびに同時に、それら自身
と活性ＥＧＳを比較することによって、ゆらぎ結合が許容されるかどうかを明ら
かにすべきである。
ＧＳが、細菌ゲノムの独特な転写領域のホモロジー検索を通じて一致し得るが、
全てではないことを示す。しかし、この結果は、ＥＧＳ活性は塩基対形成によっ
て媒介されないことを、除外しない、または示唆さえする。おそらく「ゆらぎ」
結合（すなわちＧ：Ｕ）にかなり限定されるであろうが、いくつかは、ＥＧＳ−
標的二重鎖において許容されるようである。正確である場合、それは簡便なコン
ピューターベースの逆重畳を除外しないが複雑にする。活性ＥＧＳが、ハイブリ
ダイゼーションにとって利用可能であるｍＲＮＡの領域を明らかにすることが期
待される。これらの領域は、単一のヌクレオチドに制限されることはなさそうで
ある。従って、十分なＥＧＳが分析された場合、同一ではないが重複している活
性クローンのクラスターを観察すべきである。これらのクラスターの分析は、Ｅ
ＧＳの実際の標的ＥＧＳを明らかにすべきであり、ならびに同時に、それら自身
と活性ＥＧＳを比較することによって、ゆらぎ結合が許容されるかどうかを明ら
かにすべきである。
【００７７】 コンピューターベースの逆重畳が望ましいが、これはＥＧＳと疑わしい標的と
の間の連関を証明しない。少なくとも２つのストラテジーが、ＥＧＳに媒介され
る特異的標的の不活性化の決定的な証拠を提供するために使用され得る。第１は
、「遺伝的」試験である。目的のＥＧＳが、コード領域内の（塩基対を形成する
）ｍＲＮＡを標的にすると考えられると仮定する。遺伝コードにおける縮重を利
用することによって、同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡの能力を保持しな
がら、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を変化することが可能である。変化したｍＲ
ＮＡの異所性（すなわち、プラスミドベース）の発現は、ＥＧＳアタックに由来
する免疫であるはずであり、それにより、ＥＧＳ依存性表現型をレスキューする
。第２のアプローチは、ＥＧＳ発現細胞におけるＲＮＡ発現パターンの直接的な
分析に基づくアプローチである。ゲノム配列全体の有用性は、ＤＮＡ配列の並べ
たアレイの作製をもたらす。このようなアレイは、伝統的なメンブランまたは微
小化されたマイクロチップ上に作製され得る。細胞集団に由来する総ＲＮＡがこ
のようなアレイをプローブするために使用された場合、同時に全ての遺伝子の発
現プロフィールを得ることが可能である。ＥＧＳ発現細胞において、特異的なｍ
ＲＮＡは切断され、そしてそれに応答して、その発現はアレイハイブリダイゼー
ションにおいて低下するはずである。ハイブリダイゼーションの欠乏は、標的に
された配列を明らかにする。細胞が死ぬまたは細胞増殖が緩やかになる場合、多
数の遺伝子の発現が変化する。これは、ＥＧＳ標的の同定における発現プロフィ
ールの適用について問題を提示しない。なぜなら、ＥＧＳ媒介性の効果は、既に
存在するタンパク質の希釈の後にのみ明確になるからである。この表現型のラグ
は、生じたｍＲＮＡの明白な決定を許容する。
の間の連関を証明しない。少なくとも２つのストラテジーが、ＥＧＳに媒介され
る特異的標的の不活性化の決定的な証拠を提供するために使用され得る。第１は
、「遺伝的」試験である。目的のＥＧＳが、コード領域内の（塩基対を形成する
）ｍＲＮＡを標的にすると考えられると仮定する。遺伝コードにおける縮重を利
用することによって、同一のタンパク質をコードするｍＲＮＡの能力を保持しな
がら、ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を変化することが可能である。変化したｍＲ
ＮＡの異所性（すなわち、プラスミドベース）の発現は、ＥＧＳアタックに由来
する免疫であるはずであり、それにより、ＥＧＳ依存性表現型をレスキューする
。第２のアプローチは、ＥＧＳ発現細胞におけるＲＮＡ発現パターンの直接的な
分析に基づくアプローチである。ゲノム配列全体の有用性は、ＤＮＡ配列の並べ
たアレイの作製をもたらす。このようなアレイは、伝統的なメンブランまたは微
小化されたマイクロチップ上に作製され得る。細胞集団に由来する総ＲＮＡがこ
のようなアレイをプローブするために使用された場合、同時に全ての遺伝子の発
現プロフィールを得ることが可能である。ＥＧＳ発現細胞において、特異的なｍ
ＲＮＡは切断され、そしてそれに応答して、その発現はアレイハイブリダイゼー
ションにおいて低下するはずである。ハイブリダイゼーションの欠乏は、標的に
された配列を明らかにする。細胞が死ぬまたは細胞増殖が緩やかになる場合、多
数の遺伝子の発現が変化する。これは、ＥＧＳ標的の同定における発現プロフィ
ールの適用について問題を提示しない。なぜなら、ＥＧＳ媒介性の効果は、既に
存在するタンパク質の希釈の後にのみ明確になるからである。この表現型のラグ
は、生じたｍＲＮＡの明白な決定を許容する。
【００７８】 （ＥＧＳ媒介性標的化の他の適用） 回収した効果的ＥＧＳ配列は、それら自身、特定の遺伝子の発現を減弱するた
めの価値ある試薬である。従って、特定のＥＧＳの発現を誘導することによって
、種々の表現型分析を介して、どのようにして細胞が死ぬかを決定することが可
能である。これらのＥＧＳ配列は、細菌集団に外来的に投与され得る。適切な送
達ビヒクルを使用して、このＥＧＳ自体は抗細菌治療剤として使用され得る。
めの価値ある試薬である。従って、特定のＥＧＳの発現を誘導することによって
、種々の表現型分析を介して、どのようにして細胞が死ぬかを決定することが可
能である。これらのＥＧＳ配列は、細菌集団に外来的に投与され得る。適切な送
達ビヒクルを使用して、このＥＧＳ自体は抗細菌治療剤として使用され得る。
【００７９】 （ＩＩ．最適な機能的オリゴヌクレオチド分子の同定方法） ベクター、ならびに標的ＲＮＡ分子の発現を阻害するリボザイム、ＥＧＳ、お
よびアンチセンスＲＮＡのような機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するため
の方法は、開示されている。この方法は、可能性のある機能的オリゴヌクレオチ
ド分子のライブラリーに由来する目的のＲＮＡ分子配列を含む、融合転写物の発
現を変化するＲＮＡ分子を選別することによって、機能的オリゴヌクレオチド分
子を同定する。融合転写物の発現の阻害は、レポータータンパク質の発現を妨げ
る。これは、レポータータンパク質の発現を直接的または間接的に検出すること
によって、モニターされる発現の阻害を可能にする。あるいは、発現は、最適な
機能的オリゴヌクレオチド分子を含まない細胞において、分子の発現に比例して
増加され得る。機能的オリゴヌクレオチド分子を有する目的のＲＮＡの発現に関
与する、核酸分子の相互作用によって、阻害は達成される。リボザイムおよびＥ
ＧＳは融合転写物を切断し、そしてアンチセンスＲＮＡは、融合転写物の発現に
関与する核酸分子へのハイブリダイゼーションを介して、発現を阻害する。
よびアンチセンスＲＮＡのような機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するため
の方法は、開示されている。この方法は、可能性のある機能的オリゴヌクレオチ
ド分子のライブラリーに由来する目的のＲＮＡ分子配列を含む、融合転写物の発
現を変化するＲＮＡ分子を選別することによって、機能的オリゴヌクレオチド分
子を同定する。融合転写物の発現の阻害は、レポータータンパク質の発現を妨げ
る。これは、レポータータンパク質の発現を直接的または間接的に検出すること
によって、モニターされる発現の阻害を可能にする。あるいは、発現は、最適な
機能的オリゴヌクレオチド分子を含まない細胞において、分子の発現に比例して
増加され得る。機能的オリゴヌクレオチド分子を有する目的のＲＮＡの発現に関
与する、核酸分子の相互作用によって、阻害は達成される。リボザイムおよびＥ
ＧＳは融合転写物を切断し、そしてアンチセンスＲＮＡは、融合転写物の発現に
関与する核酸分子へのハイブリダイゼーションを介して、発現を阻害する。
【００８０】 機能的オリゴヌクレオチド分子アッセイに使用するためのベクターは、第１の
レポーター遺伝子、第２のレポーター遺伝子、および標的遺伝子を含む。レポー
ター遺伝子１は、目的のＲＮＡ分子およびレポータータンパク質Ａをコードする
配列を含むＲＮＡ分子をコードする。融合転写物は、転写物の５’領域に目的の
ＲＮＡ分子の配列、ならびに転写物の３’領域に第１のレポータータンパク質を
コードする配列を含んでいる。この配列は、融合転写物が、目的のＲＮＡ分子の
配列によってコードされるタンパク質とレポータータンパク質との間の融合物で
ある融合タンパク質をコードするように連結される。この配置は、目的のＲＮＡ
の発現に依存するレポータータンパク質の発現をもたらす。レポーター遺伝子１
はまた、適切な宿主細胞において、遺伝子の発現に必要な発現配列を含む。レポ
ーター遺伝子２は、異なるレポータータンパク質Ｂをコードする。ベクターはま
た、目的のＲＮＡを特異的を標的にするか、あるいは縮重した標的配列または部
分的に縮重した標的配列を含む、のいずれかの機能的オリゴヌクレオチド分子を
コードする。
レポーター遺伝子、第２のレポーター遺伝子、および標的遺伝子を含む。レポー
ター遺伝子１は、目的のＲＮＡ分子およびレポータータンパク質Ａをコードする
配列を含むＲＮＡ分子をコードする。融合転写物は、転写物の５’領域に目的の
ＲＮＡ分子の配列、ならびに転写物の３’領域に第１のレポータータンパク質を
コードする配列を含んでいる。この配列は、融合転写物が、目的のＲＮＡ分子の
配列によってコードされるタンパク質とレポータータンパク質との間の融合物で
ある融合タンパク質をコードするように連結される。この配置は、目的のＲＮＡ
の発現に依存するレポータータンパク質の発現をもたらす。レポーター遺伝子１
はまた、適切な宿主細胞において、遺伝子の発現に必要な発現配列を含む。レポ
ーター遺伝子２は、異なるレポータータンパク質Ｂをコードする。ベクターはま
た、目的のＲＮＡを特異的を標的にするか、あるいは縮重した標的配列または部
分的に縮重した標的配列を含む、のいずれかの機能的オリゴヌクレオチド分子を
コードする。
【００８１】 レポータータンパク質Ａの発現、あるいは発現の欠損は、機能的オリゴヌクレ
オチド分子の効果を評価するために使用される。レポータータンパク質Ｂの発現
は、細胞へのベクターの形質転換またはトランスフェクションを検出するために
、ならびに目的のＲＮＡ分子の切断に起因しないレポータータンパク質Ａの発現
に対する効果についてのコントロールとして、の両方に使用され得る。
オチド分子の効果を評価するために使用される。レポータータンパク質Ｂの発現
は、細胞へのベクターの形質転換またはトランスフェクションを検出するために
、ならびに目的のＲＮＡ分子の切断に起因しないレポータータンパク質Ａの発現
に対する効果についてのコントロールとして、の両方に使用され得る。
【００８２】 ３つの構成成分：第１のレポーター遺伝子、第２のレポーター遺伝子、および
標的遺伝子が、単一の核酸分子に含まれることが好ましいが、レポーター遺伝子
および標的遺伝子は別々の分子上に存在し得る。レポーター遺伝子および標的遺
伝子が別々の分子上に存在する場合、レポーター遺伝子を含む分子は、宿主の染
色体内に組み込まれることが望ましい。これは、適切なレポーター遺伝子を含む
細胞株を容易に維持することを可能にし、そして機能的オリゴヌクレオチド分子
の異なるライブラリーをコードするベクターの異なるセットを、同一のレポータ
ー遺伝子に対して都合よく試験することを可能にする。
標的遺伝子が、単一の核酸分子に含まれることが好ましいが、レポーター遺伝子
および標的遺伝子は別々の分子上に存在し得る。レポーター遺伝子および標的遺
伝子が別々の分子上に存在する場合、レポーター遺伝子を含む分子は、宿主の染
色体内に組み込まれることが望ましい。これは、適切なレポーター遺伝子を含む
細胞株を容易に維持することを可能にし、そして機能的オリゴヌクレオチド分子
の異なるライブラリーをコードするベクターの異なるセットを、同一のレポータ
ー遺伝子に対して都合よく試験することを可能にする。
【００８３】 レポーター遺伝子２を発現する細胞を、レポータータンパク質Ｂの存在を、直
接的にあるいは間接的に検出することによって同定する。レポーター遺伝子２は
、ベクターを含む細胞を保証し、そして一般に、発現に影響を及ぼし得る任意の
因子を制御するために使用される。このような制御下にない場合、レポーター遺
伝子１の発現の欠失は解釈を誤らせ得る。測定されるレポーター遺伝子２の発現
のレベルは重要ではない。レポータータンパク質Ｂは、選択を容易にするために
、抗菌性耐性を与えるタンパク質、または培養培地に存在しない必須栄養分を産
生するタンパク質のような、細胞にとって必須なタンパク質であることが好まし
い。
接的にあるいは間接的に検出することによって同定する。レポーター遺伝子２は
、ベクターを含む細胞を保証し、そして一般に、発現に影響を及ぼし得る任意の
因子を制御するために使用される。このような制御下にない場合、レポーター遺
伝子１の発現の欠失は解釈を誤らせ得る。測定されるレポーター遺伝子２の発現
のレベルは重要ではない。レポータータンパク質Ｂは、選択を容易にするために
、抗菌性耐性を与えるタンパク質、または培養培地に存在しない必須栄養分を産
生するタンパク質のような、細胞にとって必須なタンパク質であることが好まし
い。
【００８４】 第１のレポーター遺伝子の発現を変化する細胞は、直接的または間接的のいず
れかで、レポータータンパク質Ａの発現レベルを測定することによって、あるい
はレポータータンパク質Ａの発現レベルに基づいて細胞を分別することによって
同定され得る。検出の好ましい方法は、使用されるレポータータンパク質の性質
に依存する。例えば、発現レベルに比例した検出可能なシグナルを産生するレポ
ータータンパク質を使用する場合、細胞を、産生されるシグナルレベルに基づい
て分類または採集し得る。β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質
のようなレポータータンパク質は、このようなカテゴリーにある。細胞表面タン
パク質をレポータータンパク質Ａとして使用する場合、上述した細胞分離技術が
使用され得る。細胞はまた、レポータータンパク質Ａとしてグリーン蛍光タンパ
ク質を使用する場合、ＦＡＣＳによって分類され得る。なぜなら、このタンパク
質は蛍光シグナルを産生するからである。
れかで、レポータータンパク質Ａの発現レベルを測定することによって、あるい
はレポータータンパク質Ａの発現レベルに基づいて細胞を分別することによって
同定され得る。検出の好ましい方法は、使用されるレポータータンパク質の性質
に依存する。例えば、発現レベルに比例した検出可能なシグナルを産生するレポ
ータータンパク質を使用する場合、細胞を、産生されるシグナルレベルに基づい
て分類または採集し得る。β−ガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質
のようなレポータータンパク質は、このようなカテゴリーにある。細胞表面タン
パク質をレポータータンパク質Ａとして使用する場合、上述した細胞分離技術が
使用され得る。細胞はまた、レポータータンパク質Ａとしてグリーン蛍光タンパ
ク質を使用する場合、ＦＡＣＳによって分類され得る。なぜなら、このタンパク
質は蛍光シグナルを産生するからである。
【００８５】 上述の選択過程は、選別された細胞からのベクターの単離、および新規の細胞
に得られたベクターを再導入することによって、均一集団のプラスミドを保持す
る細胞が単離され得るまで、数回繰り返され得ることが好ましい。次の、細胞の
最終分離に続き、以下に記載するようにしてベクターを単離し、そして増幅させ
得、そしてベクターの各調製物においてコードされる機能的オリゴヌクレオチド
分子の配列を決定し得る。
に得られたベクターを再導入することによって、均一集団のプラスミドを保持す
る細胞が単離され得るまで、数回繰り返され得ることが好ましい。次の、細胞の
最終分離に続き、以下に記載するようにしてベクターを単離し、そして増幅させ
得、そしてベクターの各調製物においてコードされる機能的オリゴヌクレオチド
分子の配列を決定し得る。
【００８６】 （機能的リボザイムまたはＥＧＳの同定） レポーター遺伝子１の発現の阻害に効果的な機能的オリゴヌクレオチド分子は
、任意の適切な技術を使用して同定される得る。機能的オリゴヌクレオチド分子
の配列は、選択された細胞内のベクターを配列決定することによって決定される
ことが好ましい。クローン由来のベクター配列を配列決定するための多数の技術
は公知であり、そして公開された方法において使用され得る。例えば、選択され
た細胞のＨｉｒｔ上清を作製し得、そしてこれらの細胞からプラスミドを抽出す
る。単離されたベクター中の機能的オリゴヌクレオチド分子の配列を同定するた
めの好ましい方法は、機能的ヌクレオチド領域の単一細胞ＰＣＲ増幅とそれに続
く配列決定である。単離されたベクター中の機能的オリゴヌクレオチド分子の配
列を同定するための別の好ましい方法は、細胞を溶解し、プラスミドを抽出し、
細菌中でプラスミドを増幅し、そして細胞集団に関連する機能的オリゴヌクレオ
チド分子の配列を同定する、増幅されたプラスミドの配列決定である。
、任意の適切な技術を使用して同定される得る。機能的オリゴヌクレオチド分子
の配列は、選択された細胞内のベクターを配列決定することによって決定される
ことが好ましい。クローン由来のベクター配列を配列決定するための多数の技術
は公知であり、そして公開された方法において使用され得る。例えば、選択され
た細胞のＨｉｒｔ上清を作製し得、そしてこれらの細胞からプラスミドを抽出す
る。単離されたベクター中の機能的オリゴヌクレオチド分子の配列を同定するた
めの好ましい方法は、機能的ヌクレオチド領域の単一細胞ＰＣＲ増幅とそれに続
く配列決定である。単離されたベクター中の機能的オリゴヌクレオチド分子の配
列を同定するための別の好ましい方法は、細胞を溶解し、プラスミドを抽出し、
細菌中でプラスミドを増幅し、そして細胞集団に関連する機能的オリゴヌクレオ
チド分子の配列を同定する、増幅されたプラスミドの配列決定である。
【００８７】 開示された方法を使用して同定された機能的オリゴヌクレオチド分子は、機能
的オリゴヌクレオチド分子と同一の部位に対して標的化する（ａｒｇｅｔｅｄ）
オリゴマーを設計するために使用し得る。
的オリゴヌクレオチド分子と同一の部位に対して標的化する（ａｒｇｅｔｅｄ）
オリゴマーを設計するために使用し得る。
【００８８】 （単一プラスミドへの形質転換） レポータータンパク質ＡとしてＧＦＰをコードする第１のレポーター遺伝子、
第２のレポーター遺伝子、および機能的オリゴヌクレオチド分子としてＥＧＳま
たはリボザイム分子のライブラリーをコードする標的遺伝子をコードする１組の
ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて混合した集団を増殖することによって増幅さ
せる。固定された濃度のプラスミドを適切なキャリアー（例えば、脂質、リン酸
カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン）と複合体を形成させ、そして哺乳動物細胞
に送達する。発現のピークの日（通常２日目）に、ＧＦＰおよび第２のレポータ
ーの発現レベルをＦＡＣＳ分離によって測定する。第２のレポーターの発現（例
えば、ＣＤ４）は、ＧＦＰ蛍光スペクトルと重複しない波長で測定される。代表
的に、蛍光タグと結合体化された抗体が使用され、第２のレポーターの発現レベ
ルをモニターするために第２のレポータータンパク質に対して指向される。抗体
を細胞と共にインキュベートし、過剰の抗体を洗い流し、そしてＧＦＰと異なる
波長で蛍光をモニターする。第２のレポーター発現に対するＧＦＰ発現の割合を
、標的配列の発現の阻害程度を決定するための尺度として使用する。細胞を溶解
し、プラスミドを抽出し、細菌内で増幅し、そして細胞集団に関連するＥＧＳま
たはリボザイムを同定するために配列決定した。
第２のレポーター遺伝子、および機能的オリゴヌクレオチド分子としてＥＧＳま
たはリボザイム分子のライブラリーをコードする標的遺伝子をコードする１組の
ベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて混合した集団を増殖することによって増幅さ
せる。固定された濃度のプラスミドを適切なキャリアー（例えば、脂質、リン酸
カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン）と複合体を形成させ、そして哺乳動物細胞
に送達する。発現のピークの日（通常２日目）に、ＧＦＰおよび第２のレポータ
ーの発現レベルをＦＡＣＳ分離によって測定する。第２のレポーターの発現（例
えば、ＣＤ４）は、ＧＦＰ蛍光スペクトルと重複しない波長で測定される。代表
的に、蛍光タグと結合体化された抗体が使用され、第２のレポーターの発現レベ
ルをモニターするために第２のレポータータンパク質に対して指向される。抗体
を細胞と共にインキュベートし、過剰の抗体を洗い流し、そしてＧＦＰと異なる
波長で蛍光をモニターする。第２のレポーター発現に対するＧＦＰ発現の割合を
、標的配列の発現の阻害程度を決定するための尺度として使用する。細胞を溶解
し、プラスミドを抽出し、細菌内で増幅し、そして細胞集団に関連するＥＧＳま
たはリボザイムを同定するために配列決定した。
【００８９】 （２つの個々のプラスミドへの形質転換） 別の実施態様において、２つの個々のプラスミドをＥ．ｃｏｌｉを形質転換す
るために使用する。第１のプラスミドは、融合タンパク質（標的−ＧＦＰ）をコ
ードし、そして第２のプラスミドは、第２のレポーターおよびＥＧＳまたはリボ
ザイムのライブラリーをコードする標的遺伝子をコードする。ＥＧＳ／リボザイ
ムライブラリーをコードするプラスミドを、バクテリア内で増殖させ、そして上
記のように、混合したプラスミドを調製する。
るために使用する。第１のプラスミドは、融合タンパク質（標的−ＧＦＰ）をコ
ードし、そして第２のプラスミドは、第２のレポーターおよびＥＧＳまたはリボ
ザイムのライブラリーをコードする標的遺伝子をコードする。ＥＧＳ／リボザイ
ムライブラリーをコードするプラスミドを、バクテリア内で増殖させ、そして上
記のように、混合したプラスミドを調製する。
【００９０】 固定された濃度の混合したプラスミド（個々は別々のＥＧＳまたはリボザイム
をコードする）を、固定された濃度の標的プラスミドと組み合わせる（標的−Ｇ
ＦＰ融合タンパク質をコードする）。この混合物を、市販の脂質またはリン酸カ
ルシウムの調製物と複合体化し、そして９６ウェルにプレートした細胞にトラン
スフェクトする。ＧＦＰの発現のピークで、ＧＦＰ−蛍光レベルおよび第２のレ
ポーターの発現レベルを測定し、そして第２のレポーターに対するＧＦＰ発現の
比率を、ＥＧＳまたはリボザイムの効力を判定するために使用する。標的に対す
るＥＧＳの比率は、この標的に対するＥＧＳまたはリボザイムの発現レベルを変
化するために変更され得る。
をコードする）を、固定された濃度の標的プラスミドと組み合わせる（標的−Ｇ
ＦＰ融合タンパク質をコードする）。この混合物を、市販の脂質またはリン酸カ
ルシウムの調製物と複合体化し、そして９６ウェルにプレートした細胞にトラン
スフェクトする。ＧＦＰの発現のピークで、ＧＦＰ−蛍光レベルおよび第２のレ
ポーターの発現レベルを測定し、そして第２のレポーターに対するＧＦＰ発現の
比率を、ＥＧＳまたはリボザイムの効力を判定するために使用する。標的に対す
るＥＧＳの比率は、この標的に対するＥＧＳまたはリボザイムの発現レベルを変
化するために変更され得る。
【００９１】 機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するためのこの方法は、（特に、ＲＮａ
ｓｅ Ｐによる目的のＲＮＡ分子の切断の誘導において、増強されるかまたは最
適な活性を有するＥＧＳ）以下の限定されない実施例を参照することによりさら
に理解される。
ｓｅ Ｐによる目的のＲＮＡ分子の切断の誘導において、増強されるかまたは最
適な活性を有するＥＧＳ）以下の限定されない実施例を参照することによりさら
に理解される。
【００９２】 （実施例４：ＥＧＳプールからの機能的ＥＧＳの選択） ＣＡＴ−β−ガラクトシダーゼの融合タンパク質を含む原核生物ベースのベク
ターは、濃青色のコロニーを発現した。ＣＡＴ遺伝子に相補する５５ＥＧＳ配列
をコードするＤＮＡライブラリーを、ベースのベクターの標的遺伝子内に挿入し
た。
ターは、濃青色のコロニーを発現した。ＣＡＴ遺伝子に相補する５５ＥＧＳ配列
をコードするＤＮＡライブラリーを、ベースのベクターの標的遺伝子内に挿入し
た。
【００９３】 ２つのライブラリーを作製した。第１のライブラリー（ライブラリーＡ）は、
Ｔ７ターミネーターに続いてＥＧＳをコードした。第２のライブラリーは、ＥＧ
Ｓの３’末端を完成するための自己切断ハンマーヘッドリボザイム（ｓｅｌｆ−
ｃｌｅａｖｉｎｇ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）に続いてＥＧＳ
をコードした。第２のライブラリーにおける発現は、おそらくより低い安定性に
起因して、より低かった。
Ｔ７ターミネーターに続いてＥＧＳをコードした。第２のライブラリーは、ＥＧ
Ｓの３’末端を完成するための自己切断ハンマーヘッドリボザイム（ｓｅｌｆ−
ｃｌｅａｖｉｎｇ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅ）に続いてＥＧＳ
をコードした。第２のライブラリーにおける発現は、おそらくより低い安定性に
起因して、より低かった。
【００９４】 ライブラリーＡをＸ−ｇａｌプレートにプレートした。淡青色および濃青色の
コロニーを数えた。淡青色コロニーは、ＣＡＴ発現のＥＧＳ媒介性の妨害を示す
と推定された。ＥＧＳライブラリー由来の増殖したコロニーは、コントロールプ
レート（ＥＧＳ挿入のないライブラリー由来の増殖したコロニー）の１％未満の
淡青色コロニーと比較して、約５％の淡青色コロニーを提供した。この陽性の総
数は、効果的である初代ライブラリーからの２〜３のＥＧＳ配列に一致した。従
って、配列の厳格なグループ化が期待された。それ故に、淡青色コロニーを採集
し、再プレートした。淡青色コロニーを保存した。多数の淡青色コロニーを、β
−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイし、そして酵素活性の８０〜９０％の
阻害を明らかにした。
コロニーを数えた。淡青色コロニーは、ＣＡＴ発現のＥＧＳ媒介性の妨害を示す
と推定された。ＥＧＳライブラリー由来の増殖したコロニーは、コントロールプ
レート（ＥＧＳ挿入のないライブラリー由来の増殖したコロニー）の１％未満の
淡青色コロニーと比較して、約５％の淡青色コロニーを提供した。この陽性の総
数は、効果的である初代ライブラリーからの２〜３のＥＧＳ配列に一致した。従
って、配列の厳格なグループ化が期待された。それ故に、淡青色コロニーを採集
し、再プレートした。淡青色コロニーを保存した。多数の淡青色コロニーを、β
−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイし、そして酵素活性の８０〜９０％の
阻害を明らかにした。
【００９５】 ４つの淡青色コロニーに由来するＤＮＡを単離し、そして配列決定した。各コ
ロニーは同一のＥＧＳをコードした。このＥＧＳをベースのベクター内に挿入し
た。約９０％のＣＡＴ活性の阻害が認められた。定性的に、より少ない阻害が第
２のライブラリーで確認された。
ロニーは同一のＥＧＳをコードした。このＥＧＳをベースのベクター内に挿入し
た。約９０％のＣＡＴ活性の阻害が認められた。定性的に、より少ない阻害が第
２のライブラリーで確認された。
【００９６】 コントロールとして、反対の実験を行った。ＥＧＳをベースのベクターから除
去した。β−ガラクトシダーゼ発現の野生型レベルを観察した。これらのデータ
は、機能的ＥＧＳが大きなプールから選別され得ることを示している。ＥＧＳ１
およびＥＧＳ２（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋｅｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．ＵＳＡ １９９７に示される）（以前に同定された、ＣＡＴ ＲＮＡを
標的とする機能的ＥＧＳ）は、これらのアッセイにおいてほとんど活性を示さな
いか、または全く活性がない。
去した。β−ガラクトシダーゼ発現の野生型レベルを観察した。これらのデータ
は、機能的ＥＧＳが大きなプールから選別され得ることを示している。ＥＧＳ１
およびＥＧＳ２（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋｅｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．ＵＳＡ １９９７に示される）（以前に同定された、ＣＡＴ ＲＮＡを
標的とする機能的ＥＧＳ）は、これらのアッセイにおいてほとんど活性を示さな
いか、または全く活性がない。
【００９７】 ライブラリーＡに由来する３９の陽性を、三次スクリーニングで選択した。Ｄ
ＮＡを調製し、そして配列決定した。最初の５３ＥＧＳ配列の８つのみが見出さ
れた（５２番のＥＧＳは２３回出現した）。コントロールとして、４８のコロニ
ーを、β−ガラクトシダーゼ発現レベルに関係なく無作為にライブラリーＡから
選択した。この無作為のセットにおいて、２８のＥＧＳ配列を見出した（１つと
して５回を超えて出現しなかった）。表４は、ＥＧＳ配列の分布を示している。
ＮＡを調製し、そして配列決定した。最初の５３ＥＧＳ配列の８つのみが見出さ
れた（５２番のＥＧＳは２３回出現した）。コントロールとして、４８のコロニ
ーを、β−ガラクトシダーゼ発現レベルに関係なく無作為にライブラリーＡから
選択した。この無作為のセットにおいて、２８のＥＧＳ配列を見出した（１つと
して５回を超えて出現しなかった）。表４は、ＥＧＳ配列の分布を示している。
【００９８】
【表４】 従って、これらの判定基準によって、ＥＧＳ５２、ＥＧＳ３６、およびＥＧＳ
２０が、最も高頻度に選択されるＥＧＳ分子として同定された。これらの同一の
ＥＧＳ分子は、ＣＡＴ遺伝子の発現の阻害に最も効果的であるはずである。これ
を試験するために、ＥＧＳ５２、ＥＧＳ３６、およびＥＧＳ２０を、ＣＡＴ遺伝
子を発現している細胞において発現させ、そしてその細胞をクロラムフェニコー
ルについて試験した。その結果を図９ａおよび図９ｂに示す。任意のＥＧＳを欠
くコントロールプラスミドを有する細胞は、クロラムフェニコール耐性を示す一
方、選択したＥＧＳ分子の全ての３つは、クロラムフェニコール耐性に対して有
意な効果を有する。
２０が、最も高頻度に選択されるＥＧＳ分子として同定された。これらの同一の
ＥＧＳ分子は、ＣＡＴ遺伝子の発現の阻害に最も効果的であるはずである。これ
を試験するために、ＥＧＳ５２、ＥＧＳ３６、およびＥＧＳ２０を、ＣＡＴ遺伝
子を発現している細胞において発現させ、そしてその細胞をクロラムフェニコー
ルについて試験した。その結果を図９ａおよび図９ｂに示す。任意のＥＧＳを欠
くコントロールプラスミドを有する細胞は、クロラムフェニコール耐性を示す一
方、選択したＥＧＳ分子の全ての３つは、クロラムフェニコール耐性に対して有
意な効果を有する。
【００９９】 図１０はさらなるデータを図示する。各Ｘは、ＣＡＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物
の特異的配列に相補するＥＧＳを表している。Ｘは、この実験においてＥＧＳを
回復し、そしてライブラリーを代表することを示す。同じＥＧＳが、クローンの
淡青色または青色がかった白色により選択された多数の異なるクローンから見出
された。同等に重要なことは、指標のないプレートから無作為に採集したほとん
どのＥＧＳは、指標のあるプレートから選択された活性ＥＧＳと異なっていた。
ｍＲＮＡ分子における最も可能性のある部位は、明らかに相補的なＥＧＳの作用
にアクセス不可能であった。しかし、特定のｍＲＮＡ部位はＥＧＳに対してアク
セス可能であることが同定された。
の特異的配列に相補するＥＧＳを表している。Ｘは、この実験においてＥＧＳを
回復し、そしてライブラリーを代表することを示す。同じＥＧＳが、クローンの
淡青色または青色がかった白色により選択された多数の異なるクローンから見出
された。同等に重要なことは、指標のないプレートから無作為に採集したほとん
どのＥＧＳは、指標のあるプレートから選択された活性ＥＧＳと異なっていた。
ｍＲＮＡ分子における最も可能性のある部位は、明らかに相補的なＥＧＳの作用
にアクセス不可能であった。しかし、特定のｍＲＮＡ部位はＥＧＳに対してアク
セス可能であることが同定された。
【０１００】 図１０のデータはまた、各ＥＧＳが標的遺伝子の発現をノックダウンすること
による相対的な効力を示す。集団の各組を用いて、特異的ＥＧＳに起因するβ−
ガラクトシダーゼ活性の観察された阻害を示す。最も効果的であったのはＥＧＳ
−５２であり、β−ガラクトシダーゼ活性の９２％の減少という結果であった。
別に選択された３つのＥＧＳ（ＥＧＳ−３１、ＥＧＳ−２０、およびＥＧＳ−３
６）は、それぞれ２０％および３０％まで、β−ガラクトシダーゼ活性を減少し
た。
による相対的な効力を示す。集団の各組を用いて、特異的ＥＧＳに起因するβ−
ガラクトシダーゼ活性の観察された阻害を示す。最も効果的であったのはＥＧＳ
−５２であり、β−ガラクトシダーゼ活性の９２％の減少という結果であった。
別に選択された３つのＥＧＳ（ＥＧＳ−３１、ＥＧＳ−２０、およびＥＧＳ−３
６）は、それぞれ２０％および３０％まで、β−ガラクトシダーゼ活性を減少し
た。
【０１０１】 本明細書中で引用される文献および引用される資料は、特に参考として援用さ
れる。
れる。
【０１０２】 当業者は、本明細書に記載される発明の特定の実施態様に対する多数の等価物
を、認めるか、あるいは慣用的にすぎない実験を使用して確認し得る。このよう
な等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
を、認めるか、あるいは慣用的にすぎない実験を使用して確認し得る。このよう
な等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図１】 図１は、標的ｍＲＮＡの切断におけるＥＧＳの作用機構の図である。
【図２ａ】 図２ａは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける必須遺伝子の同定における使用のために、Ａ
ＲＡ−Ｎ１１ライブラリー（１３−マーＥＧＳ、Ｎ11ＣＣＡＣＣＡ）を作成する
ための実施例において使用される構造物の図である。
ＲＡ−Ｎ１１ライブラリー（１３−マーＥＧＳ、Ｎ11ＣＣＡＣＣＡ）を作成する
ための実施例において使用される構造物の図である。
【図２ｂ】 図２ｂは、ｐＡＲＡＮｘ（Ａ／Ｋ）ＥＧＳ転写ベクターの概略図である。
【図２ｃ】 図２ｃは、ｐＡＲＡＮベクターおよびライブラリー構築物の概略図である。
【図３】 図３は、Ｅ．ｃｏｌｉ内のＡｒａＮ１１ライブラリーを固体培地において誘導
および選択するための方法の流れ図である。適切なＥＧＳを発現する細胞のみ生
存し、そして増幅される。
および選択するための方法の流れ図である。適切なＥＧＳを発現する細胞のみ生
存し、そして増幅される。
【図４】 図４は、ＥＧＳ標的必須遺伝子を選択するためのアンピシリン濃縮方法の流れ
図である。
図である。
【図５ａ】 図５ａは、アラビノースあり（円）およびアラビノースなし（四角）でのアン
ピシリン選択クローンＥ８−１の増殖を示したグラフである。
ピシリン選択クローンＥ８−１の増殖を示したグラフである。
【図５ｂ】 図５ｂは、アラビノースあり（円）およびアラビノースなし（四角）でのコン
トロールの増殖を示したグラフである。
トロールの増殖を示したグラフである。
【図６】 図６は、異なる大きさのＥＧＳのライブラリー（９−マー、１０−マー、１１
−マー、および１２−マー）において同定される活性ＥＧＳの相対数を示したグ
ラフである。
−マー、および１２−マー）において同定される活性ＥＧＳの相対数を示したグ
ラフである。
【図７】 図７は、ＥＧＳ、リボザイム、およびアンチセンスを含む機能的オリゴヌクレ
オチド分子を同定するための方法において使用するためのベクターの例を示した
図である。レポーター遺伝子１は、目的のＲＮＡおよびレポータータンパク質（
レポータータンパク質Ａ）をコードするＲＮＡからなる融合転写物をコードする
。融合転写物は、目的のＲＮＡによってコードされるタンパク質およびレポータ
ータンパク質Ａからなる融合タンパク質をコードする。レポーター遺伝子２は、
レポータータンパク質Ｂをコードする。標的遺伝子は、試験されるための機能的
オリゴヌクレオチド分子の一つをコードする。
オチド分子を同定するための方法において使用するためのベクターの例を示した
図である。レポーター遺伝子１は、目的のＲＮＡおよびレポータータンパク質（
レポータータンパク質Ａ）をコードするＲＮＡからなる融合転写物をコードする
。融合転写物は、目的のＲＮＡによってコードされるタンパク質およびレポータ
ータンパク質Ａからなる融合タンパク質をコードする。レポーター遺伝子２は、
レポータータンパク質Ｂをコードする。標的遺伝子は、試験されるための機能的
オリゴヌクレオチド分子の一つをコードする。
【図８】 図８は、機能的オリゴヌクレオチド分子を同定するための方法において使用す
るためのベクターの例を示した図である。レポーター遺伝子１は、クロラフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするＲＮＡおよびβ−ガ
ラクトシダーゼをコードするＲＮＡからなる融合転写物（レポータータンパク質
Ａ）をコードする。この融合転写物は、ＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼから
なる融合タンパク質をコードする。レポーター遺伝子２は、アンピシリン抵抗遺
伝子である。標的遺伝子は、５０ＥＧＳ分子のライブラリーの一つをコードする
ＥＧＳカセットであり、ＣＡＴ ＲＮＡにおいて異なる部位がそれぞれ標的化さ
れる。
るためのベクターの例を示した図である。レポーター遺伝子１は、クロラフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするＲＮＡおよびβ−ガ
ラクトシダーゼをコードするＲＮＡからなる融合転写物（レポータータンパク質
Ａ）をコードする。この融合転写物は、ＣＡＴおよびβ−ガラクトシダーゼから
なる融合タンパク質をコードする。レポーター遺伝子２は、アンピシリン抵抗遺
伝子である。標的遺伝子は、５０ＥＧＳ分子のライブラリーの一つをコードする
ＥＧＳカセットであり、ＣＡＴ ＲＮＡにおいて異なる部位がそれぞれ標的化さ
れる。
【図９ａ】 図９ａは、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの存在下における細胞の、時間
（分）に対する細胞培養密度（Ａ600）のグラフである。この細胞は、図８で示 されるベクターと類似した、ＥＧＳをコードしないベクター（円）、ＥＧＳ３６
をコードするベクター（三角）、ＥＧＳ２０をコードするベクター（逆三角）、
または両方のＥＧＳ５２をコードするベクター（ひし形）を含んだ。
（分）に対する細胞培養密度（Ａ600）のグラフである。この細胞は、図８で示 されるベクターと類似した、ＥＧＳをコードしないベクター（円）、ＥＧＳ３６
をコードするベクター（三角）、ＥＧＳ２０をコードするベクター（逆三角）、
または両方のＥＧＳ５２をコードするベクター（ひし形）を含んだ。
【図９ｂ】 図９ｂは、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールの存在下における細胞の、時
間（分）に対する細胞培養密度（Ａ600）のグラフである。この細胞は、図８で 示されるベクターと類似した、ＥＧＳをコードしないベクター（円）、ＥＧＳ３
６をコードするベクター（三角）、ＥＧＳ２０をコードするベクター（逆三角）
、または両方のＥＧＳ５２をコードするベクター（ひし形）を含んだ。
間（分）に対する細胞培養密度（Ａ600）のグラフである。この細胞は、図８で 示されるベクターと類似した、ＥＧＳをコードしないベクター（円）、ＥＧＳ３
６をコードするベクター（三角）、ＥＧＳ２０をコードするベクター（逆三角）
、または両方のＥＧＳ５２をコードするベクター（ひし形）を含んだ。
【図１０】 図１０は、ＥＧＳ−ＣＡＴ−１、ＥＧＳ−ＣＡＴ−２、ＥＧＳ−２０、ＥＧＳ
−３１、ＥＧＳ−３６およびＥＧＳ−５２による、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性の阻害百分率のグラフである。各Ｘは、Ｃ
ＡＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の特異的配列に相補的なＥＧＳを表わす。この複数
のＸは、ＥＧＳは回復されそしてライブラリーが本実験で表わされたことを示す
。円は、各ＥＧＳが標的化遺伝子の発現をノックダウンする相対頻度を示す。
−３１、ＥＧＳ−３６およびＥＧＳ−５２による、クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）活性の阻害百分率のグラフである。各Ｘは、Ｃ
ＡＴ遺伝子のｍＲＮＡ転写物の特異的配列に相補的なＥＧＳを表わす。この複数
のＸは、ＥＧＳは回復されそしてライブラリーが本実験で表わされたことを示す
。円は、各ＥＧＳが標的化遺伝子の発現をノックダウンする相対頻度を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ (72)発明者 キント， トーマス ジェイ． アメリカ合衆国 メリーランド 20817− 2727， ベセスダ， スティル スプリン グ コート 8313
Claims (40)
- 【請求項１】 第１のレポーター遺伝子、第２のレポーター遺伝子、および
標的遺伝子を含む核酸分子であって、 ここで、該第１のレポーター遺伝子は目的のタンパク質またはその一部分およ
び第１のレポータータンパク質を含む融合タンパク質をコードし、 そして、該第２のレポーター遺伝子は、第２のレポータータンパク質をコード
し、 そして、該目的のタンパク質またはその一部分は、目的のＲＮＡによりコード
され、 そして、該標的遺伝子は、ＥＧＳ、リボザイム、およびアンチセンスＲＮＡか
らなる群より選択される機能的オリゴヌクレオチド分子をコードし、 そして、該機能的オリゴヌクレオチド分子は、目的のＲＮＡ分子における部位
または目的のＲＮＡ分子をコードする該第１のレポーター遺伝子の一部分におけ
る部位に標的化される、核酸分子。 - 【請求項２】 前記標的遺伝子によりコードされる前記機能的オリゴヌクレ
オチド分子がＥＧＳである、請求項１に記載の核酸分子。 - 【請求項３】 前記核酸分子が原核生物細胞において発現および複製される
ベクターである、請求項１に記載の核酸分子。 - 【請求項４】 前記ベクターが真核生物細胞において発現および複製される
、請求項１に記載の核酸分子。 - 【請求項５】 請求項１に記載の核酸分子のセットであって、ここで該セッ
トにおける各核酸分子は、前記コードされる機能的オリゴヌクレオチド分子を除
いて同じであって、そして該セットにおける該核酸分子においてコードされる該
機能的オリゴヌクレオチド分子が、目的のＲＮＡ分子上の部分的または完全非重
複のオリゴヌクレオチド配列部位に対して、あるいは目的のＲＮＡ分子をコード
する第１のレポーター遺伝子の前記部分における部分的または完全非重複のオリ
ゴヌクレオチド配列部位に対して標的化される、核酸分子のセット。 - 【請求項６】 前記セットにおける各前記核酸分子上の前記標的遺伝子によ
りコードされる前記機能的オリゴヌクレオチド分子がＥＧＳである、請求項５に
記載のセット。 - 【請求項７】 前記セットにおける各前記核酸分子上の前記標的遺伝子によ
ってコードされる前記機能的オリゴヌクレオチド分子がアンチセンスである、請
求項６に記載のセット。 - 【請求項８】 前記セットにおける各前記核酸分子上の前記標的遺伝子によ
ってコードされる前記機能的オリゴヌクレオチド分子がリボザイムである、請求
項５に記載のセット。 - 【請求項９】 前記セットが５つ以上の核酸分子を含む、請求項５に記載の
セット。 - 【請求項１０】 前記セットが、部分的にまたは完全に無作為化されるオリ
ゴヌクレオチド分子のライブラリーを含む、請求項５に記載のセット。 - 【請求項１１】 目的のＲＮＡの発現を減少させるか、または目的のＲＮＡ
を不活性化する機能的オリゴヌクレオチド分子を同定する方法であって、 （ａ）核酸分子のセットを細胞へ導入する工程であって、 ここで該核酸分子の導入後、各細胞は第１のレポーター遺伝子、第２のレポー
ター遺伝子、および標的遺伝子を含み、そして該第１のレポーター遺伝子が、目
的のタンパク質またはその一部分を含む融合タンパク質および第１のレポーター
タンパク質をコードし、そして該第２のレポーター遺伝子が第２のレポータータ
ンパク質をコードし、そして該目的のタンパク質またはその一部分が目的のＲＮ
Ａによってコードされ、そして該標的遺伝子が、リボザイム、ＥＧＳ、およびア
ンチセンスからなる群より選択される標的配列を含む機能的オリゴヌクレオチド
分子をコードし、そして該セットにおける各核酸分子は該コードされる機能的オ
リゴヌクレオチド分子を除いて同じであり、そして各核酸分子においてコードさ
れる該セットにおける該機能的オリゴヌクレオチド分子が該目的のＲＮＡ上の部
分的または完全に非重複な部位に対して、あるいは該目的のＲＮＡ分子をコード
する該第１のレポーター遺伝子の部分における部分的または完全に非重複な部位
に対して標的化される、工程、 （ｂ）該第２のレポータータンパク質を発現し、かつ該第１のレポータータンパ
ク質の発現の減少を示す工程（ａ）よりこれらの細胞を同定する、工程、および
（ｃ）該第２のレポータータンパク質を発現し、かつ該第１のレポータータンパ
ク質の発現の減少を示す該細胞に存在する該核酸分子によりコードされる該機能
的オリゴヌクレオチド分子を同定する工程であって、 ここで同定される機能的オリゴヌクレオチド分子が、目的のＲＮＡの発現を減
少させる機能的オリゴヌクレオチドである、工程、 を包含する、方法。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法であって、前記第２のレポータータンパク質を発現し
、かつ前記第１のレポータータンパク質の発現の減少を示す細胞が、 工程（ａ）からの前記細胞を、第２のレポータータンパク質を発現する細胞に
ついてスクリーニングするか、または工程（ａ）からの該細胞から、該第２のレ
ポータータンパク質を発現する細胞を選択する工程、および、 該第２のレポータータンパク質を発現する該細胞をスクリーニングするか、ま
たは該第２のレポータータンパク質を発現する細胞から、前記第１のレポーター
タンパク質の発現を減少を示す細胞を選択する工程、 によって同定される、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記細胞が細菌である、請求項１１に記載の方法。
- 【請求項１４】 前記細胞が真核生物細胞である、請求項１１に記載の方法
。 - 【請求項１５】 前記細胞が真菌である、請求項１４に記載の方法。
- 【請求項１６】 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４に記載の方法
。 - 【請求項１７】 前記細胞がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓ
ａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ
、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒ
ｉａ ｇｏｎｏｒｒｈａｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａ
ｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉ
ｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｅａｅ、Ｃｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏ
ｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌ
ａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍａｇａｔｕｓ、およびＨｉｓｔｏｐ
ｌａｓｍａｔｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍからなる群より選択される、請求項１
１に記載の方法。 - 【請求項１８】 機能的オリゴヌクレオチド分子が前記第２のレポータータ
ンパク質を発現し、かつ前記第１のレポータータンパク質の発現の減少を示す前
記細胞に存在する前記核酸分子を同定する工程により同定される、請求項１１に
記載の方法。 - 【請求項１９】 前記標的配列をコードする前記標的遺伝子の部分配列を決
定する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 請求項１０〜１９のいずれかの方法により得られる目的の
ＲＮＡの発現を減少させるための、機能的オリゴヌクレオチド分子。 - 【請求項２１】 遺伝子から転写されるＲＮａｓｅ Ｐ ＲＮＡ分子による
切断を標的化する外部ガイド配列ライブラリーを、公知のヌクレオチド配列を有
する遺伝子を含む細胞と混合する工程を包含する、必須遺伝子または機能的遺伝
子を同定するための、方法。 - 【請求項２２】 前記外部ガイド配列が原核生物のＲＮａｓｅ ＰによるＲ
ＮＡ分子の切断を標的化し、そして前記細胞が細菌細胞である、請求項２１に記
載の方法。 - 【請求項２３】 前記外部ガイド配列が真核生物のＲＮａｓｅ ＰによるＲ
ＮＡ分子の切断を標的化し、そして前記細胞が真核生物細胞である、請求項２１
に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記外部ガイド配列が真核生物のＲＮａｓｅ ＰによるＲ
ＮＡ分子の切断を標的化し、そして前記細胞が真菌細胞である、請求項２１に記
載の方法。 - 【請求項２５】 前記細胞が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏ
ｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｈｅｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅ
ｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈａｏｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄ
ａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍ
ｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｅａｅ、Ｃｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍ
ｏｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆ
ｌａｖｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍａｇａｔｕｓ、およびＨｉｓｔｏ
ｐｌａｓｍａｔｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍからなる群より選択される、請求項
２１に記載の方法。 - 【請求項２６】 前記ライブラリーが、原核生物細胞内の任意のＲＮＡにお
ける任意の切断部位に、ＲＮａｓｅ Ｐによる切断を特異的に指向するに有効な
長さのヌクレオチド配列の全ての可能な組み合わせを含むように構築される、請
求項２１に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記外部ガイド配列がＮ10〜13オリゴマーを含む、請求項
２６に記載の方法。 - 【請求項２８】 前記外部ガイド配列がＮ10〜15オリゴマーを含み、そして
前記細胞が真菌である、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２９】 前記外部ガイド配列がＮ10〜18オリゴマーを含み、そして
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項３０】 前記外部ガイド配列が、前記細胞内で発現および複製され
得るベクターに存在する、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項３１】 前記ベクターがレポーター遺伝子または該ベクターを有す
る細胞をスクリーニングするために使用され得る選択遺伝子、あるいは必須遺伝
子または機能的遺伝子をコードするＲＮＡの切断を誘導する外部ガイド配列を有
する、請求項３０に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ト
ランスファーＲＮＡ、およびリボゾームＲＮＡからなる群より選択される、請求
項２１に記載の方法。 - 【請求項３３】 必須遺伝子または機能的遺伝子によりコードされるＲＮＡ
の切断を誘導する外部ガイド配列を含む細胞を選択する工程をさらに包含する、
請求項３１の方法。 - 【請求項３４】 前記細胞が最初に複製され、次いで必須遺伝子または機能
的遺伝子をコードするＲＮＡを切断する外部ガイド配列を発現する細胞の表現型
を殺傷するかまたは変化させる薬剤へ曝露される、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３５】 前記ベクターを発現する細胞が、必須遺伝子または機能的
遺伝子をコードするＲＮＡの切断を誘導する外部ガイド配列を発現する細胞の表
現型を殺傷するかまたは変化させる薬剤への曝露より前に増幅される、請求項３
４に記載の方法。 - 【請求項３６】 前記細胞の表現型の殺傷または変化を誘導する前記外部ガ
イド配列の配列を同定する工程をさらに包含する、請求項３３に記載の方法。 - 【請求項３７】 前記外部ガイド配列によって標的化される場合、コードさ
れるＲＮＡがＲＮａｓｅ Ｐによって切断される遺伝子の配列を決定する工程を
さらに包含する、請求項３６に記載の方法。 - 【請求項３８】 前記遺伝子の配列が所定の薬剤に曝露される場合、前記細
胞の表現型を殺傷するかまたは変化させる複数の外部ガイド配列の分析により決
定される、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 請求項２１〜３８に記載の方法によって同定される、単離
された遺伝子配列。 - 【請求項４０】 請求項２１〜３８に記載の方法において使用するための外
部ガイド配列のライブラリー。
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| US08/976220 | 1998-03-30 | ||
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